WO2004101822A2 - Utilisation des loci bage (b melanoma antigens) comme marqueurs tumoraux - Google Patents

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Christoph Grunau
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the subject of the present invention is the use of BAGE loci (B melanoma antigens), and more particularly fragments of these loci, for implementing methods for diagnosing cancers.
  • Radiological examination It makes it possible to identify a tumor mass, but often requires additional examination of the cells in order to check whether the neoformation is neoplastic.
  • the expression of a gene can also have prognostic and / or diagnostic value.
  • proteins or genes used as tumor markers are specific for one or a few tumors.
  • proteins and RNA are less stable than the DNA which is used in the method of the invention.
  • the BAGE1 gene (B melanoma antigens 1) was isolated because it codes for a tumor antigen (Bo ⁇ l et al., 1995). Recently, the inventors have identified and characterized new members of the BAGE gene family (Ruault et al., 2002). Like BAGE1, the new BAGE genes are expressed only in cancer cells and in the testis, while they are silent in other normal tissues. The proteins and / or peptides encoded by these genes could be used to induce a specific cellular response (cytolytic T lymphocytes) against tumors which present these antigens on the cell surface.
  • the main object of the present invention is therefore the use of BAGE loci as tumor markers for the diagnosis of cancer.
  • the new method for the diagnosis of tumors of the present invention is based on the analysis of the hypomethylation of the BAGE loci.
  • the analysis is carried out on all of the BAGE loci, namely on the functional genes and on the truncated genes.
  • the procedure is new, the biological material used (DNA) is very stable and the analysis method can be automated. All the tumors analyzed by the inventors exhibited hypomethylation of the BAGE loci.
  • the subject of the present invention is a method of in vitro diagnosis of cancers in humans or animals, characterized in that it is carried out by: - extraction of the total DNA contained in the cells of the biological sample taken from analyze,
  • the determination of the methylation rate in position 5 of the p rimidine ring of the deoxycytidines of the CpG doublets in the above-mentioned BAGE loci is carried out in as many BAGE loci, or of the aforementioned fragments thereof, among the loci as possible.
  • BAGE represented by the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, and other BAGE loci likely to be present in the sample studied and corresponding to the aforementioned related sequences.
  • the determination of the methylation rate in the aforementioned BAGE loci is carried out after amplification of these BAGE loci using suitable pairs of primers chosen so that they make it possible to amplify the greatest possible number of BAGE loci, or of aforementioned fragments thereof, among the BAGE loci represented by the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, and other BAGE loci likely to be present in the sample studied and corresponding to the aforementioned related sequences.
  • the above-mentioned pairs of primers make it possible to amplify at least approximately 10 of the sequences SEQ LD NO: 1 to 13 or of the abovementioned fragments of these sequences, and preferably at least 12 of these sequences, or all of these 13 sequences, and, if appropriate, other BAGE loci likely to be present in the sample studied.
  • the present invention also relates to a diagnostic method as defined above, characterized in that the determination of the methylation rate of the deoxycytidines of the CpG doublets comprises the following steps:
  • amplification step using pairs of suitable primers allowing the amplification, in particular according to the PCR (Polymerase Chain Reaction) technique, of the number of copies of the BAGE loci present in the total DNA extract abovementioned, or of fragments of these loci, as defined above, and in which the initially unmethylated deoxycytidines were transformed into deoxyuridines during the preceding stage of treatment with sodium bisulfite, these desoxyuridines corresponding to deoxythymidines, and the initially methylated deoxycytidines corresponding to the deoxycytidines in the copies of sequences thus obtained, a step for measuring the level of deoxycytidines present in the above-mentioned amplified sequences, and corresponding to the level of methylated deoxycytidines initially present in the above-mentioned BAGE loci, or in the fragments of these sequences, in the total DNA extracted from the biological sample .
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the present invention relates more particularly to a diagnostic method as defined above, characterized in that it comprises two stages of amplification of the number of copies of all the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, in which the deoxycytidines initially unmethylated are transformed into deoxyuridines then into deoxythymidines, and the initially methylated deoxycytidines are transformed into unmethylated deoxycytidines, the first amplification step being carried out using the following pair of primers: primer 5 ': tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ID NO : 14) primer 3 ': acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO: 15) and the second amplification step being carried out using the following pair of primers: primer 5': gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO: 16) primer 3 ' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID
  • the present invention also relates to a diagnostic method as defined above, characterized in that the measurement of the level of deoxycytidines present in the amplified sequences, and corresponding to the level of methylated deoxycytidines initially present in the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, or in the related sequences or the fragments of these sequences as defined above, in the total DNA extracted from the biological sample, is carried out according to one of the following methods:
  • SssI - Or by treatment of the amplified sequences with a methylation reagent such as M. SssI, which therefore allows the methylation of the deoxycytidines present in the CpG doublets of the amplified sequences and corresponding to the methylated deoxycytidines initially present in the sequences SEQ ID NO: 1 to 13 , or the aforementioned related sequences or fragments, in the total DNA extracted from the biological sample, followed by the quantification of said deoxycytidines thus methylated using anti-methyldesoxycytidine antibodies labeled, or capable of being recognized by a reagent marked, and comparison with a standard curve representing the results obtained by carrying out the same experiment using anti-methyldesoxycytidine antibodies in the presence of the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, or the above-mentioned related sequences or fragments, methylated from 0 100%> using a methylation reagent such as M. SssI.
  • the present invention more particularly relates to a diagnostic method as described above, characterized in that the measurement of the level of deoxycytidines present in the amplified sequences, by the method of digestion of the amplified sequences using restriction enzymes, is carried out using:
  • enzymes cutting the amplified sequences when these contain a deoxycytidine in the reference CpG doublets, and therefore a deoxycitidine initially methylated in these same doublets in the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, such as the enzymes chosen from following:. the Mbol enzyme recognizing the restriction sites located at the positions:
  • the present invention also relates to a diagnostic method as defined above, characterized in that the determination of the methylation rate of the deoxycytidines of the CpG doublets comprises the following steps: a step of processing the total DNA extracted from the biological sample with an enzyme sensitive to methylation, such as the Hhal enzyme, which makes it possible to cut the DNA sequence when it does not contain, in the restriction site of said enzyme, a methylated deoxycytidine in the reference CpG doublets, - an amplification step, in particular according to the PCR technique, using two pairs of appropriate primers, making it possible to amplify fragments of the loci BAGE present in the abovementioned total DNA extract, as defined above, the first pair of primers allowing the amplification of a fragment corresponding to a control region of BAGE loci not containing the restriction site of said enzyme, and the second pair of primers allowing the amplification of a fragment corresponding to a region of the BAGE loci containing said restriction site, this step
  • a step for measuring the percentage of methylation of the BAGE loci by comparison of the quantity of amplified sequences containing said restriction site, with the quantity of amplified sequences containing only the control region, an amount of amplified sequences containing said lower restriction site the amount of amplified sequences containing only the control region being correlable to the diagnosis of cancer in humans or animals.
  • this comparison can be made by measuring, after migration of the sequences thus amplified on agarose gel, the signal intensities of the bands corresponding to the different amplified sequences, followed by a step of calculating the ratio between the signal intensity of the bands corresponding to the amplified sequences containing only the control region and the signal intensity of the bands corresponding to the amplified sequences containing the region of the BAGE loci containing said restriction site, and the determination of the percentage of methylation of the BAGE loci.
  • the invention more particularly has a diagnostic method as defined above, characterized in that:
  • the pair of primers allowing the amplification of a fragment corresponding to a control region of the BAGE loci represented by the sequences SEQ ID NO: 1 to 12, not containing the restriction site of the enzyme Hhal is as follows : 5 'primer: aggagaaggtgggga (SEQ ID NO: 18) 3' primer: acctaccctgccagctttc (SEQ ID NO: 19) said primer pair allowing the amplification of the SEQ ID NO 21 fragment from the sequence SEQ LD NO: 1, of the SEQ ID NO 22 fragment from the sequence SEQ ED NO: 2, of the SEQ LD NO 23 fragment from the sequence SEQ ID NO: 3, of the SEQ ID NO 24 fragment from the sequence SEQ ID NO: 4, of the fragment SEQ LD NO 25 from the sequence SEQ ID NO: 5, from the fragment SEQ ID NO 26 from the sequence SEQ ID NO: 6, from the fragment SEQ ID NO 27 from the sequence SEQ ID NO: 7, from the fragment SEQ ID NO 28 from the sequence SEQ ID NO
  • primer 5 ' aggagaaggtgggga (SEQ ID NO: 18) 3 'primer: ccttaggcagtgtagacgctg (SEQ LD NO: 20) said primer pair allowing the amplification of the fragment SEQ ID NO 33 from the sequence SEQ ID NO: 1, of the fragment SEQ ID NO 34 from the sequence SEQ ID NO: 2, of the fragment SEQ LD NO 35 originating from the sequence SEQ LD NO: 3, of the fragment SEQ ID NO 36 originating from the sequence SEQ ID NO: 4, of the fragment SEQ ID NO 37 originating from the sequence SEQ ID NO: 5, from the SEQ ID NO 38 fragment from the sequence SEQ ID NO: 6, from the SEQ ID NO 39 fragment from the sequence SEQ ID NO: 7, from the SEQ ID NO 40 fragment from the sequence SEQ ID NO
  • the subject of the invention is also the fragments of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 to 13 corresponding to the sequences SEQ ED NO: 21 to 44 mentioned above.
