WO2004069862A1

WO2004069862A1 - ペプチド結合体

Info

Publication number: WO2004069862A1
Application number: PCT/JP2004/001293
Authority: WO
Inventors: Shinji Takeoka; Yasuo Ikeda; Makoto Handa
Original assignee: Keio University; Mitsubishi Pharma Corporation
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2004-08-19
Also published as: EP1591451A1; KR20050111583A; EP1591451A4; US20070059376A1

Abstract

血管中で未活性な血小板と凝集を起こして不要な血栓の生成や血液の血管内凝固を誘導しない、特異的な凝集作用を有する血小板代替物を提供すること。　詳しくは、フィブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ認識部位に含まれるドデカペプチドを結合させた結合体が、実質的に活性化されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとのみ特異的に結合する、血小板代替物として好ましい性質を有することを見いだして、本発明を完成させた。

Description

明細書

ぺプチド結合体本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号

5 2003-029847号及び日本特許出願番号 2004-017046号からの優先権を請求する。技術分野

本発明は血小板代替機能を有するペプチド結合体に関する。特に、活性化した血小板を特異的に認識するオリゴペプチドの微粒子との結合体、該結合体を含む0 血小板代替物、該結合体による血小板凝集の制御方法、該結合体の製造方法、及ぴ該結合体を含む診断薬からなる。背景技術

血小板減少症等の疾患、あるいは抗癌剤などの化学療法の使用に際して一時的5 に血小板数が減少する場合に、出血傾向及び出血した場合に血が止まり難い症状が現れる。この症状への処置法として、ヒト血小板製剤の投与が行われるが、ヒト由来であるためにウィルスや病原菌の感染リスクの問題があり、しかも血小板製剤の保存期間は室温で 3日間と非常に短いために、.これらを解決できる血小板代替物の開発が急務となっている。

0 ヒトより採取した血小板から成る血小板製剤は、血小板減少症などの処置に不可欠であるが、保存期間が短いこと、また、感染症リスクの問題等があることから、長期保存可能な血小板代替物の研究が行なわれてきた。

これまで、血小板代替物として、古くは、ヒト血小板をパラホルムアルデヒドで固定化し、凍結乾燥した物が知られている（特許文献 1参照）。これは、血小5 板膜上の G P I bの活性のみを残しつつ、固定化処理によって血小板の代謝機能を失活させることにより長期保存を可能にした物である。最近では、血小板の膜上に存在し血小板の粘着または凝集に関与することが知られている糖タンパクである、 GP I bや GP I I b/ I I I aなどの機能性高分子を、何らかの微粒子の表面に結合させた物が知られている。これらのうち、 GP I bを有する物は、 GP I bとフォンビルブラント因子（vW因子）の相互作用に基づく粘着作用を有することによって血小板の代替物として働くことが期待され、一方、 GP I I b/I I I aを有する物は、 GP I I b/I I I aとフィプリノーゲン及び Z又は V W因子の相互作用に基づく凝集作用を有することによつて血小板の代替物として働くことが期待されている。

また、これらの機能性高分子を結合させる微粒子としては、小胞体（リポソ一ム）などの脂質膜、ヒトアルブミンまたはその重合体、あるいはヒト赤血球などが知られている。具体的には、小胞体（リボソーム）を微粒子として GP l bを結合させた物（特許文献 2参照）、ヒトアルブミン重合体を微粒子として GP I bを結合させた物（特許文献 3参照）、小胞体（リボソーム）を微粒子として G P I I b/I I I aを結合させた物（非特許文献 1参照）等が知られている。また、上記の物は、機能性高分子を 1種類のみ有する物であるが、 GP I b及ぴ GP I I bZl I I aの両方を有する血小板代替物も知られている。具体的には、血小板上の GP I I b/ I I I aを活性化させた後にパラホルムアルデヒドで固定化させた物（特許文献 4参照）が知られている。

