WO2004106520A1 - 植物遺伝子活性化ベクターおよびその利用 - Google Patents

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Toshiya Muranaka
Hikaru Seki
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Definitions

  • the present invention relates to a plant gene activation vector and its use.
  • an activation tagging method As a method for activating a plant gene, there is an activation tagging method. This is because in a transformed plant in which a vector capable of functioning in a plant cell or having an enhancer or a promoter sequence is introduced into a plant via Agrobacterium mmefaciens, the DNA of the vector is introduced. This is a method of activating a gene in the vicinity by the action of an inserted enhancer or promoter (Experimental protocol for model plants, Cell Engineering Supplement, Plant Cell Engineering Series 4, Isao Shimamoto, Supervised by Kiyotaka Okada, Shujunsha , 199 6, pl 3 5-1 4 2).
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the conventional technology. That is, the present invention provides a vector and a method that can relatively easily and efficiently perform the steps from introduction of an enhancer or promoter sequence to activation of a plant gene. Providing was made an issue to be solved. Another object of the present invention is to establish a technique for rapidly activating a plant gene in hairy roots.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, invented a plant gene activation vector, and found that hairy roots induced by infection with Agrobacterium mmefaciens carrying the plant gene activation vector were reduced.
  • the present inventors have found a method for activating genes by using the present invention, and have completed the present invention.
  • infection with the soil bacterium Agrobacterium rhizogenes induces hairy roots from the infected site. This is because the hairy root-inducing gene, which is present in the T-DNA on the Ri plasmid of the fungus, enters the plant genome.
  • a plant gene activation vector having both a hairy root inducing gene and an enhancer or promoter sequence capable of functioning in a plant was disclosed, and an Agrobacterium territory containing the plant gene activation vector was identified.
  • hairy roots were induced from infected sites by infecting plants with M. memmefaciens.
  • the induction of hairy roots is an event that occurs independently in each cell infected with the fungus, it was found that each of the induced roots was a different hairy root clone. Plant gene activation was found to occur in the clone.
  • a terminator having (1) a hairy root inducing gene, and (2) having an enhancer and / or promoter capable of functioning in a plant, and capable of functioning in a plant downstream thereof.
  • a plant gene activation vector comprising an expression cassette that is substantially free is provided.
  • the hairy root inducing gene comprises the rolB gene.
  • the enhancer is from the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • a plant gene activity vectors of the present invention having a P HR- AT, or a substantially identical functions identical nucleotide sequence ⁇ Pi substantially having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 3 It is.
  • the plant gene activity vector of the present invention comprises the base set forth in SEQ ID NO: 14 P HR- AT has the sequence - GFP, or its substantially a vector having the same nucleotide sequence and substantially the same function.
  • a plant tissue is infected with an Agrobacterium tumefaciens bacterium having any of the above-described plant gene activation vectors of the present invention
  • a method for activating a plant gene comprises introducing the gene into a plant tissue to form a hairy root.
  • a plant tissue is infected with an Agrobacterium tumefaciens bacterium having any of the above-described plant gene activation vectors of the present invention
  • an expression cassette having a hairy root inducing gene and (2) having an enhancer and a Z or promoter operable in a plant, and substantially free of a terminator operable in a plant downstream thereof.
  • a plant root in which gene expression is induced by the above-mentioned enhancer and Z or a promoter after the hair roots are formed in the plant tissue to form hairy roots.
  • a plant tissue is infected with an Agrobacterium tumefaciens bacterium having any of the above-described plant gene activation vectors of the present invention
  • an Agrobacterium pumefaciens bacterium having any of the above-described plant gene activation vectors of the present invention.
  • Figure 1 shows the structure of pPCVICE (AscI-Avrll). HPT; hygromycin phosphotransferase gene, Ampr; i3-lactamase gene, ori; Col El replication Starting point, 35S ⁇ 4; 4 tandem repeats of cauliflower mosaic virus 35S promoter enhancer, RB; T-DNA right border sequence, LB; T-DNA left border sequence.
  • FIG. 2 shows a structure diagram of a P HR- AT.
  • rolA, B, C The rolA, rolB and rolC genes encoded on the Ri plasmid and pRil724 of the Agrobacterium rhizogenes MAFF03-0172 strain.
  • FIG. 3 shows the structure of pHR-AT-GFP. 35SP; Powerful reflex mosaic virus 35S promoter, GFP; Green Fluorescent Protein N N0ST; Nopaline synthase gene terminator.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of Northern hybridization.
  • the “hairy root inducing gene” used in the present invention is a gene present on the Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes, which is a gene that differentiates into a root of a plant cell transformed with the gene. That is.
  • the rolB gene of Agrobacterium rhizogenes A4 strain (Slighton et al., J. Biol. Chem. 261, 108-121 (1986)
  • Rologenes MAF03-1724 strain rolB gene Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 5-192154).
  • the rolB gene may be used alone, or the rolA gene and rolC gene present on the Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes (Slighton et al., J. Biol. Chem. 261, 108-121 (1986); It can also be used in combination with Kaihei 5-19.21 5.4).
  • the “enhancer that can function in plants” used in the present invention is a DNA sequence present in the genome of eukaryotic cells, which is a DNA sequence that significantly promotes transcription from a plant promoter located in the vicinity. That is, for example, a DNA sequence in the range of ⁇ 90 to 44 bases in the 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus can be exemplified. This enhancer sequence can be used alone, or 2 to 10, preferably 4 to 5, connected in series.
  • the “promoter operable in a plant” used in the present invention is a gene operable in a plant having a region involved in regulation of gene expression such as transcription and translation initiation, and is, for example, a nopaline synthase gene (N0S). Promoters, constitutive promoters derived from T-DNA such as the otatobin synthase gene (0CS) promoter, promoters derived from plant viruses such as the 19S and 35S promoters derived from the force reflower mosaic virus (CaMV), and phenylalanine ammonia lysate. And a promoter of the force / recon synthase (CHS) gene and a promoter of the pathogenesis-related protein (PR) gene.
  • N0S nopaline synthase gene
  • a gene promoter that highly expresses a tobacco TobRB7 gene promoter, a tobacco CIG2 gene promoter, a tobacco parAt gene promoter, etc. in roots can be used.
  • a terminator that can function in a plant refers to a terminator that can function in a plant.
  • Terminators derived from T-DNA such as the nopaline synthase gene (N0S) terminator and the otatobin synthase gene (0CS) terminator.
  • N0S nopaline synthase gene
  • 0CS otatobin synthase gene
  • a tobacco par At gene terminator and other known terminators that can function in plant roots can also be mentioned.
  • "An expression cassette not contained in” is defined as (1) having the "hairy root-inducing gene” and (2) having the “enhancer or promoter functional in plants” and " It is an expression cassette that does not substantially contain a “functional terminator”.
  • the DNA sequence downstream of the “enhancer or promoter that can function in plants” is not particularly limited as long as it is a DNA sequence that does not substantially contain “a terminator that can function in plant roots”.
  • signal sequence genes such as a chloroplast translocation signal sequence and a mitochondrial translocation signal sequence, and a DNA sequence substantially free of "a terminator capable of functioning in plant roots" can be added.
  • the expression cassette used in the present invention may further include, as necessary, a sequence containing an origin of replication in Escherichia coli, a kanamycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and an erythropillin, in addition to the above (1) and (2). It may contain a drug resistance marker such as a resistance gene, or a reporter gene such as a GFP gene, a luciferase gene, and a GUS gene.
  • the “plant gene activation vector” used in the present invention is the above-mentioned “(1) having a hairy root inducing gene, and (2) having an enhancer or promoter that can function in a plant, and a plant downstream thereof.
  • An expression cassette characterized by substantially not containing a terminator operable in the above. Normally, it is replicable in Agrobacterium.
  • T-D of a binary vector modified from BIN19 Bevan, Nucleic Acids. Res., 12, 8711-8721 (1984)
  • the cassette is inserted and used as a plant gene activation vector. Examples of such a plant gene activation vector include pHR-AT and pHR-AT-GFP.
  • the “Agrobacterium termefaciens” used in the present invention is not particularly limited as long as it is a bacterium classified as Agrobacterium termefaciens.
  • ⁇ glow butter Terri ⁇ -time Mmefashiensu GV3101 P MP90RK Ltd.
  • EHA101 strain ⁇ Glo Park Terri ⁇ -time Mmefashiensu, the like can be exemplified ⁇ Glo Bata Terri ⁇ -time Mmefu Ashensu LBA4404 strain.
  • Plant gene activation vector is introduced into Agrobacterium mesmefaciens by electroporation, calcium chloride, etc. described in Plant Cell Engineering vol. 4 No. 3 pl93-203 (1992). (Hereinafter, referred to as the transformed Agrobacterium mmefaciens of the present invention).
  • the transformed Agrobacterium tumefaciens of the present invention can be prepared according to the method for inducing hairy roots using Agrobacterium rhizogenes described in Plant Cell Engineering vol. 4 No. 3 pl93-203 (1992). Hairy roots can be induced by infecting plant tissue with hair.
  • Infectious plants are not specified, but legumes such as soybean, endu, alfalpha, kidney bean, Miyakodasa, and kanzo, solanaceous plants such as tobacco, tomato, eggplant, potato, and goldfish, radish, rapeseed, cabbage, and Arabidopsis And other plants such as cruciferous plants such as cruciferous plants, melons, cucumber, and pumpkins; agaric plants such as carrots and celery; and asteraceous plants such as jojugiku.
  • legumes such as soybean, endu, alfalpha, kidney bean, Miyakodasa, and kanzo
  • solanaceous plants such as tobacco, tomato, eggplant, potato, and goldfish, radish, rapeseed, cabbage, and Arabidopsis And other plants
  • cruciferous plants such as cruciferous plants, melons, cucumber, and pumpkins
  • agaric plants such as carrots and celery
  • asteraceous plants such as jojugiku.
  • the hairy roots obtained by the present invention can be separated and clawed one by one as necessary. After that, it may be used, or a plurality of hairy roots may be used as a group.
  • the hairy roots obtained by the present invention include those in which the gene is activated, and therefore, for example, those in which the gene involved in enhancing the biosynthesis of plant steroids is activated. If you want to obtain it, analyze the hairy root extract using an analyzer that combines a capillary electrophoresis and a quadrupole / time-of-flight hybrid mass spectrometer in series, and analyze the hair with an increased plant steroid content. Root clones can be selected. In addition, if it is desired to obtain an activated gene involved in salt tolerance, a population of multiple hairy roots should be cultured in a high-salt culture medium and hairy root clones should be selected. Can be done. '
  • Genomic DNA is extracted from these hairy root clones using an IS0PLAT (Nippon Gene (registered trademark)) DNA extraction kit, etc., and a PCR experiment protocol for a new version of the plant, Cell Engineering Separate Volume Plant Cell Engineering Series 7, Isao Shimamoto, The TAIL-PCR method described in Takuji Sasaki, Shujunsha, 1997, p83-89, etc., revealed the partial sequence of the gene on the plant genome into which the "expression cassette" was inserted. I do.
  • these hairy root clones are the transforming agroproteins of the present invention, which carry a plant gene activation vector containing a vector containing a sequence including a replication origin in Escherichia coli and a drug resistance marker. If it is obtained by Terumium ⁇ mefaciens, it is described in Experimental Protocol of New Model Plant, Cell Engineering Separate Volume Plant Cell Engineering Series 15, Isao Shimamoto, Kiyotaka Okada, Shujunsha, 2001, pl35-142 By the plasmid rescue method used, the partial sequence of the gene on the plant genome into which the “expression cassette” has been inserted is determined.
  • Gene expression levels are described in the new version of the PCR protocol for plants, Cell Engineering Separate Volume, Plant Cell Engineering Series 7, Isao Shimamoto, Takuji Sasaki, Shujunsha, 1997, 106-115 Gene activation can be detected by RT-PCR or the like.
  • the hairy root clone having the gene activated as described above can be used as it is after being cultured.
  • hairy root clones enhanced with plant steroids By culturing in a large amount, it can be used for production of plant steroids.
  • the gene can be cloned by a conventional method and, if necessary, introduced into another plant for use.
  • a gene that has been activated with respect to salt tolerance can be imparted with salt tolerance by introducing the gene into a plant that does not have salt tolerance.
  • Example 1 Construction of pHR-AT for rol-type activity tagging vector
  • Oligonucleotide Ascl-Avrll (Clal +) (SEQ ID NO: 1) and oligonucleotide Ascl-Avrll (Clal-) (SEQ ID NO: 2) were synthesized. Upstream by mixing 100 M Asc I-Avr II (Clal +) and 100 ⁇ - Ascl-Avrll (Clal-) in 20 ⁇ l each, heat treating at 70 ° C for 5 minutes, and returning to room temperature. A double-stranded DNA containing restriction enzymes Ascl and AvrII sites and having 5′-CG-3 ′ 5′-protruding ends at both ends was prepared.
  • DNA region containing the rolA, rolB and rolC genes encoded on Ri plasmid and pRil724 of the Agrobacterium rhizogenes MAFF03-01724 strain (Tanaka et al., Biosci. Biotech. Biochem 58: 548-551 ( 1994), GENB (session number D23669) as type III, a sense primer D23669 (1+, AscI / EcoRI) (SEQ ID NO: 3) with restriction enzymes Ascl and EcoRI site added to the end, and a restriction enzyme Avrll.
  • Antisense primer D23669 (7555-, Avrll) with a site added to the 5 'end Using (SEQ ID NO: 4), PfuTurbo DNA Polymerase (registered trademark of STRATAGENE) was used for 25 minutes at 94 ° C for 2 minutes, followed by 94 ° C for 30 seconds, then 62 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 11 minutes as one cycle. PCR was performed. As a result of analyzing the DNA amplified by the PCR by agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 7.6 Kb was obtained. This DNA fragment was digested with restriction enzymes Ascl and Avrll.
  • the plasmid pPCVICE (Ascl-Avrll) was digested with the restriction enzymes Ascl and Avrll, and the above-described Ascl-Avrll fragment of about 7.6 Kb was ligated with the DNA Ligation Kit Ver. pHR-AT was constructed (Fig. 2).
  • the nucleotide sequence of pH-AT (17511 bp) is shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
  • Example 2 Construction of rol-type activation tagging vector pHR-AT-GFP Construction of a fragment having the force reflower mosaic virus 35S promoter, the sGFP (S65T) gene and the nopaline synthase gene terminator Sense primer 35S-5 (Ascl) with 35S omega-sGFP (S65T) (Chiu et al., Current Biol 6: 325-330 (1996)) as a type I and a restriction enzyme Ascl site attached to the 5 'end.
  • pHR-AT constructed in Example 1 was digested with restriction enzymes Ascl and EcoRI, and the above-described Ascl-EcoRI fragment of about 1.4 Kb was ligated to construct pHR-AT-GFP (FIG. 3).
  • the nucleotide sequence (18987 bp) of pHR-AT-GFP is shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • YEP medium After adding 1 ⁇ g of the pHR-AT and pHR-AT-GFP, and treating with 37 ⁇ for 5 minutes, 1 ml of YEP medium was added, followed by shaking culture at 28 ° C and 200 rpm for about 2 hours. After collecting cells by centrifugation at 2,000 xg for 2 minutes, the cells were suspended in YEP medium 100.
  • the bacterial solution was carbecillin lOOmg / 1, rifampicin lOOmg / 1 and gen.
  • the transfected agrobacterium ummefaciens was coated on a YEP agar medium containing 25 mg / l of tamycin.
  • the transformed agrobacterium.memmefaciens utilizes the drug resistance to carbenicillin conferred by the 3-lactamase gene of the introduced plasmid.
  • the transformed Agrobacterium mmefaciens was transformed into a YEP medium containing carbenicillin lOOmg / 1, rifampicin lOOmg / 1 and gentamicin 25 mg / l at 28 ° C. After culturing for 2 days, the plasmid was purified from the obtained culture solution, and it was confirmed that pHR-AT was present having pHR-AT-GFP
  • Example 4 Transformation of Arabidopsis thaliana
  • Arabidopsis thaliana ecotype WS seeds were sterilized with a hypochlorous acid solution having an effective chlorine concentration of 1%, placed on MS agar medium, and treated at 4 ° C for 2 days. The cells were cultured at 26 ° C for 16 days with a photoperiod of 16 hours for germination. Hypocotyls are cut from the germinated seedlings, placed on an MS medium supplemented with 4 ⁇ of 2,4-D and 0.4 / iM benzyladenine, and cultured at 26 ° (7 days at a day length of 16 hours).
  • Example 4 Arabidopsis transformed with pHR-AT_GFP induced in Example 4 Roots were cut one by one so as to include the root tip, and HF agar medium (Agric Medium) supplemented with 250 mg / l claforan and 25 mg / l hygromycin was added. Biol. Chem. 50, 2715 (1986)). Each transformed root clone was placed in 30 ml of HF liquid medium, and cultured by spinning at 26 ° C. and 100 rpm in an Inoparaplatform shaker type 230 (New Brunswick Scientific). . Approximately 1 g wet weight of hairy roots that grew every four weeks were placed in 30 ml of fresh HF liquid medium and subcultured.
  • Example 6 Confirmation of transgene by genomic Southern analysis
  • Genomic DNA was extracted from the transformed root clones subjected to liquid culture using Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the attached protocol. After 10 g of the prepared genomic DNA was completely digested with the restriction enzyme Nhel, the whole amount was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis fractionation. After the electrophoresis, transfer the DNA to a Hybond-N + nylon membrane filter (Amersham®) according to the method of Chomczynski (Anal. Biochem. 201: 134-139 (1992)), and then at 120 ° C for 30 minutes. The DNA on the membrane was fixed by baking.
  • the probe used for the hybridization was prepared using a PCR DIG probe synthesis kit (Roche). Using pPCVICEn4HPT plasmid lng as type ⁇ and using sense primer AMPR5 (SEQ ID NO: 7) and antisense primer AMPR3 (SEQ ID NO: 8) in the presence of 70 ⁇ M DIG-11-dUTP at 94 ° C for 2 minutes A DIG-labeled 13-lactamase gene DNA fragment was obtained by performing PCR consisting of 35 cycles, with one cycle of incubation at 94 ° C for 30 seconds, then 55 ° C for 30 seconds, and further 72 ° C for 3 minutes.
  • RNAWIZTM RNAWIZTM from other independent transformed root clones (1-A and 4-A).
  • RNA was prepared using (Ambion) according to the attached protocol. 15 g of the obtained RNA was subjected to 1% formaldehyde agarose gel electrophoresis. After electrophoresis, transfer the RNA to a Hybond-N + nylon membrane filter (Amersham®) according to the method of Chomczynski (Anal. Biochem. 201: 134-139 (1992)), and bake at 120 ° C for 30 minutes. This fixed the RNA on the membrane. The probe was prepared by the following method. CDNA was synthesized from total RNA prepared from the transformed root clone 4-D using TakaRa RNA PCR Kit (layer) Ver. 2.1 (Takara Shuzo) according to the attached protocol.
  • cDNA 2 / Z1 as type I, using TaKaRa Ex TaqTM (Takara Shuzo), using sense primer At5g02710-5 (SEQ ID NO: 11) and antisense primer At5g02710-3 (SEQ ID NO: 12) After 2 minutes at 94 ° C, PCR is performed for 25 cycles, with 1 cycle of incubation at 94 ° C for 30 seconds, then at 55 ° C for 30 seconds, and then at 72 ° C for 1 minute, which corresponds to the full-length coding region of the At5g02710 gene. An approximately 540 bp cDNA fragment was isolated.
  • the obtained cDNA fragment was cloned into the pCRII-TOP0 vector using a TOPO TA Cloning kit (Invitrogen), and the nucleotide sequence was determined to confirm the direction of insertion of the cDNA fragment.
  • RNA complementary to At5g02710 gene mRNA expressed in vivo was synthesized by an in vitro transcription reaction. Plasmids containing At5g02710 gene cDNA were linearized with the restriction enzyme EcoRV, and the obtained DNA fragment (1 ⁇ ⁇ ) was used as a type II SP6 RA polymerase (Roche) and DIG RNA Labeling Mix.
  • plant genes can be rapidly activated in hairy roots.
  • the gene activated by the present invention can be used for producing useful components, producing useful plants such as stress-tolerant plants, and the like.

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Abstract

　本発明の目的は、エンハンサーあるいはプロモーター配列の導入から植物遺伝子の活性化までを比較的簡単に効率よく行うことができるベクターおよび方法を提供することである。本発明によれば、（１）毛状根誘発遺伝子を有し、かつ（２）植物で機能可能なエンハンサー及び／又はプロモーターを有し、その下流に植物で機能可能なターミネーターを実質的に含まない発現カセットから構成される植物遺伝子活性化ベクターが提供される。

Description

明細書
植物遺伝子活性化べクタ一およびその利用 技術分野
本発明は植物遺伝子活性化べクターおよびその利用に関する。 背景技術
植物遺伝子を活性化させる方法として、アクティベーションタギング法がある。 これは、 植物細胞で機能可能なあるいはェンハンサーあるいはプロモータ一配列 をもつベクターを、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス菌を介して植物に導 入し、 ベクターの D NAが導入された形質転換植物において、 挿入されたェンハ ンサーあるいはプロモーターの作用により、 その近傍の遺伝子を活性ィヒさせる方 法である （モデル植物の実験プロトコール、 細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 4、 島本功、 岡田清孝監修、 秀潤社、 1 9 9 6、 p l 3 5 - 1 4 2 ) 。 この方法 により活性化された遺伝子がいくつか単離されているが、 そのほとんどが、 シロ ィヌナズナ由来の遺伝子である （Weigel ら、 Plant Physiol. 122, 1003-1013 (2000) ) 。 ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス菌を用いたァクティべーショ ンタギング法では、 植物体にまで再分化させることが多く、 そのため、 形質転換 植物体を数多く扱えるシロイヌナズナのような小型の実験植物に使用が限られて いた。 さらにこのような小型の実験植物であってもァグロバタテリゥム ·ッメフ ァシエンス菌の感染から、 植物体の再分化、 遺伝子の活性化に至るまでに、 多大 な時間と労力が必要であった。 発明の開示
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。 すなわち、 発明は、 ェンハンサーあるいはプロモーター配列の導入から植物遺伝 子の活性化までを比較的簡単に効率よく行うことができるベクターおよび方法を 提供することを解決すべき課題とした。 本発明はまた、 植物遺伝子を毛状根にお いて迅速に活性化する手法を確立することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 植物遺伝子活性化 ベクターを発明し、 該植物遺伝子活性化ベクターを保持するァグロパクテリゥ ム ·ッメファシエンス菌の感染により誘発される毛状根を用いることによる遺伝 子活性化法を見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 土壌細菌ァグロパクテリウ ム * リゾゲネスを感染させることにより、 感染部位から毛状根が誘発される。 こ れは菌が持つ R iプラスミド上の T- DNAに存在する毛状根誘発遺伝子が植物ゲノ ムに入ることによる。 そこで毛状根誘発遺伝子、 および、 植物で機能可能なェン ハンサーあるいはプロモータ一配列の両者を持つ植物遺伝子活性化べクタ一を発 明し、 該植物遺伝子活性化ベクターを保持するァグロバタテリゥム ·ッメファシ エンス菌を植物に感染させることにより、 感染部位から毛状根が誘発されること を見出した。 しかも毛状根の誘発が、 菌が感染した各々の細胞で独立に起こるィ ベントであるため、 誘発された一本一本の根はそれぞれ異なる毛状根クローンで あることを見出し、 毛状根クローンにおける植物遺伝子活性化が生じることを見 出した。
すなわち、 本発明によれば、 （1 ) 毛状根誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物 で機能可能なェンハンサー及び /又はプロモーターを有し、 その下流に植物で機 能可能なターミネータ一を実質的に含まない発現カセットから構成される植物遺 伝子活性化べクタ一が提供される。
好ましくは、 毛状根誘発遺伝子は、 rolB遺伝子を含む。
好ましくは、 ェンハンサ一は、 カリフラワーモザイクウィルス 3 5 Sプロモー ター由来である。
好ましくは、 本発明の植物遺伝子活性ベクターは、 配列番号 1 3に記載の塩基 配列を有する PHR- AT、又はこれと実質的に同一の塩基配列及ぴ実質的の同一の機 能を有するベクターである。
好ましくは、 本発明の植物遺伝子活性ベクターは、 配列番号 1 4に記載の塩基 配列を有する PHR- AT - GFP、又はこれと実質的に同一の塩基配列及び実質的の同一 の機能を有するベクターである。
本発明の別の側面によれば、 上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化べク ターを保持するァグロバタテリゥム ·ッメファシエンス菌を植物組織に感染し、
( 1 ) 毛状根誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能可能なェンハンサー及ぴ Z又はプロモーターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質 的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、毛状根を形成させることを含む、 植物遺伝子の活性化方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、 上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化べク ターを保持するァグロバタテリゥム ·ッメファシエンス菌を植物組織に感染し、
( 1 ) 毛状根誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能可能なェンハンサー及ぴ Z又はプロモータ一を有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質 的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、 毛状根を形成させた後に、 上記 ェンハンサー及ぴ Z又はプロモーターによつて遺伝子発現が誘発された毛状根を 選抜することを含む、 植物遺伝子の分析方法が提供される。
本発明の別の側面によれば、 上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化べク ターを保持するァグロバタテリゥム ·ッメファシエンス菌を植物組織に感染し、
( 1 ) 毛状根誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能可能なェンハンサー及び /又はプロモーターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質 的に含まない発現カセットを植物組織に導入し、 毛状根を形成させることにより 得られる、 植物遺伝子の発現が誘発された毛状根が提供される。
本発明の別の側面によれば、 上記した何れかの本発明の植物遺伝子活性化べク ターを保持するァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス菌が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は pPCVICE (AscI- Avrll)の構造図を示す。 HPT;ハイグロマイシンフォスフ オトランスフェラーゼ遺伝子、 Ampr; i3 -ラクタマーゼ遺伝子、 ori ; Col El複製 開始点、 35S x 4;カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーターェンハンサー の 4タンデムリピート、 RB; T-DNAライトボーダー配列、 LB; T-DNAレフトボーダ 一配列を示す。
図 2は PHR- AT の構造図を示す。 rolA, B, C; ァグロパクテリゥム .リゾゲネス MAFF03-0172 株の有する Riプラスミド、 pRil724上にコードされる rolA, rolB およぴ rolC遺伝子を示す。
図 3は pHR- AT- GFPの構造図を示す。 35SP;力リフラヮーモザィクウィルス 35S プロモーター、 GFP; Green Fluorescent ProteinN N0ST ; ノパリンシンターゼ遺 伝子ターミネータ一を示す。
図 4はノザンハイブリダィゼーションの結果を示す図である。
パネル上： At5g02710をプローブとしたノザンハイブリダィゼーションを示す。 パネル下： トータル RNAの電気泳動を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。 なお、 以下に記述された遺伝子工学的 方法は、例えば、 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd editionj (1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6、 「Current Protocols in Molecular Biology」 （1987) , John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471- 50338- X、
「モデル植物の実験プロトコール、 細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 4、 島本 功、 岡田清孝監修、 秀潤社」 （1 9 9 6 ) 、 「新版植物の P C R実験プロトコ一 ル、 細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 7、 島本功、 佐々木卓治監修、 秀潤社」
( 1 9 9 7 ) 等に記載される通常の方法に準じて実施可能である。
( 1 ) 毛状根誘発遺伝子
本発明で用いられる 「毛状根誘発遺伝子」 は、 ァグロパクテリゥム · リゾゲネ ス菌の Riプラスミド上に存在する遺伝子であって、該遺伝子で形質転換した植物 細胞を根に分化する遺伝子のことである。 たとえばァグロバタテリゥム · リゾゲ ネス A4株の rolB遺伝子 (Slightonら、 J. Biol. Chem. 261, 108-121 (1986) )、 ァグロバタテリゥム . リゾゲネス MAF03- 1724株の rolB遺伝子 （特開平 5 - 1 9 2 1 5 4 ) などが例示できる。 rolB遺伝子は、 単独で用いてもよいし、 ァグロバ クテリゥム 'リゾゲネス菌の Riプラスミド上に存在する rolA遺伝子、 rolC遺伝 子（Slighton ら、 J. Biol. Chem. 261, 108 - 121 (1986)、 特開平 5— 1 9 2 1 5 4 )などと組み合わせて用いることもできる。
( 2 ) ェンハンサー
本発明で用いられる 「植物で機能可能なェンハンサー」 は、 真核細胞おょぴゥ ィルスのゲノムに存在する DNA配列で、 その近傍に存在する植物プロモーターか らの転写を著しく促進する DNA配列のことであり、 たとえば、 カリフラワーモザ ィクウィルス由来の 35Sプロモーター中の- 9 0から 4 4 0塩基の範囲の DNA配 列を例示することができる。 このェンハンサー配列は単独で用いることもできる し、 2ないし 1 0個、好ましくは 4ないし 5個直列に繋げて用いることができる。
( 3 ) 植物プロモーター
本発明で用いられる 「植物で機能可能なプロモーター」 は、 植物で機能可能な 転写および翻訳開始等の遺伝子発現調節に関与する領域を有する遺伝子のことで あり、例えば、 ノパリン合成酵素遺伝子 (N0S)プロモーター、オタトビン合成酵素 遺伝子（0CS)プロモーターなどの T- DNA由来の構成型プロモーター、力リフラワー モザイクウィルス（CaMV)由来の 19S及び 35Sプロモーターなどの植物ウィルス由 来のプロモーター、フエ二ルァラニンアンモニアリァーゼ（PAL)遺伝子プロモータ 一、 力/レコンシンターゼ（CHS)遺伝子のプロモーター、 Pathogenesis- related protein (PR)遺伝子のプロモーターなどの誘導プ口モーターなどをあげることが できる。 また、 その他の公知の植物根で機能可能なプロモーターも挙げられるこ とができる。 好ましくは、 タバコ TobRB7遺伝子プロモーター、 タバコ CIG2遺伝 子プロモーター、 タバコ parAt遺伝子プロモーターなどを根で高発現する遺伝子 プロモーターを用いることができる。
( 4 ) 植物ターミネータ一
本発明において、 「植物で機能可能なターミネータ一」 とは、 植物で機能可能 な転写終結等の遺伝子発現調節に関与する領域を有する遺伝子のことであり、 例 えば、ノパリン合成酵素遺伝子 (N0S)ターミネータ一、オタトビン合成酵素遺伝子 (0CS)ターミネータ一などの T- DNA由来のターミネータ一、タバコ par At遺伝子タ ーミネーター、 その他の公知の植物根で機能可能なターミネータ一も挙げられる ことができる。
( 5 ) 発現カセット
本発明で用いられる 「 （1 ) 毛状根誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能 可能なェンハンサー及ぴ Z又はプロモーターを有し、 その下流に植物で機能可能 なターミネータ一を実質的に含まない発現カセット」 とは、 （1 ) 上記 「毛状根 誘発遺伝子」 を有し、 かつ （2 ) 上記 「植物で機能可能なェンハンサーあるいは プロモーター」 を有し、 その下流に 「植物根で機能可能なターミネータ一」 を実 質的に含まない発現カセットである。 「植物で機能可能なェンハンサーあるいは プロモーター」 の下流の D NA配列は、 「植物根で機能可能なターミネータ一」 を実質的に含まない D NA配列であれば特に限定されるものではなく、 必要に応 じて、 葉緑体移行シグナル配列、 ミトコンドリァ移行シグナル配列などのシグナ ル配列遺伝子、 その他、 「植物根で機能可能なターミネータ一」 を実質的に含ま ない D N A配列を付加することができる。 また、 本発明で用いられる発現カセッ トには、 上記 （1 ) および （2 ) に加えて、 必要に応じて、 大腸菌における複製 開始点を含む配列、 カナマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 了 ンピシリンン耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー、 あるいは、 G F P遺伝子、 ル シフェラーゼ遺伝子、 G U S遺伝子などのレポータ一遺伝子を含むことができる。
( 6 ) 植物遺伝子活性化ベクター
本発明で用いられる 「植物遺伝子活性化ベクター」 は、 上記 「 （1 ) 毛状根誘 発遺伝子を有すること、 かつ（2 ) 植物で機能可能なェンハンサーあるいはプロ モーターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質的に含まな いことを特徴とする発現カセット」 から構成されているものである。 通常、 ァグ ロバクテリゥム .ッメファシエンス菌において複製可能であり、 かつ、 植物細胞 に遺伝子の移行が可能な BIN19 (Bevan， Nucleic Acids. Res. , 12, 8711 - 8721 (1984) )を改変したバイナリーベクターの T- D Ν Α右境界領域と左境界領域の 間に、上記発現カセットを揷入し、植物遺伝子活性化ベクターとして用いられる。 このような植物遺伝子活性化べクターとして、 pHR- AT、 pHR-AT-GFPなどが例示で きる。
( 7 ) ァグロバタテリゥム菌
本発明で用いる 「ァグロバタテリゥム 'ッメファシエンス菌」 は、 ァグロバタ テリゥム ·ッメファシエンス菌に分類される菌であれば、 特に限定されるもので はない。 例えば、 ァグロバタテリゥム ·ッメファシエンス GV3101 (PMP90RK株）、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス EHA101株、ァグロバタテリゥム ·ッメフ ァシェンス LBA4404株などを例示できる。 「植物遺伝子活性ィ匕べクター」 は、 植 物細胞工学 vol. 4 No. 3 pl93-203 (1992)記載のエレクトロポレーション法、 塩化 カルシウム法などによってァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス菌に導入する ことができる （以下、 本発明形質転換ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス菌 とする） 。
( 8 ) 植物の形質転換
本発明の形質転換ァグロバタテリゥム ·ッメファシエンス菌は、 植物細胞工学 vol. 4 No. 3 pl93-203 (1992)記載のァグロバタテリゥム · リゾゲネス菌を用いた 毛状根誘発方法に沿って植物組織に感染させることにより毛状根を誘発すること ができる。感染する植物は特定されないが、ダイズ、エンドゥ、アルフアルファ、 インゲン、 ミヤコダサ、 カンゾゥなどのマメ科植物、 タバコ、 トマト、 ナス、 ジ ャガイモ、 キンギンナスビなどのナス科植物、 ダイコン、 ナタネ、 キャベツ、 シ ロイヌナズナなどのアブラナ科植物、 メロン、 キユウリ、 カボチヤなどのゥリ科 植物、 ニンジン、 セロリなどのセリ科植物、 ジョチュウギクなどのキク科植物な どを例示できる。
( 9 ) 遺伝子の活性化
本発明で得られた毛状根は、 必要に応じて、 一本ずつ分離してクローユングし た後、 使用してもよいし、 複数の毛状根を集団のまま利用してもよい。 本発明に よれば、 本発明で得られた毛状根には遺伝子が活性化したものが含まれているの で、 例えば、 植物ステロイドの生合成増強に関与する遺伝子が活性化されたもの を取得したいのであれば、 キヤビラリ一電気泳動と四重極/飛行時間ハイブリッ ド型質量分析計とを直列させた分析装置などで、 毛状根抽出物を分析し、 植物ス テロイド含量が増加した毛状根クロ ^ンを選抜することができる。 また、 耐塩性 に関与する遺伝子が活性化されたものを取得したいのであれば、 複数の毛状根の 集団を、 高塩濃度の培養液で培養し、 生育する毛状根クローンを選抜することが できる。 '
これらの毛状根クローンから IS0PLA T (二ッボンジーン登録商標） DNA抽出キ ットなどを用いてゲノム DNAを抽出し、 新版植物の P C R実験プロトコール、 細 胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 7、 島本功、 佐々木卓治監修、 秀潤社、 1 9 9 7、 p 8 3 - 8 9に記載されている T A I L— P C R法などによって、 「本発現 カセット」 が挿入された植物ゲノム上の遺伝子の部分配列が判明する。 また、 こ れらの毛状根クローンが、 植物遺伝子活性化ベクターに大腸菌での複製開始点を 含む配列、 薬剤耐性マーカーなどが含まれているベクターを保持する本発明の形 質転換ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス菌によって得られたものであれば、 新版モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ 15、.島 本功、 岡田清孝監修、 秀潤社、 2001、 pl35- 142に記載されているプラスミ ドレス キュー法により、 「本発現カセット」 が挿入された植物ゲノム上の遺伝子の部分 配列が判明する。 遺伝子の発現量は、 新版植物の P C R実験プロトコール、 細胞 工学別冊植物細胞工学シリーズ 7、島本功、佐々木卓治監修、秀潤社、 1 9 9 7、 1 0 6 - 1 1 5に記載されている R T- P C R法などにより検出することによ り、 遺伝子の活性化を検出することができる。
( 1 0 ) 活性化した遺伝子の利用
上記のように活性化した遺伝子を有する毛状根クローンは、 そのまま培養して 用いることができる。 例えば、 植物ステロイドが増強した毛状根クローンは、 大 量培養することにより、植物ステロイドの生産に用いることができる。あるいは、 常法によって遺伝子クローユングし、 必要に応じて、 他の植物に導入して用いる こともできる。 たとえば耐塩性に関して活性化した遺伝子は、 耐塩性のない植物 に導入することにより、 その植物に耐塩性を付与することができる。 実施例
以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの例に 限定されるものではない。 実施例 1 ： rol - type ァクティベーシヨンタギングべクタ一 pHR-ATの構築
オリゴヌクレオチド Ascl- Avrll (Clal+) (配列番号 1 ) およびオリゴヌクレオ チド Ascl- Avrll (Clal- ) (配列番号 2 ) を合成した。 100 M の Asc I- Avr II (Clal+)と、 100 μ Μの Ascl- Avrll (Clal -）を 20 μ 1ずつ混合して、 70°Cで 5分間 熱処理後、 室温に戻すことによって、 上流側から制限酵素 Asclおよび Avr IIサ ィトを含み、両末端に 5' -CG-3'の 5'突出末端を持つを持つ 2本鎖 DNAを調製した。 次いで、 該 2本鎖 DNAを、 制限酵素 Cla Iで消化したベクター PPCVICEn4HPT (RB に近接してタンデム化した 4コピーのカリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモ 一ター中のェンハンサー領域、 col El の複製開始点おょぴ /3 -ラクタマーゼ遺伝 子を T- DNA部分に有する： Hayashi et al. , Science 258 : 1350 - 1353 (1992) ) に DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造登録商標） を用いてキットに記載された方法に 従ってライゲーシヨンし、 プラスミド pPCVICE (Ascl- Avrll)を得た （図 1 ) 。 ァグロバタテリゥム · リゾゲネス MAFF03- 01724株の有する Ri プラスミ ド、 pRil724上にコードされる rolA， rolBおよび rolC遺伝子を含む DNA領域（Tanaka et al. , Biosci. Biotech. Biochem 58： 548-551 (1994)、 GENB厘ァクセッショ ン番号 D23669に記載） を錶型として、制限酵素 Asclおよび EcoRIサイトを 5，端 に付加したセンスプライマー D23669 (1+, AscI/EcoRI) (配列番号 3 ) と制限酵素 Avrll サイトを 5'端に付加したアンチセンスプライマー D23669 (7555-, Avrll) (配列番号 4 ) を用いて、 PfuTurbo DNA Polymerase (STRATAGENE社登録商標） で、 94°C2分間の後、 94°C30秒間次いで 62°C30秒間さらに 72°C11分間の保温を 1サイクルとして 25サイクルからなる PCRを行つた。該 PCRにより増幅された DNA をァガロースゲル電気泳動で分析した結果、 約 7. 6Kbの DNA断片が得られた。 こ の DNA断片を制限酵素 Asclおよぴ Avrllで消化した。さらに、プラスミド pPCVICE (Ascl- Avrll)を制限酵素 Ascl および Avrll で消化し、 上記の約 7. 6Kb の Ascl-Avrll断片とを DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造登録商標） を用いてライゲ ーシヨンし、 pHR-ATを構築した （図 2 ) 。 pH - AT の塩基配列 （17511bp) を配列 表の配列番号 1 3に示す。 実施例 2 ： rol-type ァクティベーシヨンタギングべクタ一 pHR- AT- GFPの構築 力リフラワーモザイクウィルス 35Sプロモーター、 sGFP(S65T)遺伝子おょぴノ パリンシンターゼ遺伝子ターミネータ一を有する断片をプラスミ ド 35S omega-sGFP(S65T) (Chiu et al. , Current Biol 6: 325-330 (1996) ) を铸型とし て制限酵素 Asclサイトを 5'端に付カ卩したセンスプライマー 35S- 5 (Ascl) (配列 番号 5 ) と制限酵素 EcoRI サイトを 5，端に付加したアンチセンスプライマー N0S-T-3 (EcoRI) (配列番号 6 ) を用いて PfuTurbo DNA Polymerase (STRATAGENE 社登録商標） で、 94°C2分間の後、 94°C30秒間次いで 60°C30秒間さらに 72°C2 分間の保温を 1サイクルとして 25サイクルからなる PCRを行った。該 PCRにより 増幅された DNAをァガロースゲル電気泳動で分析した結果、 約 1. 4Kbの DNA断片 が得られた。 この DNA断片を制限酵素 Asclおよび EcoRIで消化した。 さらに、実 施例 1で構築した pHR- ATを制限酵素 Asclおよび EcoRIで消化し、上記の約 1. 4Kb の Ascl- EcoRI 断片とをライゲーシヨンし、 pHR- AT-GFP を構築した （図 3 ) 。 pHR-AT-GFPの塩基配列 （18987bp) を配列表の配列番号 1 4に示す。 実施例 3 ：ァグロバタテリゥム ·ッメファシエンスの形質転換
ァグロパクテリゥム ·ツメブァシエンス GV3101 (PMP90RK)株を 2 mlの YEP培 地 （bacto- tryptone lOg, yeast extract lOg, NaCl 5g、 水 1L)で 28° (：、 200 rpm で約 24時間振とう培養した。 培養液全量を 50 mlの YEP培地に移し、 OD600が約 0. 8になるまでさらに振とう培養を続けた。 3000 X g, 10分間の遠心分離により 集菌した後、 1 mlの 20 IDM塩化カルシウムに懸濁した。 懸濁した菌液を 100 μ ΐ ずつ分注し、液体窒素により凍結した後、使用するまで- 80°Cで凍結保存した。 こ の状態の菌をコンビテントセルとする。 凍結したコンビテントセルに実施例 1お よび 2で得られた pHR - AT、pHR - AT - GFPを 1 μ g添加し、 37 ^で 5分間処理した後、 lmlの YEP培地を添加し、 28°C、 200 rpmで約 2時間振とう培養した。 12, 000 x g, 2分間の遠心分離により集菌した後、 100 1の YEP培地に懸濁した。 この菌液を カルべ-シリン lOOmg/1, リファンピシン lOOmg/1およびゲンタマイシン 25mg/l を含む YEP寒天培地に添塗した。 形質転換したァグロバタテリゥム .ッメファシ エンスは、導入されたプラスミドが有する ]3 -ラクタマーゼ遺伝子により付与され るカルべニシリンに対する薬剤耐性を利用して該培地で選択する事によって得ら れた。 形質転換したァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスをカルべニシリン lOOmg/1, リファンピシン lOOmg/1およびゲンタマィシン 25mg/lを含む YEP培地 で 28°C、 2日間培養し、 得られた培養液からプラスミド精製を行い、 pHR- ATある レヽは pHR - AT-GFPを有していることを確認した。 実施例 4 ： シロイヌナズナ形質転換
シロイヌナズナのェコタイプ WS の種子を有効塩素濃度 1%の次亜塩素酸溶液 で滅菌処理した後、 MS寒天培地に置床し、 2日間 4°C処理した。 26°C日長 16時間 で 9日間培養し、発芽させた。発芽した幼植物から胚軸を切り取り、 4μ Μの 2, 4-D および 0. 4 /i Mのべンジルアデニンを添加した MS培地に置床し、 26° (、 日長 16 時間で 7日間培養し、 緑化したカルスを誘導した。 実施例 3で調製した pHR - AT あるいは pHR- AT - GFP を保持するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスをカル ベニシリン lOOmg/1, リファンピシン lOOmg/1およびゲンタマイシン 25mg/lを含 む 2 mlの YEP培地で 28°C、 2日間培養した。 12， 000 x g, 2分間の遠心分離により集菌した後、 OD600=0. 2となるように滅菌 水に懸濁した。 菌液に胚軸カルスを 2分間浸した後、 滅菌濾紙上に移して余分な 菌液を除いた。 MS寒天培地に置床し、 26°C、日長 16時間で 48時間共培養した後、 胚軸カルスを 250mg/lのクラフォラン （アベンテイス 'ファーマ株式会社、 登録 商標） を含む滅菌水で洗浄した。 250mg/lのクラフォランおよび 25mg/lのハイグ ロマイシンを添カ卩した MS培地に置床し、 26° (、 日長 16時間で培養した。 感染処 理 20 日前後から形質転換根が誘発され、 pHR - AT - GFPを導入した全ての形質転換 根で GFPの蛍光が観察された。 実施例 5 ：シロイヌナズナ形質転換根クローンの培養
実施例 4において誘発した、 pHR-AT_GFPが導入されたシロイヌナズナ形質転換 根を根端を含むように一本ずつ切り取り、 250mg/lのクラフォランおよび 25mg/l のハイグロマイシンを添加した HF寒天培地（Agric. Biol. Chem. 50, 2715 (1986) ) で培養した。 それぞれの形質転換根クローンを、 30mlの HF液体培地に入れ、 ィ ノーパプラットフオームシェーカー 2 3 5 0型 （ニューブランズウイックサイエ ンティフィック社製） で、 26°C、 100回転/分で旋回培養した。 4週間ごとに増殖 した毛状根の一部約 1 g湿重を、 新鮮な 30mlの HF液体培地に入れ、 継代培養し た。 実施例 6 ：ゲノミックサザン解析による導入遺伝子の確認
液体培養した形質転換根クローンから Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kit (Amersham Pharmacia Biotech) を用レヽて、 添付のプロトコ ールに従いゲノム DNAを抽出した。 調製したゲノム DNA 10 gを制限酵素 Nhel で完全消化した後、 全量を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動分画に供した。 泳動終 了後、 Chomczynski (Anal. Biochem. 201： 134-139 (1992) )の方法に'従い、 Hybond - N+ nylon membrane filter (アマシャム登録商標） に DNAをトランスファーした後、 120°Cで 30分間べ一キングすることによりメンブラン上の DNAを固定した。 ハイ ブリダィゼーシヨンに用いるプローブは、 PCR DIGプローブ合成キット （ロシュ） を用いて調製した。 pPCVICEn4HPTプラスミ ド lngを铸型として、 センスプライマ 一 AMPR5 (配列番号 7 ) とアンチセンスプライマー AMPR3 (配列番号 8 ) を用いて、 70 μ Mの DIG - 11- dUTP存在下で 94°C2分間の後、 94°C30秒間次いで 55°C30秒間さ らに 72°C3分間の保温を 1サイクルとして 35サイクルからなる PCRを行うことに より DIG標識された 13 -ラクタマーゼ遺伝子 DNA断片を得た。 1mlあたり 2 μ 1の PCR反応液を含む DIGイージーハイブ （ロシュ） を用いて 42° (：、 16時間のハイブ リダィゼーシヨンを行った後、 1 X SSC, 0. 1% SDS、 10分間、 室温さらに 0. 1 x SSC, 0. 1% SDS、 30分間、 68°Cの条件でメンブランを洗浄した。 アルカリフォス ファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体 （ロシュ） および CDP- Star (ロシュ） を用 いて添付のプロトコールに従い、 プローブとハイブリダィズしたゲノム DNA断片 を検出した。その結果、ゲノミックサザン解析に供した 10ラインの形質転換根ク ローンの全てに関して pHR- AT- GFP由来 T- DNAの挿入が確認された。 実施例 7 ：プラスミ ドレスキュー法による T- DNAライ トボーダー近傍ゲノム断片 のクロ一ニング
実施例 6において T- DNAの挿入を確認した形質転換根クローン （4- D) を材料に 用レ、、 モデル植物の実験プロトコール -イネ ·シロイヌナズナ編-、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ 4、 島本功、 岡田清孝監修、 秀潤社、 1996、 pl35- 142に記 載されているプラスミ ドレスキュー法によって、 T- DNA ライ トボーダーに近接す るシロイヌナズナのゲノム領域 （約 1. 6Kb) をクローニングした。 プライマー #19T- DNA10067 (-) (配列番号 9 ) および SKI015RB (配列番号 1 0 ) を用いてクロ ーン化されたゲノム領域の塩基配列を決定した。 The Arabidopsis Information Resource のホームページ （http: //arabidopsis. org/Blast/) に記載の方法によ つて BLASTサーチを行った結果、 Arabidopsis thaliana DNA chromosome 5, BAC clone F9G14 (accession no. AL162973) 中の配列と一致し、 挿入された T - DNA 中の 35Sェンハンサーリピートから約 500 1^の距離に 15§02710遺伝子の翻訳開 とが判明した。 実施例 8 ：ノーザンハイブリダィゼーシヨン法によるライトボーダー近接遺伝子 の発現解析
形質転換根クローン 4 - Dにおける At5g02710遺伝子の発現が、 近傍に挿入され た 35Sェンハンサーリピートの影響により活性化されているかをノーザンハイブ リダイゼーション法により調べた。 形質転換根クローン 4- D及ぴネガテイブコン トロールとして、他の独立した形質転換根クローン（1- Aおよび 4 - A)から RNAWIZTM
(Ambion) を用いて添付のプロトコールに従いトータル RNAを調製した。 得られ た RNA 15 gを 1%ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、 Chomczynski (Anal. Biochem. 201： 134—139 (1992) ) の方法に従い、 Hybond- N+ nylon membrane filter (アマシャム登録商標） に RNAをトランスファーした後、 120°Cで 30分間べ一キングすることによりメンブラン上の RNAを固定した。 プロ ーブの調製は以下の方法により行った。 形質転換根クローン 4- Dから調製したト 一タル RNAを材料として、 TakaRa RNA PCR Kit (層） Ver. 2. 1 (宝酒造） を用い て添付のプロトコールに従い cDNA合成を行った。得られた CDNA 2 /Z 1を鎵型とし て、 TaKaRa Ex TaqTM (宝酒造） を用いてセンスプライマー At5g02710- 5 (配列番 号 1 1 ) とアンチセンスプライマー At5g02710- 3 (配列番号 1 2 ) を用いて、 94°C 2分間の後、 94°C30秒間次いで 55°C30秒間さらに 72°C1分間の保温を 1サイクル として 25サイクルからなる PCRを行うことにより、 At5g02710遺伝子の全長コー ド領域に相当する約 540bpの cDNA断片を単離した。得られた cDNA断片を、 TOPO TA Cloningキット （インビトロジェン） を用いて pCRII- T0P0ベクターにクローニン グした後、塩基配列を決定して cDNA断片の挿入方向を確認した。 ノーザンハイブ リダィゼーシヨンに用いるプローブとして、 in vivo で発現している At5g02710 遺伝子 mRNAに相補的な RNAを in vitro転写反応により合成した。 At5g02710遺 伝子 cDNAを含むプラスミドを制限酵素 EcoRVでリニアライズし、 得られた DNA 断片 1 μ §を铸型として SP6 R A polymerase (ロシュ）および DIG RNA Labeling Mix (ロシュ） を用いて 350 μ Μの DIG- 11- UTP存在下で、 添付のプロトコールに従つ て: in 'iro転写反応を行い、 DIGラベルされたア チセンス RNAを調製した。 DIG イージーハイブ （ロシュ） を用いて 68°C、 16時間、 100 ng/mlプローブ濃度のハ イブリダイゼーシヨンの後、 1 X SSC, 0. 1% SDS、 10分間、室温、さらに 0. 1 X SSC, 0. 1% SDS、 30分間、 68°Cの条件で洗浄を行った。 アルカリフォスファターゼ標 識抗ジゴキシゲニン抗体 （ロシュ） および CDP- Star (ロシュ） を用いて添付のプ 口トコールに従いプローブとハイブリダィズした mRNAを検出した。その結果、形 質転換根ライン 4- Dにおいては At5g02710遺伝子の mRNAレベルが顕著に増高して いることが確認された （図 4 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明により、植物遺伝子を毛状根において迅速に活性化できるようになった。 本発明によって活性化された遺伝子は、 有用成分の生産、 ストレス耐性植物など の有用植物の作出などに利用することができる。

Claims

請求の範囲
1 . ( 1 ) 毛状根誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能可能なェンハン サー及ぴ 又はプロモーターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ 一を実質的に含まない発現カセットから構成される植物遺伝子活性化ベクター。
2 . 毛状根誘発遺伝子が、 rolB遺伝子を含む、 請求項 1に記載の植物遺伝子 活性化ベクター
3 . ェンハンサ一が、 カリフラワーモザイクウィルス 3 5 Sプロモーター由 来である、 請求項 1又は 2に記載の植物遺伝子活性化ベクター
4 . 配列番号 1 3に記載の塩基配列を有する PHR- AT、又はこれと実質的に同 一の塩基配列及び実質的の同一の機能を有するベクターである、 請求項 1に記載 の植物遺伝子活性ベクター。
5 . 配列番号 1 4に記載の塩基配列を有する pHR- AT- GFP、 又はこれと実質的 に同一の塩基配列及び実質的の同一の機能を有するベクターである、 請求項 1に 記載の植物遺伝子活性ベクター。
6 . 請求項 1から 5の何れかに記載の植物遺伝子活性化ベクターを保持する ァグロパクテリゥム .ッメファシエンス菌を植物組織に感染し、 （1 ) 毛状根誘 発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能可能なェンハンサー及び Z又はプロモー ターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質的に含まない発 現カセットを植物組織に導入し、 毛状根を形成させることを含む、 植物遺伝子の 活性化方法。 -
7 . 毛状根誘発遺伝子が、 rolB遺伝子を含む、 請求項 6に記載の植物遺伝子 の活性化方法。 '
8 . ェンハンサ一が、 カリフラワーモザイクウィルス 3 5 Sプロモーター由 来である、 '請求項 6又は 7に記載の植物遺伝子の活性化方法。
9 . ' 請求項 1から 5の何れかに記載の植物遺伝子活性化ベクターを保持する ァグロパクテリゥム .ッメファシエンス菌を植物組織に感染し、 （1 ) 毛状根誘 発遺伝子を有し、 かつ 2 ) 植物で機能可能なェンハンサー及び/又はプロモー ターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質的に含まない発 現カセットを植物組織に導入し、 毛状根を形成させた後に、 上記ェンハンサー及 び/又はプロモーターによって遺伝子発現が誘発された毛状根を選抜することを 含む、 植物遺伝子の分析方法。
1 0 . 請求項 1カゝら 5の何れかに記載の植物遺伝子活性化べクターを保持す るァグロバタテリゥム .ッメファシエンス菌を植物組織に感染し、 （1 ) 毛状根 誘発遺伝子を有し、 かつ （2 ) 植物で機能可能なェンハンサー及び/又はプロモ 一ターを有し、 その下流に植物で機能可能なターミネータ一を実質的に含まない 発現カセットを植物組織に導入し、 毛状根を形成させることにより得られる、 植 物遺伝子の発現が誘発された毛状根。
1 1 . 請求項 1カゝら 5の何れかに記載の植物遺伝子活性化べクターを保持す るァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス菌。
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