WO2004099219A2 - Composes silanyl-n alcanal, leur procede de preparation et leurs utilisations - Google Patents

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solid support
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Françoise Vinet
Gérard LANNEAU
Michel Granier
Franck Martin
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Commissariat A L'energie Atomique
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De Montpellier 2
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic System
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/0896—Compounds with a Si-H linkage
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to ⁇ -silanyl-n alkanals compounds, to their preparation process, to their use for the functionalization of solid supports, to the solid supports functionalized by these compounds, as well as to the use of solid supports as well functionalized for immobilization and / or synthesis of biological molecules of interest.
  • the synthetic scheme for grafting oligonucleotide molecules onto a solid support presupposes the pretreatment of surfaces (generally oxides or metals) with a coupling agent with a functional termination which is organized on the surface of the material.
  • SAMs Self-assembled monolayers
  • Self-Assembled Monolayers are defined as an assembly of molecules in which the molecules are organized, organization due to interactions between the chains of the molecules, giving rise to a stable anisotropic film, monomolecular and ordered (A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554). These self-assembled monolayers, which can be obtained in a reproducible manner (J.B. BROZSKA et al.
  • organosilicon compounds have therefore already been used as coupling agents for the functionalization of solid supports (LA CHRISEY et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039, U. MASKOS et al, Nucleic Acids Research, 1992 , 20, 1, 1679-1684) for the purpose of immobilizing or in situ synthesizing oligonucleotides.
  • the organosilicon coupling agents used in this work form inhomogeneous films and very little resistant to subsequent chemical treatments of synthesis or immobilization of oligonucleotides.
  • the formation of films with these coupling agents is not reproducible.
  • the properties of the silane coupling agent depend on the nature of the organic group R, but they mainly depend on the method of attachment to the surface by means of X functions.
  • the polyfunctional silanes of RSiX 3 and R 2 type SiX that is to say comprising three or two bonding functions, not only cling to the surface of the solid support but can also react with one another to form a crosslinked layer.
  • the monofunctional silanes of type R 3 SiX that is to say comprising only one hooking function, only hang individually on the substrate.
  • organosilanes RSiX 3 and R 3 SiX have been the most studied in the literature, both from an academic and industrial point of view, the first because they lead to the formation of a three-dimensional network and the second because they allow know the number of silanol sites present on the surface.
  • the functions generally studied are the Si-Ci, Si-OMe, Si-OEt bonds and a classic example of surface modification with a trichlorosilane is given in Scheme A below: step 1
  • the inventors have in fact set themselves the aim of improving the fixing qualities of the surfaces currently used to effect the immobilization of biological molecules of interest and their resistance over time, by controlling the attachment functions and have developed new silane-type compounds meeting this objective.
  • the present invention therefore relates to ⁇ -silanyl-n alkanals compounds, characterized in that they correspond to the following formula (I):
  • n represents an integer between 7 and 20 inclusive and preferably between 1 1 and 18 inclusive.
  • These compounds are characterized by the fact that they comprise a terminal aldehyde function allowing the direct grafting of any chemical or biological molecule comprising a terminal amine function unlike all the compounds of the silane type currently available which require either a modification step (of activation) of the terminal chemical function of the silane after the grafting step on the surface of a support, ie the presence of an intermediate molecule such as glutaraldehyde for example in order to allow grafting.
  • an intermediate molecule such as glutaraldehyde for example in order to allow grafting.
  • the synthesis of these compounds requires special conditions which are developed below and which allow the integrity of the aldehyde function to be preserved.
  • the inventors have demonstrated that the compounds of formula (I) in accordance with the invention make it possible to functionalize the surface of solid supports comprising hydroxyl functions, and this in a single step, and lead to the formation of self-assembled monolayers whose density is maximum, unlike SAMs formed from organosilanes known from the prior art, for example the compounds of formula R- (CH 3 ) 2 Si-X generally used. Indeed, if we compare the steric hindrance of different silanes, the presence of hydrogen atoms bonded to silicon leads to the minimum possible space between two silane chains, as we can see in Diagram B ci - after:
  • the subject of the invention is also the process for preparing the compounds of formula (I) as defined above, characterized in that:
  • n is a number between 7 and 20 inclusive in solution in an alcoholic solvent, with ethyl orthoformate, at reflux and in the presence of a catalyst to obtain a compound of formula (III) below:
  • the term "mild" reducing agent is understood to mean any reducing agent capable of reducing the ethoxy groups carried by the silicon atom, thereby reducing the methoxy groups present in the compound of formula (IV). It is the judicious choice of this particular reducing agent which allows the synthesis of the compounds of formula (I) which directly comprise a terminal aldehyde function.
  • certain weakly reducing agents such as sodium borohydride are not capable of reducing the ethoxy groups carried by the compounds of formula (IV) while more strongly reducing agents such as lithium trihydroaluminate not only lead to reduction ethoxy groups but also to that of the methoxy groups of the compounds of formula (IV) thus prohibiting the subsequent formation of the aldehyde function during the fourth step.
  • the intermediate compounds of formulas (II) to (V), and the final compound of formula (I) at the end of the synthesis are preferably washed, isolated and purified according to the methods conventionally used for this purpose. .
  • the organic solvents used during the first step are preferably chosen from lower alcohols such as methanol and ethanol.
  • the reaction is preferably carried out at the reflux temperature of the solvent and the duration of the reaction is generally between 8 and 16 hours.
  • the catalyst used during the first step is preferably para-toluenesulfonic acid used in a catalytic amount, that is to say at about 0.5%.
  • the catalyst used during the second step is preferably chosen from catalysts based on transition metal in homogeneous phase; Karstet's catalyst being particularly preferred.
  • the anhydrous solvent is preferably chosen from ethers and cyclic oxides; ethyl ether being particularly preferred.
  • the "mild" reducing agent is preferably lithium tetrahydroaluminate.