一方、これらのように、血小板上の機能性高分子を有することによって血小板代替物として働くのではなく、患者血液中に残存する血小板の活性を補助することにより血液の凝集を誘導する物も知られており、これらも血小板代替物とみなすことができる。例えば血小板上の GP I I b/I I I aと相互作用を起こすことにより血液凝集を誘導する物が知られている。具体的には、小胞体（リポソ一ム）に RGD配列（Ar g— G 1 y— As p) を有するペプチド（配列表 2 ) を結合させた物（非特許文献 2参照）、ヒトアルブミン重合体にフィプリノーゲンを結合させた物（非特許文献 3参照）、ヒトアルブミンにフイブリノ一ゲンの G P I I b/ I I I a認識部位に含まれるドデカぺプチド（H i s— H i s— L e u -G 1 y -G 1 y -A 1 a - L y s— G l n_A l a— G l y— A s p - V a 1 ) を含むペプチドを結合させた物（特許文献 5参照）等が知られている先行文献

(特許文献 1) 米国特許第 4, 28 7, 0 8 7号

(特許文献 2) 特開平 9— 20 8 5 9 9号、米国特許第 6， 1 7 7, 0 5 9号及ぴ欧州特許公開第 0 8 948 0 7号各号公報

(特許文献 3) 特開 2 00 1— 1 5 1 80 0号公報

(特許文献 4 ) 特開 200 1— 1 3 1 0 7 8号公報

(特許文献 5) 米国特許第 4, 6 6 1 , 4 7 1号

(非特許文献 1) M. E. Rybak, Thrombosis and Haemostasis, 55, 240-245, 1986

(非特許文献 2 ) T. Nishiya, and S. Sloan, Biochim. Biophys. Res. Commun. , 224, 242-245, 1996

(非特許文献 3) S. Takeoka et al. , Biomacromolecules, 2， 1192-1197， 2001 発明の開示

血小板代替物を製造するにあたり最も注意すべきことの一つは、製造した血小板代替物が、必要とされる場合以外にも血管中で凝集を起こすことにより血栓の生成あるいは血液の血管内凝固を誘導し、血管閉塞など重大な副作用を生じさせることがないよう、血小板代替物の凝集能力を制御することにある。事実、ヒト血小板においては、 GP I I b/ l I I aは通常状態では未活性であり、必要に応じてのみ活性化される。この制御機構により、生体中では、不要な血栓の生成や血液の凝固が抑制されている。しかしながら、固定化血小板、あるいは担体に GP I I b/ I I I aを結合させた従来の血小板代替物において、このような制御機構を備えた物は知られていない。

一方、患者血液中に残存する血小板の活性を補助することにより血液の凝固を誘導する血小板代替物は、血小板上の活性化 GP I I b/I I I aを利用したフイブリノ一ゲンの結合や血小板の凝集を必要とする。し力し、本発明者らの研究により、微粒子に RGD配列を有するペプチドを結合させた血小板代替物は、 G P I I b/ I I I aが未活性な状態である血小板に対しても、その未活性な GP I I b/ I I I aを介して血小板と結合する作用を有することが明らかとなつた。これは、血小板の活性を補助する血小板代替物であっても、不要な血栓の生成や血液の血管内凝固などの副作用を有する可能性があることを示している。また、微粒子にフイブリノ一ゲンを結合させた物についても、活性化した GP I I b/l I I aのみとの特異的結合作用を有することが期待されるが、フイブリノ一ゲンの不安定性に問題があることが示唆されている（上記の非特許文献 3参照）。そのほか、フイブリノ一ゲンの GP I I b/l I I a認識部位に含まれるドデカペプチド部分を含むペプチドを結合させた物についても、従来技術においてその具体的な態様は十分明らかにされておらず、安定性などの性状及び具体的な作用効果については、何一つ明らかにされていない（上記の特許文献 5参照）。以上のことから、血管中で未活性な血小板と凝集を起こして不要な血栓の生成や血液の血管内凝固を誘導しない、特異的な凝集作用を有する血小板代替物が、現在も要求されている。

本発明者らは、特異的な凝集作用を有する血小板代替物について鋭意研究を行なった結果、フイブリノ一ゲンの GP I I b/I I I a認識部位に含まれるドデ力べプチドの合成体を微粒子に結合させたぺプチド結合体が、実質的に活性化された GP I I b/ I I I aとのみ特異的に結合する、血小板代替物として好ましい性質を有することを見いだして、本発明を完成させた。また、本発明の血小板代替物にはヒト由来の成分を用いておらず、それら成分の合成体及び遺伝子組換え体を用いているため、ウィルス等の感染リスクは回避される。

すなわち本発明の内容は、以下のとおりである。

1. 一般式 .

