WO2004104034A1 - コンドロイチンａｃリアーゼ結晶 - Google Patents

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WO2004104034A1
WO2004104034A1 PCT/JP2004/007432 JP2004007432W WO2004104034A1 WO 2004104034 A1 WO2004104034 A1 WO 2004104034A1 JP 2004007432 W JP2004007432 W JP 2004007432W WO 2004104034 A1 WO2004104034 A1 WO 2004104034A1
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xaa
chondroitin
lyase
arthroac
substrate
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PCT/JP2004/007432
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English (en)
French (fr)
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Vladimir V. Lunin
Miroslaw Cygler
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Seikagaku Corporation
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Publication date
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Priority to JP2005506436A priority patent/JPWO2004104034A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to chondroitin AC lyase (chondroitin AC lyase II, chondroitinase AC II) crystals having specific crystallographic characteristics.
  • the present invention also relates to a protein having chondroitin AC lyase activity and having a specific amino acid sequence.
  • Glycosaminodalican is the carbohydrate component of proteoglycin.
  • Glycosaminoglycan is a highly negatively charged polysaccharide consisting of a repeating disaccharide in which substituted dalcosamine or galactosamine is linked to peronic acid by 1,4 bonds. These disaccharide units are linked by 1,3 or 1,4 bonds to form a polysaccharide chain (Reference 1). These dalcosamines and galactosamines are heavily sulfated, and their syntheses require the coordinated action of many enzymes (References 2 and 3). GAG is a major component of extracellular matritas (Reference 4).
  • GAG is degraded by two types of enzymes: hydrolases (calo hydrolases) or lyases (Ref. 5).
  • hydrolases calo hydrolases
  • lyases calo hydrolases
  • the enzymatic mechanism of hydrolase enzymes is well understood and occurs through a retaining mechanism or an inverting mechanism (Reference 6).
  • the molecular details of the enzymatic mechanism of the GAG lyase group are not well understood.
  • Reference 7 Although a chemically plausible mechanism of the elimination reaction has been reported (Reference 7), the structure of the active site and the role of individual amino acids are still unclear.
  • Many bacterial species synthesize GAG lyase and use these enzymes to degrade GAG in the natural environment of bacteria and use it as a carbon source (References 5, 8).
  • Polysaccharide lyases with known three-dimensional structures can be classified into two structures.
  • One is a dextrorotatory parallel—helix (eg, pectate Z pectin lyase, chondroitinase B, rhamnognolecuronan lyase) and the other is ( ⁇ / ⁇ ) 5 toroids (flavonata terridium heparinum chondroitin AC lyase, chondroitin ABC lyase, bacterial hyaluronate lyase, etc.) or ( ⁇ / ⁇ ) 6 toroids (alginate lyase).
  • GAG-degrading enzymes with distinct specificity are widely used as structural analysis tools for GAGs and other polysaccharides (Ref. 13), and the chondrointin AC lyases are frequently used for this purpose. . These enzymes cleave the glycosidic bond at the non-reducing end of peronic acid and use chondroitin-4-sulfate and chondroitin-16-sulfate as substrates, but not dermatan sulfate. These enzymes also show varying degrees of degrading activity against hyaluronan.
  • chondroitin AC lyase one of GAG-degrading enzymes, it will be useful in the production of low-molecular-weight chondroitin and chondroitin sulfate as various analytical reagents and pharmaceuticals. Or, it is extremely useful as a medicine itself.
  • a protein having chondroitin AC lyase activity can be provided, it has the same utility as described above, and is extremely advantageous in its production.
  • An object of the present invention is to provide a chondroitin AC lyase (chondroitinase ACII) crystal having specific crystallographic characteristics, which is useful as a biochemical analysis tool or a means for producing low molecular weight GAG or the like.
  • Another object of the present invention is to provide a protein having chondroitin AC lyase activity having the above-mentioned utility.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, succeeded in obtaining a unique crystal of chondroitin AC lyase (ArthroAC) of a bacterium of the genus Arslobata (Arsulopactor auuressens), Features were identified. Furthermore, the primary structure of chondroitin AC lyase was elucidated by structural analysis of the crystals by X-ray diffraction, and the flavobateridium hepatae, whose 17 fire structure had already been elucidated, was identified.
  • a crystal of chondroitin AC lyase derived from a bacterium belonging to the genus Arthrobacter having one molecule per unit is provided.
  • the crystal of the chondroitin AC lyase of the present invention it is preferable that the crystal is the above-mentioned bacterium of the genus Arthrobacter.
  • the present invention has an activity of chondroitin AC lyase, and has an amino acid sequence Asn-Trp-Trp- (Xaa 7 —Arg— (Xaa) 34 —Gin— (Xaa) 4 -Arg— (Xaa) 8 —Asn— ( Xaa 49 one His- (Xaa) 8 -Tyr- (Xaa ) 53 _ Arg- (Xaa) 3 - Arg- (Xaa) is 2 _ (Asn or 7 this Asp - (Xaa) 106 _Asn- ( Xaa) 54 -
  • the present invention provides a protein containing Trp (Xaa represents an arbitrary amino acid residue, and the number represents the number of residues) The amino acid sequence of this protein is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • FIG. 1 is a photograph showing a microscopic image of a chondroitin AC lyase II crystal.
  • FIG. 2 is a photograph showing a microscope image of chondroitin AC lyase II crystal.
  • FIG. 3 shows a representative portion of a 3Fo-2Fc electron density map outlined at 3 ⁇ (green) and 6 ⁇ (crimson) levels. This map makes it possible to distinguish C, N and 0 atoms.
  • FIG. 4 shows a structure-based sequence alignment for ArthroAC, FlavoAC and some hyaluronate lyases. Inserts in the ArthroAC sequence that close the substrate binding site are shown in gray. Bold italics indicate residues that form an ⁇ -helix. Bold letters indicate residues that form; 3-strands. Residues conserved in all four proteins are boxed. The arrow indicates the putative active site residues Asnl 8 0, His230, Tyr239, Arg293 and Glu404 (However, Glu404 Without an arrow). This figure was created with the programs MOLSCRIPT (Reference 44) and Raster3d (Reference 45).
  • G is glycine
  • A is arayun
  • V is valin
  • L leucine
  • I is isoleucine
  • S is serine
  • T threonine
  • D is aspartic acid
  • E is glutamic acid
  • N is asparagine
  • Q is glutamine
  • K is lysine
  • R arginine
  • C cysteine
  • M methionine
  • F is Cyprusalanin
  • Y thicin
  • W is tryptophan
  • H histidine
  • P proline.
  • Figure 5 is as follows. a) Ribbon diagram of ArthroAC. The individual ⁇ -helical hairpins of the N-terminal ( ⁇ / ⁇ ;) 5 toll are shown in different colors. Individual ⁇ -sheets of the C-terminal domain are also shown in different colors. Inserts in ArthroAC that block the grooves are shown as gray. b) A three-dimensional view showing the superimposed C traces of the N-terminal domains of ArthroAC and FlavoAC. Inserts in ArthroAC that block the grooves are shown in gray. c) Stereogram of C trace of the C-terminal domain of ArthroAC and FlavoAC.
  • FIG. 6 is a stereogram of the open and closed conformations of 457-466 norepe from the C-terminal domain.
  • the ball indicates the location of the thimerosal mercury atom near Cys405 in the open conformation. His230, Arg293, particularly showing Glu404 and side chain of Trp 462. The +2 and +1 sugars are also shown.
  • FIG. 7 is a three-dimensional view of the substrate binding site. a) The electron density in the omit map calculated at the 1.2 ⁇ level excluding the existing substrate corresponding to the tetrasaccharide of chondroitin- 14_sulfuric acid to be bound. Port conformation is clearly shown. b) Contact of the tetrasaccharide to nearby side chains. Hydrogen bonds are indicated by broken lines.
  • Figure 8 shows the complex of Arthrobactor chondroitinase AC with chondroitin-4 monosulfate tetrasaccharide (blue) and the complex of Flavobacteriwn chondroitinase AC Y234F mutant with chondroitin-14 monosulfate tetrasaccharide (red). It is the three-dimensional figure which shows what combined.
  • FIG. 9 is a diagram showing the proposed catalyst mechanism. Opening and closing of the 457-466 loop is likely to be related to the movement of the tips of the two nearby loops. And release. Substrate binding recognizes the active site and leads to deprotonation of Tyr239, which is affected by protonated His230 hydrogen bonded to positively charged Arg293 and Tyr239.
  • the 0H— of the phenyl ring first acts as a general base that abstracts protons from the C5 of glucuronic acid at the +1 site. And this proton is given to the 04 leaving group of the _ 1 sugar.
  • the blocked end of the substrate binding valley limits the binding of the non-reducing end of the glycosaminoglycan chain to the sugar, resulting in the exo-type mechanism of ArthroAC.
  • FIG. 10 is as follows. a) Stereogram of the surface of the molecule within the extended substrate binding site of ArthroAC. Inserts in the sequence that cap the substrate binding site are shown in green. b) Three-dimensional diagram showing the tetrasaccharide bound to the molecular surface in the extended substrate binding site of FlavoAC. This figure was created by the program GRASP (Reference 46). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Chondroitin lyases (EC 4.2.2.4 and EC 4.2.2.5) are glycosaminodalicanases that act as lyases. Chondroitin lyase AC (ArthroAC) obtained from alsulpactor. Auresens (Arthrobactor tor aurescens) is known to act on chondroitin-14-monosulfate and chondroitin-16-sulfate, but not on del or matanesulfate. . Other chondroitin AC lyases can also cleave hyaluronan.
  • Chondroitin lyases (EC 4.2.2.4 and EC 4.2.2.5) are glycosaminodalicanases that act as lyases. Chondroitin lyase AC (ArthroAC) obtained from alsulpactor. Auresens (Arthrobactor tor aurescens) is known to act on chondroitin-14-monosulfate and
  • the chondroitin AC lyase used for the crystal of the chondroitin AC lyase of the present invention is a known enzyme and has already been purified.
  • the chondroitin AC lyase used in the crystals of the chondroitin AC lyase of the present invention is derived from a bacterium belonging to the genus Arthrobacter.
  • the genus Arthrobacter for obtaining the chondroitin AC lyase used in the crystal of the chondroitin AC lyase of the present invention is not particularly limited, but it is preferably Arsulopactor auresens.
  • the method for obtaining chondroitin AC lyase from a bacterium belonging to the genus Arsulopactor is not particularly limited, and it can be obtained using a method generally used for obtaining an enzyme from a bacterium.
  • the bacteria of the genus Arthrobacter are cultured, and the cultured cells are cultured.
  • An enzyme may be extracted from the cells of the bacterium and the enzyme may be purified.
  • Cultivation of bacteria belonging to the genus Arthrobacter is carried out, for example, as described in J. Biol. Chem., 243 (7), 1523-1535 (1968), JP-A-62-122588, JP-A-2-57180, and the like.
  • the culture conditions are not particularly limited.
  • the culture is carried out in a medium containing meat or fish extract and polypeptone at a temperature of about 30 to 35 ° C. for about half a day to about 5 days.
  • chondroitin sulfate or its hydrolyzate is preferably added to the culture solution in an amount of 0.01% or more, and preferably about 0.05 to 1%.
  • the cells of the cultured bacteria are collected from the culture solution, suspended in a buffer having a pH near neutral, and the enzyme is extracted from the suspension.
  • a buffer having a pH around neutrality a 1 to 100 raM phosphate buffer, a Tris-hydrochloric acid buffer, an acetate buffer, or the like, usually having a pH of 6.0 to 8.0, can be used.
  • the cells are disrupted by sonication or a cell disrupter (Dino Mill, etc.) in such a buffer to extract cells containing chondroitin AC lyase, protease, other enzymes, nucleic acids, proteins, etc. Extract as a liquid.
  • the extraction efficiency of chondroitin AC lyase from bacterial cells can be increased by using a surfactant solution, for example, a buffer solution containing a surfactant.
  • purification After removing the low-molecular-weight substances by, for example, dialyzing the obtained bacterial cell extract against a buffer solution, purification can be performed by using salting out, ammonium sulfate precipitation, various types of chromatography, or the like.
  • An example of chromatography that can be used for purifying chondroitin AC lyase includes a chromatography treatment using a combination of a weak cation exchange resin and a strong thione exchange resin.
  • the weak cation exchange resin used here include a cation exchange resin in which the exchange group is a carboxyalkyl group such as a carboxymethyl group.
  • Specific examples include polysaccharide derivatives having a carboxymethyl group as an exchange group (agarose derivatives, cross-linked dextran derivatives, etc.).
  • Commercial products include CM Sepharose and CM Sephadex (both are trade names, Pharmacia).
  • the strong thione exchange resin examples include a cation exchange resin in which the exchange group is a sulfoalkyl group. Concrete Examples thereof include polysaccharide derivatives having a sulfoethyl group, a sulfopropyl group, etc. as exchange groups (agarose derivatives, cross-linked dextran derivatives, etc.). Commercial products include S-Sepharose or SP Sepharose (trade name, Pharmacia), SP Sephadec Tas (trade name, Pharmacia), SP Toyopearl (trade name, Tosoh Corporation) and the like. The following method can be given as an example of the chromatographic treatment using a combination of the above two types of cation exchange resins.
  • a buffer similar to that used for the extraction of cells using a weak cation exchange resin for example, a buffer having a pH of 6.5 to 7.5 (for example, a 1 to 50 mM phosphate buffer).
  • Acid buffer, Tris-HCl buffer, acetate buffer, etc. contact the supernatant of the bacterial cell extract described above, adsorb the enzyme, and remove the cation-exchange resin if necessary. Wash using a solution (for example, 20 to 25 solution or 7 or the above-mentioned surfactant solution (for example, 0.5% P0ELE solution).
