WO2004110484A1 - Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus - Google Patents

Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus Download PDF

Info

Publication number
WO2004110484A1
WO2004110484A1 PCT/RU2003/000263 RU0300263W WO2004110484A1 WO 2004110484 A1 WO2004110484 A1 WO 2004110484A1 RU 0300263 W RU0300263 W RU 0300263W WO 2004110484 A1 WO2004110484 A1 WO 2004110484A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vaccine
influenza virus
cells
strains
influenza
Prior art date
Application number
PCT/RU2003/000263
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Lev Stepanovich Sandakhchiev
Elena Avgustovna Nechaeva
Nikolai Anatolyevich Varaksin
Tatyana Gennadyevna Ryabicheva
Natalya Alekseevna Mazurkova
Stanislav Georgievich Markushin
Yury Zakharovich Gendon
Irina Borisovna Koptyaeva
Irina Ivanovna Akopova
Original Assignee
Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor'
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor' filed Critical Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor'
Priority to PCT/RU2003/000263 priority Critical patent/WO2004110484A1/en
Publication of WO2004110484A1 publication Critical patent/WO2004110484A1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • A61K39/145Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525Virus
    • A61K2039/5254Virus avirulent or attenuated
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70Multivalent vaccine
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/16011Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/16011Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151Methods of production or purification of viral material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/16011Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161Methods of inactivation or attenuation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/16011Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16164Methods of inactivation or attenuation by serial passage
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011Details
    • C12N2760/16011Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates to a technology for producing live influenza vaccine and can be used in the pharmaceutical industry for the production of vaccines and therapeutic drugs.
  • inactivated, subunit forms of influenza vaccines prepared on chicken embryos are produced and used to protect the public against influenza, which, when properly applied, can protect 80% of those vaccinated.
  • the high cost of such drugs, as well as the complexity of the production and use of inactivated vaccines make it difficult to use them for mass prevention of influenza.
  • inactivated vaccines form a higher level of general humoral immunity, these drugs are practically not able to induce local secretory immunity.
  • the effectiveness of an inactivated influenza vaccine decreases dramatically even with small changes in the antigenic structure of the epidemic strain compared with the vaccine.
  • a live vaccine In Russia, a live vaccine is widely used that stimulates the development of asymptomatic infection with the formation of humoral, secretory and cellular immunity with intranasal administration and immunological memory.
  • Sufficiently effective live vaccines have certain advantages over killed vaccines in terms of cost-effectiveness, ease of production and use, as well as a greater breadth of immunological effect. These benefits are associated with increased attention recently to the development of live influenza vaccine in the United States.
  • Currently used influenza vaccines need to be adjusted annually, taking into account the constantly occurring changes in the antigenic composition of the surface glycoproteins of the virus. Every year, an unpredictable situation arises when in a very short period of time it is necessary to produce a sufficient amount of vaccine that is adequately effective against strains that are most likely to cause an influenza epidemic.
  • Live influenza vaccine induces a wide range of antibodies that can neutralize variants with altered antigenic specificity of hemagglutinin.
  • a live vaccine is more economical because requires about 10 times less chicken embryos for production.
  • the use of cell culture in the production of vaccines makes the vaccine even more economical, and the use of a serum-free culture medium completely eliminates the allergic reactions of eggs vaccinated on chicken proteins.
  • a known method of producing an inactivated viral vaccine including culturing influenza virus strains in chicken embryos for 72-96 hours, incubating the embryos overnight in a refrigerator, collecting allantoic fluid, inactivating the virus, purification by filtration and / or centrifugation (Receptors For Ipastivative Ipfluepza Vassipe, World Independent Organization Testing Series, 384 (1966).
  • the disadvantages of this method are the content in the vaccine of certain amounts of chicken embryo proteins that cause adverse reactions in individuals allergic to these proteins; a change in the antigenic structure of the virus during cultivation in chicken embryos due to the loss of certain antigenic domains; the possibility of contamination with extraneous viruses; the need (one-time) for a large number of chicken embryos during vaccine production.
  • each chicken embryo is a unique biological system and thus suggests a certain instability of the resulting vaccine preparation.
  • Another method for producing a live viral vaccine is known.
  • Vaccine influenza allantoic live intranasal dry for adults including infection of chicken embryos with vaccine strains of the influenza virus, collection of virus-containing allantoic fluid, introduction of meat peptone, filling into ampoules, lyophilization and sealing.
  • the finished product is a dry porous mass with the smell of peptone.
  • the resulting vaccine does not contain chicken protein impurities.
  • this method has several disadvantages: a primary cell culture is used that does not have standard properties and is not sufficiently characterized; contamination of cell culture and vaccine with extraneous viruses, mycoplasmas, prions is possible; cell culture of chicken embryos is used, therefore, it is possible to change the antigenic structure of strains of the influenza virus, which occurs during cultivation on chicken embryos.
  • animal products are used (cattle blood serum, trypsin, gelatose or human serum albumin as a stabilizer), which can lead to allergenization of immunized , as well as a possible infection with extraneous viruses, mycoplasmas, prions contained in animal products.
  • the closest analogue is a method for producing inactivated and live influenza vaccines (US, 6344354, Bl, 02/05/2002), including cultivation of highly productive influenza virus strains on certified transplantable cell lines (Vero, MDCK) in nutrient medium MEM Needle with the addition of 5 -10% fetal serum and trypsin in an amount (0.05-1.0 ⁇ g / ml), washing the cells after the formation of a monolayer, introducing bovine serum albumin, collecting virus-containing liquid, purification by centrifugation or chromatography and subsequent iv denie chemotherapeutic components, adjuvants or polymers (polyethylene glycol, polypropylene glycol).
  • the disadvantages of this prototype method is a monolayer cultivation of cells in culture bottles, which cannot ensure the production of large volumes of virus-containing fluid; the use of MEM Needle for the cultivation of cells of the nutrient medium with the addition of 5-10% fetal serum, as well as the introduction of bovine serum albumin virus at the stage of production, leads to the introduction of components of animal feed that can be a source of extraneous viruses, mycoplasmas, prions, and cause additional allergization of the immunized organism.
  • the technical result of the proposed method is the production on an industrial scale of a live cultural trivalent influenza vaccine based on cold-adapted vaccine strains of influenza A and B virus for intranasal and parenteral administration with a lower content of extraneous protein components of animal origin, which reduces the possibility of allergic reactions.
  • cold-adapted vaccines are used as viral strains sorts of strains of influenza viruses, as a nutrient medium in the cultivation of MDCK cells and strains of influenza viruses on these cells use serum-free culture medium with the addition of soy hydrolyzate in a concentration of 0.01- 10% and a proteolytic enzyme in an amount of 0.25-50.0 ⁇ g / ml before the inoculation dose of influenza virus strains, and the cultivation of MDCK cell cultures and cold-adapted influenza virus strains in the specified cell culture is carried out in suspension on microcarriers introduced into serum-free nutrient medium at a concentration of 1-6 g
  • a culture of MDCK cells As a culture of MDCK cells, a culture stored at liquid nitrogen temperature in the form of a seed and working banks and certified for the absence of extraneous viruses, the absence of oncogenic potentials and species identity is used.
  • vaccine strains of type A / HZN2 are used; A / H1N1 and type B of this virus.
  • the seeding dose of transplanted MDCK cells is 100-600 thousand cells per 1 ml of medium, and the seeding dose of vaccine strains of influenza virus has a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EIDso / cell.
  • Papain is a proteolytic enzyme of plant origin as a proteolytic enzyme, and Cytodex 1 is used as a microcarrier.
  • the virus-containing fluid is collected after the specific activity of the influenza virus is at least 8.0 Ig EID 5 o / ml, and the ballast impurities are removed from the viral substance by filtration .
  • sucrose and peptone from soybeans are used in the final concentrations of (5-10) and (3-8) May. % respectively.
  • Drying the vaccine is carried out by freezing it for 18 hours at a temperature not exceeding minus 4O 0 C followed by lyophilization for 48 hours, moreover, before sealing, the ampoules with the viral vaccine are filled with an inert gas, in particular argon.
  • Vaccine strains of live influenza vaccine are reassortants obtained in Russia on the basis of cold-adapted mutant donors of attenuation A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) and B / CCCP / 60/69. These donors are characterized by cold adaptation, i.e. the ability to reproduce at low temperatures, temperature sensitivity and harmlessness for laboratory animals and humans.
  • a necessary condition for the safety and genetic stability of vaccine strains is considered to be the presence of 5-6 mutant genes encoding the internal proteins of the attenuation donor in their genome, while the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes always come from the current epidemic virus.
  • Strain A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) was obtained by crossing the cold-adapted master strain A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) with the epidemic strain A / Chandon / 93/1 (H1N1).
  • influenza virus strain A / 47 / Johannesbyrg / 94/2 was obtained by crossing the cold-adapted master strain A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) with an epidemic strain
  • Strain B / 60 / Peterbyg / 95/20 was obtained by crossing a cold-adapted master strain B / CCCP / 60/69 with the epidemic strain B / Peterbyg / 95/20.
  • Vaccine strains of the influenza virus are stored at the State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Products (GISK) named after L.A. Tarasevich, Moscow.
  • a significant advantage of transplanted cells is their stability, standardization, the possibility of obtaining a large number of producer cells in a fairly short time, long-term use of cells, and the relatively low cost of vaccine preparations.
  • WHO-certified cell lines are free of contaminating agents, while chicken embryos often contain retroviruses and some other agents.
  • the hemagglutinin of human influenza virus strains isolated and cultured in chicken embryos may lose one of the antigenic domains, while the isolation and cultivation of the influenza virus on the MDCK cell line preserves all antigenic domains, and the hemagglutinin of such isolates is antigenically completely identical to hemagglutinin influenza virus that multiplies in the human body.
  • vaccines prepared on MDCK or Vero cells better protect vaccinated animals from infection with virulent influenza virus strains and also induce more cross-reactive antibodies than vaccines obtained on chicken embryos that stimulate antibodies specific for to the homologous antigen (Alumova L, Codihalli S., Govorkova E. et al. Immune aproprotect effisasu ip miise odfluepza virus Vassipes grpwa ipma mma).
  • MDCK cell line derived from dog kidney cells mainly the MDCK cell line derived from dog kidney cells and the Vero cell line derived from African green monkey kidney cells were investigated.
  • comparative experiments (Mertep O., Managuerra J., Hannoun C. et al. Rupodtiop of ipfluepza virus ip sepulcultures for preserving reproduct.
  • Novel Str. Rlepspres N.-Y., 1996, pp 141-150
  • it was shown that MDCK cells produce the same number of cells 2 times faster than Vero cells and 7 times faster than BHK cells.