「（微粒子）一〔（リンカ一）一 Cy s— H i s— H i s— L e u— G l y— G 1 y -A 1 a -L y s— G l n— A l a— G l y— A s p -V a 1 -COOH] Jヽあるいは一般式「（微粒子）一〔（スぺーサ一）一（リンカー）一 C y s - H i s一 H i s— L e u— G 1 y - G 1 y - A 1 a— L y s— G l n - A 1 a— G l y— A s p - V a 1 - C O O H] J である結合体。

(式中、 nは整数）

2 . 微粒子が、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、合成高分子の何れか一から選ばれる前項 1記載の結合体。

3 . 微粒子が、小胞体、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、生分解性高分子の何れか一から選ばれる前項 1または 2に記載の結合体。

4 . 微粒子の粒子径が、 50nm以上である前項 1〜 3の何れか一に記載の結合体。 5 .微粒子の粒子径が、 10 μ m以下である前項 1〜 4の何れか一に記載の結合体。

6 . リンカ一が、片末端が SH基と反応し、もう片末端が 0H基、 C00H基、 ₂基のいずれか一と反応する化合物である前項 1〜 5の何れか一に記載の結合体。

7 . リンカ一が、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチォカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか一から選ばれる前項 1〜 6の何れか一に記載の結合体。

8 . リンカ一が、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ハロカルボエルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチォカルポン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか一であり、かつ炭素鎖が C 2〜10である前項 1〜 7の何れか一に記載の結合体。

9 . スぺーサ一が、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン及び抗体から選ばれる 1又はこれらの複数の組み合わせからなる前項 1〜 8の何れか一に記載の結合体。

1 0 . 微粒子がラテックス粒子、スぺーサ一がアルブミン、リンカ一がジチォ力ルボン酸である前項 1〜 9の何れか一に記載の結合体。

1 1 . 微粒子が小胞体、スぺーサ一がポリエチレングリコール、リンカ一がマレィミドカルボン酸である前項 1〜 9の何れか一に記載の結合体。 1 2 . 前項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体を含む血小板代替剤。

1 3 . 前項 1〜1 1の何れか一に記載の結合体による血小板凝集の制御方法。

1 4 . 前項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体の製造方法。

1 5 . 前項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体を含む診断薬又は試薬。

1 6 .血小板機能異常症の診断薬、生物学的 ·医学的な試薬、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤のスクリーニング用の試薬、血管損傷部位及び血栓形成部位の検査用診断薬又は治療剤である前項 1 5の診断薬又は試薬。

1 7 . 前項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体を含む薬物運搬体。

1 8 . 薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選択される前項 1 7に記載の結合体を含む薬物運搬体。

1 9 . 前項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体を含む医薬組成物。

2 0 . 薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選択される前項 1 9に記載の結合体を含む医薬組成物。

2 1 . 血管障害、血管損傷及び血栓症の予防又は治療のための前項 1 9又は 2 0 記載の医薬組成物。図面の簡単な説明

図 1 ：血小板のコラーゲン基板への粘着占有率の経時変化を示す。

図 2 ：ドデカペプチド結合ラテックスビーズ（H12- LB) のコラーゲン基板への粘着占有率の経時変化を示す。

図 3 ：流動後の基板の SEM観察図を示す。

図 4 ：未活性血小板に対する結合性試験としての膠着率を示す。

図 5 ：小胞体への H12導入量と血小板凝集効果を示す。

図 6 ：血小板のコラーゲン基板への粘着占有率を示す。

発明を実施するための最良の形態本発明のペプチド結合体は、一般式

「（微粒子）一〔（リンカ一）一 C y s -H i s— H i s—L e u—G l y—G l y -A 1 a— Ly s— G l n— A l a— G l y— A s ρ -V a 1一 C〇OH〕 _n」、あるいは一般式

「（微粒子） ― 〔（スぺーサ一）一（リンカー）一 C y s—H i s— H i s— L e u-G 1 y-G 1 y-A 1 a— Ly s— G i n— A l a— G l y— A s p— V a 1— COOH〕 _n」である。式中、 nは整数である。ドデカペプチドである「H i s -H i s -L e -G l y— G l y-A l a— Ly s— G i n— A l a— G l y— A s p— Va l」は、フイブリノーゲンの GP I I b/ I I I a認識部位に含まれるアミノ酸配列（配列表 1) であり公知である。この配列は、自体公知の合成手段によつて合成可能であり特に限定されるものではない（The

