WO2004097425A9 - Metodo para seleccionar agonistas y antagonistas de quimioquinas - Google Patents

Metodo para seleccionar agonistas y antagonistas de quimioquinas

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WO2004097425A9
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Frade Jose Miguel Rodriguez
Alonso Carlos Martinez
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Mario Mellado
Frade Jose Miguel Rodriguez
Alonso Carlos Martinez
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors

Definitions

  • the present invention relates generally to the diagnosis and treatment of diseases and conditions of human beings and others. animals in which the disease or condition is mediated by signal transduction pathways activated by chemokine receptors.
  • BACKGROUND Immune system cells communicate with each other to initiate, establish and maintain immune responses. This communication occurs through cell-to-cell contact or through a variety of intracellular mediators, including cytokines, chemokines and growth factors. In all cases, signal transduction is initiated by complex protein-protein interactions between these ligands and their receptors in the plasma membrane.
  • the cytokine receptor superfamily is associated with and mediates ligand-dependent activation of members of the Janus family of protein tyrosine kinases (JAK) (O'Shea et al., 2002).
  • the JAK family has four known members (JAK1, JAK2, JAK3 and Tyk2) that are activated differently in response to different cytokines.
  • JAKs are constitutively associated with many cytokine receptors. However, in some cases, the association is enhanced by cytokine stimulation. Binding of a ligand to its receptor rapidly activates the associated JAKs, leading to receptor tyrosine phosphorylation and subsequent generation of coupling sites for other molecules, including STAT transcription factors and other molecules such as PLC ⁇ l
  • PLC ⁇ 2 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) or PLC ⁇ 2 (Wang et al., 2000).
  • the activation of PLC ⁇ is involved in cytokine-mediated stimulation and growth factors of phosphoinositol metabolism and calcium release from intracellular deposits. This procedure is produced by recruitment of PLC ⁇ into the activated receptor in a manner facilitated by the product of phosphatidylinositide-S'-OH-kinase (PI3K), phosphatidylinositol- (3,4,5) -triphosphate (Ptdlns ( 3,4,5) P3) (Venema et al., 1988).
  • PI3K phosphatidylinositide-S'-OH-kinase
  • Ptdlns 3,4,5
  • Chemokines are chemotactic cytokines that are released by a wide variety of cells to attract macrophages, T cells, eosinophils, basophils and neutrophils to the sites of inflammation (reviewed by Schall, Cytokine, 3, 165-183 (1991) and Murphy, Rev Immun., 12, 593-633 (1994)
  • CXC interleukin-8
  • NAP-2 neutrophil activating protein 2
  • MGSA melanoma growth stimulating activity protein
  • chemokines ⁇ such as RANTES, ivllP-1. ⁇ , IVIIP-1. ⁇ , monocyte chemotactic protein 1 ( ⁇ ViCP-1), tvlCP-2, ⁇ W1GP-3
  • Chemokines bind to specific cell surface receptors that belong to the family of G-protein coupled proteins characterized by seven transmembrane domains (reviewed by Horuk, Trends Pharm. Sci., 15, 159-165 (1994)), called “chemokine receptors". There are at least sixteen human chemokine receptors that bind or respond to chemokines with the following characteristic model: CCR-1 (or "CKR-1” or "CC-CKR-1”) [MIP-1 ⁇ , MIP-1 ⁇ , MCP -3, RANTES, MCP-1, HCC-1, HCC-4] (Ben-Barruch, et al., J. Biol.
  • CCR-5 or "CKR-5" or "CC-CKR-5" [MDC, TARC] (Samson, et al., Biochemistry, 35, 3362- 3367 (1996)); CCR-6 (LARC), MIP-3 ⁇ ; CCR-7 (GC-Quina, MIP-3 ⁇ ); CCR-8 (I-309, LEC); CCR-9 (TECK); CCR- 10 (CTAK); CCR-11 (ELC, SLC, TECK); CXCR-1 (NAP-2, GCP-2, IL-8); CXCR-2 (GRO ⁇ , GRO ⁇ , GRO ⁇ , ENA-78, NAP-2 , IL-8, GCP-2); CXCR-3 (MIG, IP-10, l-TAC); CXCR-4 (SDF-1 ⁇ SDF-1 ⁇ ); CXCR-5 (BLC), CXCR-6 (CXCL- 16); XCR1 (SCM-1 ⁇ , SCM-1 ⁇ ); CX3CR1 (frac
  • Chemokines signal through G-protein coupled receptors characterized by seven transmembrane domains (GPCR) (Thellen, 2001) that transduce signals to a prote .
  • GPCR G-protein coupled receptors characterized by seven transmembrane domains
  • Na Gj has been described G ⁇ association with several chemokine receptors (Damaj et to the., 1996; Vila-Coro et al., 1999). Most responses to chemokines are inhibited by pertussis toxin (PTx).
  • PTx does not block the calcium response in many cases, and other PTx-insensitive G proteins can bind to chemokine receptors; This indicates that there can be no G ⁇ proteins involved in chemokine signaling (Arai and Charo, 1996).
  • chemokines can also induce the association of JAK with the chemokine receptor even after treatment with PTx, while no association of G ⁇ is observed when cells are treated with AG-490, a JAK inhibitor (Mellado et al., 1998). Both PTx and AG-490 treatment cancel receptor signaling, including migration and Ca2 + flow, suggesting that JAK plays an important role in chemokine responses (Mellado et al., 1998).
  • chemokine signaling integrates several molecules classically related to GPCR, with others activated by cytokines, but that retain specific signaling characteristics.
  • the activation of this signaling route through the GPCR raises some questions.
  • the classic view of the activation of JAK / STAT by cytokine receptors requires the presence of two JAKs that are close, so that they can be activated by transfosphorylation (Liu et al., 1998). In the case of cytokine receptors, this is achieved by dimerization of the receptors that have been constitutively associated with JAK.
  • chemokines dimerization also occurs in the case of chemokines; dimerization of chemokine receptors was first demonstrated for CCR2 using different experimental approaches that included the use of agonist monoclonal antibodies, labeled receptors, mutant receptors and energy transfer tests. This was then generalized to other chemokine receptors (such as CCR5 and CXCR4). Physiologically, chemokines do not act in isolation. Rather, during inflammation or homeostasis, several chemokines coexist and influence the cells. Recently it has been observed that simultaneous stimulation with CCL2 and CCL5 induces the formation of the CCR2-CCR5 heterodimer. The heterodimer chemokine receptor also has exceptional characteristics, such as a reduction in the response threshold to chemokines, and Ca 2+ flow
  • the heterodimer promotes the specific recruitment of Gq / n, explaining the flow of Ca 2+ resistant to PTx, and also shows differences in the activation of PI3K and increased cell adhesion. In addition, the heterodimer cancels the internalization of the receptor, indicating that there is no decrease in receptor levels on the surface.
  • An implication of the grouping of receptors as a result of chemotactic responses is that the activity of a receptor will influence that of its neighbors, so that a ligand could act trans in a receptor for which it is not specific.
  • the bound ligand induces changes in receptor signaling activity, which are propagated to a large number of neighboring receptors, amplifying the effect of a single binding event.
  • the sensitivity of the receptor can be regulated by the formation of complexes of signaling domains qualitatively dictated by the availability of chemokines.
  • a retrovirus called human immunodeficiency virus (HIV-1) is the etiologic agent of the complex disease that includes the progressive destruction of the immune system (acquired immunodeficiency syndrome; AIDS) and degeneration of the central and peripheral nervous system. This virus was previously known as LAV, HTLV-III or ARV.