  • Papain is a plant proteolytic enzyme of the hydrolase class; it exhibits broad substrate specificity and is produced by the company
  • Papain provides in a nutrient medium at the indicated concentrations the guaranteed penetration of the influenza virus into MDCK cells during their infection with the indicated virus.
  • Microcarriers provide at the indicated concentrations higher production of cells and virus and a higher yield of virus-containing material. In the process of experimental studies, it was precisely the Sigma Cytodex 1 microcarriers that were selected that were 1 mm in size, on the surface of which stable monolayers of MDCK cells are formed, which are capable of producing the influenza virus without losing their physiological functions.
  • the serum-free nutrient medium MDSS2 is manufactured by Ahsevir, France. Embodiments of the invention
  • Example JVa Certification of MDCK cell culture. For work using a culture of MDCK cells from the seed and working banks. Certification of cell culture MDCK carried out in accordance with the requirements of the WHO for transplantable cell lines.
  • the cytomorphology of culture in native and fixed preparations in a light microscope was studied. It was shown that the MDCK cell culture consists of epithelial-like cells. The nuclei are rounded with chromatin grit. Nuclei rounded, from one to several in the nucleus.
  • the cytoplasm is granular. There are giant and multinucleated cells, the number of which increases during cultivation. Cells form a monolayer on the 2nd day of cultivation, at the same time, a peak in mitotic activity is noted, pathological mitoses are not observed.
  • Mycoplasma was not detected by direct inoculation of the culture fluid of the seed and working banks of MDCK cells on selective nutrient media and by DNA staining with intercalating fluorochromes.
  • two pairs of primers were used (GPO-I and MGSO-for the first cycle; GPO-2 and MGSO-for the second cycle), which make it possible to identify all known types of mycoplasmas.
  • Mycoplasma was not detected by PCR analysis.
  • a control was conducted to detect foreign viruses in cell culture, chicken embryos and animals.
  • the state of the monolayer of intact cells of the inoculating and working banks was studied for 14 days. No cytopathic effect (CPP) was found.
  • samples of the culture fluid were examined in a hemagglutination reaction, and the monolayer in the hemadsor sion reaction with guinea pig erythrocytes. The reactions are negative.
  • Culture fluid samples were studied in three types of cell cultures: MDCK (homologous), L-68 (diploid culture), Vero for 14 days. No CPC detected.
  • the studied material in the amount of 10 6 cells was introduced into the yolk sac, allantoic cavity and the chorionallantoic membrane chicken embryos (10 embryos per point), the embryos were incubated for 7-10 days, after which the viability of the embryos was determined and a hemagglutination reaction with allantoic fluid was established. No foreign viruses were detected in the seed and working banks of the MDCK line.
  • the studied material was intramuscularly administered to sucker mice at the age of 24 hours (28 heads of sucker mice, 10 7 cells per group), adult mice (10 goals, 10 7 cells per group of mice), and guinea pigs (5 animals, 10 7 cells per group), rabbits (5 animals, 10 7 cells per animal group), the animals were monitored for 28 days, after which autonasia and examination of the internal organs were performed. All animals in the experiment were alive, no changes in internal organs were noted. No extraneous viruses were found in the seed and working banks of MDCK cells.
  • the oncogenic potencies of the cells of the seed and working banks were determined in the ip vivo system.
  • the method of heterotransplantation of cells to immunosuppressive animals was used in comparative experiments with a reference HeIa cell line that causes progressive tumor growth. The animals were observed for 21 days. In this case, all animals were alive, with a macroscopic examination for the presence of a tumor in the lymph nodes, liver, kidneys, lungs and at the injection site, pathological changes were not detected.
  • monitoring in the ip vivo system it was established that the MDCK cells of the seed and working banks do not possess oncogenic potentials.
  • the cells of the seed and working banks of MDCK have a fairly stable karyotype, characterized by clear morphological characteristics. An analysis of the electrophoretic mobility of the G-6-FDG isoenzyme was carried out.
  • the MDCK cells of the seed and worker banks have G-6-FDG characteristic of dog cells.
  • Example JVa Preparation of a living culture influenza vaccine (VHF) substance.
  • a culture vessel of a 1 or 10 liter fermenter is filled with serum-free culture medium.
  • a certified MDCK cell culture (in accordance with Example 1) is taken from a collection bank of cell cultures of the State Scientific Center of the WB Bektop and brought into the indicated culture vessel at the rate of 100-600 thousand cells per ml of culture medium.
  • the microcarrier Cytodex I is introduced into the culture vessel at a concentration of 1-6 g / l.
  • Cell deposition on a microcarrier is carried out for 12 hours at a temperature of 35-37 0 C (the filling volume of the culture vessel is 25-30%).
  • Cell planting mode 5 min stirring, 10 min break.
  • the specified cultivation parameters the stirring device rotational speed is 50-80 rpm, surface aeration with a blowing rate from 0 to 10 l / h.
  • the pH is maintained between 6.9 and 7.2 with a dosed supply of a 7.5% sodium carbonate solution.
  • the cultivation temperature is 35-37 0 C.
  • Perfusion of the nutrient medium begins at a cell concentration of 600-900 thousand / ml. The perfusion rate depends on the concentration of cells.
  • the cell cultivation time is 96-144 hours. After the accumulation of cells, 50% of the medium is removed, one of the vaccine cold-adapted reassortants of the virus is introduced into the suspension 63
  • influenza for example, A / 47 / Johannesbyrg / 94/2 (HZN2), with a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EID 50 / cell, and supporting a serum-free nutrient medium containing the papain proteolytic enzyme in an amount of 0.25-50, 0 ⁇ g / ml or trypsin in an amount of 2.0-20.0 ⁇ g / ml and soy hydrolyzate in a concentration of 0.01-10%.
  • the virus is cultivated at a temperature of (34 + I) 0 C.
  • a virus-containing liquid is collected with a specific activity of at least 8.0 Ig EID 50 / ml, which is released by filtration from cell detritus .
  • a sterile stabilizer solution (sucrose and peptone from soybeans at a final concentration of 10% and 5%, respectively) is added to the virus-containing suspension to obtain a liquid semi-finished product of strain A / 47 / Johannesbyg / 94/2 (HZN2) of the live influenza vaccine (GHV).
  • liquid semi-finished vaccine strains of cold-adapted reassortants of the influenza virus A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) and B / 60 / Peterbyg / 95/20 are produced in parallel or sequentially.
  • EID is an embryonic infectious dose.
  • liquid semi-finished products obtained from the virus-containing liquid of vaccine strains A / 47 / Johannesbyrg / 94/2 (HZN2), A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) and B / 60 / Peterbyg / 95/20 influenza virus are combined in equal proportions.
  • a liquid semi-finished product of one of the above strains of the influenza virus is used.
  • the resulting liquid form of the vaccine is poured into ampoules of 0.6 ml each and frozen at a temperature not exceeding minus 4O 0 C for 18 hours.
  • the product is freeze-dried for 48 hours under sterile conditions. After drying, the ampoules are filled with an inert gas (argon) and sealed.
  • Example JVa 4 Determination of the specific activity of preparations of live influenza vaccine
  • the specific activity of the virus-containing material is determined in monovaccines to the information of the trivalent vaccine obtained simultaneously with the trivaccine, by titration on chicken embryos according to the method described in (Methodological instructions "Methods of control of medical immunobiological preparations administered to people.” MUK 4.1 / 4.2.588-96 )
  • the specific activity of the vaccine after lyophilization is not less than 6.0-6.5 Ig EID 5 o / O, 2 ml.
  • Example JVs 5 The study of the dynamics of reproduction of the influenza virus with different multiplicity of infection on the example of a strain
  • the MDCK cell culture is infected with strain A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) of influenza virus with different multiplicity of infection (0.001;
  • Example JVs 6 The study of the stability of ts ⁇ 4 o and and ca 25 genetic traits
  • Example JNa 7 Study of the effect of the papain enzyme on the cultivation of cold-adapted vaccine strains of the influenza virus In order to replace the components of animal origin in the technology for producing live influenza vaccine with herbal preparations, studies were carried out on the use of the plant papain enzyme in the production of influenza virus strains. To do this, papain is added to the support medium used in the cultivation of influenza virus strains. The data are shown in table 3. Table 3
  • table 3 shows that at a concentration of papain in a support medium of 0.25-20.0 ⁇ g / ml, the titer of the influenza virus on 3-4 days of cultivation was 7.3-8.5 Ig EID 5 (/ ml, while in the control experiment (without introducing the enzyme into the supporting medium) the titer of the influenza virus was 6.5-6.7 Ig EID 5 o / ml, which confirms the effectiveness of the specified enzyme.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

The invention relates to biotechnology, to a method for producing a live influenza vaccine. The inventive method consists in cultivating passage cells in a nutritional medium, producing a virus-containing substance by cultivating vaccine strain of the influenza virus in the MDCK cell culture on the same nutritional medium. The vaccine cold-adapted reassortants of the influenza virus strains are used as virus strains. The nutritional medium for cultivating the MDCK cells and the influenza virus strains on said cells is embodied in the form of a serum-free nutritional medium supplemented with a soy hydrolysate at a concentration of 0.01-10.0 % and a proteolytic vegetable ferment in a quantity of 0.25-50.0 mkg/ml before inoculating seed dose of the influenza virus strains. The cultivation of MDCK culture cells and the vaccine influenza virus strains in said cell culture is carried out in a suspension based on microcarriers which are inoculated into the serum-free nutritional medium at a concentration of 1-6 g/l. Afterwards, ballast impurities are removed from a viral suspension, which is supplemented with a stabiliser and dried.

Description

Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа A method of obtaining a live culture vaccine against influenza virus
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к технологии получения живой гриппозной вакцины и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства вакцин и лечебно-профилактических препаратов.The invention relates to a technology for producing live influenza vaccine and can be used in the pharmaceutical industry for the production of vaccines and therapeutic drugs.