Peptides Analysis, Synthesis, and Bio丄 ogy Vol.2, pp.1-284,

Academic Press (1980) )。末端のカルボキシル基はアミノ酸 V a 1由来である。式中、微粒子とは医療用の非経口投与が可能な担体を意味し、生体適合性を有する限りは特に限定されない。これまでに公知の好適な微粒子材料としては、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、合成高分子などが知られており、具体的には小胞体（リボソーム）、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、生分解性高分子等が例示される。

小胞体（リボソーム）は脂質人工膜で構成される粒子でリン脂質、グリセ口糖脂質、コレステロール等から脂質二重層としてつくられる。その調製には、界面活性剤除去法、水和法、超音波法、逆相蒸留法、凍結融解法、エタノール注入法、押し出し法、及び高圧乳化法等広く公知方法が適用される。小胞体（リボソーム）の調製の詳細は上記特許文献 2及び非特許文献 2に詳しく記載されている。小胞体（リボソーム）は、本発明の実施例及び実験例で使用されたが、適宜生体適合性を有するものが選択され使用される。

組換えアルブミンは、既知の遺伝子工学的手法により製造されたものが利用でき特に制限されない。例えば、実用化レベルにある宿主として酵母を用いて生産される組換えアルブミンは好適である。アルブミンの微粒子化（重合）は公知であり、特開 2001-151800号公報の本発明者等によるアルブミン重合体の調製法が好適である。また組換えアルブミンの調製法は以下のような方法に詳しく記載されており（特開平 5-317079，同 6-56883，同 6-245789，同 8-116985各号公報）、これらの方法で実施例 1で使用する r HSAを得た。

ラテックス粒子は、本発明の実験例で使用されたが、適宜生体適合性を有するものが選択され使用される。生分解性高分子は例えば、乳酸及び/又はグリコール酸を重合して得られる高分子を微粒子化して調製される。生体内ではこれらは経時的に分解又は溶解性の性質を持つように分子量 ·共重合体組成や配合比が決定され使用される。

このようにして調製される微粒子の粒子径は、表面認識部位の導入量とその機能発揮、および体内動態の面から、約 50nm以上が好ましく、また、約 ΙΟ μ πι以下が好ましい。更に、好ましくは約 50nm〜約 500nm、より好ましくは約 100nm〜約 400nmである。

式中リンカ一は微粒子とペプチド末端の SH基と架橋できるもので、公知の生体許容性があるものならば特に限定されないが、好ましくは片末端が SH基と反応し、もう片末端が 0H基、 C00H基、 NH₂基のいずれかと反応する化合物である。このようなリンカ一としては、例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボ二ノレ化合物、ノヽロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチォカルボン酸及びマレイミドカルボン酸等が例示される。これらは炭素鎖が C 2-10であることが好ましい。

式中スぺーサ一は、微粒子とリンカ一間にあつて微粒子表面とぺプチド間の-長さを調節できるものであり、生体適合性があれば特に限定されないが、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン、及び抗体から選ばれる 1又はこれらの複数の組み合わせからなる物質を利用できる。アルブミンや抗体は組換体が利用できる。

微粒子上に結合されるドデカぺプチドの分子数は、高密度であることが血小板との結合の可能性を高め、凝集塊の形成が迅速に進むことから好適である。式中 nは整数を意味し、微粒子に結合するドデカペプチドの数を表す。その数は、適宜その所望凝集度及び凝集速度に応じて当業者は変異可能であり調整できる。例えば、実験例 4に示すように小胞体（リボソーム）を使う場合は、ドデカぺプチドによる修飾率の最適値（例えば 0. 3mol°/。- 0. 6mol%) が特定可能であり、同様に条件を変え、最適化が達成される。一定値以下の修飾率では効果が不十分であり、一定値以上の修飾率では効果に影響しなくなる。

