WO2004073740A1 - 組織内アンジオテンシンⅱ産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤 - Google Patents

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Yuichi Ishida
Atsuhiro Ichihara
Fumiaki Suzuki
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Yuichi Ishida
Atsuhiro Ichihara
Fumiaki Suzuki
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for controlling angiotensin II production enhancement in tissues and an agent for preventing or treating the onset of arteriosclerosis, cardio-cerebrovascular disease and Z or diabetic complications.
  • the renin-angiotensin system is an important regulatory system in the body, and is known to be deeply involved in blood pressure, water electrolyte metabolism, and cell proliferation.
  • the renin and angiotensin systems include the circulating reen and angiotensin system and the tissue renin and angiotensin system.
  • the former is a system that regulates and responds to acute changes in blood pressure and water-electrolyte balance. Is known to play an important role in development, differentiation, proliferation, or various disease states.
  • renin'angiotensin system Activation of the renin'angiotensin system in tissues increases the concentration of angiotensin II in tissues, and increased angiotensin II in tissues works via specific receptors in hypertension ⁇ (diabetic renal It is deeply involved in the development and progression of diabetic complications, renal disease, heart failure, myocardial infarction, cardiac hypertrophy, cardiomyopathy, cerebrovascular disease, and atherosclerosis (including diabetes, diabetic neuropathy, and diabetic retinopathy).
  • ⁇ diabetic renal It is deeply involved in the development and progression of diabetic complications, renal disease, heart failure, myocardial infarction, cardiac hypertrophy, cardiomyopathy, cerebrovascular disease, and atherosclerosis (including diabetes, diabetic neuropathy, and diabetic retinopathy).
  • angiotensin II for these diseases Angiotensin II receptor antagonists and angiotensin II receptor antagonists have been used, but the therapeutic effect is limited by the re-elevation of angiotensin II or angiotensin II effect, which is called an escape phenomenon. Therefore, in order to reliably suppress tissue angiotensin II concentration, which is the essence of the disease state, it is most important to suppress the activation of the tissue renin-angiotensin system, which is the source.
  • drugs such as the above-mentioned conventional angiotensin II synthase inhibitors can treat diseases such as arteriosclerosis only through tissue renin and angiotensin system, and do not use tissue renin and angiotensin system. There was also a limitation that it was not possible to treat diseases such as arteriosclerosis due to an independent mechanism of action and unknown.
  • the active substance in the renin-angiotensin system is renin or the renin produced by hydrolysis of prorenin, although the amount of oral reen in the blood is about 10 times that of renin. I have been.
  • profragment is an N-terminal 43 amino acid fragment (hereinafter “profragment” or “; pf”) that is cleaved when renin is generated from prorenin. ), Forms an immune complex by binding in vitro with an antibody that specifically recognizes the protein function under physiological conditions and non-enzymatically without altering the primary structure.
  • Non-Patent Documents 1-2 As means for activating prorenin, conversion to renin by a proteolytic enzyme, a method of activating it under acidic and low-temperature conditions without changing its primary structure (Non-patent Documents 1 to 4), and inhibition of low-molecular-weight renin have been reported. A method is known in which an agent is bound to the 5-position of the enzyme active site hidden in the deep groove of the three-dimensional structure of prorenin to form an open form (Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-279600
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 5,954,512
  • Non-Patent Document 1 Nature, 288, 702-705, 1980
  • Non-Patent Document 2 J. Biol. Chem “262, 2472-2477, 1987
  • Non-Patent Document 3 Clin. Chem., 37, 1811-1819, 1991
  • Non-Patent Document 4 J. Biol. Chem., 267, 11753-11759, 1992
  • Non-Patent Document 5 J. Biol. Chem “267, 22837-22842, 1992
  • An object of the present invention is to provide a novel agent for enhancing angiotensin II production in a tissue and an agent for preventing or treating the onset of arteriosclerosis, cardio-cerebrovascular disease and / or diabetic complications.
  • the present inventors have conducted studies in consideration of the above circumstances, and as a result, as a result of prorenin profragment-derived partial peptide, STZ diabetes mellitus was used as an example of a disease model animal in which tissue angiotensin II production is enhanced.
  • Disease model It was found that administration to 25 animals could control the activation of tissue renin-angiotensin system. Based on this knowledge, By using a substance that regulates the activation of oral renin, it has been found that a novel agent for enhancing the production of angiotensin II in tissues can be provided.
  • a partial peptide derived from proleun profragment is administered to an STZ diabetic disease model animal and an angiotensin receptor gene-deficient mouse to which STZ is administered, which is an example of a disease model animal in which diabetic nephropathy is predicted to develop. It was found that sclerosis of renal glomerular sclerosis caused by diabetes mellitus could be suppressed. Based on this finding, they have found that a novel agent for preventing or treating diabetic nephropathy can be provided by using a substance that controls activation of prorenin in a living body, and completed the present invention. That is, the embodiment of the present invention
  • Drugs for use in the following applications including substances having a function of inhibiting non-enzymatic prorenin activation without primary structural change caused by protein-protein interaction in the profragment region of prorenin:
  • Agent for preventing or treating arteriosclerosis, cardiac cerebrovascular disease and / or diabetic complications caused by increased production of angiotensin II in tissues Agent for preventing or treating arteriosclerosis, cardiac cerebrovascular disease and / or diabetic complications caused by increased production of angiotensin II in tissues; 3) Arteriosclerosis not involving renin in tissues and angiotensin system Agent for preventing or treating cerebrovascular disease and Z or diabetic complications,
  • Prorenin is selected from the amino acid sequence of the profragment region
  • the medicament according to the above item 3 wherein the peptide having a partial sequence is a peptide selected from SEQ ID NOS: 7 to 14 and SEQ ID NO: 21 in the sequence listing,
  • the peptide having a partial sequence selected from the amino acid sequence of the profragment region of prorenin is selected from the peptides described in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NOS: 15 to 20 in the sequence listing.
  • Figure la shows the effect of p4-peptide administration on the weight of diabetic mice.
  • FIG. Lb shows the effect of p4 peptide administration on blood pressure in diabetic mice.
  • FIG. 1c shows the effect of administration of p4 peptide on blood dalcos in diabetic mice.
  • FIG. 2a shows the effect of p4-peptide administration on urinary protein excretion in diabetic mice.
  • Figure 2b shows the effect of p4 peptide administration on glomerular damage in diabetic mice using the PAS method.
  • Figure 2c shows p4 peptide administration The effect of diabetic mice on renal glomerular injury by type IV collagen staining is shown.
  • FIG. 2d shows the effect of administration of p4 peptide on the renal glomerular damage rate in diabetic mice.
  • FIG. 3a shows the effect of p4-peptide administration on plasma renin activity in diabetic mice.
  • FIG. 3b shows the effect of administration of p4 peptide on plasma angiotensin I levels in diabetic mice.
  • Figure 3c shows the effect of administration of p4 peptide on plasma angiotensin II levels in diabetic mice.
  • FIG. 3 d shows the effect of administration of ⁇ 4 peptide on renal angiotensin I levels in diabetic mice.
  • FIG. 3e shows the effect of administration of p4 peptide on renal angiotensin II in diabetic mice.
  • FIG. 3f shows the effect of p4 peptide administration on kidney renin mRNA levels in diabetic mice.
  • Figure 3 g show the effect of the kidney ACE mRNA levels of diabetic mice with p 4 peptide administration.
  • Figure 3h shows the effect of administration of p4 peptide on kidney angiotensinogen mRNA levels in diabetic mice.
  • FIG. 4a shows the effect of angiotensin II receptor deficiency on renal glomerular damage in diabetic mice by administration of p4 peptide.
  • FIG. 4b shows the effect of angiotensin II receptor deficiency on the renal glomerular damage rate in diabetic mice by administration of p4 peptide.
  • the present inventors synthesized a partial peptide derived from rat prorenin profragment, which is an antigen of the anti-rat Pf antibody capable of activating rat prorenin in vitro, and administered it to STZ rats. These peptides antagonize the inhibition of in vitro rat prorenin activation by anti-rat p ⁇ antibody in the same way that human pf peptide inhibits in vitro activation of human propronin by an anti-human pf antibody. it can. In other words, these peptides can inhibit the activation of rat prorenin, which is not accompanied by a primary structural change but is accompanied by a conformational change, which occurs due to protein-protein interaction.
  • prorenin may develop diabetic complications by interacting with prorenin-binding protein.
  • Prorenin's f-peptide regulates renin ⁇ angiotensin II production enhancement by activation of renin ⁇ ⁇ angiotensin system and also regulates renin 'angiotensin system-independent pathway, for example. It has been shown to have preventive and therapeutic effects on various diseases such as diabetic complications. Revealed.
  • the rat prorenin pf peptide is human prorenin; the number of amino acid residues is the same as that of pf peptide, but the constituent amino acids are different. Nevertheless, as noted above, human !, an epitope peptide of an anti-human pf antibody capable of activating human proprorenin in vitro!
  • the rat pf peptide at the same position in the primary amino acid sequence sequence as the f peptide showed an angiotensin II-reducing effect and a diabetic nephropathy-suppressing effect in a rat model of hyperglycemia in the rat treated with STZ.
  • the method for selecting a substance that inhibits prorenin activation according to the present invention is characterized in that the method uses the ability to regulate prorenin activation by protein-protein interaction in the profragment region of prorenin as an index.
  • prorenin activation by protein-protein interaction in the pro-fragment pro-fragment region refers to enzymatic activity caused by protein-protein interaction in the pf region that is not accompanied by a primary structural change in prorenin but is accompanied by a higher-order structural change. It means opening of the part. Therefore, prorenin activated by the protein-protein interaction retains the same amino acid sequence as the primary structure of prorenin before activation, but can exhibit renin-like enzyme activity. is there.
  • Proteins having a protein-protein interaction in the pf region include the pf peptide Examples thereof include an antibody that recognizes and activates, a protein that is a site of action of prolene or activated prorenin in a living body, and a protein that can interact with prorenin to activate it.