  • the organic solvent used during the fourth is preferably chosen from chlorinated solvents; chloroform being particularly preferred.
  • the oxidizing agent is preferably chosen from strong carboxylic or mineral acids; trifluoroacetic acid (TFA) being particularly preferred.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the compounds of formula (I) in accordance with the invention can be used to form a self-assembled monolayer organized on the surface of a solid support.
  • the subject of the present invention is also the use of at least one compound of formula (I) as described above to form, on the surface of a solid support comprising hydroxyl functions, a self-assembled organized monolayer.
  • SAMs can be carried out conventionally for a person skilled in the art by bringing at least one hydroxylated surface of a solid support into contact with a solution of at least one compound of formula (I) in accordance with l 'Invention in an organic solvent such as for example trichlorethylene at a temperature between 2 and 10 ° C for about 12 to 24 hours.
  • organic solvent such as for example trichlorethylene
  • the substrate is then rinsed with different solvents, preferably and successively with trichlorethylene, ethanol, chloroform, pentane, then dried, preferably with nitrogen.
  • the surfaces thus obtained directly present a large number of aldehyde functions making it possible to covalently immobilize biological molecules of interest comprising a complementary amine function, without the need for prior activation of the support.
  • the compounds grafted onto the support give rise to strong covalent bonds, of the siloxane type, with the surface and develop a strong cohesion between their alkyl chains, result of a self-assembly of the molecules which protects the siloxane bonds.
  • the grafting is reproducible and the aldehyde function of the grafted compounds has a high chemical reactivity.
  • the roughness of the surfaces, measured by atomic force microscopy (AFM), of the support treated by thermal oxidation and after covalent coupling of the compounds of formula (I) in accordance with the invention are respectively 0.8 ⁇ and 2.3 ⁇ , which indicates the deposition of a homogeneous layer.
  • the thickness of the layer measured by ellipsometry after grafting an SAM with a compound of formula (I) in which n 11 is 19.9 ⁇ 2.6 ⁇ (for a refractive index equal to 1.45), while the theoretical value for a Cn carbon chain orthogonal to the surface is 18.15 ⁇ .
  • the by-product of the grafting reaction of the compounds of formula (I) in accordance with the invention on the hydroxylated surface of a solid support is a release of hydrogen, easy to remove, unlike anionic entities or protic compounds which are inherent in the processes of the prior art using chlorosilanes or alkoxysilanes.
  • the grafting reaction leads to the substitution of a single Si-H bond, that is to say that the compound of formula (I) in accordance with the invention behaves like a monofunctional organosilane.
  • the activation of the Si-H bonds corresponds to the organization of the long alkyl chains in the vicinity of the surface, which can allow the transient formation of hypercoordinated species of silicon, of the type [R-SiH 4 ] " or [ R-SiH 5 ] 2 " , known to be more reactive than tetrahedral species.
  • IR-RTA makes it possible to identify the presence on the surface of only RSiH -O- entities, showing that there was only monofixation.
  • the present invention also relates to a solid support of which at least one surface is modified by an organized self-assembled monolayer, characterized in that said monolayer comprises a network of at least one compound of formula (I) as defined above.
  • network is understood to mean an assembly of molecules in which the molecules are organized and in which the chains of the molecules interact with one another by non-covalent bonds (Van der Waals forces for example).
  • All the solid supports comprising at least one hydrated surface can be functionalized with the compounds of formula (I) in accordance with the invention.
  • said solid support is such that its surface has, before being modified, hydroxyl groups. It is advantageously selected from the group consisting of glasses, oxide type ceramics and plastics.
  • said monolayer in addition to compounds of general formula (I) according to the present invention, can also comprise any other type of compound capable of being grafted onto the solid support (obtaining a so-called “mixed” monolayer) , which makes it possible to reduce the density of the compounds of formula (I) on the support, when such an effect is sought.
  • the solid supports whose surface is modified by a self-assembled monolayer organized according to the present invention can advantageously be used, as supports for the synthesis or the covalent immobilization of biological or chemical molecules of interest comprising an amino function.
  • biological or chemical molecules of interest comprising an amino function.
  • nucleic acids such as DNA and oligonucleotides, proteins, cellular ligands, therapeutic target molecules and combinatorial chemistry ligands.
  • the subject of the present invention is also the use of a solid support as described above for the synthesis or immobilization of molecules by covalent bond (formation of an amide bond).
  • the present invention also relates to a process for synthesizing molecules on a solid support as described above, characterized in that said molecules consist of a series of repeating units and in that said process comprises successive steps for grafting said repeating units, the first grafting repeating unit carrying an amine function reactive with respect to the aldehyde functions of the compounds of formula (I) in accordance with the invention present on the solid support.
  • the present invention further relates to a method of immobilizing biomolecules on a solid support as described above, characterized in that it comprises a step of grafting said biomolecules, which carry reactive amino functions vis- with respect to the aldehyde functions of the compounds of formula (I) in accordance with the invention, on said solid support.
  • the subject of the invention is also the solid supports as described above on which biological molecules are immobilized or chemically covalently via an amide function (nucleic acid chips, protein chips, cell ligand chips, etc.).
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to an example of preparation of a compound of formula (I) according to the invention, to an example for functionalizing the surface of a solid support using a compound of formula (I), to an example of the use of a support functionalized with a compound of formula (I) for the manufacture of a chip DNA, as well as in Figures 1 and 2 attached, in which: - Figure 1 shows the image of the fluorescence obtained on an epifluorescence microscope, after grafting of the 1 1 -silanyl-undecanal on the surface of a support silicon, an oligonucleotide (manually deposited) and hybridization with a complementary target;
  • FIG. 2 shows the image of the fluorescence obtained on a scanner, after grafting of the 1 1 -silanyl-undecanal on the surface of a silicon support, of an oligonucleotide (deposited in the robot) and hybridization with a complementary target.