Во всем мире для защиты населения от гриппа производятся и применяются инактивированные, субъединичные формы гриппозных вакцин, приготовленные на куриных эмбрионах, которые при правильном применении могут защитить от гриппа 80% вакцинированных. Однако высокая стоимость таких препаратов, а также сложность производства и применения инактивированных вакцин затрудняют их использование для массовой профилактики гриппа. Несмотря на то, что инактивированные вакцины формируют более высокий уровень общего гуморального иммунитета, эти препараты практически не способны индуцировать местный секреторный иммунитет. Эффективность инактивированной гриппозной вакцины резко снижается даже при небольших изменениях антигенной структуры эпидемического штамма по сравнению с вакцинным.Around the world, inactivated, subunit forms of influenza vaccines prepared on chicken embryos are produced and used to protect the public against influenza, which, when properly applied, can protect 80% of those vaccinated. However, the high cost of such drugs, as well as the complexity of the production and use of inactivated vaccines make it difficult to use them for mass prevention of influenza. Despite the fact that inactivated vaccines form a higher level of general humoral immunity, these drugs are practically not able to induce local secretory immunity. The effectiveness of an inactivated influenza vaccine decreases dramatically even with small changes in the antigenic structure of the epidemic strain compared with the vaccine.
В России широко применяется живая вакцина, стимулирующая при интраназальном применении развитие бессимптомной инфекции с формированием гуморального, секреторного и клеточного иммунитета и иммунологической памяти. Достаточно эффективные живые вакцины имеют определенные преимущества перед убитыми вакцинами по экономичности, простоте производства и применения, а также по большей широте иммунологического действия. С этими преимуществами связано усиление внимания в последнее время к разработке живой гриппозной вакцины и в США. Применяемые в настоящее время гриппозные вакцины нуждаются в ежегодной корректировке с учетом постоянно происходящих изменений в антигенном составе поверхностных гликопротеинов вируса. Каждый год возникает непрогнозируемая ситуация, когда за очень короткий отрезок времени необходимо произвести достаточное количество вакцины, обладающей адекватной эффективностью в отношении штаммов, которые вероятнее всего вызовут эпидемию гриппа.In Russia, a live vaccine is widely used that stimulates the development of asymptomatic infection with the formation of humoral, secretory and cellular immunity with intranasal administration and immunological memory. Sufficiently effective live vaccines have certain advantages over killed vaccines in terms of cost-effectiveness, ease of production and use, as well as a greater breadth of immunological effect. These benefits are associated with increased attention recently to the development of live influenza vaccine in the United States. Currently used influenza vaccines need to be adjusted annually, taking into account the constantly occurring changes in the antigenic composition of the surface glycoproteins of the virus. Every year, an unpredictable situation arises when in a very short period of time it is necessary to produce a sufficient amount of vaccine that is adequately effective against strains that are most likely to cause an influenza epidemic.
Живая гриппозная вакцина индуцирует широкий спектр антител, способных нейтрализовать варианты с изменившейся антигенной специфичностью гемагглютинина. Кроме того, живая вакцина является более экономичной, т.к. требует примерно в 10 раз меньше куриных эмбрионов для производства. Применение в производстве вакцины культуры клеток позволяет сделать вакцину еще более экономичной, а использование бессывороточной питательной среды полностью исключит аллергические реакции вакцинированных на белки куриных яиц.Live influenza vaccine induces a wide range of antibodies that can neutralize variants with altered antigenic specificity of hemagglutinin. In addition, a live vaccine is more economical because requires about 10 times less chicken embryos for production. The use of cell culture in the production of vaccines makes the vaccine even more economical, and the use of a serum-free culture medium completely eliminates the allergic reactions of eggs vaccinated on chicken proteins.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Известен способ получения инактивированной вирусной вакцины, включающий культивирование штаммов вируса гриппа в куриных эмбрионах в течение 72-96 часов, инкубацию эмбрионов в течение ночи в холодильнике, последующий сбор аллантоисной жидкости, инактивацию вируса, очистку с помощью фильтрации и/или центрифугирования (Rеquirеmепts Fоr Iпасtivаtеd Iпfluепzа Vассiпе, Wоrld Неаlth Оrgапizаtiоп Тесhпiсаl Rероrt Sеriеs, 384 (1966). Недостатками данного способа является содержание в вакцине определенных количеств белков куриных эмбрионов, которые вызывают неблагоприятные реакции у лиц с аллергией к этим белкам; изменение антигенной структуры вируса при культивировании в куриных эмбрионах за счет утраты определенных антигенных доменов; возможность контаминации посторонними вирусами; потребность (одномоментная) в большом количестве куриных эмбрионов при наработке вакцины. Для получения одной дозы вакцины требуется 1-2 куриных эмбриона, т.е. для наработки 1 млн доз гриппозной вакцины необходимо более 1 млн куриных эмбрионов. Кроме того, каждый куриный эмбрион представляет собой уникальную биологическую систему и тем самым предполагает наличие определенной нестабильности получаемого вакцинного препарата.A known method of producing an inactivated viral vaccine, including culturing influenza virus strains in chicken embryos for 72-96 hours, incubating the embryos overnight in a refrigerator, collecting allantoic fluid, inactivating the virus, purification by filtration and / or centrifugation (Receptors For Ipastivative Ipfluepza Vassipe, World Independent Organization Testing Series, 384 (1966). The disadvantages of this method are the content in the vaccine of certain amounts of chicken embryo proteins that cause adverse reactions in individuals allergic to these proteins; a change in the antigenic structure of the virus during cultivation in chicken embryos due to the loss of certain antigenic domains; the possibility of contamination with extraneous viruses; the need (one-time) for a large number of chicken embryos during vaccine production. To receive a single dose of the vaccine, 1-2 chicken embryos are required, i.e. more than 1 million chicken embryos are needed to produce 1 million doses of influenza vaccine. In addition, each chicken embryo is a unique biological system and thus suggests a certain instability of the resulting vaccine preparation.
Известен другой способ получения живой вирусной вакциныAnother method for producing a live viral vaccine is known.
(Фармакопейная статья Министерства здравоохранения России N°42-3569-(Pharmacopoeia article of the Ministry of Health of Russia N ° 42-3569-
98 «Baкцинa гриппозная аллантоисная живая интраназальная сухая для взpocлыx»), включающий заражение куриных эмбрионов ха вакцинными штаммами вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение мясного пептона, розлив в ампулы, лиофилизацию и запайку. Готовый продукт представляет собой сухую пористую массу, обладающую запахом пептона.98 “Vaccine influenza allantoic live intranasal dry for adults”), including infection of chicken embryos with vaccine strains of the influenza virus, collection of virus-containing allantoic fluid, introduction of meat peptone, filling into ampoules, lyophilization and sealing. The finished product is a dry porous mass with the smell of peptone.
Однако очистка от балластных примесей в технологии не предусмотрена, что отрицательно сказывается на аллергологической безопасности вакцины. Кроме того, наблюдается изменение антигенной структуры вируса гриппа при культивировании в куриных эмбрионах, и не исключена контаминация вакцины ретровирусами и др. вирусами птиц, присутствующими в эмбрионах. Известен другой способ (US5 5698433, Bl, 16.12.1997) получения инактивированной вакцины против гриппа, включающий культивирование штаммов вируса гриппа на агрегатах первичных клеток куриных эмбрионов в присутствии трипсина в лабораторном спиннере или двухлитровом ферментере, сбор вируссодержащей жидкости, ультрафильтрацию, цетрифугирование, инактивацию вируса и введение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта. Технология проста в исполнении, позволяет получать большие объемы вируссодержащей жидкости с высоким титром активности вируса (выход с клеток, полученных из 4 куриных эмбрионов, составляет 400-500 мл вируссодержащей жидкости в течение 96 час или 100 мл антигена, что в 14 раз выше, чем на куриных эмбрионах). Получаемая вакцина не содержит примеси белков куриных яиц.However, purification from ballast impurities is not provided for in the technology, which adversely affects the allergological safety of the vaccine. In addition, there is a change in the antigenic structure of the influenza virus during cultivation in chicken embryos, and vaccine contamination with retroviruses and other avian viruses present in the embryos is not ruled out. Another method is known (US 5 5698433, Bl, December 16, 1997) for producing an inactivated influenza vaccine, including cultivating influenza virus strains on primary cells of chicken embryos in the presence of trypsin in a laboratory spinner or two-liter fermenter, collecting virus-containing liquid, ultrafiltration, centrifugation, inactivation virus and the introduction of aluminum hydroxide as an adjuvant. Technology is easy to performance, allows you to receive large volumes of virus-containing liquid with a high titer of virus activity (the output from cells obtained from 4 chicken embryos is 400-500 ml of virus-containing liquid for 96 hours or 100 ml of antigen, which is 14 times higher than on chicken embryos ) The resulting vaccine does not contain chicken protein impurities.
Однако указанный способ обладает рядом недостатков: используется первичная культура клеток, не обладающая стандартными свойствами и недостаточно охарактеризованная; возможна контаминация культуры клеток и вакцины посторонними вирусами, микоплазмами, прионами; используется культура клеток куриных эмбрионов, следовательно, возможно изменение антигенной структуры штаммов вируса гриппа, что имеет место при культивировании на куриных эмбрионах.However, this method has several disadvantages: a primary cell culture is used that does not have standard properties and is not sufficiently characterized; contamination of cell culture and vaccine with extraneous viruses, mycoplasmas, prions is possible; cell culture of chicken embryos is used, therefore, it is possible to change the antigenic structure of strains of the influenza virus, which occurs during cultivation on chicken embryos.
Помимо указанных недостатков, во всех известных технологиях производства гриппозных вакцин, в том числе в описанных выше аналогах, используют продукты животного происхождения (сыворотка крови крупного рогатого скота, трипсин, желатоза или человеческий сывороточный альбумин в качестве стабилизатора), что может привести как к аллергизации иммунизируемых, так и возможному заражению посторонними вирусами, микоплазмами, прионами, содержащимися в продуктах животных.In addition to these disadvantages, in all known technologies for the production of influenza vaccines, including the analogues described above, animal products are used (cattle blood serum, trypsin, gelatose or human serum albumin as a stabilizer), which can lead to allergenization of immunized , as well as a possible infection with extraneous viruses, mycoplasmas, prions contained in animal products.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения инактивированных и живых гриппозных вакцин ( US, 6344354, Bl, 05.02.2002), включающий культивирование высокопродуктивных штаммов вируса гриппа на аттестованных перевиваемых линиях клеток (Vеrо, MDCK) в питательной среде Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки и трипсина в количестве (0,05-1,0 мкг/мл), отмывку клеток после образования монослоя, введение бычьего сывороточного альбумина, сбор вируссодержащей жидкости, очистку с помощью центрифугирования или хроматографии и последующее введение хемотерапевтических компонентов, адъювантов или полимеров (полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль).The closest analogue (prototype) is a method for producing inactivated and live influenza vaccines (US, 6344354, Bl, 02/05/2002), including cultivation of highly productive influenza virus strains on certified transplantable cell lines (Vero, MDCK) in nutrient medium MEM Needle with the addition of 5 -10% fetal serum and trypsin in an amount (0.05-1.0 μg / ml), washing the cells after the formation of a monolayer, introducing bovine serum albumin, collecting virus-containing liquid, purification by centrifugation or chromatography and subsequent iv denie chemotherapeutic components, adjuvants or polymers (polyethylene glycol, polypropylene glycol).