  • Some compounds have been shown to inhibit HIV replication, including CD4 protein and synthetic derivatives (Smith et al., Science, 238, 1704-1707 (1987)), dextran sulfate, Direct Yellow dyes 50, Evans Blue , and certain azo dyes (US Patent No. 5,468,469). Some of these antiviral agents have been shown to work by blocking the binding of gp120, the protein coat of HIV, to its target, the cell's CD4 glycoprotein. The entry of HIV-1 into a target cell requires CD4 of the cell surface and additional cofactors of the host cell, between CD4 protein and synthetic derivatives (Smith et al., Science, 238, 1704-1707 (1987)), dextran sulfate, Direct Yellow dyes 50, Evans Blue , and certain azo dyes (US Patent No. 5,468,469). Some of these antiviral agents have been shown to work by blocking the binding of gp120, the protein coat of HIV, to its target, the cell's CD4 glycoprotein. The entry of HIV-1 into
  • chemokine receptors which act as the main co-receptors for these viruses. Therefore, the oligomerization of chemokine receptors is a critical stage in the function of chemokines, and chemokine receptors that cannot dimerize do not perform their function. Therefore, dimerization can be a critical stage in physiological situations in which chemokines are involved, including collaborative T-cell responses, hematopoiesis, angiogenesis, and homeostasis, as well as in pathological conditions such as asthma, tumor rejection, infection. for HIV-1, and arteriosclerosis. It has been directly boxed that the dimerization of chemokine receptors prevents HIV-1 infection.
  • the present invention provides a method for identifying compounds that interact with a chemokine receptor, to thereby modulate the activity of said receptor, the method comprising testing said compound, by at least one of the following procedures: ) activation of homodimerization of chemokine receptors; b) activation of the heterodimerization of chemokine receptors; c) inhibition of homodimerization of chemokine receptors; d) inhibition of the heterodimerization of chemokine receptors; e) competitive inhibition of chemokine receptor agonist binding; f) competitive inhibition of chemokine receptor antagonist binding; g) inhibition of the binding of JAK kinase to a chemokine receptor; h) competitive inhibition of the binding of JAK kinase to a chemokine receptor; i) inhibition of the binding of a STAT transcription factor to a chemokine receptor; and j) competitive inhibition of the
  • the present invention provides peptide antagonists of dimerization of CCR2 chemokine receptors.
  • Examples of such antagonists include peptides MLWLIL (SEQ ID No. 1) and VTSVITW (SEQ ID No. 2).
  • the peptides of SEQ ID. No 1 and 2 are non-competitive inhibitors of the binding of MCP-3 or MCP-1 to the receptor.
  • the present invention provides peptide antagonists of dimerization of CCR5 chemokine receptors. Examples of such antagonists include peptides MLVILIL (SEQ ID No. 3) and VTSVITW (SEQ ID No. 4). The peptides of SEQ ID.
  • No 3 and 4 are non-competitive inhibitors of the binding of any RANTES to the receptor.
  • the peptides of SEQ ID No. 1, 2, 3 and 4 also antagonize the CCR2 / CCR5 heterodimers and their respective functions, without interfering with the binding of their respective ligands.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) chemokine implies a route that requires the activation of JAK, G ⁇ and PLC- ⁇ ; Figure 3 shows that when CCR2 and CCR5 form heterodimers, CCR2 and CXCR4 do not; Figure 4 shows that the peptides of SEQ ID No: 3 and 4 block homodimerization of CCR5, visualized by " FRET analysis. DETAILED DESCRIPTION OF A PREFERRED EMBODIMENT.
  • growth factors are proteins that bind to receptors on the cell surface, with the main result of activating cell proliferation and / or differentiation
  • Many growth factors are quite versatile, stimulating cell division in numerous different types of cells, while others are specific to a particular type of cells.
  • of growth factors Secreted mainly from leukocytes cytokines stimulate t I enhance humoral and cellular immune responses, as well as activate phagocytic cells.
  • Cytokines that are secreted from lymphocytes are called lymphokines, while those secreted by monocytes or macrophages are called monokines.
  • cytokines Different cells in the body produce a large family of cytokines. Many of the lymphokines are also known as interleukins (IL), since they are not only secreted by leukocytes but can also affect the cellular responses of leukocytes. Specifically, interleukins are growth factors targeting cells of hematopoietic origin. Chemokines: Chemokines are a family of structurally related glycoproteins with potent activation activity of
  • RE SUBSTITUTE SHEET leukocytes and / or chemotactic They are 70 to 90 amino acids in length and approximately 8 to 10 kDa molecular weight. Most of them fit into two subfamilies with four cysteine residues. These subfamilies are based on whether the two amino acid cysteine residues are immediately adjacent or separated by an amino acid.
  • Chemokines also known as CXC chemokines, contain a single amino acid between the first and second cysteine residues; ⁇ chemokines, or CC, have adjacent cysteine residues.
  • CXC chemokines are chemoattractors for neutrophils, while CC chemokines generally attract monocytes, lymphocytes, basophils, and eosinophils. There are also two other small subgroups. Group C has a known member (lymphotactin). It lacks one of the cysteines in the four-tank pattern, but shares homology at its carboxyl end with CC chemokines. Chemokine C seems to be specific for lymphocytes. The fourth subgroup is the CX3C subgroup. CX3C chemokine (fractalin / neurotacidin) has three amino acid residues between the first two cysteines.
  • Chemokine receptors are members of a superfamily of seven transmembrane loops and transduce their signals through mere heterotri G proteins.
  • the seven transmembrane domains of GPCRs are currently known as TM1 to TM7, which correspond from transmembrane region 1 to transmembrane region 7.
  • the exact amino acid sequence of each TM is specific to each receptor.
  • Chemokine receptors are structurally related and can be classified as specific (they only bind a known ligand - for example, CXCR1 / IL8RA and CXCR4 / fusin / LESTR), shared (CXCR2 / IL8RB, CXCR3, CCCR1), promiscuous (bind many chemokine ligands of CXC or CC types - for example, Duffy blood group antigen), and viral (shared receptors that have been transduced into viral genomes during
  • chemokine receptors are structurally related. For example, the CXCR1 and CXCR2 receptors are approximately 65% identical. If the binding of chemokine receptors results in cell movement, a complex series of signaling circuits is involved. Different routes lead to activation and signaling.
  • Ligand A ligand is an atom, ion, molecule or compound that actually or supposedly binds to a receptor or other macromolecule. Ligand binding may or may not affect the structure, chemical or biochemical activity of the receptor or macromolecule thus bound.
  • Chemokine receptor antagonist A ligand that binds to a chemokine receptor but does not transmit a signal.
  • Guimioguine receptor agonist A ligand that binds to a chemokine receptor and induces some or all biological activities as would be induced by a valid chemokine.
  • Guimiokine receptor homodimer The term "homodimer" refers to the complex formed by two molecules of the same type of chemokine receptor.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FLIM fluorescence life time imaging
  • a control, or basic, amount of chemokine receptor homodimer is determined by providing cells expressing the target chemokine receptors, and bringing these cells into contact with a control solution without the ligand to be tested.
  • the control cells are contacted with a bifunctional crosslinking reagent and the amount of dimer composed of a single class of chemokine receptor is determined by any of a variety of standard biological techniques known in the art.
  • a test is determined or
  • SUBSTITUTE SHEET RULE 26 Induced level of chemokine receptor homodimer in a manner identical to that of the control determination, except that the cells are contacted with a solution containing a concentration of a test ligand.
  • Homodimers can be isolated by solubilization of cell membranes followed by immunoprecipitation of the solution.
  • Homodimers can be quantified by dehsitornétr ⁇ a ⁇ gels "SDS-PAGE: L homodimers can also be determined by analysis of the energy transfer fluorescence resonance (FRET) receptor suitably marked after the con ⁇ acto a test ligand.
  • FRET energy transfer fluorescence resonance
  • heterodimer refers to the complex formed by molecules of two different classes of chemokine receptors.
  • heterodimers include: Co-immunoprecipitation, cross-linking with bifunctional reagents, fluorescence resonance energy transfer (FRET), fluorescence life-time imaging (FLIM), loss of function muiahis, and use of synthetic peptides. it has been given before for homodimers, except that the receptors are marked so that different classes of receptors have different marker groups.
  • heterodimers can be determined by coinmunoprecipitation with monoclonal antibodies (Acm) specific to the receptor. Precipitated receptors are determined by western blot analysis and quantified by densitometry. Homo and heterodimers can be determined by other methods, such as FRET or FLIM analysis.