  • An eluate is prepared and the fraction having enzyme activity is eluted by contacting with the resin, and the elution method may be a concentration gradient method (gradient method) or a stepwise method.
  • the treatment may be a column method or a batch method.
  • the obtained fraction is brought into contact with a strong thione exchange resin equilibrated with the same buffer to adsorb chondroitin AC lyase. If necessary, the cation exchange resin is converted into a salt solution (for example, a 20 to 50 mM NaCl solution).
  • chondroitin is subjected to chondroitin by a concentration gradient method using the same buffer containing 0 to about 0.5 M sodium chloride (for example, phosphate buffer, Tris-monohydrochloride buffer, acetate buffer, etc.).
  • the purified enzyme solution is obtained by eluting and isolating the AC lyase.
  • a chromatographic treatment is carried out by a column method. It is also possible to do in the reverse order.
  • the chondroitin AC lyase obtained in this way is free of impurities such as endotoxin, nucleic acids, proteases, and other proteins, and shows a single band on electrophoresis (SDS-PAGE). Cation exchange) also shows a single peak.
  • chondroitin AC 'lyase is crystallized from the above purified enzyme solution.
  • the method for crystallizing the purified chondroitin AC lyase is not particularly limited, either.
  • the method used for crystallization of protein can be applied.
  • the chondroitin AC lyase can be crystallized by bringing the chondroitin AC lyase into contact with a polyether having a structure in which both terminals are hydroxyl groups (eg, polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc.).
  • chondroitin AC lyase solution For example, add polyethylene glycol (molecular weight: 4,000, 6,000, 8,000, etc.) to the chondroitin AC lyase solution and leave it at room temperature to about 4 ° C until crystals form.
  • the crystallization of chondroitin AC lyase is carried out by suspending a solution containing chondroitin AC lyase and polyethylene glycol / re in a solution containing polyethylene dalicol, followed by crystallization.
  • the diffusion method is preferred. In particular, it is extremely preferable to crystallize by the method described in Examples described later.
  • the crystal of the chondroitin AC lyase of the present invention obtained as described above is a monoclinic columnar crystal. Its crystallographic properties can be analyzed by X-ray diffraction and the like, and the present inventors have obtained crystals capable of determining a three-dimensional structure with a resolution of 1.25 angstroms. Based on this high resolution and the very high quality electron density maps of the native enzymes and their complexes, 97% of the amino acids of chondroitin AC lyase can be clearly identified, demonstrating the catalytic mechanism common to FlavoAC and hyaluronan lyase. The molecular details could be clarified.
  • the enzyme-substrate complex was obtained by immersing the substrate in crystals for various times and flash freezing the crystals.
  • the electron density map of the crystals immersed in the substrate for a short period of time ( ⁇ 2 minutes) clearly showed the substrate, indicating that the glucuronic acid ring at position +1 (see below) twisted into the Port II conformation.
  • tyrosine (Tyr) 239 power S C5 It acts as a general base that abstracts protons from the position, and strongly supports the degradation mechanism that asparagine (Asn) 180 and His230 neutralize the acid radical of dalucoponic acid.
  • chondroitin AC lyase from Flavobacterium heparinum FavoAC
  • Arthrobacter at resce ⁇ s was cultured under the following conditions. 0.4% peptone (Kyokuto Pharmaceutical Industry Co. Ltd., Tokyo), 0.4% Ehritsuhi fish extract (Kyokuto Pharmaceutical Industry Co. Ltd., Tokyo) and 0.75% chondroitin sulfate C (Seikagaku Corporation) Were cultured in a medium containing (32.5 liters, initial pH 6.2) for 24 hours at an aeration rate of 1 vvm and a stirring speed of 220 rpm.
  • the enzyme was purified from the cultured cells by the method described previously (Reference 20) with some modifications. That is, the culture was centrifuged at 15,000 g for 15 minutes to remove the cells, and then solid ammonium sulfate was added to the supernatant so as to be 75% (w / v) saturated. At 4 ° C, 75 g of protein precipitate (50,000 units) was dialyzed continuously against distilled water containing 0.02 M acetate buffer (pH 5.2), and the column was pre-equilibrated with the same buffer. (Araersham Bioscience Corp, Piscataway, NJ, diameter X length: 2.6 x 70 cm).
  • Chondroitin-14-monosulfate tetrasaccharide (CS tetra ), dermatan sulfate hexasaccharide (DS hexa ) and hyaluronan tetrasaccharide were prepared and characterized as previously described (Reference 10). That is, chondroitin-14-monosulfate from bovine trachea and dermatan sulfate from porcine intestinal mucosa are depolymerized using chondroitin ABC lyase and stopped by boiling for 5 minutes before the reaction is completed. I let it.
  • oligosaccharide mixture was separated on a Bio-Gel P6 column, and the tetrasaccharide fraction and the hexasaccharide fraction were collected. These mixtures were further fractionated by strong aeon exchange high performance liquid chromatography to obtain a single oligosaccharide. Their purity was confirmed by capillary electrophoresis, and their structure was confirmed by MS and NMR analysis. These structures show that CS tetra is ⁇ UAp (1 ⁇ 3)- ⁇ -D-GalpNAc4S (1 ⁇ 4)- ⁇ -D-GlcAp (1 ⁇ 3)- ⁇ , ⁇
  • DS hexa is ⁇ ⁇ (1 ⁇ [3]-; 3-D-GalpNAc4S (l ⁇ 4)--L-IdoAp (l ⁇ ) 2 3)- ⁇ , ⁇ -D- GalpNAc4S ( ⁇ UAp indicates unsaturated sugar residue 4-deoxy-a_L-sleo-hex-4-enoenopyranosyl dihydrogenate, IdoAp indicates idopyranosyl dihydrogenate, and GlcAp indicates darcopyranosyl dihydrogenate GalpN indicates 2-deoxy-2-aminoamino ratatopyranose, S indicates sulfate, and Ac indicates acetate.
  • Needle-like crystals of the above proteins have been reported long before (Ref. 20), but have not been characterized.
  • the enzyme was crystallized by hanging drop vapor phase diffusion. That is, the protein (lOrag / ml) and 2 ⁇ l of Lisapar solution (23% (w / v) PEG8000, 0.1 M phosphate buffer, pH 6.4) suspended in 1 ml of Reservoir solution , 0.4 M ammonium acetate, containing 10% (v / v) glycerol). Small crystals appeared within a few days. To obtain large crystals suitable for obtaining data, The cross-seeding method was used.
  • the crystals were purified from 22.5 (w / v) PEG8000, 0.1 M phosphate buffer (pH 6.4), 0.4 M ammonium acetate and 20% (v / v).
  • v) Soaked in antifreeze solution containing glycerol for 10 seconds, placed on a nipple pump, and cooled instantaneously to 100 ° C absolute temperature (100 ° C) in a cooling flow of nitrogen gas. These crystals showed a diffraction of 1.3 A in the synchrotron. Data were obtained at the Brookhaven National Laboratory on the X8C beamline.
  • the structure of ArthroAC was determined from a mercury-containing thimerosal derivative of ArthroAC. Data were collected at three wavelengths in the Multiwavelength Anomalous Diffraction (MAD) experiment. Analysis of the data using the program SOLVE (Ref. 23) revealed that there were three mercury sites in the asymmetric unit. These sites were used to calculate each experimental step at 1.3 angstrom resolution, yielding an overall figure of merit (FOM) of 0.33 to 1.3 angstrom. Using the program RESOLVE (Ref. 24), the electron density modification with a solvent content of 0.4 significantly increased F0M (0.45 at 1.3 ⁇ ) and substantially improved the electron density map. Was. About 80% of the protein backbone was automatically constructed using the program RESOLVE.
  • the mercury-binding ArthroAC model was used as a starting point for refinement of native protein crystals. Refinement of all models was performed using the program REFMAC5 version 5.1.08. The 1% reflection was ignored for the monitoring of the Rfree factor ⁇ (factor) during the refinement process. The electron density map showed that one loop had a substantially different conformation, which was reconstructed using program 0. The model was refined at a resolution of 1.35 ⁇ , resulting in a final R-factor of 0.130 and an Rft: ee of 0.175. This model contains 2 to 754 residues, 1029 molecules of water and one Na ion. Major features near the catalytic site residues were modeled as phosphate ions.
  • the immersion time was changed (30 seconds, 2 minutes, 10 minutes, 35 minutes, 2 hours, 4 hours, and 10 hours), and the obtained chondrointin AC lyase and chondrointin-1
  • the structures of all the complexes with the tetrasaccharide sulfate (CS tetra ) and the structures of the HA tetra complex (immersion time: 2 minutes) were determined.
  • the different electron densities revealed that the occupancy of sugars at sites 1-2, _1, +1 and +2 was regularly different for each structure. All data were obtained at high resolution, and the electron density images corresponded well to the predicted sugar types, so the temperature factor was similar between different crystals, but the occupancy was different. Was thought to be.
  • ArthroAC Hs Its mercury derivative (ArthroAC Hs ), complex with hyaluronan soaked for 2 minutes (ArthroAC, complex with CS tete soaked for 30 seconds, 10 minutes or 10 hours)
  • ArthroAC cstetra The coordination of (ArthroAC cstetra ) is registered in Protein Data Bank, RCSB. Amino acid sequence of ArthroAC
  • ArthroAC was purified from its natural host, but the gene encoding this protein has not been cloned. Although the enzyme was widely used commercially, the amino acid sequence had not been determined. Fortunately, the quality of the electron density maps calculated at 1.3 Angstroms resolution and the availability of several refined models for independently collected data sets have led to the protein The full-length amino acid sequence of was fully determined. Approximately 80% of the protein backbone atoms were automatically constructed by the program RESOLVE, and up to 95% of the total protein by manual fitting to experimentally obtained electron density maps. The strongest electron density image in the map obtained experimentally was considered to be a sulfur atom, and the type of the residue was cysteine or methionine based on the shape of the electron density.
  • the improved information at each stage of the refinement process could improve sequencing.
  • an independent electron density map for each refined complex was analyzed for peak heights in 2Fo-2Fc, 3Fo-2Fc, and Fo-Fc, comparison of individual atomic temperature factors, The analysis results of the possibility of hydrogen bonding between adjacent atoms were used. These analyzes distinguished carbon, nitrogen, and oxygen atoms, and determined the primary sequence of ArthroAC with very high confidence.
  • another partially occupied core The formation was identified.
  • the ArthroAC molecule has an overall ⁇ +] 3 structure and consists of two domains.
  • the N-terminal ⁇ - helical domain consists of 13 ⁇ -heritus, 10 of which, as classified in the SCOP database, represent incomplete double-layer ( ⁇ / ⁇ ) 5 toroids. (See Reference 30).
  • On one side of the toroid are long, deep grooves, which define the location of the active and substrate binding sites.
  • ⁇ The three single helices at the end are in front of the ( ⁇ / h) 5 toroid, shrinking the groove on one side. Residues conserved in sequences homologous to ArthroAC are concentrated in this groove region.
  • the C-terminal domain consists almost entirely of four single-sheeted] 3-strands.
  • the second domain can be divided into two subdomains, the first contains two large / 3—sheets and one short single helix, and the second subdomain is the third and fourth / 3—Consists of a sheet.
  • Hyaluronan tetrasaccharide was also used as a substrate with an immersion time of 2 minutes, and diffraction data was collected at a resolution of 1.9 Angstrom.
  • the structures were independently refined.
  • the ArthroAC molecule was first refined, and then the differential electron density map was observed and interpreted appropriately, and the modeled substrate / product was considered to include the refinement.
  • Several sugar units were clearly identified in each of the refined models. Even after immersion for 30 seconds, the electron density of the entire tetrasaccharide substrate was clearly observed ( Figure 7 and Table 4).
  • the tetrasaccharide substrate is the most evident in the series of data for this 30 second soak, with the sugar ring occupancy being 0.7 at the 11 and -2 subsites and +1 and +2.
  • Oligosaccharides bind into the narrow end of the groove of the N-terminal domain and make contact with residues Asnl 2 l, Trpl22, Trpl23, Argl31, Glnl66, Argl71, Asnl80, His230, Tyr239, Arg293, Arg297, Asp300, Asn407 and Trp462 (Figure 7).
  • Tr P 123 and Trp462 show overlapping interactions with the saccharide unit occupying positions +1 and 1-2, while Tr P 122 aligns towards the edge and + It forms a hydrogen bond with oxygen that priddings between 2 and +1 units.
  • the 410 sulfo group of the substrate shows various interactions with the protein.
  • the 4-0-sulfo group of the sugar linked at the +2 site is hydrogen-bonded to Glnl66 and is linked to Asp219 and Gln229 via a bridging water molecule.
  • the 4-0-sulfo group of the sugar linked to the 11 site is located just above the guanidinium group of Arg297, and is hydrogen-bonded to Glu409 and Asn595 via the priding water molecule. Both 4_0-sulfo groups contribute to substrate binding, but not significantly to the specificity of substrate recognition.
  • the chondrointin sulfate tetrasaccharide used in this series of studies was obtained by the action of GAG lyase, and the non-saturation between the carbon atoms at positions 4 and 5 (C 4 -C 5) It has an unsaturated ring that retains a double bond (Reference 10).
  • the electron density of one or two sugars corresponds to this unsaturated ring very well at the carbon atom at position 5 (C 5), which has sp 2 hybridization.
  • Table 5 A detailed list of all hydrogen bonds between this tetrasaccharide and the protein side chain is shown in Table 5.
  • the short distance between 06B and 0D1 indicates that there is a low-parity hydrogen bond between them (Reference 31), which indicates that the carboxyl group of dalc oxalate is protonated, Sexual state.
  • 06A forms a long second hydrogen bond of 2.90 angstroms with the protonated His230 NE2.