Недостатками данного способа-прототипа является монослойное культивирование клеток в культуральных флаконах, что не может обеспечить наработку больших объемов вируссодержащей жидкости; использование для культивирования клеток питательной среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки, а также введение на стадии наработки вируса бычьего сывороточного альбумина приводит к внесению в вакцину компонентов сырья животного происхождения, которые могут являться источником посторонних вирусов, микоплазм, прионов, а также вызывать дополнительную аллергизацию иммунизируемого организма.The disadvantages of this prototype method is a monolayer cultivation of cells in culture bottles, which cannot ensure the production of large volumes of virus-containing fluid; the use of MEM Needle for the cultivation of cells of the nutrient medium with the addition of 5-10% fetal serum, as well as the introduction of bovine serum albumin virus at the stage of production, leads to the introduction of components of animal feed that can be a source of extraneous viruses, mycoplasmas, prions, and cause additional allergization of the immunized organism.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Техническим результатом предлагаемого способа является получение в промышленных масштабах живой культуральной трехвалентной гриппозной вакцины на основе вакцинных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А и В для интраназального и парентерального применения с более низким содержанием посторонних белковых компонентов животного происхождения, что снижает возможность аллергических реакций. Указанный результат достигается тем, что в способе получения живой гриппозной вакцины, включающем культивирование перевиваемых клеток MDCK в питательной среде, получение вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на этой же питательной среде, очистку вирусной субстанции от балластных примесей, введение в очищенную субстанцию стабилизирующих добавок и сушку готовой формы вакцины, согласно изобретению, в качестве вирусных штаммов используют вакцинные холодоадаптированные реассортанты штаммов вирусов гриппа, в качестве питательной среды при культивировании клеток MDCK и штаммов вирусов гриппа на указанных клетках используют бессывороточную питательную среду с добавлением гидролизата сои в концентрации 0,01- 10% и протеолитического фермента в количестве 0,25-50,0 мкг/мл до введения посевной дозы штаммов вирусов гриппа, а культивирование культур клеток MDCK и холодоадаптированных штаммов вируса гриппа в указанной культуре клеток осуществляют в суспензии на микроносителях, вносимых в бессывороточную питательную среду в концентрации 1-6 г/л.The technical result of the proposed method is the production on an industrial scale of a live cultural trivalent influenza vaccine based on cold-adapted vaccine strains of influenza A and B virus for intranasal and parenteral administration with a lower content of extraneous protein components of animal origin, which reduces the possibility of allergic reactions. This result is achieved in that in a method for producing a live influenza vaccine, including cultivating transplantable MDCK cells in a nutrient medium, obtaining a virus-containing substance by cultivating vaccine strains of the influenza virus in an MDCK cell culture on the same nutrient medium, purifying the viral substance from ballast impurities, introducing the purified substance of stabilizing additives and the drying of the finished vaccine form according to the invention, cold-adapted vaccines are used as viral strains sorts of strains of influenza viruses, as a nutrient medium in the cultivation of MDCK cells and strains of influenza viruses on these cells use serum-free culture medium with the addition of soy hydrolyzate in a concentration of 0.01- 10% and a proteolytic enzyme in an amount of 0.25-50.0 μg / ml before the inoculation dose of influenza virus strains, and the cultivation of MDCK cell cultures and cold-adapted influenza virus strains in the specified cell culture is carried out in suspension on microcarriers introduced into serum-free nutrient medium at a concentration of 1-6 g / l.
В качестве культуры клеток MDCK используют культуру, заложенную на хранение при температуре жидкого азота в виде посевного и рабочего банков и аттестованную на отсутствие посторонних вирусов, отсутствие онкогенных потенций и видовую идентичность.As a culture of MDCK cells, a culture stored at liquid nitrogen temperature in the form of a seed and working banks and certified for the absence of extraneous viruses, the absence of oncogenic potentials and species identity is used.
В качестве вакцинных холоадаптированных реассортантов вируса гриппа используют вакцинные штаммы типа A/HЗN2; A/H1N1 и типа В этого вируса.As vaccine holo-adapted reassortants of the influenza virus, vaccine strains of type A / HZN2 are used; A / H1N1 and type B of this virus.
Посевная доза перевиваемых клеток MDCK составляет 100-600 тыс. клеток на 1 мл среды, а посевная доза вакцинных штаммов вируса гриппа имеет множественность заражения 0,01-0,0001 ЭИДsо/кл.The seeding dose of transplanted MDCK cells is 100-600 thousand cells per 1 ml of medium, and the seeding dose of vaccine strains of influenza virus has a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EIDso / cell.
В качестве протеолитического фермента используют протеолитический фермент растительного происхождения папаин, а в качестве микроносителя - Цитодекс 1. Сбор вируссодержащей жидкости осуществляют после достижения специфической активности вируса гриппа не менее 8,0 Ig ЭИД5o/мл, а удаление балластных примесей из вирусной субстанции осуществляют фильтрованием.Papain is a proteolytic enzyme of plant origin as a proteolytic enzyme, and Cytodex 1 is used as a microcarrier. The virus-containing fluid is collected after the specific activity of the influenza virus is at least 8.0 Ig EID 5 o / ml, and the ballast impurities are removed from the viral substance by filtration .
В качестве стабилизирующих добавок используют сахарозу и пептон из сои в конечной концентрации (5-10) и (3-8) мае. % соответственно.As stabilizing additives, sucrose and peptone from soybeans are used in the final concentrations of (5-10) and (3-8) May. % respectively.
Сушку вакцины осуществляют путем ее замораживания в течение 18 час при температуре не выше минус 4O0C с последующей лиофилизацией в течение 48 час, причем, перед запайкой ампулы с вирусной вакциной заполняют инертным газом, в частности, аргоном. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины представляют собой реассортанты, получаемые в России на основе холодоадаптированных мутантов - доноров аттенуации A/Лeнингpaд/134/47/57 (H2N2) и B/CCCP/60/69. Эти доноры характеризуются холодоадаптированностью, т.е. способностью размножаться при пониженной температуре, температурочувствительностью и безвредностью для лабораторных животных и человека. Необходимым условием безвредности и генетической стабильности вакцинных штаммов считается наличие в составе их генома 5-6 мутантных генов, кодирующих внутренние белки донора аттенуации, при этом гены гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) всегда происходят от актуального эпидемического вируса. Штамм А/47/ Шaндoн/93/1(H1N1) получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма A/Лeнингpaд/134/47/57(H2N2) с эпидемическим штаммом A/Шaндoн/93/1(H1N1).Drying the vaccine is carried out by freezing it for 18 hours at a temperature not exceeding minus 4O 0 C followed by lyophilization for 48 hours, moreover, before sealing, the ampoules with the viral vaccine are filled with an inert gas, in particular argon. Vaccine strains of live influenza vaccine are reassortants obtained in Russia on the basis of cold-adapted mutant donors of attenuation A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) and B / CCCP / 60/69. These donors are characterized by cold adaptation, i.e. the ability to reproduce at low temperatures, temperature sensitivity and harmlessness for laboratory animals and humans. A necessary condition for the safety and genetic stability of vaccine strains is considered to be the presence of 5-6 mutant genes encoding the internal proteins of the attenuation donor in their genome, while the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes always come from the current epidemic virus. Strain A / 47 / Chandon / 93/1 (H1N1) was obtained by crossing the cold-adapted master strain A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) with the epidemic strain A / Chandon / 93/1 (H1N1).
Штамм вируса гриппа A/47/Иoгaннecбypг/94/2(HЗN2) получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма A/Лeнингpaд/134/47/57(H2N2) с эпидемическим штаммомThe influenza virus strain A / 47 / Johannesbyrg / 94/2 (HZN2) was obtained by crossing the cold-adapted master strain A / Leningrad / 134/47/57 (H2N2) with an epidemic strain
A/Иoгaннecбypг/94/2(HЗN2).A / Johannesbyrg / 94/2 (HZN2).
Штамм B/60/Пeтepбypг/95/20 получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма B/CCCP/60/69 с эпидемическим штаммом B/Пeтepбypг/95/20. Вакцинные штаммы вируса гриппа хранятся в Государственном научно- исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биопрепаратов (ГИСК) им. Л.А.Тарасевича, г. Москва.Strain B / 60 / Peterbyg / 95/20 was obtained by crossing a cold-adapted master strain B / CCCP / 60/69 with the epidemic strain B / Peterbyg / 95/20. Vaccine strains of the influenza virus are stored at the State Research Institute for Standardization and Control of Medical Biological Products (GISK) named after L.A. Tarasevich, Moscow.
Существенным преимуществом перевиваемых клеток является их стабильность, стандартность, возможность получения большого количества клеток-продуцентов в достаточно короткие сроки, долговременное использование клеток, относительно низкая стоимость вакцинных препаратов. Клеточные линии, аттестованные в соответствии с требованиями ВОЗ, свободны от контаминирующих агентов, в то время как куриные эмбрионы нередко содержат ретровирусы и некоторые другие агенты. При выращивании вирусов гриппа на перевиваемых линиях клеток, которые можно культивировать при использовании бессывороточных сред, исключается возможность аллергических реакций на вакцину у лиц с аллергией к компонентам клеток куриных эмбрионов и компонентам сыворотки, что также особенно важно при изготовлении живых гриппозных вакцин, которые не проходят такой тщательной очистки, как инактивированные гриппозные вакцины. Кроме того, гемагглютинин штаммов вируса гриппа человека, выделенных и культивируемых в куриных эмбрионах, может терять один из антигенных доменов, в то время как при выделении и культивировании вируса гриппа на линии клеток MDCK все антигенные домены сохраняются, и гемагглютинин таких изолятов антигенно полностью идентичен гемагглютинину вируса гриппа, размножающемуся в организме человека. Имеются также данные о том, что вакцины, приготовленные на клетках MDCK или Vеrо, лучше защищают вакцинированных животных от заражения вирулентными штаммами вируса гриппа, а также индуцируют более кросс-реактивные антитела, чем вакцины, полученные на куриных эмбрионах, которые больше стимулируют антитела, специфические к гомологичному антигену (Аlуmоvа L, Коdihаlli S., Gоvоrkоvа E. еt аl. Immuпоgепiсitу апd рrоtесtivе еffiсасу iп miсе оf iпfluепzа virus В vассiпеs grоwп iп mаmmаliап).A significant advantage of transplanted cells is their stability, standardization, the possibility of obtaining a large number of producer cells in a fairly short time, long-term use of cells, and the relatively low cost of vaccine preparations. WHO-certified cell lines are free of contaminating agents, while chicken embryos often contain retroviruses and some other agents. When growing influenza viruses on transplantable cell lines that can be cultured using serum-free media, it excludes the possibility of allergic reactions to the vaccine in people who are allergic to the components of chicken embryo cells and serum components, which is also especially important in the manufacture of live influenza vaccines that do not undergo such thorough cleaning as inactivated influenza vaccines. In addition, the hemagglutinin of human influenza virus strains isolated and cultured in chicken embryos may lose one of the antigenic domains, while the isolation and cultivation of the influenza virus on the MDCK cell line preserves all antigenic domains, and the hemagglutinin of such isolates is antigenically completely identical to hemagglutinin influenza virus that multiplies in the human body. There is also evidence that vaccines prepared on MDCK or Vero cells better protect vaccinated animals from infection with virulent influenza virus strains and also induce more cross-reactive antibodies than vaccines obtained on chicken embryos that stimulate antibodies specific for to the homologous antigen (Alumova L, Codihalli S., Govorkova E. et al. Immune aproprotect effisasu ip miise odfluepza virus Vassipes grpwa ipma mma).