  • a more particular subject of the present invention is the nucleotide sequences corresponding to the sequences SEQ LD NO: 1 to 13, or fragments of these sequences as defined above, in which the deoxycytidines which do not belong to a CpG doublet are replaced by deoxyuridines or desoxythymidines, and, where appropriate, at least one of the deoxycytidines of the CpG doublets is replaced by a deoxyuridine or a deoxythymidine.
  • a subject of the invention is also the nucleotide sequences as defined above, characterized in that none of the deoxycytidines of the CpG doublets is methylated, or in that at least one up to all of the deoxycytidines of the doublets CpG is methylated.
  • the invention also relates to the pairs of primers for the amplification of the nucleotide sequences as defined above, chosen from the following: primer 5 ': tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ LD NO: 14) primer 3': acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) primer 5 ': gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO: 16) primer 3': ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID NO: 17) primer 5 ': aggagaaggtgggga (SEQ ID NO: 18) primer 3': acctaccctgccagctttc (SEQ ID NO: 16) ) 5 'primer: aggagaaggtgggga (SEQ LD NO: 18) 3' primer: ccttaggcagtgtagacgctg (SEQ LD
  • a subject of the invention is also the use of the nucleotide sequences as defined above, or of the above-mentioned pairs of primers, for the implementation of an in vitro diagnostic method as described above.
  • the invention also relates to a kit or kit for the implementation of an in vitro diagnostic method as described above, characterized in that it comprises at least one pair of primers mentioned above, and where appropriate :
  • a subject of the invention is also the use of the BAGE loci corresponding to the sequences SEQ ID NO: 1 to 13, or corresponding to sequences related to the sequences SEQ ID NO: 1 to 13 mentioned above, or to fragments of these loci as defined above, such as the fragments SEQ ED NO: 21 to 44, as tumor markers within the framework of the implementation of a method of in vitro diagnosis of cancers in humans, in particular a method chosen from those defined above.
  • the total DNA was extracted from tissue using standard techniques and subjected to a chemical reaction with sodium bisulfite which converts cytosines to thymines, while leaving the 5-methylcytosines intact.
  • the conversion reaction with sodium bisulfite was carried out as described by Frommer et al. (1992). Briefly, 500 ng of DNA were denatured in 111 ⁇ l 0.3 M NaOH (in the presence of 10 ⁇ g yeast mRNA) at 42 ° C for 20 minutes.
  • the inventors From the DNA treated with sodium bisulfite, the inventors amplified by PCR a DNA fragment of approximately 500 bp located in the 5 'region of the BAGE loci.
  • the PCR amplification was carried out with two consecutive reactions (Fig.l). Double PCR makes it possible to produce more DNA. Since the BAGE sequences are almost identical (95-99% nucleic sequence identity), it is impossible to specifically amplify a single locus. The primers used therefore amplify several BAGE loci at the same time.
  • the primers used for the first reaction were BAGE.
  • BS + 32f (TttagaggaTTaggagaagggggagT) and BAGE.
  • BS + 1540r AcctAccaAttAAcattAttActAacattA
  • the primers used for the second amplification were BAGE.
  • BS + 99f gatggtggtggTaaTagagatggT
  • BS + 1371r ccttaAAcaAtAtaAaccctAataA.
  • the nucleotides resulting from the deamination of non-methylated cytosines are in capital letters.
  • the PCR reaction was carried out in 50 ⁇ l with 25 ng of genomic DNA as a template (the loss of DNA is not considered during the treatment with bisulfite), 50 pmol of each primer, 2.5 U Taq- polymerase ( Promega), the standard buffer supplied with the enzyme, 1.5 mM MgC12 and 200 ⁇ M of each dNTP.
  • 2.5 ⁇ l of the first PCR mixture was used as a matrix for the second PCR.
  • Incubation times and temperatures were 94 ° C 2 minutes followed by 5 cycles (94 ° C 1 minute, 55 ° C 2 minutes, 72 ° C 3 minutes), 25 cycles (94 ° C 0.5 minutes, 55 ° C 2 minutes, 72 ° C 1.5 minutes) and 72 ° C 10 minutes.
  • Unmethylated cytosines, converted to uracils by sodium bisulfite, are transformed into thymines by the PCR reaction. The 5-methylcytosines remain in the form of cytosines.
  • cytosines and 5-methyl cytosines present in the amplified DNA fragments the inventors used two different methods and a third is being studied.
  • the PCR product (obtained according to the procedure described in B) was digested with 2 restriction enzymes (Mbol and HphI) and analyzed by electrophoresis (Fig. 2). The PCR products are purified. The DNA concentration was measured with a spectrophotometer (Eppendorf BioPhotometer). The size and quality of the PCR products were verified by separation on a 2% agarose gel in 0.5x TBE (Tris Borate EDTA) and visualized with ethidium bromide. 700 ng of PCR product were incubated with 2.5 U of Mbol (NEB) or HphI (Fermentas) restriction enzymes for 2 hours at 37 ° C in 20 ⁇ l.
  • the COBRA method makes it possible to measure the methylation of all the BAGE loci and makes it possible to analyze the methylation of a single cytosine by restriction enzyme.
  • These cytosines have been defined beforehand (thanks to the sequencing and cloning method) as infbr atives for the methylation of the region analyzed.
  • PCR product obtained according to the procedure described in B
  • an enzyme M SSSI methyltransferase which methylates the cytosines contained in the CpG doublets.
  • cytosines In DNA amplified by PCR, cytosines have been converted to thymines while 5methylcytosines are in the form of cytosines. The latter are re-methylated by the enzyme M. SSSI.
  • the DNA fixed on a support, is treated with a commercial anti-5-methylcytosine antibody.
  • a second antibody makes it possible to quantify the 5-methylcytosines present in DNA thanks to a colorimetric reaction (ELIS A).
  • the ELIS A is a method already widely used in the hospital environment.
  • this new procedure makes it possible to analyze the methylation of all the BAGE loci but does not make it possible to measure the individual methylation of each locus. Compared to the COBRA method, it has two advantages:
  • This method consists of digestion of genomic DNA with an enzyme sensitive to methylation (Hhal, Biolabs), followed by amplification of 100ng DNA by PCR using two pairs of primers (SEQ ID NO : 18 (or 977f), SEQ ID NO: 19 (or 1106r)) and (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 (or 1276r)). Due to the great conservation of the BAGE loci sequences, a single pair of primers makes it possible to amplify all, or almost all, of the loci present in the human genome.
  • One of the two pairs (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20) 5 makes it possible to amplify the region of the BAGE genes containing the restriction site (long fragment). If the site is methylated, the DNA will not be cut by the enzyme and will be amplified. If the site is not methylated, the DNA will be cut and not amplified.
  • the other pair of primers (SEQ ID NO .: 18, SEQ ID NO: 19) makes it possible to amplify a region considered to be a control, not comprising this restriction site (short fragment). After migration on agarose gel, we measured the intensity of the bands corresponding to the DNA fragments with an image analyzer and calculated the ratio of the intensity of the long fragment to the intensity of the short fragment.
  • the epigenetic marker BAGE can be used for the diagnosis of colon cancer.
  • the BAGE loci are hypomethylated in colon cancer compared to the healthy paired mucosa.
  • the method that we have developed, faster and less tedious, can replace the COBRA reference technique. Detection of the BAGE marker using this new method requires only a small amount of DNA (100ng).
  • Fig. 1 Schematic representation of the sequence SEQ ID NO: 7 from a BAGE locus and position of the primers (represented by arrows, not to scale) used to amplify the DNA fragment analyzed.
  • Fig. 2 Schematic representation of sequences SEQ ID NO: 1 to 13 from the different BAGE loci, and diagnostic restriction sites (triangles).
  • Fig. 3 Principle of combined restriction and bisulfite analysis (COBRA) in a locus
  • BAGE on the left, sequence containing the diagnostic cytosine (before last nucleotide) before conversion and, on the right, the same sequence after conversion to sodium bisulfite (two cases depending on whether the cytosine is or is not methylated).