  • SUBSTITUTE SHEET suitable are put in collusion with the appropriate ligand (s).
  • Chemokine receptors are designed in a different way with at least one acceptor fluorochrome and at least one donor fluorochrome.
  • the quantification by FRET is determined as the largest donor emission after photodecoloration of the acceptor fluorophore.
  • FLIM the lifetime of a donor fluorochrome is determined first, and of an acceptor fluorochrome.
  • a third method for determining homo or heterodimerization is to observe a functional response of a stimulated cell.
  • Functional assays may include Ca 2+ mobilization, cell adhesion, and chemoiaxis include non-limiting examples of chemokine-dependent functioning.
  • Functional analyzes are based on the observation that cells respond to lower concentrations of two or more chemokines applied simultaneously if a chemokine receptor heterodimer is formed.
  • Competitive guimiokine inhibitor A ligand that undergoes equilibrium binding to a chemokine receptor in the receptor site potentially occupied by related chemokine. The binding of the inhibitor prevents the manifestation of the potential biological activity present in the presence of chemokine. An arbitrary concentration of the chemokine, resulting in the displacement of the receptor inhibitor, the binding of the chemokine, and the manifestation of complete biological acfivity.
  • Competitive inhibition assays involve the use of a chemokine with a radioactive or fluorescent label.
  • a competitive inhibitor acts by binding to a receptor and displacing chemokine, evaluated by the loss of radioactivity or fluorescence of the receptor-ligand complex.
  • Non-competitive inhibition of guimioguine binding to receptors Non-competitive inhibition assays use chemokine with a radioactive or fluorescent label.
  • a non-competitive inhibitor inhibits the activity of a receptor, but does not displace the receptor chemokine.
  • the two synthesized synthetic oligonucleotide primers correspond to positions 175-207 and 469-501 of the CCR2 receptor.
  • the first contains the codon of the target Val (GTC) at position 191, which was replaced by a wing codon (GTC).
  • the second contains the codon of the target Val (GTG) at position 485, which was replaced by a wing codon (GCG). Both mutations were confirmed by DNA sequencing.
  • STAT STAT is an acronym for Signal Transducer and Activator of Transcription (for its acronym in English, Signal Transducer and Activator of Transcriptior ⁇ ). Six members of the STAT family with masses of 84-113 kDa are known.
  • STATs transmit a signal from a cyiokine or chemokine receptor to a regulatory element of DNA transcription.
  • STAT proteins are cytoplasmic proteins that are activated by phosphorylation of a specific firosine, the Tyr 701 of STAT1.
  • Phosphorylated STATs dimerize and move to the nucleus, where they bind to specific DNA elements acfivating the transcription. Dimerization apparently involves an interaction of P-Tyr 701 with an SH2 domain that contains an invariant and essential Arg. Since each receiver is specific for a
  • the first level of specificity is the interaction of a ligand activated receptor with a particular STAT.
  • the activation of cytokine or chemokine receptors leads to the phosphorylation of the receptor's tyrosine and the Janus kinases (JAK) associated with the receptor.
  • the phosphophilic elyceptor irosi ⁇ á " is ⁇ the " sitiO ⁇ for the reversible binding of a STAT, and the sequence around the ionsine confers specificity for a particular STAT.
  • the second level of specificity is the interaction of phosphoSTAT dimers with DNA elements. Except for STAT2, they bind to sequences activated by the inferred gamma (GAS), initially identified as sites of interaction of factors induced by IFN gamma. These sequences, of which there are 10 or similar, generally consist of a palindromic sequence, TT N ⁇ AA, where i is 4, 5 or 6. The recognition of this sequence by a particular STAT depends on the value of i, as well as of the specific sequence of N ⁇ . For example, STAT3 binding is better if N is 4, STAT1 if N is 5, and STAT6 if N is 6.
  • Inhibition of JAK kinase is determined in aliquots of cells previously treated or not treated with a supposedly competitive ligand or compounds that interfere in the association of JAK with the receptor.
  • the cells are stimulated with chemokines, lysed and precipitated with Acf ampi-chemokine.
  • Immunoprecipipts are analyzed in wes ⁇ ern transfers with anli-JAK antibodies.
  • the lysates of the stimulated cells were immunoprecipitated with an ⁇ i-phosphoyrosine antibodies, and analyzed in wes ⁇ ern transfers with an ⁇ i-JAK antibodies.
  • the function of the chemokine receptor of the framed cells can also be analyzed.

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Abstract

La presente invención se refiere en general al diagnóstico y tratamiento de enfermedades y estados de seres humanos y otros animales, en los que la enfermedad o estado es mediado por rutas de transducción de señales activadas por receptores de quimioquinas.

Description

Método para seleccionar agonistas y antagonistas de quimioquinas
PRIORIDAD La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos 60/466.428, presentada el 30 de Abril, 2003. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al diagnóstico y tratamiento de enfermedades y estados de seres humanos y otros animales en los que la enfermedad o estado es mediado por rutas de transducción de señales activadas por receptores de quimioquinas. ANTECEDENTES Las células del sistema inmunitario se comunican entre sí para iniciar, establecer y mantener respuestas ¡nmunitarias. Esta comunicación se produce por el contacto de célula a célula o a través de una variedad de mediadores intracelulares, que incluyen citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento. En todos los casos, la transducción de señales se inicia por interacciones proíeína-proteína complejas entre estos ligandos y sus receptores en la membrana plasmática. La superfamilia de receptores de citoquinas se asocia con y media la activación dependiente de ligando de miembros de la familia Janus de proteína tirosina quinasas (JAK) (O'Shea et al., 2002). La familia JAK tiene cuatro miembros conocidos (JAK1 , JAK2, JAK3 y Tyk2) que son activados de forma diferente en respuesta a diferentes citoquinas. Las JAK están asociadas de forma constitutiva con muchos receptores de citoquinas. Sin embargo, en algunos casos, la asociación es potenciada por la estimulación de las citoquinas. La unión de un ligando a su receptor activa rápidamente las JAK asociadas, conduciendo a la fosforilación de tirosina de los receptores y posterior generación de sitios de acoplamiento para otras moléculas, incluyendo los factores de transcripción STAT y otras moléculas tales como PLCγl
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) o PLCγ2 (Wang et al., 2000). La activación de la PLCγ está implicada en la estimulación mediada por citoquinas y factores de crecimiento del metabolismo del fosfoinositol y liberación de calcio de depósitos intracelulares. Este procedimiento se produce por reclutamiento de PLCγ en el receptor activado de un modo facilitado por el producto de la fosfatidilinositida-S'-OH-quinasa (PI3K), el fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifos- fato (Ptdlns(3,4,5)P3) (Venema et al., 1988). Las quimioquinas son citoquinas quimiotácticas que son liberadas por una amplia variedad de células para atraer macrófagos, células T, eosinófilos, basófilos y neutrófilos a los sitios de inflamación (revisado por Schall, Cytokine, 3, 165-183 (1991) y Murphy, Rev. Immun., 12, 593- 633 (1994). Hay dos clases principales de quimioquinas, CXC (α) y CC (β), dependiendo de si las dos primeras cisteínas están separadas por un solo aminoácido (CXC) o son adyacentes (CC). Las quimioquinas , tales como interleuquina-8 (II-8), proteína activadora de neutrófilos 2 (NAP-2) o proteína de la actividad estimuladora del crecimiento del melanoma (MGSA) son quimiotácticas principalmente para neutrófilos, mientras que las quimioquinas β, tales como RANTES, ívllP-1.α, IVIIP- 1.β, proteína quimiotáctica de monocitos 1 (¡ViCP-1), tvlCP-2, ÍW1GP-3 o eotaxina son quimiotácticas para macrófagos, células T, eosinófilos y basófilos (Deng. et al., Nature, 381 , 661-666 (1996)). Las quimioquinas se unen a receptores de la superficie celular específicos que pertenecen a la familia de proteínas acopladas a proteínas G caracterizadas por siete dominios transmembrana (revisado por Horuk, Trends Pharm. Sci., 15, 159-165 (1994)), denominados "receptores de quimioquinas". Hay al menos dieciséis receptores de quimioquinas humanos que se unen o responden a quimioquinas con el siguiente modelo característico: CCR-1 (o "CKR-1"o "CC-CKR-1") [MIP- 1α, MIP-1β, MCP-3, RANTES, MCP-1, HCC-1, HCC-4] (Ben-Barruch, et al., J. Biol. Chem., 270, 22123-22128 (1995); Beote, et al., Cell, 72, 415- 425 (1993)); CCR-2A y CCR-2B (o "CKR-2ATCKR-2A" o "CC-CKR- 2ATCC-CKR-2A") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4]; CCR-3 (o "CKR-3" HOJA DE S o "CC-CKR-3") [eotaxina, eotaxina 2, RANTES, MCP-3, MCP-4, MCP-2, MIP-15] (Combadiere, et al., J. Biol. Chem., 270, 16491-16494 (1995); CCR-4 (o "CKR-4" o "CC-CKR-4") [(MIP-1.α, RANTES, MCP-1] (Power, et al., J. Biol. Chem., 270, 19495-19500 (1995)); CCR-5 (o "CKR-5" o "CC-CKR-5") [MDC, TARC] (Sansón, et al., Biochemistry, 35, 3362-3367 (1996)); CCR-6 (LARC), MIP-3α; CCR-7 (GC-quina, MIP-3β); CCR-8 (I- 309, LEC); CCR-9 (TECK); CCR-10 (CTAK); CCR-11 (ELC, SLC, TECK); CXCR-1 (NAP-2, GCP-2, IL-8); CXCR-2 (GROα, GROβ, GROγ, ENA-78, NAP-2, IL-8, GCP-2); CXCR-3 (MIG, IP-10, l-TAC); CXCR-4 (SDF-1α SDF-1β); CXCR-5 (BLC), CXCR-6 (CXCL-16); XCR1 (SCM-1β, SCM-1α); CX3CR1 (fractalquina) y el antígeno del grupo sanguíneo Duffy [RANTES, MCP-1] (Chaudhun, et al., J. Biol. Chem., 269, 7835- 7838 (1994)). Las quimioquinas señalan a través de los receptores acoplados a proteínas G caracterizados por siete dominios íransmembrana (GPCR) (Thellen, 2001) que transducen señales a una proteína G¡. Se ha descrito la asociación de Gα¡ con varios receptores de quimioquinas (Damaj et al., 1996; Vila-Coro et al., 1999). La mayoría de las respuestas a las quimioquinas son inhibidas por la toxina pertussis (PTx). Sin embargo, PTx no bloquea la respuesta del calcio en muchos casos, y otras proteínas G insensibles a la PTx se pueden unir a receptores de quimioquinas; esto indica que no puede haber proteínas G¡ implicadas en la señalización por quimioquinas (Arai and Charo, 1996). Pruebas previas muestran que las quimioquinas también pueden inducir la asociación de JAK al receptor de quimioquinas incluso después de tratamiento con PTx, mientras que no se observa asociación de Gα¡ cuando las células se tratan con AG-490, un inhibidor de JAK (Mellado et al., 1998). Tanto el tratamiento con PTx como AG-490 anulan la señalización del receptor, incluyendo migración y flujo de Ca2+, sugiriendo que JAK tiene un papel importante en las respuestas de quimioquinas (Mellado et al., 1998). El análisis de los autores de la invención de la activación por HOJA DE SUSTITUCI quimioquinas de la quinasa JAK, y de la secuencia en la que JAK, G¡, PLC-β y PI3K se meten en esta cascada de señalización, indica que la asociación de Gα¡ al receptor depende de la activación de JAK, que el flujo de calcio mediado por quimioquinas es un proceso que implica PLC-β, que PLC-β está corriente abajo de G¡ y de las quinasas JAK, y que la PI3K no tiene papel en la movilización de calcio y sólo un papel limitado en la quimiotaxis de linfocitos T mediada por quimioquinas. Los datos indican que la señalización por quimioquinas integra varias moléculas relacionadas clásicamente con el GPCR, con otras activadas por citoquinas, pero que retienen las características de señalización específicas. La activación de esta ruta de señalización a través de los GPCR plantea algunas preguntas. La opinión clásica de la activación de JAK/STAT por receptores de citoquinas requiere la presencia de dos JAK que estén cerca, de modo que puedan ser activadas por transfosforilación (Liu et al., 1998). En el caso de los receptores de citoquinas, esto se logra mediante dimerización de los receptores que se han asociado de forma constitutiva a JAK. La dimeri∑ación también se produce en el caso de quimioquinas; la dimerización de receptores de quimioquinas fue demostrada por primera vez para CCR2 usando diferentes enfoques experimentales que incluían el uso de anticuerpos monoclonales agonistas, receptores marcados, receptores mutantes y pruebas de transferencia de energía. Después, esto se generalizó a otros receptores de quimioquinas (tales como CCR5 y CXCR4). Fisiológicamente, las quimioquinas no actúan aisladamente. Más bien, durante la inflamación u homeostasis, coexisten varias quimioquinas e influyen en las células. Recientemente se ha observado que la estimulación simultánea con CCL2 y CCL5 induce la formación del heterodímero CCR2-CCR5. El receptor de quimioquinas heterodímero también presenta características excepcionales, tales como una reducción del umbral de respuesta a las quimioquinas, y flujo de Ca2+
HOJA DE SUSTITUCIÓN RE independiente de PTx, lo cual indica propiedades distintas comparado con el homodímero. El heterodímero promueve el reclutamiento específico de Gq/n, explicando el flujo de Ca2+ resistente a la PTx, y también muestra diferencias en la activación de la PI3K y aumento de la adhesión celular. Además, el heterodímero anula la internalización del receptor, indicando que no hay disminución de los niveles de receptor en la superficie. Una implicación del agrupamiento de receptores como consecuencia de las respuestas quimiotácticas es que la actividad de un receptor influirá en la de sus vecinos, de modo que un ligando podría actuar en trans en un receptor para el que no es específico. De este modo, el ligando unido induce cambios en la actividad de señalización del receptor, que son propagados a un gran número de receptores vecinos, amplificando el efecto de un solo suceso de unión. La sensibilidad del receptor se puede regular por la formación de complejos de dominios de señalización dictados cualitativamente por la disponibilidad de quimioquinas. Un retrovirus denominado virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) es el agente etiológico de la compleja enfermedad que incluye la destrucción progresiva del sistema inmuniíario (síndrome de inmunodeficiencia adquirida; SIDA) y degeneración del sistema nervioso central y periférico. Este virus se conoció previamente como LAV, HTLV-III o ARV. Se ha demostrado que algunos compuestos inhiben la replicación del VIH, incluyendo la proteína CD4 y derivados sintéticos (Smith et al., Science, 238, 1704-1707 (1987)), sulfato de dextrano, los colorantes Amarillo directo 50, Azul de Evans, y ciertos colorantes azo (Patente de EE.UU. n° 5.468.469). Algunos de estos agentes antivíricos han mostrado que actúan bloqueando la unión de gp120, la cubierta de proteína del i VIH, a su diana, la glicoproteína CD4 de la célula. La entrada del VIH-1 en una célula diana requiere la CD4 de la superficie celular y cofactores de la célula hospedante adicionales, entre
HOJA DE SUSTITUCIÓN otros, los receptores de quimioquinas CCR5 y CXCR4, que actúan como los principales correceptores para estos virus. Por lo tanto, la oligomerización de receptores de quimioquinas es una etapa crítica en la función de las quimioquinas, y los receptores de quimioquinas que no pueden dimerizar no realizan su función. Por lo tanto, la dimerización puede ser una etapa crítica en las situaciones fisiológicas en las que están implicadas quimioquinas, incluyendo respuestas de células T colaboradoras, hematopoiesis, angiogénesis, y homeostasis, así como en estados patológicos tales como asma, rechazo de tumor, infección por VIH-1 , y arteriosclerosis. Se ha bóxer- vado directamente que la dimerización de receptores de quimioquinas previene la infección por el VIH-1. Otros objetivos y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para identificar compuestos que interaccionan con un receptor de quimioquinas, para modular así la actividad de dicho receptor, comprendiendo el método someter a ensayo dicho compuesto, por al menos uno de los siguientes procedim entos: a) activación de la homodimerización de receptores de quimioquinas; b) activación de la heterodimerización de receptores de quimioquinas; c) inhibición de la homodimerización de receptores de quimioquinas; d) inhibición de la heterodimerización de receptores de quimioquinas; e) inhibición competitiva de la unión del agonista del receptor de quimioquinas; f) inhibición competitiva de la unión del antagonista del receptor de quimioquinas; g) inhibición de la unión de la quinasa JAK a un receptor de quimioquinas; h) inhibición competitiva de la unión de la quinasa JAK a un receptor de quimioquinas; i) inhibición de la unión de un factor de transcripción STAT a un receptor de quimioquinas; y j) inhibición competitiva de la unión de un factor de transcripción STAT a un receptor de quimioquinas. Los expertos en la técnica bioquímica entenderán que es preferible someter un compuesto
HOJA DE SUSTITUCI a más de uno de los procedimientos de ensayo anteriores. La presente invención proporciona antagonistas peptídicos de la dimerización de los receptores de quimioquinas CCR2. Entre los ejemplos de dichos antagonistas se incluyen los péptidos MLWLIL (SEQ ID No. 1) y VTSVITW (SEQ ID No. 2). Los péptidos de los SEQ ID. No 1 y 2 son inhibidores no competitivos de la unión de MCP-3 o MCP-1 al receptor. La presente invención proporciona antagonistas peptídicos de la dimerización de los receptores de quimioquinas CCR5. Entre los ejemplos de dichos antagonistas se incluyen los péptidos MLVILIL (SEQ ID No. 3) y VTSVITW (SEQ ID No. 4). Los péptidos de los SEQ ID. No 3 y 4 son inhibidores no competitivos de la unión de cualquier RANTES al receptor. Los péptidos de los SEQ ID No. 1, 2, 3 y 4 también anta- gonizan a los heterodímeros CCR2/CCR5 y sus respectivas funciones, sin interferir con la unión de sus respetivos ligandos. Todavía oíros objetivos y ventajas de la presente invención serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada, en la que se muestran y describen realizaciones preferidas de la invención, simplemente como forma de ¡lustrar el mejor modo coníemplado de llevar a cabo la invención. Como se comprenderá, la invención puede tener otras y diferentes realizaciones, y sus diversos detalles se pueden modificar en varios aspectos obvios, sin salirse de la invención. De acuerdo con esto, la descripción se debe ver como ilustrativa en su naturaleza y no como restrictiva. BREVE DESCRIPICIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos adjuntos ilustran sólo realizaciones típicas de esta invención, y por lo tanto no se deben considerar limitantes de su alcance, ya que la invención puede admitir otras realizaciones igualmente eficaces. La Figura 1 muestra que las respuestas de las quimioquinas son abolidas en células deficientes en JAK2; La Figura 2 muestra que el flujo de Ca2+ provocado por
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) quimioquina implica una ruta que requiere la activación de JAK, G¡ y PLC-β; La Figura 3 muestra que cuando CCR2 y CCR5 forman heterodímeros, CCR2 y CXCR4 no lo hacen; La Figura 4 muestra que los péptidos de los SEQ ID No: 3 y 4 bloquean la homodimerización de CCR5, visualizado por análisis de "FRET. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE UNA REALIZACIÓN PREFERIDA Se hace referencia a las figuras para ilustrar realizaciones seleccionadas y modos preferidos de llevar a cabo la invención. Hay que entender que la invención no esíá limiíada por los aspectos descritos en las figuras. Citoguinas: Como saben los expertos en la técnica bioquímica, los factores de crecimiento son proteínas que se unen a receptores en la superficie celular, con el resultado principal de activar la proliferación y/o diferenciación celular. Muchos factores de crecimiento son bastante versátiles, estimulando la división celular en numerosos tipos diferentes de células; mientras que otros son específicos de un tipo particular de células. Las ciíoquinas son una familia especial de factores de creci- miento. Secretadas principalmente de leucocitos, las citoquinas estimulan tanto las respuestas inmunitarias humorales como celulares, así como activan células fagocíticas. Las citoquinas que son secretadas de linfocitos se denominan linfoquinas, mientras que las secretadas por monocitos o macrófagos se denominan monoquinas. Diferentes células del cuerpo producen una gran familia de citoquinas. Muchas de las linfoquinas son conocidas también como interleuquinas (IL), puesto que no sólo son secretadas por leucocitos si no que también pueden afecfar a las respuesías celulares de los leucocitos. Específicamente, las interleuquinas son factores de crecimiento dirigidos a células de origen hematopoiético. Quimioquinas: Las quimioquinas son una familia de glicoproteínas estructuralmente relacionadas con potente actividad de activación de
HOJA DE SUSTITUCIÓN RE leucocitos y/o quimiotáctica. Tienen 70 a 90 aminoácidos de longitud y aproximadamente 8 a 10 kDa de peso molecular. La mayoría de ellas encajan en dos subfamilias con cuatro restos de cisteína. Estas subfamilias se basan en si los dos restos de cisteína del extremo amino están inmediafamente adyacentes o separados por un aminoácido. Las quimioquinas α, también conocidas como quimioquinas CXC, contienen un solo aminoácido entre el primer y segundo resto de cisteína; las quimioquinas β, o CC, tienen restos de cisteína adyacentes. La mayoría de las quimioquinas CXC son quimioatractoras para neutrófilos, mientras que las quimioquinas CC en general atraen monocitos, linfocitos, basófilos, y eosinófilos. También hay otros dos pequeños subgrupos. El grupo C tiene un miembro conocido (linfotactina). Carece de una de las cisteínas en el patrón de cuatro cisternas, pero comparte homología en su extremo carboxilo con las quimioquinas CC. La quimioquina C parece que es específica para linfocitos. El cuarto subgrupo es el subgrupo CX3C. La quimioquina CX3C (fractalina/neurotacíina) tiene tres restos de aminoácido entre las dos primeras cisteínas. Está unida directamente a la membrana celular por un largo tallo de mucina e induce tanto la adhesión como la migración de leucocitos. Receptor de quimioquinas: Los receptores de quimioquinas son miembros de una superfamilia de siete bucles de transmembrana y transducen sus señales a través de proteínas G heterotrí meras. Los siete dominios transmembrana de los GPCR se conocen actualmente como TM1 a TM7, que corresponden de la región transmembrana 1 a la región transmembrana 7. La secuencia de aminoácidos exacta de cada TM es específica para cada receptor. Los receptores de quimioquinas están estructuralmente relacionados y se pueden clasificar en específicos (sólo unen un ligando conocido - por ejemplo, CXCR1/IL8RA y CXCR4/fusina/LESTR), compartidos (CXCR2/IL8RB, CXCR3, CCCR1), promiscuos (se unen a muchos ligandos de quimioquinas de tipos CXC o CC - por ejemplo, antígeno del grupo sanguíneo Duffy), y víricos (receptores compartidos que han sido transducidos a genomas víricos durante
HOJA DE SUSTITUCIÓN RE la evolución, herpesvirus saimirí y citomegalovirus). Algunos receptores de quimioquinas están estructuralmente relacionados. Por ejemplo, los receptores CXCR1 y CXCR2 son idénticos en aproximadamente 65%. Si la unión de los receptores de quimioquinas da como resultado el movimiento de la célula, se implica una serie compleja de circuitos de señalización. Diferentes rutas conducen a la activación y señalización. Ligando: Un ligando es un átomo, ion, molécula o compuesto que realmente o supuestamente se une a un receptor u otra macromolécula. La unión del ligando puede afectar o no a la estructura, actividad química o bioquímica del receptor o macromolécula así unido. Antagonista del receptor de quimioquinas: Un ligando que se une a un receptor de quimioquinas pero no transmite una señal. Agonista del receptor de guimioguinas: Un ligando que se une a un receptor de quimioquinas e induce algunas o todas las actividades biológicas como serían inducidas por una quimioquina válida. Homodímero de receptores de guimioquinas: El término "homodímero" se refiere al complejo formado por dos moléculas del mismo tipo de receptor de quimioquinas. Se pueden usar varias estrategias bioquímicas y biofísicas para definir homodímeros, incluyendo coinmunoprecipitación, reticulación con reactivos bifuncionales, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), formación de imágenes del tiempo de vida de fluorescencia (FLIM), uso de Acm y su correspondiente Fab, pérdida de mutantes de función, uso de péptidos sintéticos, y otras técnicas conocidas. Se determina una cantidad testigo, o básica, de homodímero de receptores de quimioquinas proporcionando células que expresan los receptores de quimioquinas diana, y poniendo en coníacto esas células con una solución testigo sin el ligando que se va a ensayar. Las células testigo se ponen en contacto con un reactivo de reticulación bifuncional y se determina la cantidad de dímero compuesto de una sola clase de receptor de quimioquinas, por cualquiera de una variedad de técnicas biológicas patrón conocidas en la técnica. Se determina una prueba o
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 nivel inducido de homodímero de receptores de quimioquinas de una forma idéntica a la de la determinación del testigo, excepto que las células se ponen en contacto con una solución que contiene una concentración de un ligando de prueba. Los homodímeros se pueden aislar por solubilización de las membranas celulares seguido de inmunoprecipitación de la solución. Los homodímeros se pueden cuantificar por dehsitornétría~dé geles "de SDS-PAGE: L homodímeros también se pueden determinar por análisis de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) de los receptores adecuadamente marcados después del coníacto con un ligando de prueba. Heterodímero de receptores de guimioguinas: El término "heterodímero" se refiere al complejo formado por moléculas de dos clases diferentes de receptores de quimioquinas. Se puede usar la misma variedad de estrategias bioquímicas y biofísicas para definir heterodímeros que las usadas para definir homodímeros, incluyendo: coinmunoprecipitación, reticulación con reactivos bifuncionales, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), formación de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM), pérdida de muíaníes de función, y uso de péptidos sintéticos. En general los heíerodímeros se determinan como se ha dado antes para homodímeros, excepto que los receptores se marcan de modo que diferentes clases de receptores fienen diferentes grupos marcadores. Para determinar la inducción de la heterodimerización, se ponen en contacto células que expresan al menos dos clases de receptores de citoquinas con al menos dos tipos diferentes de citoquinas u oíro ligando de prueba. Como en el caso de la homodimerización, los heterodímeros se pueden determinar por coinmunoprecipitación con aníicuerpos monoclonales (Acm) específicos para el receptor. Los receptores precipitados se determinan por análisis de transferencia western y se cuanfifican por densitometría. Los homo y heterodímeros se pueden determinar por oíros métodos, íales como análisis FRET o FLIM. Células
HOJA DE SUSTITUCI adecuadas se ponen en confaclo con el(los) ligando(s) adecuado(s). Los receptores de quimioquinas se íiñen de disíinía forma con al menos un fluorocromo acepíor y al menos un fluorocromo donador. La cuan- tificación por FRET se determina como la mayor emisión del donador después de fotodecoloración del fluoróforo acepíor. En el caso de FLIM, se determina primero el íiempo de vida de un fluorocromo donador, y se
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de un fluorocromo acepfor. Un tercer método para determinar la homo o heterodimerización es observar una respuesta funcional de una célula estimulada. Los ensayos funcionales pueden incluir movilización de Ca2+, adhesión celular, y quimioíaxis eníre los ejemplos no limitantes de funcionamiento dependiente de quimioquinas. Los análisis funcionales se basan en la observación de que las células responden a menores concentraciones de dos o más quimioquinas aplicadas simultáneamente si se forma un heterodímero de receptores de quimioquinas. Inhibidor competitivo de guimioquinas: Un ligando que experimenía unión en equilibrio a un receptor de quimioquinas en el siíio del receptor potencialmente ocupado por la quimioquina afín. La unión del inhibidor previene la manifestación de la actividad biológica potencialmeníe preseníada en presencia de la quimioquina. Una conceníración arbiírariamente alia de la quimioquina da como resulíado el desplazamiento del inhibidor del receptor, la unión de la quimioquina, y la manifesíación de la acfividad biológica completa. Los ensayos de inhibición competiíivos implican el uso de una quimioquina con marcador radiacíivo o fluorescente. Un inhibidor competifivo acfúa uniéndose a un receptor y desplazando la quimioquina, evaluado por la pérdida de radiactividad o fluorescencia del complejo de receptor-ligando. Inhibición no competitiva de la unión de guimioguinas a los receptores: Los ensayos de inhibición no competitiva usan quimioquina con marcador radiactivo o fluorescente. Un inhibidor no competitivo inhibe la actividad de un receptor, pero no desplaza a la quimioquina del receptor.
HOJA DE SUSTIT CI Mutantes CCR5152W152A: Se susíifuyó la He por Val en el resto 52 y se sustituyó la Val por Ala en el resto 150 en la secuencia del receptor CCR5, usando un kif de mutagénesis dirigida Quick Change (Stralagene) y los protocolos del fabricante. Los dos cebadores oligonucleótidos sintéticos siníetizados corresponden a las posiciones 139-171 y 433-465 del receptor CCR5. El primero contiene el codón de
~lá~πe~cliáná (ATG)~ ϊá~p^sici ñ~1^^^^ de Val (GTC). El segundo contiene el codón de la Val diana (GTC) en la posición 448, que se susfifuyó por el codón de Ala (GCG). Ambas mufaciones se confirmaron por secuenciación del ADN. Muíaníes CCR2V64AV164A: Se sustituyó la Val por Ala en el resto 64, y se sustituyó la Val por Ala en el resto 164 en la secuencia del receptor CCR2 usando el kif de mufagénesis dirigida Quick Change (Stratagene) y los protocolos del fabricante. Los dos cebadores oligonucleótidos sintéticos siníetizados corresponden a las posiciones 175-207 y 469-501 del receptor CCR2. El primero contiene el codón de la Val diana (GTC) en la posición 191, que se sustiíuyó por un codón de Ala (GTC). El segundo contiene el codón de la Val diana (GTG) en la posición 485, que se sustituyó por un codón de Ala (GCG). Ambas mutaciones se confirmaron por secuenciación del ADN. STAT: STAT es un acrónimo de Transductor de señal y Activador de la transcripción (por sus siglas en inglés, Signal Transducer and Activator of Transcriptiorí). Acfualmeníe se conocen seis miembros de la familia de STAT con masas de 84-113 kDa. Los STAT fransducen una señal de un receptor de ciíoquinas o quimioquinas a un elemento regulador de la transcripción del ADN. Las proteínas STAT son proteínas ciíoplasmáficas que son activadas por fosforilación de una firosina específica, la Tyr701 de STAT1. Los STAT fosforilados dimerizan y se mueven al núcleo, donde se unen a elementos del ADN específicos acfivando la íranscripción. La dimerización aparentemente implica una interacción de la P-Tyr701 con un dominio SH2 que contiene una Arg invariante y esencial. Puesto que cada receptor es específico para un
HOJA DE S cierto STAT o ciertos STAT, y cada STAT activado activa la íranscripción de sólo ciertos genes, este mecanismo explica, en parte, la especificidad de las ciíoquinas. El primer nivel de especificidad es la interacción de un receptor activado por ligando con un STAT particular. La activación de receptores de citoquinas o quimioquinas conduce a la fosforilación de la íirosina del receptor y de las quinasas Janus (JAK) asociadas al receptor. La íirosiñá fósfófilada el-receptor"es~el"sitiO~para la unión reversible de un STAT, y la secuencia alrededor de la íirosina confiere especificidad para un STAT particular. El segundo nivel de especificidad es la interacción de los dímeros de fosfoSTAT con elementos del ADN. Excepto el STAT2, se unen a secuencias activadas por el inferieron gamma (GAS), identificadas inicialmenle como sitios de interacción de factores inducidos por IFN gamma. Estas secuencias, de las cuales hay 10 o similar, en general consisten en una secuencia palindrómica, TT N¡ AA, donde i es 4, 5 ó 6. El reconocimiento de esta secuencia por un STAT particular depende del valor de i, así como de la secuencia específica de N¡. Por ejemplo, la unión de STAT3 es mejor si N es 4, STAT1 si N es 5 y STAT6 si N es 6. La inhibición de la quinasa JAK se determina en partes alícuotas de células previamente tratadas o no tratadas con un ligando supuestamente competitivo o compuestos que interfieren en la asociación de JAK con el receptor. Las células se estimulan con quimioquinas, se lisan y precipiten con Acm anfi-quimioquina. Los inmunoprecipifados se analizan en íransferencias wesíern con aníicuerpos anli-JAK. Alfernaíivamen- te, los lisados de las células estimuladas se inmunoprecipiían con anticuerpos aníi-fosfoíirosina, y se analizan en íransferencias wesíern con aníicuerpos aníi-JAK. Alternativamente, íambién se puede analizar la función del receptor de quimioquinas de las células fraíadas. INCORPORACIÓN COMO REFERENCIA Todas las publicaciones y solicifudes de patente ciladas en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente memoria como referencia, y para cualquiera y para todos los propósitos, como si
HO indicara específica e individualmente que cada publicación o solicilud de patente individual se incorpora como referencia. Específicamente, el contenido y descripción completos de la solicitud provisional en tramitación junto con la preseníe, número de expediente 21910/0010, se incorpora en la preseníe memoria como referencia para iodos los propósitos. DECLARACIÓN DΕ ÜTim NDUSTRI ir Con el propósito de cumplir con el Trafado de Cooperación en Materia de Patentes, la presente invención declara una uíilidad indusfrial. La preseníe invención proporciona medios de diagnóstico y íraíamienío de seres humanos y oíros animales aquejados de una enfermedad o un esíado mediado por la señalización por receptores de quimioquinas.
HOJA DE SUSTITUCIÓN

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para seleccionar un agonisía de la dimerización de recepíores de quimioquinas, comprendiendo dicho método las efapas de: determinar una cantidad testigo de un dímero de recepíores de πqüirñlóqúIrϊasT determinar una cantidad de prueba de un dímero de receptores de quimioquinas; y comparar dicha cantidad de prueba de dímero de receptores con dicha cantidad testigo de dímero de receptores.
2. Un método para seleccionar un agonista de la dimerización de recepíores de la acción de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que determinar una cantidad testigo de un receptor de quimioquinas comprende las etapas de: proporcionar una célula que expresa al menos un receptor de quimioquinas; exponer dicha célula a una cantidad eficaz de un agente de reticulación; medir una cantidad testigo del dímero de receptores de quimioquinas.
3. Un método para seleccionar un agonista de la dimerización de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que determinar una cantidad testigo de un receptor de quimioquinas comprende las elapas de: proporcionar una célula que expresa al menos un receptor de quimioquinas; exponer dicha célula a una cantidad de un ligando de prueba; exponer dicha célula a una cantidad eficaz de un agente de reticulación;
HOJA DE SUSTIT medir una cantidad de prueba de al menos un dímero de recepíores de quimioquinas.
4. Un método para seleccionar un anfagonisla de la dimerización de recepíores de quimioquinas, comprendiendo dicho método las elapas de: determinar una cantidad estimulada de un"clírτTéro de receptores de quimioquinas; determinar una caníidad de prueba de un dímero de recepíores de quimioquinas; y deíerminar dicha caníidad aníagonizada como la diferencia enfre dicha caníidad de prueba y dicha caníidad estimulada.
5. Un método para seleccionar un aníagonisía de la dimerización de recepíores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que deíerminar una caníidad estimulada de dímero de receptores de quimioquinas comprende las etapas de: proporcionar una célula que expresa al menos un receptor de quimioquinas; exponer dicha célula a una cantidad eficaz de un ligando estimulador; exponer dicha célula a una caníidad eficaz de un agente de reíiculación; medir una cantidad estimulada de al menos un dímero de recepíores de quimioquinas.
6. Un método para seleccionar un aniagonisía de la dimerización de recepíores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 4, en el que determinar una caníidad anfagonizada de dímero de receptores de quimioquinas comprende las etapas de: proporcionar una célula que expresa al menos un receptor de quimioquinas;
HO A exponer dicha célula a una caníidad eficaz de un ligando estimulador; exponer dicha célula a una caníidad de un ligando de prueba; exponer dicha célula a una caníidad eficaz de un agente de reticulación; medir una cantidad de prueba de al menos un dímero de recepíores de quimioquinas.
7. Un método para identificar un compuesto que iníeracciona con un recepíor de quimioquinas para modular así la actividad de dicho receptor, comprendiendo dicho método someter dicho compuesto a ensayo, por al menos un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: a) activación de la homodimerización de receptores de quimioquinas, b) activación de la heterodimerización de receptores de quimioquinas, c) inhibición de la homodimerización de receptores de quimioquinas, d) inhibición de la heíerodimeri∑ación de receptores de quimioquinas, e) inhibición competitiva de la unión del agonisía al recepíor de quimioquinas; f) inhibición competitiva de la unión del antagonisfa al receptor de quimioquinas; g) inhibición de la unión de la quinasa JAK a un recepíor de quimioquinas; h) inhibición competitiva de la unión de la quinasa JAK a un recepíor de quimioquinas; i) inhibición de la activación de JAK mediada por quimioquinas; j) inhibición de la unión de un factor de franscripción STAT a un recepíor de quimioquinas;
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA 26 k) inhibición competitiva de la unión de un factor de íranscripción STAT a un recepíor de quimioquinas; y I) inhibición de la activación de STAT mediada por quimioquinas.
8. Un méíodo para identificar un compuesto adecuado para írafar, en un ser humano u oíro animal, una enfermedad regulada por la
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método someíer dicho compuesío a ensayo, por al menos un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en: a) activación de la homodimerización de receptores de quimioquinas, b) acíivación de la heferodimerización de recepíores de quimioquinas, c) inhibición de la homodimeri∑ación de receptores de quimioquinas, d) inhibición de la heterodimeri∑ación de receptores de quimioquinas, e) inhibición competitiva de la unión del agonista al receptor de quimioquinas; f) inhibición competitiva de la unión del antagonista al receptor de quimioquinas; g) inhibición de la unión de la quinasa JAK a un receptor de quimioquinas; h) inhibición competitiva de la unión de la quinasa JAK a un recepíor de quimioquinas; i) inhibición de la acíivación de JAK mediada por quimioquinas; j) inhibición de la unión de un factor de íranscripción STAT a un recepíor de quimioquinas; k) inhibición compeíiíiva de la unión de un factor de franscripción STAT a un recepíor de quimioquinas; y I) inhibición de la acíivación de STAT mediada por quimioquinas.
HOJA DE SUSTITUCI
9. Un méíodo para identificar un compuesto adecuado para íralar, en un ser humano u ofro animal, una enfermedad regulada por la dimerización de recepíores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho ensayo de activación de la homodimerización de recepíores de quimioquinas comprende las eíapas de: proporcionar células que expresan al menos una clase de receptor de quimioquinas; deíerminar una caníidad testigo de homodímero de receptores de quimioquinas; poner en conlacío dicha célula con un ligando de prueba; y deíerminar un nivel de prueba de homodímero de recepíores de quimioquinas.
10. Un méíodo para identificar un compuesto adecuado para íralar, en un ser humano u otro animal, una enfermedad regulada por la dimerización de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho ensayo de acíivación de la heterodimeri∑ación de receptores de quimioquinas comprende las eíapas de: proporcionar células que expresan al menos dos clases de receptores de quimioquinas; determinar una caníidad testigo de heíerodímero de receptores de quimioquinas; poner en confacfo dicha célula con dos tipos de ligandos de prueba; y deíerminar un nivel de prueba de heterodímero de receptores de quimioquinas.
11. Un méíodo para identificar un compuesío adecuado para írafar, en un ser humano u oíro animal, una enfermedad regulada por la dimerización de recepíores de quimioquinas, de acuerdo con la
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA reivindicación 8, en el que dicho ensayo de inhibición de la homodimerización de receptores de quimioquinas comprende las eíapas de: proporcionar una primera parte alícuoía de un tipo de células que expresan al menos un tipo de recepíor de quimioquinas; poner en conlacto dicha primera parte alícuoía con una caníidad eficaz de un ligando para inducir un nivel de homodímero de receptores de quimioquinas activado; determinar un nivel de homodímero de recepíores de quimioquinas activado; proporcionar una segunda parte alícuota de un tipo de células que expresan al menos un tipo de receptor de quimioquinas; poner en contacto dicha segunda parte alícuofa con una cantidad eficaz de un ligando para inducir un nivel de homodímero de receptores de quimioquinas activado; poner en coníacto dicha segunda parte alícuota con una cantidad de un ligando de prueba; determinar un nivel de prueba de homodímero de receptores de quimioquinas; determinar un porcentaje de inhibición comparando dicho nivel de prueba con dicho nivel testigo.
12. Un método para identificar un compuesto adecuado para fraíar, en un ser humano u oíro animal, una enfermedad regulada por la dimerización de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho ensayo de inhibición de la heíerodimerización de receptores de quimioquinas comprende las eíapas de: proporcionar una primera parte alícuofa de un tipo de células que expresan al menos dos tipos de recepíores de quimioquinas; poner en conlacfo dicha primera parte alícuoía con una canfidad eficaz de un ligando para inducir un nivel de heterodímero de recepíores
HOJA de quimioquinas activado; determinar un nivel de heterodímero de receptores de quimioquinas activado; proporcionar una segunda parte alícuota de un tipo de células que expresan al menos dos tipos de receptores de quimioquinas; poner en confacío dicha segunda parte alícuofa con una caníidad
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de quimioquinas activado; poner en coníaclo dicha segunda parte alícuola con una cantidad de un ligando de prueba; determinar un nivel de prueba de heíerodímero de recepíor de quimioquinas; deíerminar un porcentaje de inhibición comparando dicho nivel de prueba con dicho nivel testigo.
13. Un método para identificar un compuesto adecuado para tratar, en un ser humano u otro animal, una enfermedad regulada por la dimeri∑ación de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el ensayo de inhibición competitiva de la unión del agonista del receptor de quimioquinas comprende las etapas de: proporcionar una parte alícuofa de un tipo de células que tienen un receptor de quimioquinas; poner en contacto dicha parte alícuota con una quimioquina marcada; medir una caníidad de quimioquina unida a dicha parte alícuota; poner en contacto dicha parte alícuota unida a quimioquinas con un inhibidor de la dimerización de recepíores de quimioquinas; y medir una caníidad de inhibición de quimioquinas unidas a dicha parte alícuofa.
14. Un méíodo para identificar un compuesío adecuado para íraíar, en un ser humano u oíro animal, una enfermedad regulada por la
HOJA DE SUSTIT dimerización de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el ensayo de inhibición competitiva de la unión del aníagonisía del receptor de quimioquinas comprende las eíapas de: proporcionar una parte alícuoía de un tipo de células que tienen un receptor de quimioquinas; poner en coníacío dicha parte alícuofa con un anfagonisía del receptor de quimiQqüinas~maTcadof medir una cantidad de aníagonisla unido a dicha parte alícuota; poner en contacto dicha parte alícuota unida a quimioquinas con un inhibidor de la dimerización de receptores de quimioquinas; y medir una cantidad de inhibición de aníagonisfa unido a dicha parte alícuoía.
15. Un método para identificar un compuesto adecuado para íratar, en un ser humano u otro animal, una enfermedad regulada por la dimerización de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el ensayo de inhibición de la quinasa JAK comprende las etapas de: proporcionar una primera y segunda parte alícuota de células; poner en contacto dicha primera parte alícuota con un ligando de prueba; poner en contacto dichas primera y segunda parte alícuoía con una quimioquina; llevar a cabo la lisis de dichas células; precipilar dicho lisafo con un Acm anli-recepíor de quimioquinas; y analizar dicho inmunoprecipiiado con un anticuerpo anfi-JAK.
16. Un méíodo para identificar un compuesto adecuado para írafar, en un ser humano u oíro animal, una enfermedad regulada por la dimerización de receptores de quimioquinas, de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el ensayo de inhibición de la unión del factor de íranscripción STAT comprende las eíapas de:
HOJA DE SUSTIT proporcionar una primera y segunda parle alícuoía de células; poner en coníacfo dicha primera parte alícuota con un ligando de prueba; poner en contacto dichas primera y segunda parte alícuofa con una quimioquina; llevar a cabo la lisis de dichas células; 5récipiíaf"dich"o_lisato~con un~Acrrraníi=recepíorde-quimioquinas; y analizar dicho inmunoprecipitado con un anticuerpo anli-STAT.
17. Un aníagonisía de la dimerización del receptor CCR2, que comprende un péptido seleccionado del grupo que consiste en el SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2.
18. Un aníagonisía de la dimerización del receptor CCR5, que comprende un péptido seleccionado del grupo que consisíe en el SEQ
ID No. 3 y SEQ ID No. 4.
19. Una forma muíante del receptor de quimioquinas CCR2, CCR2V64AV164A, en el que dicho recepíor muíante dimeriza menos de aproximadamente 10% del tipo de receptor CCR2 natural en presencia del ligando MCP-1.
20. Una forma muíante del recepíor de quimioquinas CCR2, CCR2V64AV164A, de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho receptor muíante dimeriza menos de aproximadamente 5% del tipo de receptor CCR2 naíural en presencia del ligando MCP-1.
21. Una forma muíanle del recepíor de quimioquinas CCR2, CCR2V64AV164A, de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho receptor mutante dimeriza menos de aproximadamente 1% del tipo de receptor CCR2 natural en presencia del ligando MCP-1.
22. Una célula de mamífero que contiene un receptor de
HOJA DE quimioquinas CCR2 mulante, CCR2V64AV164A.
23. Una forma muíante del receptor de quimioquinas CCR5, CCR5I52W150A, en el que dicho receptor mulante dimeriza menos de aproximadamente 10% del tipo de receptor CCR5 natural en presencia del ligando RANTES.
24. Una forma mulante del receptor de quimioquinas CCR5, CCR5I52W150A, de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho receptor mutante dimeriza menos de aproximadamente 5% del tipo de recepíor CCR5 naíural en presencia del ligando RANTES.
25. Una forma mulante del receptor de quimioquinas CCR5, CCR5I52W150A, de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho receptor mutante dimeriza menos de aproximadamente 1% del tipo de receptor CCR5 natural en presencia del ligando RANTES.
26. Una célula de mamífero que contiene un receptor de quimioquinas CCR5 mutante, CCR5I52W150A.
27. Un receptor de quimioquinas que comprende un receptor de quimioquinas que tiene una mutación CCR2V64AV164A en su primer y cuarto dominio íransmembrana.
28. Una célula animal que comprende un receptor de quimioquinas que tiene una mutación CCR2V64AV164A en su primer y cuarto dominio transmembrana.
29. La célula animal, de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicha célula animal es una célula de mamífero.
30. Un receptor de quimioquinas que comprende un receptor de
HOJA DE SUSTITUCIÓN quimioquinas que tiene una mutación CCR5I52W150A en su primer y cuarto dominio íransmembrana.
31. Una célula animal que comprende un recepíor de quimioquinas que tiene una mutación CCR5I52W150A en su primer y cuarto dominio transmembrana.
32. La célula animal, de acuerdo con la reivindicación 31 , en la que dicha célula animal es una célula de mamífero.
HOJA DE SUSTITUCIÓN REGLA
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