  • the geometry of the hydrogen bond involved in the carboxyl group is very close to ideal. Potential nucleophilicity
  • the distance from His230 NE 2 to C 5 of +1 glucuronic acid is somewhat longer, at 4.04 ⁇ .
  • the OH groups (hydroxyl groups) in C 2 and C 3 are also firmly held by some hydrogen bonds.
  • Oxygen atom 2 (02) and oxygen atom 3 (03) are hydrogen-bonded to 0D1 and ND2 of Asnl21, respectively, and 02 is hydrogen-bonded to D2 of Asn407 (Fig. 7b).
  • the other two residues also make very important contacts with the substrate.
  • the hydroxyl group of Tyr239 is within the 04 oxygen that bridges between the +1 and 11 sugars, and the 05 hydrogen bond distance of the +1 sugar ring.
  • This Tyr239 hydroxyl group is only 3.0 angstroms away from C5 in darcylic acid.
  • the side chain of Arg293 forms a hydrogen bond with prudging 04 and is 2.9 angstroms from the hydroxyl group of Tyr239.
  • the electron density corresponding to the dextrin group of dalc baltic acid shows three bulges instead of two, and the third one has a slightly lower electron density. This morphology is common to the densities found in all data sets. Since the solution used for crystallization contained 0.1 M phosphoric acid, phosphoric acid was modeled by partial occupation in the same place (Table 5). The anomalous Fourier map calculated at the model stage excluding tetrasaccharide and phosphoric acid showed a small peak at the position of phosphoric acid, confirming that the model was correct.
  • FlavoAC bound to dermatan and the position of the +1 sugar carboxyl group in ArthroAC bound to chondrointin are almost the same, which is the latter in the latter, which has a pseudo-vertical acidic group. This is due to the twisted 'port-type structure of the acid sugar.
  • the hydrogen bonds of ArthroAC to Asnl80 and His230 have nearly perfect geometries, the corresponding hydrogen bonds in the FlavoAC complex are not ideal.
  • the enzymatic reaction carried out by GAG lyase involves the abstraction of the C5 proton by a common base, followed by the donation of a proton to the priming 04 by a common acid or water molecule, and the simultaneous elimination of the leaving group; It is thought to progress (Reference 7).
  • a recent kinetic analysis of FlavoAC using well-defined synthetic substrates is This is consistent with the expected stepwise mechanism (Ref. 32).
  • a proposal for the mechanism of the polysaccharide lyase systemized by Gacesa (Reference 7) involves that the positively charged groups neutralize the acidic groups and shift the equilibrium toward the enolate tautomer.
  • This asparagine is assisted by His230, but also forms a hydrogen bond with the carboxylate group of peronic acid, judging from the hydrogen bonding network ( Figure 7), and is protonated in the complex.
  • the electron density for the substrate is in their paper
  • a differential map (excluding substrate) based on their deposited structural factors and coordinates, since they were not shown. Relatively weak scattered densities were observed, but did not allow for reliable oligosaccharide placement. We concluded that this density corresponds to a mixture of products with a very low occupancy and cannot be reliably modeled. However, even following their model, the distance between histidines NE1 and C5 exceeds 6 ⁇ . We therefore concluded that there was no structural evidence in support of the proposed role of histidine in their work. Furthermore, the His399Ala mutant of S. pneumoniae hyaluronate lyase has a significant activity of 6% of the wild-type enzyme activity (Reference 11).
  • ArthroAC exhibits significant activity on hyaluronan, and the structure of the complex between this enzyme and HA teta shows that the two sugar units at subsites 1 and 1 2 after a short soak of 2 minutes. Only, probably a reaction product. This is in contrast to the substantial occupancy of subsites +1 and +2 after similar soak times for chondroitin sulfate tetrasaccharide, where ArthroAC is more active on hyaluronan than on chondroitin sulfate Suggest that. This result correlates well with ArthroAC having a higher sequence similarity to hyaluronate lyase than to FlavoAC ( Figure 4).
  • Arg293 and Glu404 move toward Tyr239, which participates in a second salt bridge with Glu409 and forms a hydrogen bond with the Tyr239 at the 04 atom, which prids between the 11 and +1 sites.
  • the sugar ring at the +1 site must adopt a higher energy boat conformation, which consists of the newly protonated gonoleconic acid acid group and Asnl80 and the protonated His230. Strong hydrogen bond is formed between Will be compensated for.
  • the proximity of Tyr239 to the positively charged Arg293 and His230 substantially reduces the pKa of this tyrosine.
  • the present inventors speculate that Arg293 and His230 play a role in activating this tyrosine and initiate its role as a common base.
  • the Tyr239 force then extracts protons from glucuronic acid C5, which is less than 3 angstroms apart.
  • the present inventors propose assumed the protons are transported to subsequent Purijjingu 04 (general role of acid), which is associated therewith and C4 one 04 bond cleavage C4- C 5 double bond occurs.
  • the products at the +1 and +2 sites are the first to leave with the opening of the 457-466 loop. Substrate binding and release would be aided by the movement of two separate loops with Asnl21 and Asn407 at the tip, which would facilitate access to the 12 and 11 sites.
  • ArthroAC has two inserts in the N-terminal domain, approximately 15 residues (Arg20-Ser35) and 25 residues (Thr340-Gly363). These two parts form a loop containing an ⁇ -helix near the N- and C-termini of the domain, which together form a groove along the side of the (h / ⁇ ) 5 toroidal N-terminal domain. Most are closed.
  • the chondroitin AC lyase crystal provided by the present invention is a crystal of chondroitin AC lyase of extremely high purity having a unique crystallographic characteristic which has not been known so far. Therefore, it is extremely useful as a means for producing chondroitin as various analytical reagents, pharmaceuticals and the like.
  • the primary structure of chondroitin AC lyase derived from A. thaliana auressens was determined, and it was found that the chondroitinase was an exo-type chondroitinase.
  • the crystals of the chondroitin AC lyase of the present invention are useful for the production of chondroitin sulfate and chondroitin having a specific molecular weight. There is expected.
  • amino acid residues constituting the substrate binding site of chondroitin AC lyase are elucidated, and a protein having them is provided. This is expected to be useful in the production of chondroitin sulfate and chondroitin having a specific molecular weight of the protein and useful as a drug itself.
  • Hg-Peak Info Hg-Remote Native Wavelength 1.005133 1.009078 0.997068 0.950000 Resolution 40-1.3 40-1.3 50-1.4 50-1.3

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Description

明 細 書 コンドロイチン A Cリアーゼ結晶 技術分野
本宪明は、特定の結晶学的特徴を有するコンドロイチン A Cリアーゼ（コンドロ ィチン A Cリアーゼ II、コンドロイチナーゼ A C II)結晶に関する。また本発明は、 コンドロイチン A Cリアーゼの活性を有し、 特定のァミノ酸酉己列を有するタンパ ク質に関する。
背景技術