  • the method for selecting a substance that inhibits the activation of prorenin can be constructed using a drug screening system known per se. For example, by using prorenin and an anti-pf antibody capable of activating prorenin and measuring the binding between prorenen and the anti-pf antibody, a substance that inhibits prorenin activation can be selected. In addition, for example, a substance that inhibits prorenin activation or a substance that inhibits prorenin enzyme activity is measured by measuring the enzymatic activity of activated proleun using prorenin and an anti-pf antibody capable of activating prorenin. Substances to be sorted out. Of course, the sorting method is not limited to these.
  • selection of a human proprorenin activation controlling substance is performed by selecting a human proproninin, for example, an antibody against the human pf peptide of human prorenin. It is one of the preferred embodiments to carry out using
  • human proprorenin and human proprorenin P prepared according to the descriptions in JP-A-10-279600 and US Pat. No. 5,945,512 are disclosed.
  • Screening systems can be constructed using antibodies that can specifically recognize f-peptides and activate human proprorenin.
  • the substance to be selected is a low-molecular compound, a compound derived from a natural product, or a peptide such as a peptide, which is used in a well-known pharmaceutical screening system.
  • Candidate substances to be selected can be widely used.
  • peptides and low molecular weight compounds designed based on amino acid sequence information of proleen, particularly the pf region of human prorenin can also be selected.
  • the amino acid sequence of the pf region of human proprorenin is known and consists of 43 amino acid sequences (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) shown in JP-A-8-285852.
  • the amino acid sequence of prorenin: pf peptide is useful information for designing a substance to be used for selecting a prorenin activation controlling substance.
  • Human-derived Pf1-19, human-derived pf5-19, human-derived pf27_41, rat-derived pfl_19, rat-derived pf5_19, and rat-derived p ⁇ 27 The amino acid sequence of —41 is shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 6, 7, and 8 in the sequence listing, respectively.
  • fMN the M-th to N-th peptides from the N-terminal of the pf region
  • the amino acid sequence of the prorenin pf region differs in species but has the same number of amino acid residues but different amino acid constituents.
  • the amino acid sequence of rat prorenin pf peptide (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) was exemplified as useful information for designing a target substance for selecting a prorenin activation controlling substance.
  • amino acid sequence fragments of rat prorenin pf region pf 1-11 (SEQ ID NO: 9 in the sequence listing), pf 5-19 (SEQ ID NO: 7 in the sequence listing), pf 1-4 ( SEQ ID NO: 10), pf 1-7 (SEQ ID NO: 11), pf 5-11 (SEQ ID NO: 12), Pf12-19 (SEQ ID No. 13), pf 11--15 (SEQ ID NO: 14 in the sequence listing) and pf 27-41 (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) were synthesized and their prorenin activation was suppressed. Angiotensin II reduction effect was confirmed, but is not necessarily limited to this sequence.
  • a person skilled in the art According to the method described above, at least three peptides can be appropriately synthesized, and a substance to be selected can be designed and synthesized based on the synthesized peptides.
  • the pt peptide of human proleen is used as information for designing a substance to be selected. If the substance to be selected is a peptide, it can be appropriately designed based on the amino acid sequence information of the prorenin: pf region as described above and provided for selection. The amino acid constituting the peptide does not necessarily have to be the same as the amino acid sequence of the prorenin pf region. If the peptide has the same function as the peptide, the amino acid sequence of the peptide may be appropriately deleted. It may be a peptide into which a mutation such as substitution, addition, or insertion has been introduced (hereinafter, also referred to as an equivalent peptide).
  • the substance to be selected may be a low-molecular compound that is drag-designed based on its structural complementarity based on information based on the secondary and Z- or tertiary structure of the amino acid sequence of the pf region. .
  • Information is collected based on peptides having a partial sequence selected from the amino acid sequence of the pf region, known drugs for the treatment and prevention of diabetes, and the like. It is possible to select a substance having an effect of controlling tensin II production enhancement and an agent for preventing or treating the development of arteriosclerosis, cardiovascular disease and Z or diabetic complications.
  • the present invention provides an agent for controlling angiotensin II production enhancement in tissues comprising a substance inhibiting prorenin activation, which can inhibit prorenin activation based on a protein-protein interaction in the pf region of prorenin; Provide preventive or therapeutic agents for the onset of cerebrovascular disease and Z or diabetic complications Offer.
  • One embodiment of the present invention is a tissue angiotensin II production enhancement regulator comprising a prorenin activation inhibitor capable of inhibiting human prorenin activation.
  • Another embodiment of the present invention is an agent for preventing or treating the development of arteriosclerosis, cardio-cerebrovascular disease and Z or diabetic complications, which comprises a prorenin activation inhibitor capable of inhibiting human prorenin activation. is there.
  • the prorenin activation inhibitor according to the present invention is a substance that competitively inhibits a protein-protein interaction that activates prorenin, and a substance that competitively inhibits the binding of prolenin or activated prorenin at the site of action. Or an agent that acts on the site of action of prorenin or activated proreen, and inhibits the action of prorenin or activated proreen.
  • the prorenin activation inhibitor has a function of inhibiting prorenin activation based on an interaction between proteins in the pf region of prorenil, and has no renin inhibitory activity.
  • the above-mentioned prorenin activation inhibitor does not show a direct inhibitory effect on renin as its action mechanism. Therefore, it is possible to inhibit the activation of prorenin, which is activated during a disease state, without inhibiting the renin-angiotensin system, which plays an important role in the life support mechanism of the living body, like a reen inhibitor. This is an important feature of the tissue angiotensin II production promotion regulator comprising the prorenin activation inhibitor according to the present invention.
  • the peptide is human proleen! It is a peptide having a partial sequence selected from the amino acid sequence of the f region, or an equivalent peptide of the peptide.
  • the following peptides can be exemplified as peptides derived from the amino acid sequence of the human propronin pf region.
  • hP1 Hitprorenin Pf111 (SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing)
  • hP2 ;
  • Hitprorenin Pf5-11-1 SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing
  • hP3 Human Toprorenin P f 5-19 (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing)
  • hP4 human prorenin Pf1-4 (SEQ ID NO: 17 in the sequence listing)
  • hP5 Human prorenin Pf17 (SEQ ID NO: 18 in the sequence listing)
  • hP6 chick 1, prorenin: f12-19 (SEQ ID NO: 19 in the sequence listing)
  • hP7 human proproninin Pf1115 (SEQ ID NO: 20 in the sequence listing)
  • hP8 chick Toprorenin Pf2741 (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing)
  • prorenin activation one of these peptides may be used, or a mixture of two or more may be used. it can.
  • the preparation of the agent for enhancing the production of angiotensin II in tissues and the agent for preventing or treating the onset of arteriosclerosis, cardiovascular disease and / or diabetic complications of the present invention depends on the properties of the peptide or the low-molecular compound.
  • a known method can be applied as appropriate.
  • a formulation method such as a tablet, a capsule formulation, an aqueous solution formulation, an ethanol solution formulation, a ribosome formulation, a fat emulsion, and an inclusion complex such as cyclodextrin can be used.
  • excipients such as ratatose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol Binders such as norecore, hydroxypropylcellulose, gelatin, etc. It can be produced using a surfactant such as a fatty acid ester and a plasticizer such as glycerin.
  • solid pharmaceutical carriers are used for manufacturing tablets and capsules.
  • Suspensions can be prepared using water, sugars such as sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as PEG, and oils.
  • a solution for injection can be prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of a saline solution and a glucose solution.
  • a solution in which a phospholipid is dissolved in an organic solvent such as chloroform
  • a solution in which the substance is dissolved in a solvent such as ethanol
  • the solvent such as ethanol
  • the supernatant can be filtered and collected.
  • Fat emulsification involves, for example, mixing and heating the substance, oil components (vegetable oils such as soybean oil, sesame oil, olive oil, MCT, etc.) and emulsifiers (phospholipids, etc.) Then, emulsification and homogenization treatment can be performed using an emulsifier (homogenizer, for example, high-pressure injection type, ultrasonic type, etc.). It is also possible to freeze-dry this.
  • an emulsifying aid may be added. Examples of the emulsifying aid include glycerin and glucose condyles (eg, glucose, sorbitol, fructose, etc.).
  • cyclodextrin inclusion for example, a solution obtained by dissolving the substance in a solvent (such as ethanol) with a solution prepared by heating cyclodextrin in water or the like is added, followed by cooling. This can be done by sterilizing and drying.
  • cyclodextrins ( ⁇ , ⁇ , ⁇ type) having different pore diameters may be appropriately selected according to the size of the substance.
  • the dose of the agent for controlling angiotensin ⁇ production enhancement in the tissue of the present invention and the agent for preventing or treating the onset of arteriosclerosis, cardio-cerebrovascular disease and / or diabetic complications depends on the condition, gender, age and weight of the patient. Can be selected as appropriate.
  • the route of administration may be oral or parenteral.
  • One of the preferred embodiments is to administer orally in the form of an oral preparation.
  • the dose is, for example, about 1 to 1,000 ⁇ g per day.
  • Example 1
  • the following peptide p4 derived from the sequence of the pf region of rat prorenin was synthesized by a solid phase method as usual.
  • This peptide p4 contains the 11th to 15th peptide sequences of the pf region called the "handle” region, and this "handle” region plays an important role in the activation of nonenzymatic prorenin. It is thought to carry. (Experimental example 1)
  • tissue there is a renin receptor that binds to and activates tissue (pro) renin (J Clin Invest. 109: 1417) -1427,2002) 0
  • a peptide having an amino acid sequence similar to the amino acid sequence of (pro) renin corresponding to the binding site with the renin receptor was synthesized according to Example 1 above. The tissue was administered to an angiotensin II production-enhanced disease model rat, and the tissue angiotensin II concentration was measured.
