JP5719504B2

JP5719504B2 - Caspase-14 specific monoclonal antibody

Info

Publication number: JP5719504B2
Application number: JP2009178402A
Authority: JP
Inventors: 利彦日比野; 片桐　千華; 千華片桐; 純一細井
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: JP2011032190A

Description

本発明は、カスパーゼ−１４に特異的なモノクローナル抗体を提供する。 The present invention provides monoclonal antibodies specific for caspase-14.

表皮の顆粒層のケラチン線維は、角化する際にフィラグリンと呼ばれるタンパク質に結合して凝集し、“ケラチンパターン”と称される特異的な形態をつくる。顆粒細胞内のケラトヒアリン顆粒にはフィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリン（フィラグリン単位が10乃至12個縦に並んだもの）が多量に存在し、角化するときに脱リン酸化とペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）というプロテアーゼの作用によって脱イミノ化され、その後フィラグリンに分解される。遊離されたフィラグリンは角質細胞の細胞質内でケラチン線維を凝集させたのち、角層上層でアミノ酸などに分解される。これらのアミノ酸は天然保湿因子と呼ばれ、角層水分量の保持に重要な役割を担い、また紫外線吸収能をもつことで知られる［(Blank I.H. J.I. Dermatol., 18, 433 (1952)（非特許文献１）; Blank I.H. J.I. Dermatol., 21, 259 (1953)（非特許文献２）］。 When the keratin fibers of the epidermal granule bind to and aggregate with a protein called filaggrin when keratinized, they form a specific form called a “keratin pattern”. The keratohyalin granules in granule cells contain a large amount of profilagrin (a 10-12 vertical filaggrin unit), which is a precursor of filaggrin. When keratinized, dephosphorylation and peptidylarginine deiminase ( PAD) is deiminated by the action of a protease and then decomposed into filaggrin. The released filaggrin aggregates keratin fibers in the cytoplasm of the keratinocytes, and then decomposes into amino acids and the like in the upper layer of the horny layer. These amino acids are called natural moisturizing factors and play an important role in maintaining the stratum corneum moisture content, and are also known for their ability to absorb ultraviolet light [(Blank IHJI Dermatol., 18, 433 (1952) (non-patent Literature 1); Blank IHJI Dermatol., 21, 259 (1953) (non-patent literature 2)].

ＮＭＦの主成分であるアミノ酸がフィグラリンに由来することが明らかになって以来、乾燥肌を呈する病態とフィグラリンの関連性についての研究が進められている。特に、フィグラリンのプロセシング異状が起きている場合、それにバリアー機能障害が伴い、アトピーや魚鱗癬の一部はフィラグリンの遺伝子異状が原因であるとの報告がある。このように、ＮＭＦは皮膚の保湿機能、ひいては皮膚のバリアー機能に重要な役割を担い、フィラグリンがどのような過程を経てＮＭＦにまで分解されるかを知ることは皮膚科学または化粧学上、あるいは皮膚のバリアー機能を改善させる薬剤を見つける上で重要である。 Since it became clear that the amino acid that is the main component of NMF is derived from figralin, research on the relationship between the pathological condition of dry skin and figralin has been underway. In particular, when processing abnormality of figralin occurs, it is accompanied by barrier dysfunction, and it has been reported that some of atopy and ichthyosis are caused by genetic abnormality of filaggrin. Thus, NMF plays an important role in the skin moisturizing function, and hence the barrier function of the skin, and knowing what process filaggrin is degraded to NMF is dermatological or cosmetic, or It is important in finding drugs that improve the barrier function of the skin.