  • the triangles indicate the cleavage site of the enzyme.
  • Fig. 4 Ratio of the signal intensities of the control DNA fragment (short fragment) to the fragment comprising the digestion site (long fragment) as a function of the percentage of methylation of the BAGE loci.

Abstract

L'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG dans des séquences issues des loci BAGE. L'invention concerne également les amorces nucléotidiques pour la mise en oeuvre de cette méthode, ainsi que les fragments nucléotidiques amplifiés dans le cadre de cette méthode.

Description

UTILISATION DES LOCI BAGE (B MELANOMA ANTIGENS) COMME MARQUEURS TUMORAUX
La présente invention a pour objet l'utilisation des loci BAGE (B melanoma antigens), et plus particulièrement de fragments de ces loci, pour la mise en œuvre de méthodes de diagnostic des cancers.
Les méthodes actuellement utilisées pour le diagnostic des tumeurs sont les suivantes :
1. Examen radiologique. Il permet d'identifier une masse tumorale, mais nécessite souvent un examen complémentaire des cellules afin de vérifier si la néoformation est néoplasique.
2. Examen cytologique/histologique. Cellules et/ou tissus sont analysés sur la base de critères morphologiques. L'analyse est faite en microscopie optique par un analyste expérimenté et ne peut pas être automatisé. 3. Présence/absence d'une protéine. Certaines protéines sont spécifiquement associées à une ou plusieurs tumeurs.
4. Expression d'un gène. L'expression d'un gène peut également avoir valeur prognostic et/ou diagnostic.
Les protéines ou les gènes utilisés comme marqueurs tumoraux sont spécifiques d'une ou de quelques tumeurs. De plus, protéines et ARN sont moins stables que l'ADN qui est utilisé dans la méthode l'invention.
Puisque toute méthode diagnostique est ni infaillible (faux positifs et faux négatifs), ni universelle, il est donc important de développer des nouveaux marqueurs tumoraux pour renforcer les protocoles déjà disponibles. Le gène BAGE1 (B melanoma antigens 1) avait été isolé car il code pour un antigène tumoral (Boël et al., 1995). Récemment, les Inventeurs ont identifié et caractérisé des nouveaux membres de la famille des gènes BAGE (Ruault et al., 2002). Comme BAGE1, les nouveaux gènes BAGE sont exprimés uniquement dans les cellules cancéreuses et dans le testicule, alors qu'ils sont silencieux dans les autres tissus normaux. Les protéines et/ou les peptides codés par ces gènes pourraient être utilisés pour induire une réponse cellulaire spécifique (lymphocytes T cytolytiques) contre les tumeurs qui présentent ces antigènes à la surface cellulaire. Une demande internationale de brevet a été déposée au nom du CNRS (PCT/EP02/03811) pour protéger les nouveaux gènes BA GE. La présente invention découle de l'analyse par les inventeurs de la méthylation (présence de 5-méthylcytosine) de l'ADN de la région 5' des loci BAGE. L'analyse a été effectuée sur 8 tissus normaux et 23 tumeurs (13 mélanomes, 5 cancers de l'ovaire, 5 tumeurs de Wilms). Ils ont ainsi montré que les gènes BAGE sont hyperméthylés dans les tissus normaux et hypométhylés dans les -tumeurs.
La présente invention a donc principalement pour but l'utilisation des loci BAGE comme marqueurs tumoraux pour le diagnostic du cancer. La nouvelle méthode pour le diagnostic des tumeurs de la présente invention, est basée sur l'analyse de l'hypométhylation des loci BAGE. L'analyse est faite sur l'ensemble des loci BAGE, à savoir sur les gènes fonctionnels et sur les gènes tronqués. La procédure est nouvelle, le matériel biologique utilisé (l'ADN) est très stable et la méthode d'analyse peut être automatisée. Toutes les tumeurs analysées par les inventeurs ont présenté une hypométhylation des loci BAGE.
La présente invention a pour objet une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal caractérisées en ce qu'elle est effectuée par : - extraction de l'ADN total contenu dans les cellules de l'échantillon biologique prélevé à analyser,
- suivie de la détermination du taux de méthylation en position 5 de l'anneau pyrimidine des desoxycytidines des doublets CpG (desoxycytidine suivie d'une desoxyguanidine sur le même brin d'ADN en direction 5' → 3') compris dans : * les loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total susmentionné, à savoir dans les loci BAGE correspondant aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou correspondant à des séquences apparentées aux séquences SEQ LD NO : 1 à 13 susmentionnées, ces séquences apparentées ayant une homologie d'au moins environ 90%, notamment de 99%, avec ces dernières, et comprenant au moins un doublet CpG, lesdites séquences apparentées étant susceptibles d'hybrider avec les séquences susmentionnées, notamment dans un tampon d'hybridation 5xSSPE à 55°C,
* ou dans des fragments des loci BAGE susmentionnés comprenant au moins un doublet CpG,
- et comparaison du taux de méthylation des desoxycytidines dans les séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total de l'échantillon biologique à analyser, avec le taux de méthylation desdites desoxycytidines dans ces séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total d'un échantillon biologique sain non cancéreux, la détermination d'un taux de méthylation dans l'échantillon biologique analysé inférieur au taux de méthylation dans l'échantillon sain étant corrélable avec le diagnostic d'un cancer chez l'homme ou l'animal dont est issu l'échantillon biologique analysé.
Avantageusement, la détermination du taux de méthylation en position 5 de l'anneau p rimidine des desoxycytidines des doublets CpG dans les loci BAGE susmentionnés est effectuée dans le plus grand nombre possible de loci BAGE, ou de fragments susmentionnés de ces derniers, parmi les loci BAGE représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, et d'autres loci BAGE susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié et correspondant aux séquences apparentées susmentionnées.
Avantageusement encore, la détermination du taux de méthylation dans les loci BAGE susmentionnés est effectuée après amplification de ces loci BAGE à l'aide de couples d'amorces appropriés choisis de manière à ce qu'ils permettent d'amplifier le plus grand nombre possible de loci BAGE, ou de fragments susmentionnés de ces derniers, parmi les loci BAGE représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, et d'autres loci BAGE susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié et correspondant aux séquences apparentées susmentionnées.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux. de l'invention, les couples d'amorces susmentionnés permettent d'amplifier au moins environ 10 des séquences SEQ LD NO : 1 à 13 ou des fragments susmentionnés de ces séquences, et de préférence au moins 12 de ces séquences, ou la totalité de ces 13 séquences, et, le cas échéant, d'autres loci BAGE susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié.
La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG comprend les étapes suivantes :
- une étape de traitement de l'ADN total extrait de l'échantillon biologique au bisulfite de sodium qui convertit les desoxycytidmes non méthylées en desoxyuridines, sans modifier les desoxycytidines méthylées,
- au moins une étape d'amplification à l'aide de couples d'amorces appropriés permettant l'amplification, notamment selon la technique PCR (Polymerase Chain Reaction), du nombre de copies des loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total susmentionné, ou de fragments de ces loci, tels que définis ci-dessus, et dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées ont été transformés en desoxyuridines lors de l'étape précédente de traitement au bisulfite de sodium, ces desoxyuridines correspondant à des desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées correspondant aux desoxycytidines dans les copies de séquences ainsi obtenues, - une étape de mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées susmentionnées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les loci BAGE susmentionés, ou dans les fragments de ces séquences, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique. La présente invention concerne plus particulièrement une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend deux étapes d'amplification du nombre de copies de toutes les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées sont transformés en desoxyuridines puis en desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées sont transformées en desoxycytidines non méthylées, la première étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant : amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ID NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) et la deuxième étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant: amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO : 16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID NO : 17)
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou dans les séquences apparentées ou les fragments de ces séquences tels que définis ci-dessus, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, est effectuée selon l'une des méthodes suivantes :
- clonage et/ou séquençage des séquences amplifiées,
- ou par digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction reconnaissant dans les séquences SEQ LD NO : 1 à 13, ou les séquences apparentées ou fragments susmentionnés, un site de restriction où se situe une desoxycytidine d'un ou plusieurs doublets CpG de référence, lesdites enzymes coupant, ou inversement ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets de référence susmentionnés, séparation des éventuels fragments de restriction obtenus, notamment par électrophorese, mesure de la quantité de ces fragments, notamment par mesure de l'intensité des bandes d'électrophorèse correspondantes, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience par digestion à l'aide des mêmes enzymes des séquences SEQ ID NO : 1 à 13 méthylées de 0 à 100% avec un réactif de méthylation telle que la méthyltransférase CpG methylase M. SssI, - ou par traitement des séquences amplifiées avec un réactif de méthylation tel que M. SssI, qui permet donc la méthylation des desoxycytidines présentes dans les doublets CpG des séquences amplifiées et correspondant aux desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou les séquences apparentées ou fragments susmentionnés, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, suivie de la quantification desdites desoxycytidines ainsi méthylées à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine marqués, ou susceptibles d'être reconnus par un réactif marqué, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine en présence des séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou des séquences apparentées ou fragments susmentionnés, méthylées de 0 à 100%> à l'aide d'un réactif de méthylation tel que M. SssI.