  • Such a peptide binds to the renin receptor and acts like a decoy to inhibit the binding of (pro) renin to the renin receptor. As a result, the activation of the renin-angiotensin system is suppressed. Tissue angiotensin II levels were expected to decrease.
  • a hyperglycemic model rat was prepared by intraperitoneally administering 65 mg / kg of streptozotocin (STZ) to male Sprague-Dawley rats (100-150 g).
  • STZ streptozotocin
  • a tissue prorenin activation inhibitor was subcutaneously administered for 1 month using an osmotic minipump at a dose of 0.1, 1, 10 mg / kg / day.
  • Control rats receive an osmotic mye pump.
  • Physiological saline was administered subcutaneously for 1 power month. One month later, the anesthesia was decapitated, sacrificed, and angiotensin I and angiotensin II were measured in the isolated kidney.
  • Angiotensin I and angiotensin II in the homogenized kidney extract were measured by a combination of solid-phase extraction and radioimmunoassay, as previously reported (Hypertension. 27: 658-662, 1996).
  • the extracted kidney was weighed after the coating was peeled off, placed in a scintillation vial containing 5 ml of ice-cold methanol, homogenized with a tissue mill, and centrifuged at 3,000 rpm at 4 ° C for 10 minutes to collect the supernatant.
  • the supernatant was extracted with a Varian C18 reverse phase bond elut column (1210-2032), methanol was removed with an evaporator, and the sample was reconstructed with a buffer for angiotensin assay.
  • Angi O tensin I and Anjioten Singh II concentration in the sample is 125 l Angi O Tianjin I, 125 1 Angi O tensin II (NEN Life Science, EX-105) and anti-angiopathy O Tianjin I antibody, pile
  • the measurement was performed using an angiotensin II antibody (Phoenix Pharmaceutical Co., Ltd., RAB-002-12) by radioimmunoassay.
  • the renal angiotensin I in STZ-administered hyperglycemic rats was 129.3 ⁇ 56.1 fmol / g, and the angiotensin II was 147 ⁇ 12.1 pg / g.
  • angiotensin I in the kidney was 41 fmol / g on 76.2 soil, which was not significant but showed a decreasing trend.
  • Geotensin II was significantly reduced to 77.2 ⁇ 8.3 pg / g.
  • the osmotic mini-pump was replaced every 28 days with the one for 28 words. At 12, 20, and 28 weeks of age, six rats of each group were decapitated and killed under anesthesia, and blood and the right kidney were removed, and the following Experimental Examples 2-1 to 4 were performed.
  • Intra-group statistical comparisons were performed by one-way ANOVA on multiple measurements according to the Newman-Kelus post hoc test. Differences between the two groups were assessed by two-way ANOVA on multiple measurements combined in the Newman-Kelus post hoc test. P ⁇ 0.05 was determined to be significant. Data are shown as mean soil SEM.
  • the body weight, arterial systolic pressure, and blood glucose level of 4, 8, 12, 16, 20, 24, and 28-week-old rats were measured.
  • Systolic pressure was measured by tilcut plethysmography.
  • Blood was collected from the tail vein and analyzed for the amount of dalcose using the Darcos C test kit (Wako Pure Chemical Industries).
  • diabetic rats showed marked suppression of weight gain.
  • weight gain was induced in diabetic rats at the ages of 24 and 28 weeks, but otherwise no effect was observed in control rats or diabetic rats.
  • FIG. 1b the systolic pressure was not different between the diabetic rats and the control rats, and there was no effect of the p4 peptide administration.
  • Figure lc blood glucose levels were significantly elevated in diabetic rats, but had no effect on p4-peptide administration. won.
  • the urine of the rats in the 24-hour metabolic cage was collected in a bottle, and urinary protein excretion and creatinine were measured using a Micro TP test kit (Wako Pure Chemical Industries) and a creatinine HA test kit (Wako Pure Chemical Industries).
  • a portion of the kidney removed from each group of rats was fixed with 10% formalin in phosphate buffer. Paraffin-embedded sections were stained by the periodate-Schiff method (PAS method).
  • the sections were applied as a first antibody to the sections, and the sections were incubated with a biotin-conjugated anti-Peacock IgG antibody as a second antibody.
  • the antibody reaction was visualized using a Vectastatin ABC standard kit (Vector Laboratories) and an AEC standard kit (Dako Corporation) according to the manufacturer's instructions. Quantitative measurement of immunoreactive Type IV collagen positive area of each glomerulus by Mac microscope at 200x magnification It was expressed as a percentage of the total cross-sectional area of the glomerulus. The final overall value was calculated as the average of 100 glomerular values per group of rats.
  • FIGS. 3a and 3b plasma renin activity was lower in diabetic rats than in control rats, but 4-peptide administration had no effect on either control rats or diabetic rats.
  • FIG. 3b diabetic rats had lower plasma A I levels than control rats, but 4-peptide administration had no effect on either control rats or diabetic rats.
  • FIG. 3c diabetic rats had lower plasma All levels than control rats, but administration of p4 peptide had no effect on either control rats or diabetic rats.
  • Figure 3d diabetic rats had higher renal AI levels than control rats, and administration of p4-peptide suppressed this increase in renal AI levels in diabetic rats to the same level as control rats.
  • FIG. 3e diabetic rats had higher kidney All levels than control rats, and administration of p4-peptide suppressed this increase in renal levels in diabetic rats to the same level as control rats.
  • RNA was extracted from a part of the kidney of each group using a Rneasy Mini Kit (Qiagen).
  • Real-time quantitative RT-PCR analysis was performed using the TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Regents Kit with the ABI Prism 7700 HT Detection System (Applied Biosystems) using GAPDH as the internal standard for renin, ACE, and angiotensinogen. went.
  • the following primers and probes shown in SEQ ID NOs: 22 to 33 in the sequence listing) were used. Renin:
  • a 4-week-old male angiotensin II receptor gene-deficient (AT-KO) or wild-type (Wild) mouse was intraperitoneally administered with saline and streptozotocin 65 mg / kg, and the control (C) group, A diabetes (DM) group was created.
  • C control
  • DM diabetes
  • p4 peptide containing mouse prorenin profragment "handle" region was continuously subcutaneously injected into a part of the DM group using an osmotic minipump to prepare a DM + p4 group.
  • the osmotic pump was used for 28 days and was replaced every 28 days. Twenty-four weeks after the above treatment, the mice were decapitated and killed under anesthesia, the kidneys were removed, and the histopathology was examined by the PAS staining method described above.
  • AT-KO 9 ⁇ 0.3 der
  • AT-KO 9 ⁇ 0.3 der
  • AT-KO 9 ⁇ 0.3 der
  • Wild DM
  • DM + p 4 Wild
  • aT-KO DM + p 4
  • Tissue angiotensin II functions independently of circulating renin and angiotensin system (J Hypertens. 10: S13-S26, 1992), hypertension ⁇ (diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, Diabetic complications (including diabetic retinopathy) ⁇ Kidney disease-heart failure ⁇ Myocardial infarction ⁇ Cardiac hypertrophy ⁇ Cardiomyopathy ⁇ cerebrovascular disorder (J Am Soc Nephrol. 13: S173-S178, 2002). Subcutaneous administration of a tissue prorenin activation inhibitor significantly reduced tissue angiotensin II levels and completely suppressed diabetic nephropathy, one of the diabetic complications.
  • the tissue prorenin activation inhibitor according to the present invention may be used for various diseases related to increased angiotensin II production in tissues, such as hypertension (including diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, and diabetic retinopathy).
  • hypertension including diabetic nephropathy, diabetic neuropathy, and diabetic retinopathy.
  • myocardial infarction ⁇ cardiac hypertrophy
  • cardiomyopathy ⁇ cerebrovascular disorder ⁇ It is considered to be a drug that can be expected to suppress the onset of arteriosclerosis and the progress of the disease.
  • the subcutaneous administration of the tissue prorenin activation inhibitor comprises: The diabetic nephropathy was completely suppressed not only in wild-type mice but also in mice lacking the angiotensin II receptor gene. This indicates that renin, an angiotensin-dependent inhibitor, has been used for the above diseases.
  • the inhibitory factor for tissue renin activation of the present invention Compared with (ACE inhibitor, angiotensin II inhibitor), the inhibitory factor for tissue renin activation of the present invention also suppresses the unknown mechanism of action independent of renin-angiotensin, and suppresses the above-mentioned diseases. It is considered to be a drug that can be expected to prevent and treat. That is, the substance of the present invention provides a widely applicable prophylactic or therapeutic agent for not only tissue angiotensin II-dependent but also independent arteriosclerosis, cardiovascular disease and / or diabetic complications. Was.