Среди клеточных линий, потенциально пригодных для производства гриппозных вакцин, исследовались главным образом линия клеток MDCK, происходящая из клеток почек собаки, и линия клеток Vеrо, полученная из клеток почки африканской зеленой мартышки. В сравнительных опытах (Меrtеп О., Managuerra J., Hannoun C. еt аl. Рrоduсtiоп оf iпfluепzа virus iп сеll сulturеs fоr vассiпе рrераrаtiоп. In: Nоvеl Strаtеgiеs iп Dеsigп апd Рrоduсtiоп оf Vассiпеs. Еds. Соhеп S., Shаffеrmап А., Рlепшп Рrеss, N.- Y., 1996, рр 141-150) было показано, что клетки MDCK продуцируют одинаковое количество клеток в 2 раза быстрее, чем клетки Vеrо, и в 7 раз быстрее, чем клетки BHK. Что касается продукции гемагглютинина, то общее количество оказалось примерно одинаковым в клетках MDCK и Vеrо, однако в клетках MDCK это количество образуется на 6 день после заражения, а в клетках Vеrо - на 14. Гидролизат сои получают путем частичного гидролиза соевого изолятаAmong the cell lines potentially suitable for the production of influenza vaccines, mainly the MDCK cell line derived from dog kidney cells and the Vero cell line derived from African green monkey kidney cells were investigated. In comparative experiments (Mertep O., Managuerra J., Hannoun C. et al. Rupodtiop of ipfluepza virus ip sepulcultures for preserving reproduct. In: Novel Str. Rlepspres, N.-Y., 1996, pp 141-150) it was shown that MDCK cells produce the same number of cells 2 times faster than Vero cells and 7 times faster than BHK cells. As for the production of hemagglutinin, the total amount was approximately the same in MDCK and Vero cells, however, in MDCK cells this amount was formed on the 6th day after infection, and in Vero cells - by 14. Soy hydrolyzate is obtained by partial hydrolysis of soy isolate
Маisоl (Германия) в 0,1 нормальном растворе соляной кислоты при 2 избыточных атмосферах в автоклаве. Гидролизат из сои в указанных концентрациях является дополнительным питательным компонентом для культур клеток MDCK.Maisol (Germany) in 0.1 normal hydrochloric acid solution under 2 excess atmospheres in an autoclave. The soy hydrolyzate at the indicated concentrations is an additional nutritional component for MDCK cell cultures.
Папаин - растительный протеолитический фермент класса гидролаз, проявляет широкую субстратную специфичность и производится фирмойPapain is a plant proteolytic enzyme of the hydrolase class; it exhibits broad substrate specificity and is produced by the company
ICN, США. Папаин обеспечивает в питательной среде в указанных концентрациях гарантированное проникновение вируса гриппа в клетки MDCK в процессе их инфицирования указанным вирусом.ICN, USA. Papain provides in a nutrient medium at the indicated concentrations the guaranteed penetration of the influenza virus into MDCK cells during their infection with the indicated virus.
Микроносители обеспечивают в указанных концентрациях более высокую наработку клеток и вируса и больший выход вируссодержащего материала. В процессе экспериментальных исследований подобраны именно микроносители Цитодекс 1 фирмы Sigmа размером 1 мм, на поверхности которых формируются устойчивые монослои клеток MDCK, которые способны продуцировать вирус гриппа, не теряя своих физиологических функций.Microcarriers provide at the indicated concentrations higher production of cells and virus and a higher yield of virus-containing material. In the process of experimental studies, it was precisely the Sigma Cytodex 1 microcarriers that were selected that were 1 mm in size, on the surface of which stable monolayers of MDCK cells are formed, which are capable of producing the influenza virus without losing their physiological functions.
Бессывороточная питательная среда MDSS2 производится фирмой Ахсеvir, Франция. Варианты осуществления изобретенияThe serum-free nutrient medium MDSS2 is manufactured by Ahsevir, France. Embodiments of the invention
Ниже приведены примеры конкретного выполнения способа получения живой культуральной гриппозной вакцины.The following are examples of a specific implementation of the method for producing a live culture influenza vaccine.
Пример JVa 1. Аттестация культуры клеток MDCK. Для работы используют культуру клеток MDCK из посевного и рабочего банков. Аттестацию культуры клеток MDCK проводят в соответствии с требованиями ВОЗ к перевиваемым линиям клеток.Example JVa 1. Certification of MDCK cell culture. For work using a culture of MDCK cells from the seed and working banks. Certification of cell culture MDCK carried out in accordance with the requirements of the WHO for transplantable cell lines.
Исследована цитоморфология культуры в нативных и фиксированных препаратах в световом микроскопе. Показано, что культура клеток MDCK состоит из эпителиоподобных клеток. Ядра округлые с хроматиновой зернистостью. Ядрышки округлые, от одного до нескольких в ядре.The cytomorphology of culture in native and fixed preparations in a light microscope was studied. It was shown that the MDCK cell culture consists of epithelial-like cells. The nuclei are rounded with chromatin grit. Nuclei rounded, from one to several in the nucleus.
Цитоплазма зернистая. Имеются гигантские и многоядерные клетки, количество которых увеличивается в процессе культивирования. Клетки образуют монослой на 2 сутки культивирования, в то же время отмечается пик митотической активности, патологические митозы не наблюдаются.The cytoplasm is granular. There are giant and multinucleated cells, the number of which increases during cultivation. Cells form a monolayer on the 2nd day of cultivation, at the same time, a peak in mitotic activity is noted, pathological mitoses are not observed.
При проведении контроля культуральной жидкости методом посева на тиогликолевую среду установлено, что посевной и рабочий банки клеток MDCK обладают стерильностью.During the control of the culture fluid by the method of seeding on a thioglycol medium, it was found that the seed and working banks of MDCK cells are sterile.
Методом прямого посева культуральной жидкости посевного и рабочего банков клеток MDCK на селективные питательные среды и методом окраски ДНК интеркалирующими флюорохромами микоплазма не обнаружена. Для системы ПЦР-анализа использовали две пары праймеров (GPO-I и MGSO- для первого цикла; GPO-2 и МGSО-для второго цикла), которые позволяют выявить все известные виды микоплазм. Методом ПЦР-анализа микоплазма не обнаружена.Mycoplasma was not detected by direct inoculation of the culture fluid of the seed and working banks of MDCK cells on selective nutrient media and by DNA staining with intercalating fluorochromes. For the PCR analysis system, two pairs of primers were used (GPO-I and MGSO-for the first cycle; GPO-2 and MGSO-for the second cycle), which make it possible to identify all known types of mycoplasmas. Mycoplasma was not detected by PCR analysis.
Проведен контроль на выявление посторонних вирусов в культуре клеток, на куриных эмбрионах и на животных. При контроле посевного и рабочего банков на культуре клеток исследовали состояние монослоя интактных клеток посевного и рабочего банка в течение 14 суток. Цитопатического действия (ЦПД) не обнаружено. По истечении этого срока пробы культуральной жидкости исследовали в реакции гемагглютинации, а монослой в реакции гемадсорбции с эритроцитами морских свинок. Реакции отрицательные. Пробы культуральной жидкости исследовали в трех видах клеточных культур: MDCK (гомологичной), Л-68 (диплоидная культура), Vеrо в течение 14 суток. ЦПД не обнаружено. По истечении этого срока пробы культуральной жидкости исследовали в реакции гемагглютинации, а монослой - в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки. Реакции отрицательные. В посевном и рабочем банках линии MDCK цитопатогенных, гемадсорбирующих и гемагглютинирующих вирусов не обнаружено.A control was conducted to detect foreign viruses in cell culture, chicken embryos and animals. During the control of the inoculum and working banks on the cell culture, the state of the monolayer of intact cells of the inoculating and working banks was studied for 14 days. No cytopathic effect (CPP) was found. After this period, samples of the culture fluid were examined in a hemagglutination reaction, and the monolayer in the hemadsor sion reaction with guinea pig erythrocytes. The reactions are negative. Culture fluid samples were studied in three types of cell cultures: MDCK (homologous), L-68 (diploid culture), Vero for 14 days. No CPC detected. After this period, samples of the culture fluid were examined in a hemagglutination reaction, and the monolayer was studied in a hemadsorption reaction with guinea pig erythrocytes. The reactions are negative. In the seed and working banks of the MDCK line, no cytopathogenic, hemadsorbing and hemagglutinating viruses were detected.
При контроле посевного и рабочего банков на куриных эмбрионах исследуемый материал в количестве 106 клеток вводили в желточный мешок, аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку куриных эмбрионов (по 10 эмбрионов на точку), эмбрионы инкубировали в течение 7-10 сут, после чего определяли жизнеспособность эмбрионов и ставили реакцию гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. В посевном и рабочем банках линии MDCK посторонних вирусов не обнаружено.To control the seed and working banks on chicken embryos, the studied material in the amount of 10 6 cells was introduced into the yolk sac, allantoic cavity and the chorionallantoic membrane chicken embryos (10 embryos per point), the embryos were incubated for 7-10 days, after which the viability of the embryos was determined and a hemagglutination reaction with allantoic fluid was established. No foreign viruses were detected in the seed and working banks of the MDCK line.
