RU2130069C1 - Method of virus concentrating - Google Patents
Method of virus concentrating Download PDFInfo
- Publication number
- RU2130069C1 RU2130069C1 RU97103958A RU97103958A RU2130069C1 RU 2130069 C1 RU2130069 C1 RU 2130069C1 RU 97103958 A RU97103958 A RU 97103958A RU 97103958 A RU97103958 A RU 97103958A RU 2130069 C1 RU2130069 C1 RU 2130069C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- sorbent
- bioaffinity
- immobilized
- antibodies
- Prior art date
Links
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к прикладной вирусологии, конкретно к процессам выделения, очистки, идентификации, модификации вирусов и вирусных препаратов, т. е. к процессам, связанным с концентрированием вирусов. Изобретение может быть использовано как в научных исследованиях, так и при производстве вакцин и диагностикумов, а также в медицинской практике. The invention relates to applied virology, specifically to the processes of isolation, purification, identification, modification of viruses and viral preparations, i.e., to processes associated with the concentration of viruses. The invention can be used both in scientific research and in the production of vaccines and diagnostics, as well as in medical practice.
Известными методами концентрирования вирусных частиц в современной вирусологии являются многоступенчатые операции длительного высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или глицерина, а также зонного электрофореза и др. [1], кроме того используется концентрирование вирусов с помощью биоаффинных сорбентов, содержащих иммобилизованные антитела к вирусу [2]. Последний подход характеризуется большей эффективностью и технологическими удобствами. Known methods for the concentration of viral particles in modern virology are multistage operations of long-term high-speed centrifugation in the density gradient of sucrose or glycerol, as well as zone electrophoresis and others [1], in addition, virus concentration is used using bioaffinity sorbents containing immobilized antibodies to the virus [2] . The latter approach is characterized by greater efficiency and technological convenience.
Так, известен способ биоаффинной очистки вируса кори, где используют носитель, содержащий иммуноглобулины сыворотки крови обезьян, ковалентно пришитые к поверхности модифицированных стеклянных бусинок [3]. Способ включает пропускание вирусосодержащей жидкости через хроматографическую колонку, заполненную биоаффинным сорбентом с иммуноглобулинами, ковалентно-пришитыми к стеклянному носителю, с последующей промывкой колонки 0,14М раствором NaCl и элюированием вируса 0,1М глициновым буфером при pH 2,3. Thus, a method for bioaffinity purification of measles virus is known, where a carrier is used containing monkey serum immunoglobulins, covalently sewn to the surface of modified glass beads [3]. The method includes passing a virus-containing liquid through a chromatographic column filled with a bio-affinity sorbent with immunoglobulins covalently attached to a glass carrier, followed by washing the column with 0.14 M NaCl and eluting the virus with 0.1 M glycine buffer at pH 2.3.
Недостатками такого способа является низкая биоспецифическая емкость используемого носителя (работает только поверхность стеклянных гранул), неспецифическая адсорбция стеклом посторонних примесей и хрупкость, характерные для стеклянных носителей вообще. The disadvantages of this method are the low biospecific capacity of the carrier used (only the surface of the glass granules works), nonspecific adsorption of impurities by the glass, and the fragility characteristic of glass carriers in general.
Известен способ биоаффинной очистки вирусов разных размеров, где для очистки вируса используется силикагель с контролируемыми размерами пор (0,05 - 1,0 мкм) с привитыми аффинными лигандами [4]. Способ состоит из аналогичных операций хроматографической очистки целевого продукта, что и в предыдущем случае, только для промывания используют 0,1М Na-фосфатный буфер (pH 7,0), а для элюирования применяют 0,05М Na-цитратный буфер (pH 3,0). There is a method of bioaffinity purification of viruses of various sizes, where silica gel with controlled pore sizes (0.05 - 1.0 μm) with grafted affinity ligands is used to purify the virus [4]. The method consists of similar chromatographic purification operations of the target product as in the previous case; only 0.1 M Na-phosphate buffer (pH 7.0) is used for washing, and 0.05 M Na-citrate buffer (pH 3.0 is used for elution) )
Недостатками этого способа являются сложность получения иммуносорбента, связанная с многостадийной схемой модификации неорганического носителя, а также характерная для таких материалов хрупкость. Кроме того, в рабочих жидкостях даже со слабощелочной реакцией среды (pH 7,5-8,5) кремнеземные матрицы гидролитически нестабильны, что приводит к растворению активной поверхности и прогрессивному снижению биоспецифической емкости. The disadvantages of this method are the difficulty of obtaining an immunosorbent associated with a multi-stage scheme for the modification of an inorganic carrier, as well as the fragility characteristic of such materials. In addition, in working fluids, even with a slightly alkaline reaction of the medium (pH 7.5-8.5), silica matrices are hydrolytically unstable, which leads to dissolution of the active surface and a progressive decrease in biospecific capacity.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является выбранный в качестве прототипа способ очистки вируса сумчатой болезни цыплят путем его сорбционного концентрирования при пропускании вирусосодержащих суспензий через колонку с иммуносорбентом, представляющим собой нерастворимый носитель - гранулированный агарозный гель (коммерческое название - сефароза-4B), к которому после активации бромцианом ковалентно пришиты иммуноглобулины [5] . Такой биоаффинный сорбент используют для чистки не очень крупных вирусов, размеры которых ее превышают 0,08 мкм. The closest to the proposed technical essence is the method of purification of the marsupial disease of chickens virus selected as a prototype by its sorption concentration by passing virus-containing suspensions through a column with immunosorbent, which is an insoluble carrier - granular agarose gel (commercial name - sepharose-4B), to which after activation by bromine, immunoglobulins are covalently sewn [5]. Such a bioaffinity sorbent is used to clean not very large viruses, the size of which exceeds 0.08 μm.
Однако указанный способ концентрирования вируса малоэффективен при работе с крупными (0,1-0,5 мкм) вирусами. Кроме того, гранулированные агарозные гели, в частности сефароза, имеют высокую стоимость и поэтому не могут найти крупномасштабного применения. Бромциан, используемый для активации данного носителя является высокотоксичным соединением, работа с ним представляет опасность для персонала. However, this method of concentrating the virus is ineffective when working with large (0.1-0.5 microns) viruses. In addition, granular agarose gels, in particular Sepharose, have a high cost and therefore cannot find large-scale application. Bromocyan used to activate this carrier is a highly toxic compound, work with it is a danger to personnel.
Задача предлагаемого изобретения - разработка эффективного, универсального и технологически упрощенного способа концентрирования различных вирусов, в том числе и самых крупных вирусов с размером частиц до 0,5 мкм. The objective of the invention is the development of an effective, universal and technologically simplified method for the concentration of various viruses, including the largest viruses with a particle size of up to 0.5 microns.
Решение этой задачи достигается тем, что при концентрировании вируса путем его связывания биоаффинным сорбентом, содержащим антитела к вирусу, иммобилизованные на полимерной основе, промывку и последующую десорбцию, в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента используют криогель поливинилового спирта с размером пор 0,04 - 2,0 мкм. Кроме того, биоаффинный сорбент может, согласно данному изобретению, содержать, наряду с антителами, иммобилизованные ферменты, модифицирующие вирус. The solution to this problem is achieved by the fact that when the virus is concentrated by binding with a bio-affinity sorbent containing antibodies to the virus, immobilized on a polymer basis, washing and subsequent desorption, polyvinyl alcohol cryogel with a pore size of 0.04 - 2 is used as the polymer base of the bio-affinity sorbent. 0 microns. In addition, the bio-affinity sorbent may, according to this invention, contain, along with antibodies, immobilized virus-modifying enzymes.
Оказалось, что выбор криогеля поливинилового спирта (ПВС) в качестве полимерной основы биоаффинного сорбента обеспечивает возможность технологического упрощения способа концентрирования вируса, повышение эффективности способа в целом, его универсальности, в том числе и в отношении самых крупных вирусов с размером частиц до 0,5 мкм. It turned out that the choice of cryogel of polyvinyl alcohol (PVA) as the polymer base of the bio-affinity sorbent provides the possibility of technological simplification of the method of concentration of the virus, increasing the efficiency of the method as a whole, its versatility, including with respect to the largest viruses with a particle size of up to 0.5 microns .
Весьма важными свойствами криогелей ПВС является их биосовместимость, отсутствие токсичности, а также его доступностью и относительная дешевизна. Криогели ПВС образуются в результате замораживания концентрированных водных растворов ПВС, их выдерживания в замороженном состоянии в течение определенного времени и последующего оттаивания [6]. Сформированный таким образом макропористый криогель устойчив при температурах до 60-65oC и имеет температуру плавления 80-100oC. Он обладает выраженной макропористостью [6], т.е. отвечает одному из основных требований, предъявляемых к носителям, предназначенным для работы с вирусами. Согласно предлагаемому изобретению в качестве полимерной основы биоафинного сорбента предусматривается использование криогеля ПВС, имеющего поры размером 0,05-2,0 мкм. Такие поры обеспечивают свободное проникновение даже самых крупных вирусов внутрь гранул носителя, т. е. в связывании с вирусами участвуют аффинные лиганды всего объема носителя.Very important properties of PVA cryogels are their biocompatibility, lack of toxicity, as well as its availability and relative cheapness. PVA cryogels are formed as a result of freezing concentrated aqueous solutions of PVA, keeping them frozen for a certain time and subsequent thawing [6]. Thus formed macroporous cryogel is stable at temperatures up to 60-65 o C and has a melting point of 80-100 o C. It has a pronounced macroporosity [6], ie meets one of the basic requirements for media designed to work with viruses. According to the invention, the use of a PVA cryogel having pores of 0.05-2.0 μm in size is provided as the polymer base of the bioaffinity sorbent. Such pores provide free penetration of even the largest viruses into the granules of the carrier, i.e., affinity ligands of the entire volume of the carrier participate in binding to viruses.
Кроме того, в противоположность хрупким макропористым неорганическим матрицам (макропористые стекла, кремнеземы, диатомит и др.) криогели ПВС являются нехрупкими вязкоупругими физическими телами, мало подверженными абразивному износу даже при интенсивном перемешивании. Таким образом, криогели ПВС наряду с макропористостью удовлетворяют и требованию операционной стабильности. И, наконец, криогели ПВС могут, в случае необходимости, подвергаться стерилизации, например, промывке дезинфицирующими растворами, облучению или (для уничтожения отработанного материала) автоклавированию. In addition, in contrast to brittle macroporous inorganic matrices (macroporous glasses, silicas, diatomite, etc.), PVA cryogels are non-brittle viscoelastic physical bodies, little susceptible to abrasive wear even with vigorous stirring. Thus, along with macroporosity, PVA cryogels satisfy the requirement of operational stability. And finally, PVA cryogels can, if necessary, be sterilized, for example, rinsed with disinfectant solutions, irradiated or (to destroy waste material) autoclaved.
Способ осуществляют следующим образом: вирусосодержащую жидкость инкубируют с биоаффинным сорбентом, содержащим специфические антитела, иммобилизованные на активированной матрице криогеля ПВС, отмывают несвязавшиеся посторонние компоненты и освобождают адсорбированный вирус из комплекса с биоаффинным сорбентом. Для модификации вируса используют биоаффинный сорбент, содержащий соиммобилизованные специфические антитела и фермент (ферменты), способные вызвать модификацию вирусных частиц. Конкретная реализация предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.The method is as follows: the virus-containing liquid is incubated with a bio-affinity sorbent containing specific antibodies immobilized on an activated PVA cryogel matrix, unbound unbound components are washed off and the adsorbed virus is released from the complex with the bio-affinity sorbent. To modify the virus, a bio-affinity sorbent is used, containing specific immobilized specific antibodies and an enzyme (s) that can cause the modification of viral particles. A specific implementation of the invention is illustrated by the following examples:
Example 1
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H1N1, размер вирусных частиц 0,1 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 1,0 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,7 - 1,2 мг/г). Навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента перемешивают с 2,0 мл вирусосодержащей жидкостью в течение 20 часов при +5oC, затем промывают несвязавшиеся компоненты 0,1М PBS (контроль - нулевые значения оптической плотности при 260 нм и 280 нм, а также отрицательная реакция гемаглютинации (РГА)), и далее проводят десорбцию вируса 0,65 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов до полного удаления вируса. Емкость биоаффинного сорбента по десорбированному антигену - 1400 ГАЕ/г носителя. (ГАЕ - произведение обратного титра на объем пробы). Специфичность полученного биоафинного сорбента (с иммобилизованными антителами к вирусу гриппа A, H1N1) проверяют с помощью вируса гриппа A, H3N2. Антигенную активность определяют по реакции прямой гемагглютинации (РГА). Полученные результаты показывают, что на данном иммуносорбенте неспецифические антигены (H3N2) не сорбируется, т.е. наблюдается только биоспецифическая сорбция (концентрирование) антигенов.To concentrate the influenza virus (type A, H1N1, viral particle size 0.1 μm), a bioaffinity sorbent is used, which is a PVA cryogel with a maximum pore diameter of 1.0 μm, activated with glutaraldehyde at pH 1.0, to which specific antibodies are covalently linked obtained from the blood serum of rabbits immunized with the corresponding antigen (the capacity of the sorbent for immobilized antibodies is 0.7 - 1.2 mg / g). A weighed portion (0.5 g) of the bio-affinity sorbent is mixed with 2.0 ml of virus-containing liquid for 20 hours at +5 o C, then the unbound components are washed with 0.1 M PBS (control - zero absorbance at 260 nm and 280 nm, and also a negative hemagglutination reaction (RGA)), and then 0.65 NaCl virus is desorbed in 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) in 1.0 ml portions for three hours until the virus is completely removed. The capacity of the bioaffinity sorbent for the desorbed antigen is 1400 GAU / g of carrier. (GAE - the product of the inverse titer on the sample volume). The specificity of the obtained bioaffinity sorbent (with immobilized antibodies to influenza A, H1N1 virus) is checked using influenza A, H3N2 virus. Antigenic activity is determined by the direct hemagglutination reaction (RGA). The results show that nonspecific antigens (H3N2) are not adsorbed on this immunosorbent, i.e. only biospecific sorption (concentration) of antigens is observed.
Пример 2. Example 2
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H1N1, размер вирусных частиц 0,1 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 0,5 мкм, активированный эпихлоргидрином при pH 13, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,5 - 0,6 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса осуществляют в колоночном режиме с использованием 2,5М MgCl2 в 0,05М трис-HCl (pH 7,4). Количество десорбированного вируса составляет 800 ГАЕ/г носителя.To concentrate the influenza virus (type A, H1N1, viral particle size 0.1 μm), a bioaffinity sorbent is used, which is a PVA cryogel with a maximum pore diameter of 0.5 μm, activated with epichlorohydrin at pH 13, to which specific antibodies obtained from the blood serum of rabbits immunized with the corresponding antigen (the sorbent capacity for immobilized antibodies is 0.5-0.6 mg / g), and the concentrated virus is eluted in a column mode using 2.5 M MgCl 2 in 0.05 M Tris-HCl (pH 7 ,4). The amount of desorbed virus is 800 GAU / g of carrier.
Пример 3. Example 3
Для концентрирования вируса гриппа (тип A, H3N2, размер вирусных частиц 0,12 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 0,7 мкм, активированный бромцианом при pH 11,5, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигенам (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 1,5 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,65 М NaCl в 0,5М трис-HCl (pH 7,4). Количество десорбированного вируса составляет 2000 ГАЕ/г носителя. To concentrate the influenza virus (type A, H3N2, viral particle size 0.12 μm), a bio-affinity sorbent is used, which is a PVA cryogel with a maximum pore diameter of 0.7 μm, activated with bromine cyanide at a pH of 11.5, to which specific antibodies are covalently attached obtained from the blood serum of rabbits immunized with the corresponding antigens (the sorbent capacity for immobilized antibodies is 1.5 mg / g), and the concentrated virus is eluted using 0.65 M NaCl in 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4). The amount of desorbed virus is 2000 GAU / g of carrier.
Пример 4. Example 4
Для концентрирования вируса парагриппа ГП6 (размер вирусных частиц 0,15 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор 1,5 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 0,5, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови морских свинок, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,5 - 0,7 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,65 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4). Титр очищенного антигена (вирус парагриппа ГП6) определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). Емкость биоаффинного сорбента в отношении данного вируса составляет 1266 единиц антигенной активности на 1 г носителя.To concentrate the parainfluenza virus GP 6 (viral particle size 0.15 μm), a bio-affinity sorbent is used, which is a PVA cryogel with a maximum pore diameter of 1.5 μm, activated with glutaraldehyde at pH 0.5, to which specific antibodies obtained from blood serum of guinea pigs immunized with the corresponding antigen (the sorbent capacity for immobilized antibodies is 0.5 - 0.7 mg / g), and the concentrated virus is eluted with 0.65 NaCl in 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) . The titer of purified antigen (parainfluenza virus GP 6 ) is determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The capacity of the bioaffinity sorbent for this virus is 1266 units of antigenic activity per 1 g of carrier.
Пример 5. Example 5
Для концентрирования вируса оспы (размер вирусных частиц 0,4 х 0,2 мкм) используют биоаффинный сорбент, представляющий собой криогель ПАВ с максимальным диаметром пор до 2 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,2, к которому ковалентно пришиты специфические антитела, полученные из сыворотки крови кроликов, иммунизированных соответствующим антигеном (емкость сорбента по иммобилизованным антителам 0,8 мг/г), а элюцию сконцентрированного вируса проводят с помощью 0,75 NaCl в 0,05 трис-HCl (pH 7,8). Титр очищенного антигена (вирус оспы) определяют в непрямом варианте ИФА. Емкость биоаффинного сорбента в отношении данного вируса составляет 2048 единиц антигенной активности на 1 г носителя. To concentrate smallpox virus (viral particle size 0.4 x 0.2 μm), a bio-affinity sorbent is used, which is a surfactant cryogel with a maximum pore diameter of up to 2 μm, activated with glutaraldehyde at pH 1.2, to which specific antibodies obtained are covalently attached from the blood serum of rabbits immunized with the corresponding antigen (sorbent capacity for immobilized antibodies 0.8 mg / g), and the concentrated virus was eluted using 0.75 NaCl in 0.05 Tris-HCl (pH 7.8). The titer of purified antigen (smallpox virus) is determined in an indirect ELISA. The capacity of the bio-affinity sorbent for this virus is 2048 units of antigenic activity per 1 g of carrier.
Пример 6. Example 6
Для концентрирования и ферментативной модификации вируса ящура (размер вирусных частиц 0,02 мкм) навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента, представляющего собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор до 0,04 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела к вирусу ящура (получены из сыворотки крови телят, иммунизированных соответствующим антигеном) и модифицирующий фермент - папаин (емкость сорбента по иммобилизованным антителам - 0,4 мг/г, по папаину - 0,2 мг/г) перемешивают с 2,0 мл вирусосодержащей жидкости в течение 12 часов при +5oC. Аналогичным образом поступают с контрольным биоаффинным сорбентом, у которого иммобилизованный папаин содержит блокированную тиольную группу активного центра. Далее проводят десорбцию вируса 0,5М NaCl в 0,05М трис -HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов. Емкость контрольного биоаффинного сорбента по десорбированному вирусу составляет 780 БОЕ/г носителя (БОЕ - бляшкообразующие единицы), носителя с активным папаином - 32 БОЕ/г носителя, т.е. в 24,3 раза меньше, что является результатом действия иммобилизованной протеазы на вирус ящура, сконцентрированный в фазе биоаффинного сорбента за счет взаимодействия с иммобилизованными антителами (факт подобного концентрирования доказывают результаты эксперимента с контрольным биоаффинным сорбентом), что в итоге приводит к значительному снижению вирулентной активности вируса.For concentration and enzymatic modification of foot-and-mouth disease virus (viral particle size 0.02 μm), a sample (0.5 g) of bioaffinity sorbent, which is a PVA cryogel with a maximum pore diameter of up to 0.04 μm, activated with glutaraldehyde at a pH of 1.0, to which specific antibodies to foot-and-mouth disease virus are covalently sewn (obtained from the blood serum of calves immunized with the corresponding antigen) and the modifying enzyme is papain (the sorbent capacity for immobilized antibodies is 0.4 mg / g, for papain 0.2 mg / g) is mixed with 2.0 ml virusosod holding liquid for 12 hours at +5 o C. Similarly treated with a control bioaffinity sorbent, in which immobilized papain contains a blocked thiol group of the active center. The virus is then desorbed with 0.5 M NaCl in 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) in 1.0 ml portions for three hours. The capacity of the control bioaffinity sorbent for desorbed virus is 780 PFU / g of carrier (PFU - plaque forming units), the carrier with active papain is 32 PFU / g of carrier, i.e. 24.3 times less, which is the result of the action of an immobilized protease on foot and mouth disease virus, concentrated in the bioaffinity sorbent phase due to interaction with immobilized antibodies (the results of an experiment with a control bioaffinity sorbent prove the fact of such concentration), which ultimately leads to a significant decrease in virulent activity the virus.
Пример 7. Example 7
Для концентрирования и ферментативной модификации вируса паротита (размер вирусных частиц 0,14 мкм) навеску (0,5 г) биоаффинного сорбента, представляющего собой криогель ПВС с максимальным диаметром пор до 1,4 мкм, активированный глутаровым альдегидом при pH 1,0, к которому ковалентно пришиты специфические антитела к вирусу паротита (получены из сыворотки крови хомяков, иммунизированных соответствующим антигеном) и модифицирующие ферменты - нейраминидазу и рибонуклеазу (емкость сорбента по иммобилизованным антителам - 0,3 мг/г, по нейраминидазе - 0,15 мг/г, по РНК-азе 0,2 мг/г), инкубируют с 2,0 мл вирусосодержащей жидкости в течение 12 часов при +5oC. Аналогичным образом поступают с контрольным биоаффинным сорбентом, представляющим собой препарат, в котором иммобилизованы на носителе только антитела, специфические к вирусу паротита (емкость контрольного биоаффинного сорбента по антителам - 0,7 мг/г носителя). Затем отмывают несвязавшиеся компоненты 0,1М PBS (контроль - нулевые значения оптической плотности при 280 и 260 нм) и далее проводят десорбцию вируса 0,5 NaCl в 0,05М трис-HCl (pH 7,4) порциями по 1,0 мл в течение трех часов. Емкость контрольного биоаффинного сорбента по десорбированному вирусу составляет 650 ГАЕ/г носителя, для сорбента с модифицирующими ферментами вирусологической активности не зафиксировано, что связано с действием иммобилизованной нейраминидазы на белковый капсид вируса паротита и последующего воздействия иммобилизованной РНК-азы на освобождающуюся из вириона рибонуклеиновую кислоту, результатом чего является отсутствие вирулентной активности вируса.For concentration and enzymatic modification of mumps virus (viral particle size 0.14 μm), a sample (0.5 g) of bioaffinity sorbent, which is a PVA cryogel with a maximum pore diameter of up to 1.4 μm, activated with glutaraldehyde at pH 1.0, to which specific antibodies to mumps virus are covalently sewn (obtained from the blood serum of hamsters immunized with the corresponding antigen) and modifying enzymes - neuraminidase and ribonuclease (the sorbent capacity for immobilized antibodies is 0.3 mg / g for neuraminidase - 0.15 mg / g, according to RNAase 0.2 mg / g), incubated with 2.0 ml of virus-containing liquid for 12 hours at +5 o C. Similarly treated with a control bioaffinity sorbent, which is a drug, in which only antibodies specific for mumps virus are immobilized on the carrier (the capacity of the control bioaffinity sorbent for antibodies is 0.7 mg / g of the carrier). Then unbound components of 0.1 M PBS are washed off (control — zero absorbance at 280 and 260 nm) and then desorption of the 0.5 NaCl virus in 0.05 M Tris-HCl (pH 7.4) in 1.0 ml portions for three hours. The capacity of the control bio-affinity sorbent for the desorbed virus is 650 GAU / g of carrier; for the sorbent with modifying enzymes, no virological activity was detected, which is associated with the action of immobilized neuraminidase on the mumps protein capsid of the virus and the subsequent exposure of the immobilized RNAase to virionic acid released from virionone what is the lack of virulent activity of the virus.
Предлагаемый способ концентрирования вируса обладает следующими преимуществами по сравнению с аналогами и прототипом:
- повышена эффективность способа, т.к. в противоположность способам-аналогам в заявляемом способе применяется биоаффинный сорбент на основе вязкоупругого нехрупкого и гидролитически стабильного криогеля ПВС, поэтому появляется возможность проводить концентрирование вируса не только в хроматографическом (колоночном) варианте, но и в реакторах с перемешиванием сорбента, что существенно интенсифицирует массообменные процессы, т.е. улучшается технологичность способа;
- повышена универсальность способа, т. к. обеспечивается возможность концентрирования, наряду с мелкими, даже самых крупных вирусов (0,5 мкм и более), в то время как в способе-прототипе матрица биоаффинного носителя способна обеспечить диффузию внутрь его гранул лишь довольно мелких (до 0,08 мкм) вирусов; кроме того, универсальность заявляемого способа также обусловлена возможностью одновременного концентрирования и ферментативной модификацией вируса, когда биоаффинный сорбент наряду с иммобилизованными антителами содержит иммобилизованный модифицирующий фермент (ферменты);
- биоаффинные сорбенты на основе криогеля ПВС инертны и высокоспецифичны, их можно повторно применять без существенной специфической активности, полимер, используемый для приготовления гелевой основы дешев и доступен.The proposed method of concentration of the virus has the following advantages compared to analogues and prototype:
- increased efficiency of the method, because in contrast to the analogous methods, the claimed method uses a bio-affinity sorbent based on a viscoelastic non-fragile and hydrolytically stable PVA cryogel, therefore it is possible to concentrate the virus not only in the chromatographic (column) version, but also in reactors with sorbent mixing, which significantly intensifies mass transfer processes, those. the processability is improved;
- the versatility of the method is increased, since it is possible to concentrate, along with small, even the largest viruses (0.5 μm or more), while in the prototype method the matrix of the bioaffinity carrier is able to provide diffusion into its granules of only rather small (up to 0.08 microns) viruses; in addition, the versatility of the proposed method is also due to the possibility of simultaneous concentration and enzymatic modification of the virus, when the bio-affinity sorbent along with immobilized antibodies contains an immobilized modifying enzyme (enzymes);
- bioavailable sorbents based on PVA cryogel are inert and highly specific, they can be reused without significant specific activity, the polymer used to prepare the gel base is cheap and affordable.
Литература
1. Х.Френкель-Конрат. Химия и биология вирусов.// М.,1972, стр. 33-37.Literature
1. H. Frenkel-Conrat. Chemistry and biology of viruses.// M., 1972, pp. 33-37.
2. Я.Туркова, Аффинная хроматография,//М.,1980, стр. 5-14. 2. Ya. Turkova, Affinity chromatography, // M., 1980, pp. 5-14.
3. Purification of measles virus by affinity chromatography and by ultracentrifufation: a comparative study//Njayou M., Quash G.// J. Yirol. Meth. - 1991, v. 32, N 1, p/67-77. 3. Purification of measles virus by affinity chromatography and by ultracentrifufation: a comparative study // Njayou M., Quash G. // J. Yirol. Meth. - 1991, v. 32, N 1, p / 67-77.
4. Separation and purification of biopolimers by affinity chromatography on controlled-pore silica gel./Colpan M.//Ger. offen. DE 3627063, cl. B 01 D 15/08, 1988. 4. Separation and purification of biopolimers by affinity chromatography on controlled-pore silica gel./Colpan M. // Ger. offen. DE 3627063, cl. B 01 D 15/08, 1988.
5. Separation and purification of antigen for diagnosis of infectious bursa disease in chickens. Nagai Sh., Otaki Y., Ueda S., JP 63210775, cl. G 01 N 33/569, 1989. 5. Separation and purification of antigen for diagnosis of infectious bursa disease in chickens. Nagai Sh., Otaki Y., Ueda S., JP 63210775, cl. G 01 N 33/569, 1989.
6. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Обзор литературных данных. //Лозинский В.И., Вакула А.В., Зубов А.Л.// Биотехнология, N 4, 1992, с. 5-14. 6. The use of polyvinyl alcohol cryogels in biotechnology. Review of literature data. // Lozinsky V.I., Vakula A.V., Zubov A.L.// Biotechnology, N 4, 1992, p. 5-14.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97103958A RU2130069C1 (en) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Method of virus concentrating |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97103958A RU2130069C1 (en) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Method of virus concentrating |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97103958A RU97103958A (en) | 1999-03-20 |
| RU2130069C1 true RU2130069C1 (en) | 1999-05-10 |
Family
ID=20190830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97103958A RU2130069C1 (en) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Method of virus concentrating |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2130069C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031014A1 (en) | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Protista International Ab | Separation medium, its preparation and its use |
| WO2003041830A3 (en) * | 2001-10-12 | 2003-11-20 | Protista Internat Ab | Macroporous gel, its preparation and its use |
| WO2004110484A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-23 | Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor' | Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus |
| US7854717B1 (en) | 1998-05-22 | 2010-12-21 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| US8133490B2 (en) | 1998-05-22 | 2012-03-13 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitors in patients |
-
1997
- 1997-03-14 RU RU97103958A patent/RU2130069C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Асташкина О.В. Получение модифицированных химических волокон-аффинных сорбентов для вирусологии - Л., 1991, с.150. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. Обзор литературных данных, Биотехнология, N 4, 1992, с.5 - 14. * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7854717B1 (en) | 1998-05-22 | 2010-12-21 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| US8133490B2 (en) | 1998-05-22 | 2012-03-13 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitors in patients |
| US8197430B1 (en) | 1998-05-22 | 2012-06-12 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitor in patients |
| WO2003031014A1 (en) | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Protista International Ab | Separation medium, its preparation and its use |
| WO2003041830A3 (en) * | 2001-10-12 | 2003-11-20 | Protista Internat Ab | Macroporous gel, its preparation and its use |
| EP1436056A2 (en) * | 2001-10-12 | 2004-07-14 | Protista International AB | Macroporous gel, its preparation and its use |
| US7547395B2 (en) | 2001-10-12 | 2009-06-16 | Protista Biotechnology Ab | Macroporous gel, its preparation and its use |
| WO2004110484A1 (en) * | 2003-06-18 | 2004-12-23 | Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor' | Method for producing a live tissue-cultural vaccine against influenza virus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3844496B2 (en) | Chromatographic adsorbents using mercaptoheterocyclic ligands | |
| Safarik et al. | Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides | |
| JP5643721B2 (en) | Affinity chromatography matrix and its preparation and use | |
| US4138287A (en) | Purifying and isolating method for hepatitis virus to use in preparing vaccine | |
| JP2017086090A (en) | Virus like particle purification | |
| AU2011350672B2 (en) | Method for immobilising nucleic ligands | |
| CN113166792A (en) | A method for removing or eliminating endotoxin from an endotoxin-containing source or a potential endotoxin-containing source | |
| RU2130069C1 (en) | Method of virus concentrating | |
| CA2763309C (en) | Multi-media affinity column to prevent leaching of ligands | |
| JP4739233B2 (en) | Immunoglobulin purification | |
| JPWO2007123242A1 (en) | Separation agent for IgG purification, and purification method of IgG monomer using the same | |
| Wu et al. | Chemical modification of Nitzschia panduriformis's frustules for protein and viral nanoparticle adsorption | |
| JPH0489500A (en) | Method for purifying substance by affinity chromatography and apparatus for purification | |
| JP2007238479A (en) | Method of eluting organic matter adsorbed to hydroxyapatite and method for purifying organic matter using the elution method | |
| JPH03169893A (en) | Method for refining | |
| Heldt et al. | Identification of trimeric peptides that bind porcine parvovirus from mixtures containing human blood plasma | |
| JPS6155415B2 (en) | ||
| Porter et al. | A review of virus and protein sorption by ion exchange resins | |
| Turkova | Affinity chromatography | |
| JP4067684B2 (en) | Separation method using solid support | |
| US5576175A (en) | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen | |
| FI101625B (en) | A complex suitable for carrying out a method for purifying pre-hepatitis B virus surface antigen | |
| Ayhan et al. | Protein A immobilized poly (methylmethacrylate-co-hydroxyethylmethacrylate) microbeads for IgG adsorption | |
| US5340575A (en) | Complex suitable for carrying out a method of purifying pre-S hepatitis B surface antigen | |
| Yang et al. | Polymeric composite membranes and biomimetic affinity ligands for bioseparation and immunoadsorption |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070315 |