グリコサミノダリカン（GAG)はプロテオグリ力ンの糖質成分である。グリコサミ ノグリカンは負に強く荷電した多糖であり、 置換ダルコサミン又はガラクトサミ ンがゥロン酸に 1， 4結合で結合した二糖繰り返し構造よりなっている。 これら の二糖単位は 1， 3結合又は 1， 4結合で結合し多糖鎖を形成している（文献 1)。 これらのダルコサミン及びガラクトサミンは多量に硫酸化されており、 その生合 成には多くの酵素群の協調した作用が必要とされている（文献 2， 3)。GAGは細胞外 マトリッタスの主要な成分である（文献 4)。
GAG は二つのタイプの酵素、 即ちヒドロラーゼ （カロ水分解酵素） 又はリアーゼ によって分解される（文献 5)。 ヒドロラーゼ群酵素の酵素学的メカュズムはよく 理解されており、 リテイニング ·メカニズムあるいはインバーティング■メカ二 ズムにより起こる（文献 6)。一方、 GAGリアーゼ群の酵素学的メカュズムの分子的 な詳細についてはまだよく判っていない。 脱離反応の化学的にもっともらしい 機構が報告されているものの（文献 7)、 活性部位の構成及び個々のアミノ酸の役 割については依然として明確ではない。 多くの細菌種が GAGリァーゼを合成し、 これらの酵素を使用して細菌の天然環境にある GAGを分解し炭素原として利用し ている（文献 5， 8)。 三次元構造が判明してる多糖のリアーゼは二つの構造に分類 できる。 一つは右旋性平行 —へリックス （ぺクテート Zぺクチンリアーゼ、 コ ンドロイチナーゼ B、 ラムノグノレクロナンリアーゼなど） であり、 もう一つは（α / α ) 5トロイド（フラボバタテリゥム .へパリナム コンドロイチン AC リアーゼ、 コンドロイチン ABCリァーゼ、細菌ヒアルロン酸リアーゼなど）あるいは（ α / α ) 6 トロイド（アルギネートリアーゼ）である。 触媒メカニズムについては、 カルシゥ ムイオン依存性酵素ぺクテ一トリアーゼについては報告されているが（文献 9)、 ヘリックストポロジーを有する他のリアーゼにあてはまるか否かは定かでな レ、。 いくつかのもっともらしいメカェズム力 ( Qi / c 5 トロイダルフォールドを有 するリアーゼについて報告されている力 これらを支持する明確な証拠はない（文 献 10， 11)。 最近、 Jedrzejasらは、 ヒアルロニダーゼ一基質複合体の結晶構造に より一般的な塩基としてのヒスチジンの役割についての直接的な証拠が得られる ことを示している（文献 12)。 しかし基質原子の多くについて報告されている B— ファクタ一は 100A2 (おそらくリファインメントの限界） であり、 基質について の電子密度マップは示されていない。従って Jedrzejasらの解釈には疑問があり、 前記メカニズムについての問題は未解決のままである。 これらの酵素がカルシゥ ムイオンに依存せず、 認知されている化学的メカニズム（文献 7)から予測される 正に荷電した基がゥロン酸の近傍には存在しないことから、 グルクロン酸カルボ キシル基の電荷を中和するのに必要と推測される基の特性も明らかでない。
明確な特異性を有する GAG分解酵素は、 GAGや他の多糖の構造分析ツールとし て広く用いられており（文献 13)、 コンドロインチン AC リアーゼ群はこの目的の ために頻繁に用いられている。 これらの酵素はゥロン酸の非還元末端にあるグリ コシド結合を切断し、 コンドロイチン—4—硫酸、 コンドロイチン一 6—硫酸を 基質とするが、 デルマタン硫酸は基質としない。 これらの酵素はヒアルロナンに 対しても種々の程度の分解活性を示す。 二種類のソースからのこれらの酵素、 す なわち Arthrobacter aurescens に由来するコンドロイチン AC リアーゼ (ArthroAC)及び Flavobacterium heparinumに由来するコンドロイチン ACリア一 ゼ (FlavoAC)が生化学工業株式会社から市販されており、 頻繁に用いられている。 FlavoACについてはクローユングがなされており、 F. hepari匪 歡 14)及び^: cWi (文献 15)において強制発現されている。 本発明者らは以前に、 この酵素の三 次元構造をそれ自体（文献 16)及びいくつかのデルマタン硫酸オリゴ糖との複合 体 (文献 10)において決定し、別の触媒メカニズムを提案した。 これらの別の触媒 メカニズムの一つは、 反応産物複合体と分子モデリングに基づいてヒアルロン酸 リアーゼについても提唱した（文献 11, 17)。
一方、 Arthrobacter aurescens に由来するコンドロイチン AC リアーゼ (ArthroAC)の精製や特性化はかなり以前になされ (文献 18- 20)、GAG分析のツール として広く用いられてきてはいるが、 この酵素はクローユングされておらず、 そ のアミノ酸配列は未決定のままであり、 アミノ酸組成と、 糖質含量のみが報告さ れていた（文献 19)。
近年、 各種 GAGの生理学的活性が研究され、 特に分子量特異的な生理活性も注 目を集めており、 医薬としての使用も期待されている。 従って、 GAG分解酵素の —つであるコンドロイチン AC リアーゼを高度に生成された結晶状態で提供でき れば、 各種分析用試薬、 医薬等としての低分子化されたコンドロイチンやコンド ロイチン硫酸などの製造において、 あるいは医薬そのものとして極めて有用であ る。 また、 コンドロイチン ACリアーゼ活性を有するタンパク質を提供できれば、 同様に上記のような有用性を有し、 またその生産上極めて有利である。
上述のように、 ArthroACはこれまでに既に精製され、 なかには結晶化されたと の報告もあるが、 本発明におけるようなュユークな特性を有する結晶は知られて いなかった。 発明の開示
本発明は、生化学的分析ツールあるいは低分子化された GAG等の製造手段として 有用な、特定の結晶学的特徴を有するコンドロイチン A Cリアーゼ（コンドロイチ ナーゼ ACII)結晶を提供することを目的とする。また本発明は、上記のような有用 性を有するコンドロイチン A Cリアーゼの活性を有するタンパク質を提供するこ とを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 ァルスロバタ ター属細菌 （ァルスロパクター■ァウレセンス） のコンドロイチン A Cリアーゼ (ArthroAC) のユニークな結晶を得ることに成功し、 その結晶学的特徴を同定し た。さらに該結晶の X線回折による構造分析によりコンドロイチン A Cリァーゼの 一次構造を解明し、 すでに一 7火構造が解明されていたフラボバタテリゥム ·へパ リナム由来のコンドロイチン ACリア ゼ (FlavoAC)の一次構造と比較することに より、 前者がェキソ型コンドロイチナーゼであり、 後者がエンド型コンドロイチ ナーゼであることを解明した。 さらに ArthroACの上記分解機構において重要な役 割を果たす同酵素中のアミノ酸残基を特定した。
従って本発明は、 単斜晶系空間群 に属し、 単位格子定数 a=57. 6A、 b=85. 5 A、 c=80. 5A、 i3 =106. 9° を実質的に有し、 非対称単位に一つの分子を有するァ ルスロパクター属細菌由来のコンドロイチン A Cリァーゼの結晶を提供する。 本発明のコンドロイチン A Cリァーゼの結晶においては、 前記ァルスロバクタ ー属細菌 ァルスロパクター ·ァウレセンスであることが好ましい。
また本発明は、 コンドロイチン A Cリアーゼの活性を有し、 アミノ酸配列 Asn-Trp-Trp- (Xaa 7— Arg— (Xaa) 34— Gin— (Xaa) 4一 Arg— (Xaa) 8— Asn— (Xaa 49一 His— (Xaa) 8 -Tyr- (Xaa) 53 _Arg- (Xaa) 3— Arg— (Xaa) 2_ (Asnま 7こは Asp - (Xaa) 106_Asn— (Xaa) 54— Trp (Xaaは任意のァミノ酸残基を示し、数字は残基数を示す）を含むタンパク質を提 供する。 このタンパク質のァミノ酸配列は、 配列表の配列番号 2に示した。
このようなタンパク質のなかでも、 配列表の配列番号 1におけるアミノ酸番号 1 2 4〜 4 6 5で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 コンドロイチン A Cリァーゼ II結晶の顕微鏡像を示す写真である。 図 2は、 コンドロイチン A Cリアーゼ II結晶の顕微鏡像を示す写真である。 図 3は、 3 σ (緑色）および 6 σ (深紅色）のレベルで輪郭を描いた 3Fo - 2Fc電子密 度マップの代表的な部分を示す図である。 このマップにより C、 Nおよび 0原子の 区別が可能である。
図 4は、 ArthroAC、 FlavoAC およびいくつかのヒアルロン酸リアーゼについて の構造ベースの配列アラインメントを示す図である。 基質結合部位を閉鎖する ArthroAC配列におけるィンサートはグレーで示した。イタリックの太字は α —へ リックスを形成する残基を示す。 太字は ;3—ストランドを形成する残基を示す。 4種いずれのタンパク質においても保存される残基は四角で囲んだ。 矢印は推定 活性部位残基 Asnl80、 His230, Tyr239, Arg293及び Glu404を示す（ただし、 Glu404 には矢印を付していない）。 本図はプログラム MOLSCRIPT (文献 44)および Raster3d (文献 45)により作成した。 図中、 Gはグリシン、 Aはァラユン、 Vはバリ ン、 Lはロイシン、 Iはイソロイシン、 Sはセリン、 Tはスレオユン、 Dはァスパ ラギン酸、 Eはグルタミン酸、 Nはァスパラギン、 Qはグルタミン、 Kはリシン、 R はアルギニン、 Cはシスティン、 Mはメチォニン、 Fはフエエルァラニン、 Yはチ 口シン、 Wはトリプトファン、 Hはヒスチジン、 Pはプロリンの残基をそれぞれ示 す。
図 5は以下の通りである。 a) ArthroACのリボン図である。 N末端（α / ο; ) 5トロ ィドの個々の αヘリックスヘアピンは異なる色で示す。 C末端ドメインの個々の βシートも別の色で示す。溝をブロックする ArthroACにおけるインサートはグレ 一で示す。 b) ArthroACおよび FlavoACの N末端ドメインの C トレースを重ね合 わせたものを示す立体図である。溝をプロックする ArthroACにおけるインサート はグレーで示す。 c) ArthroACおよび FlavoACの C末端ドメインの Cひ トレースの 立体図である。
図 6は、 C末端ドメインからの 457〜466ノレープのオープンおよびクローズコン フオメーシヨンの立体図である。 オープンコンフオメーシヨンにおける Cys405 の近傍のチメロサール水銀原子の位置をボールで示す。 His230、 Arg293、 Glu404 および Trp462の側鎖を特に示す。 + 2および + 1糖も示す。
図 7は、 基質結合部位の立体図である。 a) 結合するコンドロイチン一 4_硫酸 の四糖に対応する存在する基質を除いて計算したォミットマップにおける電子密 度を 1. 2 σレベルで示したものであり、 + 1糖単位の捩れたポートコンフオメ一 シヨンを明確に示している。 b)四糖の近接する側鎖への接触。 水素結合は破線で 示す。
図 8は、 Arthrobactorコンドロイチナーゼ ACのコンドロイチンー4一硫酸四糖 との複合体（青色）および Flavobacteriwnコンドロイチナーゼ AC Y234F変異体の コンドロイチン一 4一硫酸四糖との複合体（赤色）を重ね合わせたものを示す立体 図である。
図 9は、提案される触媒機構を示す図である。 457〜466ループの開閉は近傍の 2つのル プの先端の動きに関連している可能性が高く、 開閉に基質の結合およ び放出が伴う。基質の結合により活性部位が認識され、正に荷電した Arg293およ び Tyr 239に水素結合したプロトン化 His230に影響される Tyr239の脱プロトン化 が起こる。フエニル環の 0H—が最初に + 1部位のグルクロン酸の C5からプロトン を引き抜く一般的な塩基として作用する。 そしてこのプロトンは _ 1部位の糖の 04脱離基に与えられる。基質結合谷のプロックされた末端によりグリコサミノグ リカン鎖の非還元末端の糖への結合が制限され、 ArthroACのェキソ型作用機序が 生じる。
図 1 0は以下の通りである。 a) ArthroAC の伸長された基質結合部位内の分子 表面の立体図である。 基質結合部位をキヤップする配列中のィンサートを緑色で 示す。 b) FlavoACの伸長された基質結合部位内の分子表面を結合した四糖ととも に示す立体図である。 本図はプログラム GRASP (文献 46)により作成した。 発明を実施するための最良の形態
コンドロイチンリアーゼ（EC 4. 2. 2. 4および EC 4. 2. 2. 5)は脱離酵素として働く グリコサミノダリカン分解酵素である。 ァルスロパクター .ァウレセンス {Arthrobac tor aurescens)カ ら得られるコンドロイチンリアーゼ AC (ArthroAC)は. コンドロイチン一 4一硫酸およびコンドロイチン一 6—硫酸に作用するが、 デル ,マタン硫酸には作用しないことが知られている。その他のコンドロイチン ACリア ーゼとして、 ヒアルロナンを開裂することもできる。
本発明のコンドロイチン ACリアーゼの結晶に使用されるコンドロイチン ACリ ァーゼ自体は公知の酵素であり、 既に精製されている。
本発明のコンドロイチン ACリアーゼの結晶に使用されるコンドロイチン ACリ ァーゼはァルスロパクター属細菌に由来する。本宪明のコンドロイチン ACリア一 ゼの結晶に使用されるコンドロイチン AC リアーゼを取得するためのアルスロバ クター属細菌は特に限定されないが、 ァルスロパクター 'ァウレセンスであるこ とが好ましい。
ァルスロパクター属細菌からコンドロイチン AC リアーゼを取得する方法も特 に限定されず、 細菌から酵素を取得するのに通常使用される方法を用いて取得す ることができる。 具体的には、 ァルスロパクター属細菌を培養し、 培養された細 菌の菌体から酵素を抽出し、 該酵素を精製すればよい。
ァルスロパクター属細菌の培養は、 例えば J. Biol. Chem. , 243 (7)， 1523 - 1535 (1968)、 特開昭 62-122588号、 特開平 2- 57180号公報等に記載されるような通常 の方法で培養することができる。 培養条件も特に限定されないが、 例えば、 肉又 は魚エキスとポリペプトンを含有する培地中、 3 0〜3 5 °C程度の温度で半日間 〜 5日間程度培養する。 コンドロイチン ACリアーゼの発現を増強するために、培 養液中にコンドロイチン硫酸又はその加水分解物を 0 . 0 1 %以上、 好ましくは 0 . 0 5〜 1 %程度添加することが好ましい。
培養された細菌の菌体を培養液から採取し、これを中性付近の PHを有する緩衝 液に懸濁させ、 その懸濁液から酵素の抽出を行う。 中性付近の p Hを有する緩衝 液としては、 通常 pH6. 0~8. 0の 1〜100 raMリン酸緩衝液、 トリス一塩酸緩衝液、 酢酸緩衝液等を用いることができる。 このような緩衝液中で超音波処理あるいは 菌体破壊装置 (Dino Mill等） による処理を行って菌体を破砕し、 コンドロイチン ACリアーゼ、 プロテアーゼ、 その他の酵素、 核酸、 蛋白質等を含む菌体抽出液と して抽出する。コンドロイチン ACリァーゼの菌体からの抽出は、界面活性剤溶液、 例えば界面活性剤を添カ卩した緩衝液を用いることにより、 抽出効率を高めること ができる場合がある。
得られた菌体抽出液を緩衝液に対して透析することなどによって低分子量物質 を除去した後、 塩析、 硫安沈降、 各種クロマトグラフィー等を用いることによつ て精製することができる。
コンドロイチン AC リアーゼの精製に用いることができるクロマトグラフィー の一例としては、 弱カチオン交換樹脂と強力チオン交換樹脂とを組合せて使用す るクロマトグラフィー処理を挙げることができる。 ここで使用する弱カチオン交 換樹脂としては、 交換基がカルボキシメチル基等のカルポキシアルキル基である カチオン交換樹脂を例示することができる。 具体的には交換基としてカルボキシ メチル基を有する多糖類誘導体 （ァガロース誘導体、架橋デキストラン誘導体等） が挙げられ、 市販品としては CMセファロース、 CMセフアデックス （いずれも 商品名、 フアルマシア社） 等が挙げられる。 強力チオン交換樹脂としては、 交換 基がスルホアルキル基であるカチオン交換樹脂を例示することができる。 具体的 には、 交換基としてスルホェチル基、 スルホプロピル基等を有する多糖類誘導体 (ァガロース誘導体、架橋デキストラン誘導体等）が挙げられ、市販品としては S セファロース又は S Pセファロース （商品名、 フアルマシア社）、 S Pセフアデッ タス （商品名、 フアルマシア社)、 S Pトヨパール （商品名、 東ソー （株)） 等が 挙げられる。 上記 2種類のカチオン交換樹脂を組合せたクロマトグラフィー処理 としては、 以下の方法を一例として挙げることができる。