微粒子、リンカー又はスぺーサ一一リンカー、及びドデカぺプチドの結合体の調製は、微粒子の調製後、必要であれば微粒子表面の活性化によって化学結合可能にし、ついで必要なリンカ一又はスぺーサ¹ ^一リンカ一を結合させ、さらにはドデカペプチドを反応させることによって調製される。或は、予めリンカ一又はスぺーサ一—リンカ一とドデカペプチドの反応産物を調製しておき、最終的に活性化された微粒子と結合させてもよい。反応条件は、各微粒子に適合した自体公知の手法が適用可能である。ドデカペプチドと微粒子の混合比は、最終的な結合体におけるドデカペプチドの密度の所望値によって調節される。

小胞体の場合、脂質二重層の構成成分と成り得るドデカペプチドを結合させた両親媒性分子をあらかじめ小胞体を構成する脂質類と有機溶媒中で混合させておき、常法にて小胞体を調製することによって小胞体表面をドデカぺプチドで修飾することができる。

次いで要すれば、本発明の結合体は、生理的に許容される水溶液で洗浄し、除菌濾過、分注を行い、液状製剤、ペレット状及び懸濁状製剤として調製する。製剤化は医薬品の製法において広く公知の方法に準ずる。また、本製剤は液状製剤を凍結させた後、減圧下で乾燥させ、凍結乾燥製剤としても提供される。なお、凍結乾燥する場合は保護剤として、単糖類（例えば、ブドウ糖等）、二糖類（例えば、蔗糖等）等を配合してもよい。本発明の製剤にはアルブミン、デキストラン、ビニル重合体、ゼラチン及びヒドロキシルェチル澱粉から選ばれた高分子物質を安定化剤として配合してもよい。当該安定化剤の添加量は脂質 1重量部に対して、 0 . 5〜1 0重量部、好ましくは 1〜5重量部である。

力べして調製された本発明の結合体を含む製剤は、活性化された血小板の G P I I b / I I I aと選択的な結合性をしめすことから、血管中で未活性な血小板とは凝集を起こすことはなく、血管損傷部位等の血小板の活性化した部位での血小板との凝集が期待でき、血小板凝集の制御手段を提供する。本発明の結合体はそれ自体で合成血小板の代替物となりうる。又本発明の結合体は、血管損傷部位等の血小板の活性化した部位への集積性を有するために、薬物含有組成物（薬物運搬体）としての態様を取ることもできる。このような薬物としては、血管損傷部位へ集積させることによって生理学的、薬理学的に有効であるものであれば特に制限はなく、例えば、止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤等が挙げられる。本発明の結合体は、ドデカペプチドとして、 1日当たり 0 . 0 0 1〜1 0 0 O m g程度を投与することができる。その投与量は患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜増減できる。本発明の結合体は、より好ましくは非経口的に投与される。具体的には、血管内（動脈内 ·静脈内）への注射、持続点滴、皮下投与、局所投与あるいは筋肉内投与等が例示される。本発明の結合体を含む医薬組成物としては、血小板代替剤、血管障害、血管損傷及び血栓症等の予防 - 治療等の医薬品、あるいは血小板無力症などの血小板機能異常症の診断薬、生物学的 ·医学的な試薬、血小板凝集抑制剤 ·抗血栓剤のスクリーニング用の試薬等がある。血管損傷部位及び血栓形成部位の検查用診断薬あるいは治療剤としても有用である。実施例

以下、製造例、実験例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例 1 ドデカぺプチド〔以下 H12と記す。（配列表 1 )〕結合ラテックスビーズ（以下 HI²- LBと記す）合成法組換えヒト血清アルブミン（以下 rHSAと記す）溶液（50mg/mL, 1. 5mL)に粒子径 1 μ πιのラテックスビーズ (以下 LBと記す)分散液を混合し、振とうさせた（20°C: 2hr)。遠心分離（13000g， 5min, 4°C, 3times)によって LBを沈殿させ、未吸着 rHSA を上清として除去後、 phosphate- buffered saline (以下 PBSと記す， 500 μ L)に 5 よって再分散させた。