При контроле посевного и рабочего банков на лабораторных животных исследуемый материал внутримышечно вводили мышам-сосункам в возрасте 24 час (28 голов мышей-сосунков, 107 клеток на группу), взрослым мышам (10 голов, 107 клеток на группу мышей), морским свинкам (5 голов, 107 клеток на группу), кроликам (5 голов, 107 клеток на группу животных), за животными проводили наблюдение в течение 28 дней, после чего проводили автоназию и осмотр внутренних органов. Все животные в эксперименте были живы, изменений внутренних органов не отмечено. Посторонних вирусов в посевном и рабочем банках клеток MDCK не обнаружено.When controlling the seed and working banks in laboratory animals, the studied material was intramuscularly administered to sucker mice at the age of 24 hours (28 heads of sucker mice, 10 7 cells per group), adult mice (10 goals, 10 7 cells per group of mice), and guinea pigs (5 animals, 10 7 cells per group), rabbits (5 animals, 10 7 cells per animal group), the animals were monitored for 28 days, after which autonasia and examination of the internal organs were performed. All animals in the experiment were alive, no changes in internal organs were noted. No extraneous viruses were found in the seed and working banks of MDCK cells.
Онкогенные потенции клеток посевного и рабочего банков определяли в системе iп vivо. При контроле использовали метод гетеротрансплантации клеток иммуносупрессивным животным в сравнительных опытах с эталонной клеточной линией HeIa, вызывающей прогрессирующий рост опухолей. За животными наблюдали в течение 21 суток. При этом все животные были живы, при макроскопическом исследовании на наличие опухоли в лимфатических узлах, печени, почках, легких и в месте введения клеток патологические изменения не выявлены. При контроле в системе iп vivо установлено, что клетки MDCK посевного и рабочего банков онкогенными потенциями не обладают.The oncogenic potencies of the cells of the seed and working banks were determined in the ip vivo system. In the control, the method of heterotransplantation of cells to immunosuppressive animals was used in comparative experiments with a reference HeIa cell line that causes progressive tumor growth. The animals were observed for 21 days. In this case, all animals were alive, with a macroscopic examination for the presence of a tumor in the lymph nodes, liver, kidneys, lungs and at the injection site, pathological changes were not detected. When monitoring in the ip vivo system, it was established that the MDCK cells of the seed and working banks do not possess oncogenic potentials.
Проведен контроль видовой идентичности клеток линии MDCK методом кариологического анализа и методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения изоферментов. При кариологическом анализе клеток линии MDCK установлено, что кариотип представляет из себя производную от нормального кариотипа собаки, Сапis fаmiliаris, 2n=78. Клетки MDCK характеризуются присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, по некоторым аутосомам отмечена трисомия (пары 29, 30, 38). Одна из X хромосом также не перестроена. Кроме того, клетки MDCK характеризуются присутствием маркерных хромосом, образованных в результате разнообразных транслокаций участков хромосом (предположительно X, 3, 4, 21, 23, 24, 28). Очевидных полиплоидов не отмечено. Клетки посевного и рабочего банков MDCK имеют достаточно стабильный кариотип, характеризующийся четкими морфологическими признаками. Проведен анализ электрофоретической подвижности изофермента Г-6-ФДГ. Клетки MDCK посевного и рабочего банков имеют Г-6-ФДГ, характерные для клеток собаки.The species identity of MDCK line cells was verified by karyological analysis and polyacrylamide gel electrophoresis to determine isoenzymes. In the karyological analysis of MDCK cells, it was found that the karyotype is a derivative of the normal dog karyotype, Сapis familiaris, 2n = 78. MDCK cells are characterized by the presence of normal (not rearranged) autosomes; trisomy was noted for some autosomes (pairs 29, 30, 38). One of the X chromosomes is also not rearranged. In addition, MDCK cells are characterized by the presence of marker chromosomes resulting from a variety of translocations of chromosome regions (presumably X, 3, 4, 21, 23, 24, 28). No obvious polyploids were noted. The cells of the seed and working banks of MDCK have a fairly stable karyotype, characterized by clear morphological characteristics. An analysis of the electrophoretic mobility of the G-6-FDG isoenzyme was carried out. The MDCK cells of the seed and worker banks have G-6-FDG characteristic of dog cells.
Пример JVa 2. Приготовление субстанции живой культуральной гриппозной вакцины (ЖГВ) Культуральный сосуд 1- или 10-литрового ферментера заполняют бессывороточной питательной средой. Аттестованную культуру клеток MDCK (в соответствии с примером 1) берут из банка коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Beктop» и вносят ее в указанный культуральный сосуд из расчета 100-600 тыс. клеток на мл питательной среды. Дополнительно в культуральный сосуд вносят микроноситель Цитодекс I в концентрации 1-6 г/л. Осаждение клеток на микроносителе проводят 12 часов при температуре 35-370C (объем заполнения культурального сосуда - 25-30 %). Режим посадки клеток: 5 мин перемешивание, 10 мин перерыв. Заданные параметры культивирования: частота вращения перемешивающего устройства 50-80 об/мин, аэрация поверхностная со скоростью продува от 0 до 10 л/час. Водородный показатель рН поддерживают в пределах от 6,9 до 7,2 с помощью дозированной подачи 7,5%-нoгo раствора углекислого натрия. Температура культивирования 35-370C. Перфузию питательной среды начинают при концентрации клеток 600-900 тыс/мл. Скорость перфузии зависит от концентрации клеток. Время культивирования клеток - 96-144 часа. После наработки клеток удаляют 50% среды, в суспензию вносят один из вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса 63Example JVa 2. Preparation of a living culture influenza vaccine (VHF) substance. A culture vessel of a 1 or 10 liter fermenter is filled with serum-free culture medium. A certified MDCK cell culture (in accordance with Example 1) is taken from a collection bank of cell cultures of the State Scientific Center of the WB Bektop and brought into the indicated culture vessel at the rate of 100-600 thousand cells per ml of culture medium. Additionally, the microcarrier Cytodex I is introduced into the culture vessel at a concentration of 1-6 g / l. Cell deposition on a microcarrier is carried out for 12 hours at a temperature of 35-37 0 C (the filling volume of the culture vessel is 25-30%). Cell planting mode: 5 min stirring, 10 min break. The specified cultivation parameters: the stirring device rotational speed is 50-80 rpm, surface aeration with a blowing rate from 0 to 10 l / h. The pH is maintained between 6.9 and 7.2 with a dosed supply of a 7.5% sodium carbonate solution. The cultivation temperature is 35-37 0 C. Perfusion of the nutrient medium begins at a cell concentration of 600-900 thousand / ml. The perfusion rate depends on the concentration of cells. The cell cultivation time is 96-144 hours. After the accumulation of cells, 50% of the medium is removed, one of the vaccine cold-adapted reassortants of the virus is introduced into the suspension 63
13thirteen
гриппа, например, A/47/Иoгaннecбypг/94/2 (HЗN2), с множественностью заражения 0,01-0,0001 ЭИД50/кл, и поддерживающую бессывороточную питательную среду, содержащую протеолитический фермент папаин в количестве 0,25-50,0 мкг/мл или трипсин в количестве 2,0-20,0 мкг/мл и гидролизат сои в концентрации 0,01-10%. Далее культивируют вирус при температуре (34+I)0C. При появлении цитопатического действия вируса на клетки (2-5 суток) осуществляют сбор вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 8,0 Ig ЭИД50/мл, которую освобождают фильтрованием от клеточного детрита. В вируссодержащую суспензию добавляют стерильный раствор стабилизатора (сахароза и пептон из сои в конечной концентрации 10% и 5% соответственно) для получения жидкого полуфабриката штамма A/47/Иoгaннecбyρг/94/2 (HЗN2) живой гриппозной вакцины (ЖГВ).influenza, for example, A / 47 / Johannesbyrg / 94/2 (HZN2), with a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EID 50 / cell, and supporting a serum-free nutrient medium containing the papain proteolytic enzyme in an amount of 0.25-50, 0 μg / ml or trypsin in an amount of 2.0-20.0 μg / ml and soy hydrolyzate in a concentration of 0.01-10%. Next, the virus is cultivated at a temperature of (34 + I) 0 C. When the cytopathic effect of the virus on the cells (2-5 days) occurs, a virus-containing liquid is collected with a specific activity of at least 8.0 Ig EID 50 / ml, which is released by filtration from cell detritus . A sterile stabilizer solution (sucrose and peptone from soybeans at a final concentration of 10% and 5%, respectively) is added to the virus-containing suspension to obtain a liquid semi-finished product of strain A / 47 / Johannesbyg / 94/2 (HZN2) of the live influenza vaccine (GHV).
Таким же образом параллельно или последовательно нарабатывают жидкий полуфабрикат вакцинных штаммов холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа A/47/Шaндoн/93/l (HlNl) и B/60/Пeтepбypг/95/20.In the same way, liquid semi-finished vaccine strains of cold-adapted reassortants of the influenza virus A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) and B / 60 / Peterbyg / 95/20 are produced in parallel or sequentially.
Примечание: ЭИД- эмбриональная инфекционная доза.Note: EID is an embryonic infectious dose.
Пример JVs 3. Получение готовой формы ЖГВExample JVs 3. Obtaining the finished form of PHA
Для получения трехвалентной вакцины перед розливом жидкие полуфабрикаты, полученные из вируссодержащей жидкости вакцинных штаммов A/47/Иoгaннecбypг/94/2 (HЗN2), A/47/Шaндoн/93/l (HlNl) и B/60/Пeтepбypг/95/20 вируса гриппа, объединяют в равных пропорциях. Для получения моновакцины используют жидкий полуфабрикат одного из выше приведенных штаммов вируса гриппа. Полученную жидкую форму вакцины разливают в ампулы по 0,6 мл в каждую и замораживают при температуре не выше минус 4O0C в течение 18 час. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 час в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном) и запаивают. Пример JVa 4. Определение специфической активности препаратов живой гриппозной вакциныTo obtain the trivalent vaccine before bottling, liquid semi-finished products obtained from the virus-containing liquid of vaccine strains A / 47 / Johannesbyrg / 94/2 (HZN2), A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) and B / 60 / Peterbyg / 95/20 influenza virus, are combined in equal proportions. To obtain a single vaccine, a liquid semi-finished product of one of the above strains of the influenza virus is used. The resulting liquid form of the vaccine is poured into ampoules of 0.6 ml each and frozen at a temperature not exceeding minus 4O 0 C for 18 hours. The product is freeze-dried for 48 hours under sterile conditions. After drying, the ampoules are filled with an inert gas (argon) and sealed. Example JVa 4. Determination of the specific activity of preparations of live influenza vaccine
Специфическую активность вируссодержащего материала определяют в моновакцинах до сведения в трехвалентную вакцину, полученных одновременно с тривакциной, путем титрования на куриных эмбрионах по методике, изложенной в (Методические указания «Meтoды контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям». МУК 4.1/4.2.588-96). Специфическая активность вакцины после лиофилизации составляет не менее 6,0-6,5 Ig ЭИД5o/O,2мл.The specific activity of the virus-containing material is determined in monovaccines to the information of the trivalent vaccine obtained simultaneously with the trivaccine, by titration on chicken embryos according to the method described in (Methodological instructions "Methods of control of medical immunobiological preparations administered to people." MUK 4.1 / 4.2.588-96 ) The specific activity of the vaccine after lyophilization is not less than 6.0-6.5 Ig EID 5 o / O, 2 ml.