まず最初のクロマトグラフィー処理としては、 弱カチオン交換樹脂を菌体の抽 出に用いたのと同様の緩衝液、 例えば pH 6. 5〜7. 5の緩衝液 （例えば、 1〜50 mM のリン酸緩衝液、 トリスー塩酸緩衝液、 酢酸緩衝液など） で平衡化し、 これに前 記の菌体抽出液の上清を接触させ、 酵素を吸着させ、 このカチオン交換樹脂を、 必要に応じて塩類溶液 （例えば、 20〜25 溶液ぉょび7または前記界面活 性剤溶液 (例えば、 0. 5 % P0ELE溶液） を用いて洗浄する。 上記緩衝液に 0. 1 M 程度の食塩を溶解させた溶出液を調製し、 前記樹脂と接触させて酵素活性を有す る画分を溶出する。溶出法は濃度勾配法（グラジェント法） によっても、 ステップ ワイズ法によってもよい。このようなクロマトグラフィー処理は、カラム法でも、 バッチ法でもよい。 得られた画分を、 同様の緩衝液で平衡化した強力チオン交換 樹脂と接触させ、コンドロイチン ACリアーゼを吸着させ、 このカチオン交換樹脂 を、 必要に応じて塩類溶液 (例えば 20〜50mM NaCl溶液）および Zまたは水を用い て洗浄後、 0〜約 0. 5Mの食塩を含む前記と同様の緩衝液 （例えばリン酸緩衝液、 トリス一塩酸緩衝液、 酢酸緩衝液など）で濃度勾配法によってコンドロイチン AC リア一ゼを溶出単離し、 精製酵素溶液を得る。 このようなクロマトグラフィー処 理は、 カラム法で行うことが好ましい。 以上の 2種類のカチオン交換樹脂を使用 するクロマトグラフィー処理を、 上記と逆の順序で行うことも可能である。
このようにして得られたコンドロイチン ACリァーゼは、不純物のェンドトキシ ン、核酸、プロテアーゼ、その他の蛋白質等が除去されており、電気泳動（SDS-PAGE) で単一のバンドを示し、 HPLC (ゲル濾過、 カチオン交換）においても単一のピーク を示すものである。
さらに、上記の精製酵素溶液からコンドロイチン AC'リアーゼを結晶化する。精 製されたコンドロイチン ACリアーゼを結晶化する方法も特に限定されず、通常タ ンパク質の結晶化に用いられる方法を応用することができる。 例えば、 コンドロ ィチン ACリァーゼを、両末端が水酸基である構造を有するポリエーテル (例えば、 ポリエチレングリコール、 ポリプロピレングリコール等） と混合接触させ、 コン ドロイチン AC リアーゼを結晶化させることもできる。 例えば、 コンドロイチン ACリァーゼ溶液にポリエチレングリコール（分子量 4, 000、 6， 000、 8, 000等）を添 加し、 室温〜 4 °C程度で結晶が生成するまで放置する。 また、 コンドロイチン AC リァーゼの結晶化は、コンドロイチン ACリァーゼ及びポリエチレングリコー/レを 含む溶液を、 ポリエチレンダリコールを含む溶液中に懸濁させて結晶化を行う、 懸滴気相拡散法（hanging drop vapor diffusion method)が好ましい。 特に、 後述 する実施例に記載された方法で結晶化することが極めて好ましい。
上記のようにして得られる本発明のコンドロイチン ACリアーゼの結晶は、単斜 晶系の柱状結晶である。 その結晶学的特性は、 X線回折等により分析することが でき、本発明者らは 1. 25オングストロームの解像度で三次元構造を決定しうる結 晶を得た。 この高い解像度と、 天然酵素およびその複合体の非常に高品質な電子 密度マップに基づいて、コンドロイチン ACリアーゼ 97%のアミノ酸を明確に同定 することができ、 FlavoACおよびヒアルロナンリアーゼに共通する触媒機構の分 子学的な詳細を明確にすることができた。
すなわち、後述の実施例に記載するように、本発明者らは ArthroACの三次元結 晶構造をその天然の形態およびその基質（コンドロイチン 4硫酸四糖 (CStetra)およ びヒアルロナン四糖）との複合体において 1. 25〜1. 9 オングストロームの解像度 で決定し、上記結晶は、単斜晶系空間群 P に属し、単位格子定数 a=57. 6A、b=85. 5 A、 c=80. 5A、 =106. 9° を実質的に有し、 非対称単位に一つの分子を有するこ とが判明した。
また、 ArthroACの一 7火構造はこれまで決定されていなかったが、 高解像度電子 密度マップによりこの酵素のアミノ酸配列を決定することができた。
酵素一基質複合体は、 基質を種々の時間結晶に浸潰し、 結晶を瞬間凍結するこ とにより得た。 短時間 (〜 2分)基質に浸漬した結晶の電子密度マップにより基質 が明確に示され、 + 1位置 (後記参照）のグルクロン酸の環がポート■コンフオメ ーシヨンにねじれることが示された。 この構造により、 チロシン（Tyr) 239 力 S C5 位置からプロトンを引き抜く一般的な塩基として作用し、 ァスパラギン (Asn) 180 および His230 がダルク口ン酸酸性基を中和するという分解機構が強く支持され る。 この構造を Fla vobac terium heparinumに由来するコンドロイチン ACリア^" ゼ（FlavoAC)のものと比較することにより、 ArthroAC のェキソ型作用機序と FlavoACのエンド型作用機序の説明が得られる。 実施例
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。
本明細書においては Davies らの命名法（文献 21)に従うものであり、 切断の還 元末端の糖を 「 +」 の記号で示し、 切断部位から数値を増加させる。 非還元末端 の糖を 「一」 の記号で示し、 切断部から離れるに従って数値が増加する。 この命 名法によれば、 前記酵素は糖— 1および + 1の間の結合を切断し、 後者がゥロン 酸である。
Arthrobacter aurescensの培養とタンパク質の精製
ArthroACの発現を刺激するために、 Arthrobacter at resce^sを下記の条件で培 養した。 0. 4%ペプトン（Kyokuto Pharmaceutical Industry Co. Ltd. , Tokyo)、 0. 4% エーリツヒ魚エキス (Kyokuto Pharmaceutical Industry Co. Ltd. , Tokyo)及び 0. 75%コンドロイチン硫酸 C (生化学工業株式会社）を含む培地 (32. 5リットル、初期 pH 6. 2)で、 1 v. v. mの通気率及び 220 rpmの攪拌速度で 24時間培養した。
培養細胞から以前に記載された方法 (文献 20)にいくつかの変更を加えた方法で 酵素を精製した。 すなわち、 培養液を 15, 000gで 15分間遠心して菌体を除いた後、 上清に 75% (w/v)飽和になるように固体の硫安を加えた。 4 °Cで 75gのタンパク沈殿 物（50， 000ュニット）を 0. 02M酢酸バッファー (pH5. 2)を含む蒸留水に対して連続 して透析し、 同じバッファーで予め平衡化したカラム SP- Sepharose (Araersham Bioscience Corp, Piscataway, NJ, 直径 X長さ： 2. 6 x 70 cm)に力、けた。 数カラ ム容量のバッファーでカラムを洗浄した後、 0. 02〜0. 3 M酢酸バッファーの直線 濃度勾配で酵素を溶出した。 酵素活性及ぴタンパク質量を先に報告された方法で モニターした（文献 20)。 このクロマトグラフィー操作を 3回繰り返し、 酵素を含 む分画を集め窒素雰囲気下で限外濾過により濃縮した（Ultrafilter Type P0200、 分子量力ットオフ 20， 000、 Advantec, Tokyo Japan) 0 最後に酵素を 0. 01 M酢酸バ ッファー（pH 5. 6)で平衡化した Sephacryl S-200HRゲル濾過力ラム（Amershatn Bioscience Corp, Piscataway NJ)に力 ナ、同じバッファ一で溶出させた。 SDS - PAGE により最も高い特異的活性と純度を示した画分を集めて合わせ、 結晶化実験に使 用した。
オリゴ糖の調製
コンドロイチン一 4一硫酸四糖 (CStetra)、 デルマタン硫酸六糖 (DShexa)およびヒ アルロナン四糖を以前に記載されたように調製し、 キャラクタライズした（文献 10)。すなわち、 ゥシ気管由来のコンドロイチン一 4一硫酸とブタ腸粘膜由来のデ ルマタン硫酸を、コンドロイチン ABCリァーゼを使用してコントロールして脱重合 し、 反応が完了する前に 5分間煮沸することによって停止させた。 各オリゴ糖混 合物を Bio-Gel P6カラムで分離し、 四糖からなるフラクションおよび六糖からな るフラクションを集めた。 これらの混合物をさらに強ァェオン交換高速液体クロ マトグラフィ一で分画し、 単一のオリゴ糖を得た。 それらの純度はキヤビラリ一 電気泳動により確認し、構造は MSおよび NMR分析により確認した。 これらの構造は CStetraが Δ UAp (1→3) - β -D-GalpNAc4S (1→4) - β -D-GlcAp (1→3) - α , β
- D - GalpNAc4Sであり、 DShexaは Δ Μρ (1→[3] - ;3 - D - GalpNAc4S (l→4) - - L - IdoAp (l →) 23) - α , β - D- GalpNAc4Sであつた（ Δ UApは不飽和糖残基 4-デォキシ- a _L -スレ ォ-へキシ -4 -エノピラノシルゥ口ン酸を示し、 IdoApはィドピラノシルゥ口ン酸を 示し、 GlcApはダルコピラノシルゥ口ン酸を示し、 GalpNは 2 -デォキシ -2-ァミノガ ラタトピラノース、 Sはスルフェート、 Acはアセテートを示す)。
タンパク質の結晶化及びデータの収集
上記タンパク質の針状結晶がかなり前に報告されているが（文献 20)、キャラク タラィズされていない。上記酵素を懸滴気相拡散法により結晶化した。すなわち、 l mlのリサーバー溶液に懸濁した、 のタンパク質（lOrag/ml)と 2 μ 1のリサ一 パー溶液（23% (w/v) PEG8000、 0. 1 M リン酸バッファー、 pH6. 4、 0. 4 M酢酸アン モユウム、 10% (v/v)グリセロールを含む）とを含む液滴中で結晶化させた。 小さ な結晶は数日中に現れた。 データを得るために適した大きな結晶を得るためにマ クロシーデイング法を用いた。 すなわち、 小さな結晶を洗浄し、 沈殿剤濃度を 21% (w/v)に低下させた新鮮なタンパク質含有液滴中に移した。 大きく、 十分に規 則性のある結晶は 3〜5週間以内に成長した。ここで得られたコンドロイチン A C リアーゼ II結晶の顕微鏡像を図 1及び図 2に示す。
結晶は、単斜晶系空間群 に属し、単位格子定数 a=57. 6 A、 b=85. 5 A、 c=80. 5 A、 ^ =106. 9° を有し、 非対称単位に一つの分子を含んでいた。 データを収集す る前に、 結晶を 22. 5 (w/v) PEG8000、 0. 1 Mリン酸バッファー（pH 6. 4)、 0. 4 M酢 酸アンモ-ゥム及び 20% (v/v) グリセ口ールを含む凍結防止溶液に 10秒間浸し、 ナイ口ン プにのせ、窒素ガスの冷却流中で絶対温度 1 0 0度（ 1 0 Ο Κ)まで瞬 間的に冷却した。 これらの結晶はシンクロ トロンにおいて解像度 1. 3Aの回折を 示した。 データは X8Cビームラインで Brookhaven National Laboratoryで得た。
2 raM Hg塩をさらに加えた凍結防止溶液にもとの（ネィティブ)結晶を一晩浸す ことにより、 この Hg塩（チメロサール） と複合体を形成した結晶タンパク質を得 た。この重原子誘導体の存在により、 c -軸が 1. 7 Aまで拡大し、格子定数は a=57. 4 A、 b=85. 3AS c=82. 2A、 β =105. 8° となった。 この結晶はネイティブ結晶に対 して有意な非同型性を示した。 3種の波長におけるそれぞれのデータは MADレジ ームにおいて得た。
酵素一基質複合体
ArthroACとその基質の複合体を得るため、ネイティブ結晶を基質を含む凍結防 止溶液中に 30秒間から 10時間浸した（表 2)。 ネイティブ結晶を 5 の CStetraま たはヒアノレ口ン酸四糖 (HAtetra)を含む凍結防止溶液に特定の時間浸し、その後検出 器のゴ-ォメーター上で冷窒素流（100K)で瞬間凍結し、 直ちにデータ収集に使用 した。 格子定数はネイティブ ArthroACと比較して有意な相違を示さなかった。 すべての結晶の回折データは Quantum_4CCD検出器を用い、 Brookhaven National Library, NSLSにおいて XSCビームラインで収集した。 最高の解像度である 1. 25 Aのデータは、 ネイティブ結晶を 5 mMの CStetra中に 10時間浸した場合に得られ た。 データの処理と計測は HKL 2000 (文献 22)により行った。 収集したデータを表 1及ぴ 2に示す。
構造決定 ArthroACの構造は、 ArthroACの水銀含有チメロサール誘導体から求めた。多波 長異常散乱 (Multiwavelength Anomalous Diffraction, MAD)実験において三波 長でデータを収集した。 プログラム SOLVE (文献 23)を使用してデータを分析した ところ、 非対称単位に三つの水銀部位があることが判明した。 これらの部位を使 用して 1. 3 オングス トロームの解像度で各実験段階を計算し、 figure of merit (FOM)の全体的な値として 0. 33〜1. 3オングスト口ームを得た。 プログラム RESOLVE (文献 24)を用いた、 溶媒含量を 0. 4とする電子密度修飾により F0Mが有 意に増大し（1. 3オングストロームにおいて 0. 45)、 電子密度マップが実質的に改 善された。 タンパク質主鎖の約 80%がプログラム RESOLVEを用いて自動的に構築 された。 主鎖のその他の断片及び多数の側鎖は、 プログラム 0 (文献 25)を用いて それぞれ計算した。 前記タンパク質の一次配列は未知であったので、 各残基のァ ミノ酸種を実験的な電子密度マップに適合するように選択した。 1. 3 オングスト ロームの解像度において、 ほとんどのアサインメントが明確なものであり、 ほぼ 全体の鎖が当初のマップ上にトレースできた。 この最初の配列決定は、 リファイ ンメントの間、 電子密度特性がさらに改良されるものとして調整された。 プログ ラム CNS、 バージョン 1. 1 (文献 26)を用いて最初のリファインメントを行い、 そ のモデルをプログラム 0を用いて計算することで再構築した。 その後、 プロダラ ム REFMAC5、 バージョン 5. 1. 08 (文献 27)を使用してリファインメントを重ねた。 このモデルのリファインメントの過程では、 1 %のリフレクション （反射） は Rfreeの計算には使用しなかった。 CNSプログラムでは水分子が最初に自動的に加 えられ、 その後マップの相違を視覚的に検査することにより常に最も新しいもの 'に置き換え、 修正するものとした。 チメロサールに浸漬したタンパク質の最終モ デルは、 1. 3オングストロームの解像度において、 R -ファクター（因子）が 0. 134 Rfreeが 0. 155 となった。 このような高い品質の電子密度マップにより、 ァスパ ラギン、 グルタミン及びヒスチジンの大部分の側鎖の炭素、 窒素、 酸素原子を区 別することができた。 このモデルは 7 5 3残基 (Gly2〜Arg754)を含み、 図 4に示 したァラインメントにおいて示した ArthroACのァミノ酸配列に対応する。本明細 書中で言及するアミノ酸番号は、 特にことわりがない限り、 この配列に付した番 号に基づく。 現在のモデルは 7 5 4残基を含み、 別途のアミノ酸番号を付して配 列表の配列番号 1に示した（Pro4〜Arg757)。