HSA吸着 LB分散液〔以下（HSA) LBと記す〕 ( 4. OxlOWticles/ μ L, 500^ に、 SPDP ( -スクシンィミジル 3， 2 -ピリジルジチォプロピオネート）エタノーノレ溶液（⁵ ， 5 μ ϋを添加し、振とうさせた（20°C, 30min. )。遠心分離（13000g， 5min， 4°C, 3times)によって未反応 SPDPや副生成物を除去して、 pyridyl 10 disulfide (以下 PDと記す）結合 (HSA) LB 〔以下 PD - (HSA) LBと記す〕を得た。この PD_ (HSA) LB (4. 0xl0⁶particles/ L， 500 μ L)に Cys - H12 (末端に Cysが付加された H12) (lOmM, 8 を混合し、振とうさせた（20°C， 12hr)。遠心分離（13000g， 5min, 4°C, 3times)によって上清を除去後、 H12-LB (2. OxlOVrticles/ L, IraL) を得た。 LB表面の H12結合量は thiol-disulfide交換反応で生成される

15 2-thiopyridone (以下 2TP) の 343nmの吸収から決定した（HPLC, TSK-GEL

G3000SWXL column, 7. 8mm o. d. x 300ram h, lmL/min, PBS)。実施例 2 H12 (配列表 1 ) 結合小胞体（以下 H12-PEG小胞体と記す）合成法

H12- PEG- Glu2C18の対照として、 PEG- Glu2C18を合成した。グルタミン酸（2. 96g,

20 20mmol)、 p-トルエンスルホン酸一水和物（4. 56g， 24mmol) をベンゼン 150mlに溶解させ、 Dean- Stark装置をもちいて 105°Cで生成水を除去しながら、 1時間還流させた。ステアリルアルコール (ll. 9mg, 44mmol) を加え、 105°Cで生成水を除去しながらさらに 14時間還流させた。溶媒を減圧蒸留した後、残分をクロ口ホルム 150mlに溶解させ、炭酸ナトリゥム飽和水溶液 150mlで 2回、水 150mlで

25 2回洗浄した。クロ口ホルム層を回収し、硫酸ナトリウム 5gで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を 60°Cでメタノール 400ralに溶解させ、不溶成分があればろ過し、 4°Cで再結晶、濾過後乾燥して白色粉末 Glu2C18 (13. 3g, 収率 85%) (式 1参照）を得た。

この Glu2C18 (50. 08mg, 76. 8 mol)と MeO- PEG - C00H ( α -力ルポキシル - ω -メトキシポリエチレングリコーノレ） (M =5150) (200mg, 38. 4 ^ πιο1)及ぴ H0BT - ヒドロキシ-ベンゾトリァゾール）（5. 2mg, 38. 4 ^ mol) をジクロロメタン 5ml中に溶解させた後、 DCC (N, i\7' -ジシク口へキシルカルボジィミド）（9. 58mg, 46. 4 μ mol) を加え、 12時間撹拌した。不溶成分を濾過にて除去後、反応溶液をジェチルエーテル 250mlに滴下し、不溶成分を回収した。回収物をベンゼンに溶解させて凍結乾燥をおこない、白色粉末 PEG- Glu2C18 (204mg，収率 83%) (n=115) (式 1 参照）を得た。式 1にその合成概略を示す。

(式 1 )

□ Me0-P EG-C00H

グルタミン酸 -C DCCHoBT

ステアりルアルコール卡 H₃C OCC H2CH₂Q3 _nC H₂C H.- C -N - Glu2C 8 し,

-トルエンスルフォン酸ジクロロメン

埜诅 12時間

Glu2 CI 8 85% PEG-Glu2C18 83%

n=115

—方、本発明の H12- PEG- Glu2C18を以下のように調製した。クロ口ホルム 5ml 中に Glu2C18 (115. lmg, 176 mol) 、 TEA (トリエチノレアミン）（24. 6 1， 176 ιτιοΐ) を加えた後に、 MAL-PEG-NHS ( a -マレイミジル- ω -ΔΓ -ヒドロキシスクシンィミジルポリエチレングリコール） (M =3400) (300mg, 58. 8 μ mol) を溶解させ、室温で 12時間撹拌させた。反応溶液をジェチルエーテル 250mlに滴下し、不溶成分を回収した。回収物をベンゼン中に溶解し凍結乾燥をおこない、白色粉末 MAL-PEG-Glu2C18 (264. 8mg, 収率 64%) (式 2参照）を得た。この MAL- PEG- Glu2C18 (n=71) (lOOmg, 25· 37 μ mol)と Cys- H12 (32. 8mg， 25. 37 mol) を DMF5mlに溶解し、室温で 12時間撹拌させた。反応溶液をジェチルエーテル 250mlに滴下し、不溶成分を回収した。水 250mlを加え不溶成分を除去後、凍結乾燥機にて溶媒を除去し、淡黄色粉末 H12-PEG- Glu2C18 (62. 8mg，収率 47%) (式 2参照）で得た。式 2にその合成概略を示す,