  • the hydroxylation of a silicon substrate covered with a 5000 ⁇ thermal oxide layer is carried out in a 3.5 M sodium hydroxide solution for 2 hours.
  • a solid support is obtained in accordance with the invention comprising a surface modified by a self-assembled monolayer formed from 1 1 -silanyl-undecanal.
  • Example 2 the modified solid support prepared above is used in Example 2.
  • oligonucleotides of the following sequence: 3 'ATG TCA CAT GCC AAA TAG 5' (SEQ ID No. 1) modified in position 5 'by an amine function are carried out on the modified solid support of the example 2, either manually at the rate of 1.5 ⁇ l, or using a piezoelectric ejection robot sold under the name Nano-Plotter® by the company GeSiM (Germany), at the rate of 300 ⁇ l.
  • the oligonucleotide concentration of the solution used is 10 ⁇ M in a 0.3 M Na PO 4 buffer.
  • the substrates are hybridized with a solution of complementary targets of the following sequence: 3 ′ TAG AGT GTA CGG TTT ATC 5 ′ of concentration 0.1 ⁇ M, marked with a fluorescent group Cy3.

Abstract

La présente invention est relative à des composés ω-silanyl-n alcanals, à leur procédé de préparation, à leur utilisation pour la fonctionnalisation de supports solides, au supports solides fonctionnalisés par ces composés, ainsi qu'à l'utilisation des supports solides ainsi fonctionnalisés pour l'immobilisation et/ou la synthèse de molécules biologiques d'intérêt.

Description

COMPOSES SILANYL-n ALCANAL, LEUR PROCEDE DE PREPARATION
ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention est relative à des composés ω-silanyl-n alcanals, à leur procédé de préparation, à leur utilisation pour la fonctionnalisation de supports solides, au supports solides fonctionnalisés par ces composés, ainsi qu'à l'utilisation des supports solides ainsi fonctionnalisés pour l'immobilisation et/ou la synthèse de molécules biologiques d'intérêt.
Pour effectuer des synthèses chimiques ou immobiliser des molécules biologiques d'intérêt telles que des acides nucléiques, des protéines ou des ligands cellulaires à la surface d'un support solide (biopuces), il est tout d'abord nécessaire de greffer sur celle-ci des agents de couplage qui vont assurer la fixation des molécules organiques sur le support.
Les limitations les plus couramment évoquées dans l'élaboration et l'utilisation des biopuces, et en particulier des biopuces à ADN, sont l'accessibilité des fonctions d'accrochage et la perte de sélectivité, dues notamment à une évolution de l'interface organique/inorganique, que ce soit au moment de l'hybridation ou bien au cours des différentes étapes de rinçage, éventuellement lors du recyclage du microsupport.
Le schéma synthétique de greffage des molécules d'oligonucléotides sur support solide suppose le pré-traitement des surfaces (généralement des oxydes ou des métaux) par un agent de couplage à terminaison fonctionnelle qui vient s'organiser à la surface du matériau.
Les monocouches auto-assemblées (SAMs) (aussi appelées SAMs :
« Self-Assembled Monolayers ») sont définies comme un assemblage de molécules dans lequel les molécules sont organisées, organisation due à des interactions entre les chaînes des molécules, donnant lieu à un film anisotrope stable, monomoléculaire et ordonné (A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554). Ces monocouches autoassemblées, que l'on peut obtenir de façon reproductible (J.B. BROZSKA et al.
Langmuir, 1994, 10, 4367-4373), ont la particularité de former un film dense, homogène et résistant aux traitements chimiques (acide ou basique). Elles sont généralement obtenues à partir de thiols, d'acides carboxyliques ou de composés organosiliciés (encore appelés silanes organofonctionnels). Les silanes organofonctionnels sont des composés particulièrement bien adaptés pour modifier les surfaces de substrats siliciés. Par exemple, ils sont utilisés industriellement comme promoteurs d'adhésion (ou agents de couplage) en créant un pont moléculaire entre des polymères organiques et l'oxyde, conduisant aux matériaux composites.
Divers composés organosiliciés ont donc déjà été utilisés comme agents de couplage pour la fonctionnalisation de supports solides (L. A. CHRISEY et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039, U. MASKOS et al, Nucleic Acids Research, 1992, 20, 1, 1679-1684) dans le but d'immobiliser ou de synthétiser in situ des oligonucléotides. Toutefois, les agents de couplage organosiliciés utilisés dans ces travaux forment des films inhomogènes et très peu résistants aux traitements chimiques ultérieurs de synthèse ou d'immobilisation d'oligonucléotides. De plus, la formation des films avec ces agents de couplage n'est pas reproductible.
Les propriétés d'agent de couplage du silane sont fonction de la nature du groupement R organique, mais elles dépendent surtout du mode de fixation à la surface par l'intermédiaire de fonctions X. Ainsi, les silanes polyfonctionnels de type RSiX3 et R2SiX , c'est-à-dire comportant trois ou deux fonctions d'accrochage, s'accrochent non seulement à la surface du support solide mais peuvent également réagir entre eux pour former une couche réticulée. Par contre, les silanes monofonctionnels de type R3SiX c'est-à-dire ne comportant qu'une seule fonction d'accrochage, ne font que s'accrocher individuellement sur le substrat.