ネイティブタンパク質および酵素一基質複合体のリファインメント （詳細化） 水銀結合 ArthroACのモデルを、ネィティブタンパク質の結晶のリファインメン トの出発点とした。 すべてのモデルのリファインメントはプログラム REFMAC5バ 一ジョン 5. 1. 08を用いて行った。リファインメントの過程での Rfreeファクタ^ (因子） のモユタリングについては 1 %のリフレクションは無視した。 電子密度 マップによりひとつのループが実質的に異なるコンフオメーシヨンを有すること が示され、これをプログラム 0を用いて再構築した。 このモデルを 1. 35オングス トロームの解像度でリファインし、最終的な Rファクターが 0. 130、Rft:eeが 0. 175 となった。 このモデルは 2〜754までの残基と 1029分子の水と一つの Naイオン とを含むものである。 触媒部位残基近辺の大きな特徴はリン酸イオンとしてモデ ル化された。
その後このモデルを使用して、 浸漬時間を変えて（30秒、 2分、 10分、 35分、 2 時間、 4時間、 10時間）、 得られたコンドロインチン ACリアーゼとコンドロイン チン一 4一硫酸四糖 (CStetra)との複合体の全て、 及ぴ HAtetra複合体 (浸漬時間 2分） の構造を決定した。 異なる電子密度の高さから、 部位一 2、 _ 1、 + 1及び + 2 における糖の占拠は構造ごとに規則的に異なっていることが明らかとなった。 す ベてのデータを高い解像度で得、 電子密度像は予測した各糖の種類によく対応し ていたので、 温度ファクター （因子） は異なる結晶間でも同様なものであるが、 占拠は異なっていると考えられた。 従って基質における各糖環の占拠を調整し、 異なる結晶でも Bファクター （因子） が同様なものとなり、 周囲タンパク質原子 と同様の値を持つようにした。 HAteta複合体の場合、 示差電子密度マップにおい て 2つのみの糖環が位置一 2及び一 1 (反応生成物）で観察された。 リファインメ ントのデータを表 3に示す。 PR0CHECK (文献 28)は、すべてのモデルが異常値なしに良好な幾何学的形態を有 することを示している。ネイティブなコンドロインチン ACリァーゼ（ArthroACnat) . その水銀誘導体（ArthroACHs)、 2分間浸漬したヒアルロナンとの複合体 (ArthroAC 、 及ぴ 30秒間、 10 分間又は 10 時間浸漬した CSteteとの複合体 (ArthroACcstetra)の配位は Protein Data Bank, RCSBに登録されている。 ArthroACのァミノ酸配列
ArthroACはその天然の宿主から精製されたが、このタンパク質をコードする遺 伝子はクローニングされていない。 この酵素が広く商業的に利用されているにも かかわらず、アミノ酸配列は決定されていなかったのである。幸いなことに、 1. 3 オングストロームの解像度で計算された電子密度マップの品質と、 独立して集め られたデータ群に対してリファインメントされたいくつかのモデルが利用できた ことにより、該タンパク質のほぼ全長のアミノ酸配列が十分に明確に確定された。 タンパク質主鎖原子の約 80%はプログラム RESOLVEにより自動的に構築され、 実験的に得られた電子密度マップに対して手作業でフィットすることによりタン パク質全体の 95%まで構築された。 実験的に得られたマップにおける最も強い電 子密度像は硫黄原子であると考えられ、 電子密度の形に基づきその残基の種類は システィンあるいはメチォニンとした。 硫黄原子の同定は、 実験の各段階におい て計算された変則的な電子密度マップを観察することにより確認した。 全部で 7 つのシスティンと 10のメチォニンが同定された。すべてのトリプトファン、 ヒス チジン、 フエ-ルァラニン、 チロシン及びプロリンの側鎖は、 実験で得られた電 子密度マップにおいて明確に認められた。 さらに、タンパク質内部（特に高度に秩 序づけられている ;3—シートドメイン）においては、ほぼすベての残基の側鎖が非 常に良好に決定できた（図 3 )。最初に、ァスパラギン酸 (Asp)あるいはァスパラギ ン (Asn)のどちらかの形であるものはァスパラギン酸として、 グルタミン酸 (Glu) ないしグルタミン（Gin)のどちらかの形であるものはグルタミン酸としてモデル 化した。 明瞭に観察できる CD1がなく、 ノ リン、 スレオニン、 またはイソ口イシ ンと解釈されるものは、 すべてのバリン (Val)としてモデルィヒした。
リファインメント作業の過程での各段階の情報が改善により、 配列決定を改善 することができた。 側鎖の決定には、 それぞれのリファインされた複合体につい て独立してなされた電子密度マップ 2Fo- 2Fc、 3Fo- 2Fc及ぴ Fo- Fcにおけるピーク 高の分析、 個々の原子温度ファクターの比較、 及び隣接原子間における水素結合 の可能性の分析結果を使用した。 これらの分析により、 炭素原子、 窒素原子、 酸 素原子を区別することができ、非常に高い信頼度で ArthroACの一次配列を決定す ることができた。 さらに、 いくつかの側鎖について、 部分的に占拠された別のコ ンフオメーシヨンを同定することができた。
上記リファインメントの後、高い信頼度で 730残基 (96. 8%)の特定のァミノ酸残 基を決定した。 電子密度により、 十分に解明された第一の残基の前に少なくも一 つの残基がある可能性が示されたため、 解明された第一の残基の番号を 「2」 と した。 付加的な 12残基（ァスパラギン又はァスパラギン酸、 グルタミン又はダル タミン酸）については、不確定性はあるが、これは主として水素結合形成の可能性 に基づくものである。 溶媒に暴露されるフレキシブルループに存在し、 高温ファ クタ一を有する 11残基についてのみ、 明確に同定できなかった（図 4 )。
プログラム BLAST (文献 29)を用いて、得られた ArthroACのァミノ酸配列に相同 性を有する NCBIデータベース中の配列を特定した。これらの相同性を有するタン パク質はヒアルロン酸、 キサンタン又はコンドロインチン AC リアーゼである。 ArthroACは、各種ヒアルロナン及ぴキサンタンリアーゼに対して最も高い配列同 —性（38%)を示し、 F. heparinumのコンドロインチン ACリアーゼに対してより低 い同一性 (24%)を示した。
タンパク質全体の折りたたみ
ArthroAC分子は、 全体的な α + ]3構造を有し、 二つのドメインからなる。 N末 端の αヘリックスドメインは 1 3 の α—ヘリッタスからなり、 そのうちの 1 0は SCOPデータベースの中で分類されているように、不完全な二重層の（ α / α ) 5トロ ィドを形成している（文献 30)。 トロイドの一つの側面上には長く深い溝があり、 これは活性部位と基質結合部位の位置を形成している。 Ν末端の 3つのひ一ヘリ ックスは（α /ひ） 5トロイ ドの前にあり、 一方の側に溝を収縮させている。 ArthroAC に相同性のある配列に保存されている残基はこの溝の領域に集中して いる。 C末端ドメインはほとんど全体的に 4つの 一シートに整列した ]3—スト ランドからなる。 このドメインには一つだけ短い α—ヘリッタスがある（図 5 )。 第二ドメインは二つのサブドメインに分けることができ、 第一のものは二つの大 きな /3—シートと一つの短いひ一ヘリックスを包含し、 第二のサブドメインは第 三および第四の /3—シートからなる。
ArthroACの全体的な折りたたみは F. heparinumのコンドロイチン ACリァーゼ と細菌ヒアルロン酸リアーゼのものに非常によく似ている（図 5 )。 ArthroAC と FlavoAC との間に見られる N末端における溝に突き出ている鎖の部分における相 違は、 これらの 2種の酵素の作用機序に重要な因果関係を有する（下記参照）。 利 用することができる全ての関連する構造の比較により、 C末端の シートドメ インは Ν末端の α—ヘリックスドメインよりも互いにより類似しており、 Ν末端 および C末端ドメィンの相対的な配置はタンパク質ごとにいくらか異なっている ことが示された。
Hg (水銀) 子結合による構造変化
ネィティブな ArthroACの結晶をチメ口サールを含む溶液に浸漬すると、単位胞 が c軸方向に 1. 7オングストローム（2%)変化し、結晶の回折の質がやや向上した。 ネィティブな ArthroAC タンパク質と水銀が結合したものの構造を比較すること により、チメロサールがシスティン（Cys) 405に結合することによって C末端ドメ イン中のアミノ酸残基 457から 466のループのコンフオメーシヨンに有意な構造 変化が起こることが示された（図 6 )。ネイティブな ArthroAC結晶中のこのループ は、 基質結合部位の一つの仕切り壁を提供し、 Cys405 を溶媒から隔離している。 水銀原子が Cys405に接近するためには、 このループが「オープン」 コンフオメ一 ションに変化する必要があり、 これにより基質結合部位が基質に接近できるもの となる。 トリプトファン（Trp) 462はこのループ中に存在し、 これは糖の環の一つ に重なることにより基質の結合に関与している（下記参照)。 Trp462と対称的に関 連する分子との相互作用により、 オープンコンフオメーションが安定化される。 これらの新しい相互作用は、 セルパラメーターに変化を起こし、 また結晶回折の 質をいくらか向上させる。 オープンコンフオメーシヨンは特異的な結晶コンタク トにより前記結晶において十分に特定されている力 このコンフオメーシヨンは、 溶液中で 「オープン」 状態にある前記ループに利用することができる、 可能性あ る多くのコンフオメーションの代表的な一つであると予想される。
457から 466のループがオープン状態になることにより、 基質結合部位の中心 の N末端 α _ヘリックスドメイン中の三残基、 すなわちヒスチジン（His) 230、 了 ルギニン (Arg) 293、 グルタミン酸 (Glu) 404が再配置される（図 6 )。 クローズコン フオメ一ションにおいては、 Arg293は Glu404および Glu409と塩ブリッジを形成 し（それぞれ一つの水素結合）、 His230は Glu404と水素結合する。 Trp462の側鎖 は近傍にパックされており、 前記アルギニンのグァニジニゥム基から 4オングス トローム未満の距離しか離れていない。 457から 466のループのオープンコンフ オメーションにおいては、 Trp462の側鎖は溝から外に出て Arg293と His230の側 鎖が先に Trp462が占拠していた空間に侵入する。 Glu404の側鎖は Arg293ととも に移動して二つの水素結合で塩ブリッジを形成し、 一方 His230と Glu404との水 素結合ならびに Arg293と Glu409との塩プリッジは存在しなくなる。
基質結合部位
ネィティブな ArthroACおよび水銀と結合した ArthroACの構造により、 457か ら 466のループのオープンおよびクローズが、 結晶中で容易に起こることが示さ れた。 従ってこれらの結晶により、 X線回折で酵素とその基質の相互作用を研究 するユニークな機会が与えられることとなった。これを完結するために、 ArthroAC のネイティブ結晶を基質であるコンドロインチン一 4一硫酸四糖とともに 30秒 間から 10時間の種々の時間浸漬した（表 2および 3 )。各浸漬の後、結晶を瞬間凍 結して回折データを収集した（解像度は 1. 25〜1. 6オングストローム、 表 3 )。 ヒ アルロナン四糖も、 浸漬時間 2分間にして基質として使用し、 1. 9 オングスト口 ームの解像度で回折データを収集した。構造はそれぞれ独立してリファインした。 それぞれの場合について、 ArthroAC分子を最初にリファインし、 その後示差電子 密度マップを観察、適切に解釈し、モデルィ匕された基質/産物はリファインメント も含むものとした。 いくつかの糖の単位がリファインメントされた各モデルにお いて明瞭に認められた。 30秒間浸漬したものでも、 四糖基質全体の電子密度が明 確に認められた（図 7および表 4)。 この四糖基質はこの 30秒間浸漬の一連のデー タ中で最も明確であり、 糖環の占拠は、 一 1およぴー 2のサブサイトで 0. 7であ り、 + 1および + 2のサブサイトで 0. 6であった。 10時間の浸漬では一 1および 一 2のサブサイトにおいて糖単位が示差電子密度マップ上で明瞭に認められ、 1. 0 の占拠でリファインされた。 一方、 + 1および + 2のサブサイトの糖単位は約 0. 25の占拠を示した。 ArthroACのヒアルロナン四糖との複合体においては、一 1 および一 2のサブサイトにおける糖単位のみが電子密度中で認められ、 二糖反応 産物に対応する可能性が最も高い。 この二糖の糖環の位置および方向はコンドロ ィチン硫酸基質の対応する糖のものと同じである。 オリゴ糖は N末端ドメインの溝の狭い終端部分中に結合し、 残基 Asnl2l、 Trpl22、 Trpl23、 Argl31、 Glnl66、 Argl71、 Asnl80、 His230、 Tyr239、 Arg293、 Arg297、 Asp300、 Asn407および Trp462 と接触している（図 7 )。 これらの残基は 前記本発明のタンパク質に含まれる配列中に特定されたアミノ酸残基に対応し、 配列番号 1に示した配列においては Asnl24、 Trpl25、 Trpl26N Argl34、 Glnl69、 Argl74、 Asnl83、 His233、 Tyr242、 Arg296 Arg300、 Asn303、 Asn410およぴ Trp465 にそれぞれ対応する。 トリプトファン残基は基質結合に重要な役割を果たしてい る。 これらのうち TrP123と Trp462の二つの残基は位置 + 1と一 2とを占拠する 糖単位と重なる相互作用を示すのに対し、 TrP122 は縁のほうに向かって整列し、 + 2と + 1の単位の間をプリッジングする酸素と水素結合を形成している。 基質 の 4一 0_スルホ基はタンパク質と種々の相互作用を示す。 + 2部位で結合してい る糖の 4—0—スルホ基は Glnl66 と水素結合し、 ブリッジング水分子を介して Asp219および Gln229に結合している。一 1部位に結合している糖の 4—0—スル ホ基は Arg297のグァニジニゥム基の直上に位置し、プリッジング水分子を介して Glu409および Asn595に水素結合している。両方の 4 _0—スルホ基が基質結合に 寄与しているが、 基質認識の特異性には有意には寄与していない。
この一連の研究に用いたコンドロインチン硫酸四糖は GAGリアーゼの作用によ り得られたもので、 非還元末端に 4位と 5位の炭素原子 （C 4— C 5 ) 間の不飽 和二重結合を保持する不飽和環を有する（文献 10)。 一 2部位の糖の電子密度ば、 sp2ハイプリダイゼーシヨンを有する 5位の炭素原子（C 5 ) で、 この不飽和環に 非常によく対応している。 この四糖とタンパク質側鎖との間のすべての水素結合 の詳細なリストを表 5に示す。
触媒メカニズムの観点から最も興味深いことは、 + 1部位におけるグルクロン 酸のコンフオメーシヨンと酵素との相互作用である。 電子密度により、 この環は すべての環置換基が水平方向にある、 ねじれたポートコンフオメーシヨンを取る ことが明確に示されている。 C 5のカルボキシル基は Asnl80の側鎖に対して正確 に反対に位置し、 その 0D1および ND2は電子密度マップ上のそれらのピーク高さ により明確に区別される。 アミド ND2とカルボキシル 06Aとの距離は 2. 9オング ス ト口ームであり、 カノレポ二ノレ 0D1と力ノレボキシノレ 06Bとの距離は 2. 5オングス トロームである。 この 06Bと 0D1との間の距離が短いことは、 これらの間に低パ リァ水素結合が存在することを示し（文献 31)、そしてこれはダルク口ン酸のカル ポキシル基がプロトン化し、 中性状態となることを示している。 Asnl80の ND2か ら水素結合を受けることに加えて、 06Aは、プロトン化した His230の NE2と 2. 90 オングストロームの長い第二の水素結合を形成する。 カルボキシル基が関与して Vヽる水素結合の幾何学的形態は理想に極めて近レ、。可能性のある求核性 His230 NE 2から + 1グルクロン酸の C 5への距離はやや長く 4. 04 オングストロームであ る。 C 2、 C 3にある OH基 (水酸基）もいくつかの水素結合で強固に保持されてい る。酸素原子 2 (02)と酸素原子 3 (03)は水素結合で Asnl21の 0D1と ND2にそれぞ れ結合し、 また 02は Asn407の D2に水素結合している（図 7 b)。