Пример JVs 5. Изучение динамики размножения вируса гриппа при разной множественности заражения на примере штаммаExample JVs 5. The study of the dynamics of reproduction of the influenza virus with different multiplicity of infection on the example of a strain
A/47/Шaндoн/93/l (HlNl) вируса гриппаA / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) of influenza virus
Культуру клеток MDCK заражают штаммом A/47/Шaндoн/93/l (HlNl) вируса гриппа при разной множественности заражения (0,001;The MDCK cell culture is infected with strain A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) of influenza virus with different multiplicity of infection (0.001;
0,005, 0,0005 и 0,0001 ЭИД5(/кл) и культивируют в среде Игла MEM или в бессывороточной среде в присутствии 1-6 мкг/мл трипсина. При множественности заражения 0,005 и 0,001 ЭИД5o/кл максимальный титр вируса при использовании среды Игла MEM (при использовании в составе ростовой среды для посадки клеток 5% фетальной сыворотки) достигается уже на 2-3 сутки, а в случае бессывороточной среды - только на 3-4 сутки, но титры были выше на 1-1,5 Ig (Таблица 1). Уменьшение множественности до 0,0005 ЭИД5o/кл приводит к сдвигу максимальных титров еще на 1 сутки ( для штамма A/47/Шaндoн/93/l (HlNl) при использовании сыворотки для посадки клеток максимальный титр был на0.005, 0.0005 and 0.0001 EID 5 (/ cell) and cultured in MEM Eagle medium or serum-free medium in the presence of 1-6 μg / ml trypsin. With a multiplicity of infection of 0.005 and 0.001 EID 5 o / cl, the maximum titer of the virus when using Medium Needle MEM (when used in the growth medium for planting cells of 5% fetal serum) is reached already for 2-3 days, and in the case of serum-free medium - only on 3-4 days, but the titers were higher by 1-1.5 Ig (table 1). A decrease in the multiplicity to 0.0005 EID 5 o / cell leads to a shift in the maximum titers by 1 more day (for strain A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) when using serum for planting cells, the maximum titer was
4-е сутки и составлял 1010'5 ЭИД5o/мл, при использовании бессывороточной среды - на 5-е сутки, титр равен 109'5 ЭИД5o/мл). Дальнейшее уменьшение множественности инфекции не способствует увеличению инфекционных титров в течение 5 суток эксперимента. Таблица 14th day and amounted to 10 10 ' 5 EID 5 o / ml, when using serum-free medium - on the 5th day, the titer is 10 9 ' 5 EID 5 o / ml). A further decrease in the multiplicity of infection does not contribute to an increase in infectious titers within 5 days of the experiment. Table 1
Динамика накопления вируса гриппа A/47/Шaндoн/93/l (HlNl) в культуре клеток MDCK при разной множественности зараженияThe dynamics of the accumulation of influenza A / 47 / Chandon / 93 / l (HlNl) in the MDCK cell culture with different multiplicity of infection
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
Пример JVs 6. Изучение стабильности ts~ 4oи и са 25 генетических признаковExample JVs 6. The study of the stability of ts ~ 4 o and and ca 25 genetic traits
У всех трех холодоадаптированных штаммов вируса гриппа изучали стабильность ts" 4o (неспособность размножаться при 4O0C) и ca+ 25 (способность к размножению при 250C) генетических признаков в течение 5 пассажей в монослойных культурах клеток MDCK при 340C в присутствии 1-6 мкг/мл трипсина. Проверку этих признаков осуществляли путем параллельного титрования на куриных эмбрионах штаммов вируса гриппа после каждого из пяти пассажей на культуре клеток MDCK. Варианты, полученные после 5 пассажей в клетках MDCK, сохраняли высокую репродуктивность в куриных эмбрионах при оптимальной температуре (340C), а также бляшкообразующую способность в системе клеток MDCK, свойственную исходным штаммам. Все три штамма на всех пассажах, включая пятый, сохранили способность размножаться при 250C, т.е. ca+ 25 признак, и не размножались при 4O0C, т.е. сохранили ts" 4o признак (Таблица X). Таблица 2All three cold-adapted influenza virus strains studied the stability of ts "4 o (inability to replicate at 4O 0 C) and ca + 25 (ability to grow at 25 0 C) genetic traits for 5 passages in monolayer cultures of MDCK cells at 34 0 C in in the presence of 1-6 μg / ml trypsin, these signs were tested by parallel titration of the influenza virus strains on chicken embryos after each of five passages on an MDCK cell culture. Options obtained after 5 passages on MDCK cells maintained high reproduction in chicken mbrionah at optimum temperature (34 0 C), and the plaque forming ability in MDCK cell system intrinsic baseline strains. All three strains in all passages, including fifth, retained the ability to proliferate at 25 0 C, i.e. ca + 25 feature and did not breed at 4O 0 C, i.e. they kept the ts " 4 o trait (Table X). table 2
Сохранение са- и ts-фенотипа реассортантов вируса гриппа в течение 5 последовательных пассажей в культуре клеток MDCKPreservation of the ca- and ts-phenotype of reassortants of the influenza virus for 5 consecutive passages in the culture of MDCK cells
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0001
Пример JNa 7. Изучение влияния фермента папаина на культивирование холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса гриппа С целью замены компонентов животного происхождения в технологии получения живой гриппозной вакцины на препараты растительного происхождения проведены исследования по использованию фермента папаин растительного происхождения при наработке штаммов вируса гриппа. Для этого в поддерживающую среду, используемую при культивировании штаммов вируса гриппа, добавляют папаин. Данные приведены в таблице 3. Таблица 3Example JNa 7. Study of the effect of the papain enzyme on the cultivation of cold-adapted vaccine strains of the influenza virus In order to replace the components of animal origin in the technology for producing live influenza vaccine with herbal preparations, studies were carried out on the use of the plant papain enzyme in the production of influenza virus strains. To do this, papain is added to the support medium used in the cultivation of influenza virus strains. The data are shown in table 3. Table 3
Динамика накопления вируса гриппа A/H1N1 в культуре клеток MDCK в присутствии папаинаThe dynamics of the accumulation of influenza A / H1N1 virus in an MDCK cell culture in the presence of papain
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0001
Анализ таблицы 3 показывает, что при концентрации папаина в поддерживающей среде, равной 0,25-20,0 мкг/мл, титр вируса гриппа на 3 - 4 сутки культивирования составлял 7,3- 8,5 Ig ЭИД5(/мл, в то время как в контрольном эксперименте (без введения фермента в поддерживающую среду) титр вируса гриппа был равен 6,5-6,7 Ig ЭИД5o/мл, что подтверждает эффективность действия указанного фермента. The analysis of table 3 shows that at a concentration of papain in a support medium of 0.25-20.0 μg / ml, the titer of the influenza virus on 3-4 days of cultivation was 7.3-8.5 Ig EID 5 (/ ml, while in the control experiment (without introducing the enzyme into the supporting medium) the titer of the influenza virus was 6.5-6.7 Ig EID 5 o / ml, which confirms the effectiveness of the specified enzyme.

Claims

Формула изобретения 1. Способ получения живой культуралыюй гриппозной вакцины, включающий культивирование перевиваемых клеток MDCK в питательной среде, получение вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на этой же питательной среде, очистку вирусной субстанции от балластных примесей, введение в очищенную субстанцию стабилизирующих добавок и сушку готовой формы вакцины, отличающийся тем, что в качестве вирусных штаммов используют вакцинные холодоадаптированные реассортанты штаммов вирусов гриппа, в качестве питательной среды при культивировании клеток MDCK и штаммов вирусов гриппа на указанных клетках используют бессывороточную питательную среду с добавлением гидролизата сои в концентрации 0,01-10% и протеолитического фермента в количестве 0,25-50,0 мкг/мл до введения посевной дозы штаммов вирусов гриппа, а культивирование культур клеток MDCK и холодоадаптированных штаммов вируса гриппа в указанной культуре клеток осуществляют в суспензии на микроносителях, вносимых в бессывороточную питательную среду в концентрации 1-6 г/л.SUMMARY OF THE INVENTION 1. A method for producing a live culture influenza vaccine, including cultivating transplantable MDCK cells in a nutrient medium, preparing a virus-containing substance by culturing vaccine strains of the influenza virus in an MDCK cell culture on the same nutrient medium, purifying the viral substance from ballast impurities, introducing it into a purified substance stabilizing additives and drying of the finished vaccine form, characterized in that cold-adapted vaccine reassortants are used as viral strains strains of influenza viruses, as a culture medium for the cultivation of MDCK cells and strains of influenza viruses on these cells, use a serum-free culture medium with the addition of soy hydrolyzate in a concentration of 0.01-10% and a proteolytic enzyme in an amount of 0.25-50.0 μg / ml before the introduction of a seeding dose of influenza virus strains, and the cultivation of MDCK cell cultures and cold-adapted influenza virus strains in the specified cell culture is carried out in suspension on microcarriers introduced into serum-free nutrient medium in a concentrate radios 1-6 g / l.
2. Способ по п.l, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве культуры клеток MDCK используют культуру, заложенную на хранение при температуре жидкого азота в виде посевного и рабочего банков и аттестованную на отсутствие посторонних вирусов, онкогенную потенцию и видовую идентичность.2. The method according to claim 1, with the fact that as a culture of MDCK cells, a culture stored at liquid nitrogen temperature in the form of a seed and working banks and certified for the absence of extraneous viruses is used , oncogenic potency and species identity.
3. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа используют вакцинные штаммы типа A/HЗN2; A/H1N1 и типа В этого вируса. 3. The method according to claim 1, with the fact that in the capacity of vaccine cold-adapted reassortants of the influenza virus, vaccine strains of type A / HZN2 are used; A / H1N1 and type B of this virus.