(式 2 )

ついで上記調製された PEG_Glu2C18及び H12- PEG- Glu2C18を使い小胞体の表面に H12を導入させた。 DPPC (100mg， 136 μ πιο1)及びコレステロール（52. 7mg, 136 u mol) に対して PEG- Glu2C18及び/又は H12-PEG- Glu2C18を任意の比で加えた混合脂質をベンゼン 5mlに溶解し、凍結乾燥を 3時間行った。乾燥後、純水 10ml を加え 12時間撹拌したのち造粒装置（Extruder) を用いて貫通孔を有するフィルターを透過させて粒径制御を行った。フィルタ一は孔径

{3000nm→800nm→650nm→450nm→300nm→220nm (x2) } の順番で通過させた。超遠心分離（33000rpm、 30分）を 2回おこない、 PBS 5ml中に分散させ小胞体分散液とした。 PEG- Glu2C18及ぴ Z又は H12- PEG- Glu2C18 の含有量について、 PEG- Glu2C18 (4. 74mg, 0. 817 μ mol)のみを含む小胞体を PEG-小胞体、

H12-PEG-Glu2C18 (4. 34mg, 0. 817 μ mol) のみを含む小胞体を H12- PEG小胞体、 PEG - Glu2C18 (4. 74mg, 0. 817 mol) · H12-PEG - Glu2C18 (14. 34-0. 43mg,

2. 72-0. 0817 mol) を含む小胞体を H12 - PEG (PEG)小胞体と定義した。

なお、調製されたリン脂質小胞体（H12- PEG小胞体 · 1. 8wt%) を PBSで 30倍希釈し 37°Cで 12時間振とう後、超遠心（33000rpm, lh)にて小胞体を沈殿、分散させ、さらに凍結乾燥した粉末を¹ H -匪 R測定した。 DPP コレステロール、

H12-PEG-Glu2C18のモル比は H12-PEG小胞体を 37°Cで 12時間振とうさせても変化がなかつたことから H12 - PEG_Glu2C18はリン脂質小胞体からは脱離せず、安定担持されていることが確認できた。実験例 1 担体にラテックスビーズを使つた場合の血小板との凝集試験血小板減少モデル血液は、全血を重力落差で赤血球製剤用白血球除去フィルタ一 (NE01J, 日本ポール社）を通過させ、多血小板血漿 (PRP)を添加して血小板濃度 2. 0 X 10V Lとなるように調製した（自動血球計測装置 K-4500, Sysmex, Kobe)。血小板減少モデル血液 5mL中に H12- LB (1. 0xl0⁵particles/ ;U L)を添加し、静置後（37°C， lOmin. ) _N コラーゲン固定化基板上にポンプを用いて流動させ（ずり速度 150s—り、蛍光顕微鏡あるいは CCDカメラを通して観察した。各基板に対する微粒子の粘着占有率 [surface coverage (以下 SCと記す）〕は、画像解析装置 (Argus - 50、浜松フォトニタス）によって測定した。

血小板にのみ蛍光標識 [3 , 3' -dihexyloxacarbocyanine iodide (Di0C₆) ] をして経時的に粘着挙動を観察した。その結果、血小板の基板への SCは時間経過と共に増大し、 180秒後では 3. 1 ±0. 4%であった〔図 1 ：口、 control〕。また、この傾向は、 LBを添加しない系、即ち、血小板のみの系のそれとほぼ変わらないことから〔3. 0±0. 6%、図 1 : ·〕、 LBのみによる血小板粘着への影響は生じないことが示唆された。そこで、 LBの代わりに H12 - LBを添加したところ、血小板粘着は LB添加時よりも增幅され、 180秒後では 5. 1 ±0. 3%であり、 controlよりも約 1. 7倍増幅された〔図 1：〇〕。