その他の二つの残基も基質との非常に重要な接触を行う。 Tyr239の水酸基は + 1と一 1との糖の間をブリッジする 04酸素、 および + 1の糖環の 05の水素結合 距離内にある。 この Tyr239水酸基はダルク口ン酸の C5からわずか 3. 0オングス トロームの距離にある。 Arg293の側鎖はプリッジング 04とともに水素結合を形 成し、 Tyr239の水酸基から 2. 9オングストロームの距離にある。
ダルク口ン酸の力ルポキシル基に対応する電子密度は二つではなく三つのふく らみを示し、 三つ目のものはやや電子密度が低い。 この形態は一連のデータすベ てに認められる密度に共通している。結晶化に使用した溶液は 0. 1Mリン酸を含ん でいるので、同じ場所における部分的な占拠によりリン酸をモデル化した（表 5 )。 四糖とリン酸を除いたモデル段階で計算した変則的な Fourier mapはリン酸の位 置に小さなピークを示し、 モデルが正しいことが確認された。
電子密度マップにおける強いピークはこの四糖の近傍に見られ、 正方晶系両錘 体配位された 6個の酸素原子に囲まれており、水平方向の酸素から 2. 2〜2. 4オン グストローム、 垂直方向の酸素から 2. 7オングストロームの距離にある。 このピ ークはナトリウムイオンと推定される。 水平方向のリガンドは His230と TrP462 の力ルポニルと二つの水分子であるのに対し、 垂直方向のリガンドはスレオ-ン
Thr232の 0G1と一つの水分子である。
その他の GAGリァーゼとの比較
推定された ArthroACの配列を FlavoACおよびいくつかのヒアルロン酸リアーゼ の配列とアラインメントした（図 4 )。 興味深いことに、 アミノ酸の同一性は ArthroACとヒアル口ン酸リァーゼ間の方（最大 38. 4%)が ArthroACと FlavoACとの 間のもの（24. 7%)よりも高かった。 ArthroAC のコンドロインチン硫酸とヒアルロ ナンに対する活性を測定したところ、 この酵素はヒアル口ナンに対して高い活性 を示すことが実際に認められた。 ArthroACおよび FlavoACの構造は、 (750残基中） 468の C o; (中心炭素）原子群に対して 1. 4オングストロームの自乗平均偏差値で重 ね合わせることができる。 FalvoAC とデルマタン硫酸六糖との複合体と、 その不 活性変異体 Tyr234Pheとコンドロインチン四糖との複合体との構造を比較するこ とにより（文献 10)、 オリゴ糖の結合様式はほぼ同じであり、最も大きな違いは + 1部位のゥロン酸に限定される（図 8 )。 オリゴ糖との重要な接触を形成している 側鎖は、 その種類おょぴ位置において保存されている。 FlavoAC とデルマタン硫 酸六糖阻害剤との複合体は、 + 1のィズロン酸が水平方向の C5の酸性基とともに イス型コンフオメーシヨンを取り、 一方環に対する水酸基置換基は垂直にあるこ とを示している。 デルマタンと結合している FlavoACの構造と、 コンドロインチ ンと結合している ArthroAC における + 1糖カルボキシル基の位置はほぼ同じで あり、 これは後者中の偽垂直方向の酸性基を有するダルク口ン酸糖のねじれた'ポ ート型構造によるものである。 し力 し、 ArthroACの Asnl80と His230に対する水 素結合はほぼ完璧な幾何学的配置を有するのに対し、 FlavoAC複合体中の対応す る水素結合は理想的なものではない。 FlavoAC (Y234F)とコンドロインチン硫酸四 糖との複合体では、 グルクロン酸糖はイス型コンフオメーシヨンのままであり、 環に対するすべての置換基は水平方向にあるが、 Tyr234の水酸基が失われること により空いた空間を酸性基が占拠するように回転する（文献 10)。先に指摘したよ うに、 Y234F FlavoAC 四糖複合体は、 酵素結合部位における基質の真のコンフォ メーシヨンを示すものではない。
触媒機構
GAGリアーゼにより行われる酵素反応は、一般的な塩基による C5プロトンの引 き抜きと、その後の一般的な酸や水分子によるプリッジング 04に対するプロトン の供与並びに同時に起こる脱離基の ;8脱離により進行すると考えられる（文献 7)。 十分に特定された合成基質を使用した FlavoACの最近の動力学的分析は、 協調的 な機構 (文献 32)ではなく、 予想された段階的なものと一致している（文献 32)。 Gacesa によって系統化されたポリサッカライドリアーゼの機構についての提案 (文献 7)は、 正に荷電した基により酸性基が中和され、 平衡がエノラート互変異 体側にシフトするということを含む。 —ヘリッタスの折りたたみを有するポリ サッカライドリァーゼとは異なり、 FlavoACおよぴヒアル口ン酸リァーゼの構造 はゥロン酸の酸性基の近傍にはそのような正に荷電した基がないことを示してい る。 そのかわり、 ァスパラギンの側鎖が酸性基に対抗して水素結合していること が判明したが、 酸性基の中和の問題は未解決のままである。 本明細書に示す複合 体の構造は、 Asnl80がこの酸性基と低バリァ水素結合を形成することによりその pKaを実質的に増加させ、そのプロトン化を促進することを示唆している（文献 33、
34)。 このァスパラギンは His230により補助されるが、 水素結合ネットワークか ら判断して、これもゥロン酸のカルボキシレート基との水素結合を形成し（図 7 )、 複合体内でプロトン化される。
GAG リアーゼオリゴ糖複合体の構造的観点に基づいて、 反応に関与する一般的 な塩基おょぴ一般的な酸の実体についてのいくつかの提案がなされてきている。 Jedrzejas とその共同研究者は、 プロトンが近傍のヒスチジン残基（この場合は His230)により引き抜かれ、 別のプロトンがチロシン（この場合は Tyr239)により 04に供与されると提案している（文献 11、 12)。彼らはそれらの構造におけるヒス チジン NE1および C5の間の距離によって、ヒスチジンの一般的な塩基としての提 案された役割を支持している。本発明者らは、彼らのデータを慎重に再分析した。 ヒスチジンの役割についての彼らの最初の提案（文献 11)はその後の論文（文献
35)によって強化され、 これは「一」部位のみが占拠されている複合体の構造に基 づくものである。 + 1糖がモデル化され、 約 4オングストロームの NE1— C5距離 は実験的な値ではない。 この距離は一般的なファンデルワールス距離に対応し、 提案されたヒスチジンのプロトンを引き抜く役割のためには長すぎるようである。 最近の論文 (文献 12)において彼らは、野生型ヒアル口ニダーゼの結晶を六糖の 10 〜50mM溶液中に数日間浸漬した際、結晶中に基質が存在すると主張している。 基 質原子のほとんどについて引用される温度ファクタ一は 100A2であり、 これはリ ファインメントプログラムの限界である。 基質についての電子密度は彼らの論文 に示されていないため、 本発明者らは、 彼らの寄託した構造ファクターおよび座 標に基づいて示差マップを計算した (基質を除く）。 比較的弱い散乱された密度が 観察されたが、 確実にオリゴ糖を配置することはできなかった。 そこで、 この密 度は非常に低度の占拠を示す産物の混合物に対応し、 確実にモデルィヒすることは できないと結論した。 しかし、 彼らのモデルに従うとしても、 ヒスチジン NE1お よび C5間の距離は 6オングストロームを越えている。従って本発明者らは、彼ら の研究においては提案されたヒスチジンの役割を支持する構造的証拠はないと結 論した。 さらに、 S. pneumoniaeヒアルロン酸リアーゼの His399Ala変異体はな お野生型酵素活性の 6%の有意な活性を示す (文献 11)。
前述のように、 ArthroACはヒアルロナンに対して有意な活性を示し、 この酵素 と HAtetaとの複合体の構造は 2分という短時間の浸漬の後でもサブサイトー 1お よび一 2 における 2つの糖単位のみの存在を示し、 おそらくこれは反応産物であ る。 これはコンドロイチン硫酸四糖についての同様の浸漬時間の後のサブサイト + 1および + 2の実質的な占拠と対照的であり、 ArthroACはコンドロイチン硫酸 に対してよりもヒアルロナンに対してより活性が高いことを示唆している。 この 結果は、 ArthroACが、 FlavoACに対してよりもヒアルロン酸リアーゼに対してよ り高い配列類似^を有することとよく相関している（図 4 )。 これらの知見並びに ArthroAC およびヒアルロン酸リアーゼの触媒として重要な残基からみて、 Jedrzejas らにより記載されたような（文献 12)、 結晶化された野生型 S. pneumoniae ヒアル口ン酸リアーゼの活性部位に結合したヒアルロナン基質は数 日間そのままであるという可能 はむしろ低！/、。
Huang らは、 チロシンが最初に一般的な塩基として機能し、 のちに一般的な酸 として機能するという説に与する三つの可能性のある機構的な筋書きを考案した (文献 10)。構造的に関係はあるが、配列上は似ていないアルギン酸リアーゼでは、 中心的な役割はチロシンに与えられている（Mikarai et al. 2001)。 Rye および Withersによる動力学的測定 (文献 32)も、 触媒残基としてのチロシンを強く支持 している。
ArthroAC と基質であるコンドロインチン一 4一硫酸四糖の複合体の構造は Tyr239の側鎖の重要な役割を非常に強く支持している（図 9 )。複合体の高解像構 造は、 基質の結合が、 + 1部位のグルクロン酸糖環のコンフオメーシヨンがイス 型からねじれたポート型に変化することに関連していることを明らかに示してい る。 そのような糖環の高エネルギーコンフオメーシヨンへの変化は特別なことで はなく、 その他の糖鎖プロセッシング酵素に見られる（文献 36〜41)。観察された ねじれたポートコンフオメーシヨンでは、酸 I"生基は擬垂直方向にあり、 Aspl80の 側鎖の面に対向し、プロトン化された His230の面にある （図 7 b)。さらに、 AsP180 に対するグルクロン酸酸性基の配置および Asnl80 のカルボニル酸素までの 2. 5 オングストロームという非常に短い距離は、酸性基がプロトン化しており、 Asnl80 と低バリア水素結合を形成していることを示唆している。 この複合体において、 Tyr239はブリッジング 04と水素結合を形成しており、 その水酸基はダルク口ン 酸の C5原子から 3. 0オングストロームしか離れていない。 Arg293は、 Tyr239の 水酸基とブリッジング 04とへの水素結合を介して重要な貢献をしている。これに 対して、 他方の可能性ある一般的な塩基である His230はプロトン化されており、 その NEと C5原子の距離 (3. 9オングストローム）は酸をベースとする触媒作用に おいて機能するにはやや長い。
ArthroAC のオープンおよびクローズコンフオメーシヨンを比較することによ り、 触媒反応サイクルの間の事象の進行を再構築するための原理が得られる。 基 質がない場合、 457〜466のループは可動であり、 Trp462は結合部位から離れたと ころにある。 His230の側鎖は溶媒に完全に暴露されており、規則正しい水分子に のみ水素結合を形成している。 Arg293と Glu404の側鎖はほとんど溶媒にさらさ れた形で塩プリッジを形成している。 このコンフオメーション状態において Tyr239は水分子に対して 1つだけ水素結合を形成する。基質が結合することで活 性部位の近傍で残基の再配置が起こる。 Trp462は + 2部位の糖環に重なって基質 に向かって回転する。これに伴つて Arg293および Glu404は Tyr239に向かって動 き、 Arg293は Glu409との二つめの塩ブリッジに関与し、 Tyr239と一 1および + 1部位間にプリッジングする 04原子でに対して水素結合を形成する。
結合部位にフィットするために、 +1部位の糖環はより高いエネルギーのボートコ ンフオメーシヨンをとらなければならず、 これは新たにプロトン化されたグノレコ ン酸の酸性基と Asnl80とプロトン化された His230との間に強い水素結合が形成 されることで代償される。 Tyr239が正に荷電した Arg293と His230とに近接して いること（水素結合）によりこのチロシンの pKaが実質的に低下している。 本発明 者らは、 Arg293および His230がこのチロシンを活性化させる役割を果たし、 そ の一般的な塩基としての役割を開始させると推定している。 その後、 Tyr239 力 3オングストローム未満しか離れていないグルクロン酸の C5からプロトンを引き 抜く。 本発明者らはこのプロトンがその後プリッジング 04に運ばれ (一般的な酸 の役割）、それに伴って C4一 04結合の開裂と C4— C5二重結合が生じるものと提案 する。 + 1と +2部位における産物は、 457〜466のループのオープンに伴い最初 に離脱するものである。 基質の結合と放出は、 先端に Asnl21および Asn407を有 する二つの別のループの動きにより助けられ、 一 2および一 1部位への接近が促 進されると考えられる。
FlavoAC とヒアル口ン酸リアーゼにおいて上述した作用機構に重要なすべての 残基が保存されていることは、 これがこの種の酵素群にとって共通の機構である ことを強く示唆している。 本発明者らは以前に、 FlavoAC のエンド型作用を説明 するのに必要であると考えたこの酵素の基質結合部位を取り卷くループのオーブ ンを仮定した（文献 10)。 本明細書に記載した ArthroACの構造はそのようなコン フオメ一ションのフレキシビリティの直接な証拠を提供するものである。
ェキソ型およびェンド型作用機序の原理
ArthroACの酵素学的なキャラクタリゼーションにより、この酵素がェキソリア —ゼとして作用し、グリコサミノグリカン基質から二糖を切り出し、一方 FlavoAC はエンドリアーゼとして作用することが示されている（文献 42、 43)。 これらの二 つの酵素の構造の比較により、作用機序においてみられる相違の原理が得られた。 •FlavoACに対して、 ArthroACは N末端ドメィンに約 15残基 (Arg20〜Ser35)及び 25残基（Thr340〜Gly363)の 2つのィンサートを有する。 これらの 2つの部分が該 ドメインの Nおよび C末端の近傍に αヘリックスを含有するループを形成し、 そ れらは一緒に（ひ / α ) 5トロイダル N末端ドメィンの側に沿ってある溝の大部分を 閉鎖する。 これらのループは、 開放した溝を深い穴に変化させる壁を形成し、 伸 長されたオリゴ糖の結合を排除する。 この穴のサイズにより非還元末端への糖鎖 の結合が制限され、約 4個の糖（一 2〜一 4) を収容でき（図 1 0 a)、 これはこの酵 素のェキソ型活^~生に相関している。 より長い糖鎖が結合するためには、 これらの 2つのループの実質的な再配置が必要であり、 明らかに頻繁に起こるものではな い。 FlavoACの開放された溝はそのような制限を課すことはなく、 長い糖鎖の途 中部分に結合することができる（図 1 0 b)。 産業上の利用可能性
本発明により提供されるコンドロイチン A Cリアーゼ結晶は、 これまでに知ら れていなかったユエークな結晶学的特 ί敷を有し、 極めて高純度のコンドロイチン A Cリアーゼの結晶である。 従って、 各種分析用試薬、 医薬等としてのコンドロ ィチンの製造の手段などとして極めて有用である。
また本発明によりァルスロパクター ·ァウレセンス由来のコンドロイチン A C リァーゼの一次構造が決定され、 ェクソ型コンドロイチナーゼであることが判明 した。 これにより、 近年 GA Gの分子量特異的な生理活性が注目されていること を背景として、 本発明のコンドロイチン A Cリアーゼの結晶は、 特定の分子量を 有するコンドロイチン硫酸やコンドロイチンの製造等に有用であることが期待さ れる。
さらに、 コンドロイチン A Cリア一ゼの基質結合部位を構成するアミノ酸残基 が解明され、 それらを有するタンパク質が提供される。 これにより該タンパク質 の特定の分子量を有するコンドロイチン硫酸やコンドロイチンの製造における有 用性や医薬そのものとしての有用性が期待される。