最近の研究結果から、カスパーゼ−１４ノックアウトマウスでフィラグリンのプロセシング異状が起きていることが明らかとされた（J Biol Chem, 284(19) 12829-36 (2009) （非特許文献３）；Nat Cell Biol., (6) 666-74 (2007)（非特許文献４））。カスパーゼ−１４がフィラグリンのプロセシングに関与し、ひいては皮膚の正常なバリアー機能の保持に重要な役割を担うことが示唆され、皮膚の正常なバリアー機能のメカニズムの解明のための新たな切り口として、カスパーゼ−１４の機能の解明が注目されている。 Recent research results revealed that filaggrin processing abnormalities occurred in caspase-14 knockout mice (J Biol Chem, 284 (19) 12829-36 (2009) (Non-Patent Document 3); Biol., (6) 666-74 (2007) (non-patent document 4)). It has been suggested that caspase-14 is involved in filaggrin processing and thus plays an important role in maintaining the normal barrier function of skin. As a new approach for elucidating the mechanism of normal barrier function of skin, caspase-14 Elucidation of the function of -14 has attracted attention.

特表2000-507812号公報Special Table 2000-507812 特表2001-521730号公報Special table 2001-521730 特表2002-534958号公報Special Table 2002-534958

Blank I.H. J.I. Dermatol., 18, 433 (1952)Blank I.H.J.I.Dermatol., 18, 433 (1952) Blank I.H. J.I. Dermatol., 21, 259 (1953)Blank I.H.J.I.Dermatol., 21, 259 (1953) J Biol Chem, 284(19) 12829-36 (2009)J Biol Chem, 284 (19) 12829-36 (2009) Nat Cell Biol., (6) 666-74 (2007)Nat Cell Biol., (6) 666-74 (2007) J. Immunology, 174:4485-4494 (2005)J. Immunology, 174: 4485-4494 (2005)

カスパーゼ−１４は皮膚に特異的に発現するカスパーゼであることが報告されているが、その活性化の機構及び機能に関しては未だ十分には解明されていない。カスパーゼ−１４の活性化の機構及び機能の解明を目的に、免疫染色を用いて生体内分布を調べたり、ＥＬＩＳＡ系を作製してカスパーゼ−１４を定量化するための特異的な抗体の利用は不可欠である。従って、本発明者はカスパーゼ−１４に特異的に結合するモノクローナル抗体の作製を検討した。その結果、カスパーゼ−１４特異的モノクローナル抗体を産生するいくつかのハブリドーマ株を得ることに成功した。 Although caspase-14 is reported to be a caspase specifically expressed in the skin, its activation mechanism and function have not yet been fully elucidated. For the purpose of elucidating the mechanism and function of caspase-14 activation, the use of specific antibodies to examine biodistribution using immunostaining or to quantitate caspase-14 by preparing an ELISA system It is essential. Therefore, the present inventors examined the production of a monoclonal antibody that specifically binds to caspase-14. As a result, several hybridoma strains producing caspase-14-specific monoclonal antibodies were successfully obtained.

従って、本願は以下の発明を包含する。
（１）カスパーゼ−１４に特異的なモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマＮＩＴＥＰ−７４９、ＮＩＴＥＰ−７５０、ＮＩＴＥＰ−７５１及びＮＩＴＥＰ−７５２からなる群から選ばれるハイブリドーマ株によって生産されるモノクローナル抗体。
（２）活性化カスパーゼ−１４に特異的なモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマＮＩＴＥＰ−７４９、ＮＩＴＥＰ−７５０、ＮＩＴＥＰ−７５１及びＮＩＴＥＰ−７５２からなる群から選ばれるハイブリドーマ株によって生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと結合するモノクローナル抗体。
（３）前記ハイブリドーマ株がＮＩＴＥＰ−７４９である、（１）又は（２）のモノクローナル抗体。
（４）前記ハイブリドーマ株がＮＩＴＥＰ−７５０である、（１）又は（２）のモノクローナル抗体。
（５）前記ハイブリドーマ株がＮＩＴＥＰ−７５１である、（１）又は（２）のモノクローナル抗体。
（６）前記ハイブリドーマ株がＮＩＴＥＰ−７５２である、（１）又は（２）のモノクローナル抗体。
（７）活性化カスパーゼ−１４に特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマヒ株であって、ハイブリドーマＮＩＴＥＰ−７４９、ＮＩＴＥＰ−７５０、ＮＩＴＥＰ−７５１及びＮＩＴＥＰ−７５２からなる群から選ばれるハイブリドーマ株。 Therefore, this application includes the following inventions.
(1) Monoclonal antibody specific to caspase-14 and produced by a hybridoma strain selected from the group consisting of hybridomas NITE P-749, NITE P-750, NITE P-751 and NITE P-752 .
(2) A monoclonal antibody specific for activated caspase-14, which is produced by a hybridoma strain selected from the group consisting of the hybridomas NITE P-749, NITE P-750, NITE P-751 and NITE P-752 A monoclonal antibody that binds to an epitope to which the monoclonal antibody binds.
(3) The monoclonal antibody according to (1) or (2), wherein the hybridoma strain is NITE P-749.
(4) The monoclonal antibody according to (1) or (2), wherein the hybridoma strain is NITE P-750.
(5) The monoclonal antibody according to (1) or (2), wherein the hybridoma strain is NITE P-751.
(6) The monoclonal antibody according to (1) or (2), wherein the hybridoma strain is NITE P-752.
(7) A hybridoma strain that produces a monoclonal antibody specific for activated caspase-14, selected from the group consisting of hybridomas NITE P-749, NITE P-750, NITE P-751 and NITE P-752 Hybridoma strain.

本発明の方法により、皮膚の性状、すなわちＮＭＦによる皮膚バリアー機能状態に関与する重要な因子であるカスパーゼ−１４を組織学的、生化学的レベルで判定することが可能となる。 The method of the present invention makes it possible to determine caspase-14, which is an important factor involved in skin properties, ie, the state of skin barrier function by NMF, at a histological and biochemical level.

ウェスタンブロットによる一次スクリーニング。Primary screening by Western blot. 合成基質WEHD-MCAを用いてカスパーゼ−１４抗体を加えた際のカスパーゼ−１４活性の測定結果。The measurement result of caspase-14 activity at the time of adding a caspase-14 antibody using synthetic substrate WEHD-MCA. 各クローンによる免疫染色の結果を示す。The result of immunostaining by each clone is shown. ＮＩＴＥＰ−７５２（クローン３）を用いたＥＬＩＳＡ法によるカスパーゼ−１４の定量。Caspase-14 quantification by ELISA using NITE P-752 (clone 3).

ヒトカスパーゼ−１４の全長配列やそれをコードする核酸配列についてはhttp://www-personal.umich.edu/~ino/List/31919.htmや、特表2000-507812号公報、特表2001-521730号公報、特表2002-534958号公報に記載されている。 For the full-length sequence of human caspase-14 and the nucleic acid sequence encoding it, see http://www-personal.umich.edu/~ino/List/31919.htm, JP 2000-507812, JP 2001- It is described in 521730 gazette and special table 2002-534958 gazette.

本発明に係るカスパーゼ−１４特異的モノクローナル抗体は、慣用の方法で作製することができる。例えば、カスパーゼ−１４抗原を好ましくは適当な担体に結合させることで形成した抗原複合体を、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。好ましくは、モノクローナル抗体の作製に適した動物、例えばGanp遺伝子トラオンスジェニックマウス［Sakaguchi et al., J. Immunology, 2005, 174:4485-4494（非特許文献３）］が使用される。マウス抗原の動物１匹当たりの投与量は、例えばアジュバントを用いないときは0.1〜100mgであり、アジュバントを用いるときは1〜100μgであるが、それらに限定されることはない。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2〜5週間間隔で、１〜10回、好ましくは2〜5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜60日後、好ましくは１〜14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。 The caspase-14-specific monoclonal antibody according to the present invention can be prepared by a conventional method. For example, an antigen complex formed by binding caspase-14 antigen to an appropriate carrier is preferably administered to mammals such as rats, mice, rabbits and the like. Preferably, an animal suitable for production of a monoclonal antibody, for example, a Ganp gene traonogenic mouse [Sakaguchi et al., J. Immunology, 2005, 174: 4485-4494 (Non-patent Document 3)] is used. The dose of mouse antigen per animal is, for example, 0.1-100 mg when no adjuvant is used, and 1-100 μg when an adjuvant is used, but is not limited thereto. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.

細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば X63Ag.8.653、NSI/1-Ag4-1、NS0/1などのマウスミエローマ細胞株、YB 2/0などのラットミエローマ細胞株が挙げられる。 In order to obtain a cell fusion hybridoma, cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Those having the following are preferred. Examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as X63Ag.8.653, NSI / 1-Ag4-1, NS0 / 1, and rat myeloma cell lines such as YB 2/0.

次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、適当な比率、例えば１×10⁶〜１×10⁷個/mlの抗体産生細胞と２×10⁵〜２×10⁶個/mlのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比２：１〜３：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。 Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion is carried out in an animal cell culture medium such as serum-free DMEM, RPMI-1640 medium, or the like at an appropriate ratio, for example, 1 × 10 ⁶ to 1 × 10 ⁷ cells / ml of antibody-producing cells and 2 × 10 ^5. ˜2 × 10 ⁶ cells / ml myeloma cells are mixed (cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 2: 1 to 3: 1), and fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter. . As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used. Alternatively, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).

ハイブリドーマの選別及びクローニング細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。 Selection and cloning of hybridoma The target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment. As a method, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, then spread on a microtiter plate, a selective medium is added to each well, and then the selective medium is appropriately replaced and cultured. I do. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.

次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、活性型カスパーゼ−１４に特異的な抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。そして、最終的に、カスパーゼ−１４とは反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。 Next, the culture supernatant of the hybridoma that has grown is screened for the presence of an antibody specific for active caspase-14. Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by the limiting dilution method or the like. Finally, a hybridoma that is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with caspase-14 is established.

モノクローナル抗体の採取樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、５％ CO₂濃度)で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。 As a method for collecting monoclonal antibodies from the established hybridoma, a normal cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO ₂ concentration). Cultivate for 7 to 14 days and obtain antibody from the culture supernatant. In the case of the ascites formation method, a single hybridoma is administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and a homologous animal, and the hybridoma is proliferated in large quantities. And ascites is collected after 1-2 weeks. When antibody purification is required in the antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.

以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with specific examples. In addition, this invention is not limited by this.

実施例１
リコンビナントカスパーゼ−１４の作製
リコンビナントプロカスパーゼ−１４は以下のとおりにして作成した。下記のＰＣＲプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ増幅したヒトカスパーゼ−１４全長コード配列をｐＧＥＸ−６Ｐ１（ＧＥヘルスケア）にクローニングし、ＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌（ＢＬ２１）に形質転換した。グルタチオン・アガロースカラムで精製後、PreScission Protease （ＧＥヘルスケア）にてＧＳＴを切断後、得られたリコンビナントカスパーゼ−１４をさらにＭｏｎｏＱＦＰＬＣシステム（アマシャム社）によるクロマトグラフィーにかけることで精製し、抗原として用いた。 Example 1
Preparation of Recombinant Caspase-14 Recombinant procaspase-14 was prepared as follows. The RT-PCR amplified human caspase-14 full-length coding sequence was cloned into pGEX-6P1 (GE Healthcare) and transformed into E. coli (BL21) as a GST (glutathione transferase) fusion protein. After purification with a glutathione / agarose column, GST was cleaved with PreScission Protease (GE Healthcare), and the resulting recombinant caspase-14 was further purified by chromatography with the MonoQ FPLC system (Amersham) as an antigen. Using.

活性化カスパーゼ−１４の作製
Reverse genetics 法により、活性化体カスパーゼ−１４のリコンビナントを作製した。
ヒト表皮角層から、活性化カスパーゼ−１４を精製し、その一次構造を決定した。その結果、活性化に必要な切断部位として、Asp146を同定し、かつIle152とLys153との間でさらに分解されlinker peptideが失われることにより、Large subunitとsmall subunitのヘテロダイマーを形成し、活性化体となることを明らかにした。この情報に基づき、small subunitをN末側におきこれにlarge subunitを融合させ、C末がAsp146で終わるコンストラクトを作製し、pET Vectorに組み込んだ。大腸菌にトランスフォーメーションし、所定の方法で蛋白を誘導、Ni-agaroseカラムを用いてリコンビナント蛋白の精製を行った。 Production of activated caspase-14
Recombinant activated caspase-14 was prepared by Reverse genetics method.
Activated caspase-14 was purified from the human stratum corneum and its primary structure was determined. As a result, Asp146 was identified as a cleavage site necessary for activation, and it was further degraded between Ile152 and Lys153, resulting in loss of the linker peptide, forming a large subunit and small subunit heterodimer, and activating Revealed to become a body. Based on this information, a small subunit was placed on the N-terminal side, the large subunit was fused to this, and a C-terminal construct ending with Asp146 was prepared and incorporated into pET Vector. E. coli was transformed, the protein was induced by a predetermined method, and the recombinant protein was purified using a Ni-agarose column.

２．酵素活性の検討
10μlのリコンビナントカスパーゼ−１４を５μg/mlになるようにDTTを含まないアッセイバッファー（PBS）で希釈し、室温で1時間インキュベートした。これに80μlのアッセイバッファー（DTT入り）を加え、15分室温に置いた後、カスパーゼ−１４の基質として公知の蛍光基質（WEHD-MCA（0.1 mM）, ペプチド研究所）20μlを加え、37^oCで30分インキュベートし、excitation:355 nm、emission:460 nmで蛍光強度の変化を測定した。コントロールとしてヒト角層から精製したカスパーゼ−１４の酵素活性を同様に測定した。測定には、フルオロスキャンアセントFL（Labsystems）を用いた。その結果、リコンビナントカスパーゼ−１４はヒト角層から精製したカスパーゼ−１４と同様の性質を認めた（データーは示さない）。 2. Examination of enzyme activity
10 μl of recombinant caspase-14 was diluted to 5 μg / ml with assay buffer (PBS) without DTT and incubated at room temperature for 1 hour. To this was added 80 μl of assay buffer (with DTT), and after 15 minutes at room temperature, 20 μl of a known fluorescent substrate (WEHD-MCA (0.1 mM), Peptide Institute) was added as a substrate for caspase-14, and 37 ^° C. Incubation was performed for 30 minutes at C, and changes in fluorescence intensity were measured at excitation: 355 nm and emission: 460 nm. As a control, the enzyme activity of caspase-14 purified from human stratum corneum was measured in the same manner. Fluoroscan Ascent FL (Labsystems) was used for the measurement. As a result, recombinant caspase-14 showed the same properties as caspase-14 purified from human stratum corneum (data not shown).

３．モノクローナル抗体の作製
ＰＣＲクローニングしたヒトカスパーゼ−１４遺伝子をｐＧＥＸ−６Ｐ１ベクター(アマシャムバイオサイエンス)に導入し、ＧＳＴ（グルタチオントランスフェラーゼ）融合タンパク質として大腸菌に発現させた。グルタチオンアガロースカラムで精製後、PreScission Protease（ＧＥヘルスケア）にてＧＳＴと切断後、リコンビナントカスパーゼ−１４をさらにＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラフィーにて精製し、抗原として用いた。
この抗原を用い、Ganp遺伝子トランスジェニックマウス（J. Immunology, 174: 4485-4494(2005)：非特許文献５）を用い、抗体産生ハイブリドーマ細胞を作製した。その結果、抗カスパーゼ−１４抗体を賛成するクローンとして、クローン６（ＮＩＴＥＰ−７４９；識別表示６Ｂ２）、クローン２（ＮＩＴＥＰ−７５０；識別表示７Ｄ４）、クローン１０（ＮＩＴＥＰ−７５１；識別表示７Ｈ４）及びクローン３（ＮＩＴＥＰ−７５２；８Ａ８））が得られた。 3. Preparation of monoclonal antibody The PCR-cloned human caspase-14 gene was introduced into a pGEX-6P1 vector (Amersham Bioscience) and expressed in E. coli as a GST (glutathione transferase) fusion protein. After purification with a glutathione agarose column, cleavage with GST with PreScission Protease (GE Healthcare), recombinant caspase-14 was further purified with MonoQ ion exchange chromatography and used as an antigen.
Using this antigen, antibody-producing hybridoma cells were prepared using Ganp gene transgenic mice (J. Immunology, 174: 4485-4494 (2005): Non-Patent Document 5). As a result, clone 6 (NITE P-749; identification 6B2), clone 2 (NITE P-750; identification 7D4), clone 10 (NITE P-751; identification) as anti-caspase-14 antibodies. 7H4) and clone 3 (NITE P-752; 8A8)) were obtained.

４．抗体の一次スクリーニング
ウェスタンブロットによる確認
カスパーゼ−１４に対するモノクローナル抗体がカスパーゼ−１４活性体のうちの大サブユニット（17kDa)又は小サブユニット（11kDa)のいずれを認識しているのか、濃度を一定ににし、デキストリン抽出物及び角層抽出液を用いて確認した。コントロールとして市販のポリクローナル抗体H-99抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc）（17kDaに特異的）及びC-20抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc）（（11kDaに特異的）を用いた。
その結果を図１に示す。クローン２（ＮＩＴＥＰ−７５０）、クローン３（ＮＩＴＥＰ−７５２）及びクローン６（ＮＩＴＥＰ−７４９）は大サブユニットを、そしてクローン１０（ＮＩＴＥＰ−７５１）は小サブユニットを認識するとの結果が得られた。 4). Primary screening of antibody Confirmation by Western blot Monoclonal antibody against caspase-14 recognizes either large subunit (17 kDa) or small subunit (11 kDa) of caspase-14 active substance at a constant concentration. This was confirmed using a dextrin extract and a stratum corneum extract. As controls, a commercially available polyclonal antibody H-99 antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc) (specific to 17 kDa) and C-20 antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc) ((specific to 11 kDa)) were used.
The result is shown in FIG. Results of clone 2 (NITE P-750), clone 3 (NITE P-752) and clone 6 (NITE P-749) recognizing the large subunit and clone 10 (NITE P-751) recognizing the small subunit was gotten.

５．抗体によるカスパーゼ−１４活性中和能の測定
アッセイバッファー：50 mM HEPES (pH 7.5) +0.1% CHAPS + 60 mM NaCl + 1.5 M Na-citrate (クエン酸ナトリウム)＋ 5 mM DTT
・モノクローナル抗体ストック：1 mg/ml in PBS
・リコンビナントカスパーゼ−１４ストック： 2.5 mg/ml 5). Measurement of caspase-14 activity neutralizing ability by antibody Assay buffer: 50 mM HEPES (pH 7.5) + 0.1% CHAPS + 60 mM NaCl + 1.5 M Na-citrate (sodium citrate) + 5 mM DTT
Monoclonal antibody stock: 1 mg / ml in PBS
Recombinant caspase-14 stock: 2.5 mg / ml

10 μlのカスパーゼ−１４を５μg/mlになるようにDTTを含まないアッセイバッファーで希釈し、適当な濃度の抗体溶液（1/10〜1/80, PBSで希釈）５μlと反応させ、室温で1時間インキュベートした。これに80 μlのアッセイバッファー（DTT入り）を加え、15分室温に置いた後、0.1 mMの蛍光基質（WEHD-MCA, ペプチド研究所）20 μlを加え、37^oCで30分インキュベートし、excitation:355 nm、emission:460 nmで蛍光強度の変化を測定した。コントロールには抗体を含まないPBSを用いた。測定には、フルオロスキャンアセントFL（Labsystems）を用いた。その結果、ヒト角層から精製したカスパーゼ−１４と同様の性質を認めた。 Dilute 10 μl of caspase-14 in assay buffer without DTT to 5 μg / ml, react with 5 μl of antibody solution of appropriate concentration (1/10 to 1/80, diluted with PBS), and at room temperature Incubated for 1 hour. Add 80 μl of assay buffer (with DTT) to this, leave it at room temperature for 15 minutes, add 20 μl of 0.1 mM fluorescent substrate (WEHD-MCA, Peptide Institute), and incubate at 37 ^° C for 30 minutes. Changes in fluorescence intensity were measured at excitation: 355 nm and emission: 460 nm. PBS containing no antibody was used as a control. Fluoroscan Ascent FL (Labsystems) was used for the measurement. As a result, the same properties as caspase-14 purified from human stratum corneum were observed.

その結果を図２に示す。クローン２（ＮＩＴＥＰ−７５０）では活性化カスパーゼ−１４の活性は完全にブランクのレベルにまで抑制され、濃度依存性の傾向の認められる強い中和活性があった。クローン６（ＮＩＴＥＰ−７４９）及びクローン１０（ＮＩＴＥＰ−７５１）については、弱いながらも活性化カスパーゼ−１４の活性を抑制する作用が認められた。クローン３（ＮＩＴＥＰ−７５２）については中和抗体としての作用はほとんどなかった。 The result is shown in FIG. In clone 2 (NITE P-750), the activity of activated caspase-14 was completely suppressed to a blank level, and there was a strong neutralizing activity in which a concentration-dependent tendency was observed. Regarding clone 6 (NITE P-749) and clone 10 (NITE P-751), an action to suppress the activity of activated caspase-14 was observed although it was weak. Clone 3 (NITE P-752) had little effect as a neutralizing antibody.

６．カスパーゼ−１４特異的抗体による免疫染色
カスパーゼ−１４特異的抗体によるヒト表皮細胞の免疫組織化学染色
ヒト皮膚切片を４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で室温、20分固定し、浸透化液（0.1％のクエン酸ナトリウム、0.1％のTriton X-100／PBS）中で、４℃、２分処理した。次に、10％のヤギ正常血清（ヒストファインブロッキング試薬：ニチレイ社製）で室温、２時間ブロッキング処理し、上記４種のカスパーゼ−１４特異的抗体（1/200）と４℃、一晩反応させた後、ＰＢＳで室温にて15分×３回、余剰抗体を洗浄した。次に抗ウサギTexas Red標識二次抗体（VECTOR社製）と室温で１時間反応させ、再度ＰＢＳで室温にて15分×３回洗浄し、余剰抗体を洗浄した。その結果を図３に示す。上記抗体いずれによっても免疫染色が可能であった。したがって、例えばマウス以外の種由来の抗カスパーゼ−１４抗体と組み合わせれば、本発明の各抗体はカスパーゼ−１４の二重染色に使用できる。 6). Immunostaining with caspase-14 specific antibody Immunohistochemical staining of human epidermal cells with caspase-14 specific antibody Human skin sections were fixed with 4% PFA (paraformaldehyde) at room temperature for 20 minutes, and permeation solution (0.1% In sodium citrate, 0.1% Triton X-100 / PBS) at 4 ° C. for 2 minutes. Next, it was blocked with 10% goat normal serum (histofine blocking reagent: manufactured by Nichirei) at room temperature for 2 hours, and reacted with the above four types of caspase-14 specific antibodies (1/200) at 4 ° C. overnight. Then, excess antibody was washed with PBS for 15 minutes × 3 times at room temperature. Next, it was reacted with an anti-rabbit Texas Red labeled secondary antibody (manufactured by VECTOR) for 1 hour at room temperature, and again washed with PBS at room temperature for 15 minutes × 3 times to wash excess antibody. The result is shown in FIG. Immunostaining was possible with any of the above antibodies. Therefore, for example, when combined with an anti-caspase-14 antibody derived from a species other than mouse, each antibody of the present invention can be used for double staining of caspase-14.

クローン３（ＮＩＴＥＰ−７５２）によるＥＬＩＳＡ系の構築
固相抗体としてクローン３（ＮＩＴＥＰ−７５２）モノクローナル抗体、一次抗体としてH-99抗体（ヒトカスパーゼ−14のアミノ酸24-122に対応するペプチドに対し生起された抗体）、二次抗体としてロバ由来のＥＣＬ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）フラグメントを用いＥＬＩＳＡサンドイッチ系を構築し、カスパーゼ−１４の定量を行った。それにより作製した検量線を図４に示す。その結果、０〜1.2μｇ／ｍｌといった広い濃度範囲において検量線に直線性が示され、クローン３（ＮＩＴＥＰ−７５２）モノクローナル抗体はカスパーゼ−１４の定量に有用であることがわかった。 Construction of ELISA system using clone 3 (NITE P-752) Clone 3 (NITE P-752) monoclonal antibody as solid phase antibody, H-99 antibody as primary antibody (peptide corresponding to amino acids 24-122 of human caspase-14) An ELISA sandwich system was constructed using a donkey-derived ECL anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-binding F (ab ′) fragment as a secondary antibody, and caspase-14 was quantified. The calibration curve thus prepared is shown in FIG. As a result, the calibration curve showed linearity in a wide concentration range of 0 to 1.2 μg / ml, and it was found that the clone 3 (NITE P-752) monoclonal antibody was useful for quantification of caspase-14.

１．マウス骨髄細胞株、マウスB細胞（６Ｂ２)
（１）微生物の表示：６Ｂ２
（２）受託番号：ＮＩＴＥＰ−７４９
（３）受領日：２００９年５月１４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
２．マウス骨髄細胞株、マウスB細胞（７Ｄ４)
（１）微生物の表示：７Ｄ４
（２）受託番号：ＮＩＴＥＰ−７５０
（３）受領日：２００９年５月１４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
３．マウス骨髄細胞株、マウスB細胞（７Ｈ４)
（１）微生物の表示：７Ｈ４
（２）受託番号：ＮＩＴＥＰ−７５１
（３）受領日：２００９年５月１４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
４．マウス骨髄細胞株、マウスB細胞（クローン３)
（１）微生物の表示：Ｃｌｏｎｅ３
（２）受託番号：ＮＩＴＥＰ−７５２
（３）受領日：２００９年５月１４日
（４）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 1. Mouse bone marrow cell line, mouse B cell (6B2)
(1) Display of microorganisms: 6B2
(2) Accession number: NITE P-749
(3) Date of receipt: May 14, 2009 (4) Depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center Mouse bone marrow cell line, mouse B cell (7D4)
(1) Microbe indication: 7D4
(2) Accession number: NITE P-750
(3) Date of receipt: May 14, 2009 (4) Depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center Mouse bone marrow cell line, mouse B cell (7H4)
(1) Display of microorganisms: 7H4
(2) Accession number: NITE P-751
(3) Date of receipt: May 14, 2009 (4) Depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center Mouse bone marrow cell line, mouse B cell (clone 3)
(1) Display of microorganisms: Clone 3
(2) Accession number: NITE P-752
(3) Date of receipt: May 14, 2009 (4) Depositary institution: National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center

Claims

A monoclonal antibody specific for caspase-14, the monoclonal antibody produced by the hybridoma strain of hybridomas N ITE P-752.

NITE P-752 , a hybridoma strain that produces a monoclonal antibody specific for caspase-14 .