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Abstract

本発明の課題は、新規な組織レニン・アンジオテンシン系の活性化を制御する手段並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療する手段を提供することである。プロレニンプロフラグメント領域における非酵素的プロレニン活性化を阻害する機能を有する物質を含む医薬を用いることによる。具体的には、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するペプチド又はその等価ペプチドを含む医薬を用いることにより組織内アンジオテンシンII産生亢進を制御することができるとともに、組織アンジオテンシンII産生亢進による又は組織内レニン・アンジオテンシン系を介さない動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療をすることができる。

Description

組織内アンジォテンシン II産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、 心 ·脳血 管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤
本出願は、 参照によりここに援用されるところの、 日本特許出願番号 特願 2003-43269号からの優先権明を請求する。 田
技術分野
本発明は組織内アンジォテンシン II産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、 心 ·脳血管疾患及び Z若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤に関 する。
背景技術
レニン■ アンジォテンシン系は、 生体において重要な調節系の中枢的 存在であり、 血圧、 水電解質代謝、 細胞増殖に深く関与することが知ら れている。 レニン , アンジォテンシン系には循環血中レエン · アンジ才 テンシン系と組織レニン · アンジォテンシン系があり、 前者は血圧や水 電解質バランスにおける急性の変化に対応し調節を行う系であり、 後者 は発生分化から増殖、 又は種々の病態において重要な役割を果たすこと が知られている。組織におけるレニン'アンジォテンシン系の活性化は、 組織中のアンジォテンシン IIの濃度を上昇させ、組織において増加した アンジォテンシン Πは、 特異的受容体を介して働き高血圧 · （糖尿病性 腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症を含む）糖尿病合併症、腎疾患、 心不全、 心筋梗塞■心肥大 ·心筋症 ·脳血管障害■動脈硬化の発症と進 展に深く関与している。 これら疾患に対し、 従来はアンジォテンシン II の産生酵素の阻害薬やアンジォテンシン II受容体拮抗薬が用いられてき たが、 エスケープ現象といわれるアンジォテンシン II又はアンジォテン シン II効果の再上昇によって、治療効果には限界が存在した。それゆえ、 病態の本質である組織アンジォテンシン II濃度の確実な抑制のためには、 根源である組織レニン■アンジォテンシン系の活性化を抑えることが最 重要である。 また、 上記従来のアンジォテンシン II産生酵素阻害薬等の 薬剤では、 組織レニン ■ アンジォテンシン系を介してしか動脈硬化症等 の疾患を治療することができず、 組織レニン · アンジォテンシン系非依 存性の未知の作用機構による動脈硬化症等の疾患を治療することはでき ないという限界も存在した。
レニンは主として腎臓において、 その前駆体である 4 0 6アミノ酸か らなるプレブ口レニン (pre-pro-renin) として生合成され、 N末端の 2 3 個のアミノ酸が切断されてプロレニンが生じ、 ついで 4 3個のアミノ酸 が N末端からさらに切断されて 3 4 0個のアミノ酸からなるレニンとな る。 レニンはアンジォテンシノーゲンを特異的に加水分解してアンジォ テンシン I (AI) を生成する蛋白質分解酵素である。 しかし、 レニンの 前駆体であるプロレニンは通常この酵素活性を示さない。 そのため、 プ 口レエンの血中存在量はレニンの約 1 0倍であるにもかかわらず、 レニ ン · アンジォテンシン系における作用物質はレニン、 又はプロレニンが 加水分解されて生じるレニンであると考えられてきた。
本発明者等は先に、 不活性型レニン前駆体プロレ-ンは、 プロレニン からレニンが生じる際に切断される N末端の 4 3個のアミノ酸断片 （以 下 「プロフラグメント」 又は 「； p f 」 とよぶ） を特異的に認識する抗体 とインビトロで結合して免疫複合体を形成すると、 生理的条件下で、 か つ一次構造が変化することなく非酵素的に、 蛋白機能すなわち酵素活性
(レニン活性） を発現することを、 抗ヒ トプロレニン p f 抗体を用いて 見い出した （特許文献 1〜2 )。 これまでにプロレニンを活性化する手段 として、 蛋白分解酵素によるレニンへの変換、 酸性及び低温状態で一次 構造の変化なしに活性化する方法 （非特許文献 1〜4 ) 及び低分子のレ ニン阻害剤をプロレニンの三次元構造の深い溝に隠れている酵素活性部 5 位に結合させて開放型とする方法（非特許文献 5 )などが知られている。
しかし、 生体内におけるプロレニン活性化のメカニズムならびにその作 用は、 未だ不明である。
(特許文献 1 ) 特開平 1 0— 2 7 9 6 0 0号公報
(特許文献 2 ) アメリカ合衆国特許第 5 9 4 5 5 1 2号
10 (非特許文献 1 ) Nature, 288, 702-705, 1980
(非特許文献 2 ) J. Biol. Chem" 262, 2472-2477, 1987
(非特許文献 3 ) Clin. Chem., 37, 1811-1819, 1991
(非特許文献 4 ) J. Biol. Chem., 267, 11753-11759, 1992
(非特許文献 5 ) J. Biol. Chem" 267, 22837-22842, 1992
丄
発明の開示
本発明の課題は、新規な組織内アンジォテンシン II産生亢進制御剤並 びに動脈硬化症、 心 ·脳血管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予 防又は治療剤を提供することである。
20 ここで、 糖尿病合併症とは糖尿病性腎症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性 網膜症等の公知の疾患を含むものである。
本発明者等は、 上記の事情を考慮して研究を進めた結果、 プロレニン プロフラグメント由来の部分ぺプチドを、組織内アンジォテンシン II産 生が亢進している病態モデル動物の一例として STZ 糖尿病病態モデル 25 動物に投与することにより組織レニン ·アンジォテンシン系の活性化を 制御しうることを見い出した。 この知見に基づいて、 生体内におけるプ 口レニンの活性化を制御する物質を用いることにより、 新規な組織内ァ ンジォテンシン II産生亢進制御剤を提供できることを見い出した。
また、 プロレユンプロフラグメント由来の部分ペプチドを、 糖尿病性 腎症が発症すると予測される病態モデル動物の一例である STZ 糖尿病 病態モデル動物及び STZ 投与アンジォテンシン受容体遺伝子欠損マウ スに投与することにより、 糖尿病に由来する腎糸球体硬化病変を抑制し うることを見い出した。 この知見に基づいて、 生体内におけるプロレニ ンの活性化を制御する物質を用いることにより、 新規な糖尿病性腎症の 発症予防又は治療剤を提供できることを見い出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明の態様は、
1 . プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によ つておこる、 一次構造変化を伴わない非酵素的プロレニン活性化を阻害 する機能を有する物質を含む以下から選ばれる用途に使用される医薬：
1 ) 組織内ァンジォテンシン II産生亢進制御剤；
2 )組織内アンジォテンシン II産生亢進により発症する動脈硬化症、心' 脳血管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤； 3 ) 組織内レニン . アンジォテンシン系を介さない動脈硬化症、 心 .脳 血管疾患及び Z若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤、
2 . 前記物質がレニン阻害活性を保持しない前項 1の医薬、
3 . 前記物質がプロレニンのプロフラグメント領域のァミノ酸配列から 選択される部分配列を有するぺプチド又はその等価べプチドからなる前 項 1又は 2の医薬、
4 . 前記部分配列が、 プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配 列から選択される連続した 3個から 1 0個の部分配列である前項 3の医 薬、
5 . プロレニンのプロフラグメント領域のァミノ酸配列から選択される 部分配列を有する前記ペプチドが、 配列表の配列番号 7から 1 4、 及ぴ 配列番号 2 1に記載のぺプチドから選択されるぺプチドである前項 3の 医薬、
6 . プロレニンのプロフラグメント領域のァミノ酸配列から選択される 部分配列を有する前記ペプチドが、 配列表の配列番号 3、 配列番号 4、 及ぴ配列番号 1 5から 2 0に記載のぺプチドから選択されるぺプチドで ある前項 3の医薬、
7 . 前記物質が、 プロレユンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列の 情報から設計される低分子化合物である前項 1又は 2の医薬、
8 . プロレニン活性化を阻害する前記機能が、 プロレニンのプロフラグ メント領域における蛋白質間相互作用の拮抗作用によるものである前項 1〜 7のいずれか 1の医薬、
9 . プロレニン活性化を阻害する前記機能が、 プロレニンのプロフラグ メント領域に対する特異的結合蛋白とプロレニンとの相互作用を阻害し てプロレニン活性化を生体内で阻害することを特徴とする前項 1〜8の いずれか 1の医薬、
1 0 . 前項 1〜 9のいずれか 1の医薬のスクリ一ユング方法。 図面の簡単な説明
図 l aは、 p 4ぺプチド投与による糖尿病マウスの体重への影響を示 す。 図 l bは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの血圧への影響を 示す。 図 1 cは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの血中ダルコ一 ス量への影響を示す。