(以下余白）
[表 1 ]
MADデータ
Hg -ピーク ンフ シヨン Hg-リモート ネィティブ 波長 1.005133 1.009078 0.997068 0.950000 解像度 40-1.3 40-1.3 50-1.4 50-1.3
(Last shell) (1.35-1.30) (1.35-1.30) (1.45-1.40) (1.35-1.30)
0.066 0.067 0.067 0.086
(Last shell) (0.274) (0.325) (0.221) (0.540) 完全度，％ 98.4 98.8 99.0 96.4
(Last shell) (85.0) (89.0) (90.7) (93.4) 反射数 876240 884015 721975 1294307 特有の反射 182880 183424 147941 178066
種々の基質浸漬時間についてのデータ 基質
浸漬時間 30秒 2分 10分 35分 2時間 4時間 10時間 2分
0.9798 0.9798 0.9798 0.9798 0.9798 0.9798 0.9798 0.9798 波長
解像度 50-1.41 50-1.6 50-1.5 50-1.35 50-1.3 50-1.35 50-1.25 50-1.9
(Last shell) (1.46-1.41) (1.66-1.6) (1.55-1.5) (1.4-1.35) (1.35-1.3) (1.4-1.35) (1.29-1.25) (1.97-1.9) lv« m 0.081 0.077 0.077 0.055 0.057 0.059 0.058 0.075
(Last shell) (0.794) (0.739) (0.483) (0.567) (0,517) (0.530) (0.430) (0.652) 完全度， ％ 99.9 100 99.9 98.3 96.5 96.1 90.8 100
(Last shell) (99.9) (100) (99.9) (96.3) (89.1) (93.5) (56.4) (99.9) 反射数 706542 501855 460480 452905 1338199 610947 939404 235444
146507 100158 120769 162044 178855 158853 188554
特有の反射 60174
Figure imgf000031_0001
[¾ 4 ]
種々の浸漬時間についての- 2, -1 +1 +2の糖の占拠 浸漬時間 部位占拠
-2 -1 +1 +2 リン酸 ネィティブ 1.0
30秒 0.7 0.7 0.6 0.6 0.4
2分 0.7 0.7 0.5 0.5 0.5
10分 0.7 0.7 0.4 0.4 0.6
35分 0.7 0.7 0.4 0.4 0.6
2時間 1.0 1.0 0.4 0.4 0.6
4時間 1.0 1.0 0.3 0.3 0.7
10時間 1.0 1.0 0.25 0.25 0.7
HA 2分 1.0 1.0 - - 1.0
複合体中の基質およびタンパク質間の水素結合 糖番号 原子 タンパク原子 距離
809 02 OD2Asp300 2.86
02 HlArg297 3.09
03 ODlAsp300 3.00
06A NHlArgl31 3.03
06B NH2Argl31 2.85
810 07 H2Arg297 2.93
07 NHlArg297 3.01
S043 NEArg297 3.17
S044 H2Arg297 3.66
811 02 NDlAsn407 3.16
02 0DlAsnl21 2.66
03 ND2Asnl21 2.83
04 NH2Arg293 2.88
04 OHTyr239 2.90
C5 OHTyr239 2.89
06A NE2His230 2.75
06A ND2Asnl80 2.88
06B ODlAsnl80 2.51
812 01 NH2Argl71 3.05
03 NElTipl22 3.37
07 NHlArgl71 2.78
S041 E2His230 2.75
S043 NE2Glnl66 2.42 参考文献
1. Iozzo, R. V. (1998) Annu.Rev. Biochem. 67, 609-652
2. Lidholt, K. (1997) BiochemSoc. Trans. 25， 866-870
3. Prydz, K. and Dalen, K. T. (2000) J.CellSci. 113 Pt 2， 193-205
4. Scott, J. E. (1995) J.Anat. 187, 259-269
5. Emst, S.， Langer, R.， Cooney, C. L.， and Sasisekharan, R. (1995) Crit. Rev. Biochem.
Mol. Biol 30, 387-444
6. McCarter, J. D. and Withers, S. G. (1994) Curr.Opin.Struct.Biol. 4， 885-892
7. Gacesa, P. FEB S Lett. 212, 199-202
8. Sutherland, I. W. (1995) FEMS Microbiol.Rev. 16， 323-347
9. Scavetta, R. D.， Herron, S. R.， Hotchkiss, A. T.， Kita, N., Keen, N. T.， Benen, J. A.，
Kester, H. C.， Visser, J.， and Jurnak, F. (1999) Plant Cell 11， 1081-1092
10. Huang, W.， Boju, L.， Tkalec, L., Su, H.， Yang, H. O., Gunay, N. S.， Linhardt, R. J., Kim, Y. S.， Matte, A., and Cygler, M. (2001) Biochemistry 40， 2359-2372
11. Li, S., Kelly, S. J, Lamani, E.， Ferraroni, M.， and Jedrzejas, M. J. (2000) EMBO J. 19,
1228-1240
12. Jedrzejas, M. J., Mello, L. V., De Groot, B. L.， and Li, S. (2002) J.Biol.Chem.
13. Linhardt, R. J" Galliher, P. M.， and Cooney, C. L. (1986) Appl.Biochem.Biotechnol.
12, 135-176
14, Tkalec, A. L.， Fink, D.， Blain, R, Zhang-Sun, G., Laliberte, M.， Bennett, D. C, Gu, K., Zimmermann, J. J" and Su, H. (1000) ApplEnvironMicrobiol. 66， 29-35
15. Pojasek, K., Shriver, Z.， Kiley, P., Venkataraman, G., and Sasisekharan, R. (2001) Biochem.Biovhvs.Res. Commun 286, 343-351
16. Fethiere, J., Eggimann, B.， and Cygler, M. (1999) JMolBiol 288， 635-647
17. Li, S. and Jedrzejas, M. J. (2001) J.Biol. Chem. 276, 41407-41416
18. Hiyama, K. and Okada, S. (1977) J.Biochem. (Tokyo) 82, 429-436
19. Hiyama, K. and Okada, S. (1975) J.Biochem. (Tokyo) 78， 1183-1190
20. Hiyama, K. and Okada, S. (1975) J.Biol.Chem. 250， 1824-1828
21. Davies, G. J.， Wilson, K. S.， and Henrissat, B. (1997) Biochem. J. 321 ( Pt 2)， 557-559 22. Otwinowski, Z. and Minor, W. ( 1997) Methods Enzymol. 276, 307-326
23. Terwilliger, T. C. and Berendzen, J. (1999) Acta Crystallogr. D55, 849-861
24. Terwilliger, T. C. (2000) Acta Crystallogr. D56， 965-972
25. Jones, T. A" Zhou, J. Y" Cowan, S. W" and Kjeldgaard, M. (1991) Acta Crystallogr.
A47, 110-119
26. Briinger, A. T.， Adams, P. D.， Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P.,
Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J. S.， Kuszewski, I, Nilges, M.， Pannu, N. S" Read, R. I, Rice, L. M.， Simonson, T.， and Warren, G. L. (1998) Acta Crystallogr. D54, 905-921
27. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., and Dodson, E. J. (1997) Acta Crystallogr. D53,
240-255
28. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W., Moss, D. S" and Thornton, J. M. (1993) J.
Appl. Crystallogr. 26, 283-291
29. Altschul, S. F., Madden, T. L.， Schaffer, A. A., Zhang, I, Zhang, Z.， Miller, W.， and Lipman, D. J. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402
30. Lo, C. L.， Ailey, B.， Hubbard, T. J" Brenner, S. R, Murzin, A. G" and Chothia, C.
(2000) Nucleic Acids Res. 28， 257-259
31. Cleland, W. W.， Frey, P. A., and Gerlt, J. A. (1998) J.Biol. Chem. 273， 25529-25532
32. Rye, C. S. and Withers, S. G. (2002) J.Am. Chem. Soc. 124, 9756-9767
33. Cleland, W. W. (2000) Arch.Biochem.Biophys., 382， 1-5
34. Gerlt, J. A. and Gassman, P. G. {199 ) Biochemistry 32, 11943-11952
35. Ponnuraj, K. and Jedrzejas, M. J. (2000) JMol.Biol. 299, 885-895
36. Sidhu, G., Withers, S, G.， Nguyen, N. T.， Mcintosh, L. P., Ziser, L.， and Brayer, G. D.
(1999) Biochemistry 3S, 5346-5354
37. White, A. and Rose, D. R. (1997) Curr.Opin.Struct.Biol 7, 645-651
38. Sulzenbacher, G.， Driguez, H" Henrissat, B.， Schulein, M" and Davies, G. J. (1996) Biochemistry 35, 15280-15287
39. Kuroki, R.， Weaver, L. H" and Matthews, B. W. (1993) Science 262, 2030-2033
40. Strynadka, N. C. and James, M. N. (1991) JMol.Biol 220, 401-424 41. Strynadka, N. C. and James, M. N. (1996) S 75， 185-222
42. Jandik, K. A" Gu, K., and Linhardt, R. J. (1994) Glycohiology 4， 289-296
43. Capila, I, Wu, Y.， Rethwisch, D. W., Matte, A., Cygler, M., and Linhardt, R. J.
(2002) Biochim.Biophys.Acta 1597, 260-270
44. Kraulis, P. J. (1991) J.Appl. Crystallogr. 24, 946-950
45. Merritt, E. A. and Bacon, D. J. (1997) Methods Enzymol. 277， 505-524
46. Nicholls, A" Sharp, K. A" and Honig, B. (1991) Proteins: Str.Func.Gen. 11, 281-296

Claims

請求の範囲
1 . 単斜晶系空間群 P2に属し、 単位格子定数 a=57. 6A、 b=85. 5A、 c=80. 5A、 β =106. 9° を実質的に有し、 非対称単位に一つの分子を有するァルスロパクター 属細菌由来のコンドロイチン A Cリアーゼの結晶。
2 . 前記ァルスロパクター属細菌がァルスロパクターァウレセンスである、 請 求項 1に記載のコンドロイチン A Cリアーゼの結晶。
3 . コン ドロイチン A C リ アーゼの活性を有し、 アミ ノ酸配列 Asn-Trp-Trp- (Xaa) 7-Arg- (Xaa) 34_Gln_ (Xaa) 4 - Arg- (Xaa) 8- Asn- (Xaa) 49- His - (Xaa; 8 -Tyr- (Xaa) 53- Arg - (Xaa) 3 - Arg- (Xaa) 2_ (Asnまたは Asp) - (Xaa) 106- Asn- (Xaa) 54-Trp
(Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、 数字は残基数を示す） を含むタンパク質。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIYAMA, K. ET AL.: "Crystallization and some properties of chondroitinase from Arthrobacter aurescens", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 250, no. 5, 1975, pages 1824 - 1828, XP002982969 *
POJASEK, K. ET AL.: "Biochemical characterzation of the chondroitinase B active site", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 34, 2002, pages 31179 - 31186, XP002978617 *
See also references of EP1634891A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480182A (zh) * 2022-01-10 2022-05-13 中国农业大学 一种假节杆菌pl-410及其在产软骨素裂解酶中的应用
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