4. Способ по п.1, отл ич аю щи й с я тем, что посевная доза перевиваемых клеток MDCK составляет 100-600 тыс. клеток на 1 мл среды.4. The method according to claim 1, distinguished by the fact that the seeding dose of transplantable MDCK cells is 100-600 thousand cells per 1 ml of medium.
5. Способ по п.l, отл ич аю щий ся тем, что посевная доза вакцинных штаммов вируса гриппа имеет множественность заражения 0,01-0,0001 ЭИД50/кл.5. The method according to claim 1, wherein the inoculum dose of vaccine strains of the influenza virus has a multiplicity of infection of 0.01-0.0001 EID 50 / cell.
6. Способ по п.l, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве протеолитического фермента используют протеолитический фермент растительного происхождения папаин. 6. The method according to claim 1, with the fact that as a proteolytic enzyme, the proteolytic enzyme of plant origin papain is used.
7. Способ по п.l, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве микроносителя используют Цитодекс 1.7. The method according to claim 1, with the fact that Cytodex 1 is used as a microcarrier.
8. Способ по п.l, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что сбор вируссодержащей жидкости осуществляют после достижения специфической активности вируса гриппа не менее 8,0 Ig ЭИД5o/мл. 8. The method according to claim 1, wherein the collection of the virus-containing fluid is carried out after the specific activity of the influenza virus is not less than 8.0 Ig EID 5 o / ml.
9. Способ по п.l, отличающийся тем, что удаление балластных примесей из вирусной субстанции осуществляют фильтрованием. 9. The method according to claim 1, characterized in that the removal of ballast impurities from the viral substance is carried out by filtration.
10. Способ по п.l, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве стабилизирующих добавок используют сахарозу и пептон из сои в конечной концентрации (5-10) и (3-8) мае. % соответственно. 10. The method according to claim 1, with the fact that sucrose and peptone from soybeans are used as stabilizing additives in the final concentrations of (5-10) and (3-8) May. % respectively.
11. Способ по п.l, отличаю щийся тем, что сушку вакцины осуществляют путем ее замораживания в течение 18 час при температуре не выше минус 4O0C с последующей лиофилизацией в течение 48 час, причем, перед запайкой ампулы с вирусной вакциной заполняют инертным газом, в частности, аргоном. 11. The method according to p. 1, characterized in that the vaccine is dried by freezing it for 18 hours at a temperature not exceeding minus 4O 0 C followed by lyophilization for 48 hours, moreover, before sealing, the ampoules with the viral vaccine are filled with inert gas in particular argon.
PCT/RU2003/000263 2003-06-18 2003-06-18 Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus WO2004110484A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2003/000263 WO2004110484A1 (en) 2003-06-18 2003-06-18 Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2003/000263 WO2004110484A1 (en) 2003-06-18 2003-06-18 Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004110484A1 true WO2004110484A1 (en) 2004-12-23

Family

ID=33550542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2003/000263 WO2004110484A1 (en) 2003-06-18 2003-06-18 Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2004110484A1 (en)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1862537A1 (en) * 2005-03-10 2007-12-05 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine
JP2008525025A (en) * 2004-12-23 2008-07-17 メッドイミューン バクシーンズ,インコーポレイティド Non-tumorigenic MDCK cell line for virus propagation
US8202726B2 (en) 2008-09-24 2012-06-19 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
CN102660511A (en) * 2012-05-17 2012-09-12 肇庆大华农生物药品有限公司 Method for reducing pancreatin inhibitor in serum and application of serum
US8357376B2 (en) 2006-09-15 2013-01-22 Memimmune, LLC Method of purifying influenza virus and removing MDCK cell DNA contaminants
CN107460156A (en) * 2016-06-03 2017-12-12 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 The serum-free strain of suspension mdck cell and its application in influenza virus is produced entirely
RU2701959C1 (en) * 2018-12-28 2019-10-02 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Method of controlling production of a vaccine against influenza
RU2701953C1 (en) * 2018-12-28 2019-10-02 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Method of producing a polyvalent influenza vaccine
RU2706191C1 (en) * 2018-12-28 2019-11-14 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Multivalent influenza vaccine
RU2706544C1 (en) * 2018-12-28 2019-11-19 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Concentrate of influenza vaccine and method for its preparation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2068271C1 (en) * 1992-11-16 1996-10-27 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН Attenuated cold-adapted strain of influenza virus b/leningrad/14/17/55 for living influenza vaccine strain preparing
RU2128223C1 (en) * 1997-05-07 1999-03-27 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН Strain a/17/nanchang/95/4 (h3n2) for production of living an antiinfluenza intranasal vaccine for adults
RU2130069C1 (en) * 1997-03-14 1999-05-10 Институт элементоорганических соединений им.А.Н.Несмеянова РАН Method of virus concentrating
RU2151185C1 (en) * 1998-12-10 2000-06-20 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН Strain of influenza virus a/47/johannesburg/96/7/7 (h1n1) for producing live anti-influenzal intranasal vaccine for children
US6344354B1 (en) * 1994-08-23 2002-02-05 St. Jude Children's Research Hospital Influenza virus replicated in mammalian cell culture and vaccine production

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2068271C1 (en) * 1992-11-16 1996-10-27 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН Attenuated cold-adapted strain of influenza virus b/leningrad/14/17/55 for living influenza vaccine strain preparing
US6344354B1 (en) * 1994-08-23 2002-02-05 St. Jude Children's Research Hospital Influenza virus replicated in mammalian cell culture and vaccine production
RU2130069C1 (en) * 1997-03-14 1999-05-10 Институт элементоорганических соединений им.А.Н.Несмеянова РАН Method of virus concentrating
RU2128223C1 (en) * 1997-05-07 1999-03-27 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН Strain a/17/nanchang/95/4 (h3n2) for production of living an antiinfluenza intranasal vaccine for adults
RU2151185C1 (en) * 1998-12-10 2000-06-20 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН Strain of influenza virus a/47/johannesburg/96/7/7 (h1n1) for producing live anti-influenzal intranasal vaccine for children

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRESHNI P.M., KULTURA ZIVOTNYKH KLETOK. METHODS, 1989, MIR, pages 17-18,40 - 42,51-52,87-91 *
KOZLOV JU.A.: "Pitatelnye sredy v meditsinskoi mikrobiologii M.", MEDGIZ., 1950, pages 110 - 111 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008525025A (en) * 2004-12-23 2008-07-17 メッドイミューン バクシーンズ,インコーポレイティド Non-tumorigenic MDCK cell line for virus propagation
US7670837B2 (en) 2004-12-23 2010-03-02 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
US8119388B2 (en) 2004-12-23 2012-02-21 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
JP2012210225A (en) * 2004-12-23 2012-11-01 Medimmune Llc Non-tumorigenic mdck cell line for propagating virus
US8748174B2 (en) 2004-12-23 2014-06-10 Medimmune, Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for propagating viruses
EP1862537A4 (en) * 2005-03-10 2009-01-21 Kyoritsu Seiyaku Corp Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine
US7910366B2 (en) 2005-03-10 2011-03-22 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell strain capable of being cultured without ingredients derived from animals, method of producing the same, method of producing virus using the same, and method of producing vaccine
EP1862537A1 (en) * 2005-03-10 2007-12-05 Kyoritsu Seiyaku Corporation Cell line culturable without aminal-derived component, method for establishment thereof, method for production of virus using the cell line and method for production of vaccine
US8846032B2 (en) 2006-09-15 2014-09-30 Medimmune, Llc MDCK cell lines supporting viral growth to high titers and bioreactor process using the same
US8357376B2 (en) 2006-09-15 2013-01-22 Memimmune, LLC Method of purifying influenza virus and removing MDCK cell DNA contaminants
US8202726B2 (en) 2008-09-24 2012-06-19 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
US9085753B2 (en) 2008-09-24 2015-07-21 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
CN102660511B (en) * 2012-05-17 2013-08-21 肇庆大华农生物药品有限公司 Method for reducing pancreatin inhibitor in serum and application of serum
CN102660511A (en) * 2012-05-17 2012-09-12 肇庆大华农生物药品有限公司 Method for reducing pancreatin inhibitor in serum and application of serum
CN107460156A (en) * 2016-06-03 2017-12-12 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 The serum-free strain of suspension mdck cell and its application in influenza virus is produced entirely
CN107460156B (en) * 2016-06-03 2022-03-11 兆丰华生物科技(南京)有限公司北京生物医药科技中心 Serum-free full-suspension MDCK cell strain and application thereof in production of influenza virus
RU2701959C1 (en) * 2018-12-28 2019-10-02 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Method of controlling production of a vaccine against influenza
RU2701953C1 (en) * 2018-12-28 2019-10-02 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Method of producing a polyvalent influenza vaccine
RU2706191C1 (en) * 2018-12-28 2019-11-14 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Multivalent influenza vaccine
RU2706544C1 (en) * 2018-12-28 2019-11-19 Общество с ограниченной ответственностью "Нанолек" Concentrate of influenza vaccine and method for its preparation

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100968141B1 (en) Multiplication of viruses in a cell culture
ES2352638T3 (en) ANIMAL CELLS AND REPLICATION PROCEDURES OF THE VIRUS OF THE FLU.
ES2367081T3 (en) PROCEDURE FOR THE REPLICATION OF VIRUSES OF THE FLU IN CELL CULTURE AND THE VIRUSES OF THE FLU THAT CAN BE OBTAINED BY THE PROCEDURE.
US10329536B2 (en) Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an MDCK cell suspension culture
WO2004110484A1 (en) Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus
BRPI0914805B1 (en) method for replicating viruses in a scldk cell culture, process for adapting substrate-dependent cldk cells for suspension development, method for continuously propagating suspended scldk cells, and, composition
RU2420314C1 (en) Method of obtaining life culture vaccine against influenza virus
RU2330885C2 (en) Method of production of live culture influenza virus vaccines
CN1617882B (en) Method of isolation and purification of trypsin from pronase protease and use thereof
CN117070476B (en) Bovine herpesvirus 4 strain and application thereof in preparation of inactivated vaccine
SU1317021A1 (en) Manъs embryo skin and muscle diploid cells strain used for cultivating viruses
Nechaeva et al. Development of Pilot Technology for Cell-Based Anti-Influenza Live Attenuated Pandemic Vaccine Manufacturing
Mazurkova et al. Use of Plant-Derived Protease to Design of Live Cultural Influenza Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA CN IN JP KR RU US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006110264

Country of ref document: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP