WO2004108957A2 - Procede de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique - Google Patents

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WO2004108957A2
WO2004108957A2 PCT/FR2004/050210 FR2004050210W WO2004108957A2 WO 2004108957 A2 WO2004108957 A2 WO 2004108957A2 FR 2004050210 W FR2004050210 W FR 2004050210W WO 2004108957 A2 WO2004108957 A2 WO 2004108957A2
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Alexandre Pachot
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Biomerieux
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome.
  • the invention also relates to a kit for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome.
  • Septic syndrome a systemic response to infection, is one of the leading causes of death in the intensive care unit. It can result from a bacterial, viral, fungal or parasitic infection.
  • sepsis, severe sepsis and septic shock are distinguished in increasing order of severity.
  • a group of experts proposed criteria for defining these three clinical syndromes (RC Bone et al, The ACCP / SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine. Chest 101 (6) : 1644-1655, 1992):
  • sepsis is thus a systemic inflammatory response linked to an infection
  • severe sepsis is sepsis accompanied by dysfunction of at least one organ
  • septic shock is severe sepsis associated with persistent hypotension and can be qualified by: o the presence of an identified infectious site, o a generalized inflammatory response manifested by at least two of the following signs: a) temperature above 38 ° C or below 36 ° C; b) heart rate greater than 90 beats per minute; c) respiratory rate greater than 20 breaths per minute; d) number of leukocytes greater than 12,000 / mm 3 or less than 4,000 / mm 3 , o persistent hypotension despite adequate refills and vasopressure treatments.
  • the signs of sepsis, severe sepsis and septic shock are close, and the difference between these 3 situations lies mainly in the importance of the disruption of all vital functions.
  • the prognosis of septic syndrome is essential to offer each patient an appropriate treatment, and to discriminate as soon as possible from patients with septic syndrome of poor prognosis, and who require heavy therapy, patients with good prognosis.
  • diagnosis and prognosis of a septic syndrome, and in particular of a septic shock are essentially based on the number of visceral failures, the response to symptomatic treatment, the accessibility to medical and / or surgical therapy of the infectious focus. initial and possible metastatic foci. This however has the disadvantage of being applicable only at an advanced stage of the septic syndrome, and in particular of septic shock, reducing the chances of survival of the patient.
  • the diagnosis and prognosis of a septic syndrome can also be based on the detection of certain soluble proteins or factors involved in this syndrome, such as cytokines.
  • cytokines soluble proteins or factors involved in this syndrome
  • the dosage of cytokines, involved in the development of a septic syndrome can be a means of diagnosis and prognosis of a septic syndrome.
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • TNF- ⁇ and then uAl ⁇ are the first two pro-inflammatory cytokines released by monocytes after the onset of a septic state.
  • the plasma cytokine assay is based on an antigen antibody reaction. which can be distorted by the presence of cross-reaction with other antigens not specific for cytokines or by the presence of cytokines complexed in plasma with a soluble receptor.
  • the present invention proposes to solve the drawbacks of the state of the art by presenting a new reliable tool for diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome, such as in particular a septic shock.
  • the inventors have demonstrated that the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome can be determined by studying a panel of genes selected from IL-10, TGF ⁇ , HMGl, T- bet (T cell specifies T-box transcritption factor T bet), IL-l ⁇ , GATA-3 (GATA - binding protein 3), TNF- ⁇ .
  • T cell specifies T-box transcritption factor T bet
  • IL-l ⁇ IL-l ⁇
  • GATA-3 GATA - binding protein 3
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇
  • septic syndrome is meant a systemic response to infection. This septic syndrome can be in a stage of sepsis, severe sepsis or septic shock.
  • septic syndrome is a septic shock.
  • biological sample means any material originating from the patient, capable of containing a biological material making it possible to detect the expression of a gene, and may in particular be a sample of blood, serum, saliva or of circulating tissue or cells. of the patient. This biological sample is available by any type of sample known to those skilled in the art, such as in particular a blood test.
  • Biological material is understood to mean any material making it possible to detect the expression of a gene, such as in particular a nucleic acid or a protein.
  • the nucleic acid may in particular be an RNA (ribonucleic acid) such as an mRNA (messenger RNA).
  • the biological material is a nucleic acid, and even more preferably an mRNA (messenger RNA).
  • step a) The extraction of the biological material from the biological sample during step a) can be carried out by all the nucleic acid or protein extraction protocols well known to those skilled in the art.
  • nucleic acids can in particular be carried out by:
  • a step of lysis of the cells present in the biological sample in order to releasing the nucleic acids contained in the protein and / or lipid envelopes of microorganisms (such as cellular debris which disturb subsequent reactions).
  • the lysis methods as described in the Applicant's patent applications can be used: o WO-A-00/05338 on mixed magnetic and mechanical lysis, o WO-A-99/53304 on electrical lysis, and o WO-A-99/15321 on mechanical lysis.
  • a purification step allowing the separation between the nucleic acids and the other cellular constituents released in the lysis step.
  • This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acids.
  • This nucleic acid purification step is particularly advantageous if it is desired to subsequently amplify said nucleic acids.
  • a particularly interesting embodiment of these magnetic particles is described in the patent applications filed by the Applicant under the following references: WO- A- 97/45202 and
  • WO-A-99/35500 Another interesting example of a nucleic acid purification method is the use of silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R. et al, J. Clin. Microbiol., 1990, n ° 28 (3 ), p. 495-503) or magnetic (Merck: MagPrep ® Silica, Promega: MagneSil TM Paramagnetic particles).
  • silica either in the form of a column or in the form of inert particles (Boom R. et al, J. Clin. Microbiol., 1990, n ° 28 (3 ), p. 495-503) or magnetic (Merck: MagPrep ® Silica, Promega: MagneSil TM Paramagnetic particles).
  • Other very widespread methods are based on ion exchange resins in column or in paramagnetic particle format (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al.,
  • Xtrana Xtra-Bind TM matrix
  • specific reagent is understood to mean a reagent which reacts with the biological material in order to demonstrate, directly or indirectly, the expression of a target gene, which can be determined by analysis of the mRNAs derived from this gene, or by analyzing the protein encoded by this gene.
  • this specific reagent comprises at least one antibody specific for the protein encoded by this target gene.
  • this specific reagent comprises at least one specific amplification primer for the DNA complementary to this MRNA (this is known as a specific amplification primer for a target gene).
  • the complementary DNA of an mRNA can be obtained according to a protocol well known to those skilled in the art.
  • the total RNAs comprising the ribosomal RNAs, the transfer RNAs, the mRNAs
  • a reverse transcription reaction is then carried out using a reverse transcriptase enzyme which makes it possible to obtain, from an RNA fragment, a complementary DNA fragment.
  • RNA complementary to the messenger RNAs Carrying out such a step is well known to those skilled in the art.
  • this enzymatic step is carried out in the presence of nucleotide fragments comprising only thymine bases (polyT), which hybridize by complementarity on the polyA sequence of the different mRNAs in order to form a polyT-polyA complex which then serves as a starting point for the reverse transcription reaction carried out by the enzyme reverse transcriptase.
  • polyT thymine bases
  • cDNA is understood to mean a DNA complementary to a messenger RNA.
  • amplification primer is meant a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleotide units, preferably from 15 to 25 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction.
  • enzymatic amplification reaction is meant a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment using specific amplification primers by the action of at least one enzyme.
  • Such amplification reactions are well known to those skilled in the art and the following techniques may be mentioned in particular: - PCR (Polymerase Chain Reaction), as described in US-A patents
  • the specific reagent comprises at least 2 specific amplification primers in order to amplify a particular region of the DNA complementary to the mRNA derived from the target gene.
  • the enzymatic amplification is a PCR carried out after a reverse transcription reaction, we speak of RT-PCR.
  • hybridization probe is intended to mean a nucleotide fragment comprising from 5 to 100 nucleotide motifs, in particular from 6 to 35 nucleotide motifs, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide fragment.
  • the target nucleotide fragment can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA or a nucleotide sequence included in a complementary DNA obtained by reverse transcription of said messenger RNA.
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as for example a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences are capable of forming a double strand with bonds stable and specific hydrogens.
  • a nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment which can hybridize with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in known manner.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is performed at higher stringency.
  • Stringency is defined in particular as a function of the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the stringency can also be a function of the parameters of the reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and or the hybridization temperature.
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will depend mainly on the hybridization probes used. All this data is good known and the appropriate conditions can be determined by a person skilled in the art. In general, depending on the length of the hybridization probes used, the temperature for the hybridization reaction is between approximately 20 and 70 ° C., in particular between 35 and
  • a step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
  • detection is meant either direct detection by a physical method, or a detection method using a marker.
  • marker is meant a tracer capable of generating a signal.
  • a non-limiting list of these tracers includes the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-lactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase; chromophores such as fluorescent, luminescent or coloring compounds; electron density groups detectable by electron microscopy or by their electrical properties such as conductivity, by amperometry or voltammetry methods, or by impedance measurements; the groups detectable by optical methods such as diffraction, surface plasmon resonance, variation of contact angle or by physical methods such as atomic force spectroscopy, tunnel effect, etc. ; radioactive molecules like P, S or I.
  • the polynucleotide can be labeled during the enzymatic amplification step, for example by using a labeled nucleotide triphosphate for the amplification reaction.
  • the labeled nucleotide will be a deoxyribonucleotide in amplification systems generating DNA, such as PCR, or a ribonucleotide in amplification techniques generating RNA, such as TMA or NASBA techniques.
  • the polynucleotide can also be labeled after the amplification step, for example by hybridizing a labeled probe according to the sandwich hybridization technique described in document WO-A-91/19812.
  • Another particular preferred mode of labeling nucleic acids is described in Application FR-A-2,780,059 to the Applicant.
  • Another preferred mode of detection uses the 5'-3 'exonuclease activity of a polymerase, as described by Holland P.M., PNAS (1991) p 7276-7280.
  • Signal amplification systems can be used as described in WO-A-95/08000 and, in this case, the preliminary amplification reaction enzyme may not be necessary.
  • the hybridization probe can be a so-called capture probe.
  • the target nucleotide fragment can be previously labeled with a marker.
  • the so-called capture probe is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or adsorption.
  • a hybridization reaction is then carried out between said detection probe and the labeled target nucleotide fragment.
  • the hybridization probe can also be a so-called detection probe.
  • the hybridization probe can be labeled with a marker.
  • a hybridization reaction is then carried out between said capture probe and the target nucleotide fragment. .
  • the hybridization reaction can be carried out on a solid support which includes all the materials on which a nucleic acid can be immobilized.
  • Synthetic materials or natural materials, optionally chemically modified, can be used as solid support, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nftrocellulose or dextran, polymers, copolymers, in particular based on monomers of the styrene type, natural fibers such as cotton, and synthetic fibers such as nylon; mineral materials such as silica, quartz, glasses, ceramics; latexes; magnetic particles; metal derivatives, gels etc.
  • the solid support can be in the form of a microtiter plate, a membrane as described in application WO-A-94/12670, a particle or a biochip.
  • biochip By biochip is meant a solid support of reduced size where a multitude of capture probes are fixed at predetermined positions.
  • This concept has expanded since protein chips are starting to develop. It is based on a multidisciplinary technology integrating microelectronics, nucleic acid chemistry, image analysis and computer science.
  • the operating principle is based on a foundation in molecular biology: the phenomenon of hybridization, that is to say the complementarity pairing of the bases of two DNA and / or RNA sequences.
  • the biochip method relies on the use of capture probes fixed on a solid support on which a sample of target nucleotide fragments labeled directly or indirectly with fluorochromes is made to act.
  • the capture probes are positioned specifically on the support or chip and each hybridization gives a specific information, in relation to the target nucleotide fragment.
  • the information obtained is cumulative, and makes it possible, for example, to quantify the level of expression of a gene or of several target genes.
  • To analyze the expression of a target gene one can then produce a biochip carrying very many probes which correspond to all or part of the target gene, which is transcribed into mRNA.
  • the DNAs complementary to the mRNAs originating from the target gene (s) that are to be analyzed are then hybridized.
  • the support or chip is washed, read for example by a scanner and the analysis of the fluorescence is processed by computer.
  • Affymctrix Genetic Information ith High-Density DNA arrays
  • M. Chee et al. Science, 1996, 274, 610-614.
  • Light - generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis ", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), for molecular diagnostics.
  • the capture probes are generally of reduced size, around twenty nucleotides.
  • biochips are given in the publications of G. Ra say, Nature Biotechnology, 1998, n ° 16, p. 40-44; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n ° 10, p.1-10; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n ° l (3), p.183-200; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, No. 22 (15), p. 2915-2921; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n ° 16, p.
  • the determination of the expression of target genes can be analyzed by the expression of the mRNAs which are transcribed at a given time.
  • the biological material is a nucleic acid
  • the specific reagent can be either an amplification primer or a hybridization probe as defined above.
  • the expression of a target gene can also be analyzed by the expression of proteins encoded by the target gene.
  • the biological material is a protein and the specific reagent can be an antibody specific for the protein encoded by the target gene.
  • the expression of a target gene can be determined as follows:
  • a reverse transcription step is carried out, as described above in order to obtain the different DNA complementary to the different messenger RNAs initially present in the biological sample (or cDNA)
  • the cDNAs are specifically amplified.
  • the specific reagent used comprises at least one primer for specific amplification of the target gene, as defined above.
  • This step can be carried out in particular by an amplification reaction of the PCR type or by any other amplification technique as defined above. It is also possible to simultaneously amplify the cDNAs of several target genes: this is called multiplex amplification.
  • the expression of the target gene is determined by quantifying the cDNAs.
  • the cDNAs can be quantified in particular by the use of a quantification range obtained by an amplification reaction carried out until saturation.
  • the expression of the target gene of the different groups of patients can be normalized by the simultaneous determination of the expression of a so-called household gene, the expression of which is similar in different groups of patients.
  • a reverse transcription step is carried out, as described above in order to obtain the different complementary DNAs from the different messenger RNAs initially present in the biological sample (or cDNA)
  • the expression of the target gene is determined by hybridizing the cDNAs to hybridization probes specific for the target gene, previously labeled.
  • hybridization techniques are well known to those skilled in the art, and there may be mentioned in particular the Northern blot technique.
  • This hybridization reaction can be carried out after a specific amplification step of the DNAs complementary to the messenger RNAs of a target gene when in particular the gene is weakly expressed.
  • Analysis of the expression of a target gene provides a tool for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome.
  • We can for example analyze the expression of a target gene in a patient for whom the prognosis of his septic syndrome is not known, and by comparing with known average expression values of the target gene of patients with good prognosis and known average expression values of the target gene of patients with poor prognosis, determine whether the patient is of good or poor prognosis in order to offer him an appropriate treatment.
  • We can also simultaneously study the expression of several target genes, in particular by the use of a biopucc and we determine, in a single step, that is to say from the same sample and by a single analysis ( using repeated assay or single step measurement), expression of multiple target genes.
  • the genes are then analyzed globally for a patient for whom the prognosis of his septic syndrome is not known, and by comparing with known average expression values of the same panel of target genes of patients with good prognosis and values of average expression known from the same panel of target genes of patients with poor prognosis, it can therefore be determined whether the patient is of good or poor prognosis in order to offer him an appropriate treatment.
  • the invention relates to a method of diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome according to which: a. a biological sample from the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. there are at least four specific reagents selected from the following specific reagents: reagent specific for the target gene IL-10, reagent specific for the target gene TGF ⁇ , reagent specific for the target gene HMGl, reagent specific for the target gene T-bet, specific reagent of the target gene IL-l ⁇ , reagent specific for the target gene TNF ⁇ , reagent specific for the target gene GATA- 3 c. determining the expression of at least four target genes chosen from: IL-10, TGF ⁇ , HMGl, T-bet, IL-l ⁇ , TNF ⁇ , GATA-3.
  • the biological sample is a blood sample.
  • the biological material is a nucleic acid.
  • the total RNAs are extracted from the biological sample.
  • the specific reagent for IL10 comprises at least one primer for specific amplification of the target gene IL-10
  • the reagent specific for TGF ⁇ comprises at least one specific primer for amplification of the target gene TGF ⁇
  • the specific reagent for HMGl comprises at least one primer for specific amplification for the target gene HMGl
  • the specific reagent for Tbet comprises at least one primer for specific amplification of the target gene T-bet
  • the specific reagent of IL-l ⁇ comprises at least one primer for specific amplification of the target gene IL-l ⁇
  • the specific reagent of TNF ⁇ comprises at least one primer of specific amplification of the target gene TNF ⁇ and / or the GATA 3 specific reagent comprises at least one primer for amplification specific for the GATA 3 target gene.
  • the specific reagent according to the invention comprises at least one hybridization probe specific for a target gene.
  • the specific reagent of 1TL10 comprises at least one hybridization probe specific for the target gene IL-10
  • the specific reagent for TGF ⁇ comprises at least one probe, for specific hybridization of the target gene TGF ⁇
  • the specific reagent for HMGl comprises at least one hybridization probe specific for the target gene HMGl
  • the specific reagent for T-bet comprises at least one hybridization probe specific for the target gene T-bet
  • the specific reagent for DL-l ⁇ comprises at least one probe for specific hybridization of the IL-l ⁇ target gene
  • the TNF ⁇ specific reagent comprises at least one hybridization probe specific for the TNF ⁇ target gene and / or the GATA 3 specific reagent comprises at least one hybridization probe specific for the GATA target gene 3.
  • This probe can be a detection probe or a capture probe, such as in particular a capture probe immobilized on a biochip.
  • the invention preferably relates to determining the expression of target genes by analyzing the expression of mRNAs.
  • at step b) of the method according to the invention there are at least two specific reagents selected from the following specific reagents: specific reagent for the TGF ⁇ gene, specific reagent for HMGl gene, and the expression of at least two target genes chosen from: TGF ⁇ , HMGl is determined during step c) of the method according to the invention.
  • at least three, preferably at least four and even more preferably at least five reagents are available.
  • specifics selected from the following specific reagents reagent specific for the IL-10 gene, reagent specific for the TGF ⁇ gene, reagent specific for the HMG1 gene, reagent specific for the T-bet gene; specific reagent IL-l ⁇ gene, specific reagent for the TNF ⁇ gene, specific reagent for the GATA-3 gene, and the expression of at least 3, preferably at least 3, is determined during step c) of the method according to the invention 4 and even more preferably at least 5 genes chosen from IL-10, TGF ⁇ , HMGl, T-bet, IL-l ⁇ , TNF ⁇ , GATA-3.
  • step b) of the method according to the invention there are at least three specific reagents selected from the following specific reagents: specific reagent for the TGF ⁇ gene, specific reagent for HMGl gene, specific reagent of the TL-l ⁇ gene and the expression of at least three target genes chosen from: TGF ⁇ , HMGl, IL-l ⁇ is determined during step c) of the method according to the invention.
  • step b) of the method according to the invention there are at least four specific reagents selected from the following specific reagents: specific reagent for the TGF ⁇ gene, specific reagent of the HMGl gene, specific reagent of the IL-1 ⁇ gene, specific reagent of the IL-10 gene and the expression of at least four selected target genes is determined during step c) of the method according to the invention among: TGF ⁇ , HMGl, IL-l ⁇ , IL-10.
  • step b) of the method according to the invention there is available during step b) of the method according to the invention, at least five specific reagents selected from the following specific reagents: specific reagent of the TGF ⁇ gene, specific reagent of the HMGl gene, specific reagent of the IL-l ⁇ gene, specific reagent of the dTL-10 gene, specific reagent of the T-bet gene and the expression of at least five target genes chosen from: TGF ⁇ , HMGl, IL-1 ⁇ , IL-10, T-bet.
  • the invention also relates to a method for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome, as defined above, according to which: a.
  • biological sample of the patient as defined above
  • biological material as defined above
  • biological sample b there is a biological sample of the patient, as defined above, and biological material, as defined above, is extracted from the biological sample b.
  • the biological sample is a blood sample.
  • the biological material is a nucleic acid.
  • the specific reagent is an amplification primer, as defined above, specific for a gene chosen from IL-10; T-bet, GATA 3.
  • the specific reagent for IL-10; T-bet, or GATA 3 is a hybridization probe as defined above, specific respectively for the target genes IL-10; T-bet, and GATA 3.
  • the invention also relates to a method for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome according to which: a. a biological sample from the patient is available and the total RNA is extracted from the biological sample b. at least one specific reagent for the HMGl c gene is available. the expression of the mRNAs of the HMGl gene is determined. It is obvious that in this method, it is not desired to detect the expression of the HMG1 gene at the protein level but only at the level of the mRNAs.
  • the specific reagent for the HMG1 gene is an amplification primer or a hybridization probe as defined above.
  • the invention also relates to a kit for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome comprising at least four specific reagents selected from the following specific reagents: reagent specific for the IL-10 gene, reagent specific for the TGF ⁇ gene, specific reagent the HMG1 gene, a specific reagent for the T-bet gene; specific reagent for the D -l ⁇ gene, specific reagent for the TNF ⁇ gene, specific reagent for the GATA- 3 gene.
  • the specific reagent for ÎTLIO comprises at least one specific amplification primer for the target gene IL-10
  • the specific reagent for TGF ⁇ comprises at least one primer for specific amplification of the target gene TGF
  • the specific reagent for HMGl comprises at least one primer for specific amplification for the target gene HMGl
  • the specific reagent for Tbct comprises at least an amplification primer specific for the target gene T-bet
  • the specific reagent for IL-1 ⁇ comprises at least one specific amplification primer for the target gene IL-l ⁇
  • b specific reagent for TNF ⁇ comprises at least one primer for specific amplification of the TNF ⁇ target gene and / or the GATA 3 specific reagent comprises at least one primer specific amplification of the GATA 3 target gene.
  • the specific reagent for 1TL10 comprises at least one hybridization probe specific for the target gene IL-10, the specific reagent for
  • TGF ⁇ comprises at least one hybridization probe specific for the target gene TGF ⁇
  • the specific reagent for HMGl comprises at least one hybridization probe specific for the target gene HMGl
  • the specific reagent for T-bet comprises at least one specific hybridization probe of the target gene T-bet
  • the specific reagent of IL-l ⁇ comprises at least one hybridization probe specific of the target gene TJ-l ⁇
  • TNF ⁇ comprises at least one hybridization probe specific for the target TNF ⁇ gene and / or the reagent specific for GATA 3 comprises at least one hybridization probe specific for the target gene GATA 3.
  • the invention also relates to a kit for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome comprising at least one specific reagent selected from the following specific reagents: reagent specific for the IL-10 gene, reagent specific for the T-bet gene; specific reagent for the GATA-3 gene.
  • the specific reagent of IL10 comprises at least one primer for specific amplification of the target gene IL-10
  • the specific reagent of T-bet comprises at least one primer of specific amplification of T-bet target gene
  • / or the GATA 3 specific reagent comprises at least one specific amplification primer for the GATA 3 target gene.
  • the specific reagent for IL10 comprises at least one hybridization probe specific for the target gene IL-10
  • the specific reagent for T-bet comprises at least one specific hybridization probe of the T-bet target gene
  • / or the GATA 3 specific reagent comprises at least one hybridization probe specific for the GATA 3 target gene.
  • the invention also relates to a method for the diagnosis and / or prognosis of a septic syndrome according to which: a. a biological sample from the patient is available and biological material is extracted from the biological sample b. there are at least two specific reagents of at least two target genes chosen from among: TL-10, TGF ⁇ , HMGl, T-bet, IL-l ⁇ , TNF ⁇ , GATA-3. vs. the expression of at least two selected target genes is determined in a single step among: EL- 10, TGF ⁇ , HMGl, T-bet, D -l ⁇ , TNF ⁇ , GATA-3.
  • the biological sample is a blood sample.
  • the total RNAs are extracted from the biological sample.
  • the target gene is chosen from TL-10, TGF ⁇ , HMGl, T-bet, IL-l ⁇ , TNF ⁇ ,
  • the specific reagent of IL10 comprises at least one primer for specific amplification of the target gene IL-10
  • the specific reagent of TGF ⁇ comprises at least one primer for specific amplification of the gene target TGF ⁇
  • the specific reagent for HMGl comprises at least one specific amplification primer for the target gene HMGl
  • the specific reagent for Tbet comprises at least one specific amplification primer for the target gene T-bet
  • the specific reagent for IL - l ⁇ comprises at least one specific primer for amplification of the target gene IL-l ⁇
  • the specific TNF ⁇ reagent comprises at least one primer for specific amplification of the TNF ⁇ target gene and / or the GATA 3 specific reagent comprises at least one primer specific amplification of the GATA 3 target gene.
  • the specific reagent according to the invention comprises at least one hybridization probe specific for a target gene.
  • the specific reagent for IL10 comprises at least one hybridization probe specific for the target gene IL-10
  • the specific reagent for TGF ⁇ comprises at least one hybridization probe specific for the target gene TGF ⁇
  • the specific reagent for HMGl comprises at least one hybridization probe specific for the target gene HMGl
  • the specific reagent for T-bet comprises at least one hybridization probe specific for the target gene T-bet
  • the specific reagent for lTL-l ⁇ comprises at least one probe for specific hybridization of the target gene TL-l ⁇
  • the specific reagent of TNF ⁇ comprises at least one hybridization probe specific of the target gene TNF ⁇
  • / or the specific reagent of GATA 3 comprises at least one hybridization probe specific of the target gene GATA 3
  • This probe can be a detection probe or a capture probe, such as in particular a capture probe immobilized on a biochip.
  • the invention preferably relates to determining the expression of target genes by analyzing the expression of mRNAs.
  • step c) in a single step, that is to say, it is determined from the same sampling and by a single analysis (using repeated dosing or one-step measurement), the expression of at least two target genes.
  • the genes are then analyzed globally for a patient for whom the prognosis of his septic syndrome is not known, and by comparing with known average expression values of the same panel of target genes of patients with good prognosis and values of average expression known from the same panel of target genes of patients with poor prognosis, it can therefore be determined whether the patient is of good or poor prognosis in order to offer him an appropriate treatment.
  • step b) of the method according to the invention at least three, preferably at least four and even more preferably at least five reagents are available.
  • step b) of the method according to the invention there are at least three specific reagents selected from the following specific reagents: specific reagent for the TGF ⁇ gene, specific reagent for HMGl gene, specific reagent of the IL-1 ⁇ gene and the expression of at least three target genes chosen from: TGF ⁇ , HMG1, IL-1 ⁇ is determined during step c) of the method according to the invention.
  • step b) of the method according to the invention there are at least four specific reagents selected from the following specific reagents: specific reagent of the TGF ⁇ gene, specific reagent of the HMGl gene, specific reagent of the IL-l ⁇ gene, specific reagent of the IL-10 gene and the expression of at least four selected target genes is determined during step c) of the method according to the invention among: TGF ⁇ , HMGl, IL-1 ⁇ , IL-10.
  • step b) of the method according to the invention there are at least five specific reagents selected among the following specific reagents: reagent specific for the TGF ⁇ gene, reagent specific for the HMGl gene, reagent specific for the IL-l ⁇ gene, reagent specific for the IL-10 gene, reagent specific for the T-bet gene and the expression of at least five target genes chosen from: TGF ⁇ , HMGl, IL-l ⁇ , EL-10, T is determined during step c) of the method according to the invention - bet.
  • specific reagents selected among the following specific reagents: reagent specific for the TGF ⁇ gene, reagent specific for the HMGl gene, reagent specific for the IL-l ⁇ gene, reagent specific for the IL-10 gene, reagent specific for the T-bet gene and the expression of at least five target genes chosen from: TGF ⁇ , HMGl, IL-l ⁇ , EL-10, T is determined during step c) of the method according
  • Figure 1 presents a dendogram obtained from 31 samples from patients with septic syndrome of good prognosis (SEP-BP) or poor prognosis (SEP-MP), and the use of a panel of probes allowing the analysis the expression of 5 target genes according to the invention (EL10, IL-1 ⁇ , GATA-3, TGF- ⁇ ; HMGl).
  • SEP-BP septic syndrome of good prognosis
  • SEP-MP poor prognosis
  • RNA samples were collected directly in PAXGene TM Blood RNA tubes (PrcAnalytix, Frankin Lakcs, USA). After the blood sampling step and in order to obtain a complete lysis of the cells, the tubes were left at room temperature for 4 h and then stored at -20 ° C. until the extraction of the biological material. More specifically, in this protocol, the total RNAs were extracted using the PAXGcnc Blood RNA® kits (PrcAnalytix) in accordance with the manufacturer's recommendations. Briefly, the tubes were centrifuged (10 min, 3000g) in order to obtain a pellet of nucleic acids.
  • RNAsc free DNAse set (Qiagen Ltd, Crawlcy, UK).
  • RNA was verified by electrophoresis on agarose gel and labeling with octhidium bromide.
  • a reverse transcription reaction (RT) was carried out in a final volume of 20 ⁇ l.
  • Total RNA (1 ⁇ g) was mixed with 1 ⁇ l of 50 ⁇ M polyT and 1 ⁇ l of dNTP mix (ThermoScript TM RT-PCR System, Invitrogen), then incubated for 5 min at 65 ° C.
  • the solution was mixed with 4 ⁇ l of 5x cDNA synthesis buffer, 1 ⁇ l of RNAse out (40 U / ⁇ l), 1 ⁇ l of water treated with DEPC and 1 ⁇ l of Thermoscript RT (15 U / ⁇ l), all these products being from the ThermoScript TM RT-PCR System (Invitrogen).
  • the reverse transcription was carried out for 1 h at 50 ° C. and then stopped by an incubation of 5 min at 85 ° C. Finally, each cDNA solution was diluted 1/10 in DEPC water.
  • the HMGl standard was prepared by PCR (polymerase chain reaction) amplification carried out until saturation.
  • the amplicons obtained were purified (PCR purification kit, Qiagen Ltd) and the presence of a single amplicon was verified by electrophoresis on agarose gel and labeling with ethidium bromide.
  • the standards for the “household” cyclophilin B gene and the target genes TGF ⁇ , EL-l ⁇ , T-bet, GATA3 and IL-10 were obtained from Search-LC (Heidelberg, Germany). Analysis of mRNA expression by real-time PCR - The mRNAs of the target genes TGF ⁇ , IL-1 ⁇ , T-bet, GATA3, IL-10 and TNF ⁇ were quantified by quantitative real-time PCR using the LightCycler TM (Rock). The PCR reactions were carried out using the Fast-Start TM DNA Master SYBR Green I real-time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals).
  • Each PCR was carried out in a final volume of 20 ⁇ l containing 1 ⁇ l of LC-Fast Start Reaction Mix SYBR Green I, 1 ⁇ l of LC-Fast Start DNA Master SYBR Green I / Enzyme (including Taq DNA polymerase, the buffer of reaction and a mixture of deoxynucleotides triphosphate), MgCt (3 mM final concentration), sense and antisense primers (0.5 ⁇ M final concentration; each obtained from Search-LC - Heidelberg, Germany), and 10 ⁇ l of solution of cDNA. After a stage of denaturation of 10 min at 95 ° C, the amplification was carried out using 40 cycles of a protocol
  • the PCR products were systematically subjected to a fusion curve analysis (LightCycler TM - Roche). For this, the PCR products were treated with an increasing temperature from 58 to 98 ° C with an increase of 0.1 ° C / s. For each PCR product, a single peak was obtained during the analysis of the curve, characterized by a specific melting temperature.
  • the combination of primers for the quantification of HMGl used is that described by Sotiriou et al (Brest Cancer Res.
  • Genbank accession number was X01394, and region 373-783 was amplified.
  • number Genbank accession was AF241243, and the region 461-669 was amplified.
  • Genbank accession number was X55037, and the region 1023-1294 was amplified.
  • the access number sion Genbank was X02812, and the region 1540-1818 was amplified.
  • the Genbank accession number wasAY029171, and the region 126-413 was amplified.
  • the quantity of target mRNA relative to the quantity of cyclophilin B household gene mRNA was analyzed by the relative quantification technique with the LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
  • the "Second Derivative Maximum Method" from LightCycler TM software (Roche) was used to automatically determine the Crossing Point (Cp) for each sample.
  • the Cp value was defined as the number of cycles for which the fluorescence was significantly different from the background noise.
  • This table 1 presents the level of expression of the IL-10, IL-1 ⁇ , TNF ⁇ , HMGl, GATA3, TGF ⁇ and T-bct mRNAs in 15 healthy patients (S) and 42 patients developing septic syndrome (MS), obtained at from whole blood samples obtained during the first three days after the onset of septic syndrome.
  • S healthy patients
  • MS septic syndrome
  • the comparison between the group of S and MS patients was carried out using the Mann Whitney nonparametric U test and the probability value (p) was calculated.
  • the results are expressed by the relative quantification ratio between the mRNAs of the target gene and the mRNAs of the cyclophilin B household gene.
  • the results are expressed by the average of the ratios obtained for each of the groups of patients.
  • the SEM standard deviation from the mean
  • the values presented in table 1 are the means obtained ⁇ the SEM. The values were considered to be statistically different when the p-value obtained was less than 0.05.
  • MS patients had a significantly increased level of expression of EL-10 and TNF ⁇ mRNA compared to healthy volunteers S (+ 10% and + 4%).
  • the inventors have also shown an overexpression of HMG1 mRNAs in MS patients (+ 50%).
  • the inventors have also demonstrated that the level of expression of T-bct mRNAs was significantly increased compared to healthy volunteers S (+ 24%).
  • the expression of GATA3 mRNAs was significantly reduced in MS patients compared to healthy volunteers S (- 70%).
  • EXAMPLE 2 Analysis by RT PCR of the Expression of the IL-10, TGF ⁇ , HMGl, T-bet, BL-l ⁇ , TNF ⁇ , GATA-3 Genes for the Prediction of a Septic Syndrome
  • the inventors looked for a tool for the prognosis of a septic syndrome during the first 72 hours after the start of a septic shock.
  • This table shows the level of expression of IL-10, IL-l ⁇ , TNF ⁇ , HMGl, GATA3, TGF ⁇ and T-bet mRNAs in patients with good prognosis (SEP-BP) and poor prognosis (SEP-MP) obtained from whole blood samples obtained during the first three days after the onset of septic shock.
  • SEP-BP good prognosis
  • SEP-MP poor prognosis
  • Cyclophilin B household gene mRNA The results are expressed by the average of the reports obtained for each of the patient groups. The SEM (standard deviation from the mean) was also calculated for each of the groups. The values presented in table 2 are the means obtained ⁇ the SEM. The values were considered to be statistically different when the p-value obtained was less than 0.05.
  • the inventors have demonstrated that the study of an expression profile of several genes makes it possible to obtain a tool for predicting septic syndrome, and in particular septic shock.
  • the table below presents a hierarchical clusteiing analysis of 36 SEP-BP and SEP-MP patients using the expression of 2 to 5 genes measured during the first three days following the onset of septic shock.
  • the hierarchical clustering function of the Spofire software was used to make this analysis.
  • the results used for the analysis are expressed by the relative quantification ratio between the mRNAs of the target gene and the mRNAs of the cyclophilin B household gene.
  • the expression levels of each gene were normalized by calculating a reduced centered variable.
  • Table 3 represents, for each of the 2 groups, the percentage of patients clustered together, that is to say the percentage of patients classified as MP who were actually of poor prognosis, and the percentage of patients classified as BP who were actually of good prognosis.
  • Example 2 The results presented in Example 2 were validated by the use of another technique, applied to new patient samples. For this, a study was carried out on 31 patients developing a septic syndrome, and admitted to the surgical or medical resuscitation department of the Lyon-Sud hospital center. More specifically, these patients with septic syndrome were selected between the second and the fourth day following the onset of septic shock according to the inclusion criteria of the American College of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine as defined above. Each patient was followed for a maximum of 28 days.
  • SEP-BP septic syndrome with good prognosis
  • SEP-MP septic syndrome with poor prognosis
  • RNA extraction - This step was carried out according to the protocol previously described in Example 1.
  • the samples were classified according to the unweighted average method (Spotfire Decision Site for Functional Genomics V7.1, manual) while the genes were classified according to the average expression value obtained in all the samples.
  • the level of expression is represented by different levels (b color.
  • the white color corresponds to a low level of expression
  • the color gray corresponds to an intermediate level of expression
  • black corresponds to a high level of expression.
  • the length of the branches of the dendograme is correlated to the expression profile and the dotted line which divides the dendograme makes it possible to distinguish two patient groups: a first group of patients with a poor prognosis C 'SEP-MP "and a second group of patients with a good prognosis U SEP-BP".

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: A) on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de 1'échantillon biologique b) on dispose d'au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants: réactif spécifique du gene cible IL- 10, réactif spécifique du gene cible TGF(3, réactif spécifique du gene cible HMG1, réactif spécifique du gene cible T- bet, réactif spécifique du gene cible IL-1β réactif spécifique du gene cible TNFα, réactif spécifique du gène cible GATA-3 c) on détermine 1'expression d'au moins quatre gènes cibles choisis parmi : IL­10, TGFβ, HMG1, T -bet, IL-1β, TNFα, GATA-3. La présente invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique.

Description

Procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique
La présente invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique. L'invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique. Le syndrome septique, réponse systémique à l'infection, représente l'une des premières causes de mortalité dans les services de réanimation. Il peut résulter d'une infection bactérienne, virale, mycosique ou parasitaire. Parmi ce syndrome septique, on distingue par ordre croissant de gravité le sepsis, le sepsis sévère et le choc septique. Un groupe d'experts a ainsi proposé en 1992 des critères de définitions de ces trois syndromes cliniques (R. C. Bone et al, The ACCP/SCCM Consensus Conférence Committee. American Collège of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. Chest 101 (6): 1644- 1655, 1992) :
• le sepsis est ainsi une réponse systémique inflammatoire liée à une infection, • un sepsis sévère est un sepsis accompagné du disfonctionnement d'au moins un organe,
• le choc septique est un sepsis sévère associé à une hypotension persistante et peut être qualifié par : o la présence d'un site infectieux identifié, o une réponse inflammatoire généralisée se manifestant par au moins deux des signes suivants : a) température supérieure à 38°C ou inférieure à 36°C ; b) rythme cardiaque supérieur à 90 battements par minute ; c) rythme respiratoire supérieur à 20 respirations par minute ; d) nombre de leucocytes supérieur à 12000/mm3 ou inférieur à 4000/mm3, o une hypotension persistante malgré des remplissages adéquats et des traitements vasopresscurs. D'une manière générale, les signes d'un sepsis, d'un sepsis sévère et d'un choc septique sont proches, et la différence entre ces 3 situations réside principalement dans l'importance de la perturbation de toutes les fonctions vitales. Lors d'un choc septique, on observe principalement une chute de pression artérielle, tachycardie, polypnée, marbrures cutanées, hypo- ou hyperthermie, frissons. Ces signes s'accompagnent également d'un dysfonctionnement d'organes "cibles" avec une altération de fonction d'organes à distance du foyer infectieux (reins, poumons, système nerveux central, appareil digestif et système hématologique le plus souvent atteints) se traduisant par une oligurie (<0,5 ml/kg/h), insuffisance rénale, hypoxémie, thrombopénie, agitation , confusion.
L'évolution d'un syndrome septique depuis le stade de sepsis vers un stade de sepsis sévère, puis de choc septique n'est pas systématique puisque environ 64% des patients scptiqucs développent un sepsis sévère, et 23% des patients en sepsis sévère évoluent en choc septique. Avant cette étape ultime de choc septique, des traitements doivent être prescrits au patient afin d'interrompre et d'inverser le processus physiopathologiquc. Il faut ainsi restaurer un état hémodynamique satisfaisant et assurer une ventilation efficace. Il faut également mener de front le traitement symptomatique du choc et un traitement antibiotique adapté dès que possible aux données bactériologiques.
Il apparaît ainsi que si certains patients développant un syndrome septique, et notamment un choc septique, peuvent être réanimés par une prise en charge standard, telle qu'un traitement antibiotique de large spectre mis en place avant les résultats des analyses bactériologiques indiquant la source infectieuse, d'autres patients, développant un syndrome septique beaucoup plus grave, nécessitent une mise en place de thérapeutiques lourdes, comme la protéine C activée. Au delà du coût très élevé, ce genre de thérapeutique expose les patients à des risques d'effets indésirables très importants (troubles de la coagulation ...). Il est donc très important de cibler de manière efficace les patients suceptibles de bénéficier d'un tel traitement. De ce fait, le diagnostic précoce d'un syndrome septique est essentiel et permet de proposer un traitement adapté au patient. De plus, le pronostic du syndrome septique, et notamment d'un choc septique est primordial pour proposer à chaque patient un traitement adapté, et discriminer au plus tôt les patients présentant un syndrome septique de mauvais pronostic, et qui nécessitent une thérapie lourde, des patients de bon pronostic. Actuellement, le diagnostic et le pronostic d'un syndrome septique, et notamment d'un choc septique sont essentiellement basés sur le nombre des défaillances viscérales, la réponse au traitement symptomatique, l'accessibilité à la thérapeutique médicale et/ou chirurgicale du foyer infectieux initial et des éventuels foyers métastatiques. Ceci présente toutefois l'inconvénient de n'être applicable qu'à un stade avancé du syndrome septique, et notamment du choc septique, réduisant les chances de survie du patient.
Le diagnostic et le pronostic d'un syndrome septique peuvent également être basés sur la détection de certaines protéines ou facteurs solubles impliquées dans ce syndrome, telles que les cytokines. On peut notamment citer la publication de Thijs & Hack (Intensive Care Med, 1995, 21 : S258-S263), qui présente une revue des concentrations plasmatiques de certaines cytokines telles que TNF, IL-lb, IL-6, IL- 8, lors d'un sepsis. Ainsi, le dosage de cytokines, impliquées lors du développement d'un syndrome septique peut être un moyen de diagnostic et de pronostic d'un syndrome septique. Ces auteurs ont ainsi décrit une
5 corrélation positive entre la teneur plasmatique d'IL-1 (Interleukine-1) et un syndrome septique de mauvais pronostic (Thijs & Hack, Intensive Care Med 31 :S258-263, 1995).
Toutefois, d'autres auteurs n'ont trouvé aucune corrélation entre ÎTL-I et un mauvais pronostic du syndrome septique, suggérant une grande wiabilité de ce facteur. De plus, des dosages élevés de TNF (Tumor Necrosis Factor) ont été associés aussi à un mauvais
10 pronostic (Casey et al., Ann Intern Med. 1993. 119:771-778). Le TNF-α puis l'uAlβ sont les deux premières cytokines pro- inflammatoire libérées par les monocytes après le déclenchement d'un état septique.
D'autres auteurs ont montré que la teneur en IL- 10 (Interleukine-10) plasmatique est plus élevée chez les patients développant un sepsis de mauvais pronostic alors qu'elle décroît
15 significativement chez les patients présentant un sepsis de bon pronostic pour ne pas être détectable chez les patients sains (Van der Poil, J. Infect. Dis. 175 :118-122, 1997). L'IL-
10 est une cytokine anti inflammatoire très importante, et qui, par sa capacité à inhiber la production du TNF-α et de l'IL-lβ, participe à la mise en place de l'état d'immuno- paralysie. Toutefois, cette augmentation de la teneur en IL- 10 n'étant détectable que chez
20 80% des patients en choc septique, la détection unique de ce facteur reste insuffisante pour pronostiquer l'évolution du choc septique.
On peut citer également le brevet US-B-6,303,321 qui décrit une méthode de pronostic de la sévérité d'un syndrome septique comprenant la mesure de la concentration sérique en HMGl (liigh mobility group 1 protein) par une technique immunoblot. L'HMGl est, à
25 l'inverse du TNF-α et de l'TL-lβ, décrit comme un médiateur pro- inflammatoire tardif des syndromes septiques. Une forte concentration en HMGl est corrélée à un mauvais pronostic, la concentration sérique en HMGl n'étant pas détectée chez les patients sains. Il a par contre été décrit chez la souris une régulation post transcriptionnelle du gène HMGl, suggérant que l'expression de ce gène ne doit être analysé qu'au niveau protéique (Wang et
30 al, Science, 1999, vol 285, p248-251).
11 est toutefois important de noter que, actuellement, aucune cytokine n'est reconnue de manière consensuelle comme outil de diagnostic ou de pronostic d'un syndrome septique. De plus, le dosage plasmatique de cytokines est basée sur une réaction antigène anticorps qui peut être faussée par la présence de réaction croisée avec d'autres antigènes non spécifiques des cytokines ou par la présence de cytokines complexé dans le plasma a un récepteur soluble.
La présente invention se propose de résoudre les inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil fiable de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique, tel que notamment un choc septique.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le diagnostic et/ou le pronostic d'un syndrome septique peut être déterminé par l'étude d'un panel de gènes sélectionnés parmi IL- 10, TGFβ, HMGl, T-bet (T cell spécifie T-box transcritption factor T bet), IL-lβ, GATA-3 (GATA - binding protein 3), TNF-α . De plus, l'analyse en une seule étape de l'expression de plusieurs de ces gènes permet d'obtenir un outil très efficace pour le pronostic et/ou diagnostic d'un syndrome septique.
Avant d'aller plus avant, les définitions suivantes sont données afin de mieux comprendre l'invention.
On entend par syndrome septique, une réponse systémique à l'infection. Ce syndrome septique peut être à un stade de sepsis, sepsis sévère ou de choc septique.
Préfcrenticllcmcnt, le syndrome septique est un choc septique.
On entend par échantillon biologique, tout matériel issu du patient, susceptible de contenir un matériel biologique permettant de détecter l'expression d'un gène, et peut être notamment un échantillon de sang, de sérum, de salive ou de tissu ou de cellules circulantes du patient. On dispose de cet échantillon biologique par tout type de prélèvement connu de l'homme du métier, tel que notamment une prise de sang.
On entend par matériel biologique tout matériel permettant de détecter l'expression d'un gène, comme notamment un acide nucléique ou une protéine. L'acide nucléique peut être notamment un ARN (acide ribonucléique) tel qu'un ARNm (ARN messager). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique, et encore plus préférentiellement un ARNm (ARN messager).
L'extraction du matériel biologique de l'échantillon biologique lors de l'étape a) peut être réalisée par tous les protocoles d'extraction d'acides nucléiques ou de protéines bien connus de l'homme du métier.
A titre indicatif, l'extraction d'acides nucléique peut notamment être réalisée par :
• une étape de lyse des cellules présentes dans l'échantillon biologique, afin de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse : o WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, o WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et o WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues, telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A-5,234,809).
• une étape de purification, permettant la séparation entre les acides nucléiques et les autres constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A litre d'exemple, on peut utiliser des particules magnétiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiqœs est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO- A- 97/45202 et
WO-A-99/35500. Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne, soit sous forme de particules inertes (Boom R. et al, J. Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503) ou magnétiques (Merck: MagPrep® Silica, Promega: MagneSil™ Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne ou en format particulaire paramagnétique (Whatman: DEAE-Magarose) (Levison PR et al.,
J. Chromatography, 1998, p. 337-344). Une autre méthode très pertinente mais non exclusive pour l'invention est celle de l'adsorption sur support d'oxyde métallique (société
Xtrana: matrice Xtra-Bind™). On entend par réactif spécifique un réactif qui réagit avec le matériel biologique afin de mettre en évidence, d'une manière directe ou indirecte l'expression d'un gène cible, qui peut être déterminé par l'analyse des ARNm issus de ce gène, ou par l'analyse de la protéine codée par ce gène. A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse de la protéine codée par ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins un anticorps spécifique de la protéine codée par ce gène cible.
A titre indicatif, lorsque l'on souhaite déterminer l'expression d'un gène cible par l'analyse des ARNm transcrits à partir de ce gène, ce réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification spécifique de l'ADN complémentaire de cet ARNm (on parle alors d'amorce d'amplification spécifique d'un gène cible). L'ADN complémentaire d'un ARNm peut être obtenu selon un protocole bien connu de l'homme du métier. A titre indicatif, on extrait lors de l'étape a) du procédé selon l'invention les ARN totaux (comprenant les ARN ribosomaux, les ARN de transfert, les ARNm) de l'échantillon biologique. On réalise ensuite une réaction de transcription reverse à l'aide d'une enzyme reverse transcriptase qui permet d'obtenir, à partir d'un fragment d'ARN, un fragment complémentaire d'ADN. La réalisation d'une telle étape est bien connue de l'homme du métier. Lorsque l'on souhaite plus particulièrement obtenir uniquement les ADN complémentaires des ARN messagers, on réalise cette étape enzymatique en présence de fragments nucleotidiques comprenant uniquement des bases thymine (polyT), qui s'hybrident par complémentarité sur la séquence polyA des différents ARNm afin de former un complexe polyT-polyA qui sert alors de point de départ à la réaction de transcription reverse réalisée par l'enzyme reverse transcriptase. On obtient alors différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique. Dans la suite de l'exposé, on entend par ADNc, un ADN complémentaire d'un ARN messager.
Par amorce d'amplification, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucleotidiques, préférentiellement de 15 à 25 motifs nucleotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible à l'aide d'amorces d'amplification spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : - PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-
4,683,195, US-A-4,683,202 etUS-A-4,800,159,
LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP- A-0 201 184,
RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO-A-
90/06995,
NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet
WO-A-91/02818, et - TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491.
On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique. Préfércntiellcment, lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification spécifiques afin d'amplifier une région particulière de l'ADN complémentaire de l'ARNm issu du gène cible. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.
Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucleotidiques, notamment de 6 à 35 motifs nucleotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique cible. Dans la présente invention, le fragment nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucleotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et
65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.
Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical
Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Kellcr G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose- 6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme P, S ou I. Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué sera un désoxyribonucléotidc dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les tecliniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA. Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812. Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides nucléiques est décrit dans la demande FR-A-2 780 059 de la Demanderesse. Un autre mode préférentiel de détection utilise l'activité exonucléase 5'-3' d'une polymérase, tel que décrit par Holland P.M., PNAS (1991) p 7276-7280.
Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WO-A-95/08000 et, dans ce cas, la réaction préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire.
Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de capture. Dans ce cas, le fragment nucléotidique cible peut être préalablement marqué au moyen d'un marqueur. La sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de détection et le fragment nucléotidique cible marqué.
La sonde d'hybridation peut également être une sonde dite de détection Dans ce cas, la sonde d'hybridation peut être marquée au moyen d'un marqueur .On réalise alors une réaction d'hybridation entre ladite sonde de capture et le fragment nucléotidique cible. Que l'on utilise une sonde dite de capture ou une sonde dite de détection, la réaction d'hybridation peut être réalisée sur un support solide qui inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nucléique. Des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nftrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopucc, plus précisément de puce à ADN, date du début des années 90. De nos jours, ce concept s'est élargi puisque des puces à protéines commencent à se développer. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l' informatique. Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucleotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADN complémentaires des ARNm issues du ou des gènes cibles que l'on souhaite analyser.
Après hybridation, le support ou puce est lavé(e), lu(e) par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymctrix ("Acccssing Genetic Information ith High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996, 274, 610-614. "Light- generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de vingt nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ra say, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40-44 ; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915-2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n° 16, p. 541-546 ou dans les brevets US- A-4,981,783, US- A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristi ues d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucleotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection.
Lors de la présente invention, la détermination de l'expression de gènes cibles peut être analysée par l'expression des ARNm qui sont transcrits à un moment donne. Dans ce cas, le matériel biologique est un acide nucléique, et le réactif spécifique peut être indifféremment une amorce d'amplification ou une sonde d'hybridation telles que définies précédemment. L'expression d'un gène cible peut être également analysé par l'expression des protéines codées par le gène cible. Dans ce cas, le matériel biologique est une protéine et le réactif spécifique peut être un anticorps spécifique de la protéine codée par le gène cible.
A titre indicatif, on peut déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que défini lors de l'étape a) du procédé selon l'invention telle que présentée précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc)
2) on amplifie spécifiquement les ADNc . Dans ce cas, le réactif spécifique utilisé comprend au moins une amorce d'amplication spécifique du gène cible, telle que définie précédemment. Cette étape peut être réalisée notamment par une réaction d'amplification de type PCR ou par toute autre technique d'amplification telle que définie précédemment. On peut également amplifier simultanément les ADNc de plusieurs gènes cibles : on parle alors d'amplification en multiplex.
3) on détermine l'expression du gène cible en quantifiant les ADNc. Les ADNc peuvent être quantifiés notamment par l'utilisation d'une gamme de quantification obtenue par une réaction d'amplification conduite jusqu'à saturation. Afin de tenir compte de la variabilité d'efficité enzymatique qui peut être observée lors des différentes étapes (transcription reverse, PCR...), on peut normaliser l'expression du gène cible des différents groupes de patients, par la détermination simultanée de l'expression d'un gène dit de ménage, dont l'expression est similaire chez les différents groupes de patients. En réalisant un rapport entre l'expression du gène cible et l'expression du gène de ménage, on corrige ainsi toute variabilité entre les différentes expérimentations. L'homme du métier pourra se référer notammant aux publications suivantes : Bustin SA Journal of molecular endocrinology, 2002, 29 : 23-39 ; Giulietti A Methods, 2001, 25 : 386-401. On peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait les ARN totaux d'un échantillon biologique tel que défini lors de l'étape a) du procédé selon l'invention telle que présentée précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les différents ADN complémentaires des différents ARN messagers initialement présents dans l'échantillon biologique (ou ADNc)
2) on immobilise les ADNc sur une membrane
3) on détermine l'expression du gène cible en hybridant les ADNc à des sondes d'hybridation spécifiques du gène cibl,e préalablement marquées. De telles techniques d'hybridation sont bien connues de l'homme du métier, et on peut citer notamment la technique du Northern blot. Cette réaction d'hybridation peut être réalisée après une étape d'amplification spécifique des ADN complémentaires des ARN messagers d'un gène cible lorsque notamment le gène est faiblement exprimé.
L'analyse de l'expression d'un gène cible permet alors de disposer d'un outil pour le diagnostic et / ou le pronostic d'un syndrome septique. On peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le pronostic de son syndrome septique, et en comparant avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de mauvais pronostic, déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitemen adapté. On peut également étudier simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, par notamment l'utilisation d'une biopucc et on détermine, en une seule étape, c'est à dire à partir d'un même prélèvement et par une seule analyse (à l'aide de dosage répétés ou de mesure en une seule étape), l'expression de plusieurs gènes cibles. Les gènes sont ensuite analysés de manière globale pour un patient dont on ne connaît pas le pronostic de son syndrome septique, et en comparant avec des valeurs d'expression moyenne connues d'un même panel de gènes cibles de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues d'un même panel de gènes cibles de patients de mauvais pronostic, on peut donc déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitemen adapté.
Ainsi, l'invention concerne un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants: réactif spécifique du gène cible IL- 10, réactif spécifique du gène cible TGFβ, réactif spécifique du gène cible HMGl, réactif spécifique du gène cible T-bet, réactif spécifique du gène cible IL- lβ, réactif spécifique du gène cible TNFα, réactif spécifique du gène cible GATA- 3 c. on détermine l'expression d'au moins quatre gènes cibles choisis parmi : IL- 10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL-lβ, TNFα, GATA-3.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon sanguin. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est une acide nucléique. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de Tbet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL- lβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le réactif spécifique selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique d'un gène cible. Préférentiellement, le réactif spécifique de 1TL10 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une sonde, d'hybridation spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T- bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'DL-lβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3. Cette sonde peut être une sonde de détection ou une sonde de capture, telle que notamment une sonde de capture immobilisée sur une biopuce.
L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression des gènes cibles par l'analyse de l'expression des ARNm. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins deux réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins deux gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose, lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins trois, préférentiellement d'au moins quatre et encore plus préférentiellement d'au moins cinq réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène TNFα, réactif spécifique du gène GATA- 3, et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins 3 préférentiellement d'au moins 4 et encore plus préférentiellement d'au moins 5 gènes choisis parmi IL-10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL-lβ, TNFα, GATA-3. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins trois réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène TL-lβ et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins trois gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl, IL-lβ.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène d'IL-10 et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins quatre gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl, IL-lβ, IL- 10.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins cinq réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène dTL-10, réactif spécifique du gène T-bet et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins cinq gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl , IL-l β, IL-10, T- bet. L'invention concerne également un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique, tel que défini précédemment, selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient, tel que défini précédemment, et on extrait du matériel biologique, tel que défini précédemment, de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique d'un gène choisi parmi les gènes suivants: IL- 10, T-bct ; GATA-3. c. on détermine l'expression, telle que définie précédemment, d'au moins un gène cible choisi parmi : IL- 10 ; T-bet, GATA-3.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon sanguin. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le matériel biologique est un acide nucléique.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique est une amorce d'amplification, telle que définie précédemment, spécifique d'un gène choisi parmis IL- 10 ; T-bet, GATA 3 .
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de IL- 10 ; T- bet, ou de GATA 3 est une sonde d'hybridation telle que définie précédemment, spécifique respectivement des gènes cibles IL- 10 ; T-bet, et GATA 3.
L'invention concerne également un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique du gène HMGl c. on détermine l'expression des ARNm du gène HMGl. II est bien évident que dans ce procédé, on ne souhaite pas détecter l'expression du gène HMGl au niveau proteique mais uniquement au niveau des ARNm. Préférentiellement, le réactif spécifique du gène HMGl est une amorce d'amplification ou une sonde d'hybridation telle que définie précédemment.
L'invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique comprenant au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène D -lβ, réactif spécifique du gène TNFα, réactif spécifique du gène GATA- 3. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de ÎTLIO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGF , le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de Tbct comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL- lβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-lβ , b réactif spécifique de TNFα comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de 1TL10 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de
TGFβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-lβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TJ -lβ , le réactif spécifique de
TNFα comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.
L'invention concerne également un kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique comprenant au moins un réactif spécifique sélectionné parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène GATA- 3.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-10, le réactif spécifique deT-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique deT-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T- bet, et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.
L'invention concerne également un procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins deux réactifs spécifiques d'au moins deux gènes cibles choisi parmis : TL- 10, TGFβ, HMGl, T-bet , IL-lβ, TNFα, GATA-3. c. on détermine, en une seule étape, l'expression d'au moins deux gènes cibles choisis parmi : EL- 10, TGFβ, HMGl, T-bet, D -lβ, TNFα, GATA-3.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'échantillon biologique est un échantillon sanguin.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique.
Selon l'invention, le gène cible est choisi parmi TL-10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL-lβ, TNFα,
GATA-3.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de Tbet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL- lβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le réactif spécifique selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique d'un gène cible. Préférentiellement, le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T- bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de lTL-lβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au ûioins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3. Cette sonde peut être une sonde de détection ou une sonde de capture, telle que notamment une sonde de capture immobilisée sur une biopuce.
L'invention concerne préférentiellement la détermination de l'expression des gènes cibles par l'analyse de l'expression des ARNm.
Lors de l'étape c), on détermine, en une seule étape, c'est à dire à partir d'un même prélèvement et par une seule analyse (à l' aide de dosage répétés ou de mesure en une seule étape), l'expression d'au moins deux gènes cibles. Les gènes sont ensuite analysés de manière globale pour un patient dont on ne connaît pas le pronostic de son syndrome septique, et en comparant avec des valeurs d'expression moyenne connues d'un même panel de gènes cibles de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues d'un même panel de gènes cibles de patients de mauvais pronostic, on peut donc déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitemen adapté.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose, lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins trois, préférentiellement d'au moins quatre et encore plus préférentiellement d'au moins cinq réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène TNFα, réactif spécifique du gène GATA- 3, et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins 3 préférentiellement d'au moins 4 et encore plus préférentiellement d'au moins 5 gènes choisis parmi IL-10, TGFβ, HMGl, T-bet, TJL-lβ, TOFα, GATA-3. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins trois réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène IL-l β et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins trois gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl, IL-lβ. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène d'IL-10 et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins quatre gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl, IL-lβ, IL- 10. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on dispose lors de l'étape b) du procédé selon l'invention, d'au moins cinq réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène T-bet et on détermine, lors de l'étape c) du procédé selon l'invention, l'expression d'au moins cinq gènes cibles choisis parmi : TGFβ, HMGl, IL-lβ, EL- 10, T- bet.
La figure ci-jointe est donnée à titre d'exemple explicatif et n'a aucun caractère limitatif. Elle permettra de mieux comprendre l'invention.
La figure 1 présente un dendogramme obtenu à partir de 31 échantillons issus de patients en syndrome septique de bon pronostic (SEP-BP) ou de mauvais pronostic (SEP-MP), et l'utilisation d'un panel de sondes permettant l'analyse de l'expression de 5 gènes cibles selon l'invention (EL10, IL-lβ, GATA-3, TGF-β ; HMGl).
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention.
Exemple 1 - Etude de l'expression des gènes IL-10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL- lβ, TNRx, GATA-3 pour le diagnostic d'un syndrome septique
L'étude a été réalisée sur 42 patients ayant développé un syndrome septique, et admis dans le service de réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon-Sud. Quinze volontaires sains ont également été utilisés, afin de comparer l'expression des gènes IL- 10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL- lβ, TNFα, GATA-3 dans le sang périphérique de patients sains et de patients en syndrome septique. On distinguait alors un groupe de 15 patients sains (S), et un groupe de 42 patients développant un syndrome septique (SEP) Extraction des ARN et synthèse des cDNA - Pour chaque patient, l'échantillon biologique était un prélèvement sanguin, été régulièrement obtenu pendant les 11 premiers jours suivant le début du syndrome septique développé par les patients SEP. Un prélèvement a également été effectué selon un même protocole chez les patients sains (S). Ces prélèvements ont été collecté directement dans des tubes PAXGene™ Blood RNA (PrcAnalytix, Frankin Lakcs, USA). Après létape de prélèvement sanguin et afin d'obtenir une lyse totale des cellules, les tubes ont été laissés à température ambiante pendant 4 h puis conservés à -20°C jusqu'à l'extraction du matériel biologique. Plus préciment, dans ce protocole, les ARN totaux ont été extraits à l'aide des kits PAXGcnc Blood RNA® (PrcAnalytix) en respectant les recommandations du fabriquant. Brièvement, les tubes ont été centrifugés (10 min, 3000g) afin d'obtenir un culot d'acides nucléiques. Ce culot a été lavé et repris dans un tampon contenant de la protéinase K nécessaire à la digestion des protéines (10 min à 55°C). Une nouvelle cenlrifugation (5 min 19000g) a été effectuée pour éliminer les débris cellulaires et de l'éthanol a été ajouté afin d'optimiser les conditions de fixation des acides nucléiques. Les ARN totaux ont été spécifiquement fixés sur les colonnes PAXgenc RNA spin colutnn et, avant l'élution de ceux-ci, une digestion de l'ADN contaminant a été effectuée à l'aide du RNAsc free DNAse set (Qiagen Ltd, Crawlcy, UK).
Pour chaque extraction, la qualité des ARN totaux a été vérifiée par une électrophorèse sur gel d'agarose et un marquage au bromure d'cthidium.Une réaction de transcription reverse (RT) a été réalisée dans un volume final de 20 μl. L'ARN total (1 μg) a été mélangé avec 1 μl de polyT à 50 μM et 1 μl de dNTP mix (ThermoScript™ RT-PCR System, Invitrogen), puis incubé 5 min à 65°C. Après refroidissement dans la glace, la solution a été mélangée avec 4 μl de 5x cDNA synthesis buffer, 1 μl de RNAse out (40 U/μl), 1 μl d'eau traitée au DEPC et 1 μl de Thermoscript RT (15 U/μl), tous ces produits étant issus du ThermoScript™ RT-PCR System (Invitrogen). La transcription reverse a été effectuée pendant 1 h à 50°C puis stoppée par une incubation de 5 min à 85°C. Pour finir, chaque solution de cDNA a été diluée au 1/10 dans de l'eau DEPC.
Préparation des standards pour la génération des gammes de quantification - Le standard HMGl a été préparé par une amplification PCR (polymerase chain reaction) conduite jusqu'à saturation. Les amplicons obtenus ont été purifiés (PCR purification kit, Qiagen Ltd) et la présence d'un amplicon unique a été vérifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marquage au bromure d'éthidium.
Les standards du gène «de ménage » cyclophilin B et des gènes cibles TGFβ, EL-lβ, T- bet, GATA3 et IL- 10 ont été obtenus chez Search-LC (Heidelberg, Allemagne). Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel - Les ARNm des gènes cibles TGFβ, IL-l β, T-bet, GATA3, IL- 10 et TNFα ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel en utilisant le LightCycler™ (Roche). Les réactions PCR ont été effectuées à l'aide du Fast- Start™ DNA Master SYBR Green I real-time PCR kit (Roche Molecular Biochemicals). Chaque PCR a été effectuée dans un volume final de 20 μl contenant 1 μl de LC-Fast Start Reaction Mix SYBR Green I, 1 μl de LC-Fast Start DNA Master SYBR Green I/Enzyme (incluant la Taq DNA polymerase, le tampon de réaction et un mélange de deoxynucleotides triphosphate), du MgCt (3 mM concentration finale), les amorces sens et anti-sens (0.5 μM concentration finale ; chacunes obtenues auprès de Search-LC - Heidelberg, Allemagne), et 10 μl de solution de cDNA. Après une étape de dénaturation de 10 min à 95 °C, l'amplification a été effectuée à l'aide de 40 cycles d'un protocote de
"touch-down" PCR (10 s à 95°C, 10 s d'hybridation à 68-58°C, suivi d'une extension de
16 s à 72°C). A la fin de chaque cycle, la fluorescence émise par le SYBR Green a été mesurée. Pour confirmer la spécificité de l'amplification, les produits PCR ont systématiquement fait l'objet d'une analyse de courbe de fusion (LightCycler™ - Roche).. Pour cela, les produits PCR ont été traités par une température croissante de 58 à 98°C avec une augmentation de 0,l°C/s. Pour chaque produit PCR, un seul pic a été obtenu lors de l'analyse de la courbe, caractérisé par une température de fusion spécifique. La combinaison des amorces pour la quantification de HMGl utilisée est celle décrite par Sotiriou et al (Brest Cancer Res. 2002, 4:1-8 correspondant aux amorces sens : 5'- GCG GAC AAG GCC CGT TA- 3' et anti-sens : 5'-AGA GGA AGA AGG CCG AAG GA-3' (produit PCR: 119 pb). Les combinaisons d' amorces nécessaires à la quantification du gène de ménage cyclophilin B et des gènes cibles TGFb, IL-lb, T-bet, GATA3 et EL- 10 ont été obtenu chez Search-LC (Heidelberg, Allemagne). Ainsi, pour le gène de ménage Cyclophilin B, le n° d'accesion Genbank était M60857 et on amplifiait la région 105-338. Pour l'IL-lb, le n° d'accesion Genbank était M15330 et on amplifiait la région 438-642. Pour TNFa, le n° d'accession Genbank était X01394, et on amplifiait la région 373-783. Pour Tbet , le n° d'accession Genbank était AF241243, et on amplifiait la région 461-669. Pour GATA3, le n° d'accession Genbank était X55037, et on amplifiait la région 1023-1294. Pour TGF-bl, le n° d'accession Genbank était X02812, et on amplifiait la région 1540-1818. Pour IL- 10, le n° d'accession Genbank étaitAY029171 , et on amplifiait la région 126-413 . La quantité d'ARNm cible relative à la quantité d'ARNm du gïnc de ménage cyclophilin B a été analysée par la technique de quantification relative avec le LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals). La "Second Derivative Maximum Method" du logiciel LightCycler™ (Roche) a été utilisée pour déterminer automatiquement le Crossing Point (Cp) pour chaque échantillon. La valeur du Cp a été définie comme le nombre de cycles pour lequel la fluorescence était significativement différente du bruit de fond.
Cinq dilutions en séries au 1/10 ont été réalisées en quadruplicate avec chaque standard afin de générer une courbe d'étalonnage exprimant le Cp en fonction du logarithme du nombre de copies. Les dilutions de standard ont été optimisées afin que la courbe d'étalonnage couvre le niveau d'expression attendu pour le gène cible et le gène de ménage. Les courbes standards relatives décrivant l'efficacité de PCR pour le gène cible et le gène de ménage ont été générées et utilisées pour réaliser une quantification avec le
LightCycler Relative Quantification Software (Roche Molecular Biochemicals).
Résultats obtenus Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 ci dessous.
Figure imgf000023_0001
Tableau 1
Ce tableau 1 présente le niveau d'expression des ARNm IL-10, IL-lβ, TNFα, HMGl, GATA3, TGFβ et T-bct chez 15 patients sains (S) et 42 patients développant un syndrome septique (SEP), obtenus à partir de prélèvements de sang total obtenu au cours des trois premiers jours suivant le début du syndrome septique. La comparaison entres le groupe des patients S et SEP a été effectuée à l'aide du test U non paramétrique de Mann Whitney et la valeur de probabilité (p) a été calculée. Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 1 sont les moyennes obtenues ± la SEM. Les valeurs étaient considérées comme statistiquement différentes lorsque la valeur de p obtenue était inférieure à 0,05. Les patients SEP présentaient un niveau d'expression des ARNm EL- 10 et TNFα significativement augmenté par rapport aux volontaires sains S (respectivement + 10% et + 4%). D'une manière surprenante, les inventeurs ont également montré une surexpression des ARNm d'HMGl chez les patients SEP (+ 50 %). De plus, les inventeurs ont également mis en évidence que le niveau d'expression des ARNm T-bct était significativement augmenté par rapport aux volontaires sains S (+ 24%). A l'inverse, l'expression des ARNm GATA3 était significativement diminuée chez les patients SEP par rapport aux volontaires sains S (- 70%). Conclusion - L'étude de l'expression des ARNm des gènes codant T-bct, et GATA3, mais également HMGl â partir de prélèvements de sang total permet ainsi le diagnostic d'un patient développant un syndrome septique.
Exemple 2 - Analyse par RT PCR de l'expression des gènes IL-10, TGFβ, HMGl, T- bet, BL-lβ, TNFα, GATA-3 pour le pronostic d'un syndrome septique
Dans un deuxième temps, les inventeurs ont recherché un outil pour le pronostic d'un syndrome septique au cours des premières 72 h suivant le début d'un choc septique.
Pour cela, une étude a été réalisée sur 42 patients SEP développant un syndrome septique, et admis dans le service de réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon- Sud. Plus précisément, ces patients en syndrome septique ont été sélectionnés au cours des premières 72 h suivant le début d'un choc septique selon les critères d'inclusions de l'American Collège of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine tels que définis précédemment. Chaque patient a été suivi au cours d'une période maximum de 28 jours. On distinguait alors un groupe de 26 patients développant un syndrome septique de bon pronostic (SEP-BP), et un groupe de 16 patients développant un syndrome septique de mauvais pronostic (SEP-MP).
Extraction des ARN et synthèse des cDNA - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1.
Préparation des standards pour la génération des gammes de quantification - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1.
Analyse de l'expression des ARNm par PCR en temps réel - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1.
Résultats obtenus
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci après.
Figure imgf000024_0001
Tableau 2
Ce tableau présente le niveau d'expression des ARNm IL- 10, IL-lβ, TNFα, HMGl, GATA3, TGFβ et T-bet chez des patients de bon pronostic (SEP-BP) et de mauvais pronostic (SEP-MP) obtenus à partir de prélèvements de sang total obtenus au cours des trois premiers jours suivant le début du choc septique. La comparaison entre le groupe des patients de bon pronostic et de mauvais pronostic a été effectuée à l'aide du test [/ non paramétrique de Mann Whitney et la valeur de probabilité (p) a été calculée. Les résultats sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les
ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La SEM (standard des écarts à la moyenne) a également été calculée pour chacun des groupes. Les valeurs présentées dans le tableau 2 sont les moyennes obtenues ± la SEM. Les valeurs étaient considérées comme statistiquement différentes lorsque la valeur de p obtenue était inférieure à 0,05.
Les patients de mauvais pronostic présentaient un niveau d'expression des ARNm IL- 10, TNFα et HMGl augmenté par rapport aux patients de bon pronostic. La différence était statistiquement significative pour l'IL-10 et HMGl. Al'inverse de l'EL-10, du TNFα et de HMGl, les patients de mauvais pronostic avaient tendance à présenter des niveaux d'expression des ARNm GATA3, Tbet, IL-lβ et TGFβ plus faibles que les patients de bon pronostic.
Les inventeurs ont mis en évidence que l'étude d'un profil d'expression de plusieurs gènes permet d'obtenir un outil de pronostic du syndrome septique, et notamment du choc septique. A ce titre, le tableau ci dessous présente une analyse de clusteiing hiérarchique de 36 patients SEP-BP et SEP-MP en utilisant l'expression de 2 à 5 gènes mesurés au cours des trois premiers jours suivant le début du choc septique. La fonction de clusteiing hiérarchique du logiciel Spofire a été utilisée pour faire cette analyse. Les résultats utilisés pour l'analyse sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène de ménage cyclophilin B. Afin de tenir compte des différences constitutives d'expression entre les gènes, les niveaux d'expression de chaque gène ont été normalisés en calculant une variable centrée réduite. Pour chacune des analyses effectuées, 2 sous clusters ont été obtenus, l'un regroupant essentiellement des patients de mauvais pronostic (SEP-MP), et l'autre, des patients de bon pronostic (SEP- BP). Le tableau 3 représente, pour chacun des 2 groupes, le pourcentage de patients clusterisés ensemble, c'est à dire le pourcentage de patients classé MP qui étaient effectivement de mauvais pronostic, et le pourcentage de patients classé BP qui étaient effectivement de bon pronostic.
Figure imgf000026_0001
Tableau 3
Ces résultats montrent que l'étude simultanée de l'expression de 2 gènes choisis parmi IL- 10, TGFβ, IL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3, et notamment TGFβ et HMGl, permet de bien classer plus de 80% des patients SEP-MP. Des résultats comparables étaient obtenus lors de l'étude simultanée de l'expression de 3 gènes choisis parmi IL- 10, TGFβ, EL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3, et notamment TGFβ, EL-lβ et HMGl, l'étude simultanée de l'expression de 4 gènes choisis parmi EL-10, TGFβ, EL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3, et notamment TGFβ, IL- lβ, IL- 10, et HMGl, l'étude simultanée de l'expression de 5 gènes choisis parmi IL- 10, TGFβ, IL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3, et notamment TGFβ, IL-lβ, EL-10, T-bet et HMGl.
Conclusion - L'analyse du profil d'expression d'au moins deux gènes choisis parmi IL- 10, TGFβ, IL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3 à partir de prélèvements de sang total permet ainsi un pronostic piécoce de la survie des patients présentant un syndrome septique, et développant notamment un choc septique. Plus particulièrement, l'analyse de l'expression d'un panel de gènes comprenant au moins IL-10, ILl-β, TGF- β, HMG-1 permet de discriminer très efficacement les patients de bons pronostics, des patients de mauvais pronostics. Ceci peut permette au médecin réanimateur d'identifier rapidement les patients de mauvais pronostic et donc d'orienter la prise en charge du patients vers l'utilisation de traitements lourds et coûteux.
Exemple 3 - Analyse sur puce à ADN de l'expression des gènes IL-10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL-lβ, TNFα, GATA-3 pour le pronostic d'un syndrome septique
Les résultats présentés dans l'exemple 2 ont été validés par l'utilisation d'une autre technique, apphquee sur de nouveaux écahntiUons de patients. Pour cela , une étude a été réalisée sur 31 patients développant un syndrome septique, et admis dans le service de réanimation Chirurgicale ou Médicale du centre hospitalier Lyon- Sud. Plus précisément, ces patients en syndrome septique ont été sélectionnés entre le deuxième et le quatrième jours suivant le début d'un choc septique selon les critères d'inclusions de l' American Collège of Chest Physicians / Society of Critical Care Medicine tels que définis précédemment. Chaque patient a été suivi au cours d'une période maximum de 28 jours.
On distinguait alors un groupe de 21 patients développant un syndrome septique de bon pronostic (SEP-BP), et un groupe de 10 patients développant un syndrome septique de mauvais pronostic (SEP-MP).
Extraction des ARN - Cette étape a été réalisée selon le protocole précédemment décrit dans l'exemple 1.
Analyse de l'expression des ARNm sur puce à ADN- une synthèse d'ADNc puis d'ADN double brin a été effectuée à partir des ARN extraits. Les ADN double brin ont été ensuite utilisés comme base pour une transcription in vitro au cours de laquelle le marquage des cRNA est effectué. Les ARNc ont ensuite été hybrides sur la puce. Le scanner permettait la lecture de la fluorescence. Résultats obtenus Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 1. On retrouve sur le dendograme 31 colonnes correspondant aux 31 échantillons de patients, et 5 lignes correspondant aux 5 sondes utilisées pour l'analyse de l'expression des 5 gènes cibles. Les échantillons, ainsi que les gènes ayant un profil d'expression comparable, mis en évidence par une corrélation de type Pearson, ont été placés côte à côte. Les échantillons ont été classés selon la méthode de moyenne non-pondérée (Spotfire Décision Site for Functional Genomics V7.1, manual) alors que les gènes ont été classés selon la valeur moyenne d'expression obtenue dans l'ensemble des échantillons. Après normalisation des signaux de fluorescence générés par le logiciel Microarray Suite (MAS5.0, Affymetrix), le niveau d'expression est représente par différents niveaux (b couleur. Ainsi, la couleur blanche correspond à un faible niveau d'expression, la couleur grise correspond à un niveau d'expression intermédiaire, alors que la couleur noire correspond à un fort niveau d'expression. La longueur des branches du dendograme est corrélée au profil d'expression et la ligne en pointillée qui divise le dendograme permet de distinguer deux groupes de patients : un premier groupe de patients de mauvais pronostic C'SEP-MP" et un deuxième groupe de patients de bon pronostic USEP-BP". Ces résultats montraient que l'étude simultanée de l'expression de 5 gènes choisis parmi EL-10, TGFβ, IL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3, et notamment TGFβ, EL-lβ, IL-10, GATA-3 et HMGl permettent de bien classer 70% des patients.
Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que l'étude d'un profil d'expression de plusieurs gènes tel que défini dans l'exemple 2 pour des patients au cours des premières 72 h suivant le début d'un choc septique, était également applicable pour des patients entre le deuxième et quatrième jours suivant le début d'un choc septique.
Conclusion - L'analyse du profil d'expression d'au moins deux gènes choisis parmi IL- 10, TGFβ, IL-lβ, HMGl, T-bet, TNFα, GATA3 à partir de prélèvements de sang total permet ainsi un pronostic de la survie des patients au cours des premières 72 h suivant le début d'un choc septique, mais aussi entre le deuxième et quatrième jours suivant le début d'un choc septique Plus particulièrement, l'analyse de l'expression d'un panel de gènes comprenant au moins IL- 10, ILl-β, TGF- β, HMG-1 permet de discriminer très efficacement les patients de bons pronostics, des patients de mauvais pronostics, en tout début de choc septique, comme quelques jours après. Ceci peut permettre au médecin réanimateur d'identifier rapidement les patients de mauvais pronostic et donc d'orienter la prise en charge du patients vers l'utilisation de traitements lourds et coûteux.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants: réactif spécifique du gène cible EL- 10, réactif spécifique du gène cible TGFβ, réactif spécifique du gène cible HMGl, réactif spécifique du gène cible T-bet, réactif spécifique du gène cible EL- lβ, réactif spécifique du gène cible TNFα, réactif spécifique du gène cible GATA-3 c. on détermine l'expression d'au moins quatre gènes cibles choisis parmi : EL- 10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL-lβ, TNFα, GATA-3.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le matériel biologique est un acide nucléique.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le réactif spécifique de l'ELlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible EL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-lβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible EL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le réactif spécifique de l'ELlO comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-lβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible LL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.
6. Procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique sélectionné parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d' IL- 10, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène GATA-3. c. on détermine l'expression d'au moins un gène cible choisis parmi : EL- 10, T-bet, GATA-3.
7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon sanguin.
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7 dans lequel le matériel biologique est un acide nucléique.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 dans lequel le réactif spécifique de l'TLlO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique deT-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 dans lequel le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique deT-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.
11. Kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique comprenant au moins quatre réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène TGFβ, réactif spécifique du gène HMGl, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène IL-lβ, réactif spécifique du gène TNFα, réactif spécifique du gène GATA-3.
12. Kit selon la revendication 11 selon lequel le réactif spécifique de ÎTLIO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T- bet, le réactif spécifique de l'IL-lβ comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
13. Kit selon la revendication 11 selon lequel le réactif spécifique de l'ILlO comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique de TGFβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TGFβ, le réactif spécifique de HMGl comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible HMGl, le réactif spécifique de T-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, le réactif spécifique de l'IL-lβ comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL-lβ , le réactif spécifique de TNFα comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible TNFα et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.
14. Kit de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique comprenant au moins un réactif spécifique sélectionné parmi les réactifs spécifiques suivants : réactif spécifique du gène d'IL-10, réactif spécifique du gène T-bet ; réactif spécifique du gène GATA-3.
15. Kit selon la revendication 14 selon lequel le réactif spécifique de ÎTLIO comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique deT-bet comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible T-bet, et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une amorce d'amplification spécifique du gène cible GATA 3.
16. Kit selon la revendication 14 selon lequel le réactif spécifique de ÎTLIO comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible IL- 10, le réactif spécifique deT-bet comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible T-bet, et/ou le réactif spécifique de GATA 3 comprend au moins une sonde d'hybridation spécifique du gène cible GATA 3.
17. Procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait du matériel biologique de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins deux réactifs spécifiques sélectionnés parmi les réactifs spécifiques suivants: réactif spécifique du gène cible IL- 10, réactif spécifique du gène cible TGFβ, réactif spécifique du gène cible HMGl, réactif spécifique du gène cible T-bet, réactif spécifique du gène cible IL-1 β, réactif spécifique du gène cible TNFα, réactif spécifique du gène cible GATA-3 c. on détermine, en une seule étape, l'expression d'au moins deux gènes cibles choisis parmi : IL-10, TGFβ, HMGl, T-bet, IL-lβ, TNFα, GATA-3.
18. Procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un syndrome septique selon lequel: a. on dispose d'un échantillon biologique du patient et on extrait les ARN totaux de l'échantillon biologique b. on dispose d'au moins un réactif spécifique du gène HMGl c. on détermine l' expression des ARNm du gène HMGl .
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