' La présente invention a plus particulièrement pour objet une méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, par la méthode de digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction, est effectuée à l'aide :
- d'enzymes coupant les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, telles que les enzymes choisies parmi les suivantes : . l'enzyme Mbol reconnaissant les sites de restriction situés aux positions :
* 407 à 410, et 736 à 439 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant respectivement la séquence entre les positions 406 et 407, et les positions 435 et 436, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 410 et 439,
* 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 2, ''et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245,
* 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ ID NO : 3, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185,
* 193 à 196 de la séquence SEQ ID NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196,
* 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ LD NO : 5, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185, * 370 à 373, 958 à 961, et 987 à 990 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant respectivement la séquence entre les positions 369 et 370, les positions 957 et 958, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 373, 961, et 990, * 193 à 196 de la séquence SEQ ID NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196,
* 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 8, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245,
* 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245,
* 240 à 205 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 201 et 202, le doublet CpG de référence étant situé à la position 205,
* 13 à 16 de la séquence SEQ ID NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 12 et 13, le doublet CpG de référence étant situé à la position 16, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de Mbol dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de" fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés,
. l'enzyme Acll reconnaissant les sites de restriction situés aux positions :
* 252 à 257 de la séquence SEQ LD NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254,
* 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 4, 'et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234,
* 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234,
* 252 à 257 de la séquence SEQ ID NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254, * 212 à 217 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 213 et 214, le doublet CpG de référence étant situé à la position 214, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de Acll dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés,
- d'enzymes ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, mais coupant lesdites séquences lorsque celles-ci contiennent une desoxythymidine en lieu et place d'une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement non méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ID NO : 1 à 13, telle que l'enzyme HphI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : , . . * 501 à 505 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant la séquence entre les positions 513 et 514, le doublet CpG de référence étant situé à la position 503,
* 247 à 251 de la séquence SEQ ID NO : 3, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249,
* 247 à 251 de la séquence SEQ ID NO : 5, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249,
* 1052 à 1056 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant la séquence entre les positions 1064 et 1065, le doublet CpG de référence étant situé à la position 1054,
* 314 à 318 de la séquence SEQ ID NO : 9, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316, * 314 à 318 de la séquence SEQ LD NO : 10, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316,
* 267 à 271 de la séquence SEQ ED NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 279 et 280, le doublet CpG de référence étant situé à la position 269,
* 10 à 14 de la séquence SEQ ID NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 18 et 19, le doublet CpG de référence étant situé à la position 12, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de HphI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme, et que' la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés.
La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que la détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG comprend les étapes suivantes : - une étape de traitement de l'ADN total extrait de l'échantillon biologique par une enzyme sensible à la méthylation, telle que l'enzyme Hhal, qui permet de couper la séquence d'ADN lorsque celle-ci ne contient pas, dans le site de restriction de ladite enzyme, une desoxycytidine méthylée dans les doublets CpG de référence, - une étape d'amplification, notamment selon la technique PCR, à l'aide de deux couples d'amorces appropriés, permettant d'amplifier des fragments des loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total susmentionné, tels que définis ci-dessus, le premier couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région contrôle des loci BAGE ne contenant pas le site de restriction de ladite enzyme, et le second couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région des loci BAGE contenant ledit site de restriction, cette étape permettant d'obtenir d'une part des séquences amplifiées contenant la région contrôle, et d'autre part des séquences amplifiées contenant la région des loci BAGE contenant ledit site de restriction, étant entendu que l'obtention des séquences amplifiées contenant la région des loci BAGE contenant ledit site de restriction est corrélée à l'absence de la coupure des séquences par l'enzyme et donc à la présence, dans le site de restriction de ladite enzyme, de desoxycytidine méthylée dans les doublets CpG de référence, et étant entendu que l'absence d'une desoxycytidine méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de coupure de ladite enzyme est corrélée à la coupure de ladite séquence et donc à l'absence d'amplification, et
- une étape de mesure du pourcentage de méthylation des loci BAGE, par comparaison de la quantité de séquences amplifiées contenant ledit site de restriction, avec la quantité de séquences amplifiées contenant uniquement la région contrôle, une quantité de séquences amplifiées contenant ledit site de restriction inférieure à la quantité de séquences amplifiées contenant uniquement la région contrôle étant correlable au diagnostic d'un cancer chez l'homme ou l'animal.
A titre d'illustration, cette comparaison peut être effectuée par mesure, après migration des séquences ainsi amplifiées sur gel d'agarose, des intensités de signal des bandes correspondant aux différentes séquences amplifiées, suivie d'une étape de calcul du rapport entre l'intensité du signal des bandes correspondant aux séquences amplifiées contenant uniquement la région contrôle et l'intensité du signal des bandes correspondant aux séquences amplifiées contenant la région des loci BAGE contenant ledit site de restriction, et la détermination du pourcentage de méthylation des loci BAGE. L'invention a plus particulièrement une méthode de diagnostic telle que définie ci- dessus, caractérisée en ce que :
- le couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région contrôle des loci BAGE représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 12, ne contenant pas le site de restriction de l' enzyme Hhal,est le suivant : amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ ID NO : 18) amorce 3' : acctaccctgccagctttc (SEQ ID NO : 19) ledit couple d'amorce permettant l'amplification du fragment SEQ ID NO 21 issu de la séquence SEQ LD NO : 1, du fragment SEQ ID NO 22 issu de la séquence SEQ ED NO : 2, du fragment SEQ LD NO 23 issu de la séquence SEQ ID NO : 3, du fragment SEQ ID NO 24 issu de la séquence SEQ ID NO : 4, du fragment SEQ LD NO 25 issu de la séquence SEQ ID NO : 5, du fragment SEQ ID NO 26 issu de la séquence SEQ ID NO : 6, du fragment SEQ ID NO 27 issu de la séquence SEQ ID NO : 7, du fragment SEQ ID NO 28 issu de la séquence SEQ ID NO : 8, du fragment SEQ ID NO 29 issu de la séquence SEQ ID NO : 9, du fragment SEQ ID NO 30 issu de la séquence SEQ ID NO : 10, du fragment SEQ ID NO 31 issu de la séquence SEQ ID NO : 11, du fragment SEQ ID NO 32 issu de la séquence SEQ ID NO : 12,
- le couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région des loci BAGE représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 12, contenant ledit site de restriction, est le suivant : amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ ID NO : 18) amorce 3' : ccttaggcagtgtagacgctg (SEQ LD NO : 20) ledit couple d'amorce permettant l'amplification du fragment SEQ ID NO 33 issu de la séquence SEQ ID NO : 1, du fragment SEQ ID NO 34 issu de la séquence SEQ ID NO : 2, du fragment SEQ LD NO 35 issu de la séquence SEQ LD NO : 3, du fragment SEQ ID NO 36 issu de la séquence SEQ ID NO : 4, du fragment SEQ ID NO 37 issu de la séquence SEQ ID NO : 5, du fragment SEQ ID NO 38 issu de la séquence SEQ ID NO : 6, du fragment SEQ ID NO 39 issu de la séquence SEQ ID NO : 7, du fragment SEQ ID NO 40 issu de la séquence SEQ ID NO : 8, du fragment SEQ LD NO 41 issu de la séquence SEQ ID NO : 9, du fragment SEQ ID NO 42 issu de la séquence SEQ ID NO : 10, du fragment SEQ ID NO 43 issu de la séquence SEQ ID NO ; 11, du fragment SEQ ID NO 44 issu de la séquence SEQ ID NO : 12. L'invention concerne également les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences contenant au moins un doublet CpG.
L'invention a également pour objet les fragments des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 1 à 13 correspondants aux séquences SEQ ED NO : 21 à 44 susmentionnées. La présente invention a plus particulièrement pour objet les séquences nucléotidiques correspondant aux séquences SEQ LD NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences tels que définis ci-dessus, dans lesquelles les desoxycytidines n'appartenant pas à un doublet CpG sont remplacées par des desoxyuridines ou des desoxythymidines, et, le cas échéant, l'une au moins des desoxycytidines des doublets CpG est remplacée par un desoxyuridine ou une desoxythymidine.
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques telles que définies ci- dessus, caractérisées en ce qu'aucune des desoxycytidines des doublets CpG n'est méthylée, ou en ce qu'au moins une jusqu'à la totalité des desoxycytidines des doublets CpG est méthylée.
L'invention concerne également les couples d'amorces pour l'amplification des séquences nucléotidiques telles que définie ci-dessus, choisis parmi les suivants : amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ LD NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ID NO : 15) amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO : 16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ID NO : 17) amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ ID NO : 18) amorce 3' : acctaccctgccagctttc (SEQ ED NO : 19) amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ LD NO : 18) amorce 3' : ccttaggcagtgtagacgctg (SEQ LD NO : 20)
L'invention a également pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, ou des couples d'amorces susmentionnés, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus.
L'invention concerne également un nécessaire ou kit pour la' mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces susmentionné, et le cas échéant :
- les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification par PCR,
- du bisulfite de sodium,
- des enzymes de restriction telles que Mbol, Acll, ou HphI, - un réactif de méthylation tel que M. SssI,
- une courbe étalon correspondant à 0%> jusqu'à 100% de méthylation de l'une au moins des séquences SEQ ED NO : 1 à 13, choisie en fonction du ou des couples d'amorces utilisés.
L'invention a également pour objet l'utilisation des loci BAGE correspondant aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13, ou correspondant à des séquences apparentées aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13 susmentionnées, ou à des fragments de ces loci tels que définis ci-dessus, tels que les fragments SEQ ED NO : 21 à 44, en tant que marqueurs tumoraux dans le cadre de la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme, notamment d'une méthode choisie parmi celles définies ci-dessus.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la mise en évidence de Phypométhylation des loci Bage dans les tumeurs
I Méthode par traitement de l'ADN au bisulfite de Na A) Matériels et Méthodes
Extraction ADN génomique
Figure imgf000012_0001
Traitement de l'ADN au bisulfite de Na (Cm-^C ; C--»U)
Amplification du locus d'intérêt par PCR (Cm-->C ; U-- T)
Figure imgf000012_0002
Frommer Cobra Nouvelle méthode
1. Traitement au bisulfite de sodium
L'ADN total a été extrait à partir de tissus selon des techniques standards et soumis à une réaction chimique avec le bisulfite de sodium qui convertit les cytosines en thymines, tout en laissant intactes les 5-méthylcytosines. La réaction de conversion avec le bisulfite de sodium a été effectuée comme décrit par Frommer et collaborateurs (1992). Brièvement, 500 ng d'ADN ont été dénaturés dans 111 μl 0,3 M NaOH (en présence de 10 μg ARNm de levure) à 42°C pendant 20 minutes. Pour la déamination des cytosines non-methylées et leur conversion en uracile, 1200 μl d'une solution de bisulfite de sodium fraîchement préparée [541 g 1 (sigma, réactif de catégorie d'ACS) en 10 mM d'hydroquinone (sigma), pH 5 ] ont été ajoutés directement à 1ΑDN dénaturé. La réaction a été couverte avec 200 μl de l'huile minérale (sigma, catégorie IRE) et incubée à 55°C pendant 4h dans l'obscurité. L'ADN a été dessalé en utilisant un kit de purification d'ADN (Promega Wizard Clean-Up) et élue avec 105 μl 1 mM Tris/HCl pH 8,5. 100 μl de cette solution d'ADN ont été traités par 0,3 M NaOH à 37°C pendant 30 minutes. Pour la neutralisation, l'acétate d'ammonium a été ajouté à une concentration finale de 3 M et l'ADN a été précipité avec l'éthanol, en utilisant 1 μg d'ARNm de levure comme carrier. L'ADN a été dissout dans 100 μl 10 mM Tris/HCl pH 8,5 et conservé à -20°C jusqu'à utilisation.
Figure imgf000013_0001
Cytosin Cytosinsulfonate Uracilsulfonate Uracil
Réaction de conversion des cytosines en uraciles.
2. Amplification des loci BAGE par PCR
A partir de l'ADN traité au bisulfite de sodium, les inventeurs ont amplifié par PCR un fragment d'ADN d'environ 500 pb localisé dans la région 5' des loci BAGE. L'amplification par PCR a été effectuée avec deux réactions consécutives (Fig.l). La double PCR permet de produire plus d'ADN. Etant donnée que les séquences BAGE sont presque identiques (95- 99% identité de séquence nucléique), il est impossible d'amplifier spécifiquement un seul locus. Les amorces utilisées amplifient donc plusieurs loci BAGE à la fois. Les amorces utilisée pour la première réaction étaient BAGE.BS+32f (TttagaggaTTaggagaagggggagT) et BAGE.BS+1540r (AcctAccaAttAAcattAttActAacattA) ; les amorces utilisée pour la deuxième amplification étaient BAGE.BS+99f (gatggtggtggTaaTagagatggT) et BAGE.BS+1371r (ccttaAAcaAtAtaAaccctAataA). Les nucléotides résultant de la déamination des cytosines non-méthylées sont en majuscule. La réaction de PCR a été faite dans 50 μl avec 25 ng de l'ADN génomique comme matrice (on ne considère pas la perte d'ADN pendant le traitement avec le bisulfite), 50 pmol de chaque amorce, 2.5 U Taq- polymérase (Promega), le tampon standard fourni avec l'enzyme, 1,5 mM MgC12 et 200 μM de chaque dNTP. 2.5 μl du premier mélange de PCR ont été utilisés comme matrice pour le deuxième PCR. Les temps et les températures d'incubation étaient 94°C 2 minutes suivis de 5 cycles (94°C 1 minute, 55°C 2 minutes, 72°C 3 minutes), de 25 cycles (94°C 0.5 minute, 55°C 2 minutes, 72°C 1.5 minute) et de 72°C 10 minutes. Les cytosines non méthylées, converties en uraciles par le bisulfite de sodium, sont transformées en thymines par la réaction de PCR. Les 5-méthylcytosines restent sous forme de cytosines.
3. Analyse des cytosines et des 5méthylcytosines.
Pour identifier les cytosines et les 5-méthyl cytosines présentes dans les fragments d'ADN amplifiés, les inventeurs ont utilisé deux méthodes différentes et une troisième est à l'étude.
3.1. Clonage et Séquençage (Frommer et al., 1992). Le produit de PCR (obtenu selon procédure décrite en B) a été clone dans un vecteur pCRÏÏ TOPO (Lnvitrogen) et transformé dans des cellules E. coli. Les bactéries transformées ont été utilisées directement comme matrice pour amplifier les inserts avec des amorces universelles (SP6 et T7). Les produits de PCR ont été séquences et les séquences obtenues ont été comparées à la séquence génomique des loci BAGE grâce au logiciel Methtools software, mis au point par l'un des inventeurs (Grunau, 2000). La comparaison avec les séquences génomiques connues a permis d'identifier dans les séquences clonées les cytosines, qui ont été converties en thymines, et les 5-méthylcytosines, qui restaient sous forme de cytosines. Cette méthode est très informative car
(1) elle permet d'analyser la méthylation de l'ensemble des cytosines présentes dans la région amplifiée par PCR ;
(2) elle permet d'analyser la méthylation de chaque locus BAGE de façon individuelle.
3.2 COBRA (Combined Bisulfite and Restriction enzyme Assay) (Xiong and Laird, 1997).
Le produit de PCR (obtenu selon procédure décrite en B) a été digéré avec 2 enzymes de restriction (Mbol et HphI) et analysé par électrophorese (Fig.2). Les produits de PCR sont purifiés. La concentration de l'ADN a été mesurée au spectrophotomètre (Eppendorf BioPhotometer). La taille et la qualité des produits de PCR ont été vérifiées par séparation sur un gel d'agarose 2% dans 0.5x TBE (Tris Borate EDTA) et visualisées avec le bromure d'ethidium. 700 ng de produit de PCR ont été incubés avec 2.5 U d'enzymes de restriction Mbol (NEB) ou HphI (Fermentas) pendant 2 heures à 37°C dans 20 μl. 20 μl ont été chargés sur un gel d'agarose 2% dans 0.5x TBE et les fragments ont été séparés par l'électrophorèse. Les images ont été digitalisées avec un appareil-photo CCD et analysées avec le logiciel d'ImageQuant. Des mélanges définis de l'ADN méthylés avec SssI ont été utilisés comme standards pour obtenir une courbe étalon. Les sites de restriction des enzymes utilisées contiennent des cytosines qui, si elles ne sont pas méthylées, sont converties par le bisulfite de sodium en thymines (Fig.3). La réaction enzymatique permet donc de distinguer entre 5- méthylcytosine et cytosine.
La méthode COBRA permet de mesurer la méthylation de l'ensemble des loci BAGE et permet d'analyser la méthylation d'une seule cytosine par enzyme de restriction. Ces cytosines ont été définies au préalable (grâce à la méthode séquençage et clonage) comme infbr atives de la méthylation de la région analysée.
3.3 Nouvelle méthode d'analyse de la méthylation des loci BAGE selon l 'invention Le produit de PCR (obtenu selon procédure décrite en B) est traité avec une enzyme M. SSSI méthyltransferase qui méthyle les cytosines contenues dans les doublets CpG. Dans l'ADN amplifié par PCR, les cytosines ont été converties en thymines alors que les 5methylcytosines sont sous formes des cytosines. Ces dernières sont re-méthylées par l'enzyme M. SSSI. L'ADN, fixé sur un support, est traité avec un anticorps commercial anti 5-méthylcytosine. Un deuxième anticorps permet de quantifier les 5-méthylcytosines présentes dans l'ADN grâce à une réaction colorimétrique (ELIS A). L'ELIS A est une méthode déjà très utilisée dans le milieu hospitalier.
Comme la méthode COBRA, cette nouvelle procédure permet d'analyser la méthylation de l'ensemble des loci BAGE mais ne permet pas de mesurer la méthylation individuelle de chaque locus. Par rapport à la méthode COBRA, elle a deux avantages :
(1) elle permet d'analyser la méthylation de l'ensemble 'des cytosines présentes dans la région amplifiée par PCR.
(2) elle est plus facile à utiliser, donc, plus adaptée à l'analyse de routine d'échantillons tumoraux.
B) Résultats Analyse de la méthylation des loci BAGE sur des tissus normaux et cancéreux.
Nous avons analysé la méthylation des loci BAGE dans 8 tissus normaux et 23 tumeurs (13 mélanomes, 5 cancers de l'ovaire, 5 tumeurs de ilms) en utilisant la méthode COBRA. Notre travail montre que les loci BAGE sont hyperméthylés dans les tissus normaux et hypométhylés dans les tumeurs. Un seul tissu normal présente une hypométhylation des loci BAGE : le testicule. Ce résultat était attendu car le testicule est le seul tissu normal dans lequel les gènes BAGE sont exprimés. Par conséquent, le système de l'invention n'est pas adapté au diagnostic des tumeurs du testicule.
5
II Principe de la méthode par digestion d'ADN génomique par une enzyme sensible à la méthylation
Nous avons développé une autre méthode pour mesurer la méthylation des loci BAGE. Cette méthode consiste en une digestion d'ADN génomique par une enzyme sensible à la 0 méthylation (Hhal, Biolabs), suivie d'une amplification de lOOng d'ADN par PCR à l'aide de deux paires d'amorces (SEQ ID NO : 18 (ou 977f), SEQ ID NO : 19 (ou 1106r)) et (SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20 (ou 1276r)). En raison de la grande conservation des séquences des loci BAGE, un seul couple d'amorces permet d'amplifier la totalité, ou quasi-totalité, des loci présents dans le génome humain. Une des deux paires (SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 20) 5 permet d'amplifier la région des gènes BAGE contenant le site de restriction (fragment long). Si le site est méthylé, l'ADN ne sera pas coupé par l'enzyme et sera amplifié. Si le site n'est pas méthylé, l'ADN sera coupé et non amplifié. L'autre paire d'amorces (SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO : 19) permet d'amplifier une région considérée comme contrôle, ne comportant pas ce site de restriction (fragment court). Après migration sur gel d'agarose nous avons 0 mesuré avec un analyseur d'image l'intensité des bandes correspondant aux fragments d'ADN et calculé le rapport de l'intensité du fragment long sur l'intensité du fragment court.
Schéma de la méthode proposée pour quantifier la méthylation des gènes BAGE (CM = Cytosine méthylée) 5 ADN non méthylé Hhal ,
3' 5'
—\ Contrôle CG CG
-*- fragment - 1106r 0 ™t court ft t I fragment long
• <- 1276r
ADN méthylé
Figure imgf000016_0001
(0 • fragment long -«- 1276r Validation de la méthode: Pour valider cette méthode, nous avons produit une gamme de méthylation des gènes BAGE, de 0 à 100%o par palier de 20%>. Nous avons clone l'ADN de 6 loci BAGE dans un plasmide pGEM-T (Promega). Nous avons méthylé la moitié de ces plasmides à l'aide d'une méthyltransférase (M.SssI, Biolabs). Nous avons ensuite mélangé à des proportions différentes ces plasmides méthylés à des plasmides non traités et de l'ADN de sperme de saumon. Nous avons analysé cette gamme par la nouvelle méthode. La quantité d'ADN après restriction enzymatique croît de façon linéaire en fonction de l'augmentation du pourcentage de méthylation des loci BAGE. Pour 0% de méthylation, l'ADN est entièrement digéré, donc il n'y a pas d'amplification du fragment long (Fig. 4).
Analyse des échantillons: Nous avons analysé par cette nouvelle méthode le pourcentage de méthylation des loci BAGE, pour chacun des 6 cancers coliques et de leur muqueuse saine appariée. Les résultats sont superposables à ceux obtenues par la méthode COBRA (voir tableau ci-dessous). Les loci BAGE sont hypométhylés dans 5 cancers coliques sur 6 par rapport à la muqueuse saine. Les loci BAGE du cancer 2 sont plus méthylés (88,8%) que ceux de la muqueuse saine appariée (67,8%). L'éventualité d'une erreur d'inversion du prélèvement tumoral et du tissu sain peut expliquer ce résultat. Aucun contrôle histologique n'a été fait après l' échantillonnage des prélèvements.
Tableau : Pourcentage de méthylation des loci BAGE dans les cancers coliques (Ca) et dans leur muqueuse saine appariée (Mu).
Figure imgf000017_0001
Notre étude révèle que le marqueur épigénétique BAGE peut être utilisé pour le diagnostic des cancers coliques. En effet les loci BAGE sont hypométhylés dans les cancers coliques par rapport à la muqueuse saine appariée. La méthode que nous avons mise au point, plus rapide et moins fastidieuse, peut remplacer la technique de référence COBRA. La détection du marqueur BAGE à l'aide de cette nouvelle méthode ne nécessite qu'une faible quantité d'ADN (lOOng). Nous proposons, à l'aide de ce marqueur BAGE, de dépister de manière non invasive les cancers coliques sur des liquides physiologiques paucicellulaires comme les selles.
Légende des figures.
Fig. 1 : Représentation schématique de la séquence SEQ ID NO : 7 issue d'un locus BAGE et position des amorces (représentées par des flèches, non à l'échelle) utilisées pour amplifier le fragment d'ADN analysé.
Fig. 2 : Représentation schématique des séquences SEQ ID NO : 1 à 13 issues des différents loci BAGE, et des sites de restriction diagnostiques (triangles).
Fig. 3 : Principe d'analyse combinée de restriction et bisulfite (COBRA) dans un locus
BAGE: à gauche, séquence contenant la cytosine diagnostique (avant dernier nucleotide) avant conversion et, à droite, la même séquence après conversion au bisulfite de sodium (deux cas de figures selon si la cytosine est ou n'est pas méthylée). Les triangles indiquent le site de coupure de l'enzyme.
Fig. 4 : Rapport des intensités de signal du fragment d'ADN contrôle (fragment court) sur le fragment comportant le site de digestion (fragment long) en fonction du pourcentage de méthylation des loci BAGE.
Références.
Boël P., ildmann C, Sensi M.L., Brasseur R, Renauld J.C., Coulie P., Boon T. and van der Bruggen P. BAGE: a new gène encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic T lymphocytes. Immunity 2: 167-175 (1995)
Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis CM., Watt F., Grigg G.W., Molloy P.L., Paul CL. A genomic sequencing protocol that yelds a positive display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands. P.N.A.S. 89 : 1827-1831. (1992). Grunau C, Schattevoy R., Mâche N., and Rosenthal A. MethTools-a toolbox to visualize and analyse DNA méthylation data. NA.R 28 (5) : 1053-1058. (2000)
Ruault M. van der Bruggen P., Brun,M-E., Boyle S., Roizès G., and De Sario A. New BAGE (B melanoma antigen) gènes mapping to the juxtacentromeric régions of human chromosomes 13 and 21 hâve a cancer/testis expression profile. Eur.J.Hum.Genet. 10 (12): 833-840 (2002)
Xiong Z.G. and Laird PW. COBRA : a sensitive and quantitative DNA méthylation assay. N.A.R. 12 : 2532-2534. (1997).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme ou l'animal, à l'exception des tumeurs des testicules, caractérisée en ce qu'elle est effectuée par :
- extraction de l'ADN total contenu dans les cellules de l'échantillon biologique prélevé à analyser,
- suivie de la détermination du taux de méthylation en position 5 de l'anneau pyrimidine des desoxycytidines des doublets CpG (desoxycytidine suivie d'une desoxyguanidine sur le même brin d'ADN en direction 5' → 3') compris dans :
* les loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total susmentionné, à savoir dans les loci BAGE correspondant aux séquences SEQ ED NO : 1 à 13, ou correspondant à des séquences apparentées aux séquences SEQ ID NO : 1 à 13 susmentionnées, ces séquences apparentées ayant une homologie d'au moins environ 90%, notamment de 99%, avec ces dernières, et comprenant au moins un doublet CpG, lesdites séquences apparentées étant susceptibles d'hybrider avec les séquences susmentionnées, notamment dans un tampon d'hybridation 5xSSPE à 55°C,
* ou dans des fragments des loci BAGE susmentionnés comprenant au moins un doublet CpG, - et comparaison du taux de méthylation des desoxycytidines dans les séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total de l'échantillon biologique à analyser, avec le taux de méthylation desdites desoxycytidines dans ces séquences ou fragments de séquences susmentionnés présents dans l'extrait d'ADN total d'un échantillon biologique sain non cancéreux, la détermination d'un taux de méthylation dans l'échantillon biologique analysé inférieur au taux de méthylation dans l'échantillon sain étant correlable avec le diagnostic d'un cancer chez l'homme ou l'animal dont est issu l'échantillon biologique analysé.
2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que la détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG comprend les étapes suivantes :
- une étape de traitement de l'ADN total extrait de l'échantillon biologique au bisulfite de sodium qui convertit les desoxycytidmes non méthylées en desoxyuridines, sans modifier les desoxycytidines méthylées, - au moins une étape d'amplification à l'aide de couples d'amorces appropriés permettant l'amplification, notamment selon la technique PCR, du nombre de copies des séquences issues des loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total susmentionné, ou de fragments de ces loci, tels que définis dans la revendication 1, et dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées ont été transformés en desoxyuridines lors de l'étape précédente de traitement au bisulfite de sodium, ces desoxyuridines correspondant à des desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées correspondant aux desoxycytidines dans les copies de séquences ainsi obtenues,
- une étape de mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées susmentionnées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans loci BAGE susmentionnés, ou dans les fragments de ces séquences, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique.
3. Méthode de diagnostic selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend deux étapes d'amplification du nombre de copies de séquences SEQ ED NO:
1 à 13, dans lesquelles les desoxycytidines initialement non méthylées sont transformés en desoxyuridines puis en desoxythymidines, et les desoxycytidines initialement méthylées sont transformées en desoxycytidines non méthylées, la première étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant : amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ED NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ ED NO : 15) et la deuxième étape d'amplification étant effectuée à l'aide du couple d'amorces suivant: amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ED NO : 16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SE'Q LD NO : 17)
4. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, et correspondant au taux de desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ED NO : 1 à 13, ou dans les séquences apparentées ou les fragments de ces séquences tels que définis dans la revendication 1, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, est effectuée selon l'une des méthodes suivantes :
- clonage et/ou séquençage des séquences amplifiées,
- ou par digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction reconnaissant dans les séquences SEQ ED NO : 1 à 1.3, ou les séquences apparentées ou fragments susmentionnés, un site de restriction où se situe une desoxycytidine d'un ou plusieurs doublets CpG de référence, lesdites enzymes coupant, ou inversement ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets de référence susmentionnés, séparation des éventuels fragments de restriction obtenus, notamment par électrophorese, mesure de la quantité de ces fragments, notamment par mesure de l'intensité des bandes d'électrophorèse correspondantes, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience par digestion à l'aide des mêmes enzymes des séquences SEQ LD NO : 1 à 13 méthylées de 0 à 100% avec un réactif de méthylation telle que la méthyltransférase CpG methylase M. SssI, - ou par traitement des séquences amplifiées avec un réactif de méthylation tel que M.
SssI, qui permet donc la méthylation des desoxycytidines présentes dans les doublets CpG des séquences amplifiées et correspondant aux desoxycytidines méthylées initialement présentes dans les séquences SEQ ED NO : 1 à 13, ou les séquences apparentées ou fragments susmentionnés, dans l'ADN total extrait de l'échantillon biologique, suivie de la quantification desdites desoxycytidines ainsi méthylées à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine marqués, ou susceptibles d'être reconnus par un réactif marqué, et comparaison avec une courbe étalon représentant les résultats obtenus en effectuant la même expérience à l'aide d'anticorps anti-méthyldesoxycytidine en présence des séquences SEQ ED NO : 1 à 13, ou des séquences apparentées ou fragments susmentionnés, méthylées de 0 à 100% à l'aide d'un réactif de méthylation tel que M. SssI.
5. Méthode de diagnostic selon la revendication 4, caractérisée en ce que la mesure du taux de desoxycytidines présentes dans les séquences amplifiées, par la méthode de digestion des séquences amplifiées à l'aide d'enzymes de restriction, est effectuée à l'aide - d'enzymes coupant les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ED NO : 1 à 13, telles que les enzymes choisies parmi les suivantes :
. l'enzyme Mbol reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 407 à 410, et 736 à 439 de la séquence SEQ ED NO : 1, et coupant respectivement la séquence entre les positions 406 et 407, et les positions 435 et 436, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 410 et 439,
* 242 à 245 de la séquence SEQ ID NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245, * 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ LD NO : 3, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185,
* 193 à 196 de la séquence SEQ ED NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196,
* 153 à 156, et 182 à 185 de la séquence SEQ LD NO : 5, et coupant respectivement la séquence entre les positions 152 et 153, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 156 et 185,
* 370 à 373, 958 à 961, et 987 à 990 de la séquence SEQ ED NO : 6, et coupant respectivement la séquence entre les positions 369 et 370, les positions 957 et 958, et les positions 181 et 182, les doublets CpG de référence étant respectivement situés aux positions 373, 961, et 990,
* 193 à 196 de la séquence SEQ ED NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 192 et 193, le doublet CpG de référence étant situé à la position 196, * 242 à 245 de la séquence SEQ ED NO : 8, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245,
* 242 à 245 de la séquence SEQ ED NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 241 et 242, le doublet CpG de référence étant situé à la position 245,
* 240 à 205 de la séquence SEQ ED NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 201 et 202, le doublet CpG de référence étant situé à la position 205,
* 13 à 16 de la séquence SEQ ED NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 12 et 13, le doublet CpG de référence étant situé à la position 16, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de Mbol dans lés séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés,
. l'enzyme Acll reconnaissant les sites de restriction situés aux positions : * 252 à 257 de la séquence SEQ ID NO : 2, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254,
* 232 à 237 de la séquence SEQ ID NO : 4, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234, * 232 à 237 de la séquence SEQ LD NO : 7, et coupant la séquence entre les positions 233 et 234, le doublet CpG de référence étant situé à la position 234,
* 252 à 257 de la séquence SEQ ED NO : 11, et coupant la séquence entre les positions 253 et 254, le doublet CpG de référence étant situé à la position 254, * 212 à 217 de la séquence SEQ ED NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 213 et 214, le doublet CpG de référence étant situé à la position 214, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de Acll dans les séquences amplifiées, est corrélée à la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc à l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, et que la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés,
- d'enzymes ne coupant pas les séquences amplifiées lorsque celles-ci contiennent une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, mais coupant lesdites séquences lorsque celles-ci contiennent une desoxythymidme en lieu et place d'une desoxycytidine dans les doublets CpG de référence, et donc une desoxycitidine initialement non méthylée dans ces mêmes doublets dans les séquences SEQ ED NO : 1 à 13, telle que l'enzyme HphI reconnaissant les sites de restriction situés aux positions :
* 501 à 505 de la séquence SEQ ID NO : 1, et coupant la séquence entre les positions 513 et 514, le doublet CpG de référence étant situé à la position 503,
* 247 à 251 de la séquence SEQ ED NO : 3, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé à la position 249,
* 247 à 251 de la séquence SEQ ED NO : 5, et coupant la séquence entre les positions 259 et 260, le doublet CpG de référence étant situé a la position 249, * 1052 à 1056 de la séquence SEQ ID NO : 6, et coupant la séquence entre les positions 1064' et 1065, le doublet CpG de référence étant situé à la position 1054,
* 314 à 318 de la séquence SEQ LD NO : 9, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316,
* 314 à 318 de la séquence SEQ ID NO : 10, et coupant la séquence entre les positions 326 et 327, le doublet CpG de référence étant situé à la position 316,
* 267 à 271 de la séquence SEQ ID NO : 12, et coupant la séquence entre les positions 279 et 280, le doublet CpG de référence étant situé à la position 269,
* 10 à 14 de la séquence SEQ ED NO : 13, et coupant la séquence entre les positions 18 et 19, le doublet CpG de référence étant situé à la position 12, étant entendu que la détection d'une desoxycytidine initialement méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de restriction de HphI dans les séquences amplifiées, est corrélée à la résistance desdites séquences à l'action de l'enzyme, et que la coupure desdites séquences par l'enzyme, et donc l'obtention de fragments de restriction de taille déterminée, témoigne de l'absence de méthylation de la desoxycytidine initialement présente dans les doublets CpG de référence susmentionnés.
6. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que la détermination du taux de méthylation des desoxycytidines des doublets CpG comprend les étapes suivantes :
- une étape de traitement de l'ADN total extrait de l'échantillon biologique par une enzyme sensible à la méthylation, telle que l'enzyme Hhal, qui permet de couper la séquence d'ADN lorsque celle-ci ne contient pas, dans le site de restriction de ladite enzyme, une desoxycytidine méthylée dans les doublets CpG de référence, - une étape d'amplification, notamment selon la technique PCR, à l'aide de deux couples d'amorces appropriés, permettant d'amplifier des fragments des loci BAGE présents dans l'extrait d'ADN total susmentionné, tels que définis dans la revendication 1, le premier couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région contrôle des loci BAGE ne contenant pas le site de restriction de ladite enzyme, et le second couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région des loci BAGE contenant ledit site de restriction, cette étape permettant d'obtenir d'une part des séquences amplifiées contenant la région contrôle, et d'autre part des séquences amplifiées contenant la région des loci BAGE contenant ledit site de restriction, étant entendu que l'obtention dès séquences amplifiées contenant la région des loci BAGE contenant ledit site de restriction est corrélée à l'absence de la coupure des séquences par l'enzyme et donc à la présence, dans le site de restriction de ladite enzyme, de desoxycytidine méthylée dans les doublets CpG de référence, et étant entendu que l'absence d'une desoxycytidine méthylée dans les doublets CpG de référence dans le site de coupure de ladite enzyme est corrélée à la coupure de ladite séquence et donc à l'absence d'amplification, et
- une étape de mesure du pourcentage de méthylation des loci BAGE, par comparaison de la quantité de séquences amplifiées contenant ledit site de restriction, avec la quantité de séquences amplifiées contenant uniquement la région contrôle, une quantité de séquences amplifiées contenant ledit site de restriction inférieure à la quantité de. séquences amplifiées contenant uniquement la région contrôle étant correlable au diagnostic d'un cancer chez l'homme ou l'animal.
7. Méthode de diagnostic selon la revendication 6, caractérisée en ce que : - le couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région contrôle des loci BAGE représentés par les séquences SEQ LD NO : 1 à 12, ne contenant pas le site de restriction de l'enzyme Hhal,est le suivant : amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ ID NO : 18) amorce 3' : acctaccctgccagctttc (SEQ ID NO : 19) ledit couple d'amorce permettant l'amplification du fragment SEQ ED NO 21 issu de la séquence SEQ LD NO : 1, du fragment SEQ LD NO 22 issu de la séquence SEQ ID NO : 2, du fragment SEQ ED NO 23 issu de la séquence SEQ ED NO : 3, du fragment SEQ ID NO 24 issu de la séquence SEQ ED NO : 4, du fragment SEQ ED NO 25 issu de la séquence SEQ ED NO : 5, du fragment SEQ ED NO 26 issu de la séquence SEQ LD NO : 6, du fragment SEQ LD NO 27 issu de la séquence SEQ ED NO : 7, du fragment SEQ ID NO 28 issu de la séquence SEQ ED NO : 8, du fragment SEQ ED NO 29 issu de la séquence SEQ ED NO : 9, du fragment SEQ LD NO 30 issu de la séquence SEQ ED NO : 10, du fragment SEQ ID NO 31 issu de la séquence SEQ ED NO : 11, du fragment SEQ LD NO 32 issu de la séquence SEQ ED NO : 12, - le couple d'amorces permettant l'amplification d'un fragment correspondant à une région des loci BAGE représentés par les séquences SEQ ED NO : 1 à 12, contenant ledit site de restriction, est le suivant : amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ ED NO : 18) amorce 3' : ccttaggcagtgtagacgctg (SEQ ED NO : 20) ledit couple d'amorce permettant l'amplification du fragment SEQ ED NO 33 issu de la séquence SEQ ED NO : 1, du fragment SEQ LD NO 34 issu de la séquence SEQ ED NO : 2, du fragment SEQ LD NO 35 issu de la séquence SEQ ED NO : 3, du fragment SEQ ED NO 36 issu de la séquence SEQ ED NO : 4, du fragment SEQ ED NO 37 issu de la séquence SEQ ED NO : 5, du fragment SEQ LD NO 38 issu de la séquence SEQ ED NO : 6, du fragment SEQ ED NO 39 issu de la séquence SEQ ED NO : 7, du fragment SEQ LD NO 40 issu de la séquence SEQ LD NO : 8, du fragment SEQ ID NO 41 issu de la séquence SEQ LD NO : 9, du fragment SEQ LD NO 42 issu de la séquence SEQ ED NO : 10, du fragment SEQ LD NO 43 issu de la séquence SEQ LD NO : 11, du fragment SEQ ED NO 44 issu de la séquence SEQ ED NO : 12.
8. Séquences nucléotidiques SEQ LD NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences contenant au moins un doublet CpG.
9. Fragments des séquences nucléotidiques SEQ ED NO : 1 à 13 correspondants aux séquences SEQ ED NO : 21 à 44.
10. Séquences nucléotidiques correspondant aux séquences SEQ ED NO : 1 à 13, ou fragments de ces séquences selon la revendication 8, dans lesquelles les desoxycytidines n'appartenant pas à un doublet CpG sont remplacées par des desoxyuridines ou des desoxythymidines, et, le cas échéant, l'une au moins des desoxycytidines des doublets CpG est remplacée par un desoxyuridine ou une desoxythymidme.
11. Séquences nucléotidiques selon la revendication 8 ou 10, caractérisées en ce qu'aucune des desoxycytidines des doublets CpG n'est méthylée, ou en ce qu'au moins une jusqu'à la totalité des desoxycytidines des doublets CpG est méthylée.
12. Couples d'amorces pour l'amplification des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 11, choisis parmi les suivants : amorce 5' : tttagaggattaggagaagggggagt (SEQ ID NO : 14) amorce 3' : acctaccaattaacattattactaacatta (SEQ LD NO : 15) amorce 5' : gatggtggtggtaatagagatggt (SEQ ID NO : 16) amorce 3' : ccttaaacaatataaaccctaataa (SEQ ED NO : 17) amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ ED NO : 18) amorce 3' : acctaccctgccagctttc (SEQ LD NO : 19) amorce 5' : aggagaaggtgggga (SEQ LD NO : 18) amorce 3' : ccttaggcagtgtagacgctg (SEQ LD NO : 20)
13. Utilisation des loci BAGE correspondant aux séquences SEQ ED NO : 1 à 13, ou correspondant à des séquences apparentées aux séquences SEQ ED NO : 1 à 13 susmentionnées, ces séquences apparentées ayant une homologie d'au moins environ 90%», notamment de 99%, avec ces dernières, et comprenant au moins un doublet CpG, lesdites séquences apparentées étant susceptibles d'hybrider avec les séquences susmentionnées, notamment dans un tampon d'hybridation 5xSSPE à 55°C, en tant que marqueurs tumoraux dans le cadre de la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de cancers chez l'homme telle que définie dans l'une des revendications 1 à 7.
14. Utilisation selon la revendication 13 des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 8 à 11, ou des couples d'amorces selon la revendication 12, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 1 à 7.
15. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un couple d'amorces selon la revendication 12, et le cas échéant :
- les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification par PCR,
- du bisulfite de sodium,
- des enzymes de restriction telles que Mbol, Acll, ou HphI,
- un réactif de méthylation tel que M. SssI, - une courbe étalon correspondant à 0% jusqu'à 100% de méthylation de l'une au moins des séquences SEQ ID NO : 1 à 13, choisie en fonction du ou des couples d'amorces utilisés.
PCT/FR2004/001170 2003-05-13 2004-05-13 Utilisation des loci bage (b melanoma antigens) comme marqueurs tumoraux WO2004101822A2 (fr)

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