Les organosilanes RSiX3 et R3SiX ont été les plus étudiés dans la littérature, aussi bien du point de vue académique qu'industriel, les premiers parce qu'ils conduisent à la formation d'un réseau tridimensionnel et les deuxièmes car ils permettent de connaître le nombre de sites silanols présents en surface. Les fonctions généralement étudiées sont les liaisons Si-Ci, Si-OMe, Si-OEt et un exemple classique de modification de surface avec un trichlorosilane est donné sur le Schéma A ci-après : tape 1
Figure imgf000004_0001
- HCI
Etape 2
Etape 3
Figure imgf000004_0002
SCHEMA A
Cependant, l'utilisation de ces trichlorosilanes impose une étape supplémentaire, après greffage sur la surface, d'activation de la liaison libre pour permettre la réaction avec un groupement amino (NH2) d'une molécule biologique. A titre d'exemple, lorsque le silane greffé comporte une fonction époxyde terminale, celle-ci doit être ensuite être activée selon un procédé mettant en œuvre deux étapes (une étape d'ouverture du cycle époxyde par hydrolyse, suivie d'une étape d'oxydation), afin de conduire à la fonction aldéhyde réactive correspondante.
La réalisation d'étapes supplémentaires d'activation des fonctions terminales des silanes afin de permettre la fixation subséquente de façon covalente de molécules biologiques portant une fonction complémentaire n'est cependant pas toujours acceptable d'un point de vue industriel et peut avoir des conséquences négatives sur la qualité du support finalement obtenu (perte de sélectivité due notamment à une évolution de l'interface organique/inorganique, mauvaise répartition des fonctions d'accrochage, etc .). C'est donc afin de remédier à l'ensemble de ces problèmes que les
Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'invention.
Les Inventeurs se sont en effet fixés pour but d'améliorer les qualités de fixation des surfaces actuellement utilisées pour effectuer l'immobilisation de molécules biologiques d'intérêt et leur tenue dans le temps, en contrôlant les fonctions d'accrochage et ont mis au point de nouveaux composés de type silanes répondant à cet objectif.
La présente invention a donc pour objet des composés ω-silanyl-n alcanals, caractérisés par le fait qu'ils répondent à la formule (I) suivante :
CH(O)-CnH2n-SiH3 (I) dans laquelle n représente un nombre entier compris entre 7 et 20 inclusivement et de préférence entre 1 1 et 18 inclusivement.
Ces composés se caractérisent par le fait qu'ils comportent une fonction aldéhyde terminale permettant le greffage direct de toute molécule chimique ou biologique comportant une fonction aminé terminale contrairement à tous les composés de type silanes actuellement disponibles qui requièrent soit une étape de modification (d'activation) de la fonction chimique terminale du silane après l'étape de greffage sur la surface d'un support soit la présence d'une molécule intermédiaire telle que du glutaraldéhyde par exemple afin de permettre le greffage. De plus, la synthèse de ces composés nécessite des conditions particulières qui sont développées ci-après et qui permettent de conserver l'intégrité de la fonction aldéhyde.
Par ailleurs, les Inventeurs ont démontré que les composés de formule (I) conformes à l'Invention permettent de fonctionnaliser la surface de supports solides comportant des fonctions hydroxyle, et ce en une seule étape, et conduisent à la formation de monocouches auto-assemblées dont la densité est maximale, contrairement aux SAMs formées à partir des organosilanes connus de l'art antérieur comme par exemples les composés de formule R-(CH3)2Si-X généralement utilisés. En effet, si l'on compare l'encombrement stérique de différents silanes, la présence d'atomes d'hydrogène liés au silicium conduit à l'espace minimal possible entre deux chaînes de silanes, comme on peut le voir sur le Schéma B ci- après :
Figure imgf000006_0001
conforme à l'Invention SCHEMA B
Parmi les composés de formule (I) conformes à l'Invention, on peut en particulier citer le 8-silanyl-octanal, le 9-silanyl-nonanal, le 10-silanyl-décanal, le 11 -silanyl-undécanal, le 12-silanyl-dodécanal, le 13-silanyl-tridécanal, le 14-silanyl- tetradécanal, le 15-silanyl-pentadécanal, le 16-silanyl-hexadécanal, le 17-silanyl- heptadécanal, le 18-silanyl-octadécanal, le 19-silanyl-nonadécanal et le 20-silanyl- dodécanal ; le 1 1 -silanyl-undécanal et le 18-silanyl-octadécanal étant particulièrement préférés.
L'invention a également pour objet le procédé de préparation des composés de formule (I) telle que définie ci-dessus, caractérisé par le fait que :
(i) dans une première étape, on fait réagir un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000006_0002
dans laquelle n est nombre compris entre 7 et 20 inclusivement en solution dans un solvant alcoolique, avec de l'orthoformiate d'éthyle, au reflux et en présence d'un catalyseur pour obtenir un composé de formule (III) suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle n a la même signification que celle indiquée ci-dessus pour le composé de formule (II) ; ii) dans une deuxième étape, on fait réagir le composé de formule (III) obtenu à la première étape, en solution dans du triéthoxysilane en présence d'un catalyseur, pour obtenir un composé de formule (IV) suivante :
Figure imgf000007_0002
dans laquelle n a la même signification que celle indiquée ci-dessus pour le composé de formule (III) ; iii) dans une troisième étape, on réduit uniquement les groupes éthoxy portés par le composé de formule (IV) ci-dessus, en solution dans un solvant anhydre et en présence d'un agent réducteur doux, pour obtenir un composé de formule (V) suivante :
Figure imgf000007_0003
dans laquelle n a la même signification que celle indiquée ci-dessus pour le composé de formule (IV) ; iv) puis dans une quatrième étape à oxyder le composé de formule (V) ci-dessus, en solution dans un solvant organique et en présence d'un agent oxydant, pour obtenir le composé de formule (I) correspondant. Selon l'Invention, on entend par agent réducteur "doux", tout agent réducteur capable de réduire les groupements éthoxy portés par l'atome de silicium dans pour autant réduire les groupements méthoxy présents dans le composé de formule (IV). C'est le choix judicieux de cet agent réducteur particulier qui permet la synthèse des composés de formule (I) qui comportent directement une fonction aldéhyde terminale. En effet, certains agents faiblement réducteurs tels que le borohydrure de sodium ne sont pas capables de réduire les groupes éthoxy portés par les composés de formule (IV) alors que des agents plus fortement réducteurs tels que le trihydroaluminate de lithium conduisent non seulement à la réduction des groupes éthoxy mais également à celle des groupes méthoxy des composés de formule (IV) interdisant ainsi la formation ultérieure de la fonction aldéhyde lors de la quatrième étape.