他方、 FITCで LBを標識した H12 - LB及ぴ LBの粘着挙動を観察したところ、 H12-LB の場合の初期粘着速度は図 1に示した血小板のそれと比較して非常に緩やかであつたが、 SCは徐々に増大した〔図 2 ：△〕。また、血小板濃度が 0. 2χ10⁴/ μ ίのとき H12 - LBの基板への結合数は抑制され〔図 2 ：〇〕、さらに LBではほとんど結合しなかった〔図 2 ：口〕。

そこで、流動後の基板を SEM (Scanning Electron Microscope) 観察したところ、コラーゲン基板上にまず血小板が粘着した後に H12-LBが結合し、さらに別の血小板による H12- LBを卷き込んだ粘着が確認できた（図 3 )。

以上より、コラーゲン基板に対する H12- LBの粘着は血小板の存在によって誘導され、コラーゲンに粘着し活性化した血小板上に H12-LBが結合し、さらに流動血小板がそれを介して誘導 ·粘着し、次々と両者の積層が生じたことが確認できた。実験例 2 未活性血小板に対する結合性試験

未活性血小板（2.0 X 10⁴/ μ L)に対して各 LB、 H12- LB、及ぴ CGGRGDF-LB [RGD 配列（Ar g— G 1 y— A s p) を有するペプチドを結合した LB〕を 1.0X10⁵/ //L混合し、振とう（37°C，30min) し、それぞれの膠着率をフローサイトメトリーによって評価した。その結果、 LB、 H12-LBは膠着率の上昇は見られなかったが、 CGGRGDF - LBは 2.9+1.3%であった（図 4)。このことから、 H12 - LBは CGGRGDF - LB より未活性血小板に膠着しにくいことが確認できた。実験例 3 小胞体への H12導入量と血小板凝集効果

クェン酸ナトリウム水溶液（3.8%) を全血に l/9(v/v) 添加し、遠心分離 (600rpm， 15min)を行い、多血小板血漿 (PRP) を得た。沈殿成分を更に遠心分離 (2500rpm, lOmin) して、乏血小板血漿（PPP) を得た。 PRP、 PPPを混合し血小板減少血漿（180μ1，

を調製した。これに小胞体分散液 10 μ 1 を添カ卩した後、 ADP (アデノシン- 5'-二リン酸）（300μΜ) ΙΟμΙを添カ卩し、血小板を凝集させた。 '

凝集計による測定は ΡΡΡを透過度 100%、血小板減少血漿を透過度 0%としたときの凝集による透過度の増大を測定し、 PEG-小胞体を添加した場合に対して、同濃度の H12- PEG (PEG)小胞体を添加した場合の透過度の差を評価した。

H12- PEG- Glu2C18を 0. lmol°/。、 0.2mol%、及び 0.3mol%で含む小胞体いずれにおいても血小板凝集の促進が認められたが、小胞体への H12導入量が増加するほど、血小板の凝集を促進した（図 5 )。実験例 4 担体に小胞体を使つた場合の血小板との凝集試験

血小板を DiOC₆にて蛍光標識し、血小板減少血液（[血小板] =5. OXlOV zL) 5mL に H12 - PEG (PEG; ^i (1. 5wt%, 200 μ L) を添加し、静置後（3⁷°C， lOmin)、コラーゲン基板上をずり速度 150 s—¹にて流動させ蛍光顕微鏡にて観察した。血小板の基板への SCは Argus- 20にて解析した。血小板減少血液（[血小板] =5. 0 X 10⁴/ μ ΐ) に、 H12 - PEG小胞体（H12- PEG_Glu2C18 ： 0. 3mol%) あるいは PEG小胞体を添加し、コラーゲン基板上を流動させたところ、 H12- PEG小胞体添加系は PEG-小胞体添加系と比較して SCが増大した（表 1 )。

(表 1 ) H12- PEG (PEG)小胞体と H12- PEG小胞体の存在下での血小板凝集の促進

Samples SC of platelets (%)

PEG小胞体 9.6+0.9

H 12-PEG小胞体 15.0+5.0

H 12- PEG(PEG)小胞体 1 7.3+1 .9 これは、血小板がまずコラーