WO2004093911A1 - Pharmaceutical composition for prostatic disease treatment - Google Patents

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WO2004093911A1
WO2004093911A1 PCT/JP2004/005745 JP2004005745W WO2004093911A1 WO 2004093911 A1 WO2004093911 A1 WO 2004093911A1 JP 2004005745 W JP2004005745 W JP 2004005745W WO 2004093911 A1 WO2004093911 A1 WO 2004093911A1
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prostate
cell
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Yoshiyuki Kakehi
Shinji Sakamoto
Masahiro Yokoyama
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Yoshiyuki Kakehi
Shinji Sakamoto
Masahiro Yokoyama
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • composition for treating prostate disease comprising
  • the present invention relates to (1) a substance having the activity of inhibiting the physiological activity of Cyr61 (cysteine-rich 61), the transcription of mRNA of a gene encoding Cyr61, or the translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein.
  • prostatic hyperplasia is thought to be caused by a number of factors, including genetic factors and environmental factors such as diet, in the pathogenesis of prostatic hypertrophy, but the full picture has not yet been clarified.
  • the Ministry of Health and Welfare estimates that the number of patients with benign prostatic hyperplasia in Japan is 300,000 to 400,000, but it is actually estimated that it is over 400,000.
  • the prostate grows to a size similar to the normal size of Hu at the age of thirty, growing and growing after youth.
  • enlarged benign adenomas occur in the prostate inner glands with a mixture of fibromuscular stromal and glandular parts, and the adenomas are enlarged, that is, prostatic hyperplasia.
  • the incidence of benign prostatic hyperplasia is about 7.7% in the 30s to 40s, about 40% in the 50s, about 67.3% in the 60s, and about 92% in the 70s.
  • the cause and mechanism of the development of prostatic hypertrophy are not yet fully understood, but the reversal of sex hormones that occurs around the age of 40, that is, decreased secretion of the male hormone testosterone and adrenal glands. It is said that one of the causes is the proliferation of stromal components of the prostate, which is induced by an increase in the amount of estrogen, a female hormone produced.
  • dysuria caused by benign prostatic hyperplasia is largely due to the above-mentioned increase in benign adenomas in the internal glands, decreased elasticity of the prostatic capsule, and decreased bladder contractility (3). See, for example, Urol. Clin. North Am., 1990, Vol. 17, p. 509).
  • anti-androgens are used to reduce adenomas
  • ai blockers ⁇ ⁇ blockers
  • anticholinesterases are used to increase bladder contractility. It is used.
  • antiandrogens only reduce 30-40% of the glandular epithelium, and do not correlate the reduction effect with the degree of symptom improvement. It is not clear how anti-androgens and a1 blockers are used in combination and their effects on amelioration of symptoms.
  • the fact that the effect of antiandrogens on reducing the glandular epithelium by only 30 to 40% is attributed to the pathogenesis of prostatic hypertrophy as well as the proliferation of epithelial cells as well as stroma cells (stromal cells). This suggests that there is an increase in stroma (stroma) accompanying the proliferation of cells.
  • prostate cancer which develops with a high probability in elderly males along with the above-mentioned prostatic hyperplasia, is more serious in that it is malignant, whereas the tumor seen in benign prostatic hyperplasia is benign. It is a problem.
  • prostate cancer mortality is lower than in the United States and Europe, it is considered a serious problem in Japan that prostate cancer mortality is increasing compared to any other cancer. Even more interesting is the fact that prostate cancer found at necropsy is more than 1,000 times greater than lethal cancer. Prostate cancer can be said to be an extremely slow cancer that changes from small early low-grade tumor cells to large high-grade cancer cells. As many as 40% of Japanese boys in their 80s have prostate cancer.
  • prostatic intraepithelial carcinoma is limited to the epithelium of the prostate tissue is diagnosed in only multilayered cell atypia and glandular cells (prostatic intraepithelial neoplasm; PIN) force s attention has been Reply It has also been reported that about 50% of men with PIN have advanced prostate cancer. .
  • the clinical symptoms of prostate cancer include lower urinary tract symptoms due to an increase in cancer; obstruction of the upper urinary tract; symptoms caused by metastasis to lymph nodes, liver or lungs; Pain due to bone metastasis or pain due to nerve compression.
  • Risk factors for prostate cancer include androgen, sexual life, oral intake, fat intake, meat intake, vitamin A, vitamin E, and vitamins! ), Alcohol consumption, coffee consumption, obesity, cirrhosis, etc., but the detailed cause has not been clarified.
  • One approach to pursue such research is to identify the genes that are specifically or highly expressed in specific tissues of healthy individuals or the tissues of patients, and analyze the biological activities of the molecules encoded by the genes. Then, there is a method of clarifying the relationship between the molecule and a disease.
  • the present invention relates to the secretion of various physiologically active substances from prostate epithelial cells that are deeply indirectly or directly involved in the development and progression of prostatic hypertrophy and prostate cancer, and to the production of prostatic stromal cells that directly cause prostatic hypertrophy.
  • prostatic hypertrophy mainly proliferating, by directly controlling the causes, the prevention of the development of prostate disease (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.) and the prevention of symptoms
  • An object of the present invention is to provide a method and an agent for suppressing progression and treating Z or the prostate disease.
  • the aim is to increase the therapeutic effect of diseases (such as prostatic hypertrophy and prostate cancer).
  • the present inventors have proposed various cell lines derived from prostate and tissues of patients with benign prostatic hyperplasia. In addition to analyzing the gene expression profile at the same time and identifying genes that are highly expressed in the cells and tissues, the expression of the genes and the physiological activities of the molecules encoded by the genes and the etiology of prostatic hypertrophy and prostate cancer Intensive research.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a medicament for preventing the onset of prostate disease (particularly, benign prostatic hyperplasia or prostate cancer), suppressing the progress of the prostate disease, or treating the prostate disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can alleviate or treat symptoms of a disease associated with the disease such as dysuria by suppressing prostate disease (particularly, prostatic hypertrophy). .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of prostate diseases (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) (for example, in the case of benign prostatic hyperplasia, an antiandrogen agent, an ⁇ blocker, Drugs such as esterases Drug therapy. ) Can increase the therapeutic effect of prostate diseases (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer).
  • prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer
  • an antiandrogen agent such as an antiandrogen agent, an ⁇ blocker
  • Drugs such as esterases Drug therapy.
  • Can increase the therapeutic effect of prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer).
  • the present invention also provides a method for identifying a substance as an active ingredient of the pharmaceutical composition, and the substance can be identified simply and with high accuracy by using the method of the present invention.
  • the present invention also provides a method for diagnosing the signs, presence or absence, or the degree of progression of the above-mentioned prostate diseases (such as prostatic hypertrophy and prostate cancer). In addition, it is possible to make a diagnosis with high accuracy.
  • prostate diseases such as prostatic hypertrophy and prostate cancer.
  • the present invention is as described in the following (1) to (29).
  • the physiological activity of the Cyr61 is proliferation or expansion of prostate epithelial cells or prostatic stromal cells, maintenance of the morphology of the cells, or activation of MAP kinase in the cells (1).
  • composition according to any of (1) to (4), wherein the substance is an antibody that binds to 'Cyr61 or a part thereof.
  • a method for identifying a substance capable of regulating transcription of a gene encoding Cyr61 to mRNA, translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, or production of Cyr61 which comprises the following steps.
  • a method for identifying quality comprising the steps of:
  • the cell is characterized by the presence or absence of a stimulus that induces the production of Cyr61, in the presence or absence of the substance, respectively. 'Culturing under conditions;
  • Cyr61-producing cells are cultured in the presence or absence of a stimulus that induces the production of Cyr61 under the conditions of the presence or absence of the substance, and under the respective conditions. Comparing the degree of proliferation, extension or morphological change of the cultured cells.
  • the cells are prostate epithelial cells or stromal cells or The method according to any one of the above (19), which is a cell line established from the above.
  • a method for diagnosing the presence or absence of prostate disease in a subject comprising the steps of:
  • test sample is prostate tissue or blood.
  • FIG. 1 shows the state of electrophoresis of purified recombinant human Cyr61 by estamplotting on an SDS polyacrylamide gel.
  • Lanes 1 and 2 show the following electrophoretic states, respectively. ''
  • Lane 1 marker molecule.
  • FIG. 2 shows the activity of recombinant human Cyr61 in inducing cell adhesion to prostate-derived stromal primary cells PrSC.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity as an index of the adhesive activity between the substrate (Cyr61, fibronectin, BSA) and the prostate-derived stromal primary cell PrSC, and the horizontal axis shows the concentration of the coated substrate (Cyr61, fipronectin, BSA). Show.
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of EDTA and / or heparin on cell adhesion of prostate-derived stromal primary cells PrSC induced by Cyr61.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity as an indicator of the adhesive activity between Cyr61 and the prostate-derived stromal primary cell PrSC, and the horizontal axis indicates the type of inhibitor.
  • FIG. 4 shows the reactivity of various anti-human Cyr61 polyclonal antibodies to human and monkey Cyr61 proteins by estamplotting.
  • Lanes 1 to 4 show the type of lysate of cells expressing the Cyr61 protein. Lane 1: African green monkey kidney fibroblast cell line C0S-7.
  • Lane 2 Human Cyr61—overexpressed African monkey monkey kidney fibroblast cell line COS-7.
  • Lane 3 mycHis-tag labeled human Cyr61—overexpressed African monkey monkey kidney fibroblast cell line COS-7.
  • Lane 4 mycHis-tag labeled negative control protein-overexpressing africamido lizal kidney fibroblast cell line COS-7.
  • FIG. 5 shows the presence or absence or the state of prostate-derived stromal primary cells PrSC extended by recombinant human Cyr61.
  • FIG. 6 shows the presence or absence or state of prostate-derived stromal primary cell PrSC in the presence of recombinant human Cyr6.1 and EDTA.
  • the diagrams (a) to (f) show the following test results, respectively.
  • Figure 7 shows the presence of recombinant human Cyr61 and anti-human Cyr61 polyclonal antibodies.
  • 3 shows the presence or absence or state of prostate-derived stromal primary cells PrSC in the presence.
  • the diagrams (a) to (d) show the following test results, respectively.
  • FIG. 8 shows the time-dependent activation (phosphorylation) of MAP kinase (ERK p42 / p44) in prostate-derived stromal primary cells PrSC by purified recombinant human Cyr61 by Western blotting.
  • Figure 9 shows the activation of a Western plot MAP in prostate derived stromal primary cells PrSC by with various stimuli computing ki nas e (ERK P 42 / p44) (phosphorus oxide). '
  • FIG. 10 shows the growth promoting activity of recombinant human Cyr61 on prostate-derived stromal primary cells PrSC.
  • the vertical axis shows the activity value (cell number) of intracellular dehydrogenase as an indicator of cell proliferation.
  • the horizontal axis indicates the presence or absence of the added growth factor PDGF.
  • Figure 11 shows the effect of anti-human Cyr61 polyclonal antibody on the growth-promoting activity of prostate-derived stromal primary cells PrSC induced by recombinant human Cyr61. Shows the suppression effect.
  • the vertical axis shows the activity value (cell number) of intracellular dehydrogenase as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence and concentration of the added growth factor PDGF.
  • FIG. 12 shows various probes used in the bDNA method established in the present invention. .
  • FIG. 13 shows the dilution linearity of the Cyr61 mRNA quantification test by the bDNA method established in the present invention. '
  • the diagrams (a) and (b) show the following test results, respectively.
  • the vertical axis represents alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an index of RNA amount, and the horizontal axis represents cell number.
  • RLU Read Luminescence Unit
  • FIG. 14 shows a calibration curve of Cyr6 RNA (standard substance) quantified by the bDNA method.
  • the vertical axis indicates alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an index of RNA amount, and the horizontal axis indicates the concentration of the standard substance.
  • RLU Read Luminescence Unit
  • FIG. 15 shows a dilution calibration curve of a human Cyr61 standard substance quantified by sandwich ELISA using two types of anti-human Cyr61 polyclonal antibodies established in the present invention.
  • the vertical axis shows peroxidase activity (absorbance) as an index of the amount of protein, and the horizontal axis shows the dilution ratio of the standard substance.
  • FIG. 16 shows the expression levels of Edg receptors (Edg2, Edg4, Edg7) in prostate-derived stromal primary cells PrSC and prostate-derived epithelial cells ⁇ BRF-55T.
  • the vertical axis represents the Edg receptor expression level per unit total RNA.
  • the Edg receptor copy number is shown, and the horizontal axis shows the cell type.
  • FIG. 17 shows an increase in Cyr61 and gene expression by LPA in prostate-derived stromal primary cells PrSC and its time course.
  • the vertical axis shows alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an indicator of the amount of Cyr61 RNA, and the horizontal axis shows the type of stimulus.
  • FIG. 18 shows an increase in the expression of the Cyr61 gene by LPA in the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T and its time course. .
  • the vertical axis shows alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an indicator of the amount of Cyr61 RNA, and the horizontal axis shows the type of stimulus.
  • FIG. 19 shows an increase in the production of Cyr61 protein by FBS in the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T and its time course.
  • the distribution diagrams (to (b) show the following test results, respectively.
  • the vertical axis shows peroxidase activity (absorbance) as an indicator of the amount of Cyr61 protein produced, and the horizontal axis shows the elapsed time after FBS stimulation.
  • FIG. 20 shows the expression status of the Cyr61 gene in various prostate-derived cell lines analyzed by RT-PCR.
  • the upper row shows the expression status of the Cyr61 gene
  • the lower row shows the expression status of the GAPDH (negative control) gene.
  • Figure 21 shows prostate cells induced by FBS by Western plotting.
  • 2 shows the inhibitory activity of Cyr61 antisense oligonucleotide on the production of Cyr61 protein in vesicles.
  • Lanes 1 to 4 show the results for the following cells, respectively.
  • Lane 1 FBS-unstimulated prostate-derived epithelial cell line BRF-55T.
  • Lane 2 prostate-derived epithelial cell line BRF-55 ⁇ 2 hours after FBS stimulation.
  • Lane 3 prostate-derived epithelial cell line BRF-55 ⁇ 2 hours after stimulation with FBS with antisense oligonucleotide.
  • Lane 4 prostate-derived epithelial cell line BRF-55 ⁇ 2 hours after stimulation with FBS with sense oligonucleotide (negative control).
  • FIG. 22 shows the morphology of the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T when Cyr61 protein production was suppressed.
  • Panel (a) shows the morphology of the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T 2 days after stimulation with FBS with the addition of the antisense oligonucleotide
  • panel (b) shows the addition of the sense oligonucleotide (negative control).
  • the morphology of prostate-derived epithelial cell line BRF-55T 2 days after stimulation with FBS is shown.
  • FIG. 23 shows the effect of Cyr61 antisense oligonucleotide on the growth of prostate-derived stromal primary cell PrSC.
  • the vertical axis shows the intracellular dehydrogenase activity value (cell number) as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence or absence of added FBS and the concentration of added oligonucleotide (antisense and sense).
  • FIG. 24 shows the effect of suppressing the proliferation of prostate-derived stromal primary cells PrSC when Cyr61 antisense oligonucleotide was added before stimulation with FBS.
  • FIG. 25 shows the effect of suppressing the growth of prostate-derived stromal primary cells PrSC when Cyr61 antisense oligogonutatide was added after stimulation with FBS.
  • the vertical axis shows the intracellular dehydrogenase activity value (number of cells) as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence or absence of added FBS and the concentration of added oligonucleotides (antisense and sense). .
  • Figure 26 shows the inhibitory effect of the compound (various concentrations) on Cyr61 gene expression in prostate cells identified by the method for identifying a substance that inhibits transcription of Cyr61 gene into mRNA in prostate cells established in the present invention. Show.
  • the vertical axis indicates the inhibition rate, and the horizontal axis indicates the concentration of the compound.
  • FIG. 27 shows the inhibitory effect of the compound (various concentrations) on Cyr61 protein production in prostate cells identified by the method for identifying a substance that inhibits Cyr61 protein production in prostate cells established in the present invention.
  • the vertical axis indicates the inhibition rate, and the horizontal axis indicates the concentration of the compound.
  • mammal in the present invention means a human, a magpie, a goat, a heron, a mouse, a rat, a hamster, and a guinea pig, and preferably a human, a magpie, a rat, a mouse Or hamsters, particularly preferably humans.
  • Cyr61 in the present invention is mammalian Cyr61, particularly preferably human Cyr61 (human Cyr61) amino acid sequence: GenBank Accession No. 000622 (SEQ ID NO: 3); cDNA sequence: GenBank Accession on No. NM— 001554 (SEQ ID NO: 2); Oncogene, Vol. 14. No. 14, p. 1753-1757, 1997; Oncogene, Vol. 16, No. 6, p. 747-754, 1998; Mol. Pathol., Vol. 50, No. 6, p. 310-316, 1997Z mouse Cyr61> GenBank Accession No. P18406; Mol. Cell. Biol., Vol. 10, No. 7, p.
  • Cyr61 is collectively referred to as C ⁇ family (Cyr61 (Cysteine-rich 61) / CTGF (connective tissue growth factor) / NOV (nephroblastoma overexpressed)), which is thought to be involved in cell proliferation, differentiation and tumor formation. It is one of the molecules encoded by each gene belonging to the gene group.
  • This group of genes are growth factor inducible imraeciiate-early genes whose expression is controlled by adding serum or growth factors to cells in the stationary phase. Encode an extracellular matrix-bound signal molecule with a conserved region and 38 cysteine residues.
  • Human Cyr61 is thought to be a secretory protein consisting of 381 amino acid residues and having a secretory signal peptide sequence at the N-terminus.
  • the molecular structure has four distinctive regions.
  • Region 1 called the insulin-like growth factor (IGF; binding module), has approximately 32% homology S with the N-terminal of six classical IGF-binding proteins (IGFBP 1-6).
  • Region 3 is a throrabospondin type 1 repeat, has a local motif of WSXCSXXCG (SEQ ID NO: 1), and is responsible for binding to sulfated saccharides, etc. It is called factor type C module and has the same structure as various von Willebrand factors. In this regard, it has been reported that Cyr61 binds to cell surface heparan sulfate proteodalican Region 4 is called the C-terminal module, and 10 cysteines within this region are reported.
  • This nerve growth factor NGF
  • transforming growth factor transforming growth factor- j3, TGF- ⁇
  • platelet-derived growth factor platelet derived growth factor, PDGF
  • Cyr61 from the cDNA library of mouse fibroblast cells that were serum-stimulated differential hybridization screening [in is Na heritage J3 ⁇ 4 obtained ⁇ was I child stranded, sits on chromosome 1 (1 P 22- 31).
  • Cyr61 in the present invention is not limited to the molecules having the previously reported amino acid sequence and structural characteristics, but also includes any previously reported or yet unidentified mutants derived from potential mammalian individual differences and The mutant Cyr61 encoded by the single nucleotide polymorphism of the gene encoding the wild-type Cyr61 is also included.
  • the term “physiological activity of Cyr61” refers to the growth, differentiation or morphology of prostate-derived cells (eg, epithelial cells, stromal cells) or the activity of MAP kinase in the cells described in the Examples below. Means any activity that has already been reported, not limited to Particularly preferred is proliferation, differentiation or morphology of prostate-derived cells (eg, epithelial cells, stromal cells) or activation of MAP kinase in the cells.
  • LPA as referred to in the present invention is an abbreviation for lysophosphatidic acid, and is composed of phosphatidic acid (PA) power S, phospholipinase 0 Al (Phospholipase A1; PLA1) or phospholipase A2.
  • Phospholipase A2; PLA2 is a substance that has a structure in which only one molecule of fatty acid is bonded to the glycerol skeleton by releasing one of the fatty acids by the action of (Phospholipase A2; PLA2).
  • LPA has a very large number of LPAs depending on the type of fatty acid, the bonding position of the fatty acid, and the type of bonding, and the LPA referred to in the present invention includes the LPA receptor defined below unless otherwise specified.
  • acyl LPA mainly containing saturated fatty acids such as palmitic acid (16: 0) and stearic acid (18: 0)
  • 2-acyl LPA It mainly contains unsaturated fatty acids such as linoleic acid (18: 2) and arachidonic acid (20: 4)
  • 1-alkyl LPA 1-alkenyl LPA, cyclic phosphatidic acid (cPA)
  • LPA referred to in the present invention includes any of those that bind to the LPA receptor and induce a physiological activity.
  • the LPA receptor in the present invention means a receptor on a cell membrane that transmits a signal into a cell by binding the above-mentioned LPA as a ligand and causes various physiological phenomena to a living body.
  • the Edg-2 receptor (vzg-1 receptor, also referred to as Rec.1.3. Receptor), as reported in the previous report defined below.
  • Edg-4 receptor also called 1 ⁇ 2 receptor
  • Edg-7 receptor lp A3 receptor.
  • prostate epithelial cells and stromal cells Te are each specific expression of Ed g 7 receptor and Edg2 receptor is observed.
  • the ⁇ substance '' constituting the present invention specifically, ⁇ one or more substances that inhibit the physiological activity of Cyr61, the transcription of mRNA of the gene encoding Cyr61 or the translation of the mRNA of Cyr61 into protein '' Means any naturally occurring substance or any substance prepared artificially.
  • Examples of the “substance” in the present invention include (1) an antibody, a polypeptide or a chemically synthesized compound that binds to Cyr61 and inhibits the physiological activity of Cyr61, and (2) encodes Cyr61. Oligonucleotides or chemically synthesized compounds that bind to genes and inhibit transcription into mRNA encoding Cyr61, (3) Rigonucleotides that bind to mRNA encoding Cyr61 and inhibit translation into Cyr61 Or a chemically synthesized compound.
  • the “antibody” includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a part of the monoclonal antibody that binds to Cyr61. Preferably it is a monoclonal antibody or a part thereof.
  • the monoclonal antibodies include not only monoclonal antibodies derived from non-human mammals, but also recombinant chimeric monoclonal antibodies (Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988 and No. 3,73,280), a recombinant human monoclonal antibody and a human monoclonal antibody (Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Japanese Patent Publication No.
  • polypeptide means any polypeptide that binds to Cyr61.
  • the polypeptide includes an oligopeptide, a fusion polypeptide, and Their chemical modifications are included. Oligopeptides can include peptides consisting of 5 to 30 amino acids, preferably 5 to 20 amino acids. The chemical modification should be designed for various purposes, such as an increase in blood half-life when administered to a living body or an increase in resistance or absorption to degradation in the gastrointestinal tract during oral administration. Can be.
  • the “oligonucleotide” refers to a gene useful as an antisense DNA drug or an antisense RNA drug designed based on the base sequence of a gene (including cDNA and genomic DNA) or mRNA encoding Cyr61.
  • Oligonucleotides containing partial nucleotide sequences of genes or mRNAs or chemically modified oligonucleotides obtained by chemically modifying them can inhibit transcription of the gene encoding Cyr61 into mRNA or translation of the raRNA into protein by hybridizing to the gene or RNA encoding Cyr61.
  • the “partial nucleotide sequence” means a partial nucleotide sequence consisting of an arbitrary number of bases at an arbitrary site of the gene or mRNA encoding the Cyr61.
  • the partial base sequence include a continuous partial base sequence of 5 to 100 bases, preferably a continuous partial base sequence of 5 to 70 bases, and more preferably a continuous partial base sequence of 5 to 50 bases.
  • oligonucleotide when used as an antisense drug, an increase in blood half-life (stability) when the oligonucleotide is administered to a patient's body, an increase in permeability of an intracellular membrane, or
  • chemical modification of a part of the base can be performed for the purpose of increasing resistance to degradation in the digestive tract or increasing absorption.
  • the chemical modification include a chemical modification of a phosphate bond, a ribose, a nucleic acid base, a sugar moiety, a 3 ′ and a 5 ′ or 5 ′ end in an oligonucleotide structure.
  • Modification of a phosphate bond may include one or more of the following linkages: a phosphodiester bond (D-oligo), a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond (S-oligo), a methylphosphonate bond (MP- (Oligo), a phosphoramidate linkage, a non-phosphate linkage and a methylphosphonothioate linkage, or a combination thereof.
  • Examples of the modification of ribose include a change to 2'-fluororibose or 2'-0-methylribose.
  • Modifications of nucleobases include changes to 5-produracil or 2-aminoadenine and the like.
  • “Chemically synthesized compound” refers to any compound excluding the above-mentioned antibodies, polypeptides and oligonucleotides, and is a compound having a molecular weight of about 100 to about 1000 or less, preferably about 100 to about 800. And more preferably a compound having a molecular weight of about 100 to about 600.
  • the above-mentioned polypeptide, a part (fragment) of the polypeptide and a fusion polypeptide are known in the technical field such as a chemical synthesis method, a cell culture method and the like, in addition to a genetic recombination technique described later. It can be produced by appropriately using a known method or its modification method.
  • an antibody that binds to Cyr61 refers to an antibody that expresses Cyr61 (particularly preferably human Cyr61) (natural cells, cell lines, tumor cells, etc.) and Cyr61 (particularly preferably human Cyr61).
  • a transformant, a purified or recombinant Cyr61 (particularly preferably, human Cyr61) polypeptide produced using a gene recombination technique so as to be expressed is used as an antigen, and the antigen is used as a mouse, rat, or hamster.
  • Natural antibodies obtained by immunizing mammals such as guinea pigs, magpies and goats, chimeric antibodies and human antibodies (CDR-grafted antibodies) that can be produced using gene recombination techniques, and Human antibodies that can be produced using human antibody-producing transgenic animals and the like are also included.
  • Monoclonal antibodies can be of any l g G, IgM, IgA, IgD or IgE And monoclonal antibodies having the following isotypes: Preferably, it is IgG or IgM.
  • Polyclonal antibodies (antisera) or monoclonal antibodies can be produced by existing general production methods. That is, for example, a mammal, preferably a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig, a heron, a cat, and a dog, may be added to the antigen as described above together with Freund's adjuvant, if necessary. Immunize pigs, goats, peas or stomachs, more preferably mice, rats, wild cats, musters, guinea pigs or magpies.
  • the polyclonal antibody can be obtained from serum obtained from the immunized animal.
  • a monoclonal antibody is prepared by preparing a hybridoma from the antibody-producing cells obtained from the immunized animal and a myeloma cell line (myeloma cell) having no autoantibody-producing ability, and cloning the hybridoma. It is produced by selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity for the antigen used for immunizing a mammal.
  • the monoclonal antibody can be specifically produced as follows. That is, the antigen as described above is used as an immunogen, and the immunogen is used together with Freund's Adjuvant, if necessary, together with a non-human mammal, specifically, a mouse, rat, Hamsters and guinea pigs are egrets, preferably mice, rats or hamsters (transgenes produced to produce antibodies from other animals, such as the human antibody-producing transgenic mice described below). Immunization is performed by one or several injections or implantations subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a footpad, or intraperitoneally (including animals).
  • immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days after the first immunization, and antibody producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the last immunization.
  • the number and time interval can be appropriately changed depending on the nature of the immunogen to be used and the like.
  • the preparation of a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be carried out according to the method of Koehler and Minoresutine et al. (Nature, Vol. 256, p. 495-497, 1975) and modifications according thereto.
  • spleen lymph nodes, antibody-producing cells preferably contained in the spleen, such as bone marrow or tonsil, obtained from a non-human mammal immunized as described above, and preferably, a mouse or rat.
  • C-cell fusion prepared by cell fusion with a mammal such as guinea pig, hamster, rabbit, human or the like, more preferably a mouse, rat or human derived myeloma cell having no autoantibody-producing ability.
  • myeloma cells obtained include mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8.63 (653), P3 / NS I / 1-Ag4-1 (NS-1), P3 / X63—Ag8.U1 (P3U1), SP2 / 0-A g 14 (Sp2 / 0, Sp2), PAI, FO or BW5147, rat-derived myeloma 210RCY3-Ag 2. 3., human-derived myeloma U -. 266AR1, GM1500- 6TG- A1 - 2, UC729 — 6, CEM_AGR, D1R11 or CEM-T15 can be used. .
  • hybridoma clones that produce monoclonal antibodies is performed by culturing hybridomas, for example, in microtiter plates, and immunizing the culture supernatant of the wells in which proliferation has been observed in the immunization described above.
  • the reactivity with the antigen can be measured by, for example, an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
  • the production of monoclonal antibodies from hybridomas can be carried out in vitro, or in vivo in mice, rats, monoremots, hamsters, or egrets, preferably in mice or rats, more preferably in ascites of mice. It can be performed by isolating from the obtained culture supernatant or ascites of a mammal.
  • the hybridomas are grown, maintained and preserved in accordance with various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method, and the monoclonal antibody is contained in the culture supernatant. It can be carried out using any known nutrient medium such as that used for producing E. coli or any nutrient medium derived and prepared from a known basal medium. '
  • Examples of the basic medium include a low calcium medium such as Ham's F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium, and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium.
  • the basic medium may contain, for example, serum, hormones, cytosolic acid and / or various inorganic or organic substances, depending on the purpose.
  • part of an antibody in the present invention means a partial region of the monoclonal antibody as described above, and specifically, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragment of antibody) ⁇ sFv, dsFv, disulphide stabilized Fv), a certain means dAb (single domain antibody), etc. (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, 441-456, 1996) ).
  • the prostate disease in the present invention specifically includes, for example, benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
  • Prostatic hypertrophy or benign prostatic hyperplasia is a disease that shows symptoms and pathology as reported in the previous report (Pharmacy, Vol. 51, No. 3, p. 3-50, 2000).
  • the “disease associated with prostate disease” in the present invention refers to dysuria or urination It refers to bladder dilation and renal failure associated with disability. Urinary disorders are classified into irritant symptoms (residual urination, urgency, frequent urination, nocturia) and obstructive symptoms (prolonged urination, prolonged urination, urinary gland disruption, small urinary glands, igimi). Is done.
  • the dysuria in the present invention means a state showing any of those symptoms. .
  • “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, bulking agents, • disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, viscous agents Agents, flavoring agents, solubilizing agents or other additives.
  • pharmaceutical compositions can be prepared c These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include topical solutions containing one or more active substances, formulated in a conventional manner, suppositories and pessaries for enteral administration.
  • the dosage may be the patient's age, sex, body weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient (such as the “substance” according to the present invention described above) contained in the pharmaceutical composition.
  • the dose can vary depending on the dose. Usually, the dose can be in the range of lO jug, per dose, or lOOOOmg (or 10 ⁇ g, 500 mg). However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be necessary.
  • the concentration of 0.1 ⁇ g antibody Zml carrier to 10 mg antibody Zml carrier in a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection is used. It can be produced by dissolving or suspending as such.
  • the injection thus produced is treated 1 to 100 mg / kg body weight, preferably 50 / zg to 50 mg / kg body weight per dose, for human patients who require be able to.
  • the administration form include medically appropriate administration forms such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection and intraperitoneal injection. Preferably it is an intravenous injection.
  • Injectables may be prepared as non-aqueous diluents (eg, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions and emulsions. You can also.
  • non-aqueous diluents eg, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil, alcohols such as ethanol
  • injections can be sterilized by filtration and sterilization through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide or irradiation.
  • Injectables can be manufactured as ready-to-use preparations. That is, it can be used as a sterile solid composition by freeze-drying or the like, dissolved in sterile distilled water for injection or other solvents before use.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a medicament for preventing the onset of prostate disease (particularly, benign prostatic hyperplasia, prostate cancer), suppressing the progress of prostate disease, or treating prostate disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention suppresses prostate diseases (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.), thereby suppressing symptoms such as urinary dysfunction caused by prostate disease, prostate disease (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.). Can be alleviated or treated.
  • compositions of the present invention the existing methods of treatment of prostate disease (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) (e.g., in the treatment of prostatic hypertrophy Koa androgen agents, alpha iota blockers or anticholinesterase It can also increase the therapeutic effect of prostate disease (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) when used in combination with drug therapies.
  • prostate disease such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer
  • prostatic hypertrophy Koa androgen agents, alpha iota blockers or anticholinesterase e.g., in the treatment of prostatic hypertrophy Koa androgen agents, alpha iota blockers or anticholinesterase It can also increase the therapeutic effect of prostate disease (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) when used in combination with drug therapies.
  • the present invention relates to the conversion of a gene encoding Cyr61 into mRNA.
  • the present invention relates to a method for identifying a substance capable of regulating transcription, translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, or production of Cyr61, and a method for identifying a substance capable of regulating the physiological activity of Cyr61.
  • the method of the present invention is a method of screening (screening) the substance.
  • any cells that can produce Cyr61 can be used.
  • they are epithelial cells or stromal cells derived from the prostate of a mammal (preferably human), and the cells may be primary cultured cells or established cell lines.
  • Such cell lines include, for example, DU-145 (ATCC No. HTB-81), PC-3 (ATCC No. CRL-1435) LNCaP.
  • FGC ATCC No.
  • any cell can be used as long as it has the ability to produce Cyr61.
  • various cells for example, bacteria (Escherichia sp., Bacillus sp.), Yeast (Saccharomyces sp.) Such as natural cells or artificially established recombinant cells commonly used in the technical field of the production of recombinant proteins. Genus, Pichia), animal cells or insect cells, and the like.
  • animal cells specifically, mouse-derived cells (C0P, L, C127, S P 2/0, NS- 1 or NIH3T3, etc.), rat-derived cells (PC12, PC12 h, etc.), hamster Cells (BHK and CH0 etc.), monkey-derived cells (C0S1, C0S3, C0S7, CV1, and Velo) and human-derived cells (HeLa, cells derived from diploid fibroblasts, HEK293 cells, myeloma cells, Namalwa, and the like).
  • mouse-derived cells C0P, L, C127, S P 2/0, NS- 1 or NIH3T3, etc.
  • rat-derived cells PC12, PC12 h, etc.
  • hamster Cells BHK and CH0 etc.
  • monkey-derived cells C0S1, C0S3, C0S7, CV1, and Velo
  • HeLa human-derived cells
  • One of the ⁇ methods for identifying a substance capable of regulating transcription of a gene encoding Cyr61 to mRNA, translation of mRNA encoding Cyr61 into protein, or production of Cyr61 '' of the present invention includes: The so-called reporter gene assay using the gene encoding the reporter protein and the properties of the protein is included.
  • reporter protein luciferase derived from fireflies or Glycyrrhiza or a jellyfish-derived GFP (Green Fluorescence Protein) is preferable.
  • the following method is representative of the reporter Gene Atsushi.
  • the identification of the compound using the present assay can be performed manually, but a so-called high-throughput system is automatically performed using a machine (robot).
  • a machine robot
  • high-throughput screening tissue culture engineering, Vol. 23, No. 13, p. 521-524; U.S. Pat. No. 5,670,113
  • cell and “substance” used in the above method have the meanings as defined above.
  • any of the previously reported methods can be used, For example, a branched DNA probe method (branched DNA; bDNA), an RT-PCR method and the like can be mentioned. Particularly preferred is the bDNA method.
  • the bDNA method can be carried out using a commercially available kit and according to the instruction manual attached to the reagent (for example, F Quant iGene Hig Volum Kit for the Direct Quantitation of Cel no. lular mRNA ").
  • any of the previously reported methods can be used, but is preferably used widely.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent as say.
  • stimulation for inducing the production of Cyr61 refers to a cell capable of producing Cyr61 (natural, wild-type, recombinant cells, etc.) having an activity of inducing or promoting the production of Cyr61 from the cell.
  • Means to have a substance that has Any substance can be used as long as it has an activity of inducing or promoting the production of Cyr61 from the cells, such as serum (for example, fetal bovine serum (FBS)) or LPA (as detailed above) and the like can be used.
  • serum for example, fetal bovine serum (FBS)
  • LPA as detailed above
  • IMAGE clone CDNA encoding 0RF of human Cyr61 obtained from a commercially available plasmid (called IMAGE clone) (IMAGE no.5 (dbEST ID: 2431291, GenBank accession: AI612743)) (SEQ ID NO: 2) It was inserted into plasmid PETD (manufactured by Novagen), creating the expression vectors P ETd / Cyr61mycHis. Escherichia coli BL21 codonPlus (DE3) -RIL competent cell (manufactured by Stratagene) was transformed with this expression vector by a conventional method.
  • the transformed strain was pre-cultured in LB medium, expression was induced with IPTG, and a culture solution containing recombinant human Cyr61 (to which His-Tag was added) was collected after 4 hours.
  • the expression of human Cyr61 was confirmed by easter blotting using an anti-His-tag polyclonal antibody (manufactured by Santa-Cruz).
  • the inclusion body fraction was collected from the collected culture supernatant, solubilized, and then subjected to affinity mouth chromatography using a Ni chelate column. Wash buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazono, 6 M urea, ImM 2-mercaptoethanol ( ⁇ 80)), then regenerate buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazono, ImM 2-Menolecaptoethanol ( ⁇ 80) and an elution buffer (20 mM Tris—HC1, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 0.1% Triton X-100 ( ⁇ 8.0))
  • the purified recombinant human Cyr61 surface was obtained. It was confirmed that human Cyr61 was purified by Western blotting using an anti-His-tag polyclonal antibody (manufactured by Santa-Cruz).
  • Recombinant human Cyr61 was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki) for ELISA, and incubated at room temperature for 2 hours to adsorb the recombinant human Cyr61 to the microplate.
  • fibronectin Boehringer
  • Bovine Serum Albumin BSA, Sigma
  • microplates were prepared in which each well was coated with recombinant Cyr61, fipronectin or BSA, respectively.
  • Prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; Catalog No. CC) cultured in flasks using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics; CC-3205) -2508) was gently recovered using a phosphate buffer containing 10 mM EDTA and 0.1% BSA.
  • the recovered prostate-derived stromal primary cells, PrSC were transformed into a basal medium SCBM (Clonet) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% ⁇ -sylin / streptomycin (Sigma). Suspended in ICS, catalog number CC-3204), seeded on the microplate described above (1 ⁇ 10 4 wells), and incubated at 37 ° C. for 2 hours. ',
  • the wells inoculated with the cells were washed four times with a basal medium for stromal cells SCBM (100 ⁇ l; Clonet ics) containing 0.01% BSA and 1% penicillin / streptomycin.
  • a basal medium for stromal cells SCBM 100 ⁇ l; Clonet ics
  • a basal medium for stromal cells SCBM manufactured by Clonetics
  • the Calsein-AM / DMSO solution contained in was diluted 50-fold with a basal medium for stromal cells SCBM (manufactured by Clonetics) and added to each well (10 1 / well). Then, the cells were incubated at 37 ° C for 2 hours, and the number of viable cells adhered was measured by measuring the fluorescence of Calsein taken up into the cells and hydrolyzed by intracellular esterase.
  • Example 2-1> The inhibition of the adhesion-inducing activity of purified human Cyr61 to prostatic stromal cells, as shown in Example 2-1>, was tested as follows.
  • Recombinant human Cyr61 was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated for 2 hours at room temperature, and the recombinant human Cyr61 was adsorbed to the microplate. Next, the supernatant was discarded, and each gel was washed three times with a phosphate buffer solution (200 ⁇ ) containing 0.1% BSA. In this way, a microphone opening plate in which each well was coated with recombinant Cyr61 was prepared.
  • heparin manufactured by Wako Pure Chemical Industries; 100 ig / ml
  • EDTA manufactured by GIBCO; 50 mM
  • EDTAZ heparin
  • 50 mMZ 100 g / ml
  • SCBM basal medium for stromal cells SCBM containing 0.01% of BSA (manufactured by Sigma) and 1% of penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma) was used.
  • the prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; Cat. No.CC-2508) cultured in flasks were grown in 10 mM EDTA and 0.1% using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics). Gently recovered using phosphate buffer containing BSA. Recovered prostate-derived stromal primary cells PrSC BSA and 1 ° /. Suspended in a basal medium for stromal cells SCBM (manufactured by Clonetics) containing penicillin / streptomycin, and inoculated in the above microplate at 50 w 1 / ⁇ -ell (1 ⁇ 10 4 cells). Incubated at ° C for 2 hours.
  • the Calsein-AM / DMS0 solution contained in the Cell Counting Kit-F was diluted 50-fold with the basal medium for stromal cells SCBM and added to each well (10 // 1 / ⁇ L).
  • the cells inoculated with the cells were washed four times with a basal medium for stromal cells SCBM (100 ml) containing 0.01% BSA and 1% penicillin / streptomycin.
  • the cells were incubated at 37 ° C for 2 hours, and the number of viable cells adhered was measured by measuring the fluorescence of Calsein taken up into the cells and hydrolyzed by intracellular esterase.
  • an antiserum or 0 / -glopurin fraction was prepared by immunizing a heron or a goat in a conventional manner.
  • the antiserum or ⁇ -glopurin fraction was filtered through a 0.45 ⁇ filter, and then subjected to affinity chromatography using a protein ⁇ column. Provided. After washing with washing bars Tsu off ⁇ chromatography (2mM KH 2 P0 4, 18mM Na 2 HP0 4, 154mM NaCl (pH7.4-7.8)), Kuen acid (elution) buffer (67mM Citrate, 77mM Na 2 HP0 4, 150mM eluting with 3.0)), 0.75M Tris - - NaCl (pH3.6-4.0) or 87mM Citrate, 41mM Na 2 HP0 4 ) 150mM NaCl (P H2.7 HC1 immediately with buffer (pH 9.0) neutralization did.
  • Tsu off ⁇ chromatography 2mM KH 2 P0 4, 18mM Na 2 HP0 4, 154mM NaCl (pH7.4-7.8)
  • Kuen acid (elution) buffer 67mM Citrate
  • the obtained neutralized solution was dialyzed for 24 hours with a phosphate buffer (-) and filtered through a 0.22 ⁇ 11! Filter (manufactured by Millipore) to obtain the following purified anti-human Cyr61 polyclonal antibody. .
  • the expression vector pcDNA3 / Cyr61 which was prepared by inserting human Cyr61 cDNA containing the translation region (SEQ ID NOs: 2 and 3) into plasmid pcDNA3 (manufactured by Envitrogen), was prepared. And pEFlraycHisA (manufactured by Invitrogen), and the prepared expression vector pEFlmycHisA / Cyr61mycHis was used.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the cell spreading activity of the purified human Cyr61 prepared in Example 1 on prostate-derived stromal cells was tested as follows.
  • Recombinant human Cyr61 (0.16 gZ well, 0.5 zg / well) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (Iwaki), incubated at room temperature for 2 hours, and the recombinant human Cyr61 was micronized. The plate was adsorbed. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer; 0.5 g / ml) was used as a positive control, and BSA (manufactured by Sidama; 0.5 g / ml) was used as a negative control. Then, the supernatant was discarded and each well was removed at 0.1 ° / well. It was washed three times with a phosphate buffer solution 1) containing BSA. In this way, microplates were prepared in which each gel was coated with recombinant Cyr61, fibronectin, or BSA.
  • a phosphate buffer solution 1 containing BSA.
  • PrSC Primary prostate-derived stromal primary cells, PrSC (Clonetics; Cat.No.CC-2508), cultured in flasks using SCGM (Clonetics), a growth medium for stromal cells, containing 10 mM EDTA and 0.1% BSA The solution was gently recovered using a phosphate buffer solution.
  • Primary prostate-derived stromal primary cells, PrSC were converted to basal medium for stromal cells SCBM (Clonetics) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). And seeded on the above-mentioned microphone-mouth plate (1 ⁇ 10 4 wells). Incube at 37 ° C The morphology was observed over time and photographed 2 hours later.
  • Fig. 5 shows the results.
  • Recombinant human Cyr61 (0.16 gZ well, 0.5 g / well) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated at room temperature for 2 hours, and the recombinant human Cyr61 was micronized. The plate was adsorbed. At this time, fibronectin (Boehringer; 0.5 ⁇ l) was used as a control. Then, the supernatant was discarded, and each well was washed three times with a phosphate buffer solution (2001) containing 0.1% BSA. Thus, a microplate plate in which each well was coated with recombinant Cyr61 or fipronectin was prepared.
  • EDT.A (manufactured by GIBC0; 50 mM) was added to each well at 501 wells, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. At this time, a basal medium for stromal cells SCBM containing 0.01% of BSA (manufactured by Sigma) and 1% of basin-siline / streptomycin X Sigma) was used as a negative control.
  • Prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) cultured in a flask using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics) and 0.1 mM EDTA and 0.1% Gently recovered using phosphate buffer containing 2% BSA.
  • the recovered prostate-derived stromal primary cells, PrSC are suspended in SCBM (Clonetics), a basal medium for stromal cells containing 0.01% BSA and 1% penicillin / streptomycin. Seed at 1 / well (1 x 10 4 zwells), incubate at 37 ° C and age Morphological observation was performed, and photographs were taken 2 hours later.
  • Fig. 6 shows the results.
  • Example 4 The inhibition of the cell spreading activity of human Cyr61 shown in 4-1> on prostatic stromal cells was tested as follows.
  • Recombinant human Cyr61 (0.16 gZell, 0.5 ⁇ / ⁇ ⁇ ) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated at room temperature for 2 hours, and the recombinant human Cyr61 was added to the microphone. Adsorbed to the mouth plate. At this time, as a control, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 g / well) was used. Next, the supernatant was discarded, and each well was washed three times with a phosphate buffer solution (2001) containing 0.1% BSA. In this way, a microplate plate was prepared in which each insert was coated with a modified Cyr61 or fibronectin.
  • each well was prepared by adding the above-prepared rabbit ego anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1 to the wells in a 2 ⁇ g well and incubating at 37 ° C. for 2 hours.
  • Egret IgG manufactured by Chemicon was used as a negative control.
  • Prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; Cat. No. CC-2508) cultured in a flask were cultured in 10 mM EDTA and 0.1% stromal cells using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics). Gently recovered using phosphate buffer containing BSA. The recovered prostate-derived stromal primary cells, PrSC, were transferred to a basal medium for stromal cells, SCBM (Clonetics), containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). Suspended, as described above The microplate was seeded at 50/1 Nowell, (1 ⁇ 10 4 cells / well), incubated at 37 ° C., observed over time, and photographed 2 hours later. Fig. 7 shows the results.
  • MAP kinase (ERK p42 / P 44 ) activation in prostate cells purified human Cyr61 prepared in Example 1 was tested as follows.
  • Recombinant human Cyr61 (0.5 / well) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated at room temperature for hours, and the recombinant human Cyr61 was adsorbed to the microplate.
  • fibronectin manufactured by Boehringer Co .; 0.5 g / ⁇ l
  • poly-L-lysine (manufactured by Sigma; 0.5 / g / ⁇ l) was used as a negative control.
  • the supernatant was discarded and each gel was washed three times with a phosphate buffer solution (2001) containing 0.1% BSA. In this manner, microplates in which each well was coated with recombinant Cyr61, fipronectin or poly-L-lysine were prepared.
  • the prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) cultured in a flask using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics) and 10 mM EDTA and 0.1% Gently using a phosphate buffer containing BSA.
  • the recovered prostate-derived stromal primary cells PrSC were transformed into a basal medium for stromal cells SCBM (Clonetics) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). were suspended in Ltd.) were seeded into microplates above (1 10 4 Weru). The cells were incubated at 37 ° C and the cell lysate was collected over time.
  • MAP kinase ERK P 42 / p44
  • Activation (phosphorylation) of ERK monoclonal antibody manufactured by Cell Signaling Technology
  • anti-ERK monoclonal antibody manufactured by Cell Signaling Technology
  • activated and non-activated Recognition was confirmed by Western blotting.
  • the growth promoting activity of the purified human CyrS1 prepared in Example 1 on prostate cells was tested as follows.
  • Recombinant human Cyr61 (0.5 ⁇ g Z-well) was added to each well of a 96-well microtiter plate (Falcon), incubated at 4 ° C, and the recombinant human Cyr61 was added to the microtiter plate. The plate was adsorbed. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 g / well) was used as a comparative control, and no adsorption was used as a negative control. Subsequently, the supernatant was discarded, and each buffer was added with a phosphate buffer solution (100 / l) containing 0.5% BSA, and incubated at 37 ° C for 2 hours, followed by blocking.
  • a phosphate buffer solution 100 / l
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • a viable cell count reagent WST-8 manufactured by Nacalai Tester was added to each well and incubated at 37 ° C. for 3 hours.
  • the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured using a microplate reader (Molecular Device).
  • a negative control the test was performed in the same manner as above without adding PDGF. .
  • Recombinant human Cyr61 was shown to have growth-promoting activity against PrSC, a prostate-derived stromal primary cell. It was also confirmed that it had a growth-promoting activity against prostate-derived stromal primary cells PrSC in the presence of human PDGF.
  • Recombinant human Cyr61 (0.5 zg / well) is added to each well of a 96-well microtiter plate (Falcon), incubated at 4 ° C for 1 hour, and the recombinant human Cyr61 is adsorbed to the microtiter plate. I let it. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 ⁇ g well) was used as a comparative control, and no adsorption was used as a negative control. Next, the supernatant was discarded, and a phosphate buffer (1001) containing 0.5% BSA was added to each gel, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours to block.
  • a phosphate buffer 1001 containing 0.5% BSA
  • each plate was incubated with human platelet-derived growth factor (R &D; platelet derived growth factor (PDGF)) (0.5 ng / wenore) at 501 / wellenole and incubated at 37 ° C for 6 days.
  • R &D platelet derived growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • a live cell count reagent WST-8 manufactured by Nacalai Tester was added to each of the tubes, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 3 hours.
  • the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 mn) was measured using a microplate reader (Molecular Device).
  • a negative control the test was performed in the same manner as above without adding or adding PDGF.
  • RNA quantification by the branched DNA probe method was performed according to the standard procedure described in the technical bulletin provided by the company (QuantiGene High Volume Kit for the Direct Quantitation of Cellular mRNA). The procedure is available on the Bayer website.
  • Probe Extender Capture Extender (CE), labeling extenders (Label Extender, LE) and blocking probes (Blocking Probe)
  • CE Capture Extender
  • Label Extender LE
  • Blocking Probe blocking probes
  • Dilution linearity test-Dilution linearity was evaluated using prostate-derived stromal primary cell PrSC (Clonetics; Cat. No. CC-2508) and prostate from which prostate Cyr61 gene expression was confirmed. The following tests were performed using the epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF). Using a growth medium for stromal cells SCGM (manufactured by Clonetics), a cell lysate of prostate-derived stromal primary cells PrSC cultured in a flask was prepared using the Lysis Mixture attached to the kit.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Sigma penicillin / streptomycin
  • RNA was quantified by the branched DNA probe method according to a standard procedure.
  • Fig. 13 shows the results.
  • prostate-derived stromal primary cell PrSC and prostate-derived epithelial cell line BRF-55T Test range (cell number concentration: 0. 5 X 10 4 cells ⁇ 4 X 10 4 cells / Ueru) good dilution linearity in is confirmed.
  • T7 RNA polymerase (Promega; Ribomax Large) was prepared using the expression vector pcDNA3 Cyr61 obtained by inserting the human Cyr61 cDNA containing the translation region prepared in Example 3-2> into Plasmid pcDNA3 (Invitrogen). Scale RNA-Product ion System) 4 Cyr61 RNAs in vitro! /, was prepared.
  • the polyclonal antibody 070-3 derived from normal egret prepared above was used as the polyclonal antibody 070-3 derived from normal egret prepared above.
  • This polyclonal antibody is characterized in that it has high reactivity with human Cyr61 and does not show reactivity with mycHis-tag.
  • each well of a 96-well ELISA microplate was added and incubated at room temperature for 1 hour to adsorb the polyclonal antibody 070-3 to the microplate.
  • each well was washed with 200 ⁇ l of a phosphate buffer, and a phosphate buffer containing 3% BSA (200 1 / well) was added to each well.
  • the site where no antibody was bound was blocked by incubating at room temperature for 2 hours or at 4 ° C. Then, place the plate in phosphate buffer
  • the sandwich ELISA for human Cyr61 quantification established in the present invention is as follows. ⁇
  • Example 8-1> To each well of the antibody-immobilized microplate prepared in Example 8-1>, a measurement sample (50 1 / well) was added and incubated at room temperature for 2 hours. After washing the microtiter plate three times with phosphate buffer 200 1 / well containing 0.1% Tween20, each well contains 0.5% BSA and 0.1% Tween20. Goat anti-human prepared in Example ⁇ 3-1> diluted with phosphate buffer. Add Cyr61 polyclonal antibody 069-2 (0.15 g / 501 / well) and incubate at room temperature for 1 hour. did.
  • the microplate was then washed three times with 200 1 ⁇ ⁇ of phosphate buffer containing 0.1% Tween 20 and then 0.5 ° /.
  • a biotin-labeled anti-goat IgG antibody (manufactured by DAK0) diluted 10000-fold with a phosphate buffer containing BSA and 0.1% Tween20 was added to each well, and incubated at room temperature for an additional hour.
  • the microplate was then placed at 0.1 ° /.
  • Streptavidin-Horse rusted peroxidase 1 TM diluted 3000-fold with phosphate buffer containing 0.5% BSA and 0.1% Tween20 (Streptoavi din-norseradi) sh peroxidase ⁇ ⁇ , ⁇ , manufactured by Manham was added to each gel and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Microplates were washed with 200 ⁇ l of phosphate buffer containing 0.1% Tween20.
  • Example A standard sample was prepared from the cell lysate of the African green monkey kidney fibroblast cell line COS-7 (ATCC; CRL-1651) transiently expressing human Cyr61 prepared in the usual manner in 3-2>. (Standard), and a calibration curve was prepared using the sandwich ELISA established in Example 8-2>.
  • prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) and prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF), the following tests were performed.
  • Edg receptor specific primers Edg2> SEQ ID Nos. 42 and 43; Edg4> SEQ ID Nos. 44 and 45; Edg7> SEQ ID Nos. 46 and 47.
  • the expression level of Edg receptors was determined from the uptake of SYBR Green I.
  • Edg2 and Edg4 were confirmed in prostate-derived stromal primary cells PrSC and prostate-derived epithelial cell line BRF-55T. Expression of only Edg7 in prostate derived stromal primary cells PrSC is confirmed, expression of Ed g 7 in prostate ⁇ epithelial cell line BRF- 55T was shown to be very low.
  • SCBM Basal medium for stromal cells
  • BSA BSA
  • penicillin / streptomycin Sigma
  • LPA (18: 1, 14: 0, 16: 0, 18: 0) (final concentration 10 M / well) was added to each well and incubated at 37 ° C for 1 hour, 6 hours, and 18 hours. .
  • FBS and defatted FBS were added, and as a negative control, the test was carried out in the same manner as above without any addition.
  • Example 7-1> a template for quantification of human Cyr61 mRNA designed in Example 7-1> was used.
  • Cell lysates were prepared using the Lysis Mixture provided with the kit to which various lobes (CE, LE, Blocking Probe) were added.
  • CE, LE, Blocking Probe various lobes
  • mRNA was quantified by the branched DNA prop method constructed in Example 7 according to standard procedures.
  • Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was transformed with 10% FBS (manufactured by JRH) and 1% penicillin / Using RPMI1640 medium (manufactured by Nikken Biomedical Research Institute) containing streptomycin (manufactured by Sigma), the cells were seeded on microtiter plates (1 ⁇ 10 4 cells).
  • Example 7-1> the Lysis attached to the kit to which various probes for quantifying human Cyr61 mRNA (CE, LE, Blocking Probe) designed in Example 7-1> were added.
  • a cell lysate was prepared using Mixture.
  • RNA was quantified by the branched DNA prop method constructed in Example 7 according to standard procedures.
  • Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was added to RPMI1640 medium containing 0.01% BSA (manufactured by Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma). The plate was inoculated into a 96-well microtiter plate (5 ⁇ 10 4 cells / well) and incubated at 37 ° C.
  • FBS final concentration 2% Z-well; manufactured by JRH
  • Lysis buffer 0.1%
  • a cell lysate was prepared using Tween 20, 20raM EDTA and 1% Elugent (a phosphate buffer containing CALBIOCHEM).
  • Elugent a phosphate buffer containing CALBIOCHEM
  • FBS final concentration 2% ZL ;: TRH was added and incubated at 37 ° C for 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours or 8 hours, and a cell lysate for SDS-PAGE was prepared using a sample buffer (Owl).
  • sample buffer Owl
  • Cyr61 gene in the following various human prostate-derived cell lines was tested by RT-PCR using Cyr61-specific primers according to the conventional method.
  • FGC ATCC No. CRL-1740
  • PrSC Human prostate-derived stromal cell line
  • Human prostate-derived epithelial cell line PZ-HPV-7 (ATCC No. CRL-2221)
  • Human prostate-derived epithelial cell line (cancer cell) PC-3 (ATCC No. CRL-1435) Human prostate-derived smooth muscle cell line PrSMC (Clonetics)
  • Cyr61 gene was confirmed in all prostate-derived cell lines except LNCaP. FGC cells. The cell types examined in this study showed higher expression of the Cyr61 gene in stromal cells and smooth muscle cells than in epithelial cells. [Example 12] Inhibition of Cyr61 protein production in prostate cells by antisense oligonucleotide
  • Cyr61 antisense oligonucleotide The inhibitory effect of Cyr61 antisense oligonucleotide on the production of Cyr61 protein in prostate cells induced by stimulation with FBS was as follows.
  • Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was converted to RPMI 1640 medium containing 0.01% BSA (manufactured by Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma). The seeds were inoculated on a 24-well microtiter plate (7 ⁇ 10 4 cells / well) using Niken Biomedical Research Institute).
  • antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 48
  • sense oligonucleotide SEQ ID NO: 49
  • the antisense oligonucleotide is a phosphorothioate antisense oligonucleotide having a modified phosphate bond.
  • RPMI 1640 medium containing prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF) and 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) The seeds were seeded on a 96-well microtiter plate (1 ⁇ 10 4 cells / well) using (Nikken Biomedical Research Institute).
  • antisense oligonucleotides (same as above) or sense oligonucleotides (same as above) for the human Cyr61 gene were added to each well (final concentration of wells). . C-incubated.
  • FBS final concentration 2% / Pell; manufactured by JRH
  • Cyr antisense oligonucleotide (same as above) or sense oligonucleotide (same as above) was added to each well (final concentration 0.2, 0.4, 0.8 ⁇ l) and incubated at 37 ° C.
  • FBS final concentration 2% / ⁇ ⁇ ; manufactured by JRH
  • WST-8 viable cell counting reagent WST-8 (10 1 / ⁇ ; (Nakarai Testa) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 3 hours.
  • the absorbance at 450 nm (reference wavelength 650 nm) was measured using a microplate reader (Molecular Device).
  • a negative control the test was performed in the same manner as above without adding FBS and oligonucleotides. '
  • the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured using a microplate reader (Molecular Device).
  • a negative control the test was performed in the same manner as above without adding FBS (manufactured by JRH) and oligonucleotides.
  • Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF) was transformed into RPMI 1640 medium containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). Nikken and biomedical Laboratories, Inc.) seeded in 96-well Maikurota Ita first plate with (1 10 4 Weru) was Ichito base one ⁇ Incubate at 37 ° C.
  • each of the various test compounds (various concentrations; final concentration of 10 ⁇ L) was added to each well, and the mixture was further incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • FBS manufactured by JRH; final concentration 2% gel
  • LPA 18: 1 final concentration 1 ml
  • Example 7-1> the cell lysate was used. Prepared. Then, the amount of Cyr61 mRNA in each cell lysate (1001) was quantified by the branched DNA probe method constructed in Example 7 according to standard procedures.
  • GAPDH RNA was also quantified by a branched DNA probe method using various probes (CE, LE, Blocking Probe) for quantification of GAPDH mRNA which were separately designed as a control.
  • the measured values for each test substance were compared with those obtained from control (including negative control) tests to identify a number of compounds that inhibited transcription of the Cyr61 gene to mRNA in prostate cells. .
  • the identified compounds were induced by stimulation of FBS and LPA (18: 1) respectively.
  • FBS and LPA 18: 1 respectively.
  • increased expression of the Cyr61 gene was significantly suppressed in a concentration-dependent manner.
  • the compound did not suppress the increase in the expression of the GAPDH gene in the control test, and thus was a compound that specifically suppressed the expression of the Cyr61 gene.
  • the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF.) was reconstituted with 0.01% BSA (Sigma) and 1% Using a RPMI 1640 medium (manufactured by Nikken Biomedical Research Laboratories) containing penicillin / streptomycin (manufactured by Nikken Biomedical Research Laboratories), seeded (1 ⁇ 10 4 cells / well) on a 96-well microtiter plate Incubated at 37 ° C.
  • test compounds (various concentrations; final concentration 10 M / well; including the compound identified in Example 13-1>) was added to each well, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2 hours.
  • the test was carried out in the same manner as above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control.
  • the measured values determined for each test substance were compared to those determined in control (including negative control) tests to identify a number of compounds that inhibited Cyr61 protein production in prostate cells. Among these, the compounds identified in Example 14-1> were also included.
  • Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was 0.01. /. 96-well microtiter plates using RPMI 1640 medium (Niken Biomedical Research Laboratories) containing BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) Plates were seeded (1 x 10 4 cells) and incubated at 37 ° C.
  • each of the various test compounds (final concentration: ⁇ ) was added to each well, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2 hours.
  • the test was performed in the same manner as described above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control.
  • FBS manufactured by JRH; 2% final concentration
  • [3 ⁇ 4] -Thymidine (lCiZell) was added to each plate, and further 37 ° C was added. Incubated at C for 6 hours.
  • the cells were collected using a Micromet 196 Cell Harvester (Packard), and the amount of [] -Thymidine incorporated into the cells was measured using a TopCount (Packard).
  • the measured values determined for each test substance were compared to those determined in control (including negative control) tests to identify a number of compounds that inhibited prostate cell proliferation.
  • the compounds identified in Examples 13-1> and 13-2> were also included.
  • the identified compounds significantly inhibited the proliferation of prostate-derived epithelial cells induced by FBS.
  • the compound was also shown to suppress cell growth by suppressing Cyr61 protein production in the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF).
  • BRF-55T prostate-derived epithelial cell line
  • ⁇ 13-4> A compound that inhibits the physiological activity of Cyr61 against the proliferation of blood cells of the blood cell line
  • the compound that inhibits the biological activity of Cyr61 identified in Example 13-3> is a blood cell line that does not express Cyr61 It was examined whether or not it has an effect on cell proliferation induced by stimulation of FBS and IL-2 of cells (NK cells).
  • Human NK cell line KHYG-1 Human Science Research Resource Bank; JCRB0156 was supplemented with 10% FBS (manufactured by JRH), 10 Unit / ml IL-2 (manufactured by PBL) and 1% penicillin. down / be sampled replica Tomai Shin seeded in 96-well microtiter plate using RPMI 1640 medium containing (sigma) (produced by Nikken Institute for biomedical Research, Inc.) (IX 10 4 cells / Ueru) was.
  • each of the compounds (final concentration of ⁇ ⁇ ) which inhibits the physiological activity of Cyr61 (proliferation of prostate cells) identified in the above Example 13-3> was added, and further added at 37 ° C. Incubated for days. The test was carried out in the same manner as above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can prevent the onset of prostate disease (for example, prostatic hypertrophy and prostate cancer), suppress the progression of the prostate disease, or prevent the prostate disease It is useful as a medicine for treating
  • the pharmaceutical composition of the present invention reduces or treats symptoms such as dysuria caused by prostate disease (particularly prostatic hypertrophy) by suppressing prostate disease (particularly prostatic hypertrophy).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of prostate diseases (for example, in the case of treatment of benign prostatic hyperplasia, an antiandrogen agent, an o; l blocker, or an anticholinesterase). It is possible to increase the therapeutic effect of the prostate disease (for example, prostatic hyperplasia, prostate cancer, etc.) by using the drug in combination with a drug treatment with an agent.
  • SEQ ID NO: 10 Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 1
  • SEQ ID NO: 3 6 Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.

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Abstract

A method and medicinal agent capable of preventing the sideration of prostatic diseases (prostate hypertrophy, carcinoma prostata, etc.) and capable of effecting progress inhibition or treatment of prostatic diseases; and a method and medicinal agent capable of treating urinary disturbance caused by prostatic diseases (especially, prostate hypertrophy). In particular, it has been discovered that the expression of Cyr61 is observed in various cell strains derived from the prostate gland and prostate hypertrophy patient's tissue. The treatment of prostatic diseases can be accomplished by controlling the physiological activity of Cyr61 and translation of gene coding for Cyr61 to mRNA or translation of the mRNA to polypeptide.

Description

明細書  Specification
前立腺疾患治療用医薬組成物 技術分野  Pharmaceutical composition for treating prostate disease
本発明は、 （ 1 ) Cyr61 ( cysteine- ri ch 61 ) の生理活性、 Cyr61 をコ 一ドする遺伝子の mRNAの転写若しくは Cyr61をコードする mRNAの蛋白 質への翻訳を阻害する活性を有する物質を含んでなる前立腺疾患 （特に は前立腺肥大症、 前立腺癌.)' 若しくは該疾患に付随する疾患 （特には排 尿障害） の進行の抑制または該前立腺疾患若しくは付随疾患を治療する ための医薬組成物、 （2 ) 該物質を同定する方法及び （ 3 ) 前立腺疾患の 兆候若しくは有無を診断する方法等に関する。 背景技術  The present invention relates to (1) a substance having the activity of inhibiting the physiological activity of Cyr61 (cysteine-rich 61), the transcription of mRNA of a gene encoding Cyr61, or the translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein. A pharmaceutical composition for suppressing the progress of a prostate disease (particularly, benign prostatic hyperplasia, prostate cancer) or a disease associated with the disease (particularly, dysuria) or treating the prostate disease or a related disease. (2) a method for identifying the substance; and (3) a method for diagnosing the signs or presence of prostate disease. Background art
高齢者の割合が増加の一途とたどる我が国において、 男性高齢者の健 康的な生活を著しく損なう代表的な疾患は、 5 0歳代以上の男性におい て排尿障害を引き起こす原因となっている前立腺肥大症 （ Beni gn prostat ic hyperplas ia； BPH) と悪性腫瘍を伴う前立腺癌である。  In Japan, where the proportion of elderly people is ever increasing, a prominent disease that significantly impairs the healthy life of elderly men is the prostate gland that causes dysuria in men aged 50 and older. Prostate cancer with benign prostatic hyperplasia (BPH) and malignancy.
まず前立腺肥大症であるが、 前立腺肥大症の成因には、 遺伝的要因及 び食生活等の環境的要因など多数の要因が関与すると考えられるが、 未 だその全貌は明らかとされていない。 現在の我が国における前立腺肥大 症患者は厚生省による調査では 3 0乃至 4 0万人とされているが、 実際 には 4 0 0万人以上と推定されている。  First, prostatic hyperplasia is thought to be caused by a number of factors, including genetic factors and environmental factors such as diet, in the pathogenesis of prostatic hypertrophy, but the full picture has not yet been clarified. At present, the Ministry of Health and Welfare estimates that the number of patients with benign prostatic hyperplasia in Japan is 300,000 to 400,000, but it is actually estimated that it is over 400,000.
前立腺は若年期以後に発育増大しながら、 3 0歳代で正常の大きさで ある胡挑ほどの大きさに成長する。 しかしながら、 3 0歳代以降では、 前立腺の内腺部分に線維筋性の間質部分と腺性部分が混合した状態で肥 大した良性の腺腫が発生し、 この腺腫の増大化が即ち前立腺肥大症であ る （例えば、 J. Urol . , 1984, Vol. 132, p. 474- 479を参照）。 前立腺肥大症の発生頻度は、 3 0乃至 4 0歳代で約 7. 7%、 5 0歳代 で約 40%、 6 0歳代で約 67. 3%、 7 0歳代で約 92%、 8 0歳代では 100% であったとの報告がなされている（例えば、 Jap, J. Uro l . , 1967, Vol . 58, p. 814を参照）。 この発生頻度は、 欧米での報告とほぼ同様である。 この 良性腺腫の肥大に伴い、 7 5歳ではその約 50%において尿の勢いが弱く 、 なるという障害が生じる。 この前立腺肥大により、 8 0歳代ではその約 80%において、 何らかの排尿障害が生じる （例えば、 Prostate, 1990, Vol. 16， P253-261を参照）。 The prostate grows to a size similar to the normal size of Hu at the age of thirty, growing and growing after youth. However, from the age of thirties onwards, enlarged benign adenomas occur in the prostate inner glands with a mixture of fibromuscular stromal and glandular parts, and the adenomas are enlarged, that is, prostatic hyperplasia. With illness (See, for example, J. Urol., 1984, Vol. 132, p. 474-479). The incidence of benign prostatic hyperplasia is about 7.7% in the 30s to 40s, about 40% in the 50s, about 67.3% in the 60s, and about 92% in the 70s. In the 80s, it was reported that it was 100% (see, for example, Jap, J. Urol., 1967, Vol. 58, p. 814). The frequency of this occurrence is similar to that reported in Europe and the United States. With the enlargement of this benign adenoma, at the age of 75, about 50% of the urine has a weak urinary dysfunction. This enlargement of the prostate causes some dysuria in about 80% of those in their 80s (see, for example, Prostate, 1990, Vol. 16, pages 253-261).
上述したとおり、 前立腺肥大の原因と発生のメカニズムは未だ十分に は解明されていないが、 4 0歳.頃から起こる性ホルモンの逆転現象、 即 ち、 男性ホルモンのテス トステロンの分泌減少と副腎で産生される女性 ホルモンのエス トロゲンの分泌量の増加により誘導される前立腺の間質 成分の増殖がその原因の一つとも言われている。  As described above, the cause and mechanism of the development of prostatic hypertrophy are not yet fully understood, but the reversal of sex hormones that occurs around the age of 40, that is, decreased secretion of the male hormone testosterone and adrenal glands. It is said that one of the causes is the proliferation of stromal components of the prostate, which is induced by an increase in the amount of estrogen, a female hormone produced.
臨床症状的には、 前立腺肥大症により起こる排尿障害は、 上述した内 腺内に生じる良性腺腫の増大、 前立腺被膜の弾力性の低下、 及び膀胱収 縮力の低下の 3つが大きな成因である （例えば、 Urol. Cl in. North Am. , 1990, Vol. 17, p. 509を参照）。  Clinically, dysuria caused by benign prostatic hyperplasia is largely due to the above-mentioned increase in benign adenomas in the internal glands, decreased elasticity of the prostatic capsule, and decreased bladder contractility (3). See, for example, Urol. Clin. North Am., 1990, Vol. 17, p. 509).
従って、 今日における前立腺肥大症の治療は、 その発生の原因を遮断 することによるものではなく、 上述のような臨床症状を和らげるための 治療である。具体的には、腺腫の縮小を目的として抗アンドロゲン剤が、 前立腺被膜の弾力性の回復の目的で a i遮断剤 （α ιブロッカー剤） 力 また膀胱の収縮力の増強の目的で抗コリンエステラーゼ剤が用いられて いる。 Therefore, the treatment of benign prostatic hyperplasia today is not to block the cause of its occurrence, but to relieve the above-mentioned clinical symptoms. Specifically, anti-androgens are used to reduce adenomas, ai blockers ( α ι blockers) are used to restore the elasticity of the prostatic capsule, and anticholinesterases are used to increase bladder contractility. It is used.
しかしながら、 抗アンドロゲン剤では、 腺上皮の 30乃至 40%を縮小さ せるに過ぎず、 またその縮小効果と症状の改善の程度とは相関しない。 また抗アンドロゲン剤と a 1遮断剤との併用とその症状の改善効果も明 確ではない。 抗アンドロゲン剤での腺上皮の縮小効果が 30乃至 40%に過 ぎないという事実は、 前立腺肥大の発生の病因に上皮細胞 (epithelial cell) の増殖だけでなく、 間質細胞 （stroma cell ； ス トローマ細胞） の 増殖を伴う間質（ス トローマ）の増大があることを示唆するものである。 従って、 今後の前立腺肥大症の治療には間質を縮小させることが課題と されている （例えば、 薬局， 2000， Vol.51, No.3, p.29- 36を参照）。 しかしながら、 前立腺の肥大に到る前立腺の上皮細胞及び間質細胞の 増殖の原因及ぴメカニズムは未だ明らかにされていない。 However, antiandrogens only reduce 30-40% of the glandular epithelium, and do not correlate the reduction effect with the degree of symptom improvement. It is not clear how anti-androgens and a1 blockers are used in combination and their effects on amelioration of symptoms. The fact that the effect of antiandrogens on reducing the glandular epithelium by only 30 to 40% is attributed to the pathogenesis of prostatic hypertrophy as well as the proliferation of epithelial cells as well as stroma cells (stromal cells). This suggests that there is an increase in stroma (stroma) accompanying the proliferation of cells. Accordingly, there is a problem that reduces the interstitial to treat future prostatic hyperplasia (see, for example, pharmacy, 2000, Vol.51, No.3, the p.29- 3 6). However, the cause and mechanism of prostate epithelial and stromal cell proliferation leading to prostate hypertrophy has not yet been elucidated.
一方、 上述の前立腺肥大症と並んで男性高齢者において高い確立で発 症する前立腺癌は、 前立腺肥大症に見られる腫瘍が良性であるのに対し 前立腺癌におけるそれは悪性である点でさらに深刻な問題である。  On the other hand, prostate cancer, which develops with a high probability in elderly males along with the above-mentioned prostatic hyperplasia, is more serious in that it is malignant, whereas the tumor seen in benign prostatic hyperplasia is benign. It is a problem.
前立腺癌の死亡率は、 欧米に比べ低率ではあるものの、 日本において は前立腺癌による死亡率が他のどの癌によるそれにも比べ上昇してきて いるのは深刻な問題として捉えられている。 さらに興味深いことには、 剖検において発見される前立腺癌は致死癌の 1， 0 0 0倍以上であると いう事実である。 前立腺癌は初期の小さな悪性度の低い腫瘍細胞から大 きな悪性度の高い癌に変化してゆく速度が極めて遅い癌であるともいえ る。 8 0歳代の日本男子の実に 40%が前立腺癌を有している。  Although prostate cancer mortality is lower than in the United States and Europe, it is considered a serious problem in Japan that prostate cancer mortality is increasing compared to any other cancer. Even more interesting is the fact that prostate cancer found at necropsy is more than 1,000 times greater than lethal cancer. Prostate cancer can be said to be an extremely slow cancer that changes from small early low-grade tumor cells to large high-grade cancer cells. As many as 40% of Japanese boys in their 80s have prostate cancer.
このような一般的な前立腺癌に加えて、 最近、 前立腺組織の上皮内に 限定され細胞異型と腺細胞の多層化のみで診断される前立腺上皮内癌 (prostatic intraepithelial neoplasm; PIN) 力 s注目されてレヽる。 PIN を有する男性の約 50%は前立腺癌に進行しているという報告もなされ ている。 . In addition to this general prostate cancer, recently, prostatic intraepithelial carcinoma is limited to the epithelium of the prostate tissue is diagnosed in only multilayered cell atypia and glandular cells (prostatic intraepithelial neoplasm; PIN) force s attention has been Reply It has also been reported that about 50% of men with PIN have advanced prostate cancer. .
前立腺癌の臨床症状としては、 癌の増大による下部尿路症状；上部尿 路の通過障害； リンパ節、 肝臓または肺などへの転移に起因する症状 ； 骨転移による骨痛や神経圧迫による痛みなどがある。 The clinical symptoms of prostate cancer include lower urinary tract symptoms due to an increase in cancer; obstruction of the upper urinary tract; symptoms caused by metastasis to lymph nodes, liver or lungs; Pain due to bone metastasis or pain due to nerve compression.
前立腺癌の危険因子としては、男性ホルモン、性生活、摂取力口リー、 脂肪摂取、 肉類の摂取、 ビタミン A、 ビタミン E、 ビタミン！)、 アルコー ル摂取、 コーヒー摂取、 肥満、 肝硬変など種々が挙げられるが詳細な成 因は明らかになっていない。  Risk factors for prostate cancer include androgen, sexual life, oral intake, fat intake, meat intake, vitamin A, vitamin E, and vitamins! ), Alcohol consumption, coffee consumption, obesity, cirrhosis, etc., but the detailed cause has not been clarified.
上述した前立腺肥大の成因やそのメカニズムと同様に、 前立腺癌の発 生及ぴ進行のメカニズムについても未だ解明されておらず、 現在多くの 研究者らが様々な角度からその解明及びその予防及び治療が可能な薬剤 の開発に精力的な研究を進めている。  As with the causes and mechanisms of prostatic hyperplasia described above, the mechanisms of prostate cancer initiation and progression have not yet been elucidated, and many researchers are currently elucidating them from various angles and preventing and treating them. We are actively conducting research on the development of drugs that can be used.
そのような研究を進めるの一つのアプローチとして、 健常人の特定組 織や患者の該組織で特異的あるいは高い発現が見られる遺伝チを同定し、 当該遺伝子によりコードされる分子の生理活性を解析することにより当 該分子と疾患との関連性を明らかにするという手法がある。  One approach to pursue such research is to identify the genes that are specifically or highly expressed in specific tissues of healthy individuals or the tissues of patients, and analyze the biological activities of the molecules encoded by the genes. Then, there is a method of clarifying the relationship between the molecule and a disease.
前立腺肥大や前立腺癌の研究分野においても同様のアプローチが展開 されており、 前立腺肥大に罹患している患者の前立腺組織において多種 類の遺伝子の特異的発現が示唆されている （例えば、 国際公開第 0 2 / 1 2 4 4 0号パンフレッ トを参照）。また前立腺癌の患者の前立腺癌組織 に由来する細胞株あるいは当該癌組織においても例えば、 Cyr61 ( cysteine- ri ch 61) と呼ばれる分子の発現が認められることが報告さ れている （例えば、 Prostate, 1998, Vol . 36, No. 2, p. 85- 91 及び日本 泌尿器科学会雑誌， 2002, Vol . 93, No. 2, p. 31, PP- 335を参照）。  Similar approaches have been developed in the prostate hypertrophy and prostate cancer research areas, suggesting the differential expression of various genes in the prostate tissue of patients suffering from prostate hypertrophy (eg, International Publication No. 0 2/1 2 4 4 4 Refer to the pamphlet No.). It has also been reported that, for example, the expression of a molecule called Cyr61 (cysteine-rich 61) is also observed in a cell line derived from a prostate cancer tissue of a prostate cancer patient or in the cancer tissue (for example, Prostate, 1998, Vol. 36, No. 2, p. 85-91 and Japanese Journal of Urology, 2002, Vol. 93, No. 2, p. 31, PP-335).
しかしながら、 いずれの報告も、 前立腺肥大あるいは前立腺癌の組織 あるいはそれに由来する細胞株でのある種類の遺伝子の発現を開示する のみにとどまり、 当該遺伝子がコードする分子と前立腺肥大または前立 腺癌との関連性については何ら示唆及び開示されていない。  However, both reports only disclose the expression of certain genes in prostate hyperplasia or prostate cancer tissues or cell lines derived therefrom, and the genes encoded by the genes and prostate hyperplasia or prostate adenocarcinoma. There is no suggestion or disclosure of the relevance of
上述したとおり、 5 0歳代の男性のほぼ半分以上、 さらに 8 0歳代の 男性のほぼ 100%に発症し排尿障害を引き起こす前立腺肥大症は、 未だそ の発症の原因及びメ力二ズムも解明されていないことから、 既存の薬剤 療法は前立腺肥大症の原因を遮断するものではなく、 その臨床症状'（良 性腺腫の増大、 前立腺被膜の弾力性の低下、 及び膀胱収縮力の低下） を 和らげるための治療に過ぎず根本的な治療ではない。 また、 れらの既 存の薬剤療法は、 前立腺肥大の直接的な成因である前立腺間質細胞 ( s troma ce l l ； ス トローマ細胞） の増殖を抑制するものではない。 また、 最近になって死亡率が増加してきており高齢男性において発生 する前立腺癌についても、 その発生及び進行の原因及ぴメ力二ズムは明 らかにされておらず、 その発生及び進行を抑制する薬剤及び根本的な治 療方法は提供されていない。 発明の開示 As mentioned above, more than half of men in their 50s, and those in their 80s Prostate hyperplasia, which affects nearly 100% of men and causes dysuria, does not yet elucidate the cause and mechanism, so existing drug therapy blocks the cause of benign prostatic hyperplasia Instead, it is only a treatment to relieve its clinical symptoms (increased benign adenomas, decreased elasticity of the prostatic capsule, and decreased bladder contractility), not a radical treatment. Also, these existing drug therapies do not suppress the growth of stromal cells (stromal cells), which are the direct cause of prostatic hypertrophy. In addition, the cause and mechanism of the occurrence and progression of prostate cancer in elderly men whose mortality rate has been increasing recently has not been clarified. No suppressive drug or radical treatment is provided. Disclosure of the invention
本発明は、 前立腺肥大や前立腺癌の発生や進行に間接的または直接的 に深く関与する前立腺上皮細胞からの種々生理活性物質の分泌、 並びに 前立腺肥大の直接的な成因となる前立腺間質細胞の増殖を主とする前立 腺肥大の発生の原因及びメカニズムを解明するとともに、 その発生原因 を直接的に制御することにより前立腺疾患 （前立腺肥大症、 前立腺癌な ど） の発生の予防、 症状の進行の抑制、 及び Zまたは該前立腺疾患を治 療する方法及ぴ薬剤を提供することを目的とする。  The present invention relates to the secretion of various physiologically active substances from prostate epithelial cells that are deeply indirectly or directly involved in the development and progression of prostatic hypertrophy and prostate cancer, and to the production of prostatic stromal cells that directly cause prostatic hypertrophy. In addition to elucidating the causes and mechanisms of the development of prostate gland hypertrophy, mainly proliferating, by directly controlling the causes, the prevention of the development of prostate disease (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.) and the prevention of symptoms An object of the present invention is to provide a method and an agent for suppressing progression and treating Z or the prostate disease.
さらには、 当該方法または薬剤を、 既存の治療方法 （例えば前立腺肥 大症の治療においては、 抗アンドロゲン剤、 α ΐ遮断剤、 あるいは抗コ リンエステラーゼ剤などによる薬剤療法） と併用することにより前立腺 疾患 （前立腺肥大症や前立腺癌など） の治療効果を増大させることを目 的とする。  Furthermore, by using the method or drug in combination with existing treatment methods (for example, in the treatment of benign prostatic hyperplasia, drug therapy with an anti-androgen agent, αΐ-blocker, or anti-cholinesterase agent), The aim is to increase the therapeutic effect of diseases (such as prostatic hypertrophy and prostate cancer).
本発明者らは、 前立腺由来の種々細胞株及び前立腺肥大症患者の組織 での遺伝子発現のプロファイルを解析し、 当該細胞及び組織において高 い発現が見られる遺伝子を同定するとともに、 当該遺伝子の発現及び当 該遺伝子によりコードきれる分子の生理活性と前立腺肥大及び前立腺癌 の成因について鋭意研究を重ねた。 The present inventors have proposed various cell lines derived from prostate and tissues of patients with benign prostatic hyperplasia. In addition to analyzing the gene expression profile at the same time and identifying genes that are highly expressed in the cells and tissues, the expression of the genes and the physiological activities of the molecules encoded by the genes and the etiology of prostatic hypertrophy and prostate cancer Intensive research.
その結果、 （ 1 ) 種々の前立腺由来の上皮細胞及び間質細胞で Cyr61 をコードする mRNAの発現が認められること、（2 )当該細胞株での Cyr61 ' の mRNA の発現及び Cyr61 蛋白の産生が、 リ ゾホスァァチジン酸 (Lysophosphat i di c aci d ; LPA) の刺激の大きさに依存して増加するこ と、 （3 ) Cyr61が前立腺間質細胞の細胞の増殖及び伸展を誘導し、 該伸 展活性が Cyr61に結合する抗体または EDTAにより阻害されること、（4 ) Cyr61が前立腺間質細胞における MAPキナーゼを活性化すること、 （ 5 ) 前立腺間質細胞及ぴ Zまたは前立腺上皮細胞内での Cyr61の遺伝子発現 を抑制することにより刺激により誘導される当該細胞の増殖が抑制され、 また細胞の形態変化が起こること、 （6 ) 刺激により誘導される前立腺間 質細胞及び Zまたは前立腺上皮細胞の増殖が種々化合物により阻害され る、 等という新たな知見を世界に先駆けて初めて見出し本発明を完成す るに到った。  As a result, (1) expression of mRNA encoding Cyr61 was observed in various prostate-derived epithelial cells and stromal cells, and (2) expression of Cyr61 'mRNA and production of Cyr61 protein in the cell line. (3) that Cyr61 induces proliferation and expansion of prostate stromal cells, and increases the number of lysophosphatidic acid (LPA) stimulations; (4) Cyr61 activates MAP kinase in prostate stromal cells, (5) activity in prostate stromal cells and in Z or prostate epithelial cells. Suppression of Cyr61 gene expression suppresses the proliferation of the cells induced by stimulation and changes in cell morphology. (6) Prostate stromal cells and Z or prostate epithelial cells induced by stimulation. Proliferation diversified I came to you complete for the first time heading the present invention prior Ru is inhibited by things, a new finding that equal in the world.
本発明の医薬組成物は、 前立腺疾患 （特には、 前立腺肥大症または前 立腺癌） の発症の予防、 該前立腺疾患の進行の抑制または該前立腺疾患 を治療するための医薬品として有用である。 'また、 本発明の医薬組成物 は、 前立腺疾患 （特には前立腺肥大） を抑制することにより排尿障害に 代表されるような当該疾患に付随する疾患の症状を緩和または治療する ことも可能である。  The pharmaceutical composition of the present invention is useful as a medicament for preventing the onset of prostate disease (particularly, benign prostatic hyperplasia or prostate cancer), suppressing the progress of the prostate disease, or treating the prostate disease. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can alleviate or treat symptoms of a disease associated with the disease such as dysuria by suppressing prostate disease (particularly, prostatic hypertrophy). .
さらに、 本発明の医薬組成物は、 前立腺疾患 （前立腺肥大症や前立腺 癌など） の既存の治療方法 （例えば前立腺肥大症の場合には、 抗アンド ロゲン剤、 α ΐ遮断剤、 あるいは抗コリ ンエステラーゼ剤などによる薬 剤療法が挙げられる。） と併用することにより前立腺疾患 （前立腺肥大症 や前立腺癌など） の治療効果を増大させることも可能である。 Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of prostate diseases (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) (for example, in the case of benign prostatic hyperplasia, an antiandrogen agent, an αΐ blocker, Drugs such as esterases Drug therapy. ) Can increase the therapeutic effect of prostate diseases (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer).
本発明はまた上記医薬組成物の活性成分としての物質を同定する方法 を提供するものであり、 本発明の方法を用いれば当該物質を簡便且つ高 精度で同定することが可能である。  The present invention also provides a method for identifying a substance as an active ingredient of the pharmaceutical composition, and the substance can be identified simply and with high accuracy by using the method of the present invention.
さらに本発明はまた上記の前立腺疾患 （前立腺肥大や前立腺癌など） の兆候、 有無または進行の程度を診断する方法を提供するものであり、 当該方法を用いれば、 当該疾患の兆候や有無を簡便且つ高精度で診断す ることが可能である。  Furthermore, the present invention also provides a method for diagnosing the signs, presence or absence, or the degree of progression of the above-mentioned prostate diseases (such as prostatic hypertrophy and prostate cancer). In addition, it is possible to make a diagnosis with high accuracy.
即ち、 本発明は、 下記（1)乃至（29)に記載されるとおりの発明である。 That is, the present invention is as described in the following (1) to (29).
(1) Cyr61.の生理活性、 Cyr61 の産生、 Cyr61 をコードする遺伝子の raRNAの転写若しくは Cyr61 をコードする mRNAの蛋白質への翻訳を阻害 する 1若しくは複数の物質及び薬学的に許容され得る担体を含んでなり、 前立腺疾患の発症の予防、 前立腺疾患の進行の抑制、 前立腺疾患の治療 または前立腺肥大に付随する疾患の治療をするための医薬組成物。 (1) One or more substances that inhibit the biological activity of Cyr61, production of Cyr61, transcription of raRNA of the gene encoding Cyr61 or translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, and a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical composition for preventing the onset of prostate disease, suppressing the progress of prostate disease, treating prostate disease or treating a disease associated with prostatic hypertrophy.
(2) 該 Cyr61の生理活性が、前立腺上皮細胞若しくは前立腺間質細胞 の増殖若しくは伸展、 該細胞の形態維持または該細胞における MAPキナ ーゼの活性化であることを特徴とする前記（1)に記載の医薬組成物。  (2) The physiological activity of the Cyr61 is proliferation or expansion of prostate epithelial cells or prostatic stromal cells, maintenance of the morphology of the cells, or activation of MAP kinase in the cells (1). 8. The pharmaceutical composition according to item 1.
(3) 該前立腺疾患が、前立腺肥大症または前立腺癌であることを特徴 とする前記（1)または前記（2)に記載の医薬組成物。  (3) The pharmaceutical composition according to (1) or (2), wherein the prostate disease is benign prostatic hyperplasia or prostate cancer.
(4) 該前立腺肥大に付随する疾患が排尿障害であることを特徴とす る前記（1)または前記（2)に記載の医薬組成物。  (4) The pharmaceutical composition according to (1) or (2), wherein the disease associated with prostatic hypertrophy is dysuria.
(5) 該物質が、' Cyr61に結合する抗体またはその一部であることを特 徴とする前記（1)乃至前記（4)のいずれかに記載の医薬組成物。  (5) The pharmaceutical composition according to any of (1) to (4), wherein the substance is an antibody that binds to 'Cyr61 or a part thereof.
(6) 該物質が、 DNAまたは RNAであることを特徴とする前記（1)乃至 前記（4)のいずれかに記載の医薬組成物。 (7) 該物質が、化学的に合成された化合物であることを特徴とする前 記（1)乃至前記（5)のいずれかに記載の医薬組成物。 (6) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (4), wherein the substance is DNA or RNA. (7) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (5) above, wherein the substance is a chemically synthesized compound.
(8) Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写、 Cyr61をコードする mRNAの蛋白質への翻訳または Cyr61の産生を調節する能力を有する物質 を同定する方法であって、 下記の工程を含むことを特徴とする'方法： (8) A method for identifying a substance capable of regulating transcription of a gene encoding Cyr61 to mRNA, translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, or production of Cyr61, which comprises the following steps. Features' method:
( a ) Cyr61を産生する細胞を、 Cyr61の産生を誘導する刺激の存在下 若しくは不存在下で、 該物質の存在下及び不存在下の各々の条件下で培 養する工程；及び (a) culturing Cyr61-producing cells in the presence or absence of a stimulus that induces Cyr61 production, in the presence and absence of the substance, respectively; and
( b ) ( i) 該物質の存在下で培養した細胞が産生する Cyr61の量と該 物質の不存在下で培養した細胞が産生する Cyr61の量を比較する工程； 若しくは .  (b) (i) comparing the amount of Cyr61 produced by cells cultured in the presence of the substance with the amount of Cyr61 produced by cells cultured in the absence of the substance;
( i i ) 該物質の存在下で培養した細胞中で転写された Cyr61 をコ ードする mRNA の量と該物質の不存在下で培養した細胞中で転写された Cyr61をコードする mRNAの量とを比較する工程。  (ii) the amount of Cyr61-encoding mRNA transcribed in cells cultured in the presence of the substance and the amount of Cyr61-encoding mRNA transcribed in cells cultured in the absence of the substance Comparing.
(9) 該細胞が、前立腺の上皮細胞若しくは間質細胞またはそれらから 樹立された細胞株であることを特徴とする前記（8)に記載の方法。  (9) The method according to (8), wherein the cells are prostate epithelial cells or stromal cells or cell lines established therefrom.
( 10) 該細胞が、 ヒ ト前立腺'由来上皮細胞株 BRF- 55Tであることを特 徴とする前記（9)に記載の方法。  (10) The method according to (9), wherein the cell is a human prostate'-derived epithelial cell line BRF-55T.
(11) 該 Cyr61の産生を誘導する刺激が、 血清または LPAであること を特徴とする前記（8)乃至前記（10)のいずれかに記載される方法。  (11) The method according to any of (8) to (10), wherein the stimulus for inducing the production of Cyr61 is serum or LPA.
(12) 該 Cyr61 の量が、 ELISAを用いて決定されることを特徴とする 前記（8)乃至前記（11)のいずれかに記載の方法。  (12) The method according to any one of (8) to (11), wherein the amount of Cyr61 is determined using ELISA.
- ( 13) 該 Cyr61 をコードする raRNAの量が、 bDNA法を用いて決定され ることを特徴とする前記（8)乃至前記（11)のいずれかに記載の方法。  -(13) The method according to any one of (8) to (11), wherein the amount of the raRNA encoding Cyr61 is determined using a bDNA method.
( 14) Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写、 Cyr61をコードす る mRNAの蛋白質への翻訳または Cyr61の産生を調節する能力を有する物 質を同定する方法であって、 下記の工程を含むことを特徴とする方法：(14) A substance capable of regulating transcription of a gene encoding Cyr61 to mRNA, translation of mRNA encoding Cyr61 into protein, or regulation of Cyr61 production. A method for identifying quality, comprising the steps of:
( a ) Cyr61及ぴ Cyr61 以外の他の蛋白質を産生する細胞であって、 該細胞における該他の蛋白質をコードする遺伝子の mRNAへの転写が、該 Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写のシグナルの程度に依存して 起こるも.のであることを特徴とする細胞を、 Cyr61 の産生を ^導する刺 激の存在下若しくは不存在下で、 該物質の存在下及び不存在下の各々の ' 条件下で培養する工程；及び (a) a cell that produces Cyr61 and a protein other than Cyr61, wherein the transcription of the gene encoding the other protein in the cell into mRNA is the transcription of the gene encoding the Cyr61 into mRNA; The cell is characterized by the presence or absence of a stimulus that induces the production of Cyr61, in the presence or absence of the substance, respectively. 'Culturing under conditions; and
( b ) 該物質の存在下で培養した細胞が産生する該他の蛋白質の量と 該物質の不存在下で培養した細胞が産生する該他の蛋白質の量を比較す る工程。  (b) a step of comparing the amount of the other protein produced by cells cultured in the presence of the substance with the amount of the other protein produced by cells cultured in the absence of the substance.
(15) 該細胞が、 該 Cyr61 をコードする遺伝子及び該他の蛋白質をコ 一ドする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴と する前記（14)に記載の方法。  (15) The method according to (14), wherein the cell is a transgenic cell transformed with a gene encoding the Cyr61 and a gene encoding the other protein.
(16) 該他の蛋白質が、 レポーター蛋白質であることを特徴とする前 記（14)に記載の方法。  (16) The method according to the above (14), wherein the other protein is a reporter protein.
(17) 該レポーター蛋白.質が、 ルシフェラーゼであることを特徴とす る前記（16)に記載の方法。  (17) The method according to (16), wherein the reporter protein is luciferase.
(18) 該他の蛋白質の量の比較が、 該レポーター蛋白質が発するシグ ナルのレベルの比較であることを特徴とする前記（17)に記載の方法。  (18) The method according to the above (17), wherein the comparison of the amount of the other protein is a comparison of the level of a signal generated by the reporter protein.
( 19) Cyr61 の生理活性を調節する能力を有する物質を同定する方法 であって、 下記の工程を含むことを特徴とする方法：  (19) A method for identifying a substance having the ability to regulate the biological activity of Cyr61, comprising the following steps:
( a ) Cyr61を産生する細胞を、 Cyr61の産生を誘導する刺激の存在下 若しくは不存在下で、 該物質の存在下または不存在下の各々の条件下で 培養し、 該各々の条件下での培養した細胞の増殖の程度、 伸展の程度ま たは形態の変化を比較する工程。  (a) Cyr61-producing cells are cultured in the presence or absence of a stimulus that induces the production of Cyr61 under the conditions of the presence or absence of the substance, and under the respective conditions. Comparing the degree of proliferation, extension or morphological change of the cultured cells.
(20) 該細胞が、 前立腺の上皮細胞若しくは間質細胞またはそれらか ら樹立された細胞株であることを特徴とする前記（19)のいずれかに記載 の方法。 (20) The cells are prostate epithelial cells or stromal cells or The method according to any one of the above (19), which is a cell line established from the above.
(21) 該細胞が、 ヒ ト前立腺由来上皮細胞株 BRF-55Tであることを特 徴とする前記（20)に記載の方法。  (21) The method according to (20), wherein the cell is a human prostate-derived epithelial cell line BRF-55T.
(22) 該 Cyr61の産生を誘導する刺激が、 血清または. LPAであること を特徴とする前記（19)乃至前記（21)のいずれかに記載される方法。  (22) The method according to any of (19) to (21), wherein the stimulus for inducing the production of Cyr61 is serum or LPA.
(23) 被験者における前立腺疾患の兆候または有無を診断する方法で あって、 下記の工程を含むことを特徴とする方法：  (23) A method for diagnosing the presence or absence of prostate disease in a subject, comprising the steps of:
( a ) 該被験者から取得した被験試料中における Cyr61の量及び健常 人から取得した被験試料中における Cyr61の量を決定し両者を比較する 工程； または  (a) determining the amount of Cyr61 in a test sample obtained from the subject and the amount of Cyr61 in a test sample obtained from a healthy subject, and comparing the two; or
( b ) 該被験者から取得した被験試料中における Cyr61 をコードする mRNAの量及び健常人から取得した被験試料中における Cyr61をコードす る mRNAの量を決定し両者を比較する工程。  (b) a step of determining the amount of Cyr61-encoding mRNA in a test sample obtained from the subject and the amount of Cyr61-encoding mRNA in a test sample obtained from a healthy subject, and comparing the two.
(24) 該前立腺疾患が、 前立腺肥大症または前立腺癌であることを特 徴とする前記（23)に記載の.方法。  (24) The method according to (23), wherein the prostate disease is benign prostatic hyperplasia or prostate cancer.
(25) 該被験試料が、 前立腺組織または血液であることを特徴とする 前記（23)または前記（24)に記載の方法。  (25) The method according to (23) or (24), wherein the test sample is prostate tissue or blood.
(26) 該 Cyr61 の量が、 ELISA を用いて決定されることを特徴とする 前記（23)乃至前記（25)のいずれかに記載の方法。  (26) The method according to any one of (23) to (25), wherein the amount of Cyr61 is determined using ELISA.
(27) 該 Cyr61 をコードする raRNAの量が、 b蘭 Aを用いて決定される ことを特徴とする前記（23)乃至前記（25)のいずれかに記載の方法。  (27) The method according to any of (23) to (25), wherein the amount of raRNA encoding said Cyr61 is determined using b orchid A.
(28) Cyr61の生理活性、 Cyr61の産生、 Cyr61をコードする遺伝子の mRNAの転写若しくは Cyr61 をコードする mRNAの蛋白質への翻訳を阻害 する 1若しくは複数の物質を被験体に投与することを含む、 前立腺疾患 の発症を予防するため、 前立腺疾患の進行を抑制するため、 前立腺疾患 を治療するためまたは前立腺肥大に付随する疾患を治療するための方法 ( (28) administering to the subject one or more substances that inhibit the physiological activity of Cyr61, the production of Cyr61, the transcription of mRNA of the gene encoding Cyr61, or the translation of mRNA encoding Cyr61 into protein. To prevent the development of prostate disease, to control the progress of prostate disease, Methods for treating diseases associated to order or prostate hypertrophy treatment (
(29) 前立腺疾患の発症の予防用の、 前立腺疾患の進行の抑制用の、 前立腺疾患の治療用のまたは前立腺肥大に付随する疾患の治療用の組成 物の製造における、 Cyr61の生理活性、 Cyr61の産生、 Cyr61をコードす る遺伝子.の mRNAの転写若しくは Cyr61をコードする mRNAの蛋白質への 翻訳を阻害する 1若しくは複数の物質の使用。 図面の簡単な説明 (29) bioactivity of Cyr61 in the manufacture of a composition for preventing the onset of prostate disease, suppressing the progression of prostate disease, treating prostate disease, or treating a disease associated with prostatic hypertrophy; And the use of one or more substances that inhibit the transcription of mRNA of the gene encoding Cyr61 or the translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、ゥエスタンプロッティングによる精製組換えヒ ト Cyr61の SDS ポリアクリルアミ ドゲルでの電気泳動の状態を示す。  FIG. 1 shows the state of electrophoresis of purified recombinant human Cyr61 by estamplotting on an SDS polyacrylamide gel.
レーン 1乃至 2は各々下記の電気泳動の状態を示す。' '  Lanes 1 and 2 show the following electrophoretic states, respectively. ''
レーン 1 : マーカー分子。  Lane 1: marker molecule.
レーン 2：精製糸且換えヒ ト Cyr61。  Lane 2: Purified and changed human Cyr61.
図 2は、組換えヒ ト Cyr61 の前立腺由来間質初代細胞 PrSCに対する細 胞接着誘導活性を示す。  FIG. 2 shows the activity of recombinant human Cyr61 in inducing cell adhesion to prostate-derived stromal primary cells PrSC.
縦軸は基質 （Cyr61、 フイブロネクチン、 BSA) と前立腺由来間質初代 細胞 PrSCとの接着活性の指標となる蛍光強度を示し、横軸はコートした 基質 （Cyr61、 フィプロネクチン、 BSA) の濃度を示す。  The vertical axis shows the fluorescence intensity as an index of the adhesive activity between the substrate (Cyr61, fibronectin, BSA) and the prostate-derived stromal primary cell PrSC, and the horizontal axis shows the concentration of the coated substrate (Cyr61, fipronectin, BSA). Show.
図 3は、 Cyr61により誘導される前立腺由来間質初代細胞 PrSCの細胞 接着の EDTA及び/またはへパリンによる阻害効果を示す。  FIG. 3 shows the inhibitory effect of EDTA and / or heparin on cell adhesion of prostate-derived stromal primary cells PrSC induced by Cyr61.
縦軸は Cyr61と前立腺由来間質初代細胞 PrSCとの接着活性の指標とな る蛍光強度を示し、 横軸は阻害物質の種類を示す。  The vertical axis indicates the fluorescence intensity as an indicator of the adhesive activity between Cyr61 and the prostate-derived stromal primary cell PrSC, and the horizontal axis indicates the type of inhibitor.
図 4は、 ゥエスタンプロッティングによる各種の抗ヒ ト Cyr61ポリク ローナル抗体のヒ ト及びサルの Cyr61蛋白質の各々に対する反応性を示 す。  FIG. 4 shows the reactivity of various anti-human Cyr61 polyclonal antibodies to human and monkey Cyr61 proteins by estamplotting.
レーン 1乃至 4は Cyr61蛋白質を発現した細胞の溶解液の種類を示す。 レーン 1 : アフリカミ ドリザル腎線維芽細胞株 C0S-7。 Lanes 1 to 4 show the type of lysate of cells expressing the Cyr61 protein. Lane 1: African green monkey kidney fibroblast cell line C0S-7.
レーン 2： ヒ ト Cyr61 —過的発現ァフリカミ ドリザル腎線維芽細胞株 COS- 7。  Lane 2: Human Cyr61—overexpressed African monkey monkey kidney fibroblast cell line COS-7.
レーン 3： mycHis-tag標識ヒ ト Cyr61—過的発現ァフリカミ ドリザル 腎線維芽細胞株 COS- 7。  Lane 3: mycHis-tag labeled human Cyr61—overexpressed African monkey monkey kidney fibroblast cell line COS-7.
レーン 4： mycHis-tag標識陰性対照タンパクー過的発現ァフリカミ ド リザル腎線維芽細胞株 COS- 7。  Lane 4: mycHis-tag labeled negative control protein-overexpressing africamido lizal kidney fibroblast cell line COS-7.
図 5は、組換えヒ ト Cyr61による前立腺由来間質初代細胞 PrSCの伸展 の有無または状態を示す。  FIG. 5 shows the presence or absence or the state of prostate-derived stromal primary cells PrSC extended by recombinant human Cyr61.
分図（a)乃至（e)は各々下記の試験による結果を示す。  (A) to (e) show the results of the following tests, respectively.
分図（a) 基質無しの場合。  Diagram (a) Without substrate.
分図（b) 基質としてフイブロネクチン （0.5 z g) を用いた場合。 分図（c) 基質として BSA (0. g) を用いた場合。  Diagram (b) When fibronectin (0.5 zg) is used as a substrate. Diagram (c) Using BSA (0. g) as substrate.
分図（d) 基質として Cyr61 (0. Ιβ,α g) を用いた場合。  Diagram (d) Using Cyr61 (0. Ιβ, α g) as substrate.
分図（ 基質として Cyr61 (0.5,u g) を用いた場合。  Diagram (When Cyr61 (0.5, ug) is used as a substrate.
図 6は、組換えヒ ト Cyr6.1及び EDTAの存在下での前立腺由来間質初代 細胞 PrSCの伸展の有無または状態を示す。  FIG. 6 shows the presence or absence or state of prostate-derived stromal primary cell PrSC in the presence of recombinant human Cyr6.1 and EDTA.
分図（a)乃至（f)は各々下記の試験結果を示す。  The diagrams (a) to (f) show the following test results, respectively.
分図（a) 基質無しの場合。  Diagram (a) Without substrate.
分図（b) 基質として Cyr61 (0. 16^ g) を用いた場合。  Diagram (b) Using Cyr61 (0.16 ^ g) as substrate.
分図（c) 基質として Cyr61 (0.5^ g) を用いた場合。  Diagram (c) Using Cyr61 (0.5 ^ g) as substrate.
分図（d) 基質としてフィプロネクチン （0. を用!/ EDTA を添 加した場合。  Diagram (d) When fipronectin (0.! Is used as a substrate / when EDTA is added).
分図（e)：基質として Cyr61 (0. 16 g) を用い、 EDTAを添加した場合。 分図（f) ：基質として Cyr61 (0.5 g) を用い、 EDTAを添加した場合。 図 7は、 組換えヒ ト Cyr61及び抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル抗体の存 在下での前立腺由来間質初代細胞 PrSCの伸展の有無または状態を示す。 分図（a)乃至（d)は各々下記の試験結果を示す。 Diagram (e): Cyr61 (0.16 g) as substrate and EDTA added. Diagram (f): When Cyr61 (0.5 g) was used as a substrate and EDTA was added. Figure 7 shows the presence of recombinant human Cyr61 and anti-human Cyr61 polyclonal antibodies. 3 shows the presence or absence or state of prostate-derived stromal primary cells PrSC in the presence. The diagrams (a) to (d) show the following test results, respectively.
分図（a) ：基質としてフィプロネクチン ( 0. 5 g) を用い、 ゥサギ抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル抗体 N70 - 1を添加した場合。  Diagram (a): When fipronectin (0.5 g) is used as a substrate and a heron anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1 is added.
分図（b) ：基質として Cyr61 ( 0. 16 ^ g) を用い、 ゥサギ抗ヒ ト Cyr61 ポリクローナル抗体 N70 - 1を添加した場合。  Diagram (b): When Cyr61 (0.16 ^ g) was used as a substrate and a heron anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1 was added.
' 分図（c) ：基質として Cyr61 ( 0. 5 g) を用い、 ゥサギ抗ヒ ト Cyr61ポ リクローナル抗体 N70- 1を添加した場合。 'Separation diagram (c): When Cyr61 (0.5 g) was used as the substrate, and the heron anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1 was added.
分図（d) ：基質として Cyr61 ( 0. 5 ^ g) を用い、 陰性対照ゥサギ I gG抗 体を添加した場合。  Diagram (d): When Cyr61 (0.5 ^ g) was used as a substrate and a negative control, eg, a rabbit IgG antibody was added.
図 8は、 ウェスタンブロッテイングによる精製組換えヒ ト Cyr61によ る前立腺由来間質初代細胞 PrSCでの MAP kinase ( ERK p42/p44) の経時 的な活性化 （リ ン酸化） の状態を示す。  FIG. 8 shows the time-dependent activation (phosphorylation) of MAP kinase (ERK p42 / p44) in prostate-derived stromal primary cells PrSC by purified recombinant human Cyr61 by Western blotting.
図 9は、 ウェスタンプロッティングによる各種刺激による前立腺由来 間質初代細胞 PrSCにおける MAP ki nas e ( ERK P42/p44) の活性化 （リン ,酸化） を示す。 ' Figure 9 shows the activation of a Western plot MAP in prostate derived stromal primary cells PrSC by with various stimuli computing ki nas e (ERK P 42 / p44) (phosphorus oxide). '
分図（ 乃至（c)は各々下記の試験結果を示す。  Each of the distribution diagrams (to (c) shows the following test results.
分図（a) ： 基質として Cyr61を用いた場合。  Diagram (a): When Cyr61 is used as a substrate.
分図（b) ：基質としてフィプロネクチンを用いた場合。  Diagram (b): when fipronectin is used as a substrate.
分図（c) ： 基質としてポリ - L -リジンを用いた場合。  Diagram (c): using poly-L-lysine as a substrate.
図 1 0は、組換えヒ ト Cyr61の前立腺由来間質初代細胞 PrSCに対する 増殖促進活性を示す。  FIG. 10 shows the growth promoting activity of recombinant human Cyr61 on prostate-derived stromal primary cells PrSC.
縦軸は細胞増殖の指標としての細胞内脱水素酵素の活性値 （細胞数） を示す。 横軸は添加した増殖因子 PDGFの有無を示す。  The vertical axis shows the activity value (cell number) of intracellular dehydrogenase as an indicator of cell proliferation. The horizontal axis indicates the presence or absence of the added growth factor PDGF.
図 1 1は、 耝換えヒ ト Cyr61 により誘導される前立腺由来間質初代細 胞 PrSCの増殖促進活性に対する抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル抗体による 抑制効果を示す。 Figure 11 shows the effect of anti-human Cyr61 polyclonal antibody on the growth-promoting activity of prostate-derived stromal primary cells PrSC induced by recombinant human Cyr61. Shows the suppression effect.
縦軸は細胞増殖の指標としての細胞内脱水素酵素の活性値 （細胞数） を示し、 横軸は添加した増殖因子 PDGFの有無及び濃度を示す。  The vertical axis shows the activity value (cell number) of intracellular dehydrogenase as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence and concentration of the added growth factor PDGF.
図 1 2は、本発明において確立した bDNA法で用いられる各種プローブ を示す。.  FIG. 12 shows various probes used in the bDNA method established in the present invention. .
図 1 3は、 本発明において確立した bDNA法による Cyr61の mRNA定量 試験の希釈直線性を示す。 '  FIG. 13 shows the dilution linearity of the Cyr61 mRNA quantification test by the bDNA method established in the present invention. '
分図（a)乃至（b)は各々下記の試験結果を示す。 縦軸は RNA量の指標と してのアルカリホスファタ一ゼ活'生 (Read Lumines cence Uni t； RLU) を 示し、 横軸は細胞数を示す。  The diagrams (a) and (b) show the following test results, respectively. The vertical axis represents alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an index of RNA amount, and the horizontal axis represents cell number.
分図（a) ： 細胞溶解液として前立腺由来間質初代細胞 PrS を用いた揚 合。  Diagram (a): Using prostate-derived stromal primary cell PrS as cell lysate.
分図（b)：細胞溶解液として前立腺由来上皮細胞 BRF- 55Tを用いた場合。 図 1 4は、 bDNA法により定量した Cyr6 lの RNA (標準物質） の検量線 を示す。 ，  Diagram (b): Prostate-derived epithelial cell BRF-55T used as cell lysate. FIG. 14 shows a calibration curve of Cyr6 RNA (standard substance) quantified by the bDNA method. ,
縦軸は RNA 量の指標と してのアルカ リ ホスファターゼ活性 （Read Luminescence Unit； RLU) を示し、 横軸は該標準物質の濃度を示す。  The vertical axis indicates alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an index of RNA amount, and the horizontal axis indicates the concentration of the standard substance.
図 1 5は、 本発明において確立した 2種類の抗ヒ ト Cyr61ポリクロー ナル抗体を用いたサンドィツチ ELISAにより定量したヒ ト Cyr61標準物 質の希釈検量線を示す。  FIG. 15 shows a dilution calibration curve of a human Cyr61 standard substance quantified by sandwich ELISA using two types of anti-human Cyr61 polyclonal antibodies established in the present invention.
縦軸はタンパク量の指標としてのペルォキシダーゼ活性 （吸光度） を 示し、 横軸は該標準物質の希釈倍率を示す。  The vertical axis shows peroxidase activity (absorbance) as an index of the amount of protein, and the horizontal axis shows the dilution ratio of the standard substance.
図 1 6は、 前立腺由来間質初代細胞 PrSC と前立腺由来上皮細胞祙 BRF- 55Tにおける Edg受容体 （Edg2、 Edg4、 Edg7) の発現量を示す。  FIG. 16 shows the expression levels of Edg receptors (Edg2, Edg4, Edg7) in prostate-derived stromal primary cells PrSC and prostate-derived epithelial cells 祙 BRF-55T.
分図（a)乃至（b)は各々下記の試験結果を示す。  The diagrams (a) and (b) show the following test results, respectively.
縦軸は Edg受容体の発現量の指標としての単位トータル RNA当たりの 該 Edg受容体コピー数を示し、 横軸は細胞種を示す。 The vertical axis represents the Edg receptor expression level per unit total RNA. The Edg receptor copy number is shown, and the horizontal axis shows the cell type.
分図（a) ： PrSC及び BRF- 55Tの各々における各種 Edg受容体の発現量 を示す。  Diagram (a): shows the expression levels of various Edg receptors in each of PrSC and BRF-55T.
分図（b) ： PrSC及び BRF- 55Tの各々における各種 Edg受容体の発現量 を示す。 .  Diagram (b): shows the expression levels of various Edg receptors in each of PrSC and BRF-55T. .
図 1 7は、 前立腺由来間質初代細胞 PrSC における LPA による Cyr61 、遺伝子の発現の上昇及びその経時変化を示す。  FIG. 17 shows an increase in Cyr61 and gene expression by LPA in prostate-derived stromal primary cells PrSC and its time course.
縦軸は Cyr61 の RNA 量の指標としてのアルカリホスファターゼ活性 (Read Luminescence Uni t； RLU) を示し、 横軸は刺激物の種類を示す。 図 1 8は、 前立腺由来上皮細胞株 BRF-55Tにおける LPAによる Cyr61 遺伝子の発現の上昇及びその経時変化を示す。 .  The vertical axis shows alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an indicator of the amount of Cyr61 RNA, and the horizontal axis shows the type of stimulus. FIG. 18 shows an increase in the expression of the Cyr61 gene by LPA in the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T and its time course. .
縦軸は Cyr61 の RNA 量の指標としてのアルカリホスファターゼ活性 (Read Luminescence Unit； RLU) を示し、 横軸は刺激物の種類を示す。 図 1 9は、 前立腺由来上皮細胞株 BRF-55Tに ける FBSによる Cyr61 蛋白質の産生の上昇及びその経時変化を示す。  The vertical axis shows alkaline phosphatase activity (Read Luminescence Unit; RLU) as an indicator of the amount of Cyr61 RNA, and the horizontal axis shows the type of stimulus. FIG. 19 shows an increase in the production of Cyr61 protein by FBS in the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T and its time course.
分図（ 乃至（b)は各々下記の試験結果を示す。  The distribution diagrams (to (b) show the following test results, respectively.
分図（a) ： ELISAで測定した Cyr61蛋白質の産生量の経時変化を示す。 縦軸は Cyr61蛋白質の産生量の指標としてのペルォキシダーゼ活性 （吸 光度） を示し、 横軸は FBS刺激後の経過時間を示す。  Diagram (a): Shows the time course of Cyr61 protein production measured by ELISA. The vertical axis shows peroxidase activity (absorbance) as an indicator of the amount of Cyr61 protein produced, and the horizontal axis shows the elapsed time after FBS stimulation.
分図（b)：ウェスタンブロッテイングによる Cyr61蛋白質の産生量の経 . 時変化を示す。 横軸は FBS刺激後の経過時間を示す。  Diagram (b): Shows the time course of Cyr61 protein production by Western blotting. The horizontal axis shows the elapsed time after FBS stimulation.
図 2 0は、 RT-PCRで解析した各種の前立腺由来細胞株における Cyr61 遺伝子の発現の状態を示す。  FIG. 20 shows the expression status of the Cyr61 gene in various prostate-derived cell lines analyzed by RT-PCR.
上段は Cyr61遺伝子の発現の状態を示し、 下段は GAPDH (陰性対照） 遺伝子の発現の状態を示す。  The upper row shows the expression status of the Cyr61 gene, and the lower row shows the expression status of the GAPDH (negative control) gene.
図 2 1は、 ウェスタンプロッティングによる FBSで誘導した前立腺細 胞での Cyr61蛋白質産生に対する Cyr61アンチセンスオリ ゴヌクレオチ ドの抑制活性を示す。 Figure 21 shows prostate cells induced by FBS by Western plotting. 2 shows the inhibitory activity of Cyr61 antisense oligonucleotide on the production of Cyr61 protein in vesicles.
レーン 1乃至 4は各々下記の細胞での結果を示す。  Lanes 1 to 4 show the results for the following cells, respectively.
レーン 1 ： FBS無刺激の前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T。  Lane 1: FBS-unstimulated prostate-derived epithelial cell line BRF-55T.
レーン 2 ： FBS刺激 2時間後の前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Τ。  Lane 2: prostate-derived epithelial cell line BRF-55Τ 2 hours after FBS stimulation.
レーン 3： ァンチセンスオリゴヌクレオチド添加して FBSで刺激 2時 間後の前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Τ。  Lane 3: prostate-derived epithelial cell line BRF-55Τ 2 hours after stimulation with FBS with antisense oligonucleotide.
レーン 4 ： センスオリゴヌクレオチド （陰性対照） 添加して FBSで刺 激 2時間後の前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Τ。  Lane 4: prostate-derived epithelial cell line BRF-55Τ 2 hours after stimulation with FBS with sense oligonucleotide (negative control).
図 2 2は、 Cyr61 タンパク産生を抑制した場合の前立腺由来上皮細胞 株 BRF- 55Tの形態を示す。 ，  FIG. 22 shows the morphology of the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T when Cyr61 protein production was suppressed. ,
分図（a)はアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加して FBS で刺激 2 日後の前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Tの形態を示し、分図（b)はセンスォ リゴヌクレオチド （陰性対照） を添加して FBSで刺激 2 日後の前立腺由 来上皮細胞株 BRF- 55Tの形態を示す。  Panel (a) shows the morphology of the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T 2 days after stimulation with FBS with the addition of the antisense oligonucleotide, and panel (b) shows the addition of the sense oligonucleotide (negative control). The morphology of prostate-derived epithelial cell line BRF-55T 2 days after stimulation with FBS is shown.
図 2 3は、 Cyr61 ァンチセンスオリ ゴヌクレオチドの前立腺由来間質 初代細胞 PrSCの増殖の抑制効果を示す。  FIG. 23 shows the effect of Cyr61 antisense oligonucleotide on the growth of prostate-derived stromal primary cell PrSC.
縦軸は細胞増殖の指標としての細胞内脱水素酵素の活性値 （細胞数） を示し、横軸は添加した FBSの有無及び添加したオリゴヌクレオチド（ァ ンチセンス、 センス共） の濃度を示す。  The vertical axis shows the intracellular dehydrogenase activity value (cell number) as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence or absence of added FBS and the concentration of added oligonucleotide (antisense and sense).
図 2 4は、 FBS で刺激を与える前に Cyr61 アンチセンスォリゴヌクレ ォチドを添加した場合の前立腺由来間質初代細胞 PrSC の増殖の抑制効 果を示す。  FIG. 24 shows the effect of suppressing the proliferation of prostate-derived stromal primary cells PrSC when Cyr61 antisense oligonucleotide was added before stimulation with FBS.
縦軸は細胞増殖の指標としての細胞内脱水素酵素の活性値 （細胞数） を示し、横軸は添加した FBS の有無及ぴ添加したオリゴヌクレオチド（ァ ンチセンス、 センス共） の濃度を示す。 図 2 5は、 FBSで刺激を与えた後に Cyr61 アンチセンスォリ ゴヌタ レ ォチドを添加した場合の前立腺由来間質初代細胞 PrSC の増殖の抑制効 果を示す。 The vertical axis shows the activity value (cell number) of intracellular dehydrogenase as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence or absence of added FBS and the concentration of added oligonucleotide (antisense and sense). FIG. 25 shows the effect of suppressing the growth of prostate-derived stromal primary cells PrSC when Cyr61 antisense oligogonutatide was added after stimulation with FBS.
縦軸は細胞増殖の指標としての細胞内脱水素酵素の活性値 （細胞数） を示し、横軸は添加した FBSの有無及ぴ添加したオリ ゴヌクレオチド（ァ ンチセンス、 センス共） の濃度を示す。  The vertical axis shows the intracellular dehydrogenase activity value (number of cells) as an indicator of cell proliferation, and the horizontal axis shows the presence or absence of added FBS and the concentration of added oligonucleotides (antisense and sense). .
図 2 6は、本発明で確立した前立腺細胞での Cyr61遺伝子の mRNAへの 転写を阻害する物質の同定方法により同定した当該化合物 （各種濃度） の前立腺細胞での Cyr61遺伝子の発現の阻害効果を示す。  Figure 26 shows the inhibitory effect of the compound (various concentrations) on Cyr61 gene expression in prostate cells identified by the method for identifying a substance that inhibits transcription of Cyr61 gene into mRNA in prostate cells established in the present invention. Show.
縦軸は阻害率を示し、 横軸は化合物の濃度を示す。  The vertical axis indicates the inhibition rate, and the horizontal axis indicates the concentration of the compound.
図 2 7は、 本発明で確立した前立腺細胞での Cyr61蛋白質の産生を阻 害する物質の同定方法により同定した当該化合物 (各種濃度） の前立腺 細胞での Cyr61蛋白質の産生の阻害効果を示す。  FIG. 27 shows the inhibitory effect of the compound (various concentrations) on Cyr61 protein production in prostate cells identified by the method for identifying a substance that inhibits Cyr61 protein production in prostate cells established in the present invention.
縦軸は阻害率を示し、 横軸は化合物の濃度を示す。 発明の詳細な説明  The vertical axis indicates the inhibition rate, and the horizontal axis indicates the concentration of the compound. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
以下、 本発明で用いられる語句の意味、 並びに物質の製造方法を明ら ' かにすることにより、 本発明を詳細に説明する。 '  Hereinafter, the present invention will be described in detail by clarifying the meanings of the terms used in the present invention and the method for producing the substance. '
本発明における 「哺乳動物」 とは、 ヒ ト、 ゥシ、 ャギ、 ゥサギ、 マウ ス、 ラッ ト、 ハムスター、 及びモルモッ小等を意味し、 好ましくは、 ヒ ト、 ゥシ、 ラッ ト、 マウスまたはハムスターであり、 特に好ましくは、 ヒ トである。  The term "mammal" in the present invention means a human, a magpie, a goat, a heron, a mouse, a rat, a hamster, and a guinea pig, and preferably a human, a magpie, a rat, a mouse Or hamsters, particularly preferably humans.
本発明における 「Cyr61」 とは、 哺乳動物の Cyr61であり、 特に好まし くはヒ トの Cyr61である（くヒ ト Cyr61〉アミノ酸配列： GenBank Accession No. 000622 (配列番号 3 ) ； 0RF を含む cDNA 配列 ： GenBank Access i on No. NM— 001554 (配列番号 2 ) ; Oncogene, Vol . 14. No. 14, p. 1753-1757, 1997； Oncogene, Vol.16, No.6， p.747-754, 1998； Mol. Pathol. , Vol.50, No.6, p.310-316, 1997Zくマウス Cyr61〉GenBank Accession No. P18406 ; Mol. Cell. Biol. , Vol.10, No.7, p.3569-3577, 1990 ; Nucleic Acids Res. , Vol.19, No.12, p.3261-3267, 1991/くラッ ト Cyr61>GenBank Accession No. Q9ES72； J. Biol. Chem. , Vol.275, No.37, p.28929 - 28936， 2000)。 “Cyr61” in the present invention is mammalian Cyr61, particularly preferably human Cyr61 (human Cyr61) amino acid sequence: GenBank Accession No. 000622 (SEQ ID NO: 3); cDNA sequence: GenBank Accession on No. NM— 001554 (SEQ ID NO: 2); Oncogene, Vol. 14. No. 14, p. 1753-1757, 1997; Oncogene, Vol. 16, No. 6, p. 747-754, 1998; Mol. Pathol., Vol. 50, No. 6, p. 310-316, 1997Z mouse Cyr61> GenBank Accession No. P18406; Mol. Cell. Biol., Vol. 10, No. 7, p. 3569-3577, 1990; Nucleic Acids Res., Vol. 19, No. 12, p. 3261-3267, 1991 / lat Cyr61> GenBank Accession No. Q9ES72; J. Biol. Chem., Vol.275, No.37, p.28929-28936, 2000).
Cyr61 は、 細胞の増殖、 分化及び腫瘍形成に関与すると考えられてい る C丽ファミ リー （Cyr61 (Cysteine- rich 61) /CTGF (connective tissue growth factor) /NOV (nephroblastoma overexpressed) ) と総称される遺 伝子群に属する各遺伝子によりコードされる分子の一つである。  Cyr61 is collectively referred to as C と family (Cyr61 (Cysteine-rich 61) / CTGF (connective tissue growth factor) / NOV (nephroblastoma overexpressed)), which is thought to be involved in cell proliferation, differentiation and tumor formation. It is one of the molecules encoded by each gene belonging to the gene group.
この遺伝子群は、 静止期にある細胞に血清や増殖因子を添加すること によ りその発現が制御される増殖因子誘導型最初期遺伝子 （growth factor inducible imraeciiate-early gene) であり、' 4つの保存 れた領 域と 38 のシスティン残基を有する細胞外基質結合型シグナル分子をコ ードする。  This group of genes are growth factor inducible imraeciiate-early genes whose expression is controlled by adding serum or growth factors to cells in the stationary phase. Encode an extracellular matrix-bound signal molecule with a conserved region and 38 cysteine residues.
ヒ ト Cyr61は、 381のアミノ酸残基からなり、 N末端に分泌信号べプチ ド配列を持つ分泌型の蛋白と考えられている。 分子構造と しては、 4 つ の特徴的な領域がらなる。  Human Cyr61 is thought to be a secretory protein consisting of 381 amino acid residues and having a secretory signal peptide sequence at the N-terminus. The molecular structure has four distinctive regions.
領域 1、 は Insulin like growth factor (IGF; binding module と呼 ばれ、 6つの古典的 IGF- binding protein (IGFBP 1-6) の N末端と約 32% の相同性力 Sある。 領域 2は丽 Willebrand factor type C module と呼 ばれ、 種々の von Willebrand factor と同様の構造を持つ。 領域 3 は throrabospondin type 1 repeatで、 WSXCSXXCG (配列番号 1 )の local motif を持ち、 硫酸化糖類等への結合を担う と考えられている。 これに関し、 Cyr61 は細胞表面のへパラン硫酸プロテオダリカンと結合することが報 告されている。 領域 4は C - terminal module と呼ばれ、 この領域内の 10 個のシスティン残基の内 6つがシスティンノッ トモチーフを取っており、 これは神経増殖因子 （NGF)、 形質転換増殖因子 （transforming growth factor- j3 , TGF- β ) s 血小板由来増殖因子 (platelet derived growth factor、 PDGF) らと同様である。 Region 1, called the insulin-like growth factor (IGF; binding module), has approximately 32% homology S with the N-terminal of six classical IGF-binding proteins (IGFBP 1-6). Region 3 is a throrabospondin type 1 repeat, has a local motif of WSXCSXXCG (SEQ ID NO: 1), and is responsible for binding to sulfated saccharides, etc. It is called factor type C module and has the same structure as various von Willebrand factors. In this regard, it has been reported that Cyr61 binds to cell surface heparan sulfate proteodalican Region 4 is called the C-terminal module, and 10 cysteines within this region are reported. Six of the residues have a cysteine knot motif, This nerve growth factor (NGF), transforming growth factor (transforming growth factor- j3, TGF- β ) is the same as s platelet-derived growth factor (platelet derived growth factor, PDGF) et al.
Cyr61 は、 血清刺激したマウス繊維芽細胞の cDNA ライブラリーより differential hybridization screening 【こよって J¾得^れた遺 isナで、 1番染色体 （1P22- 31) に座す。 Cyr61, from the cDNA library of mouse fibroblast cells that were serum-stimulated differential hybridization screening [in is Na heritage J¾ obtained ^ was I child stranded, sits on chromosome 1 (1 P 22- 31).
ヒ ト Cyr61 (381アミノ酸） とラッ ト Cyr61 (379アミノ酸） のァミノ 酸配列比較では、 38箇所のシスティンが全て保存されており、 91°/。のァ ミノ酸配列同一性がある。  A comparison of the amino acid sequences of human Cyr61 (381 amino acids) and rat Cyr61 (379 amino acids) shows that all 38 cysteines are conserved, at 91 ° /. Amino acid sequence identity.
また、 本発明における Cyr61には、 上述した既報のアミノ酸配列及び 構造的特徴を有する分子に限らず、 既報または未だ同定されていないが 潜在的な哺乳動物の個体差に由来する任意の変異体及び当該野生型 Cyr61 をコードする遺伝子の一塩基多型によりコードされる変異 Cyr61 も含まれる。  In addition, Cyr61 in the present invention is not limited to the molecules having the previously reported amino acid sequence and structural characteristics, but also includes any previously reported or yet unidentified mutants derived from potential mammalian individual differences and The mutant Cyr61 encoded by the single nucleotide polymorphism of the gene encoding the wild-type Cyr61 is also included.
本発明における 「Cyr61 の生理活性」 とは、 後述の実施例において詳 述される前立腺由来の細胞 （例えば、 上皮細胞、 間質細胞） の増殖、 分 化若しくは形態または該細胞における MAPキナーゼの活性化等に限らず、 既に報告されている任意の活性を意味する。 特に好ましくは、 前立腺由 来の細胞 （例えば、 上皮細胞、 間質細胞） の増殖、 分化若しくは形態ま たは該細胞における MAPキナーゼの活性化が挙げられる。  In the present invention, the term “physiological activity of Cyr61” refers to the growth, differentiation or morphology of prostate-derived cells (eg, epithelial cells, stromal cells) or the activity of MAP kinase in the cells described in the Examples below. Means any activity that has already been reported, not limited to Particularly preferred is proliferation, differentiation or morphology of prostate-derived cells (eg, epithelial cells, stromal cells) or activation of MAP kinase in the cells.
本発明でいう LPA とは、 リ ゾホスファチジン酸 （Lysophosphatidic acid) の略称であり、 フォスファチジン酸（Phosphatidic acid； PA) 力 S、 フォスフオリノヽ0ーゼ Al (Phospholipase A1 ； PLA1) またはフォスフオリ パーゼ A2 (Phospholipase A2 ； PLA2) の作用により脂肪酸の片方が遊離 することによりグリセロール骨格に脂肪酸が 1分子だけ結合した構造を 有する物質である。 LPA には、 その脂肪酸の種類、 脂肪酸の結合位置、 及び結合の種類に より非常に多数の LPAが存在し、 本発明でいう LPAには、 特に断わりの ない限り、 下記に定義する LPA受容体のリガンドとしての任意の LPAを 意味する。 LPA as referred to in the present invention is an abbreviation for lysophosphatidic acid, and is composed of phosphatidic acid (PA) power S, phospholipinase 0 Al (Phospholipase A1; PLA1) or phospholipase A2. (Phospholipase A2; PLA2) is a substance that has a structure in which only one molecule of fatty acid is bonded to the glycerol skeleton by releasing one of the fatty acids by the action of (Phospholipase A2; PLA2). LPA has a very large number of LPAs depending on the type of fatty acid, the bonding position of the fatty acid, and the type of bonding, and the LPA referred to in the present invention includes the LPA receptor defined below unless otherwise specified. Means any LPA as a ligand for
哺乳動物 （例えば、 ヒ ト） の生体内には、 ァシル LPA (パルミチン 酸 （16:0) ゃステアリン酸 （18:0)等の飽和脂肪酸を主に含む。）、 2-ァシ ル LPA (リ ノール酸 （18:2) やァラキドン酸 （20:4) 等の不飽和脂肪酸 を主に含む。）、 1-アルキル LPA、 1-ァルケ-ル LPA、 環状フォスファチジ ン酸 (cyclic phosphatidic acid； cPA) などの種々の生理活性 LPA力 S検 出されるが、 本発明でいう LPAには該 LPA受容体に結合して生理活性を 誘導するものであればそれらの任意が包含される。  In vivo in mammals (eg, humans), acyl LPA (mainly containing saturated fatty acids such as palmitic acid (16: 0) and stearic acid (18: 0)), 2-acyl LPA ( It mainly contains unsaturated fatty acids such as linoleic acid (18: 2) and arachidonic acid (20: 4)), 1-alkyl LPA, 1-alkenyl LPA, cyclic phosphatidic acid (cPA) ) Are detected, and LPA referred to in the present invention includes any of those that bind to the LPA receptor and induce a physiological activity.
本発明における LPA受容体とは、 上述の LPAをリガンドとして結合す ることにより細胞内にシグナルを伝達し、 生体に対して様々な生理現象 を引き起こす細胞膜上の受容体を意味する。  The LPA receptor in the present invention means a receptor on a cell membrane that transmits a signal into a cell by binding the above-mentioned LPA as a ligand and causes various physiological phenomena to a living body.
具体的には、 下記に定義する既報に報告されるとおりの Edg - 2受容体 (vzg-1 受容体、 Rec.1.3 .受容体とも呼ばれる。 くヒ ト Edg- 2> GenBank Accession Number ： NP001392.1 ； J. Cell Biol. , Vol.135, No.4, p.1071-1083, 1996； Biochem. Biophys. Res. Commun. , Vol.231, No.3, p.619-622, 1997 ； Curr. Op in. Cell Biol. , Vol.9 No.2, p.168 - 173， 1997； J. Cell Biochem. Suppl. 30 - 31， .147.-157, 1998； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.95, p.6151 - 6156, 1998)、 Edg- 4受容体 （1ρΛ2受容 体とも呼ばれる。）及び Edg- 7受容体（lpA3受容体。 くヒ ト Edg- 7> GenBank Accession Number： NP036284；国際出願公開 W099/67383号公報； J. Bio. Chem. , Vol.274, No.39, p.27776-27785, 1999 ;Mol. Pharmacol. , Vol.57, p.753-759, 2000 ； Biochem. Biophys. Res. Commun. , Vol.273, No.3, P.805-810, 2000) などを意味する。 前立腺上皮細胞及ぴ間質細胞におい ては、 各々 Edg7受容体及び Edg2受容体の特異的発現が見られる。 Specifically, the Edg-2 receptor (vzg-1 receptor, also referred to as Rec.1.3. Receptor), as reported in the previous report defined below. Human Edg-2> GenBank Accession Number: NP001392. 1; J. Cell Biol., Vol. 135, No. 4, p. 1071-1083, 1996; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 231, No. 3, p. 619-622, 1997; Curr Op in. Cell Biol., Vol. 9 No. 2, p. 168-173, 1997; J. Cell Biochem. Suppl. 30-31, .147.-157, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.95, p.6151-6156, 1998), Edg-4 receptor (also called 1ρρ2 receptor) and Edg-7 receptor (lp A3 receptor. Human Edg-7> GenBank Accession Number: NP036284; International Application Publication W099 / 67383; J. Bio. Chem., Vol. 274, No. 39, p. 27776-27785, 1999; Mol. Pharmacol., Vol. 57, p. 753-759. , 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 273, No. 3, P. 805-810, 2000). In prostate epithelial cells and stromal cells Te are each specific expression of Ed g 7 receptor and Edg2 receptor is observed.
本発明を構成する 「物質」、 具体的には 「Cyr61 の生理活性、 Cyr61 を コードする遺伝子の mRNAの転写若しくは Cyr61をコードする mRNAの蛋 白質への翻訳を阻害する 1若しくは複数の物質」 とは、 自然界に存在す る天然の物質あるいは人工的に調製される任意の物質を意味する。  The `` substance '' constituting the present invention, specifically, `` one or more substances that inhibit the physiological activity of Cyr61, the transcription of mRNA of the gene encoding Cyr61 or the translation of the mRNA of Cyr61 into protein '' Means any naturally occurring substance or any substance prepared artificially.
本発明における該 「物質」 としては、 具体的には、 （1 ) Cyr61 に結合 ■ し Cyr61 の生理活性を阻害する抗体、 ポリペプチドまたは化学的に合成 された化合物、 （2) Cyr61をコードする遺伝子に結合し Cyr61をコードす る mRNA への転写を阻害するオリゴヌク レオチ ドまたは化学的に合成さ れた化合物、 （3) Cyr61をコードする mRNAに結合し Cyr61への翻訳を阻 害するすリゴヌクレオチドまたは化学的に合成された化合物などが挙げ られる。  Examples of the “substance” in the present invention include (1) an antibody, a polypeptide or a chemically synthesized compound that binds to Cyr61 and inhibits the physiological activity of Cyr61, and (2) encodes Cyr61. Oligonucleotides or chemically synthesized compounds that bind to genes and inhibit transcription into mRNA encoding Cyr61, (3) Rigonucleotides that bind to mRNA encoding Cyr61 and inhibit translation into Cyr61 Or a chemically synthesized compound.
該 「抗体」 としては、 Cyr61 に結合するポリクローナル抗体、 モノグ ローナル抗体または該モノクローナル抗体の一部が挙げられる。 好まし くはモノクローナル抗体またはその一部である。 該モノ ク ローナル抗体 には、 非ヒ ト哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体だけでなく、 組換えキ メラモノク ローナル抗体 （実験医学 （臨時増刊号）、 第 6巻、 第 10号、 1988年及び特公平 3 - 73280号公報等）、 組換えヒ ト型モノクローナル抗 体及ぴヒ トモノ ク ローナノレ抗体 ( Nature Genet i c s , Vo l . 7, p. 13— 21， 1994 ； Nature Genet i cs, Vo l . 15, p. 146- 156, 1997 ； 特表平 4-504365 号公報 ； 特表平 7- 509137号公報 ； 日経サイエンス、 6月号、 第 40頁〜 第 50頁、 1995年； 国際出願公開 W094/25585号公報 ； Nature, Vo l . 368， - p. 856-859， 1994；及び特表平 6-500233号公報； 日経サイエンス、 1997 年 4月号、 第 78頁〜第 84頁など） が包含される。  The “antibody” includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a part of the monoclonal antibody that binds to Cyr61. Preferably it is a monoclonal antibody or a part thereof. The monoclonal antibodies include not only monoclonal antibodies derived from non-human mammals, but also recombinant chimeric monoclonal antibodies (Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988 and No. 3,73,280), a recombinant human monoclonal antibody and a human monoclonal antibody (Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Japanese Patent Publication No. 4-504365; Japanese Patent Publication No. 7-509137; Nikkei Science, June, pages 40 to 50, 1995; International Application Publication W094 No./25585; Nature, Vol. 368,-p. 856-859, 1994; and JP-T-Hei 6-500233; Nikkei Science, April 1997, pp. 78-84. Included.
該 「ポリペプチド」 は、 Cyr61 に結合する任意のポリペプチドを意味 する。 該ポリペプチドには、 オリゴペプチド、 融合ポリペプチド、 及び それらの化学修飾体が包含される。 オリゴペプチドとしては、 5乃至 30 個のアミノ酸、好ましくは 5乃至 20個のアミノ酸からなるぺプチドを举 げることができる。 該化学修飾は、 生体に投与された場合の血中半減期 の増大あるいは経口投与時における消化管での分解に対する耐性若しく は吸収性の増大の目的等の種々の目的に応じて設計することができる。 該 「オリゴヌクレオチド」 とは、 Cyr61 をコードする遺伝子 （cDNA及 -びゲノ ミック DNAを含む）または mRNAの塩基配列を基に設計されるァン チセンス DNA医薬またはアンチセンス RNA医薬として有用な 「該遺伝子 または mRNA の部分塩基配列を含むオリゴヌクレオチドあるいはそれら を化学修飾した化学修飾オリ ゴヌクレオチド」 を意味する。 即ち、 該ァ ンチセンスオリゴヌクレオチドは、 Cyr61をコードする遺伝子または RNA にハイブリダイズすることにより、 該 Cyr61をコードする遺伝子の mRNA への転写あるいは該 raRNAの蛋白への翻訳を阻害することができる。 The “polypeptide” means any polypeptide that binds to Cyr61. The polypeptide includes an oligopeptide, a fusion polypeptide, and Their chemical modifications are included. Oligopeptides can include peptides consisting of 5 to 30 amino acids, preferably 5 to 20 amino acids. The chemical modification should be designed for various purposes, such as an increase in blood half-life when administered to a living body or an increase in resistance or absorption to degradation in the gastrointestinal tract during oral administration. Can be. The “oligonucleotide” refers to a gene useful as an antisense DNA drug or an antisense RNA drug designed based on the base sequence of a gene (including cDNA and genomic DNA) or mRNA encoding Cyr61. Oligonucleotides containing partial nucleotide sequences of genes or mRNAs or chemically modified oligonucleotides obtained by chemically modifying them. That is, the antisense oligonucleotide can inhibit transcription of the gene encoding Cyr61 into mRNA or translation of the raRNA into protein by hybridizing to the gene or RNA encoding Cyr61.
ここで、 「部分塩基配列」 とは、 該 Cyr61 をコードする遺伝子または mRNA の任意の部位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意 味する。 該部分塩基配列と.しては、 連続した 5乃至 100塩基の部分塩基 配列が挙げられ、 好ましくは、 連続した 5乃茧 70塩基の部分塩基配列、 さらに好ましくは連続した 5乃至 50塩基の部分塩基配列、より好ましく は連続した 5乃至 30塩基の部分塩基配列が挙げられる。  Here, the “partial nucleotide sequence” means a partial nucleotide sequence consisting of an arbitrary number of bases at an arbitrary site of the gene or mRNA encoding the Cyr61. Examples of the partial base sequence include a continuous partial base sequence of 5 to 100 bases, preferably a continuous partial base sequence of 5 to 70 bases, and more preferably a continuous partial base sequence of 5 to 50 bases. A base sequence, more preferably a partial base sequence of continuous 5 to 30 bases, may be mentioned.
また、 該オリゴヌクレオチドをアンチセンス医薬として用いる場合に は、 該オリ ゴヌクレオチドが患者の体内に投与された場合の血中半減期 の増大 （安定性）、 細胞内膜の透過性の増大、 あるいは経口投与の場合の 消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、 その塩基の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、 例えば、 オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、 リボース、 核酸塩 基、 糖部位、 3 ' 及びノまたは 5 ' 末端等の化学修飾が挙げられる。 リン酸結合の修飾としては、 1以上の該結合を、 ホスホジエステル結 合（D-オリ ゴ）、ホスホロチォエート結合、ホスホロジチォエート結合（S- オリ ゴ）、 メチルホスホネート結合 （MP-オリ ゴ）、 ホスホロアミデート結 合、 非リン酸結合及ぴメチルホスホノチォエート結合のいずれかまたは それらの.組み合わせへの変更を挙げることができる。 リボースの修飾と しては、 2' -フルォロリボースあるいは 2' - 0-メチルリボースなどへの変 ' 更を挙げることができる。 核酸塩基の修飾としては、 5 -プロビュルゥラ シルまたは 2 -ァミノアデニンなどへの変更が挙げられる。 In addition, when the oligonucleotide is used as an antisense drug, an increase in blood half-life (stability) when the oligonucleotide is administered to a patient's body, an increase in permeability of an intracellular membrane, or In the case of oral administration, chemical modification of a part of the base can be performed for the purpose of increasing resistance to degradation in the digestive tract or increasing absorption. Examples of the chemical modification include a chemical modification of a phosphate bond, a ribose, a nucleic acid base, a sugar moiety, a 3 ′ and a 5 ′ or 5 ′ end in an oligonucleotide structure. Modification of a phosphate bond may include one or more of the following linkages: a phosphodiester bond (D-oligo), a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond (S-oligo), a methylphosphonate bond (MP- (Oligo), a phosphoramidate linkage, a non-phosphate linkage and a methylphosphonothioate linkage, or a combination thereof. Examples of the modification of ribose include a change to 2'-fluororibose or 2'-0-methylribose. Modifications of nucleobases include changes to 5-produracil or 2-aminoadenine and the like.
「化学的に合成された化合物」 とは、 上述の抗体、 ポリペプチド、 ォ リ ゴヌクレオチドを除く任意の化合物であって、 分子量約 100 乃至約 1000以下の化合物、好ましくは分子量約 100乃至約 800の化合物であり、 より好ましくは分子量約 100乃至約 600の化合物を挙げることができる。 上述したポリペプチド、 該ポリペプチドの一部 （断片） 及び融合ポリ ぺプチドは、 後述するような遺伝子組換え技術のほか、 化学的合成法、 細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あ るいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。 本発明における 「Cyr61に結合する抗体」 は、 Cyr61 (特に好ましくは ヒ ト Cyr61) を発現する細胞 （天然の細胞、 株化細胞、 腫瘍細胞など）、 Cyr61 (特に好ましくはヒ ト Cyr61) を高発現するように遺伝子組換技術 を用いて作製された形質転換体、 精製または組換え Cyr61 (特に好まし くはヒ ト Cyr61) ポリペプチドを抗原として用い、 該抗原をマウス、 ラ ッ ト、 ハムスター、 モルモッ ト、 ゥサギあるいはャギ等の哺乳動物に免 疫して得られる天然型抗体、 遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメ ラ抗体及ぴヒ ト型抗体 （CDR - grafted抗体）、 並びにヒ ト抗体産生トラン スジエニック動物等を用いて製造され得るヒ ト抗体も包含する。  “Chemically synthesized compound” refers to any compound excluding the above-mentioned antibodies, polypeptides and oligonucleotides, and is a compound having a molecular weight of about 100 to about 1000 or less, preferably about 100 to about 800. And more preferably a compound having a molecular weight of about 100 to about 600. The above-mentioned polypeptide, a part (fragment) of the polypeptide and a fusion polypeptide are known in the technical field such as a chemical synthesis method, a cell culture method and the like, in addition to a genetic recombination technique described later. It can be produced by appropriately using a known method or its modification method. In the present invention, “an antibody that binds to Cyr61” refers to an antibody that expresses Cyr61 (particularly preferably human Cyr61) (natural cells, cell lines, tumor cells, etc.) and Cyr61 (particularly preferably human Cyr61). A transformant, a purified or recombinant Cyr61 (particularly preferably, human Cyr61) polypeptide produced using a gene recombination technique so as to be expressed is used as an antigen, and the antigen is used as a mouse, rat, or hamster. Natural antibodies obtained by immunizing mammals such as guinea pigs, magpies and goats, chimeric antibodies and human antibodies (CDR-grafted antibodies) that can be produced using gene recombination techniques, and Human antibodies that can be produced using human antibody-producing transgenic animals and the like are also included.
モノクローナル抗体には、 lgG、 IgM、 IgA、 IgDあるいは IgEのいずれ のアイソタイプを有するモノクローナル抗体が包含される。好ましく は、 IgGまたは IgMである。 Monoclonal antibodies can be of any l g G, IgM, IgA, IgD or IgE And monoclonal antibodies having the following isotypes: Preferably, it is IgG or IgM.
ポリクローナル抗体 （抗血清） あるいはモノクローナル抗体は、 既存 の一般的な製造方法によって製造することができる。 即ち、 例えば、 前 述のような抗原を、 必要に応じてフロイントアジュパント （Freund' s Adjuvant) とともに、 哺乳動物、 好ましくは、 マウス、 ラッ ト、 ハムス ター、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ブタ、 ャギ、 ゥマあるいはゥ シ、 より好ましくはマウス、 ラッ ト、 ノ、ムスター、 モルモッ トまたはゥ サギに免疫する。  Polyclonal antibodies (antisera) or monoclonal antibodies can be produced by existing general production methods. That is, for example, a mammal, preferably a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig, a heron, a cat, and a dog, may be added to the antigen as described above together with Freund's adjuvant, if necessary. Immunize pigs, goats, peas or stomachs, more preferably mice, rats, wild cats, musters, guinea pigs or magpies.
ポリクローナル抗体は、 該免疫感作動物から得た血清から取得するこ とができる。 またモノ ク ローナル抗体は、 該免疫感作動物から得た該抗 体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞 （ミエローマ細胞） か らハイプリ ドーマを調製し、 該ハイプリ ドーマをクローン化し、 哺乳動 物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体 を産生するクローンを選択することによって製造される。  The polyclonal antibody can be obtained from serum obtained from the immunized animal. In addition, a monoclonal antibody is prepared by preparing a hybridoma from the antibody-producing cells obtained from the immunized animal and a myeloma cell line (myeloma cell) having no autoantibody-producing ability, and cloning the hybridoma. It is produced by selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity for the antigen used for immunizing a mammal.
モノクローナル抗体は、，具体的には下記のようにして製造することが できる。 即ち、 前述のような抗原を免疫原とし、 該免疫原を、 必要に応 じてフロイントアジュパント （Freund' s Adjuvant) とともに、 非ヒ ト哺 乳動物、 具体的には、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモッ トあるレヽ はゥサギ、 好ましくはマウス、 ラッ トあるいはハムスター （後述するヒ ト抗体産生トランスジェエックマウスのような他の動物由来の抗体を産 生するように作出されたトランスジヱニック動物を含む） の皮下内、 筋 肉内、 静脈内、 フッ ドパッ ド内あるいは腹腔内に 1乃至数回注射するか あるいは移植することにより免疫感作を施す。 通常、 初回免疫から約 1 乃至 14日毎に 1乃至 4回免疫を行って、最終免疫より約 1乃至 5 日後に 免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。 免疫を施す 回数及び時間的インターバルは、 使用する免疫原の性質などにより、 適 宜変更することができる。 The monoclonal antibody can be specifically produced as follows. That is, the antigen as described above is used as an immunogen, and the immunogen is used together with Freund's Adjuvant, if necessary, together with a non-human mammal, specifically, a mouse, rat, Hamsters and guinea pigs are egrets, preferably mice, rats or hamsters (transgenes produced to produce antibodies from other animals, such as the human antibody-producing transgenic mice described below). Immunization is performed by one or several injections or implantations subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a footpad, or intraperitoneally (including animals). Usually, immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days after the first immunization, and antibody producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the last immunization. Immunize The number and time interval can be appropriately changed depending on the nature of the immunogen to be used and the like.
モノクローナル抗体を分泌するハイプリ ドーマの調製は、 ケーラー及 びミノレシユタインらの方法（ネイチヤー（Nature)、 Vo l . 256, p. 495-497, 1975) 及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。 '即ち、 前 述の如く免疫感作された非ヒ ト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、 - 骨髄あるいは扁桃等、 好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、 好ま しくはマウス、 ラッ ト、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギまたはヒ ト等 の哺乳動物、 より好ましくはマウス、 ラッ トまたはヒ ト由来の自己抗体 産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される c 細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、 例えばマウス由来ミ ェローマ P3/X63-AG8. 653 ( 653)、 P3/NS I/ 1- Ag4 - 1 (NS- 1)、 P3/X63— Ag8. U1 ( P3U1)、 SP2/0-Ag14 ( Sp2/0、 Sp2)、 PAI、 FOあるいは BW5147、 ラッ ト 由来ミエローマ 210RCY3-Ag. 2. 3. 、 ヒ ト由来ミエローマ U - 266AR1、 GM1500— 6TG— A1 - 2、 UC729— 6、 CEM_AGR、 D 1R 1 1あるいは CEM - T 15を使用す ることができる。 . . The preparation of a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be carried out according to the method of Koehler and Minoresutine et al. (Nature, Vol. 256, p. 495-497, 1975) and modifications according thereto. 'I.e., spleen, lymph nodes, antibody-producing cells preferably contained in the spleen, such as bone marrow or tonsil, obtained from a non-human mammal immunized as described above, and preferably, a mouse or rat. C-cell fusion prepared by cell fusion with a mammal such as guinea pig, hamster, rabbit, human or the like, more preferably a mouse, rat or human derived myeloma cell having no autoantibody-producing ability. Examples of myeloma cells obtained include mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8.63 (653), P3 / NS I / 1-Ag4-1 (NS-1), P3 / X63—Ag8.U1 (P3U1), SP2 / 0-A g 14 (Sp2 / 0, Sp2), PAI, FO or BW5147, rat-derived myeloma 210RCY3-Ag 2. 3., human-derived myeloma U -. 266AR1, GM1500- 6TG- A1 - 2, UC729 — 6, CEM_AGR, D1R11 or CEM-T15 can be used. .
モノクローナノレ抗体を産生するハイブリ ドーマクローンのスクリ一二 ングは、 ハイプリ ドーマを、 例えばマイクロタイタープレート中で培養 し、 増殖の見られたゥエルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗 原に対する反応性を、 例えば R I Aや E L I S A等の酵素免疫測定法に よって測定することにより行なうことができる。  Screening of hybridoma clones that produce monoclonal antibodies is performed by culturing hybridomas, for example, in microtiter plates, and immunizing the culture supernatant of the wells in which proliferation has been observed in the immunization described above. The reactivity with the antigen can be measured by, for example, an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
ハイプリ ドーマからのモノクローナノレ抗体の製造は、 ハイプリ ドーマ をインビトロ、 またはマウス、 ラッ ト、 モノレモッ ト、 ハムスターまたは ゥサギ等、 好ましくはマウスまたはラッ ト、 より好ましくはマウスの腹 水中等でのインビボで行い、 得られた培養上清、 または哺乳動物の腹水 から単離することにより行うことができる。 インビトロで培養する場合には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の 目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、 ハイプリ ドーマを増殖、 維 持及び保存させ、 培養上清中にモノク口ーナル抗体を産生させるために 用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製さ れるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。 ' The production of monoclonal antibodies from hybridomas can be carried out in vitro, or in vivo in mice, rats, monoremots, hamsters, or egrets, preferably in mice or rats, more preferably in ascites of mice. It can be performed by isolating from the obtained culture supernatant or ascites of a mammal. When culturing in vitro, the hybridomas are grown, maintained and preserved in accordance with various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method, and the monoclonal antibody is contained in the culture supernatant. It can be carried out using any known nutrient medium such as that used for producing E. coli or any nutrient medium derived and prepared from a known basal medium. '
基本培地としては、 例えば、 Ham' s F12培地、 MCDB153培地あるいは低 カルシウム MEM培地等の低カルシウム培地及び MCDB104培地、 MEM培地、 D- MEM培地、 RPMI1640培地、 ASF104培地あるいは RD培地等の高カルシ ゥム培地等が挙げられ、 該基本培地は、 目的に応じて、 例えば血清、 ホ ルモン、 サイ ト力イン及び/または種々無機あるいは有機物質等を含有 することができる。  Examples of the basic medium include a low calcium medium such as Ham's F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium, and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium. The basic medium may contain, for example, serum, hormones, cytosolic acid and / or various inorganic or organic substances, depending on the purpose.
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、 飽和硫酸アンモニゥム、 ユーグロブリン沈澱法、 力プロイン酸法、 カプ リル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（D EAEまたは DE 5 2等）、 抗ィムノグロプリンカラムあるいはプロテイン Aカラム等のァフィニテ イカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。 本発明における 「抗体の一部」 とは、 前述のようなモノクローナル抗 体の一部分の領域を意味し、具体的には F(ab' ) 2、Fab'、Fab、Fv(variable fragment of antibody) ^ sFv、 dsFv 、disulphide stabilised Fv) ,ある レヽは dAb (single domain antibody) などを意味する (Exp. Opin. Ther. Patents, 第 6卷， 第 5号， 第 441頁〜第 456頁， 1996年）。 For isolation and purification of monoclonal antibodies, use the above culture supernatant or ascites fluid with saturated ammonium sulfate, euglobulin precipitation method, force proic acid method, caprylic acid method, ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.) By subjecting it to affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column. The term “part of an antibody” in the present invention means a partial region of the monoclonal antibody as described above, and specifically, F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv (variable fragment of antibody) ^ sFv, dsFv, disulphide stabilized Fv), a certain means dAb (single domain antibody), etc. (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, 441-456, 1996) ).
本発明における前立腺疾患とは、 具体的には、 例えば、 前立腺肥大症 及び前立腺癌などが挙げられる。前立腺肥大あるいは前立腺肥大症とは、 前述した既報に報告されているとおりに症状及び病態を示す疾患である (薬局、 Vol.51, No.3， p.3-50, 2000)。  The prostate disease in the present invention specifically includes, for example, benign prostatic hyperplasia and prostate cancer. Prostatic hypertrophy or benign prostatic hyperplasia is a disease that shows symptoms and pathology as reported in the previous report (Pharmacy, Vol. 51, No. 3, p. 3-50, 2000).
本発明における 「前立腺疾患に付随する疾患」 とは、 排尿障害や排尿 障害に伴う膀胱拡張や腎不全を意味する。 排尿障害を症状で分類すると 刺激症状 （残尿感、 尿意切迫、 昼間頻尿、 夜間頻尿） と閉塞症状 （遷延 性排尿、 苒延性排尿、 尿腺途絶、 尿腺細小、 いぎみ） に分類される。 本 発明における排尿障害とはそれらいずれかの症状を呈する状態を意味す る。 . The “disease associated with prostate disease” in the present invention refers to dysuria or urination It refers to bladder dilation and renal failure associated with disability. Urinary disorders are classified into irritant symptoms (residual urination, urgency, frequent urination, nocturia) and obstructive symptoms (prolonged urination, prolonged urination, urinary gland disruption, small urinary glands, igimi). Is done. The dysuria in the present invention means a state showing any of those symptoms. .
ここで 「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 • 崩壊剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の一つ以上を用いることにより、 錠剤、 丸剤、 散剤、 顆 粒剤、 注射剤、 液剤、 カプセル剤、 トローチ剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる c これらの医薬組成物は、 経口あるいは非経口的に投与することができ る。 非経口投与のためのその他の形態としては、 一つまたはそれ以上の 活性物質を含み、 常法により処方される外用液剤、 腸溶内投与のための 坐剤およびペッサリーなどが含まれる。 Here, “pharmaceutically acceptable carrier” refers to excipients, diluents, bulking agents, • disintegrants, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, viscous agents Agents, flavoring agents, solubilizing agents or other additives. By using one or more of such carriers, tablets, pills, powders, granules, injections, liquids, capsules, troches, elixirs, suspensions, emulsions, syrups, etc. Pharmaceutical compositions can be prepared c These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally. Other forms for parenteral administration include topical solutions containing one or more active substances, formulated in a conventional manner, suppositories and pessaries for enteral administration.
投与量は、 患者の年齢、 .性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間、 あるいは該医薬組成物に含有される活性成分 （前記の本発明 に係る 「物質」 など） の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、 —回につき lO ju g力、ら lOOOmg (あるいは 10 μ g力 ら 500mg) の範囲で投 与することができる。 しかしながら、 投与量は種々の条件により変動す るため、 上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、 また上記の範囲 を越える投与量が必要な場合もある。  The dosage may be the patient's age, sex, body weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient (such as the “substance” according to the present invention described above) contained in the pharmaceutical composition. The dose can vary depending on the dose. Usually, the dose can be in the range of lO jug, per dose, or lOOOOmg (or 10 μg, 500 mg). However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, or a dose exceeding the above range may be necessary.
とりわけ注射剤の場合には、 例えば生理食塩水あるいは市販の注射用 蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に 0. 1 μ g抗体 Zml担 体〜 10mg 抗体 Zml 担体の濃度となるように溶解または懸濁することに より製造することができる。 このようにして製造された注射剤は、 処置 を必要とするヒ ト患者に対し、 1回の投与において 1 kg体重あたり、 1 μ g〜100mgの割合で、 好ましくは 50 /z g〜50mgの割合で、 1 日あたり 1回〜数回投与することができる。 投与の形態としては、 静脈内注射、 皮下注射、 皮内注射、 筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適 当な投与形態が例示できる。 好ましくは静脈内注射である。 Particularly in the case of injections, the concentration of 0.1 μg antibody Zml carrier to 10 mg antibody Zml carrier in a non-toxic pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection is used. It can be produced by dissolving or suspending as such. The injection thus produced is treated 1 to 100 mg / kg body weight, preferably 50 / zg to 50 mg / kg body weight per dose, for human patients who require be able to. Examples of the administration form include medically appropriate administration forms such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection and intraperitoneal injection. Preferably it is an intravenous injection.
また、 注射剤は、 場合により、 非水性の希釈剤 （例えばプロピレング リ コール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エタ ノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製す ることもできる。  Injectables may be prepared as non-aqueous diluents (eg, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions and emulsions. You can also.
そのような注射剤の無菌化は、 バクテリア保留フィルターを通す濾過 滅菌、 殺菌剤の配合または照射により行うことができる。 注射剤は.、 用 時調製の形態として製造することができる。 即ち、 凍結乾燥法などによ つて無菌の固体組成物とし、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶 媒に溶解して使用することができる。  Such injections can be sterilized by filtration and sterilization through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide or irradiation. Injectables can be manufactured as ready-to-use preparations. That is, it can be used as a sterile solid composition by freeze-drying or the like, dissolved in sterile distilled water for injection or other solvents before use.
本発明の医薬組成物は、 前立腺疾患 （特には、 前立腺肥大症、 前立腺 癌） の発症の予防、 前立腺.疾患の進行の抑制または前立腺疾患を治療す るための医薬品として有用である。 また、 本発明の医薬組成物は、 そう して前立腺疾患 （前立腺肥大、 前立腺癌など） を抑制することにより前, 立腺疾患 （前立腺肥大、 前立腺癌など） によって引き起こされる排尿障 害等の症状を緩和または治療することも可能である。  The pharmaceutical composition of the present invention is useful as a medicament for preventing the onset of prostate disease (particularly, benign prostatic hyperplasia, prostate cancer), suppressing the progress of prostate disease, or treating prostate disease. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention suppresses prostate diseases (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.), thereby suppressing symptoms such as urinary dysfunction caused by prostate disease, prostate disease (prostatic hypertrophy, prostate cancer, etc.). Can be alleviated or treated.
さらに、 本発明の医薬組成物は、 前立腺疾患 （前立腺肥大症や前立腺 癌など） の既存の治療方法 （例えば、 前立腺肥大の治療の場合には抗ァ ンドロゲン剤、 α ι遮断剤、 あるいは抗コリンエステラーゼ剤などによ る薬剤療法。） と併用することにより前立腺疾患 （前立腺肥大症や前立腺 癌など） の治療効果を増大させることも可能である。 Furthermore, the pharmaceutical compositions of the present invention, the existing methods of treatment of prostate disease (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) (e.g., in the treatment of prostatic hypertrophy Koa androgen agents, alpha iota blockers or anticholinesterase It can also increase the therapeutic effect of prostate disease (such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer) when used in combination with drug therapies.
本発明は、 前述したとおりの 「Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの 転写、 Cyr61をコードする mRNAの蛋白質への翻訳または Cyr61の産生を 調節する能力を有する物質を同定する方法」 及び 「Cyr61 の生理活性を 調節する能力を有する物質を同定する方法」 に関する。 As described above, the present invention relates to the conversion of a gene encoding Cyr61 into mRNA. The present invention relates to a method for identifying a substance capable of regulating transcription, translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, or production of Cyr61, and a method for identifying a substance capable of regulating the physiological activity of Cyr61.
該本発明の方法は、 即ち、 当該物質を選別 （スク リーニング） する方 法である.。  The method of the present invention is a method of screening (screening) the substance.
本発明の方法に用いられる細胞としては、 Cyr61 を産生し得る細胞で あればどのような細胞をも利用し得る。 例えば、 天然の細胞または当該 細胞から樹立された細胞株 （特に好ましくはヒ ト由来）、 Cyr61 (好まし くはヒ ト由来）をコードする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞、 Cyr61 をコードする RNAが導入された細胞などが挙げられる。 特に好ま しくは、 哺乳動物 （好ましくはヒ ト） の前立腺に由来する上皮細胞また は間質細胞であり、 それら細胞は初代培養細胞または樹立された細胞株 であってもよい。当該細胞株としては、例えば DU - 145 (ATCC No. HTB - 81)、 PC - 3 ( ATCC No. CRL-1435 ) LNCaP. FGC ( ATCC No. CRL - 1740 )、 PZ - HPV- 7 (ATCC No. CRL-2221)、 PrSC ( Clonet i cs製）、 PrEC ( Clonet i cs製）、 PrSMC ( Clonet i cs 製）、 BRF-55T ( BRFF 製） 等が挙げられ、 特に好ましくは BRF - 55Tである。  As the cells used in the method of the present invention, any cells that can produce Cyr61 can be used. For example, a natural cell or a cell line established from the cell (particularly preferably derived from human), a transgenic cell transformed with a gene encoding Cyr61 (preferably derived from human), encoding Cyr61 And cells into which RNA has been introduced. Particularly preferably, they are epithelial cells or stromal cells derived from the prostate of a mammal (preferably human), and the cells may be primary cultured cells or established cell lines. Such cell lines include, for example, DU-145 (ATCC No. HTB-81), PC-3 (ATCC No. CRL-1435) LNCaP. FGC (ATCC No. CRL-1740), PZ-HPV-7 (ATCC No. CRL-2221), PrSC (manufactured by Clonet ics), PrEC (manufactured by Clonet ics), PrSMC (manufactured by Clonet ics), BRF-55T (manufactured by BRFF), etc., and particularly preferably BRF-55T .
該遺伝子組換え細胞の調製に用いられる宿主細胞としては、 Cyr61 を 産生する能力を有する限り任意の細胞を用いることができる。  As a host cell used for the preparation of the transgenic cell, any cell can be used as long as it has the ability to produce Cyr61.
例えば、 遺伝子組換え蛋白質の製造の技術分野において通常使用され る天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞 （例え ば、 細菌 （ェシエリキア属菌、 バチルス属菌）、 酵母 （サッカロマイセス 属、 ピキア属など）、 動物細胞または昆虫細胞などが例示される。  For example, various cells (for example, bacteria (Escherichia sp., Bacillus sp.), Yeast (Saccharomyces sp.) Such as natural cells or artificially established recombinant cells commonly used in the technical field of the production of recombinant proteins. Genus, Pichia), animal cells or insect cells, and the like.
好ましくは動物細胞であり、 具体的には、 マウス由来細胞 （C0P、 L、 C127、 SP2/0、 NS- 1 または NIH3T3等）、 ラッ ト由来細胞 （PC12、 PC12 h 等）、ハムスター由来細胞（BHK及ぴ CH0等）、サル由来細胞（C0S1、 C0S3、 C0S7、 CV1及ぴ Velo等) およぴヒ ト由来細胞 （HeLa、 2倍体線維芽細胞 に由来する細胞、 HEK293細胞、 ミエローマ細胞および Namalwa等）.など が例示される。 Preferably animal cells, specifically, mouse-derived cells (C0P, L, C127, S P 2/0, NS- 1 or NIH3T3, etc.), rat-derived cells (PC12, PC12 h, etc.), hamster Cells (BHK and CH0 etc.), monkey-derived cells (C0S1, C0S3, C0S7, CV1, and Velo) and human-derived cells (HeLa, cells derived from diploid fibroblasts, HEK293 cells, myeloma cells, Namalwa, and the like).
本発明の 「Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写、 Cyr61をコー ドする mRNAの蛋白質への翻訳または Cyr61の産生を調節する能力を有す る物質を同定する方法」 の一つには、 レポーター蛋白質をコードする遺 -' 伝子及ぴその蛋白質の性質を用いる所謂レポータージーンアツセィ ^reporter gene assay が包含される。  One of the `` methods for identifying a substance capable of regulating transcription of a gene encoding Cyr61 to mRNA, translation of mRNA encoding Cyr61 into protein, or production of Cyr61 '' of the present invention includes: The so-called reporter gene assay using the gene encoding the reporter protein and the properties of the protein is included.
「レポーター蛋白質」 としては、 蛍若しくはゥミシィタケなどに由来 するルシフェラーゼ、 またはクラゲ由来の G F P (Green Fluorescence Protein) などが好ましい。  As the "reporter protein", luciferase derived from fireflies or Glycyrrhiza or a jellyfish-derived GFP (Green Fluorescence Protein) is preferable.
レポータージーンアツセィは、 例えば、 下記のような方法が代表的で ある。  For example, the following method is representative of the reporter Gene Atsushi.
標的蛋白をコードする遺伝子とレポーター蛋白をコードする遺伝子を、 該標的蛋白遺伝子の mRNA への転写のシグナルに依存して該レポーター タンパクをコードする遺伝子の mRNA への転写が起こるように挿入した 発現ベクターで、 遺伝子組換えタンパクの製造で一般的に使用される細 胞を形質転換して遺伝子組換え細胞を作製する。 得られた形質転換細胞 に、 被験物質 （上述） を接触させる。 該物質の作用に依存して発現され る該標的蛋白のレベルを、 該標的蛋白の発現と同時に発現される該レポ 一タータンパクが発する蛍光の量を測定することにより間接的に測定す ることにより、 該化合物が、 トランスポーター分子の発現に影響を与え るか否かを分析する方法 （例えば、 米国特許第 5, 436， 128号及び米国'特 許第 5， 401, 629号を参照）。  An expression vector in which a gene encoding a target protein and a gene encoding a reporter protein are inserted so that transcription of the gene encoding the reporter protein into mRNA depends on a signal for transcription of the target protein gene into mRNA. Then, cells commonly used in the production of transgenic proteins are transformed to produce transgenic cells. A test substance (described above) is brought into contact with the obtained transformed cells. Indirectly measuring the level of the target protein expressed depending on the action of the substance by measuring the amount of fluorescence emitted by the reporter protein expressed simultaneously with the expression of the target protein. To analyze whether the compound affects the expression of a transporter molecule (see, eg, US Pat. No. 5,436,128 and US Pat. No. 5,401,629). .
また、 本アツセィを用いた該化合物の同定は、 マニュアル作業でも可 能であるが、 機械 （ロボッ ト） を用いて自動で行う所謂ハイスループッ トスクリーニング（Hi gh Throughput Screening) (組織培養工学， Vo l . 23， No. 13, p. 521 - 524；米国特許第 5， 670， 113号） を用いることにより より 迅速、 簡便に行うことができる。 In addition, the identification of the compound using the present assay can be performed manually, but a so-called high-throughput system is automatically performed using a machine (robot). The use of high-throughput screening (tissue culture engineering, Vol. 23, No. 13, p. 521-524; U.S. Pat. No. 5,670,113) allows for quicker and simpler screening. it can.
上記方法で用いられる 「細胞」 及び 「物質」 なる用語は、 前記に定義 したとおりの意味を有する。  The terms “cell” and “substance” used in the above method have the meanings as defined above.
本発明の 「Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写を調節する能力 を有する物質を同定する方法」の実施の工程における mRNAの量の測定に は、 既報の任意の方法を用いることができ、 例えば、 分岐 DNAプローブ 法 （branched DNA ; bDNA) 及び RT- PCR法等を挙げることができる。 特に 好ましくは bDNA法である。 bDNA法は、 市販のキッ トを甩いて当該試薬 に添付の取扱い説明マニュアルに従って実施することができる（例えば、 ノヽ エノレネ土の F Quant iGene Hi gh Vo lume Ki t for the Direct Quant i tat ion of Cel lular mRNA」 など）。  For the measurement of the amount of mRNA in the step of carrying out the `` method of identifying a substance capable of regulating transcription of the gene encoding Cyr61 into mRNA '' of the present invention, any of the previously reported methods can be used, For example, a branched DNA probe method (branched DNA; bDNA), an RT-PCR method and the like can be mentioned. Particularly preferred is the bDNA method. The bDNA method can be carried out using a commercially available kit and according to the instruction manual attached to the reagent (for example, F Quant iGene Hig Volum Kit for the Direct Quantitation of Cel no. lular mRNA ").
本発明の 「Cyr61の産生を調節する能力を有する物質を同定する方法」 の工程における Cyr61の量の決定には、 既報の任意の方法を用いること ができ るが、 好ま し く .は汎用 されている ELISA ( enzyme-l inked immunosorbent as say) でめ.る。  For the determination of the amount of Cyr61 in the step of the `` method for identifying a substance capable of regulating Cyr61 production '' of the present invention, any of the previously reported methods can be used, but is preferably used widely. ELISA (enzyme-linked immunosorbent as say).
本発明における 「Cyr61の産生を誘導する刺激」 とは、 Cyr61を産生す る能力を有する細胞（天然、野生型、組換え細胞等）に該細胞からの Cyr61 の産生を誘導または促進する活性を有する物質を作用させることを意味 する。 該物質は、 該細胞からの Cyr61の産生を誘導または促進する活性 を有していれば任意の物質が使用でき、 例えば、 血清 （例えば、 ゥシ胎 児血清 （FBS ; fetal bovine serum) ) や LPA (上記に詳述したとおり） 等を用いることができる。 実施例 以下、 実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明が該実 施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでも ない。 〔実施例 1〕 組換えヒ ト Cyr61の調製 In the present invention, “stimulation for inducing the production of Cyr61” refers to a cell capable of producing Cyr61 (natural, wild-type, recombinant cells, etc.) having an activity of inducing or promoting the production of Cyr61 from the cell. Means to have a substance that has Any substance can be used as long as it has an activity of inducing or promoting the production of Cyr61 from the cells, such as serum (for example, fetal bovine serum (FBS)) or LPA (as detailed above) and the like can be used. Example Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but it is needless to say that the present invention is not limited to the embodiments described in the Examples. [Example 1] Preparation of recombinant human Cyr61
商業的に取得可能なプラスミ ド （IMAGE clone と呼ばれる） である (IMAGE no.5 (dbEST ID: 2431291、 GenBank accession: AI612743) ) から得たヒ ト Cyr61の 0RFをコードする cDNA (配列番号 2 ) をプラスミ ド pETd (Novagen製） に挿入し、 発現ベクター PETd/Cyr61mycHisを作成 した。常法により、この発現べクターで大腸菌 BL21 codonPlus (DE3)- RIL competent cell (Stratagene社製） を形質転換した。 形質転換株を、 LB 培地中で前培養し、 IPTGで発現誘導を行い、 組換えヒ ト Cyr61 (His- Tag が付加されている） を含む培養液を 4時間後に回収した。 ヒ ト Cyr61の 発現は、 抗 His- tagポリクローナル抗体 （Santa- Cruz社製） を用いたゥ エスタンブロッテイングにより確認した。 CDNA encoding 0RF of human Cyr61 obtained from a commercially available plasmid (called IMAGE clone) (IMAGE no.5 (dbEST ID: 2431291, GenBank accession: AI612743)) (SEQ ID NO: 2) It was inserted into plasmid PETD (manufactured by Novagen), creating the expression vectors P ETd / Cyr61mycHis. Escherichia coli BL21 codonPlus (DE3) -RIL competent cell (manufactured by Stratagene) was transformed with this expression vector by a conventional method. The transformed strain was pre-cultured in LB medium, expression was induced with IPTG, and a culture solution containing recombinant human Cyr61 (to which His-Tag was added) was collected after 4 hours. The expression of human Cyr61 was confirmed by easter blotting using an anti-His-tag polyclonal antibody (manufactured by Santa-Cruz).
回収した培養上清から封入体画分を回収、 可溶化後、 Niキレートカラ ムを用いたァフイエティーク口マトグラフィ一に供した。 洗浄バッファ 一 (20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM イミダゾーノレ， 6M 尿素， ImM 2— メルカプトエタノール （ρΗ8·0)) で洗浄後、 再生バッファー （20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 20mM イミダゾーノレ， ImM 2—メノレカプトエタノー ノレ （ρΗ8·0)) と溶出バッ フ ァー （20mM Tris— HC1， 0.5M NaCl, 500mM ィ ミダゾール， 0.1% Triton X-100 (ρΗ8.0) ) とのイミ.ダゾールのグラジェ ントにて溶出し、 精製組換えヒ ト Cyr61面分を得た。 抗 His - tagポリク ローナル抗体 （Santa- Cruz社製） を用いたウェスタンプロッティングに より ヒ ト Cyr61が精製されたことを確認した。  The inclusion body fraction was collected from the collected culture supernatant, solubilized, and then subjected to affinity mouth chromatography using a Ni chelate column. Wash buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazono, 6 M urea, ImM 2-mercaptoethanol (ρΗ80)), then regenerate buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazono, ImM 2-Menolecaptoethanol (ρΗ80) and an elution buffer (20 mM Tris—HC1, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 0.1% Triton X-100 (ρΗ8.0)) The purified recombinant human Cyr61 surface was obtained. It was confirmed that human Cyr61 was purified by Western blotting using an anti-His-tag polyclonal antibody (manufactured by Santa-Cruz).
結果を図 1に示す。 〔実施例 2〕 Cyr61の前立腺細胞の接着誘導活性 The results are shown in Figure 1. Example 2 Activity of Cyr61 for Inducing Adhesion to Prostate Cells
く 2- 1> ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の接着誘導活性の試験  2-1 Test of the activity of human Cyr61 to induce prostate cell adhesion
実施例 1で調製した精製ヒ ト Cyr61 の前立腺細胞に対する細胞接着誘 導活性を以下のように試験した。  The activity of the purified human Cyr61 prepared in Example 1 for inducing cell adhesion to prostate cells was tested as follows.
組換えヒ ト Cyr61 を、 ELISA用 96穴マイク口プレート ( Iwaki社製） - 各ゥヱルに加え、 室温で 2時間インキュベートし、 組換えヒ ト Cyr61を マイクロプレートに吸着させた。 この時、 陽性対照としてはフイブロネ クチン （ベーリンガー社製）、 陰性対照としては Bovine Serum Albumin (BSA, シグマ社製） を用いた。  Recombinant human Cyr61 was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki) for ELISA, and incubated at room temperature for 2 hours to adsorb the recombinant human Cyr61 to the microplate. At this time, fibronectin (Boehringer) was used as a positive control, and Bovine Serum Albumin (BSA, Sigma) was used as a negative control.
次いで、 上清を捨て、 各クエルを 0. 1%の BSAを含有するリン酸緩衝液 ( 200 /i 1) で 3回洗浄した。 このようにして、各ゥエルを組換え Cyr61、 フィプロネクチンもしくは BSAでそれぞれコーティングしたマイクロプ レートを作製した。  The supernatant was then discarded and each well was washed three times with phosphate buffer containing 200% of BSA (200 / i 1). Thus, microplates were prepared in which each well was coated with recombinant Cyr61, fipronectin or BSA, respectively.
間質細胞用増殖培地 SCGM ( Clonet i cs社製 ； 力タログ番号 CC- 3205) を用いて、 フ ラ ス コにて培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics社製；カタ口グ番号 CC - 2508) を 10mMの EDTAと 0. 1%の BSA を含有するリン酸緩衝液を用いて穏やかに回収した。 回収した前立腺由 来間質初代細胞 PrSC を 0. 01%の BSA (シグマ社製） と 1%のぺ シリン/ ス ト レプトマイシン （シグマ社製） を含有する間實細胞用基礎培地 SCBM (Clonet i cs 社製； カタログ番号 CC- 3204) に懸濁し、 上述のマイク ロ プレートに播種 （1 X 104個ノウエル） し、 37°Cで 2時間インキュベート した。 ' ， Prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; Catalog No. CC) cultured in flasks using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics; CC-3205) -2508) was gently recovered using a phosphate buffer containing 10 mM EDTA and 0.1% BSA. The recovered prostate-derived stromal primary cells, PrSC, were transformed into a basal medium SCBM (Clonet) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% ぺ -sylin / streptomycin (Sigma). Suspended in ICS, catalog number CC-3204), seeded on the microplate described above (1 × 10 4 wells), and incubated at 37 ° C. for 2 hours. ',
細胞を播種したゥエルを 0. 01%の BSAと 1%のぺニシリン /ス トレプトマ イシンを含有する間質細胞用基礎培地 SCBM ( 100 μ 1 ； Clonet i cs社製） で 4回洗浄した。 次いで、 Ce l l Count ing Kit- F (同仁化学研究所社製） に含まれる Calsein- AM / DMSO 溶液を間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） で 50倍希釈し、 各ゥエルに添加した （10 1/ゥェ ル）。 次いで、 37°Cで 2時間インキュベートし、 細胞内に取り込まれ細胞 内エステラーゼにより加水分解された Calseinの蛍光を測定することに よって接着した生細胞数を測定した。 The wells inoculated with the cells were washed four times with a basal medium for stromal cells SCBM (100 μl; Clonet ics) containing 0.01% BSA and 1% penicillin / streptomycin. Next, Cell Counting Kit-F (manufactured by Dojindo Laboratories) The Calsein-AM / DMSO solution contained in was diluted 50-fold with a basal medium for stromal cells SCBM (manufactured by Clonetics) and added to each well (10 1 / well). Then, the cells were incubated at 37 ° C for 2 hours, and the number of viable cells adhered was measured by measuring the fluorescence of Calsein taken up into the cells and hydrolyzed by intracellular esterase.
結果を図 2に示す。  The result is shown in figure 2.
ヒ ト Cyr61が、 前立腺間質細胞に対して濃度依存的な細胞接着誘導活 性を有していることが示された。  It was shown that human Cyr61 had a concentration-dependent cell adhesion-inducing activity on prostate stromal cells.
<2-2> ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の細胞接着誘導活性の抑制試験  <2-2> Inhibition test of human Cyr61 on cell adhesion-inducing activity of prostate cells
実施例く 2- 1>で示した、精製ヒ ト Cyr61の前立腺間質細胞に対する接着 誘導活性の抑制について以下のように試験した。  The inhibition of the adhesion-inducing activity of purified human Cyr61 to prostatic stromal cells, as shown in Example 2-1>, was tested as follows.
組換えヒ ト Cyr61を、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Iwaki社製） 各ゥエルに加え、 室温で 2時間インキュベー小し、 組換えヒ ト Cyr61を マイクロプレートに吸着させた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥヱルを 0.1% の BSAを含有するリン酸緩衝液 （200 μ ΐ) で 3回洗浄した。 このように して、 各ゥエルを組換え Cyr61でコ ーティングしたマイク口プレートを 作製した。  Recombinant human Cyr61 was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated for 2 hours at room temperature, and the recombinant human Cyr61 was adsorbed to the microplate. Next, the supernatant was discarded, and each gel was washed three times with a phosphate buffer solution (200 μΐ) containing 0.1% BSA. In this way, a microphone opening plate in which each well was coated with recombinant Cyr61 was prepared.
次いで、各ゥエルにへパリン（和光純薬社製； 100 i g/ml)、 EDTA (GIBCO 社製； 50mM)、 EDTAZへパリ ン （50mMZ 100 g/ml) を 50 1/ゥエルで 加え 37°Cで 30分間ィンキュベートした。この時、陰性対照としては 0.01% の BSA (シグマ社製） と 1%のぺニシリン /ス トレプトマイシン （シグマ社 製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBMを用いた。  Next, heparin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries; 100 ig / ml), EDTA (manufactured by GIBCO; 50 mM) and EDTAZ heparin (50 mMZ 100 g / ml) were added to each well at 50 1 / well, and the temperature was 37 ° C. For 30 minutes. At this time, as a negative control, a basal medium for stromal cells SCBM containing 0.01% of BSA (manufactured by Sigma) and 1% of penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma) was used.
' 間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いて、 フラスコにて 培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics社製； カタ口グ番号 CC-2508) を 10mMの EDTA と 0.1%の BSAを含有するリン酸緩衝液を用い て穏やかに回収した。 回収した前立腺由来間質初代細胞 PrSCを 0.01%の BSA と 1°/。のペニシリ ン/ス トレプトマイシンを含有する間質細胞用基礎 培地 SCBM, (Clonetics社製） に懸濁し、 上述のマイクロプレートに 50 w 1/ゥエルで播種 （1X104個 Zゥエル） し、 37°Cで 2時間インキュベート した。 '' The prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; Cat. No.CC-2508) cultured in flasks were grown in 10 mM EDTA and 0.1% using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics). Gently recovered using phosphate buffer containing BSA. Recovered prostate-derived stromal primary cells PrSC BSA and 1 ° /. Suspended in a basal medium for stromal cells SCBM (manufactured by Clonetics) containing penicillin / streptomycin, and inoculated in the above microplate at 50 w 1 / ゥ -ell (1 × 10 4 cells). Incubated at ° C for 2 hours.
この時.、 同時に Cell Counting Kit- F (同仁化学研究所社製） に含ま れる Calsein- AM/DMS0溶液を間質細胞用基礎培地 SCBMで 50倍希釈し、 各ゥエルに添加した （10// 1/ゥエル）。 次いで、 細胞を播種したゥ ル を 0.01%の BSAと 1%のぺニシリ ン /ス トレプトマイシンを含有する間質細 胞用基礎培地 SCBM (100 i l) で 4回洗浄した。 次いで、 37°Cで 2時間ィ ンキュペートし、 細胞内に取り込まれ細胞内エステラーゼにより加水分 解された Calseinの蛍光を測定することによって接着した生細胞数を測 定した。  At this time, at the same time, the Calsein-AM / DMS0 solution contained in the Cell Counting Kit-F (manufactured by Dojindo Laboratories) was diluted 50-fold with the basal medium for stromal cells SCBM and added to each well (10 // 1 / ゥ L). Next, the cells inoculated with the cells were washed four times with a basal medium for stromal cells SCBM (100 ml) containing 0.01% BSA and 1% penicillin / streptomycin. Then, the cells were incubated at 37 ° C for 2 hours, and the number of viable cells adhered was measured by measuring the fluorescence of Calsein taken up into the cells and hydrolyzed by intracellular esterase.
結果を図 3に示す p P showing the result in FIG. 3
ヒ ト CyrSl の、 前立腺由来間質細胞に対する接着誘導活性は、 へパリ ンもしくは EDTAによって部分的に、 へパリンと EDTAとの併用によって 完全に抑制されることが示された。 組換えヒ ト Cyr61は、 へパリン結合 部位を介して、 または 2価イオン依存的な結合部位を介して接着誘導活 性を示していることが示された。 〔実施例 3〕 抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル抗体の調製 .  It was shown that the activity of human CyrSl to induce adhesion to prostate-derived stromal cells was partially inhibited by heparin or EDTA, and completely inhibited by the combined use of heparin and EDTA. The recombinant human Cyr61 was shown to exhibit adhesion-inducing activity via a heparin binding site or via a divalent ion-dependent binding site. (Example 3) Preparation of anti-human Cyr61 polyclonal antibody.
く 3-1〉 抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル抗体の調製 3-1> Preparation of anti-human Cyr61 polyclonal antibody
実施例 1で調製した組換えヒ ト Cyr61を免疫原として、常法に従って、 ゥサギもしくはャギに免疫することにより抗血清または 0 /-グロプリ ン 画分を調製した。  Using the recombinant human Cyr61 prepared in Example 1 as an immunogen, an antiserum or 0 / -glopurin fraction was prepared by immunizing a heron or a goat in a conventional manner.
次いで、抗血清または γ-グロプリン画分を 0·45μιτιフィルターでろ過 後、 プロテイン Αカラムを用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一に 供した。 洗浄バ ッ フ ァ ー （2mM KH2P04, 18mM Na2HP04, 154mM NaCl (pH7.4-7.8)) で洗浄後、 クェン酸 （溶出） バッファー （67mM Citrate, 77mM Na2HP04, 150mM NaCl (pH3.6-4.0)または 87mM Citrate, 41mM Na2HP04) 150mM NaCl (PH2.7 - 3.0)) で溶出し、 0.75M Tris - HC1バッファー （pH9.0) を用いて直ちに中和した。 Next, the antiserum or γ-glopurin fraction was filtered through a 0.45μιτι filter, and then subjected to affinity chromatography using a protein Α column. Provided. After washing with washing bars Tsu off § chromatography (2mM KH 2 P0 4, 18mM Na 2 HP0 4, 154mM NaCl (pH7.4-7.8)), Kuen acid (elution) buffer (67mM Citrate, 77mM Na 2 HP0 4, 150mM eluting with 3.0)), 0.75M Tris - - NaCl (pH3.6-4.0) or 87mM Citrate, 41mM Na 2 HP0 4 ) 150mM NaCl (P H2.7 HC1 immediately with buffer (pH 9.0) neutralization did.
次いで、 得られた中和液をリン酸緩衝液（-）で一昼夜透析後、 0.22^ 11! フィルター （ミ リポア社製） でろ過して、 下記の精製抗ヒ ト Cyr61ポリ クローナル抗体を得た。  Next, the obtained neutralized solution was dialyzed for 24 hours with a phosphate buffer (-) and filtered through a 0.22 ^ 11! Filter (manufactured by Millipore) to obtain the following purified anti-human Cyr61 polyclonal antibody. .
<ゥサギ抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル抗体 >  <Egret anti-human Cyr61 polyclonal antibody>
N70-1及ぴ 070-3  N70-1 and 070-3
くャギ抗ヒ ト Cyr61ポリクローナノレ抗体〉  Goat anti-human Cyr61 polyclonal antibody>
069-1及び 069-2  069-1 and 069-2
なお、 本実施例を含め以下のいずれの実施例中、 並びに当該実施例に おける試験結果として示した図面または表中においては、 上記の名称を 使用する。，  The above names are used in any of the following examples including this example, and in the drawings or tables shown as the test results in the examples. ,
く 3-2〉 ゥサギ及びャギポリクローナル抗体のヒ ト Cyr61 に対する反応 性 ' 3-2> 反 応 Reactivity of rabbit and goat polyclonal antibodies to human Cyr61 '
前述のようにして調製した種々のゥサギ及びャギポリクローナル抗体 のヒ ト Cyr61.に対する反応性を、 常法により ヒ ト Cyr61を一過性に発現 させたアフリカミ ドリザル腎線維芽細胞株 COS- 7 (ATCC社製； CRL- 1651) の細胞溶解液を用いたウェスタンプロッティングにより確認した。  The reactivity of the various rabbit and goat polyclonal antibodies prepared as described above to human Cyr61 was determined using the African green monkey kidney fibroblast cell line COS-7 (transiently expressing human Cyr61 by a conventional method). It was confirmed by Western plotting using a cell lysate of ATCC; CRL-1651).
この際、 ヒ ト Cyr61 の一過的発現には、 翻訳領域 （配列番号 2及び 3 ) を含むヒ ト Cyr61 cDNAをプラスミ ド pcDNA3 (ェ nvitrogen社製） に挿入 し作成した発現ベクター pcDNA3/Cyr61、 及び pEFlraycHisA (Invitrogen 社製） に揷入し作成した発現ベクター pEFlmycHisA/Cyr61mycHis を用い た。 結果を図 4に示す。 At this time, for the transient expression of human Cyr61, the expression vector pcDNA3 / Cyr61, which was prepared by inserting human Cyr61 cDNA containing the translation region (SEQ ID NOs: 2 and 3) into plasmid pcDNA3 (manufactured by Envitrogen), was prepared. And pEFlraycHisA (manufactured by Invitrogen), and the prepared expression vector pEFlmycHisA / Cyr61mycHis was used. Fig. 4 shows the results.
全てのゥサギ及びャギポリク口ーナル抗体が、 ヒ ト Cyr61に対する反 応性を有することを確認した。 N70-1 と 069 - 2は mycHis - tagに対する反 応性も有することを確認した。 069-2 はサル Cyr61 に対する反応性を有 すること.を確認した。  All the rabbit and goat polyclonal antibodies were confirmed to have reactivity to human Cyr61. It was confirmed that N70-1 and 069-2 also had reactivity to mycHis-tag. 069-2 was found to be reactive to monkey Cyr61.
·· 〔実施例 4〕 Cyr61の前立腺細胞の伸展活性 Example 4 Cyr61 Spreading Activity of Prostate Cells
〈4-1〉 ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の伸展活性の試験  <4-1> Examination of human Cyr61 prostatic cell spreading activity
実施例 1で調製した精製ヒ ト Cyr61の前立腺由来間質細胞に対する細 胞伸展活性を以下のように試験した。  The cell spreading activity of the purified human Cyr61 prepared in Example 1 on prostate-derived stromal cells was tested as follows.
組換えヒ ト Cyr61 (0.16 gZクエル， 0.5 z g/ゥェル） を、 ELISA用 , 96穴マイクロプレート （Iwaki社製） 各ゥエルに加え、 室温で 2時間ィ' ンキュベートし、 耝換えヒ ト Cyr61をマイクロプレートに吸着させた。 この時、 陽性対照と してはフイブロネクチン （ベーリ ンガ一社製 ； 0.5 gZゥェル）、 陰性対照としては BSA (シダマ社製； 0.5 g/ゥヱル） を用いた。 次いで、 上清を捨て、 各ウェ^ /レを 0.1°/。の BSAを含有するリ ン 酸緩衝液 1) で 3回洗浄した。 このようにして、 各ゥヱルを組換 え Cyr61、 フイブロネクチン、 もしくは BSAでそれぞれコーティングし たマイクロプレートを作製した。  Recombinant human Cyr61 (0.16 gZ well, 0.5 zg / well) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (Iwaki), incubated at room temperature for 2 hours, and the recombinant human Cyr61 was micronized. The plate was adsorbed. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer; 0.5 g / ml) was used as a positive control, and BSA (manufactured by Sidama; 0.5 g / ml) was used as a negative control. Then, the supernatant was discarded and each well was removed at 0.1 ° / well. It was washed three times with a phosphate buffer solution 1) containing BSA. In this way, microplates were prepared in which each gel was coated with recombinant Cyr61, fibronectin, or BSA.
間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いて、 フラスコにて 培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics社製； カタログ番号 CC-2508) を 10mMの EDTA と 0.1%の BSAを含有するリン酸緩衝液を用い て穏やかに回収した。 回収した前立腺由来間質初代細胞 PrSCを 0.01%の BSA (シグマ社製） と 1%のペニシリ ン/ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 上述 のマイク口プレー トに播種した （1X104個ノウエル）。 37°Cでィンキュベ 一トし経時的に形態観察し、 2時間後に写真撮影した。 Primary prostate-derived stromal primary cells, PrSC (Clonetics; Cat.No.CC-2508), cultured in flasks using SCGM (Clonetics), a growth medium for stromal cells, containing 10 mM EDTA and 0.1% BSA The solution was gently recovered using a phosphate buffer solution. Primary prostate-derived stromal primary cells, PrSC, were converted to basal medium for stromal cells SCBM (Clonetics) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). And seeded on the above-mentioned microphone-mouth plate (1 × 10 4 wells). Incube at 37 ° C The morphology was observed over time and photographed 2 hours later.
結果を図 5に示す。  Fig. 5 shows the results.
ヒ ト Cyr61が、 前立腺間質細胞に対して濃度依存的な細胞伸展活性を 有することが示された。  It was shown that human Cyr61 has a concentration-dependent cell spreading activity on prostate stromal cells.
〈4-2〉 ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の伸展活性の抑制試験 （その ' 1) <4-2> Inhibition test of human Cyr61 on the extension activity of prostate cells (Part 1)
実施例〈4-1〉で示した、ヒ ト Cyr61 の前立腺由来細胞に対する細胞伸展 活性の抑制について以下のように試験した。  The inhibition of the cell spreading activity of human Cyr61 on prostate-derived cells, as described in Example <4-1>, was tested as follows.
組換えヒ 卜 Cyr61 (0. 16 gZゥエル， 0.5 g/ゥエル） を、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Iwaki社製） 各ゥエルに加え、 室温で 2時間ィ ンキュペートし、 組換えヒ ト Cyr61をマイクロプレートに吸着させた。 この時、 対照 してはフイブロネクチン （ベーリ ンガー社製； 0.5 μ ゥエル） を用いた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルを 0. 1%の BSAを含有 するリン酸緩衝液 （200 1) で 3回洗浄した。 このようにして、 各ゥェ ルを組換え Cyr61 もしくはフィプロネクチンでコーティングしたマイク 口プレートを作製した。  Recombinant human Cyr61 (0.16 gZ well, 0.5 g / well) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated at room temperature for 2 hours, and the recombinant human Cyr61 was micronized. The plate was adsorbed. At this time, fibronectin (Boehringer; 0.5 μl) was used as a control. Then, the supernatant was discarded, and each well was washed three times with a phosphate buffer solution (2001) containing 0.1% BSA. Thus, a microplate plate in which each well was coated with recombinant Cyr61 or fipronectin was prepared.
次いで、 各ゥエルに EDT.A (GIBC0社製； 50mM) を 50 1 ゥエルで加 え 37°Cで 30分間ィンキュベートした。 この時、 陰性対照としては 0.01% の BSA (シグマ社製） と 1%のべ-シリ'ン /ス トレプトマイシン Xシグマ社 製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBMを用いた。  Next, EDT.A (manufactured by GIBC0; 50 mM) was added to each well at 501 wells, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. At this time, a basal medium for stromal cells SCBM containing 0.01% of BSA (manufactured by Sigma) and 1% of basin-siline / streptomycin X Sigma) was used as a negative control.
間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いて、 フラスコにて 培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics社製； カタ口グ番号 CC-2508) を.10mMの EDTA と 0. 1%の BSAを含有するリン酸緩衝液を用い て穏やかに回収した。 回収した前立腺由来間質初代細胞 PrSCを 0.01%の BSA と 1%のペニシリ ン/ス トレプトマイシンを含有する間質細胞用基礎 培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 上述のマイクロプレートに 50 1/ゥエルで播種 （1X 104個 Zゥエル） し、 37°Cでインキュベートし経時 的に形態観察し、 2時間後に写真撮影した。 Prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) cultured in a flask using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics) and 0.1 mM EDTA and 0.1% Gently recovered using phosphate buffer containing 2% BSA. The recovered prostate-derived stromal primary cells, PrSC, are suspended in SCBM (Clonetics), a basal medium for stromal cells containing 0.01% BSA and 1% penicillin / streptomycin. Seed at 1 / well (1 x 10 4 zwells), incubate at 37 ° C and age Morphological observation was performed, and photographs were taken 2 hours later.
結果を図 6に示す。  Fig. 6 shows the results.
ヒ ト Cyr61の、 前立腺間質細胞に対する伸展活性は、 EDTAによって完 全に抑制されることが示された。 組換えヒ ト Cyr61 は、 2価イオン依存 的に伸展活性を示していることが示された。  It was shown that the spreading activity of human Cyr61 on prostatic stromal cells was completely suppressed by EDTA. Recombinant human Cyr61 was shown to exhibit extension activity in a divalent ion-dependent manner.
<4-3> ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の伸展活性の抑制試験 （その 2)  <4-3> Inhibition test of human Cyr61 on prostate cell spreading activity (Part 2)
実施例く 4 - 1>で示したヒ ト Cyr61 の前立腺間質細胞に対する細胞伸展 活性の抑制について以下のように試験した。  Example 4 The inhibition of the cell spreading activity of human Cyr61 shown in 4-1> on prostatic stromal cells was tested as follows.
組換えヒ ト Cyr61 ( 0.16 gZゥェル， 0.5^ /ゥヱル） を、 ELISA用 96穴マイクロプレート （Iwaki社製） 各ゥエルに加え、 室温で 2時間ィ ンキュベ一トし、 組換えヒ ト Cyr61 をマイク口プレートに吸着させた。 この時、 対照としてはフイブロネクチン （ベーリンガ一社製； 0.5 g/ ゥエル） を用いた。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルを 0.1%の BSAを含有 するリン酸緩衝液 （200 1) で 3回洗浄した。 このようにして、 各ゥ ノレを糸且換え Cyr61 もしくはフイブロネクチンでコーティングしたマイク 口プレートを作製した。  Recombinant human Cyr61 (0.16 gZell, 0.5 ^ / ゥ ヱ) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated at room temperature for 2 hours, and the recombinant human Cyr61 was added to the microphone. Adsorbed to the mouth plate. At this time, as a control, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 g / well) was used. Next, the supernatant was discarded, and each well was washed three times with a phosphate buffer solution (2001) containing 0.1% BSA. In this way, a microplate plate was prepared in which each insert was coated with a modified Cyr61 or fibronectin.
次いで、 各ゥエルに上記で調製したゥサギ抗ヒ ト Cyr61ポリクローナ ル抗体 N70- 1を 2μ gノウエルで、 lZゥェル加え 37°Cで 2時間ィン キュペートした。 この時、 陰性対照としてはゥサギ IgG (ケミコン社製） を用いた。  Next, each well was prepared by adding the above-prepared rabbit ego anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1 to the wells in a 2 μg well and incubating at 37 ° C. for 2 hours. At this time, Egret IgG (manufactured by Chemicon) was used as a negative control.
間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いて、 フラスコにて 培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics社製； .カタ口グ番号 CC-2508) を 10mMの EDTA と 0.1%の BSAを含有するリン酸緩衝液を用い て穏やかに回収した。 回収した前立腺由来間質初代細胞 PrSCを 0.01%の BSA (シグマ社製） と 1%のペニシリン/ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 上述 のマイクロプレートに 50 / 1ノウエルで播種，（1 X 104個/ゥエル） し、 37°Cでィンキュベートし経時的に形態観察し、 2時間後に写真撮影した。 結果を図 7に示す。 Prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; Cat. No. CC-2508) cultured in a flask were cultured in 10 mM EDTA and 0.1% stromal cells using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics). Gently recovered using phosphate buffer containing BSA. The recovered prostate-derived stromal primary cells, PrSC, were transferred to a basal medium for stromal cells, SCBM (Clonetics), containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). Suspended, as described above The microplate was seeded at 50/1 Nowell, (1 × 10 4 cells / well), incubated at 37 ° C., observed over time, and photographed 2 hours later. Fig. 7 shows the results.
ヒ ト Cyr61の前立腺間質細胞に対する伸展活性は、ゥサギ抗ヒ ト Cyr61 ポリクローナル抗体 N70- 1 によって完全に抑制されることが示された。 〔実施例 5〕 ヒ ト Cyr61による MAP kinase活性化の試験  It was shown that the spreading activity of human Cyr61 on stromal cells of the prostate was completely suppressed by the rabbit heron anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1. [Example 5] Test of MAP kinase activation by human Cyr61
実施例 1で調製した精製ヒ ト Cyr61の前立腺細胞における MAP kinase (ERK p42/P44) 活性化を以下のように試験した。 The MAP kinase (ERK p42 / P 44 ) activation in prostate cells purified human Cyr61 prepared in Example 1 was tested as follows.
組換えヒ ト Cyr61 (0.5 /ゥェル） を、 ELISA用 96穴マイクロプレ ート （Iwaki 社製） 各ゥヱルに加え、 室温で 時間インキュベートし、 組換えヒ ト Cyr61をマイクロプレートに吸着させた。 この時、 陽性対照 としてはフイブロネクチン （ベーリンガ一社製； 0.5 g/ゥエル）、 陰性 対照としてはポリ- L -リジン （シグマ社製； 0.5/ g/ゥエル） を用いた。 次いで、上清を捨て、各ゥヱルを 0. 1%の BSAを含有するリン酸緩衝液（200 1) で 3回洗浄した。 このようにして、 各ゥエルを組換え Cyr61、 フィ プロネクチン若しくはポリ - L-リジンでそれぞれコ ーティングしたマイ クロプレートを作製した。  Recombinant human Cyr61 (0.5 / well) was added to each well of a 96-well microplate for ELISA (manufactured by Iwaki), incubated at room temperature for hours, and the recombinant human Cyr61 was adsorbed to the microplate. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 g / ゥ l) was used as a positive control, and poly-L-lysine (manufactured by Sigma; 0.5 / g / ゥ l) was used as a negative control. Subsequently, the supernatant was discarded and each gel was washed three times with a phosphate buffer solution (2001) containing 0.1% BSA. In this manner, microplates in which each well was coated with recombinant Cyr61, fipronectin or poly-L-lysine were prepared.
間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いて、 フラスコにて 培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics社製 ； カタ口グ番号 CC-2508) を 10mMの EDTA と 0. 1%の BSAを含有するリン酸緩衝液を用い て穏やかに回収した。 回収した前立腺由来間質初代細胞 PrSCを 0, 01%の BSA (シグマ社製） と 1%のペニシリ ン/ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 上述 のマイクロプレートに播種 （1 104個 ゥェル） した。 37°Cでインキュ ペートし、 経時的に細胞溶解液を回収した。 MAP kinase (ERK P42/p44) の活性化 （リン酸化） は、 抗活性化型 ERK モノクローナル抗体 （Cel l S ignal ing Technology 社製） または抗 ERK モノクローナル抗体 （Cel l Si gnal ing Technology社製； 活性化型、 非活性化型共に認識） を用いた ウェスタンブロッテイングにより確認した。 The prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) cultured in a flask using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics) and 10 mM EDTA and 0.1% Gently using a phosphate buffer containing BSA. The recovered prostate-derived stromal primary cells PrSC were transformed into a basal medium for stromal cells SCBM (Clonetics) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). were suspended in Ltd.) were seeded into microplates above (1 10 4 Weru). The cells were incubated at 37 ° C and the cell lysate was collected over time. MAP kinase (ERK P 42 / p44) Activation (phosphorylation) of ERK monoclonal antibody (manufactured by Cell Signaling Technology) or anti-ERK monoclonal antibody (manufactured by Cell Signaling Technology); activated and non-activated Recognition) was confirmed by Western blotting.
結果を.図 8及び図 9に示す。  The results are shown in FIGS.
ヒ ト Cyr61 力 S、 前立腺間質細胞において MAP kinase (ERK P42/p44) を活性化することが示された。 Human Cyr61 force S, to activate MAP kinase (ERK P 42 / p44 ) in prostate stromal cells was demonstrated.
〔実施例 6〕 ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の増殖促進活性 Example 6 Activity of Human Cyr61 to Promote Prostate Cell Proliferation
く 6-1〉 ヒ ト Cyr61の前立腺細胞の増殖促進活性の試験 6-1> Test of human Cyr61 for prostate cell growth-promoting activity
実施例 1で調製した精製ヒ ト CyrS lの前立腺細胞に対する増殖促準活性 を以下のようにして試験した。 The growth promoting activity of the purified human CyrS1 prepared in Example 1 on prostate cells was tested as follows.
組換えヒ ト Cyr61 ( 0. 5 μ gZゥエル） を、 96穴マイクロタイタープレ ート （Falcon 社製） 各ゥエルに加え、 4°Cでー晚インキュベートし、 組 換えヒ ト Cyr61 をマイクロタイタ一プレートに吸着させた。 この時、 比 較対照としてはフイブロネクチン（ベーリンガ一社製； 0. 5 g/ゥエル）、 陰性対照としては無吸着を用いた。次いで、上清を捨て、各ゥヱルに 0. 5% の BSAを含有するリン酸緩衝液 （100 / l) を加え、 37°Cで 2時間インキ ュペートし、 プロッキングした。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルを 0. 1% の BSAを含有するリン酸緩衝液 （200 1) で 3回洗浄した。 このように して、 各ゥエルを組換え Cyr61 もしくはフィプロネクチンでそれぞれコ 一ティングしたマイクロプレートを作製した。  Recombinant human Cyr61 (0.5 μg Z-well) was added to each well of a 96-well microtiter plate (Falcon), incubated at 4 ° C, and the recombinant human Cyr61 was added to the microtiter plate. The plate was adsorbed. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 g / well) was used as a comparative control, and no adsorption was used as a negative control. Subsequently, the supernatant was discarded, and each buffer was added with a phosphate buffer solution (100 / l) containing 0.5% BSA, and incubated at 37 ° C for 2 hours, followed by blocking. Then, the supernatant was discarded, and each well was washed three times with a phosphate buffer (2001) containing 0.1% BSA. In this manner, microplates were prepared in which each well was coated with recombinant Cyr61 or fipronectin.
次いで、 間質細胞用増殖培地 SCGM ( Clonet i cs社製） を用いて、 フラ スコにて培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonet i cs社製； 力タ ログ番号 CC- 2508) を回収後、 0. 01%の BSA (シグマ社製） と 1%のぺニシ リン /ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics 社製） に懸濁し、 上述のマイクロタイタープレートに 播種 （8X103個 Zゥ.エル、 50Α( 1Ζゥ工ル） し、 37°Cで 2時間インキュべ ートした。 Then, using a growth medium for stromal cells SCGM (manufactured by Clonet ics), prostate-derived prostate-derived stromal primary cells PrSC (manufactured by Cloneti cs; power tag number CC-2508) cultured in a flask were collected. Then, a basal medium for stromal cells containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) The cells were suspended in SCBM (manufactured by Clonetics), inoculated on the microtiter plate described above (8 × 10 3 Z ゥ. L, 50Α (1Ζ ゥ)), and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
次いで、 各ゥエルにヒ ト血小板由来増殖因子 （R&D 社製； platelet derived growth factor (PDGF) ) (0.5ng/ウエノレ） を 50 μ 1/ゥェ /レカロ え、 37°Cで 6 日間インキュベートした。  Next, human platelet-derived growth factor (PDGF) (0.5 ng / well) was added to each well at 50 μl / μ / recalo and incubated at 37 ° C. for 6 days.
次いで、 各ゥエルに、 生細胞数測定試薬 WST- 8 (ナカライテスタ社製） を ΙΟμ ΐΖゥエル添加しさらに 37°Cで 3時間ィンキュベートした。 マイ クロプレートリーダー （Molecular Device 社製） を用いて、 450nm (参 考波長 650nm) の吸光度を測定した。 なお、 陰性対照として、 PDGFを添 加せず上記と同様にして試験を行った。 .  Next, a viable cell count reagent WST-8 (manufactured by Nacalai Tester) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 3 hours. The absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured using a microplate reader (Molecular Device). As a negative control, the test was performed in the same manner as above without adding PDGF. .
結果を図 10に示す。  The results are shown in FIG.
組換えヒ ト Cyr61が、前立腺由来間質初代細胞 PrSCに対して増殖促進 活性を持つことが示された。またヒ ト PDGF共存下でも前立腺由来間質初 代細胞 PrSCに対して増殖促進活性を持つことが確認された。  Recombinant human Cyr61 was shown to have growth-promoting activity against PrSC, a prostate-derived stromal primary cell. It was also confirmed that it had a growth-promoting activity against prostate-derived stromal primary cells PrSC in the presence of human PDGF.
〈6 - 2〉 ビト Cyr61の前立腺細胞の増殖促進活性の阻害試験 <6-2> Inhibition test of Cyr61 on the promotion of prostate cell proliferation
組換えヒ ト Cyr61 (0.5 z g/ゥェル） を、 96穴マイクロタイタープレ ート （Falcon 社製） 各ゥエルに加え、 4°Cで一晚インキュベートし、 組 換えヒ ト Cyr61 をマイクロタイタープレートに吸着させた。 この時、 比 較対照としてはフイブロネクチン（ベーリンガ一社製； 0.5 μ g ウエル）、 陰性対照としては無吸着を用いた。次いで、上清を捨て、各ゥヱルに 0.5% の BSAを含有するリン酸緩衝液 （100 1) を加え、 37°Cで 2時間ィンキ ュペートし、 ブロッキングした。 次いで、 上清を捨て、 各ゥヱルを 0.1% の BSAを含有するリン酸緩衝液 （200 μ ΐ) で 3回洗浄した。 このように して、 各ゥエルを組換え Cyr61 もしくはフイブロネクチンでそれぞれコ 一ティングしたマイクロプレートを作製した。 次いで、 上清を捨て、 各ゥエルにゥサギ抗ヒ ト Cyr61ポリクローナル 抗体 N70-1 (0.4 g/ゥヱル、 2μ g/ゥヱノレ）を 100 1Ζゥエル加え 37°C で 2時間ィンキュベートした。 この時、 陰性対照としてはゥサギ IgG (ケ ミコン社製 ； 2μ g/ウエノレ) を用いた。 Recombinant human Cyr61 (0.5 zg / well) is added to each well of a 96-well microtiter plate (Falcon), incubated at 4 ° C for 1 hour, and the recombinant human Cyr61 is adsorbed to the microtiter plate. I let it. At this time, fibronectin (manufactured by Boehringer Co .; 0.5 μg well) was used as a comparative control, and no adsorption was used as a negative control. Next, the supernatant was discarded, and a phosphate buffer (1001) containing 0.5% BSA was added to each gel, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 hours to block. Next, the supernatant was discarded, and each gel was washed three times with a phosphate buffer solution (200 μΐ) containing 0.1% BSA. In this way, microplates were prepared in which each well was coated with recombinant Cyr61 or fibronectin. Next, the supernatant was discarded, and each well was supplemented with 100 pegs of a rabbit ego anti-human Cyr61 polyclonal antibody N70-1 (0.4 g / l, 2 μg / l), and incubated at 37 ° C for 2 hours. At this time, as a negative control, Egret IgG (manufactured by Chemicon; 2 μg / Uenole) was used.
上清を捨て、 次いで、 間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を 用いて、フラスコにて培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics ' 社製； カタログ番号 CC- 2508) を回収後、 0.01°/。の 83 （シグマ社製） と 1。/0のぺニシリン /ス トレブトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞 用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 上述のマイクロタイター プレートに播種 （8X 103個/ゥ： Xル、 50μ ΐΖゥヱル） し、 37。Cで 2時間 ィンキュベートした。， Discard the supernatant, and collect the prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics'; Cat. No. CC-2508) cultured in a flask using SCGM (Clonetics), a growth medium for stromal cells. , 0.01 ° /. 83 (manufactured by Sigma) and 1. / 0 penicillin / streptomycin (Sigma) in a basal medium for stromal cells SCBM (Clonetics) and seeded on the microtiter plate described above (8 × 10 3 cells / ゥ: X 50 μm) and 37. Incubated at C for 2 hours. ,
次いで、 各ゥエルにヒ ト血小板由来増殖因子 （R&D 社製 ； platelet derived growth factor (PDGF)) (0.5ng/ウエノレ） を 50 1/ウエノレカロ え、 37°Cで 6 日間インキュベードした。  Then, each plate was incubated with human platelet-derived growth factor (R &D; platelet derived growth factor (PDGF)) (0.5 ng / wenore) at 501 / wellenole and incubated at 37 ° C for 6 days.
次いで、 各ゥュルに、 生細胞数測定試薬 WST- 8 (ナカライテスタ社製) を 10 1Zゥエル添加しさらに 37°Cで 3時間インキュベートした。 マイ クロプレートリーダー （Molecular Device 社製） を用いて、 450nm (参 考波長 650mn) の吸光度を測定した。 なお、 ..陰性対照として、 PDGFを添 , 加せず上記と同様にして試験を行った。  Next, a live cell count reagent WST-8 (manufactured by Nacalai Tester) was added to each of the tubes, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 3 hours. The absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 mn) was measured using a microplate reader (Molecular Device). As a negative control, the test was performed in the same manner as above without adding or adding PDGF.
結果を図 11に示す。  The results are shown in FIG.
ヒ ト Cyr61の前立腺間質細胞の増殖促進活性が抗七 ト Cyr61ポリクロ ーナル抗体により濃度依存的に阻害することが確認された。  It was confirmed that the activity of human Cyr61 to promote the growth of prostatic stromal cells was inhibited in a concentration-dependent manner by an anti-Cyr61 polyclonal antibody.
〔実施例 7〕 ヒ ト Cyr61の mRNAの定量のための分岐 DNAプローブ法の 確立 [Example 7] Establishment of a branched DNA probe method for quantification of human Cyr61 mRNA
本実施例における分岐 DNAプローブ法による RNAの定量は、 バイエル 社提供の技術広報 （QuantiGene High Volume Kit for the Direct Quantitation of Cellular mRNA) に記載される標準的手順に従って行つ た。 当該手順はバイエル社のウェブサイ トで閲覧できる。 In this example, RNA quantification by the branched DNA probe method The procedure was performed according to the standard procedure described in the technical bulletin provided by the company (QuantiGene High Volume Kit for the Direct Quantitation of Cellular mRNA). The procedure is available on the Bayer website.
く 7-1〉 プローブの設計 7-1> Probe design
本実施例において使用するヒ ト Cyr61の mRNAの定量のためめプローブ 各種 （捕捉用イクステンダー （Capture Extender、 CE)、 標識用イクステ ンダー (Label Extender, LE) 及び阻害用プローブ (Blocking Probe)) は、 プローブデザイナーソフ ト （バイエル社製） を用いて設計した。 結果を掘 12及び配列番号 4乃至 41に示す。  Various probes (Capture Extender (CE), labeling extenders (Label Extender, LE) and blocking probes (Blocking Probe)) used for quantification of human Cyr61 mRNA used in this example are The probe was designed using Probe Designer software (manufactured by Bayer). The results are shown in Excavation 12 and SEQ ID NOs: 4 to 41.
<7-2> 希釈直線性の試験 - 希釈直線性を、 Cyr61 の遺伝子発現が確認されている前立腺由来間質 初代細胞 PrSC (Clonetics社製； カタ口グ番号 CC- 2508) 及ぴ前立腺由 来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を用いて、 以下のように試験した。 間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いて、 フラスコにて 培養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC の細胞溶解液を、 キッ ト付属の Lysis Mixtureを使用し調製した。 <7-2> Dilution linearity test-Dilution linearity was evaluated using prostate-derived stromal primary cell PrSC (Clonetics; Cat. No. CC-2508) and prostate from which prostate Cyr61 gene expression was confirmed. The following tests were performed using the epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF). Using a growth medium for stromal cells SCGM (manufactured by Clonetics), a cell lysate of prostate-derived stromal primary cells PrSC cultured in a flask was prepared using the Lysis Mixture attached to the kit.
同様に、 10%のゥシ胎児血清 （Fetal Bovine Serum (FBS)、 JRH社製） と 1%のペニシリ ン/ス ト レプトマイ シン （シグマ社製） を含有する RPMI1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて、 フラスコにて培養 した前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55 の細胞溶解液を、 Kit 付属の Lysis Mixtureを使用し調製した。  Similarly, RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum (FBS), manufactured by JRH) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) (Niken Institute of Biomedical Research) A cell lysate of prostate-derived epithelial cell line BRF-55 cultured in a flask was prepared using the Lysis Mixture included in the Kit.
次いで、 それぞれの細胞溶解液 （細胞数濃度 ： 0.5X104個〜 4X104個 Zゥエル）を用いて、標準的手順に従って分岐 DNAプローブ法による RNA の定量を行った。 Next, using each cell lysate (cell number concentration: 0.5 × 10 4 to 4 × 10 4 cells), RNA was quantified by the branched DNA probe method according to a standard procedure.
結果を図 13に示す。  Fig. 13 shows the results.
前立腺由来間質初代細胞 PrSC及び前立腺由来上皮細胞株 BRF-55T共に 試験範囲 （細胞数濃度： 0. 5 X 104個〜 4 X 104個/ゥエル） において良好 な希釈直線性が確認された。 Both prostate-derived stromal primary cell PrSC and prostate-derived epithelial cell line BRF-55T Test range (cell number concentration: 0. 5 X 10 4 cells ~ 4 X 10 4 cells / Ueru) good dilution linearity in is confirmed.
<7-3> 検量線の作成  <7-3> Creating a calibration curve
実施例く 3- 2>で作製した、 翻訳領域を含むヒ ト Cyr61 cDNAをプラスミ pcDNA3 ( Invitrogen社製） に揷入した発現ベクター pcDNA3ノ Cyr61 を 用いて、 T7 RNAポリメラーゼ （プロメガ社製； Ribomax Large Scale RNA - Product ion System) こよ り、 Cyr61 RNAを in vitro 4こお！/、て調製した。  T7 RNA polymerase (Promega; Ribomax Large) was prepared using the expression vector pcDNA3 Cyr61 obtained by inserting the human Cyr61 cDNA containing the translation region prepared in Example 3-2> into Plasmid pcDNA3 (Invitrogen). Scale RNA-Product ion System) 4 Cyr61 RNAs in vitro! /, Was prepared.
次いで、 これを標準物質 （スタンダード） として用い、 実施例く 7 - 2〉 で確立した分岐 DNAプローブ法を用いて Cyr61の mRNAの検量線を作成し た。  Next, using this as a standard substance, a calibration curve of Cyr61 mRNA was prepared using the branched DNA probe method established in Example 7-2>.
結果を図 14に示す。  The results are shown in FIG.
ヒ ト Cyr61 の mRNA こつき lpg〜 lOOOpg/ウエノレとレヽぅ極めて dynamic rangeの広い濃度範囲で有意差を持った検量線が得られた。 〔実施例 8〕 ヒ ト Cyr61蛋白質の定量のための ELISAの確立  Calibration curves with significant differences over a wide dynamic range were obtained from human Cyr61 mRNA lpg to lOOOpg / well. [Example 8] Establishment of ELISA for quantification of human Cyr61 protein
く 8-1〉 抗体固定化マイクロプレートの作製  8-1> Preparation of antibody-immobilized microplate
本実施例においてマイクロプレートに固定化するポリクローナル抗体 は、 前記で調製した正常ゥサギ由来のポリクローナル抗体 070-3を用い た。 このポリクローナル抗体は、 ヒ ト Cyr61 に高い反応性を有すること に加え、 mycHi s - tagには反応性を示さないという特徴を持つ。  In this example, as the polyclonal antibody to be immobilized on the microplate, the polyclonal antibody 070-3 derived from normal egret prepared above was used. This polyclonal antibody is characterized in that it has high reactivity with human Cyr61 and does not show reactivity with mycHis-tag.
ポリクローナル抗体 070-3 をリン酸緩衝液で希釈し、 0. 5 £ 50 1 Dilute polyclonal antibody 070-3 with phosphate buffer and add 0.5 £ 50 1
Zゥエルの濃度で、 ELISA用 96穴マイクロプレート （ヌンク （Nunc) 社 製） の各ゥエルに加え、 室温で 1時間インキュベートし、 ポリクローナ ル抗体 070-3をマイクロプレートに吸着させた。 At a Z-well concentration, each well of a 96-well ELISA microplate (Nunc) was added and incubated at room temperature for 1 hour to adsorb the polyclonal antibody 070-3 to the microplate.
次いで、 各ゥ ルをリン酸緩衝液 200 μ 1Zゥエルで洗浄した後、 各ゥ エルに 3 %の BSA を含有するリン酸緩衝液 （200 1/ゥエル） を加え、 室温で 2時間もしくは 4°Cでー晚ィンキュベートすることにより抗体が 結合していない部位をブロックした。 次いで、 プレートをリン酸緩衝液Subsequently, each well was washed with 200 μl of a phosphate buffer, and a phosphate buffer containing 3% BSA (200 1 / well) was added to each well. The site where no antibody was bound was blocked by incubating at room temperature for 2 hours or at 4 ° C. Then, place the plate in phosphate buffer
200 1Zゥヱルで 3回洗浄した。 Washed three times with 200 1Z.
<8-2> サンドイッチ ELISAによる定量法の確立  <8-2> Establishment of quantitative method by sandwich ELISA
本発明.で確立されたヒ ト Cyr61定量のためのサンドイッチ ELISAは以 下の通りである。 ·  The sandwich ELISA for human Cyr61 quantification established in the present invention is as follows. ·
実施例く 8- 1>で作製した抗体固定化マイクロプレートの各ゥエルに、測 定試料 （50 1/ゥエル） を加え、 室温で 2時間インキュベートした。 マ ィク口プレートを、 0. 1% Tween20を含有するリン酸緩衝液 200 1/ゥェ ルで 3回洗浄後、 各ゥヱルに、 0. 5% BSA と 0. 1% Tween20 を含有するリ ン酸緩衝液で希釈した実施例 < 3-1 >で作製したャギ抗ヒ ト . Cyr61 ポリ クローナル抗体 069 - 2 ( 0. 15 g/ 50 1/ゥエル） を加え、 室温下で 1 時間インキュベートした。  To each well of the antibody-immobilized microplate prepared in Example 8-1>, a measurement sample (50 1 / well) was added and incubated at room temperature for 2 hours. After washing the microtiter plate three times with phosphate buffer 200 1 / well containing 0.1% Tween20, each well contains 0.5% BSA and 0.1% Tween20. Goat anti-human prepared in Example <3-1> diluted with phosphate buffer. Add Cyr61 polyclonal antibody 069-2 (0.15 g / 501 / well) and incubate at room temperature for 1 hour. did.
次いで、 マイクロプレートを、 0. 1% Tween20を含有するリン酸緩衝液 200 1Zゥヱルで 3回洗浄後、 0. 5°/。 BSA と 0. 1% Tween20 を含有するリ ン酸緩衝液で 10000倍に希釈したビォチン標識抗ャギ IgG抗体 （DAK0社 製） を各ゥエルに加え、 室温下でさらに 1時間インキュベートした。 次いで、 マイクロプレートを、 0. 1°/。 Tween20を含有するリン酸緩衝液 The microplate was then washed three times with 200 1 ゥ ヱ of phosphate buffer containing 0.1% Tween 20 and then 0.5 ° /. A biotin-labeled anti-goat IgG antibody (manufactured by DAK0) diluted 10000-fold with a phosphate buffer containing BSA and 0.1% Tween20 was added to each well, and incubated at room temperature for an additional hour. The microplate was then placed at 0.1 ° /. Phosphate buffer containing Tween20
200 1Zゥェルで 3回洗浄後、 0. 5% BSA と 0. 1% Tween20 を含有するリ ン酸緩衝液で 3000倍に希釈したス トレプトアビジン-西洋ヮサビペルォ キシグ 1™セ ( Streptoavi din-norseradi sh peroxidase ^ ΰθ μ,丄、 マンャ ム社製） を各ゥヱルに加え、 室温下で 1時間インキュベートした。 200 After washing three times with 1Zwell, Streptavidin-Horse rusted peroxidase 1 ™ diluted 3000-fold with phosphate buffer containing 0.5% BSA and 0.1% Tween20 (Streptoavi din-norseradi) sh peroxidase ^ ΰθμ, 丄, manufactured by Manham) was added to each gel and incubated at room temperature for 1 hour.
マイクロプレートを、 0. 1% Tween20 を含有する'リン酸緩衝液 200 μ ΐ Microplates were washed with 200 μl of phosphate buffer containing 0.1% Tween20.
/ゥエルで 4 回洗浄後、 テ ト ラメ チルベンジジン （ DAK0 社製 ； 3-3' -5-5' -Tetra methyl benz i dine (TMB + )、 100 1) を各ウエノレにカロ え、 室温下で 15〜20分間インキュベートした。 各ゥヱルに、 0.5Nの H2S04 (50 μ 1) を加え撹拌し、 反応を止めた。 波 長 450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー （Molecular Divice社 製） で測定した。 測定試料中の Cyr61量は、 下記実施例で作成した検量 線から求めた。 After washing 4 times with a gel / well, add tetramethyl benzylbenzidine (manufactured by DAK0; 3-3'-5-5'-Tetra methyl benzidine (TMB +), 100 1) to each well and add room temperature. For 15-20 minutes. 0.5N H 2 SO 4 (50 μl) was added to each well and stirred to stop the reaction. The absorbance at a wavelength of 450 nm was measured with a microplate reader (Molecular Divice). The amount of Cyr61 in the measurement sample was determined from a calibration curve created in the following example.
<8-3> 検量線の作成 ' <8-3> Create calibration curve ''
実施例く 3 - 2>で常法により調製したヒ ト Cyr61 を一過性に発現させ たアフリカミ ドリザル腎線維芽細胞株 COS- 7 (ATCC社製； CRL-1651) の 細胞溶解液を標準試料 （スタンダード） として用い、 実施例く 8- 2〉で確 立したサンドイッチ ELISAを用いて検量線を作成した。  Example A standard sample was prepared from the cell lysate of the African green monkey kidney fibroblast cell line COS-7 (ATCC; CRL-1651) transiently expressing human Cyr61 prepared in the usual manner in 3-2>. (Standard), and a calibration curve was prepared using the sandwich ELISA established in Example 8-2>.
結果を図 15に示す。  The results are shown in FIG.
ヒ ト Cyr61.について、 低濃度 （高希釈倍率） である 100倍〜 3倍希釈 の範囲で有意差を持った検量線が得られた。  For human Cyr61., A calibration curve with a significant difference was obtained in the low concentration (high dilution ratio) range of 100-fold to 3-fold dilution.
〔'実施例 9〕 LPAによる Edg受容体を介した Cyr61遺伝子の発現誘導 <9-1> 前立腺細胞における Edg受容体の発現 ['Example 9] Induction of Cyr61 gene expression via Edg receptor by LPA <9-1> Expression of Edg receptor in prostate cells
前立腺由来間質初代細胞 PrSC(Clonetics社製；カタ口グ番号 CC - 2508) 及び前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を用いて、 以下のよう に試験した。  Using prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) and prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF), the following tests were performed.
間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いてフラスコにて培 養した前立腺由来間質初代細胞 PrSCから、 セパゾール RNA I (ナカライ テスク社製） を使用して全 RNAを単離した。  Total RNA was isolated from prostate-derived stromal primary cells PrSC cultured in flasks using stromal cell growth medium SCGM (Clonetics) using Sepasol RNA I (Nacalai Tesque).
同様に、 10%の FBS (JRH社製） と 1%のペニシリン/ス トレプトマイシ ン （シグマ社製） を含有する RPMI1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いてフラスコにて培養した前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Tから、 セ パゾール RNA I (ナカライテスタ社製） を使用して全 RNAを単離した。 次いで、 単離した全 RNAを DNase Iで処理してゲノム DNAを除去した 後、 オリ ゴ （dT) プライマーまたはランダムへキサマーを用いて常法に 従って逆転写反応を行い cDNAを調製した。 Similarly, a prostate cultured in a flask using RPMI1640 medium (manufactured by Niken Biomedical Research Institute) containing 10% FBS (manufactured by JRH) and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma) is used. Total RNA was isolated from the derived epithelial cell line BRF-55T using Sepazol RNA I (manufactured by Nacalai Testa). Next, the isolated total RNA was treated with DNase I to remove genomic DNA. Thereafter, reverse transcription was carried out using an oligo (dT) primer or a random hexamer according to a conventional method to prepare cDNA.
次いで、 この cDNAを錶型として Edg受容体特異的プライマー （く Edg2> 配列番号 42及び 43； く Edg4〉配列番号 44及ぴ 45； く Edg7〉配列番号 46及 び 47) を使用し PCR反応を行い、 SYBR Green I の取り込み畺から Edg 受容体 （Edg2、 Edg4、 Edg7) の発現レベルを決定した。  Next, PCR was performed using this cDNA as type III and Edg receptor specific primers (Edg2> SEQ ID Nos. 42 and 43; Edg4> SEQ ID Nos. 44 and 45; Edg7> SEQ ID Nos. 46 and 47). The expression level of Edg receptors (Edg2, Edg4, Edg7) was determined from the uptake of SYBR Green I.
結果を図 16に示す。  The results are shown in FIG.
前立腺由来間質初代細胞 PrSC及び前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Tにお いて Edg2及び Edg4の発現が確認された。 前立腺由来間質初代細胞 PrSC においてのみ Edg7 の発現が確認され、 前立皞由来上皮細胞株 BRF- 55T において Edg7の発現は非常に低いことが示された。 Expression of Edg2 and Edg4 was confirmed in prostate-derived stromal primary cells PrSC and prostate-derived epithelial cell line BRF-55T. Expression of only Edg7 in prostate derived stromal primary cells PrSC is confirmed, expression of Ed g 7 in prostate皞epithelial cell line BRF- 55T was shown to be very low.
<9-2> 前立腺細胞における LPAによる Cyr61遺伝子の発現誘導（その 1) 前立腺由来間質初代細胞 PrSC ( Clonet i cs社製； カタ口グ番号 CC- 2508) 及ぴ前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製) を用いて、 以下のよう に試験した。 - 前立腺由来間質初代細胞 PrSCを、間質細胞用増殖培地 SCGM( Clonet i cs 社製） を用いてマイクロタイタープレートに播種 （I X 104個/ゥエル） した。 37°Cで一晚インキュベートした後、 0. 01%の BSA (シグマ社製） と 1%のぺニシリン /ス トレブトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞 用基礎培地 SCBM (Clonet i cs社製） に置換し、 37°Cで一晚スタベーショ ンを行った。 <9-2> Induction of Cyr61 Gene Expression by LPA in Prostate Cells (Part 1) Prostate-Derived Stromal Primary Cells PrSC (Clonet ics; Kataguchi No. CC-2508) and Prostate-Derived Epithelial Cell Line BRF- Using 55T (manufactured by BRFF), the test was conducted as follows. - prostate derived stromal primary cells PrSC, seeded in microtiter plates using stromal cells for the growth medium SCGM (Clonet i cs Co.) (IX 10 4 cells / Ueru) was. After incubation at 37 ° C, a basal medium for stromal cells, SCBM (Cloneti®) containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) was used. (manufactured by cs Co.) and subjected to a single stove at 37 ° C.
次いで、 各ゥエルに LPA ( 18 : 1、 14 : 0、 16 : 0、 18 : 0) を （最終濃度 10 M/ゥエル） を加え、 37°Cで 1時間、 6時間、 18時間インキュベートし た。 なお、 陽性対照として、 FBS及び脱脂 FBS (LPA除去） を添加し、 陰 性対照として、 無添加で上記と同様にして試験を行った。  Next, LPA (18: 1, 14: 0, 16: 0, 18: 0) (final concentration 10 M / well) was added to each well and incubated at 37 ° C for 1 hour, 6 hours, and 18 hours. . As a positive control, FBS and defatted FBS (LPA removed) were added, and as a negative control, the test was carried out in the same manner as above without any addition.
次いで、 実施例く 7 - 1>において設計したヒ ト Cyr61の mRNAの定量用プ ローブ各種 （CE、 LE、 Blocking Probe) を添加したキッ ト付属の Lysis Mixtureを使用し、細胞溶解液を調製した。次いで、各細胞の溶解液（100 β 1) を用いて、 標準的手順に従って実施例 7で構築した分岐 DNAプロ一 プ法による mRNAの定量を行った。 Next, a template for quantification of human Cyr61 mRNA designed in Example 7-1> was used. Cell lysates were prepared using the Lysis Mixture provided with the kit to which various lobes (CE, LE, Blocking Probe) were added. Next, using the lysate (100β1) of each cell, mRNA was quantified by the branched DNA prop method constructed in Example 7 according to standard procedures.
結果を.図 17に示す。  The results are shown in FIG.
前立腺由来間質初代細胞 PrSCにおいては、いずれの LPA (18:1、 14:0、 16:0、 18:0) によっても Cyr61遺伝子の発現が約 10倍上昇することが確 認された。 この発現上昇は、 LPAの添加から 1時間目をピークに達し、 その後時間経過と共に低下するというプロファイルを示した。 また当該 細胞での Cyr61遺伝子の発現は、 脱脂 FBS (LPA除去） の刺激によっても 上昇することから前立腺細胞における Cyr61 の遺伝子発現の誘導 LPA の刺激による Edg受容体等を介さない経路が存在することも示された。 く 9-3> 前立腺細胞における LPAによる Cyr61遺伝子の発現誘導（その 2 ) 前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を、 10%の FBS ( JRH社製） と 1%のペニシリ ン/ス ト レプトマイシン （シグマ社製） を含有する RPMI1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いてマイクロタイタープ レートに播種 （1X104個 Zゥェル） した。 37°Cでー晚インキュベートし た後、 0.01%の BSA (シグマ社製） と 1%のぺニシリン /ス トレプトマイシ ン （シグマ社製） を含有する RPMI1640培地 （日研生物医学研究所社製） に置換し、 37°Cで一晚スタベーシヨンを行った。 In the prostate-derived stromal primary cells PrSC, it was confirmed that the expression of the Cyr61 gene was increased about 10-fold by any LPA (18: 1, 14: 0, 16: 0, 18: 0). This increased expression peaked at 1 hour after the addition of LPA, and then decreased with time. In addition, the expression of Cyr61 gene in the cells is also increased by the stimulation of defatted FBS (LPA removal). Therefore, induction of Cyr61 gene expression in prostate cells. Was also shown. 9-3> Induction of Cyr61 gene expression by LPA in prostate cells (Part 2) Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was transformed with 10% FBS (manufactured by JRH) and 1% penicillin / Using RPMI1640 medium (manufactured by Nikken Biomedical Research Institute) containing streptomycin (manufactured by Sigma), the cells were seeded on microtiter plates (1 × 10 4 cells). After incubating at 37 ° C, RPMI1640 medium containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) (Nikken Biomedical Research Laboratories) And was subjected to a single station at 37 ° C.
次いで、 各ゥエルに各種の LPA (18:1、 14:0、 16:0、 18:0 ; 最終濃度 ΙΟμΜΖゥエル） を加え、 37°Cで 1時間、 6時間または 18時間インキュ ペートした。 なお、 陽性対照として、 FBS及び脱脂 FBS (LPA除去） を添 加し、 陰性対照として、 無添加で上記と'同様にして試験を行った。  Next, various LPAs (18: 1, 14: 0, 16: 0, 18: 0; final concentration of μμΜΖ ゥ) were added to each well and incubated at 37 ° C for 1, 6 or 18 hours. As a positive control, FBS and defatted FBS (LPA removed) were added, and as a negative control, the test was performed in the same manner as described above without any addition.
次いで、 実施例く 7- 1>において設計した、 ヒ ト Cyr61の mRNA定量用プ ロープ各種 （CE、 LE、 Blocking Probe) を添加したキッ ト付属の Lysis Mixtureを使用し、細胞溶解液を調製した。次いで、各細胞の溶解液（100 μ 1) を用いて、標準的手順に従って実施例 7で構築した分岐 DNAプロ一 プ法による RNAの定量を行った。 Next, the Lysis attached to the kit to which various probes for quantifying human Cyr61 mRNA (CE, LE, Blocking Probe) designed in Example 7-1> were added. A cell lysate was prepared using Mixture. Next, using the lysate (100 μl) of each cell, RNA was quantified by the branched DNA prop method constructed in Example 7 according to standard procedures.
結果を図 18に示す。  The results are shown in FIG.
前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Τにおいては、いずれの LPA(18;1、14:0、 16:0、 18:0) によっても Cyr61遺伝子の発現が約 6- 7倍上昇することが 確認された。 この発現上昇は、 LPAの添加から 1時間目にピークに達し、 その後時間経過と共に低下するプロファイルを示した。 また当該細胞で の Cyr61遺伝子の発現は、 脱脂 FBS (LPA除去） の刺激によつても上昇す ることから前立腺細胞における Cyr61の遺伝子発現の誘導は LPAの刺激 による Edg受容体等を介さない経路が存在することも示された。  In the prostate-derived epithelial cell line BRF-55Τ, it was confirmed that all LPAs (18; 1, 14: 0, 16: 0, 18: 0) increased Cyr61 gene expression by about 6 to 7-fold. . This increased expression peaked at 1 hour after the addition of LPA, and then decreased with time. In addition, the expression of Cyr61 gene in the cells is also increased by the stimulation of defatted FBS (LPA removal). Therefore, the induction of Cyr61 gene expression in prostate cells is not stimulated by LPA, but via the Edg receptor, etc. Was also shown to be present.
〔実施例 1 0〕 FBSによる Cyr61の産生誘導 [Example 10] Induction of Cyr61 production by FBS
前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を、 0.01%の BSA (シグマ 社製） と 1%のペニシリ ン/ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有す る RPMI1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 96穴マイクロタ イタ一プレートに播種 （5X104個/ゥエル） し、 37°Cでー晚インキュべ ートした。 Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was added to RPMI1640 medium containing 0.01% BSA (manufactured by Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma). The plate was inoculated into a 96-well microtiter plate (5 × 10 4 cells / well) and incubated at 37 ° C.
次いで、 各ゥエルに FBS (最終濃度 2%Zゥエル ； JRH社製） を加え、 37°Cで 0.5時間、 1時間、 2時間、 4時間または 8時間ィンキュベートし、 Lysisノ ッファー (0. 1% Tween20、 20raM EDTA及び 1% Elugent (CALBIOCHEM 社製） を含有するリン酸緩衝液） を使用し細胞溶解液を調製した。 実施 例 8で構築したサンドイッチ ELISAを用いて、 該細胞溶解液 （50μ 1) の ヒ ト Cyr61の定量を行った。  Next, FBS (final concentration 2% Z-well; manufactured by JRH) was added to each well, and incubated at 37 ° C for 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours or 8 hours, and Lysis buffer (0.1% A cell lysate was prepared using Tween 20, 20raM EDTA and 1% Elugent (a phosphate buffer containing CALBIOCHEM). Using the sandwich ELISA constructed in Example 8, human Cyr61 in the cell lysate (50 μl) was quantified.
結果を図 19(a)に示す。  The results are shown in FIG. 19 (a).
また、 別の試験として、 各ゥュルに FBS (最終濃度 2%Zゥエル；： TRH 社製） を加え、 37°Cで 0. 5時間、 1時間、 2時間、 4時間または 8時間ィ ンキュペートし、 サンプルバッファー （Owl社製） を使用し SDS- PAGE用 細胞溶解液を調製した。 ャギ抗 Cyr61ポリクローナル抗体を使用したゥ エスタンブロッティングにより該細胞溶解液（15 μ 1) のヒ ト Cyr61の産 生の程度を分析した。 . In addition, as another test, FBS (final concentration 2% ZL ;: TRH Was added and incubated at 37 ° C for 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours or 8 hours, and a cell lysate for SDS-PAGE was prepared using a sample buffer (Owl). . The degree of human Cyr61 production in the cell lysate (15 μl) was analyzed by eastern blotting using a goat anti-Cyr61 polyclonal antibody. .
結果を図 19 (b)に示す。  The results are shown in FIG. 19 (b).
• 前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） において、 FBS刺激により Cyr61蛋白質の産生が上昇することが確認された。 この上昇は、 FBS添加 後 2時間目にピークに達し、 その後時間経過と共に微減するというプロ ファイルを示した。 • In the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF), it was confirmed that FBS stimulation increased the production of Cyr61 protein. The profile showed a profile that peaked 2 hours after the addition of FBS and then decreased slightly over time.
〔実施例 1 1〕 Cyr61遺伝子の前立腺細胞株における発現 [Example 11] Expression of Cyr61 gene in prostate cell line
以下の種々のヒ ト前立腺由来細胞株における Cyr61遺伝子の発現を、 Cyr61特異的プライマーを用いて常法に従って RT- PCR法により試験した c ヒ ト前立腺由来上皮細胞株 （癌細胞） DU- 145 (ATCC No. HTB - 81) ヒ ト前立腺由来上皮細胞.株 （癌細胞） LNCaP. FGC (ATCC No. CRL - 1740) ヒ ト前立腺由来間質細胞株 PrSC (Cloneti cs社製） The expression of the Cyr61 gene in the following various human prostate-derived cell lines was tested by RT-PCR using Cyr61-specific primers according to the conventional method. C Human prostate-derived epithelial cell line (cancer cell) DU-145 ( ATCC No. HTB-81) Human prostate-derived epithelial cell line (cancer cell) LNCaP. FGC (ATCC No. CRL-1740) Human prostate-derived stromal cell line PrSC (Clonetics)
ヒ ト前立腺由来上皮細胞'株 PrEC (Cl onet i cs社製）  Human prostate-derived epithelial cells' strain PrEC (Clonetics)
ヒ ト前立腺由来上皮細胞株 PZ- HPV- 7 (ATCC No. CRL- 2221 )  Human prostate-derived epithelial cell line PZ-HPV-7 (ATCC No. CRL-2221)
ヒ ト前立腺由来上皮細胞株 （癌細胞） PC-3 (ATCC No. CRL- 1435) ヒ ト前立腺由来平滑筋細胞株 PrSMC (Clonet i cs社製）  Human prostate-derived epithelial cell line (cancer cell) PC-3 (ATCC No. CRL-1435) Human prostate-derived smooth muscle cell line PrSMC (Clonetics)
結果を図 20に示す。  The results are shown in FIG.
LNCaP. FGC細胞を除く全ての前立腺由来細胞株において Cyr61遺伝子 の発現が確認された。 本試験で調べた細胞種においては、 上皮系細胞よ りも間質細胞及び平滑筋細胞において Cyr61遺伝子の高い発現が示され た。 〔実施例 1 2〕 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる前立腺細胞で の Cyr61蛋白質の産生の抑制 Expression of the Cyr61 gene was confirmed in all prostate-derived cell lines except LNCaP. FGC cells. The cell types examined in this study showed higher expression of the Cyr61 gene in stromal cells and smooth muscle cells than in epithelial cells. [Example 12] Inhibition of Cyr61 protein production in prostate cells by antisense oligonucleotide
く 12 - 1> Cyr61蛋白質の産生の抑制  12-1> Suppression of Cyr61 protein production
Cyr61アンチセンスオリゴヌクレオチドによる、 FBSによる刺激により 誘導される前立腺細胞での Cyr61蛋白質の産生の抑制効果を、 以下のよ The inhibitory effect of Cyr61 antisense oligonucleotide on the production of Cyr61 protein in prostate cells induced by stimulation with FBS was as follows.
" うにして試験した。 "
前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を、 0. 01%の BSA (シグマ 社製） と 1%のペニシリ ン/ス ト レプトマイシン （シグマ社製） を含有す る RPMI 1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 24穴マイクロタ イタ一プレートに播種 （7 X 104個/ゥェル） した。 Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was converted to RPMI 1640 medium containing 0.01% BSA (manufactured by Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (manufactured by Sigma). The seeds were inoculated on a 24-well microtiter plate (7 × 10 4 cells / well) using Niken Biomedical Research Institute).
37°Cで 8時間インキュベートした後、 常法に従って設計、 合成した t ト Cyr61遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号 48) またはセンスオリゴヌク レオチ ド （配列番号 49) を各ゥエル （最終濃度 I MZゥエル） に加え、 さらに 37°Cでー晚インキュベートした。 なお、 当該アンチセンスオリ ゴヌク レオチドは、 リ ン酸結合の修飾したホスホ ロチォエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 '  After incubating at 37 ° C for 8 hours, antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 48) or sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 49) against t-Cyr61 gene designed and synthesized according to a conventional method was added to each well (final concentration I MZ And further incubated at 37 ° C. The antisense oligonucleotide is a phosphorothioate antisense oligonucleotide having a modified phosphate bond. '
次いで、 FBS (最終濃度 2°/0 ゥヱル； JRH社製） を加え、 37°Cで 2時 間ィンキュベートし、サンプルバッファー（Owl社製） を使用し SDS- PAGE 用細胞溶解液 100 1を調製した。前記で調製したャギ抗 Cyr61ポリクロ ーナル抗体 069- 2を使用したウェスタンブロッテイングにより、 該細胞 溶解液 （5 μ 1) 中の Cyr61蛋白質の量を測定した。 Then, FBS (final concentration 2 ° / 0 Uweru; JRH Co.) was added, 3 7 Inkyubeto two hours at ° C, the sample buffer (Owl Co.) using SDS-PAGE for cell lysate 100 1 Prepared. The amount of Cyr61 protein in the cell lysate (5 μl) was measured by Western blotting using the goat anti-Cyr61 polyclonal antibody 069-1 prepared as described above.
結果を図 21に示す。  The results are shown in FIG.
前立腺由来上皮細胞おいて、 FBSの刺激により Cyr61蛋白質の産生が 誘導され、 この産生は Cyr61アンチセンスオリゴヌクレオチドにより有 意に抑制された。 < 12-2> 細胞の形態変化 In prostate-derived epithelial cells, FBS stimulation induced the production of Cyr61 protein, which was significantly suppressed by the Cyr61 antisense oligonucleotide. <12-2> Morphological changes of cells
前立腺細胞での Cyr61蛋白質の産生の抑制が細胞の形態に及ぼす影響 を、 Cyr61 アンチセンスオリ ゴヌクレオチドを用いて以下のようにして 試験した。  The effect of suppression of Cyr61 protein production in prostate cells on cell morphology was tested using Cyr61 antisense oligonucleotides as follows.
前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を、 0. 01%の BSA (シグマ 社製） と 1%のぺニシリ ン /ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有す る RPMI 1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 96穴マイクロタ イタ一プレートに播種 （1 X 104個 /ゥエル） した。 RPMI 1640 medium containing prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF) and 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) The seeds were seeded on a 96-well microtiter plate (1 × 10 4 cells / well) using (Nikken Biomedical Research Institute).
37°Cで 8時間インキュベー トした後、 ヒ ト Cyr61遺伝子に対するアン チセンスオリ ゴヌク レオチド （上記に同じ） またはセンスオリ ゴヌタ レ ォチド （上記に同じ） を各ゥエル （最終濃度 ゥエル） に加え、 さ らに 37。Cでー晚インキュベートレた。  After incubation at 37 ° C for 8 hours, antisense oligonucleotides (same as above) or sense oligonucleotides (same as above) for the human Cyr61 gene were added to each well (final concentration of wells). . C-incubated.
次いで、 FBS (最終濃度 2 % /ゥエル ； JRH社製） を加え、 37°Cで 2 日 間インキュベートし、 ヒ ト Cyr61の産生が抑制された際の形態変化を観 察した。，  Then, FBS (final concentration 2% / Pell; manufactured by JRH) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 2 days, and morphological changes were observed when the production of human Cyr61 was suppressed. ,
結果を図 22に示す。 .  The results are shown in FIG. .
' 前立腺細胞内での Cyr61蛋白質の産生が抑制されることにより細胞の 形態の著しい変化が起こった。 'Suppression of Cyr61 protein production in prostate cells caused a marked change in cell morphology.
く 12- 3> 細胞増殖の抑制 （その 1 ) 12- 3> Suppression of cell proliferation (Part 1)
前立腺細胞内での Cyr61蛋白質の産生抑制が細胞の増殖に及ぼす影響を、 Cyr61 アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて以下のようにして試験 した。 The effect of suppression of Cyr61 protein production in prostate cells on cell growth was tested using Cyr61 antisense oligonucleotides as follows.
間質細胞用増殖培地 SCGM ( Cl onet i cs社製） を用いてフラスコにて培 養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC ( Cl onet i cs 社製 ； カタログ番号 CC-2508) を回収後、 0. 01%の BSA (シグマ社製） と 1%のぺニシリ ン /ス ト レブトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 マイクロタイタープレートに播種 （1X 104 個/ゥェル、 50 1/ゥヱル) し、 37°Cで 8時間インキュベートした。 各ゥエルに Cyrアンチセンスオリゴヌクレオチド （上記に同じ） また はセンスオリ ゴヌクレオチド（上記に同じ） を加え（最終濃度 0.2、 0.4、 0.8μΜΖゥエル）、 さらに 37°Cでー晚インキュベートした。 After collecting prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetcs; catalog number CC-2508) cultured in a flask using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetcs), 0 g SCBM basal medium containing 01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) (Clonetics), seeded on a microtiter plate (1 × 10 4 cells / well, 501 / well) and incubated at 37 ° C. for 8 hours. Cyr antisense oligonucleotide (same as above) or sense oligonucleotide (same as above) was added to each well (final concentration 0.2, 0.4, 0.8 µl) and incubated at 37 ° C.
次いで、 FBS (最終濃度 2% /ゥヱル； JRH社製） を加え、 37°Cで 4 日 間イ ンキュベー ト後、 各ゥ ルに生細胞数測定試薬 WST- 8 (10 1/ゥェ ル；ナカライテスタ社製） を添加しさらに 37°Cで 3時間ィンキュベート した。  Then, FBS (final concentration 2% / ゥ ヱ; manufactured by JRH) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 4 days. Then, the viable cell counting reagent WST-8 (10 1 / ゥ; (Nakarai Testa) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C for 3 hours.
次いで、 マイクロプレートリーダー （Molecular Device社製） を用い て、 450nm (参考波長 650nm) の吸光度を測定した。 なお、 陰性対照と し て、 FBS とオリ ゴヌクレオチドを添加せず上記と同様にして試験を行つ た。 '  Next, the absorbance at 450 nm (reference wavelength 650 nm) was measured using a microplate reader (Molecular Device). As a negative control, the test was performed in the same manner as above without adding FBS and oligonucleotides. '
結果を図 23に示す。  The results are shown in FIG.
前立腺由来間質初代細胞における Cyr61 の産生を抑制することにより 、 細胞増殖が有意に抑制された。またその細胞増殖の抑制は、加え Cyr61 アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度に依存したものであった。  By suppressing the production of Cyr61 in primary prostate-derived stromal cells, cell proliferation was significantly suppressed. The suppression of cell proliferation was dependent on the concentration of the Cyr61 antisense oligonucleotide.
く 12-4〉 細胞増殖の抻制 （その 2) 12-4> Cell proliferation control (Part 2)
前立腺細胞での Cyr61の産生の抑制のタイミングと細胞増殖の抑制の 関係について以下のように検討した。  The relationship between the timing of suppression of Cyr61 production in prostate cells and the suppression of cell proliferation was examined as follows.
間質細胞用増殖培地 SCGM (Clonetics社製） を用いてフラスコにて培 養した前立腺由来間質初代細胞 PrSC (Clonetics 社製 ； カタログ番号 CC - 2508) を回収後、 0.01%の BSA (シグマ社製） と 1%のぺニシリン /ス ト レブトマイシン （シグマ社製） を含有する間質細胞用基礎培地 SCBM (Clonetics社製） に懸濁し、 マイクロタイタ一プレートに播種 （1X 104 個/ゥェル、 50 1ノウエル） し、 37。Cで 8時間インキュベートした。 次いで、 下記く A〉またはく B>を行った。 く A〉は、 Cyr61アンチセンスオリ ゴヌクレオチド添加後に FBSにて細胞に刺激を与え Cyr61産生を誘導す るものであり、く B〉は FBSにて細胞に刺激を与え Cyr61産生を誘導した後 に Cyr61ァンチセンスオリ ゴヌクレオチド添加するものである。 After recovering prostate-derived stromal primary cells PrSC (Clonetics; catalog number CC-2508) cultured in flasks using a growth medium for stromal cells SCGM (Clonetics), 0.01% BSA (Sigma) Cells) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) in a basal medium for stromal cells SCBM (Clonetics) and seeded on a microtiter plate (1 × 10 4 cells / well, 50 1 Nowell) and 37. Incubated at C for 8 hours. Next, the following A> or B> was performed. (A) stimulates cells with FBS to induce Cyr61 production after addition of Cyr61 antisense oligonucleotide, and (B) stimulates cells with FBS to induce Cyr61 production. Cyr61 antisense oligonucleotide is added.
<A> 各ゥエルに Cyr61 アンチセンスオリ ゴヌクレオチド （上記に同 じ） または、 センスオリ ゴヌクレオチド （上記に同じ） を加え （最終濃 ' 度 0. 2、 0. 4、 0. 8 z MZゥェル）、 さらに 37°Cでー晚ィンキュベートした。 次いで、 FBS ( JRH社製） を加えた （最終濃度 2%Zゥエル）。  <A> Add Cyr61 antisense oligonucleotide (same as above) or sense oligonucleotide (same as above) to each well (final concentrations of 0.2, 0.4, 0.8 zMZ) Then, the mixture was incubated at 37 ° C. Then, FBS (manufactured by JRH) was added (final concentration 2% Zell).
く B〉 FBS ( JRH社製） を加え （最終濃度 2% Zゥェル）、 37°Cでー晚ィ ンキュペートした後、 各ゥェ に Cyr61アンチセンスオリ ゴヌクレオチ ド （上記に同じ）'または、 センスオリゴヌクレオチド (上記に同じ） を 加え （最終濃度 0. 2、 0. 4、 Ο. δ ί ΜΖゥヱル） を加えた。 '  B> Add FBS (manufactured by JRH) (final concentration 2% Z-well), and incubate at 37 ° C, then add Cyr61 antisense oligonucleotide (same as above) or sense to each well. Oligonucleotides (same as above) were added (final concentrations 0.2, 0.4, Ο. Δί ΜΖ ゥ ヱ ΜΖ ゥ ヱ). '
上記く Α>またはく Β〉の後、 さらに 37°Cで 3 日間インキュベート後、 各ゥ エルに、生細胞数測定試薬 WST - 8 ( 10 1/ゥエル；ナカライテスタ社製） を添加し、 さらに 37°Cで 3時間インキュベートした。  After the above <1> or <2>, further incubate at 37 ° C for 3 days, then add viable cell counting reagent WST-8 (101 / well; manufactured by Nacalai Tester) to each well. Incubated at 37 ° C for 3 hours.
次いで、 マイクロプレートリーダー （Mo l ecu lar Devi ce社製） を用レヽ て、 450nm (参考波長 650nm) の吸光度を測定した。 なお、 陰性対照とし て、 FBS ( JRH社製） とオリゴヌクレオチドを添加せず上記と同様にして 試験を行った。  Next, the absorbance at 450 nm (reference wavelength: 650 nm) was measured using a microplate reader (Molecular Device). As a negative control, the test was performed in the same manner as above without adding FBS (manufactured by JRH) and oligonucleotides.
結果を図 24及び 25に示す。  The results are shown in FIGS.
前立腺由来間質初代細胞での Cyr61蛋白質の産生の抑制による細胞増 殖の抑制の程度は、 細胞の FBSによる刺激前に Cyr61の産生を抑制した 方が、 当該刺激後に Cyr61 の産生を抑制するよりも大きかった。 〔実施例 1 3 ] Cyr61の生理活性、 Cyr61の産生、 Cyr61遺伝子の mRNA の転写若しくは Cyr61の mRNAの蛋白質への翻訳を阻害する化合物の同定 <13-1> 前立腺細胞での CyrW遺伝子の mRNAへの転写を阻害する化合物 の同定 The degree of suppression of cell proliferation in primary prostate-derived stromal cells by suppressing Cyr61 protein production was more marked by suppressing Cyr61 production before stimulation of cells with FBS than by suppressing Cyr61 production after stimulation. Was also big. [Example 13] Identification of a compound that inhibits physiological activity of Cyr61, production of Cyr61, transcription of Cyr61 gene mRNA or translation of Cyr61 mRNA into protein <13-1> Identification of compounds that inhibit transcription of CyrW gene into mRNA in prostate cells
前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） を、 0. 01%の BSA (シグマ 社製） と 1%のペニシリ ン/ス トレプトマイシン （シグマ社製） を含有す る RPMI 1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 96穴マイクロタ イタ一プレートに播種 （1 104個 ゥェル） し、 37°Cで一晚インキュべ 一トした。 Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF) was transformed into RPMI 1640 medium containing 0.01% BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma). Nikken and biomedical Laboratories, Inc.) seeded in 96-well Maikurota Ita first plate with (1 10 4 Weru) was Ichito base one晚Incubate at 37 ° C.
次いで、 各ゥエルに各種の被験化合物の各々 （各種濃度 ；最終濃度 10 β ΜΖゥヱル) を加え、 さらに 37°Cで 2時間インキュベートした。  Next, each of the various test compounds (various concentrations; final concentration of 10 βμL) was added to each well, and the mixture was further incubated at 37 ° C. for 2 hours.
次いで、 FBS (JRH社製；最終濃度 2% Ζゥェル） もしくは LPA 18 : 1 (最 終濃度 1 ζ ΜΖゥエル）を加え、 37°Cで 1時間ィンキュベートした。なお、 対照として化合物無添加、 陰性対照として FBS無添加で上記と同様にし て試験を行った。  Then, FBS (manufactured by JRH; final concentration 2% gel) or LPA 18: 1 (final concentration 1 ml) was added and incubated at 37 ° C for 1 hour. The test was carried out in the same manner as above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control.
次いで、 実施例く 7- 1>において設計した、 ヒ ト Cyr61 mRNAの定量用プ ロープの各種 （CE、 LE、 Blocking Probe) を添加したキッ ト付属の Lysi s Mixture を使用し、 細胞溶解液を調製した。 次いで、 各々の細胞溶解液 ( 100 1) 中の Cyr61 mRNAの量を、 標準的手順に従って実施例 7で構築 した分岐 DNAプローブ法により定量した。  Then, using the Lyss Mixture attached to the kit to which various types of human Cyr61 mRNA quantification probes (CE, LE, Blocking Probe) designed in Example 7-1> were added, the cell lysate was used. Prepared. Then, the amount of Cyr61 mRNA in each cell lysate (1001) was quantified by the branched DNA probe method constructed in Example 7 according to standard procedures.
なお、対照として別途設計した GAPDH mRNAの定量用のプローブ各種（CE、 LE、 Blocking Probe) を用いた分岐 DNAプロープ法による GAPDHの RNA の定量も行った。  GAPDH RNA was also quantified by a branched DNA probe method using various probes (CE, LE, Blocking Probe) for quantification of GAPDH mRNA which were separately designed as a control.
各々の被験物質について求められた測定値を、対照 （陰性対照を含む） 試験で求められた測定値と比較し、 前立腺細胞での Cyr61遺伝子の mRNA への転写を阻害する多数の化合物を同定した。  The measured values for each test substance were compared with those obtained from control (including negative control) tests to identify a number of compounds that inhibited transcription of the Cyr61 gene to mRNA in prostate cells. .
結果を図 26に示す。  The results are shown in FIG.
同定された化合物は、 FBS及び LPA ( 18 : 1) の各々の刺激により誘導さ れる前立腺由来上皮細胞での Cyr61遺伝子の発現上昇を化合物の濃度依 存的に有意に抑制した。 一方、 当該化合物は、 対照試験 おいて GAPDH 遺伝子の発現上昇を抑制しないことから、 Cyr61 遺伝子の発現を特異的 に抑制する化合物であった。 The identified compounds were induced by stimulation of FBS and LPA (18: 1) respectively. In the prostate-derived epithelial cells, increased expression of the Cyr61 gene was significantly suppressed in a concentration-dependent manner. On the other hand, the compound did not suppress the increase in the expression of the GAPDH gene in the control test, and thus was a compound that specifically suppressed the expression of the Cyr61 gene.
〈13-2〉 .前立腺細胞での Cyr61蛋白質の産生を阻害する化合物の同定 前立腺由来上皮細胞株 BRF-55T (BRFF.社製） を、 0. 01%の BSA (シグマ 社製） と 1%のペニシリン/ス ト レプトマイシン （シグマ社掣） を含有す る RPMI 1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 96穴マイクロタ イタ一プレートに播種 （1 X 104個/ゥエル） し、 37°Cでー晚インキュべ — トした。 <13-2>. Identification of a compound that inhibits the production of Cyr61 protein in prostate cells The prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (BRFF.) Was reconstituted with 0.01% BSA (Sigma) and 1% Using a RPMI 1640 medium (manufactured by Nikken Biomedical Research Laboratories) containing penicillin / streptomycin (manufactured by Nikken Biomedical Research Laboratories), seeded (1 × 10 4 cells / well) on a 96-well microtiter plate Incubated at 37 ° C.
次いで、 各ゥエルに多種の被験化合物の各々 （各種濃度 ；最終濃度 10 M/ゥエル；実施例く 13 - 1 >で同定した化合物を含む。） を加え、 さらに 37°Cで 2時間インキュベートした。. なお、 対照として化合物無添加、 陰 性対照として FBS無添加で上記と同様にして試験を行った。  Then, each of various test compounds (various concentrations; final concentration 10 M / well; including the compound identified in Example 13-1>) was added to each well, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2 hours. The test was carried out in the same manner as above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control.
次いで、 FBS ( JRH社製；最終濃度 2%Zゥエル） を加え、 37°Cで 2時 間インキュベートし、 Lys i sバッファー （0. 1% Tween20、 20mM EDTA、 1% El ugent ( CALBIOCHEM 社製） を含有するリン酸緩衝液） を使用し細胞溶 解液を調製した。 実施例 8で構築したサンドイッチ ELISAにより、 該細 胞溶解液 （50 /z l ) 中のヒ ト Cyr61蛋白質を定量した。  Then, FBS (manufactured by JRH; final concentration: 2% Z-well) was added, and incubated at 37 ° C for 2 hours. Lys is buffer (0.1% Tween20, 20 mM EDTA, 1% Elugent (manufactured by CALBIOCHEM)) Lysate was prepared using a phosphate buffer solution containing Human Cyr61 protein in the cell lysate (50 / zl) was quantified by the sandwich ELISA constructed in Example 8.
各々の被験物質について求められた測定値を、対照 （陰性対照を含む） 試験で求められた測定値と比較し、 前立腺細胞での Cyr61蛋白質の産生 を阻害する多数の化合物を同定した。 これらの中には、 実施例く 14- 1 >で 同定された化合物群も含まれていた。  The measured values determined for each test substance were compared to those determined in control (including negative control) tests to identify a number of compounds that inhibited Cyr61 protein production in prostate cells. Among these, the compounds identified in Example 14-1> were also included.
結果を図 27に示す。  The results are shown in FIG.
同定された化合物は、 FBS で誘導した Cyr61 の産生上昇を化合物濃度 に依存的に有意に抑制した。 く 13- 3〉 Cyr61の生理活性を阻害する化合物の同定 The identified compounds significantly suppressed FBS-induced increase in Cyr61 production in a compound-dependent manner. <13-3> Identification of compounds that inhibit the biological activity of Cyr61
前記実施例において明らかにした Cyr61の生理活性の一つである前立 腺細胞の増殖促進活性を阻害する化合物以下のようにして同定した。  Compounds that inhibit the growth-promoting activity of prostate cells, which is one of the physiological activities of Cyr61 described in the above Examples, were identified as follows.
前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T ( BRFF社製） を、 0. 01。/。の BSA (シグマ 社製） と. 1%のペニシリン/ス トレプトマイシン （シグマ社製） 'を含有す る RPMI 1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 96穴マイクロタ - イタ一プレートに播種 （1 X 104個 Zゥエル） し、 37°Cでー晚インキュべ ートした。 Prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF) was 0.01. /. 96-well microtiter plates using RPMI 1640 medium (Niken Biomedical Research Laboratories) containing BSA (Sigma) and 1% penicillin / streptomycin (Sigma) Plates were seeded (1 x 10 4 cells) and incubated at 37 ° C.
次いで、 各ゥエルに多種の被験化合物の各々 （最終濃度 Ι Ο μ ΜΖゥ ル） を加え、 さらに 37°Cで 2時間インキュベートした。 なお、 対照とし て化合物無添加、 陰性対照として FBS無添加で上記と同様にして試験を 行った。  Next, each of the various test compounds (final concentration: ΟμΟ) was added to each well, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2 hours. The test was performed in the same manner as described above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control.
次いで、 FBS ( JRH社製；最終濃度 2% Zゥヱル） を加え、 37°Cで 2 曰 間インキュベート後、 各ゥヱルに、 [¾] - Thymi dine ( l CiZゥエル） を 添加し、 さらに 37°Cで 6時間インキュベートした。 細胞をマイクロメ一 ト 196セルハーべスター （パッカード社製） を用いて回収し、 細胞内に 取り込まれた [ ] - Thymi dine の量をトップカウント （パッカード社製） にて測定した。  Then, FBS (manufactured by JRH; 2% final concentration) was added, and after incubation at 37 ° C for 2 hours, [¾] -Thymidine (lCiZell) was added to each plate, and further 37 ° C was added. Incubated at C for 6 hours. The cells were collected using a Micromet 196 Cell Harvester (Packard), and the amount of [] -Thymidine incorporated into the cells was measured using a TopCount (Packard).
各々の被験物質について求められた測定値を、対照 （陰性対照を含む） 試験で求められた測定値と比較し、 前立腺細胞の増殖を阻害する多数の 化合物を同定した。 これらの中には、 実施例く 13- 1〉及び実施例く 13- 2>で , 同定された化合物群も含まれていた。  The measured values determined for each test substance were compared to those determined in control (including negative control) tests to identify a number of compounds that inhibited prostate cell proliferation. Among these, the compounds identified in Examples 13-1> and 13-2> were also included.
同定された化合物は、 FBS により誘導した前立腺由来上皮細胞の増殖 を有意に抑制した。 また当該化合物は、 前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55T (BRFF社製） において、 Cyr61 タンパク産生を抑制することにより、 細 胞増殖が抑制されることを示した。 <13-4> Cyr61 の生理活性を阻害する化合物の血球系細胞の増殖に対す 前記実施例く 13- 3〉で同定した Cyr61の生理活性を阻害する化合物が、 Cyr61を発現していない血球系細胞 （NK細胞） の FBS及ぴ IL- 2の刺激に より誘導される細胞増殖に対して影響を及ぼすか否かを検討した。 The identified compounds significantly inhibited the proliferation of prostate-derived epithelial cells induced by FBS. The compound was also shown to suppress cell growth by suppressing Cyr61 protein production in the prostate-derived epithelial cell line BRF-55T (manufactured by BRFF). <13-4> A compound that inhibits the physiological activity of Cyr61 against the proliferation of blood cells of the blood cell line The compound that inhibits the biological activity of Cyr61 identified in Example 13-3> is a blood cell line that does not express Cyr61 It was examined whether or not it has an effect on cell proliferation induced by stimulation of FBS and IL-2 of cells (NK cells).
ヒ ト NK 細胞株 KHYG-1 (ヒ ューマンサイエンス研究資源バンク ； JCRB0156) を、 10%の FBS ( JRH社製） と 10Uni t/mlの IL - 2 (PBL社製） と 1%のペニシリ ン/ス ト レプ トマイ シン （シグマ社製） を含有する RPMI 1640培地 （日研生物医学研究所社製） を用いて 96穴マイクロタイ タープレートに播種 （I X 104個/ゥエル） した。 Human NK cell line KHYG-1 (Human Science Research Resource Bank; JCRB0156) was supplemented with 10% FBS (manufactured by JRH), 10 Unit / ml IL-2 (manufactured by PBL) and 1% penicillin. down / be sampled replica Tomai Shin seeded in 96-well microtiter plate using RPMI 1640 medium containing (sigma) (produced by Nikken Institute for biomedical Research, Inc.) (IX 10 4 cells / Ueru) was.
次いで、各ゥエルに前記実施例く 13- 3>で同定した Cyr61の生理活性（前 立腺細胞の増殖） を阻害する化合物の各々 （最終濃度 ΙΟ μ ΜΖゥエル） を加え、 さらに 37°Cで 2 日間インキュベートした。 なお、 対照として化 合物無添加、 陰性対照として FBS無添加で上記と同様にして試験を行つ た。 .  Next, to each well, each of the compounds (final concentration of ΙΟμΜΖ ゥ) which inhibits the physiological activity of Cyr61 (proliferation of prostate cells) identified in the above Example 13-3> was added, and further added at 37 ° C. Incubated for days. The test was carried out in the same manner as above, with no compound added as a control and without FBS as a negative control. .
次いで、 各ゥヱルに、 [¾] - Thymidine ( 1 i CiZクヱル） を添加し、 さ らに 37°Cで 6時間ィンキュベートした。 細胞をマイク口メート 196セル ハーべスター （パッカード社製） を用いて回収し、 細胞内に取り込まれ た [ ] - Thymidine の量をトップカウント （パッカード社製） にて測定し た。  Then, [¾] -Thymidine (1 i CiZ quol) was added to each tube, and the mixture was incubated at 37 ° C for 6 hours. The cells were collected using a Microphone Mate 196 Cell Harvester (Packard), and the amount of [] -Thymidine incorporated into the cells was measured by TopCount (Packard).
いずれの化合物も FBSと IL-2により誘導される血球系細胞の増殖を抑 制しなかった。 産業上の利用可能性  None of the compounds inhibited FBS and IL-2 induced proliferation of hematopoietic cells. Industrial applicability
本発明の医薬組成物は、 前立腺疾患 （例えば、 前立腺肥大及び前立腺 癌など） の発症の予防、 該前立腺疾患の進行の抑制または該前立腺疾患 を治療するための医薬品として有用である。 The pharmaceutical composition of the present invention can prevent the onset of prostate disease (for example, prostatic hypertrophy and prostate cancer), suppress the progression of the prostate disease, or prevent the prostate disease It is useful as a medicine for treating
また、 本発明の医薬組成物は、 そう して前立腺疾患 （特には前立腺肥 大） を抑制することにより前立腺疾患 （特には前立腺肥大） によって引 き起こされる排尿障害等の症状を緩和または治療することが可能である ( さらに、 本発明の医薬組成物は、 前立腺疾患の既存の治療方法 （例え 前立腺肥大症の治療の場合には、 抗アンドロゲン剤、 o; l遮断剤、 あ るいは抗コリンエステラーゼ剤などによる薬剤療法） と併用することに より該前立腺疾患 （例えば前立腺肥大症、 前立腺癌など） の治療効果を 増大させることが可能である。 配列表フリ一テキス ト  In addition, the pharmaceutical composition of the present invention reduces or treats symptoms such as dysuria caused by prostate disease (particularly prostatic hypertrophy) by suppressing prostate disease (particularly prostatic hypertrophy). (Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of prostate diseases (for example, in the case of treatment of benign prostatic hyperplasia, an antiandrogen agent, an o; l blocker, or an anticholinesterase). It is possible to increase the therapeutic effect of the prostate disease (for example, prostatic hyperplasia, prostate cancer, etc.) by using the drug in combination with a drug treatment with an agent.
配列番号： 1 SEQ ID NO: 1
他の情報 ： 人工配列についての記載： モチーフ配列  Other information: Description of artificial sequence: Motif sequence
配列番号： 4 SEQ ID NO: 4
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 5 . SEQ ID NO: 5
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 6 SEQ ID NO: 6
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 7 SEQ ID NO: 7
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 8 SEQ ID NO: 8
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 9 SEQ ID NO: 9
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 1 0 他の情報 ： 人工配列についての記载： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 1 1 SEQ ID NO: 10 Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 1
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 1 2  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 2
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。' 配列番号： 1 3  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. 'SEQ ID NO: 1 3
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 1 4  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 4
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 1 5  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 5
他の情報 ：人工配列についての記載： bDNA用プロー 配列。 配列番号： 1 6  Other information: Description of artificial sequence: probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 6
他の情報 ： 人工配列についての記载： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 1 7  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 7
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番.号 : 1 8  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. Array number: 1 8
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 1 9  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 1 9
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 2 0  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 20
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プロ一プ配列。 配列番号： 2 1  Other information: Description of artificial sequence: Prop sequence for bDNA. SEQ ID NO: 2 1
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 2 2  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 2 2
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 配列番号： 2 3 他の情報 ： 人工配列についての記载 ： bDNA用プローブ配列。 Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. SEQ ID NO: 2 3 Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 2 4 SEQ ID NO: 2 4
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 2 5 SEQ ID NO: 25
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。' 配列番号： 2 6  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. '' SEQ ID NO: 2 6
他の情報 ： 人工配列についての記载： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 2 7 SEQ ID NO: 2 7
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 2 8 SEQ ID NO: 2 8
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 2 9 SEQ ID NO: 2 9
■他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プロープ配列。  ■ Other information: Description of artificial sequence: probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 0 SEQ ID NO: 30
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 1 SEQ ID NO: 3 1
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プロープ配列。  Other information: Description of artificial sequence: probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 2 SEQ ID NO: 3 2
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 3 SEQ ID NO: 3 3
他の情報 ： 人工配列についての記載，： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence ,: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 4 SEQ ID NO: 3 4
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 · 配列番号： 3 5  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. · SEQ ID NO: 3 5
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 6 他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 SEQ ID NO: 3 6 Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 7 SEQ ID NO: 3 7
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 3 8 SEQ ID NO: 3 8
他の情.報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。 ' 配列番号： 3 9  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA. '' SEQ ID NO: 3 9
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プロ一ブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 4 0 SEQ ID NO: 40
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 4 1 SEQ ID NO: 4 1
他の情報 ： 人工配列についての記載： bDNA用プローブ配列。  Other information: Description of artificial sequence: Probe sequence for bDNA.
配列番号： 4 2 SEQ ID NO: 4 2
他の情報 ： 人工配列についての記載： プライマー配列。  Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence.
配列番号： 4 3 SEQ ID NO: 4 3
他の情報 ： 人工配列についての記載： プライマー配列。  Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence.
配列番号： 4 4 SEQ ID NO: 4 4
他の情報 ： 人工配列についての記載： プライマー配列。 ·  Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence. ·
配列.番号： 4 5 . Sequence number: 4 5.
他の情報 ： 人工配列についての記載： プライマー配列。  Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence.
配列番号： 4 6 SEQ ID NO: 4 6
他の情報 ： 人工配列についての記載 ： プライマー配列。  Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence.
配列番号： 4 7 SEQ ID NO: 4 7
他の情報 ： 人工配列についての記載： プライマー配列。  Other information: Description of artificial sequence: Primer sequence.
配列番号： 4 8 SEQ ID NO: 4 8
他の情報 ： 人工配列についての記載： ヒ ト Cyr61アンチセンスオリゴ ヌクレオチド。 配列番号： 4 9 ' Other Information: Description of Artificial Sequence: Human Cyr61 antisense oligonucleotide. SEQ ID NO: 4 9 '
他の情報 ： 人工配列についての記載： ヒ ト Cyr61センスオリ ゴヌク レ ォチド。 本出願は、 日本で出願された特願 20 0 3— 1 1 5 2 3 3 (出願日 ： 平成 1 5年 4月 2 1 日） を基礎としており、 それらの内容は全て本明細 書に包含されるものとする。  Other information: Description of the artificial sequence: Human Cyr61 sense oligonucleotide. This application is based on a patent application No. 2003-1-1115233 filed in Japan (filing date: April 21, 2003), the contents of which are incorporated in full herein. Shall be

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 . Cyr61の生理活性、 Cyr61の産生、 Cyr61をコードする遺伝子の mRNA の転写若しくは Cyr61をコードする mRNAの蛋白質への翻訳を阻害する 1 若しくは複数の物質及び薬学的に許容され得る担体を含んでなり、 前立 腺疾患の発症の予防、 前立腺疾患の進行の抑制、 前立腺疾患の治療また - は前立腺肥大に付随する疾患の治療をするための医薬組成物。 1. Including one or more substances that inhibit the physiological activity of Cyr61, production of Cyr61, transcription of mRNA of a gene encoding Cyr61 or translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, and a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical composition for preventing the onset of prostate disease, suppressing the progress of prostate disease, treating prostate disease or-treating a disease associated with prostatic hypertrophy.
2 . 該 Cyr61の生理活性が、 前立腺上皮細胞若.しくは前立腺間質細胞の 増殖若しくは伸展、 該細胞の形態維持または該細胞における MAPキナー ゼの活性化であることを特徴とする請求項 1に記載の医薬組成物。  2. The biological activity of Cyr61 is proliferation or expansion of prostate epithelial cells or prostate stromal cells, maintenance of the cell morphology, or activation of MAP kinase in the cells. 8. The pharmaceutical composition according to item 1.
3 . 該前立雎疾患が、 前立腺肥大症または前立腺癌であることを特徴と する請求項 1または請求項 2に記載の医薬組成物。  3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the prostatic disease is benign prostatic hyperplasia or prostate cancer.
4 . 該前立腺肥大に付随する疾患が排尿障害であることを特徴とする請 求項 1または請求項 2に記載の医薬組成物。  4. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the disease associated with prostatic hypertrophy is dysuria.
5 . 該物質が、 Cyr61 に結合する抗体またはその一部であることを特徴 とする請求項 1乃至請求項 4のいずれかに記載の医薬組成物。  5. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the substance is an antibody that binds to Cyr61 or a part thereof.
6 . 該物質が、 DNAまたは RNAであることを特徴とする請求項 1乃至請 求項 4のいずれかに記載の医薬組成物。  6. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the substance is DNA or RNA.
7 . 該物質が、 化学的に合成された化合物であることを特徴とする請求 項 1乃至請求項 5のいずれかに記載の医薬組成物。  7. The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the substance is a chemically synthesized compound.
8 . Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写、 Cyr61をコードする mRNA の蛋白質への翻訳または Cyr61の産生を調節する能力を有する物質を同 定する方法であって、 下記の工程を含むことを特徴とする方法：  8. A method for identifying a substance capable of regulating transcription of a gene encoding Cyr61 to mRNA, translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, or production of Cyr61, comprising the following steps: Features method:
( a ) Cyr61を産生する細胞を、 Cyr61の産生を誘導する刺激の存在下 若しくは不存在下で、 該物質の存在下及び不存在下の各々の条件下で培 養する工程；及び (b ) (i) 該物質の存在下で培養した細胞が産生する Cyr61の量と該 物質の不存在下で培養した細胞が産生する Cyr61の量を比較する工程； 若しくは (a) culturing cells producing Cyr61 in the presence or absence of a stimulus that induces Cyr61 production, in the presence and absence of the substance, respectively; and (b) (i) a step of comparing the amount of Cyr61 produced by cells cultured in the presence of the substance with the amount of Cyr61 produced by cells cultured in the absence of the substance; or
(ii) 該物質の存在下で培養した細胞中で転写された Cyr61 をコ ードする. mRNA の量と該物質の不存在下で培養した細胞中で転写された Cyr61をコードする mRNAの量とを比較する工程。  (ii) Code for Cyr61 transcribed in cells cultured in the presence of the substance.Amount of mRNA and amount of mRNA encoding Cyr61 transcribed in cells cultured in the absence of the substance Comparing with.
' 9. 該細胞が、 前立腺の上皮細胞若しくは間質細胞またはそれらから樹 立された細胞株であることを特徴とする請求項 8に記載の方法。  9. The method according to claim 8, wherein the cells are prostate epithelial cells or stromal cells or cell lines established therefrom.
1 0. 該細胞が、 ヒ ト前立腺由来上皮細胞株 BRF- 55Tであることを特徴 とする請求項 9に記載の方法。  10. The method according to claim 9, wherein the cell is a human prostate-derived epithelial cell line BRF-55T.
• 1 1. 該 Cyr61の産生を誘導する刺激が、 血清または LPAであることを 特徴とする請求項 8乃至請求項 1 0のいずれかに記載される方法。  The method according to any one of claims 8 to 10, wherein the stimulus for inducing the production of Cyr61 is serum or LPA.
1 2. 該 Cyr の量が、 ELISA を用いて決定されることを特徴とする請 求項 8乃至請求項 1 1のいずれかに記載の方法。  12. The method according to any one of claims 8 to 11, wherein the amount of Cyr is determined using ELISA.
1 3. 該 Cyr61 をコードする mRNAの量が、 bDNA法を用いて決定される ことを特徴とする請求項 8.乃至請求項 1 1のいずれかに記載の方法。 1 4. Cyr61 をコードする遺伝子の mRNA の転写、 Cyr61をコードする mRNAの蛋白質への翻訳または Cyr61の産生を調節する能力を有する物質 を同定する方法であって、 下記の工程を含むことを特徴とする方法： ( a ) Cyr61及び Cyr61 以外の他の蛋白質を産生する細胞であって、 該細胞における該他の蛋白質をコードする遺伝子の mRNAへの転写が、該 Cyr61をコードする遺伝子の mRNAへの転写のシグナルの程度に依存して 起こるものであることを特徴とする細胞を、 Cyr61 の産生を誘導する刺 激の存在下若しくは不存在下で、 該物質の存在下及び不存在下の各々の 条件下で培養する工程；及び  13. The method according to any one of claims 8 to 11, wherein the amount of mRNA encoding Cyr61 is determined using a bDNA method. 1 4. A method for identifying a substance having the ability to regulate transcription of mRNA of a gene encoding Cyr61, translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein, or production of Cyr61, comprising the following steps: (A) a cell that produces Cyr61 and a protein other than Cyr61, wherein transcription of the gene encoding the other protein in the cell into mRNA of the gene encoding the Cyr61 A cell characterized in that it occurs depending on the level of the transcriptional signal of Cyr61, in the presence or absence of a stimulus that induces the production of Cyr61, in the presence or absence of the substance, respectively. Culturing under the conditions of;
(b ) 該物質の存在下で培養した細胞が産生する該他の蛋白質の量と 該物質の不存在下で培養した細胞が産生する該他の蛋白質の量を比較す る工程。 (b) the amount of the other protein produced by cells cultured in the presence of the substance and Comparing the amount of the other protein produced by cells cultured in the absence of the substance.
1 5 . ^細胞が、 該 Cyr61をコードする遺伝子及び該他の蛋白質をコー ドする遺伝子で形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とす 15. The ^ cells are characterized in that they are transgenic cells transformed with the gene encoding the Cyr61 and the gene encoding the other protein.
5 る請求項 1 4に記載の方法。 15. The method according to claim 14, wherein
1 6 . 該他の蛋白質が、 レポーター蛋白質であることを特徴とする請求 ' 項 1 4に記載の方法。  16. The method according to claim 14, wherein the other protein is a reporter protein.
1 7 . 該レポーター蛋白質が、 ルシフェラーゼであることを特徴とする 請求項 1 6に記載の方法。 17. The method according to claim 16, wherein the reporter protein is luciferase.
0 1 8 . 該他の蛋白質の量の比較が、 該レポーター蛋白質が発するシグナ ルのレベルの比較であることを特徴とする請求項 1 7に記載の方法。 1 9 . Cyr61 の生理活性を調節する能力を有する物質を同定する方法で あって、 下記の工程を含むことを特徴とする方法：  18. The method according to claim 17, wherein the comparison of the amount of the other protein is a comparison of the level of a signal generated by the reporter protein. 19. A method for identifying a substance capable of regulating the biological activity of Cyr61, comprising the following steps:
( a ) Cyr61を産生する細胞を、 Cyr61の産生を誘導する刺激の存在下 L5 若しくは不存在下で、 該物質の存在下または不存在下の各々の条件下で 培養し、 該各々の条件下での培養した細胞の増殖の程度、 伸展の程度ま たは形態の変化を比較する工程。  (a) Cyr61-producing cells are cultured in the presence or absence of the substance in the presence or absence of L5 or in the presence of a stimulus that induces the production of Cyr61 under the respective conditions. Comparing the degree of proliferation, extension or morphological change of the cultured cells in the cultivation.
2 0 . 該細胞が、 前立腺の上皮細胞若しくは間質細胞またはそれらから 樹立された細胞株であることを特徴とする請求項 1 9のいずれかに記载 0 の方法。  20. The method according to claim 19, wherein the cells are prostate epithelial cells or stromal cells or cell lines established therefrom.
2 1 . 該細胞が、 ヒ ト前立腺由来上皮細胞株 BRF - 55Tであることを特徴 とする請求項 2 0に記載の方法。  21. The method according to claim 20, wherein the cell is a human prostate-derived epithelial cell line BRF-55T.
2 2 . 該 Cyr61の産生を誘導する刺激が、 血清または LPAであることを 特徴とする請求項 1 9乃至請求項 2 1のいずれかに記載される方法。 5 2 3 . 被験者における前立腺疾患の兆候または有無を診断する方法であ つて、 下記の工程を含むことを特徴とする方法： (a)該被験者から取得した被験試料中における Cyr61 の量及び健常人 から取得した被験試料中における Cyr61の量を決定し両者を比較するェ 程； または ' 22. The method according to claim 19, wherein the stimulus for inducing the production of Cyr61 is serum or LPA. 52. A method of diagnosing the presence or absence of prostate disease in a subject, comprising the steps of: (a) determining the amount of Cyr61 in the test sample obtained from the subject and the amount of Cyr61 in the test sample obtained from a healthy subject and comparing the two; or
(b)該被験者から取得した被験試料中における Cyr61 をコードする mRNAの量及び健常人から取得した被験試料中における Cyr61をコードす る mRNAの量を決定し両者を比^する工程。  (b) determining the amount of Cyr61-encoding mRNA in the test sample obtained from the subject and the amount of Cyr61-encoding mRNA in the test sample obtained from a healthy subject, and comparing the two;
2 4 . 該前立腺疾患が、 前立腺肥大症または前立腺癌であることを特徴 とする請求項 2 3に記載の方法。  24. The method according to claim 23, wherein the prostate disease is benign prostatic hyperplasia or prostate cancer.
2 5 . 該被験試料が、 前立腺組織または血液であることを特徴とする請 求項 2 3または請求項 2 4に記載の方法。  25. The method according to claim 23 or claim 24, wherein the test sample is prostate tissue or blood.
2 6 . 該 Cyr61 の量が、 ELISA を用いて決定されることを特徴とする請 求項 2 3乃至請求項 2 5のいずれかに記載の方法。  26. The method according to any one of claims 23 to 25, wherein the amount of Cyr61 is determined using ELISA.
2 7 . 該 Cyr61 をコードする mRNAの量が、 bDNAを用いて決定されるこ とを特徴とする請求項 2 3乃至請求項 2 5のいずれかに記載の方法。 2 8 . Cyr61の生理活性、 Cyr61の産生、 Cyr61をコードする遺伝子の mRNA . の転写若しくは Cyr61をコードする mRNAの蛋白質への翻訳を阻害する 1 若しくは複数の物質を被験体に投与することを含む、 前立腺疾患の発症 を予防するため、 前立腺疾患の進行を抑制するため、 前立腺疾患を治療 するためまたは前立腺肥大に付随する疾患を治療する'ための方法。  27. The method according to any one of claims 23 to 25, wherein the amount of mRNA encoding Cyr61 is determined using bDNA. 28. Including administering one or more substances that inhibit the biological activity of Cyr61, the production of Cyr61, the transcription of the mRNA of the gene encoding Cyr61, or the translation of the mRNA encoding Cyr61 into a protein. A method for preventing the onset of prostate disease, inhibiting the progression of prostate disease, treating prostate disease or treating a disease associated with prostatic hypertrophy.
2 9 . 前立腺疾患の発症の予防用の、 前立腺疾患の進行の抑制用の、 前 立腺疾患の治療用のまたは前立腺肥大に付随する疾患の治療用の組成物 の製造における、 Cyr61の生理活性、 Cyr61の産生、 Cyr61をコードする 遺伝子の raRNAの転写若しくは Cyr61 をコードする mRNAの蛋白質への翻 訳を阻害する 1若しくは複数の物質の使用。 29. Physiological activity of Cyr61 in the manufacture of a composition for preventing the development of prostate disease, inhibiting the progression of prostate disease, treating prostate disease or treating diseases associated with prostatic hypertrophy. Use of one or more substances that inhibit Cyr61 production, transcription of raRNA of a gene encoding Cyr61, or translation of mRNA encoding Cyr61 into a protein.
士^ Chief ^
II6£60請 OAV 2/24 図 2 II6 £ 60 contract OAV 2/24 Figure 2
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000071_0001
0 5 10  0 5 10
コート濃度（ g/ml)  Coat concentration (g / ml)
CYR61 フイブロネクチン つ r»BSA CYR61 fibronectin ti r »BSA
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000072_0001
4/24 4/24
図 4  Fig. 4
N70-1 (ゥサギ） N70-1 (Egret)
Ο70-3 (ゥサギ)  Ο70-3 (ゥ Egret)
069-1 (ャギ)  069-1 (goat)
069-2 (ャギ） 069-2 (goat)
Figure imgf000073_0001
mycHis - tagへの父差性 サル CYR61への交差性
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000073_0001
mycHis-paternity to tag cross property to monkey CYR61
Figure imgf000074_0001
(S ri 9Ό) L9d人 0 (9) (s ri 9Ό) vsa (°)
Figure imgf000074_0002
(S ri 9Ό) L9d people 0 (9) (s ri 9Ό) vsa (°)
Figure imgf000074_0002
η 'ΰ) 人〇 (p) (s SO) ベ 4 口 (q)
Figure imgf000074_0003
η 'ΰ) Person (p) (s SO) b 4 mouths (q)
Figure imgf000074_0003
瑪 —に (  Ma — to (
99
Z/ζ  Z / ζ
Π6ε60請 OAV 6/24 Π6ε60 contract OAV 6/24
Figure imgf000075_0001
7/24
Figure imgf000075_0001
7/24
図 7  Fig. 7
(a)フイブロネクチン （0.5j«g)+抗 CYR61抗体 N70-1 1
Figure imgf000076_0001
(a) Fibronectin (0.5j «g) + anti-CYR61 antibody N70-11
Figure imgf000076_0001
(d) CYR61 (0.5j«g)+陰性対照 IgG (d) CYR61 (0.5j «g) + negative control IgG
8/24 8/24
図 8
Figure imgf000077_0001
Fig. 8
Figure imgf000077_0001
時間 (分 0 15 30 50 180 420  Time (min 0 15 30 50 180 420
図 9 Fig. 9
(a) CYR61 (a) CYR61
(b)フイブロネクチン
Figure imgf000077_0002
(b) Fibronectin
Figure imgf000077_0002
,嚷 :編眚纖 鼹^ β (c)ポリ- L-リジン 時間（分）： 0 15 30 50 120 180 300 420 540 9/24 図 10 , 嚷: Edited fiber 鼹 ^ β (c) Poly-L-lysine Time (min): 0 15 30 50 120 180 300 420 540 9/24 Fig. 10
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000078_0001
PDGF (-） PDGF (+) 口 コート無 0フイブロネクチン B CYR61 PDGF (-) PDGF (+) Mouth Uncoated 0 Fibronectin B CYR61
10/24 10/24
図 11  Fig. 11
コート無 フイブロネクチン CYR61 Uncoated fibronectin CYR61
□PDGF (無） □ PDGF (none)
■ PDGF+陰性対照 IgG 2 g/ゥエル ■ PDGF + negative control IgG 2 g / ゥ L
□ PDGF+N70-1 0.4 g/ゥエル □ PDGF + N70-1 0.4 g / ゥ L
□ PDGF+N70— 1 2jUg/ウエノレ □ PDGF + N70— 1 2jUg / Uenole
Figure imgf000080_0001
Z/U
Figure imgf000080_0001
Z / U
II6£60請 OAV 12/24 II6 £ 60 contract OAV 12/24
図 13  Fig. 13
(a)  (a)
800000 800000
700000  700000
600000  600000
500000  500000
^ 400000  ^ 400000
300000  300000
200000  200000
100000  100000
0  0
10000 20000 30000 40000 10000 20000 30000 40000
PrSC細胞数（細胞/ゥエル） PrSC cell count (cells / well)
(b)  (b)
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000081_0001
10000 20000 30000 40000 10000 20000 30000 40000
BRF-55T細胞数（細胞/ゥエル） 寸 BRF-55T cell count (cells / well) Dimension
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000082_0001
14/24 -, o55 3521 図 15 14/24-, o55 3521 Fig. 15
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000083_0001
10 100 1000 ' 10000 10 100 1000 '10000
PBS/T希釈倍率 (倍） PBS / T dilution ratio (times)
g画 ed4 g drawing ed4
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000084_0001
17/24 17/24
4/093911 4/093911
18/24  18/24
図 19  Fig. 19
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000087_0001
FBS刺激後時間 (hr)  Time after FBS stimulation (hr)
(b)  (b)
Figure imgf000087_0002
Figure imgf000087_0002
0 0.5 1 2 4 8 0 0.5 1 2 4 8
FBS刺激後時間 （hr) 004/093911 Time after FBS stimulation (hr) 004/093911
19/24 図 20  19/24 Fig. 20
CYR61 30サイクル CYR61 30 cycles
GAPDH 25サイクル
Figure imgf000088_0001
図 21 アンチセンス:
Figure imgf000088_0002
GAPDH 25 cycles
Figure imgf000088_0001
Figure 21 Antisense:
Figure imgf000088_0002
センス： + Sense: +
FBS刺激 FBS stimulation
Figure imgf000088_0003
Figure imgf000088_0003
レーン 1 2 3 4 20/24 図 22 Lane 1 2 3 4 20/24 Fig. 22
(a) (a)
FBS (2曰後）  FBS (after 2)
アンチセンス Antisense
(b) (b)
FBS (2日後)  FBS (after 2 days)
センス sense
21/24 21/24
図 23 Fig. 23
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000090_0001
E ア チセンス Θセンス E Achisense Θ Sense
細胞数（WST-8： 450/650nm) Cell count (WST-8: 450 / 650nm)
o o o O •o p o o o O • op
JI 05 bo  JI 05 bo
/ () () FBSBS8 F 0.+I
Figure imgf000091_0001
/ () () FBSBS8 F 0. + I
Figure imgf000091_0001
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000092_0001
24/24 図 26
Figure imgf000093_0001
24/24 Fig. 26
Figure imgf000093_0001
図 27
Figure imgf000093_0002
Fig. 27
Figure imgf000093_0002
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010010288A1 (en) 2010-03-04 2011-09-08 Wolfgang Poller Medicament, useful to prevent or treat e.g. ulcerative colitis, comprises polypeptide sequences of cysteine-rich protein 61 (CCN1) and/or cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide, or nucleic acid encoding polypeptide sequence of CCN1
WO2011107590A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Wolfgang Poller Cnn1 (cyr61) for prevention and therapy of inflammatory disease
RU2612268C1 (en) * 2016-06-08 2017-03-03 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" Means for prevention and treatment of benign prostatic hyperplasia

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5006802B2 (en) * 2005-02-18 2012-08-22 チルドレンズ メディカル センター コーポレイション Cyr61 as a biomarker for cancer diagnosis and prognosis derived from epithelium

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000506732A (en) * 1996-03-15 2000-06-06 ミューニン コーポレイション Extracellular matrix signaling molecule
WO2001055210A2 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Munin Corporation Human cyr61
WO2001098359A2 (en) * 2000-06-21 2001-12-27 Wyeth Cyr61 as a target for treatment and diagnosis of breast cancer
WO2002055706A2 (en) * 2001-01-09 2002-07-18 Incyte Genomics Inc Asip-related proteins
WO2003027633A2 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Gene Logic, Inc. Identifying drugs for and diagnosis of benign prostatic hyperplasia using gene expression profiles

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000506732A (en) * 1996-03-15 2000-06-06 ミューニン コーポレイション Extracellular matrix signaling molecule
WO2001055210A2 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Munin Corporation Human cyr61
WO2001098359A2 (en) * 2000-06-21 2001-12-27 Wyeth Cyr61 as a target for treatment and diagnosis of breast cancer
WO2002055706A2 (en) * 2001-01-09 2002-07-18 Incyte Genomics Inc Asip-related proteins
WO2003027633A2 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Gene Logic, Inc. Identifying drugs for and diagnosis of benign prostatic hyperplasia using gene expression profiles

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BABIC A.M. ET AL.: "CYR61, a product of a growth factor-inducible immediate early gene, promotes angiogenesis and tumor growth", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 95, no. 11, 1998, pages 6355 - 6360, XP002175432 *
CELL GROWTH & DIFFERENTIATION, vol. 5, no. 4, 1994, pages 457 - 466 *
DATABASE MEDLINE [online] IYPE P.T. ET AL.: "Establishment and characterization of immortalized human cell lines from prostatic carcinoma and benign prostatic hyperplasia", XP002981705, accession no. STN Database accession no. 1998128039 *
DATABASE MEDLINE [online] SAKAMOTO S. ET AL.: "Development of quantitative detection assays for CYR61 as a new marker for benign prostatic hyperplasia", XP002981702, accession no. STN Database accession no. 2004014813 *
DATABASE MEDLINE [online] SELLS S.F. ET AL.: "Commonality of the gene programs induced by effectors of apoptosis in androgen-dependent and -independent prostate cells", XP002981706, accession no. STN Database accession no. 94318563 *
INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY, vol. 12, no. 2, 1998, pages 257 - 263 *
J. BIOMOL. SCREEN., vol. 8, no. 6, December 2003 (2003-12-01), pages 701 - 711 *
KIM K.H. ET AL.: "Expression of angiogenic factor Cyr61 during neuronal cell death via the activation of c-Jun N-terminal kinase and serum response factor", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 16, 18 April 2003 (2003-04-18), pages 13847 - 13854, XP002981703 *
PRAKASH K. ET AL.: "Symptomatic and asymptomatic genign prostatic hyperplasia: molecular differentiation by using microarrays", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, no. 11, 2002, pages 7598 - 7603, XP002981707 *
SAKAMOTO S. ET AL.: "Increased expression of CYR61, an extra cellular matrix signaling protein, in human benign prostatic hyperplasia and its regulation by lysophosphatidic acid", ENDOCRINOLOGY, vol. 45, no. 6, June 2004 (2004-06-01), pages 2929 - 2940, XP002981701 *
SAKAMOTO S. ET AL.: "Saibogai kishitsu kanren tanpaku CYR61 (CCN1), no zenritsusen shikkan ni okeru hatsugen to zenritsusen saibo zoshoku eno kanyo ni tsuite", NIHON GAN GAKKAI SOKAI KIJI, vol. 62, 25 August 2003 (2003-08-25), pages 354, XP002984794 *
SAMPATH D. ET AL.: "Cyr61, a member of the CCN familly, is required for MCF-7 cell proliferation: regulation by 17beta-estradiol and overexpression in human brest cancer", ENDOCRINOLOGY, vol. 142, no. 6, 2001, pages 2540 - 2548, XP001053141 *
SAMPATH D. ET AL.: "The angiogenic factor Cyr61 is induced by the progestrin R5020 and is necessary for mammary adenocarcinoma cell growth", ENDOCRINE, vol. 18, no. 2, 2002, pages 147 - 159, XP002981704 *
YOKOYAMA M. ET AL.: "LPA ni yori zenritsusen saibo ni oite yudo sareru CYR61(CCN1) no hatsugen to kino", NIHON GAN GAKKAI SOKAI KIJI, vol. 62, 25 August 2003 (2003-08-25), pages 355, XP002984793 *
ZHANG X. ET AL.: "Localization of Cyr61 mRNA and protein in prostate cancer", THE JAPANESE JOURNAL OF UROLOGY, vol. 93, no. 2, 2002, pages 331, XP002984796 *
ZHANG X. ET AL.: "Zenritsusen gan ni okeru CYR61 (CCN1) no hatsugen to byoki shinten tono kanren", NIHON GAN GAKKAI SOKAI KIJI, vol. 62, 25 August 2003 (2003-08-25), pages 217, XP002984795 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010010288A1 (en) 2010-03-04 2011-09-08 Wolfgang Poller Medicament, useful to prevent or treat e.g. ulcerative colitis, comprises polypeptide sequences of cysteine-rich protein 61 (CCN1) and/or cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide, or nucleic acid encoding polypeptide sequence of CCN1
WO2011107590A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Wolfgang Poller Cnn1 (cyr61) for prevention and therapy of inflammatory disease
RU2612268C1 (en) * 2016-06-08 2017-03-03 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" Means for prevention and treatment of benign prostatic hyperplasia

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