A chaque étape de ce procédé, les composés intermédiaires de formules (II) à (V), et le composé final de formule (I) en fin de synthèse, sont de préférence lavés, isolés et purifiés selon les méthodes classiquement utilisées à cet effet.
Les solvants organiques utilisés au cours de la première étape sont de préférence choisis parmi les alcools inférieurs tels que le méthanol et l'éthanol. La réaction est de préférence conduite, à la température de reflux du solvant et la durée de la réaction est généralement comprise entre 8 et 16 heures. Le catalyseur utilisé lors de la première étape est de préférence de l'acide para-toluènesulfonique utilisé en quantité catalytique, c'est à dire à environ 0,5 %.
Le catalyseur utilisé lors de la deuxième étape est de préférence choisi parmi les catalyseurs à base de métaux de transitions en phase homogène ; le catalyseur de Karstet étant particulièrement préféré.
Lors de la troisième étape le solvant anhydre est de préférence choisi parmi les éthers et les oxydes cycliques ; l'éther éthylique étant particulièrement préféré. L'agent réducteur "doux" est de préférence du tetrahydroaluminate de lithium.
Le solvant organique utilisé lors de la quatrième est de préférence choisi parmi les solvants chlorés ; le chloroforme étant particulièrement préféré. L'agent oxydant est de préférence choisi parmi les acides forts carboxyliques ou minéraux ; l'acide trifluoroacétique (TFA) étant particulièrement préféré. Les composés de formule (I) conformes à l'Invention peuvent être utilisés pour former une monocouche autoassemblée organisée à la surface d'un support solide.
Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé de formule (I) telle que décrite ci-dessus pour former, à la surface d'un support solide comportant des fonctions hydroxyle, une monocouche autoassemblée organisée.
L'utilisation des composés de formule (I) permet avantageusement de modifier la surface de supports solides par une monocouche de densité maximale et organisée, qui répond à la définition des SAMs donnée précédemment.
La réalisation de ces SAMs peut être effectuée de façon classique pour l'homme du métier par mise en contact d'au moins une surface hydroxylée d'un support solide avec une solution d'au moins un composé de formule (I) conforme à l'Invention dans un solvant organique tel que par exemple du trichloroéthylène à une température comprise entre 2 et 10°C environ pendant 12 à 24 heures environ. Le substrat est ensuite rincé avec différents solvants, de préférence et successivement avec du trichloroéthylène, de l'éthanol, du chloroforme, du pentane, puis séché, de préférence à l'azote.
Ces deux caractéristiques, à savoir un minimum d'étapes chimiques pour la fonctionnalisation de la surface et l'obtention d'une monocouche autoassemblée de densité maximale, permettent de s'affranchir des problèmes de reproductibilité des procédés couramment utilisés.
Par ailleurs, les surfaces ainsi obtenues présentent directement un grand nombre de fonctions aldéhyde permettant d'immobiliser de façon covalente des molécules biologiques d'intérêt comportant une fonction aminé complémentaire, et ce sans qu'il ne soit nécessaire de procéder à une activation préalable du support. Les composés greffés sur le support donnent lieu à des liaisons covalentes fortes, de type siloxanique, avec la surface et développent une forte cohésion entre leurs chaînes alkyles, résultat d'un autoassemblage des molécules qui protège les liaisons siloxaniques. En outre, le greffage est reproductible et la fonction aldéhyde des composés greffés présente une grande réactivité chimique. Les rugosités des surfaces, mesurée par microscopie à force atomique (AFM), du support traité par oxydation thermique et après couplage covalent des composés de formule (I) conformes à l'Invention sont respectivement de 0,8 Â et 2,3 Â, ce qui indique le dépôt d'une couche homogène. A titre d'exemple, l'épaisseur de la couche mesurée par ellipsométrie après greffage d'une SAM avec un composé de formule (I) dans lequel n = 11 est de 19,9 ± 2,6 Â (pour un indice de réfraction égal à 1,45), alors que la valeur théorique pour une chaîne carbonée en Cn, orthogonale à la surface est de 18,15 Â.
Par ailleurs, le sous-produit de la réaction de greffage des composés de formule (I) conformes à l'Invention sur la surface hydroxylée d'un support solide est un dégagement d'hydrogène, facile à éliminer, contrairement aux entités anioniques ou aux composés protiques qui sont inhérents aux procédés de l'art antérieur utilisant les chlorosilanes ou les alcoxysilanes. La réaction de greffage conduit à la substitution d'une seule liaison Si-H, c'est-à-dire que le composé de formule (I) conforme à l'Invention se comporte comme un organosilane monofonctionnel. Dans le cas présent, Vactivation des liaisons Si-H correspond à l'organisation des longues chaînes alkyle au voisinage de la surface, qui peut permettre la formation transitoire d'espèces hypercoordonnées du silicium, du type [R-SiH4]" ou [R-SiH5]2", connues pour être plus réactives que les espèces tétraédriques. L'analyse spectroscopique infrarouge en réflexion totale atténuée
(IR-RTA), permet en effet d'identifier la présence en surface des seules entités RSiH -O-, montrant bien qu'il n'y a eu que monofixation.
La présente Invention a également pour objet un support solide dont au moins une surface est modifiée par une monocouche autoassemblée organisée, caractérisé en ce que ladite monocouche comprend un réseau d'au moins un composé de formule (I) telle que définie précédemment.
Au sens de la présente invention, on entend par « réseau » un assemblage de molécules dans lequel les molécules sont organisées et dans lequel les chaînes des molécules interagissent entre elles par des liaisons non covalentes (forces de Van der Waals par exemple).
Tous les supports solides comportant au moins une surface hydratée peuvent être fonctionnalisés par les composés de formule (I) conformes à l'Invention. De préférence, ledit support solide est tel que sa surface présente, avant d'être modifiée, des groupements hydroxyles. Il est avantageusement sélectionné dans le groupe constitué par les verres, les céramiques de type oxyde et les plastiques.
Il est bien entendu que ladite monocouche, outre des composés de formule générale (I) selon la présente invention, peut également comprendre tout autre type de composé capable d'être greffé sur le support solide (obtention d'une monocouche dite « mixte »), ce qui permet de diminuer la densité des composés de formule (I) sur le support, lorsqu'un tel effet est recherché.
Les supports solides dont la surface est modifiée par une monocouche autoassemblée organisée selon la présente invention peuvent avantageusement être utilisés, en tant que supports pour la synthèse ou l'immobilisation covalente de molécules biologiques ou chimiques d'intérêt comportant une fonction aminé. Parmi de telles molécules on peut par exemple citer les acides nucléiques tels que l'ADN et les oligonucléotides, les protéines, les ligands cellulaires, les molécules cibles thérapeutiques et les ligands de chimie combinatoire.
Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un support solide tel que décrit ci-avant pour la synthèse ou l'immobilisation de molécules par liaison covalente (formation d'une liaison amide).
La présente invention a également pour objet un procédé de synthèse de molécules sur un support solide tel que décrit ci-avant, caractérisé en ce que lesdites molécules sont constituées d'un enchaînement d'unités répétitives et en ce que ledit procédé comprend des étapes successives de greffage desdites unités répétitives, la première unité répétitive greffée portant une fonction aminé réactive vis-à-vis des fonctions aldéhyde des composés de formule (I) conforme à l'Invention présents sur le support solide.
La présente invention a, en outre, pour objet un procédé d'immobilisation de biomolécules sur un support solide tel que décrit ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de greffage desdites biomolécules, qui portent des fonctions aminé réactives vis-à-vis des fonctions aldéhyde des composés de formule (I) conforme à l'Invention, sur ledit support solide.
Enfin, l'invention a également pour objet les supports solides tels que décrits précédemment sur lesquels sont immobilisées des molécules biologiques ou chimiques de façon covalente par l'intermédiaire d'une fonction amide (puces à acides nucléiques, puces à protéines, puces à ligands cellulaires, etc .).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de préparation d'un composé de formule (I) conforme à l'invention, à un exemple de fonctionnalisation de la surface d'un support solide à l'aide d'un composé de formule (I), à un exemple d'utilisation d'un support fonctionnalisé par un composé de formule (I) pour la fabrication d'une puce à ADN, ainsi qu'aux figures 1 et 2 annexées, dans lesquelles : - la figure 1 représente l'image de la fluorescence obtenue sur un microscope à épifluorescence, après greffage du 1 1 -silanyl-undécanal sur la surface d'un support silicié, d'un oligonucléotide (déposé manuellement) et hybridation avec une cible complémentaire ;
- la figure 2 représente l'image de la fluorescence obtenue sur un scanner, après greffage du 1 1 -silanyl-undécanal sur la surface d'un support silicié, d'un oligonucléotide (déposé au robot) et hybridation avec une cible complémentaire.
Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : PRÉPARATION DU 11 -SILANYL-UNDECANAL (10)
1 ) Première étape : Synthèse du 1 1.11 -diméthoxy-undéc- 1 -ène (7)
Figure imgf000012_0001
A une solution de 30,05 g d'undécénal à 97 % (37,10 ml ; 173 mmoles) dissous dans 500 ml de méthanol, est additionné 37,78 g d'orthoformiate d'éthyle (13,09 ml ; 356 mmoles ; 2 éq.) et 1,691 g d'acide para-toluènesulfonique (quantité catalytique : 8,9 mmoles ; 0,051 éq.). La réaction se déroule en 12 heures et au reflux du méthanol. Après addition de 500 ml de dichlorométhane, le mélange réactionnel est lavé successivement avec une solution de carbonate de sodium à 1 % (deux fois) et avec une solution de chlorure de sodium saturée, séché sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentré pour donner 36,39 g d'un liquide brun avec un rendement de 97%.
L'analyse RMN du produit obtenu, conforme à celle du produit attendu, était la suivante : δH (200 MHz ; CDC13) : 1,31 (12H ; m ; H4"9) ; 1,59 (2H ; m; H10) 2,06 (2H ; m ; H3) ; 3,21 (6H ; s ; H12+13) ; 4,38 (1H ; t ; H11; 3JH-H 5,7 Hz) ; 4,98 (2H m ; H1) ; 5,81 (1H ; m ; H2) ; δc (200 MHz ; CDC13) : 24,97 ; 29,30 ; 29,48; 29,76 29,84 ; 29,87 ; 32,87 ; 34,18 ; 52,91 (CI2+13) ; 104,94 (C11) ; 114,48 (C1) ; 139,54 (C2) ; m/z (NBA) : 213 [M-H]+.
2) Deuxième étape : Synthèse du 11 ,1 1-diméthoxy-undécyl-triéthoxysilane (8)
Figure imgf000013_0001
36,39 g de 1 1,11-diméthoxy-undéc-l-ène (7) obtenu ci-dessus à la première étape (170 mmoles) est dissous avec 31,025 g de triéthoxysilane à 97 % (34,86 ml ; 183 mmoles ; 1 ,08 éq.). On additionne ensuite très lentement 0,424 g (0,45 mmole ; 0,0026 éq.) de catalyseur de Karstedt. Après 3 heures d'agitation à température ambiante, le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner 41,88 g d'un liquide incolore (rendement de 65%) fondant à une température de 1 15°- 120°C (à une pression de 10"2mm de mercure).
L'analyse RMN du produit obtenu, conforme à celle du produit attendu, était la suivante : δH (200 MHz; CDC13) : 0,59 (2H ; m ; H13) ; 1,19 (9H ; t ; H15 ; 3JH.H 7 Hz) ; 1,22 (16H ; m ; H5"12) ; 1,53 (2H ; m ; H4) ; 3,27 (6H ; s ; H1+2) ; 3,76 (6H ; q ; H14; 3JH-H 7 Hz), 4,32 (1H ; t ; H3 ; 3JH-H 5,7 Hz) ; δc (200MHz ; CDC13) : 10,70 (C13) ; 18,60 (C15) ; 23,08 ; 24,93 ; 29,56 ; 29,82 ; 29,88 ; 32,80 ; 33,49 ; 33,49 ; 52,79 (C,+2) ; 58,56 (C14) ; 104,86 (C3) ; δsi (200 MHz ; CDC13) - 44,23. mlz (NBA) 377
[M-H]+. 3) Troisième étape : Synthèse du 1 1,1 1-diméthoxy-undécyl-silane (9)
Figure imgf000014_0001
A une solution de 4,22 g de tetrahydroaluminate de lithium (1 1 1 mmoles ; 2 éq.) mélangé avec 500 ml d'éther éthylique anhydre et refroidi à 0°C, est additionné lentement une solution de 21,016 g du composé (8) obtenu ci-dessus à l'étape précédente (55,6 mmoles) dissous dans 500 ml d'éther anhydre. La réaction de réduction se déroule en 48 heures, à température ambiante et sous argon. Le mélange réactiormel est filtré sur célite puis évaporé et repris au dichlorométhane. Ensuite, la phase organique est lavée successivement avec une solution d'acide chlorhydrique IN (deux fois) et avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentrée. Le brut réactiormel est purifié par distillation pour donner 16,147 g d'un liquide incolore (rendement 60 %) fondant à une température de 60°-65°C (à une pression de 10"2 mm de mercure).
Les analyses RMN et IR du produit obtenu, conformes à celles du produit attendu, étaient les suivantes :
RMN : δH (200 MHz ; CDC13) : 0,78 (2H ; m ; H13) ; 1,30 (16H ; m ; H5-12) ; 1,64 (2H ; m ; H4) ; 3,36 (6H ; s ; H1+2) ; 3,51 (3H ; t ; H14, 3JH-H 3,9 Hz) ; 4,39 (1H ; t ; H3; 3JH-H 5,7 Hz) ; δc (200 MHz; CDC13) : 6,28 (C13) ; 24,98 ; 26,73 ; 29,62; 29,85; 29,92 ; 29,98 ; 32,83 ; 32,86; 52,81 (C1+2) ; 104,87 (C3) ; δsi (200 MHz; CDC13) : -58,93 ;
IR : 1056,7 et 1 125,7 (CO) ; 2149,2 (SiH3) ; 2854 (CH2s) ; 2924 (CH2as) ; m/z (NBA) : 245 [M - H]+. 4) Quatrième étape : Synthèse du 11 -silanyl-undécanal (10)
Figure imgf000014_0002
A une solution de 13,106 g de 1 1,1 1-diméthoxy-undécyl-silane (9) obtenu ci-dessus à l'étape précédente (53,3 mmoles) dissous dans 50 ml de chloroforme, est additionné 14,8 g d'acide trifluoroacétique (130 mmoles ; 10 ml). La réaction d'oxydation se déroule en 12 heures et à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé et repris à l'éther. La phase organique est alors lavée successivement avec une solution de carbonate de sodium (deux fois), avec une solution d'eau permutée (deux fois) et avec une solution de chlorure de sodium saturée, séchée sur du sulfate de magnésium anhydre puis concentrée. Le brut réactionnel est purifié par distillation pour donner 7,036 g d'un liquide incolore (rendement 66%) fondant à une température de 60°-65°C (à une pression de 7,5.10"' mm de mercure).
Les analyses RMN et IR du produit obtenu, conformes à celles du produit attendu, étaient les suivantes :
RMN : δH (200 MHz ; CDC13) : 0,73 (2H ; m ; H1) ; 1 ,27 (16H ; m ; H4-10) ; 1,61 (2H ; m ; H3) ; 2,41 (2H ; td ; H2 3JH-HI 3,9 Hz ; 3JH-Hι 7,4 Hz) ; 3,47 (3H ; t ; H12, 3JH-H 3,9 Hz) ; 9,75 (1H; t ; H1 ; 3JH-H 1,9 Hz) ; δc (200 MHz ; CDC13) : 6,30
(C1 1) ; 22,47 ; 26,73 ; 29,60 ; 29,63 ; 29,88 ; 29,94 ; 32,85 ; 32,87 ; 44,30 (C2) ; 203,33
(C1) ; δsi (200 MHz ; CDC13) : -58,97 ;
IR : 1728 (C=O) ; 2149 (SiH3); 2714 (CHO) ; 2854 (CH2s) ; 2924 (CH2as) ; m/z (NBA) 199 [M - H]+.
EXEMPLE 2 : PREPARATION D'UN SUPPORT SOLIDE COMPORTANT UNE SURFACE MODIFIEE PAR UNE MONOCOUCHE AUTOASSEMBLEE DE COMPOSES DE FORMULE (I)
Dans cet exemple on utilise, à titre de composé de formule (I), le 1 1 -silanyl-undécanal préparé ci-dessus à l'exemple 1.
On réalise l'hydroxylation d'un substrat de silicium recouvert d'une couche d'oxyde thermique de 5000 Â dans une solution de soude 3,5 M pendant 2 heures.