図 2 aは、 p 4ぺプチド投与による糖尿病マウスの尿蛋白排出量への 影響を示す。 図 2 bは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの腎糸球 体障害への影響を PAS法を用いて示す。 図 2 cは、 p 4ペプチド投与に よる糖尿病マウスの腎糸球体障害への影響を Type IVコラーゲン染色法 を用いて示す。 図 2 dは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの腎糸 球体障害率への影響を示す。
図 3 aは、 p 4ぺプチド投与による糖尿病マウスの血漿レニン活性へ の影響を示す。 図 3 bは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの血漿 アンジォテンシン I量への影響を示す。 図 3 cは、 p 4ペプチド投与に よる糖尿病マウスの血漿アンジォテンシン II量への影響を示す。 図 3 d は、 ρ 4ぺプチド投与による糖尿病マウスの腎臓アンジォテンシン I量 への影響を示す。 図 3 eは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの腎 臓アンジォテンシン IIへの影響を示す。 図 3 f は、 p 4ペプチド投与に よる糖尿病マウスの腎臓レニン mRNAレベルへの影響を示す。図 3 gは、 p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓 ACE mRNA レベルへの影 響を示す。 図 3 hは、 ； p 4ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓アン ジォテンシノーゲン mRNA レベルへの影響を示す。
図 4 aは、 p 4ペプチド投与によるアンジォテンシン II受容体欠損の 糖尿病マウスの腎糸球体障害への影響を示す。 図 4 bは、 p 4ペプチド 投与によるアンジォテンシン II受容体欠損の糖尿病マウスの腎糸球体障 害率への影響を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳しく説明するが、 本明細書中で使用されている技術 的及ぴ科学的用語は、 別途定義されていない限り、 本発明の属する技術 分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。 本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。 そのよう な引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、 それらを引 用することにより本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているも のとして導入される。
本発明者等は、 ラットプロレニンをインビトロで活性化し得る上記抗 ラット P f 抗体の抗原である、 ラットプロレニンプロフラグメント由来 の部分べプチドを合成して STZラットに投与した。 これらのぺプチドは、 ヒ ト p f ぺプチドが抗ヒ ト p f 抗体によるインビトロでのヒ トプロレニ ン活性化を阻害するのと同様に、 抗ラット p ί抗体によるインビトロで のラットプロレニン活性化を拮抗阻害できる。 すなわちこれらのぺプチ ドは、 蛋白質間相互作用によっておこる、 ラッ トプロレニンの一次構造 変化は伴わないが高次構造変化を伴う活性化を阻害できる。 STZラット にこれらのぺプチドを投与すると、 実験例 1及び 2に示すように腎臓内 アンジォテンシン IIの減少に有意の効果が得られた。 しかし、 正常ラッ トにこれらのぺプチドを投与してもアンジォテンシン IIは変動しなかつ た。 また実験例 2及び 3に示すように、 上記ペプチドを投与すると、 投 与されていない STZ ラットにおいて著明である腎糸球体硬化病変が抑 制され、 正常ラットにほぼ近い状態になった。 上記ペプチドの投与で得 られるこれらの効果は、 上記べプチドにより、 生体内におけるラッ トプ ロレニンの蛋白質間相互作用による構造変化を伴う活性化が阻害される ことにより、 又はラットプロレニンもしくは活性化されたラッ トプロレ ニンとその作用部位との結合が阻害されることにより得られたものと推 測される。
以上の結果から、 STZラッ トではプロ レニンが、 プロレニン結合性蛋 白質と相互作用することにより糖尿病合併症を発症している可能性が示 唆された。 プロレニンの： f ペプチドは、 レニン ■ アンジォテンシン系 が活性化されることによる組織内アンジォテンシン II産生亢進を制御す るとともにレニン ' アンジォテンシン系非依存性の経路を制御し、 例え ば糖尿病合併症等の種々の疾患に対して、 予防治療作用を示すことが判 明した。
ラットプロレニンの p f ぺプチドはヒ トプロレニン； p f ぺプチドとァ ミノ酸残基数は同じであるが構成アミノ酸が異なる。それにも拘わらず、 上記のように、 インビトロでヒ トプロレニンを活性化し得る抗ヒ p f 抗体のェピトープペプチドであるヒ ト！） f ペプチドと一次構造上のアミ ノ酸配列順序において同一部位のラット p f ペプチドが、 STZ投与ラッ ト高血糖病態モデルでアンジォテンシン II減少効果及ぴ糖尿病性腎症の 抑制効果を示した。 従って、 組織内アンジォテンシン II産生亢進に関与 するプロレニンの薬理作用、 プロレエン活性化に係わるその構造上の部 位、 及びその活性化のメカェズムには種差がないといえる。 つまり、 上 記ぺプチドのアンジォテンシン II減少効果はラット病態モデル動物で認 められたものであるが、 ヒ トプロレニンの！ f ぺプチドのァミノ酸配列 を考慮して適当なペプチドを選択することにより、 むろんヒ トの組織内 アンジォテンシン II産生亢進性疾患、例えば糖尿病合併症においても同 様の効果を期待できる。
(プロレニン活性化を阻害する物質の選別方法）
本発明に係るプロレニン活性化を阻害する物質の選別方法は、 プロレ ニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によるプロレニ ン活性化の調節能を指標として行うことを特徴とする。 ここで、 プロレ ユンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によるプロレニ ン活性化とは、 p f 領域における蛋白質間相互作用により生じる、 プロ レニンの一次構造変化は伴わないが高次構造変化を伴う酵素活性部位の 開放を意味する。 従って、 該蛋白質間相互作用により活性化されたプロ レニンは、 活性化される前のプロレニンの一次構造と同一のァミノ酸配 列は保持しているが、 レニン様の酵素活性を示し得るものである。 p f 領域における蛋白質間相互作用を有する蛋白質としては、 p f ペプチド を認識して活性化する抗体、 生体内におけるプロレ-ン又は活性化した プロレニンの作用部位である蛋白質、 及びプロレニンと相互作用してこ れを活性化させ得る蛋白質などが例示される。
上記プロレニン活性化を阻害する物質の選別方法は、 自体公知の医薬 品スク リーニングシステムを利用して構築可能である。 例えば、 プロレ ニンとプロレニンを活性化し得る抗 p f 抗体とを用いて、 プロレエンと 該抗 P f 抗体の結合を測定することにより、 プロレニン活性化を阻害す る物質を選別できる。 また、 例えば、 プロレニンとプロレニンを活性化 し得る抗 p f 抗体とを用いて、 活性化されたプロレユンの酵素活性を測 定することにより、 プロレニン活性化を阻害する物質、 又はプロレニン の酵素活性を阻害する物質を選別できる。 むろん、 選別方法はこれらに 限定されない。 また、 上記のように、 プロレニン p ί領域のアミノ酸配 列の構成ァミノ酸は種により異なるため、 ヒ トプロレニン活性化制御物 質の選別は、 ヒ トプロレニンと、 例えばヒ トプロレニンの p f ぺプチド に対する抗体とを用いて行うことが好ましい態様の 1つである。
具体的には例えば、 特開平 1 0 - 2 7 9 6 0 0号公報及びァメリ力合 衆国特許第 5 9 4 5 5 1 2号の記載に準じて調製した、ヒ トプロレニン、 及びヒ トプロレニン P f ぺプチドを特異的に認識してヒ トプロレニンを 活性化し得る抗体を利用して、 スクリーユングシステムを構築できる。 上記プロレユン活性化を阻害する物質の選別方法で、 選別される対象 となる物質としては、 低分子化合物、 天然物由来の化合物、 又はぺプチ ドなど、 自体公知の医薬品スクリーユングシステムで使用している選別 の対象となる候補物質を広く利用できる。
また、 プロレエンとくにヒ トプロレニンの p f 領域のアミノ酸配列情 報を基にして設計されるぺプチド及び低分子化合物も選別される対象と することができる。 ヒ トプロレニンの； p f 領域のアミノ酸配列は既知であり、 特開平 8— 28 5 8 5 2に示す 4 3個のアミノ酸配列 （配列表の配列番号 1 ) から なる。 プロレニンの： p f ペプチドのアミノ酸配列は、 プロレニン活性化 制御物質を選別する対象となる物質の設計に有用な情報となる。 とくに プロレニン p f 領域の N末端より 1番目〜 1 9番目 （p f 1 - 1 9)、 と りわけ 5番目〜 1 9番目 （p f 5 - 1 9)、及ぴ 2 7番目〜 4 1番目 （p f 2 7-4 1 ) のァミノ酸配列の、 少なく とも 3個、 より好ましくは少 なくとも 4個の連続するアミノ酸配列の情報は、 プロレニン活性化制御 物質の設計のために有用である。 ヒ ト由来 P f 1— 1 9、 ヒ ト由来 p f 5— 1 9、 ヒ ト由来 p f 2 7_ 4 1、 ラット由来 p f l _ 1 9、 ラット 由来 p f 5 _ 1 9、 及びラット由来 p ί 2 7— 4 1のアミノ酸配列は、 それぞれ配列表の配列番号 2、 3、 4、 6、 7、 及び 8に示す。 以下、 p f 領域の N末端より例えば M番目〜 N番目のぺプチドを、 f M-N と記載する。
上記のように、 プロレニン p f 領域のアミノ酸配列は種が異なっても ァミノ酸残基数は同一であるがその構成ァミノ酸が異なる。実験例では、 ラットプロレニンの p f ぺプチドのアミノ酸配列（配列表の配列番号 5 ) を、 プロレニン活性化制御物質を選別するための対象物質の設計に有用 な情報として例示した。 実施例では、 ラットプロレニン p f 領域のアミ ノ酸配列断片である、 p f 1 - 1 1 (配列表の配列番号 9)、 p f 5 - 1 9 (配列表の配列番号 7)、 p f 1 - 4 (配列表の配列番号 1 0)、 p f 1 - 7 (配列表の配列番号 1 1 )、 p f 5— 1 1 (配列表の配列番号 1 2)、 P f 1 2 - 1 9 (配列表の配列番号 1 3 )、 p f 1 1— 1 5 (配列表の配 列番号 1 4)、 及び p f 2 7 -4 1 (配列表の配列番号 8) を合成し、 そ れらのプロレニン活性化抑制によるアンジォテンシン II減少効果を確認 したが、 必ずしもこの配列に限定されない。 当業者であれば、 自体公知 の手法により、 適宜少なく とも 3個のペプチドを合成し、 その合成ぺプ チドをもとに選別の対象となる物質を設計し合成できる。
なお、 ラット p f ペプチドと一次構造上のアミノ酸配列順序が同一の ヒ トプロレニン; p f ぺプチドが、 ヒ トにおいて同様の効果をもたらすこ とは容易に推定できる。 好ましい態様の 1つとして、 ヒ トプロレエンの p f ペプチドを、 選別の対象となる物質を設計するための情報とする。 選別の対象となる物質は、 ペプチドであれば、 上記のようにプロレニ ン: p f 領域のアミノ酸配列の情報をもとに適宜設計され、 選択のために 提供され得る。 該ぺプチドを構成するアミノ酸は、 必ずしもプロレニン p f 領域のアミノ酸配列と同一である必要はなく、 該ペプチドと同様の 機能を有するものであれば、該ぺプチドのァミノ酸配列に、適宜、欠失、 置換、付加、揷入などの変異を導入したぺプチドであってもよい（以下、 等価ぺプチドと呼ぶこともある）。
また、 選別の対象となる物質は、 p f 領域のアミノ酸配列の二次及ぴ Z又は三次構造に基づく情報により、 その構造的相補性をもとにしてド ラッグデザィンした低分子化合物であつてもよい。
p f 領域のアミノ酸配列から選択された部分配列を有するペプチド、 既知の糖尿病治療予防剤などをもとに情報を集積し、 また動物モデルを 使用した実験などにより、 得られた物質から、 組織内アンジォテンシン II産生亢進制御効果を有する物質並びに動脈硬化症、 心■脳血管疾患及 び Z若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤を選択できる。
(プロレニン活性化を阻害する物質）
かく して本発明は、 プロレニンの p f 領域における蛋白質間相互作用 に基づくプロレニン活性化を阻害し得るプロレニン活性化を阻害する物 質からなる組織内ァンジォテンシン II産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、 心 ·脳血管疾患及び Z若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤を提 供する。
本発明の 1つの態様は、 ヒ トプロレニン活性化を阻害し得るプロレニ ン活性化阻害物質からなる組織内アンジォテンシン II産生亢進制御剤で ある。
本発明のもう 1つの態様は、 ヒ トプロレニン活性化を阻害し得るプロ レニン活性化阻害物質からなる動脈硬化症、 心 ·脳血管疾患及び Z若し くは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤である。
本発明に係るプロレニン活性化阻害物質は、 プロレニンを活性化する 蛋白質間相互作用を競合的に阻害するもの、 プロレ-ンもしくは活性化 されたプロレニンの作用部位において拮抗的にその結合を阻害するもの、 又はプロレニンもしくは活性化されたプロレエンの作用部位に作用し、 プロレニンもしくは活性化されたプロレエンの作用を阻害するものなど であり得る。
上記プロレニン活性化阻害物質が、 プロレユンの p f 領域における蛋 白質間相互作用に基づくプロレニン活性化を阻害する機能を有し、 かつ レニン阻害活性のないプロレユン活性化阻害物質であることは好ましい 態様の 1つである。 すなわち、 上記プロレニン活性化阻害物質は、 その 作用メカニズムとしてレニンへの直接的な阻害作用を示さない。 そのた め、 生体の生命維持機構に重要な役割を担っているレニン · アンジォテ ンシン系をレエン阻害剤などの様に阻害することなく、 病態時に活性化 するプロレニンの活性化を阻害できる。 このことは本発明に係るプロレ ニン活性化阻害物質からなる組織内アンジォテンシン II産生亢進制御剤 の重要な特徴である。
具体例としては、 プロレユン p f 領域のアミノ酸配列から選択される 部分配列を有するぺプチド、 該ぺプチドの等価ぺプチド、 及びプロレニ ン： p f 領域のアミノ酸配列の情報から設計される低分子化合物などが挙 げられるが、 これらに限定されない。
好ましい態様の 1つとして、 上記ペプチドはヒ トプロレエン！ f 領域 のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するぺプチド又は該ぺプチ ドの等価ペプチドである。 例えば、 ヒ トプロレニン p f 領域のアミノ酸 配列に由来するペプチドとして、 以下のペプチドを例示できる。
h P 1 ： ： ヒ トプロレニン P f 1一 1 1 (配列表の配列番号 1 5 ) h P 2 ； ； ヒ トプロレニン P f 5 ― 1 1 (配列表の配列番号 1 6 ) h P 3 ： ： ヒ トプロレニン P f 5 ― 1 9 (配列表の配列番号 3 )
h P 4 ： ； ヒ トプロレニン P f 1 ― 4 (配列表の配列番号 1 7 )
h P 5 ： ： ヒ トプロレニン P f 1一 7 (配列表の配列番号 1 8 )
h P 6 ： ヒ 1、プロレニン: f 1 2 ― 1 9 (配列表の配列番号 1 9 ) h P 7 ： ヒ トプロレニン P f 1 1 1 5 (配列表の配列番号 2 0 ) h P 8 ： ヒ トプロレニン P f 2 7 4 1 (配列表の配列番号 4 ) プロレニン活性化を制御するとき、これらのぺプチドのうち 1種類を使 用してもよく、 2種類以上を混合して使用することもできる。
(製剤化）
本発明の組織内ァンジォテンシン II産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、 心■脳血管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤の製 剤化には、 ぺプチド又は低分子化合物の物性に応じて適宜公知の方法が 適用できる。 例えば、 錠剤、 カプセル製剤、 水溶液製剤、 エタノール溶 液製剤、 リボソーム製剤、 脂肪乳剤、 シクロデキス トリンなどの包接体 などの製剤化方法が利用できる。
散剤、 丸剤、 カプセル剤及び錠剤は、 ラタ トース、 グルコース、 シュ 一クロース、 マンニトールなどの賦形剤、 澱粉、 アルギン酸ソーダなど の崩壊剤、 マグネシウムステアレート、 タルクなどの滑沢剤、 ポリビニ ノレァノレコーノレ、ヒ ドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、 脂肪酸エステルなどの界面活性剤、 グリセリンなどの可塑剤などを用い て製造できる。 錠剤やカプセルを製造するには、 固体の製薬担体が用い られる。
懸濁剤は、 水、 シユークロース、 ソルビトール、 フラク トースなどの 糖類、 P E Gなどのグリコール類、 油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、 塩溶液、 グルコース溶液又は、 塩水とグルコース溶 液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リボソーム化は例えば、 リン脂質を有機溶媒 (クロロホルムなど) に 溶解した溶液に、 当該物質を溶媒 (エタノールなど) に溶解した溶液を 加えた後、 溶媒を留去し、 これにリン酸緩衝液を加え、 振盪、 超音波処 理及び遠心分離した後、 上清を濾過処理して回収することにより行い得 る。
脂肪乳剤化は例えば、 当該物質、 油成分 (大豆油、 ゴマ油、 ォリーブ 油などの植物油、 M C Tなど）、 乳化剤 （リ ン脂質など） などを混合、 加 熱して溶液とした後に、 必要量の水を加え、 乳化機 （ホモジナイザー、 例えば、 高圧噴射型、 超音波型など） を用いて、 乳化 ·均質化処理して 行い得る。 また、 これを凍結乾燥化することも可能である。 なお、 脂肪 乳剤化するとき、 乳化助剤を添加してもよく、 乳化助剤としては、 例え ば、 グリセリン、 糖顆 (例えば、 ブドウ糖、 ソルビトール、 果糖など） が例示される。
シクロデキストリン包接化は例えば、 当該物質を溶媒 （エタノールな ど） に溶解した溶液に、 シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶 液を加えた後、 冷却して析出した沈殿を濾過し、 滅菌乾燥することによ り行い得る。 この際、 使用されるシクロデキス ト リ ンは、 当該物質の大 きさに応じて、 空隙直径の異なるシクロデキストリン （α、 β、 γ型） を適宜選択すればよい。 本発明の組織内アンジォテンシン π産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、 心 ·脳血管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤の投 与量は、 患者の病状、 性別、 年齢、 体重に応じて適宜選択できる。 投与 経路としては、経口、非経口のいずれでもよい。好ましい態様の 1つは、 経口剤の形態となし、 経口投与することである。 その投与量としては、 1 日当たり、 1〜 1 , 000 μ g程度が例示される。 実施例
以下、 実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は これらに限定されるものではなく、 本発明の技術的思想を逸脱しない範 囲内で種々の応用が可能である。 実施例 1
(ラットプロレユン p f 領域由来のぺプチドの作成）
ラッ トプロレニンの p f 領域の配列に由来する下記ペプチドを固相法 により常法どおり合成した。
1 ： p f 1 - 1 1 (配列表の配列番号 9)
p 2 ： p f 5 - 1 9 (配列表の配列番号 7)
P 3 ： p f 2 7 - 4 1 (配列表の配列番号 8)
1 a ： p f 1 - 4 (配列表の配列番号 1 0 )
p 1 b ： p f 1 - 7 (配列表の配列番号 1 1 )
p l c : p f 5 - l l (配列表の配列番号 1 2)
p 2 a : p f l 2 - 1 9 (配列表の配列番号 1 3 )
p 2 b : p f l l - 1 5 (配列表の配列番号 1 4)
また、 ： p 1、 p 2、 及び！） 3を等量混合し、 Pm i Xとした。 実施例 2
(ラットプロレニン； p f 領域由来のぺプチド] p 4の作成）
ラットプロレニンの p f 領域の配列に由来する下記べプチド p 4を固 相法により常法どおり合成した。
p 4 : p f l 0 - 1 9 (配列表の配列番号 2 1 )
このぺプチド p 4は" handle"領域と呼ばれる p f 領域の 1 1番目〜 1 5 番目までのぺプチド配列を含有し、 この" handle"領域は非酵素的プロレ ニンの活性化に重要な役割を担うと考えられている。 (実験例 1 )
( p f ベプチド (実施例 1 )によるアンジォテンシン II減少効果の検討) 組織中には、 組織 (プロ) レニンに結合しその活性化を起こすレニン 受容体が存在する ( J Clin Invest. 109: 1417-1427,2002) 0 レニン受容体と の結合部位に相当する （プロ） レニンのアミノ酸配列に相似したァミノ 酸配列を持ったペプチド （組織プロレニン活性化阻害因子） を上記実施 例 1により合成し、組織内アンジォテンシン II産生亢進病態モデルラッ トへ投与し組織ァンジォテンシン II濃度を測定した。 このようなぺプチ ドはレニン受容体に結合し、 （プロ）レニンとレニン受容体との結合を阻 害するいわばデコイのような働きをし、 結果としてレニン ·アンジォテ ンシン系の活性化は抑制され組織ァンジォテンシン II濃度は低下するこ とが予想された。
組織内アンジォテンシン II産生亢進制病態モデルの代表として、雄性 Sprague-Dawleyラッ ト（100-150 g)にス トレプトゾトシン（STZ) 65 mg/kg を腹腔内投与した高血糖モデルラットを作成した。 さらに組織プロレニ ン活性化抑制因子を、 浸透圧ミニポンプを用い、 0.1，1, 10 mg/kg/dayの投 与速度で 1力月間皮下投与した。 対照ラットには、 浸透圧ミエポンプを 用いて生理食塩水を以下 1 力月間皮下投与した。 1 力月後、 無麻酔断頭 屠殺し摘出腎臓内アンジォテンシン Iとアンジォテンシン IIを測定した。 ホモジネートした腎臓抽出物におけるアンジォテンシン I とアンジォ テンシン IIは、 従来の報告 (Hypertension.27:658-662, 1996) のように、 固相抽出法とラジオィムノアツセィを組み合わせて測定した。 抽出した 腎臓は、 被膜を剥離した後に重量を測定し、 5ml氷冷メタノール入りの シンチレーションバイアルに入れ組織粉碎器でホモジネートした後、 3,000 回転 4 °C 1 0分遠心し上清を回収した。 この上清をバリアン社製 C18逆相ボンドエル一トカラム ( 1210-2032) で抽出した後、 エバポレー タでメタノールを除き、 アンジォテンシンアツセィ用バッファ一で検体 を再構築した。 この検体に含まれるアンジォテンシン I とアンジォテン シン II濃度は、 1251-アンジォテンシン I、 1251-アンジォテンシン II (NEN ライフサイエンス社、 EX-105) と抗アンジォテンシン I抗体、 杭アン ジォテンシン II抗体 (フェニックス薬品、 RAB-002-12) 用いラジオィム ノ了ッセィで測定した。
統 こ ί 、 one-way factorial ANOVA and multiple comparison tests ¾r用 ヽ、 Pく 0.05を有意差ありと判定した。
(結果）
表 1に示すように、 STZ投与高血糖ラットにおける腎臓内アンジォテ ンシン Iは 129.3 ± 56.1 fmol/gであり、 アンジォテンシン IIは 147± 12.1 pg/g であった。 同モデルラッ トを組織プロ レエン活性化抑制因子 0.1mg/kg/dayで同時に治療した群における腎臓内アンジォテンシン Iは 76.2土 41 fmol/gであり有意ではないものの減少傾向を示し、 腎臓内アン ジォテンシン IIは 77.2± 8.3 pg/gと有意に減少した。 また、 同モデルラ ットを組織プロレ二ン活性化抑制因子 1 mg/kg/dayで同時に治療したラ ットにおける腎臓内ァンジォテンシン Iは 14.6 fmol/gであり減少傾向を 示し、 腎臓内アンジォテンシン IIも 89 pg/gと減少傾向を示した。 同モ デルラットを組織プロレニン活性化抑制因子 10 mg/kg/dayで同時に治療 した群における腎臓内アンジォテンシン Iは 58.3 ± 15.9 fmol/gであり有 意ではないものの減少傾向を示し、 腎臓内アンジォテンシン IIは 73.7土 11.8 pg/gと有意に減少した。
Figure imgf000020_0001
(実験例 2 )
( p 4ぺプチドによる糖尿病性腎症の発症■進展の抑制効果の検討） 雄性 Sprague-Dawleyラット （体重 100~ 150g) の左の腎臓を摘出し、 半分腎臓が摘出されたラットを作成した。 これらのラットの 4週令に、 生理食塩水、 ストレプトゾトシン 65mg/kgを腹腔内投与し、 それぞれ対 照群 (C)、 糖尿病群 (DM)を作成した。 さらに各群の一部に実施例 2によ り合成した p 4ぺプチドを浸透圧ミ -ポンプを用いて持続皮下注し (0.1 mg/kg)、 C+p4群、 DM+p4群を作成した。 浸透圧ミニポンプは 28 曰 間用のものを用いて 28 日毎に入れ替えた。 ラットの 12,20,28週令に各 群について 6匹のラットを無麻酔下で断頭堵殺し、 血液と右の腎臓を摘 出し以下の実験例 2— 1〜4を行った。
(統計分析）
グループ内の統計比較は、 Newman-Kelus post hoc試験に従って複数回 の測定値に対して one-way ANOVAによりおこなつた。 二つのグループ 間の差は Newman-Kelus post hoc試験で組み合わされた複数回の測定値 に対して two-way ANOVAにより評価した。 Pく 0.05を有意差ありと判 定した。 データは平均土 SEMとして示した。
(実験例 2 - 1 )
( p 4によるラットの代謝に対する影響の検討)
4， 8, 12, 16, 20, 24, 28週令のラットの体重、動脈の収縮期圧、及び血中 グルコース濃度を測定した。 収縮期圧はティルカッ トプレスチモグラフ ィ一により測定した。 血液は尾の静脈から回収しダルコース量をダルコ ース C試験キット (和光純薬工業) で分析した。
(結果）
実験例 2 - 1の結果を図 1 a〜 cに示す。 図 1 aに示すように、 糖尿 病ラッ トにおいては体重増加の抑制が著しかった。 p 4ペプチド投与群 では糖尿病ラットの 24及び 28週令において体重増加を引き起こしたが、 それ以外は対照ラットにおいても糖尿病ラットにおいても全く影響は見 られなかった。 図 1 bに示すように収縮期圧は糖尿病ラットにおいても 対照ラットにおいても差はなく、 p 4ペプチド投与による影響も見られ なかった。 図 l cに示すように、 血中グルコース濃度は糖尿病ラットに おいて著しく上昇したが、 p 4ぺプチド投与による影響は全くみられな かった。
*は C群と DM群との間で有意差があることを示す。 +は p4処理あ りの群と p4処理なしの群との間で有意差があることを示す。
(実験例 2— 2 )
( p 4によるラットの尿蛋白排出に対する影響、 及び腎糸球体の形態学 的、 免疫組織学的変化）
24時間代謝ケージにあるラットの尿を瓶に集め、尿蛋白質排出及びク レアチニンを Micro TP試験キッ ト (和光純薬工業) とクレアチニン HA 試験キット （和光純薬工業） で測定した。
各群のラットから除去した腎臓の一部をリン酸緩衝液中の 10%ホルマ リ ンで固定した。 パラフィン包埋切片を過ヨウ素酸-シッフ法 (PAS法) で染色した。
免疫組織学的染色にあたり、 パラブインのない切片を蛋白質分解酵素 Kで前処理し、 その切片をタエン酸緩衝液中で電子レンジで沸騰させ、 抗原性部位を露出させ、 内因性のビォチンを Biotin Blocking System (ダ ココーポレーション ： X0590) でブロックした。 次に、 切片をメタノー ル中の 3 % ¾02に浸して内因性のペルォキシダ一ゼを阻害し、 リン酸緩 衝液生理食塩水中の 1 %無脂肪乳で満たして非特異的結合をブロックし た。 ゥサギポリクローナル抗体 (Type IVコラーゲンの抗 a2 (IV), 抗 & 4 (IV)、 抗 a5 (IV) 鎖） のカクテル (Beth Israel Deaconness Medical Center, Center for Matrix Biology, Raghuram Klluri博士より提供） を第一抗体とし て切片に付与し、 第 2抗体としてのビォチン結合抗ゥサギ IgG抗体で切 片をインキュベートした。 抗体反応を製造者の指示に従って Vectastatin ABC標準キット （ベクターラボラトリーズ） と AEC標準キット （ダコ コーポレーション） で可視化した。 200倍の倍率で Mac顕微鏡により各 糸球体の免疫反応性 Type IVコラーゲンポジティブ領域を定量的に測定 し、 それを糸球体の全断面領域の百分率として表した。 最終的な総合値 をラットの群あたり 100糸球体の値の平均として計算した。
(結果）
実験例 2— 2の結果を図 2 a 〜 dに示す。 図 2 aに示すように、 糖尿 病ラットにおいては尿蛋白の排出が著しく増加し、 p 4ペプチド投与は 糖尿病ラットにおけるこの尿蛋白の排出の開始と進行を抑制した。 図 2 bに示すように、糖尿病ラットにおいては 20週令以後で糖尿病性腎糸球 体硬化の発症と進展が著明であるが、 P 4ぺプチド投与は糖尿病ラット におけるこの糖尿病性腎糸球体硬化の発症を抑制した。 図 2 cに示すよ うに、 糖尿病ラットにおいては 20週令以後で腎糸球体 Type IV コラー ゲンが増加するが、 4ペプチド投与は糖尿病ラッ トにおける腎糸球体 Type IV コラーゲン増加を抑制した。 図 2 dに示すように糖尿病ラット においては 28週令で腎糸球体 Type IV コラーゲンポジティブ領域が増 加し、 これは p 4ペプチド投与により阻害された。
*は C群と DM群との間で有意差があることを示す。
(実験例 2 - 3 )
( p 4によるラッ トァンジォテンシン I ( A I) とアンジォテンシン II ( A II) のべプチド量に対する影響)
各群のマウスを断頭堵殺した直後に 3 mlの血液を 30 μ \の EDTA ( 500 mM)、 15 μ ΐ の enalaprilat (1 mM)ヽ 30 μ \ の ο-フエナンス口リン（24.8 mg/ml)及びぺプスタチン (0.2 mM)の入つた試験管に集めた。 その後遠心 分離して血漿試料を得た。 血漿レニン活性は radioimmunoassay coated-bead kit (ダイナポットラジオアイソトープィンスティテュート） で測定した。 除去した腎臓の半分の重さを測定し、 氷冷メタノール ( 10%w/v)中に置き、冷えたガラスホモジナイザーで磨砕し、遠心した。 上清を乾燥させて、 1%アルブミンを含むリン酸ナトリウム緩衝液 （50 mmol/1) 4 ml中に懸濁した。血漿及び腎臓からの試料をボンドエル一ト カラムに通して抽出し、 抽出液を蒸発させて乾燥し、 アンジォテンシン ぺプチド分析希釈液に溶かした。 AIおよび ΑΠはゥサギ抗 AI抗血清お よびゥサギ抗 All抗血清を用いてラジオィムノアッセィによって定量的 に測定した。
(結果）
実験例 2 _ 3の結果を図 3 a〜 eに示す。 図 3 aに示すように糖尿病 ラットにおいては対照ラットに比べて血漿レニン活性は低かったが、 4ぺプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を 与えなかった。 図 3 bに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラッ ト に比べて血漿 A I レベルは低かったが、 4ぺプチド投与は対照ラッ ト 及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。 図 3 cに示す ように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比べて血漿 All レベルは低 かったが、 p 4ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれに も一切影響を与えなかった。 図 3 dに示すように糖尿病ラットにおいて は対照ラットに比べて腎臓 AI レベルが高く、 p 4ぺプチド投与は糖尿 病ラットにおけるこの腎臓 AI レベルの上昇を対照ラットと同じレベル にまで抑制した。 図 3 eに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラッ トに比べて腎臓 All レベルが高く、 p 4ぺプチド投与は糖尿病ラットに おけるこの腎臓 ΑΠ レベルの上昇を対照ラッ トと同じレベルにまで抑制 した。
*は C群と DM群との間で有意差があることを示す。 +は p4処理あ りの群と p4処理なしの群との間で有意差があることを示す。
(実験例 2— 4 )
( p 4によるラッ トの腎臓レニン、 アンジォテンシノーゲン変換酵素 (ACE)、 アンジォテンシノ一ゲン mRNAに対する影響の分析） Rneasy Mini Kit (キアゲン株式会社） で各群の腎臓の一部から総 RNA を抽出した。 リアルタイム定量的 RT-PCR 分析を TaqMan One- Step RT-PCR Master Mix Regents Kitを用いて ABI Prism 7700 HT Detection System (アプライ ドバイオシステムズ） で、 レニン、 ACE、 アンジォテ ンシノーゲンに関して内部標準に GAPDHを用いて行った。 以下の各プ ライマーとプローブ（配列表の配列番号 2 2から 3 3に示す）を用いた。 レニン：
forward 5 '-GCTAC ATGGAGAATGGG ACTG AA-3 ' (配列番号 2 2 ) reverse 5'-ACCACATCTTGGCTGAGGAAAC-3' (配列番号 2 3 ) probe 5'-FAM-CCATCCACTATGGATCAGGGAAGGTCAA-TAMRA-3'
(配列番号 2 4 )
ACE：
Forward 5'-CTGCCTCCCAACGAGTTAGAA-3' (配列番号 2 5 ) reverse 5 '-CGGGACGTGGCCATTATATT-3' (配列番号 2 6 )
probe 5'-FAM-AAATGGCACTTGTCTGTCACTGGAGCC-TAMRA-3'
(配列番号 2 7 ) アンジォテンシノーゲン：
forward 5'-AGCACGGACAGCACCCTATT-3' (配列番号 2 8 )
reverse 5'-AGAACTCATGGAGCCCAGTCA-3' (配列番号 2 9 )
probe 5 '-FAM-TC AAC ACCTACGTTC ACTTCC AAGGGA AGA-TAMRA-3 '
(配列番号 3 0 )
GAPDH：
forward 5'-TGACAACTCCCTCAAGATTGTCA-3' (配列番号 3 1 ) reverse 5， -GGCATGG ACTGTGGTC AT GA-3 ' (配列番号 3 2 )
probe 5'-FAM-TGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-TAMRA-3'
(配列番号 3 3 ) (結果）
実験例 2 _ 4の結果を図 3 f 〜hに示す。 図 3 f に示すように糖尿病 ラッ トにおいては対照ラッ トに比較して 20 週令までは腎臓レニン mRNAレベルが低かったが、 p 4ぺプチド投与は対照ラット及ぴ糖尿病 ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。 図 3 gに示すように対照 ラット及ぴ糖尿病ラットの両方において 28週令で腎臓 ACE mRNAのレ ベルは低下したが、 p 4ぺプチド投与は対照ラット及ぴ糖尿病ラットの いずれにも一切影響を与えなかった。 図 3 hに示すように、 対照ラット 及び糖尿病ラットの両方において、 加齢に伴い腎臓アンジォテンシン mRNAレベルが低下したが、 4ぺプチド投与は対照ラット及び糖尿病 ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。
*は C群と DM群との間で有意差があることを示す。
(実験例 3 )
( p 4によるアンジォテンシン II非依存性機序の糖尿病性腎症の発症 · 進展抑制効果の検討）
4週令雄のアンジォテンシン II受容体遺伝子欠損（AT-KO)マウスまた は野生型 (Wild)マウスに生理食塩水、 ストレプトゾトシン 65mg/kg を腹 腔内投与し、 それぞれ対照 (C)群、 糖尿病 (DM)群を作成した。 さらに DM 群の一部にマウスプロレニンプロフラグメント" handle"領域を含む p 4 ぺプチドを浸透圧ミニポンプを用いて持続皮下注入し、 DM+p4群を作成 した。 浸透圧ミエポンプは 28 日間用のものを用いて 28日毎に入れ替え た。上記処置後 24週を経過した時点で、マウスを無麻酔下で断頭堵殺し 腎臓を摘出し上記 PAS染色法により病理組織を検討した。
(結果）
図 4 aに示すように、 腎組織所見は AT-KOマウス、 Wild マウスのい ずれにおいても、 C群で正常であり、 DM群で腎糸球体硬化病変が顕著 であり、 DM+p4群で腎糸球体硬化病変は抑制されほぼ正常に近い状態で あった。 腎糸球体 10個あたりの硬化病変の面積を測定し Wild(C)を 1と じた場合の各群 (n=6 匹）における比を図 4 bに示す。 Wild(C)と比べて Wild(DM)は 19.2± 2.3 と有意に増加し、 Wild(DM+p4)では 1.5 ± 0.8 と Wild(C)と同等レベルまで有意に抑制された。 AT-KO (C)は 0.9 ± 0.3であ り、AT-KO(DM)は 13.9 ± 1.8と Wild(DM)と比べて小さかったが AT-KO(C) と比べて有意に増加しており、 AT-KO(DM+p4)では 1.4 ± 0.7と AT-KO(C) と同等レベルまで有意に抑制された。
*は C群と DM群との間で有意差があることを示す。 +は AT-KO群 と Wild群との間で有意差があることを示す。 産業上の利用可能性
組織アンジォテンシン IIが循環血中レニン ·アンジォテンシン系とは 独立して機能を有し （J Hypertens. 10:S13-S26, 1992)、 高血圧 ·（糖尿病性 腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症を含む）糖尿病合併症 ·腎疾患 - 心不全 ·心筋梗塞 ·心肥大 ·心筋症■脳血管障害 ·動脈硬化の発症と進 展に深く関与することは、 従来の数多くの報告によって明らかな事実で ある (J Am Soc Nephrol.13 :S 173-S178,2002)。 組織プロレニン活性化阻害 因子の皮下投与は、組織ァンジォテンシン II濃度を統計学的有意に低下 させ、 糖尿病合併症の 1つである糖尿病性腎症を完全に抑制した。 それ ゆえ、 本発明による組織プロレニン活性化阻害因子は、 組織内アンジォ テンシン II産生亢進に関係する各種疾患、 例えば高血圧 · （糖尿病性腎 症、 糖尿病性神経症、 糖尿病性網膜症を含む） 糖尿病合併症 ·腎疾患 - 心不全■心筋梗塞 ·心肥大■心筋症■脳血管障害■動脈硬化の発症と病 態進展を抑制する効果が期待できる薬剤であると考えられる。
さらに本発明によれば、組織プロレニン活性化阻害因子の皮下投与は、 野生型マウスのみならずアンジォテンシン II受容体遺伝子欠損マウスに おいても、 糖尿病性腎症を完全に抑制した。 このことから、 従来より上 記疾患に用いられてきたレニン ■ アンジォテンシン系依存性の阻害薬
(ACE阻害薬、 アンジォテンシン II阻害薬） に比べて、 本発明の組織プ 口レニン活性化阻害因子は、 レニン · アンジォテンシン非依存性の未知 の作用機構をも抑制して上記疾患を予防 ·治療することが期待できる薬 剤であると考えられる。 すなわち、 本発明の物質により、 組織アンジォ テンシン II依存性のみならず、 非依存性の動脈硬化症、 心■脳血管疾患 及び/若しくは糖尿病合併症に対する広く適用可能な発症予防又は治療 剤が提供された。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によ つておこる、 一次構造変化を伴わない非酵素的プロレニン活性化を阻害 する機能を有する物質を含む以下から選ばれる用途に使用される医薬： 1 ) 組織内アンジォテンシン II産生亢進制御剤；
2 )組織内ァンジォテンシン II産生亢進により発症する動脈硬化症、心 · 脳血管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤；
3 ) 組織内レニン · アンジォテンシン系を介さない動脈硬化症、 心 '脳 血管疾患及び/若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤。
2 . 前記物質がレニン阻害活性を保持しない請求の範囲第 1項の医薬。
3 . 前記物質がプロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から 選択される部分配列を有するぺプチド又はその等価べプチドからなる請 求の範囲第 1項又は第 2項の医薬。
4 . 前記部分配列が、 プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配 列から選択される連続した 3個から 1 0個の部分配列である請求の範囲 第 3項の医薬。
5 . プロレニンのプロフラグメント領域のァミノ酸配列から選択される 部分配列を有する前記ペプチドが、 配列表の配列番号 7から 1 4、 及び 配列番号 2 1に記載のペプチドから選択されるペプチドである請求の範 囲第 3項の医薬。
6 . プロレニンのプロフラグメント領域のァミノ酸配列から選択される 部分配列を有する前記ペプチドが、 配列表の配列番号 3、 配列番号 4、 及び配列番号 1 5から 2 0に記載のぺプチドから選択されるぺプチドで ある請求の範囲第 3項の医薬。
7 . 前記物質が、 プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列の 情報から設計される低分子化合物である請求の範囲第 1項又は第 2項の 医薬。
8 . プロレユン活性化を阻害する前記機能が、 プロレニンのプロフラグ メント領域における蛋白質間相互作用の拮抗作用によるものである請求 の範囲第 1項〜第 7項のいずれか 1の医薬。
9 . プロレニン活性化を阻害する前記機能が、 プロレニンのプロフラグ メント領域に対する特異的結合蛋白とプロレニンとの相互作用を阻害し てプロレニン活性化を生体内で阻害することを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれか 1の医薬。
1 0 . 請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれか 1の医薬のスクリ一-ング 方法。
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