Le support est ensuite mis en présence d'une solution de 1 1 -silanyl- undécanal à 10 mM dans du trichloroéthylène à une température de 4°C pendant 24 heures. Le support est ensuite rincé successivement avec du trichloroéthylène, de l'éthanol, du chloroforme, du pentane, puis séché à l'azote. On obtient un support solide conforme à l'Invention comportant une surface modifiée par une monocouche autoassemblée formée de 1 1 -silanyl-undécanal. EXEMPLE 3 : PREPARATION D'UNE PUCE A ADN
Dans cet exemple, on utilise le support solide modifié préparé ci- dessus à l'exemple 2.
Des dépôts d'une solution d'oligonucléotides de séquence suivante : 3' ATG TCA CAT GCC AAA TAG 5' (SEQ ID n°l) modifiés en position 5' par une fonction aminé sont effectués sur le support solide modifié de l'exemple 2, soit manuellement à raison de 1,5 μl, soit à l'aide d'un robot à éjection piézoélectrique vendu sous la dénomination Nano-Plotter ® par la société GeSiM (Allemagne), à raison de 300 pi. La concentration en oligonucléotides de la solution utilisée est de 10 μM dans un tampon Na PO4 à 0,3 M.
Après un temps d'incubation de 24 heures, les substrats sont hybrides avec une solution de cibles complémentaires de séquence suivante : 3' TAG AGT GTA CGG TTT ATC 5' de concentration 0,1 μM, marquées par un groupement fluorescent Cy3.
Les signaux de fluorescence obtenus sur un microscope à épifluorescence vendu sous la dénomination par la société Olympus Inc. (USA) et sur un scanner vendu sous la dénomination GenePix® par la société Axon sont présentés respectivement sur les figures 1 et 2 annexées.
Ces résultats montrent que les supports modifiés par une monocouche autoassemblée de composés de formule (I) conformes à l'Invention permettent de réaliser l'immobilisation de molécules comportant une fonction aminé complémentaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composés ω-silanyl-n alcanals caractérisés par le fait qu'ils répondent à la formule (I) suivante : CH(O)-CnH2n-SiH3 (I) dans laquelle n représente un nombre entier compris entre 7 et 20 inclusivement.
2. Composés selon la revendication 1 , caractérisés par le fait que n est compris entre 1 1 et 18 inclusivement.
3. Composés selon la revendication 1, caractérisés par le fait qu'ils sont choisis parmi le 8-silanyl-octanal, le 9-silanyl-nonanal, le 10-silanyl-décanal, le 11 -silanyl-undécanal, le 12-silanyl-dodécanal, le 13-silanyl-tridécanal, le 14-silanyl- tetradécanal, le 15-silanyl-pentadécanal, le 16-silanyl-hexadécanal, le 17-silanyl- heptadécanal, le 18-silanyl-octadécanal, le 19-silanyl-nonadécanal et le 20-silanyl- dodécanal.
4. Procédé de préparation des composés de formule (I) tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que :
(i) dans une première étape, on fait réagir un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle n est nombre compris entre 7 et 20 inclusivement, en solution dans un solvant alcoolique, avec de l'orthoformiate d'éthyle, au reflux et en présence d'un catalyseur pour obtenir un composé de formule (III) suivante :
Figure imgf000017_0002
dans laquelle n a la même signification que celle indiquée ci-dessus pour le composé de formule (II) ; ii) dans une deuxième étape, on fait réagir le composé de formule (III) obtenu à la première étape en solution dans du triéthoxysilane en présence d'un catalyseur, pour obtenir un composé de formule (IV) suivante :
Figure imgf000018_0001
dans laquelle n a la même signification que celle indiquée ci-dessus pour le composé de formule (III) ; iii) dans une troisième étape, on réduit uniquement les groupes éthoxy porté par le composé de formule (IV) ci-dessus, en solution dans un solvant anhydre et en présence d'un agent réducteur doux, pour obtenir un composé de formule (V) suivante :
Figure imgf000018_0002
dans laquelle n a la même signification que celle indiquée ci-dessus pour le composé de formule (IV) ; iv) puis dans une quatrième étape à oxyder le composé de formule (V) ci-dessus, en solution dans un solvant organique et en présence d'un agent oxydant, pour obtenir le composé de formule (I) correspondant.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l'agent réducteur doux utilisé au cours de la troisième étape est du tetrahydroaluminate de lithium.
6. Utilisation d'au moins un composé de formule (I) telle que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour former, à la surface d'un support solide comportant des fonctions hydroxyle, une monocouche autoassemblée organisée.
7. Support solide dont au moins une surface est modifiée par une monocouche autoassemblée organisée, caractérisé en ce que ladite monocouche comprend un réseau d'au moins un composé de formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3.
8. Support solide selon la revendication 7, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les verres, les céramiques de type oxyde et les plastiques.
9. Utilisation d'un support solide tel que défini à la revendication 7 ou 8, pour la synthèse ou l'immobilisation par liaison covalente de molécules biologiques ou chimiques d'intérêt comportant une fonction aminé.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée par le fait que lesdites molécules sont choisies parmi les acides nucléiques, les protéines, les ligands cellulaires, les molécules cibles thérapeutiques et les ligands de chimie combinatoire.
1 1. Procédé de synthèse de molécules sur un support solide tel que défini à la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que lesdites molécules sont constituées d'un enchaînement d'unités répétitives et en ce que ledit procédé comprend des étapes successives de greffage desdites unités répétitives, la première unité répétitive greffée portant une fonction aminé réactive vis-à-vis des fonctions aldéhyde des composés de formule (I) présents sur le support solide et tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3.
12. Procédé d'immobilisation de biomolécules sur un support solide tel que défini à la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de greffage desdites biomolécules, qui portent des fonctions aminé réactives vis-à-vis des fonctions aldéhyde des composés de formule (I) tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3, sur ledit support solide.
13. Support solide tel que défini à la revendication 7 ou 8, sur lequel sont immobilisées des molécules biologiques ou chimiques de façon covalente par l'intermédiaire d'une fonction amide.
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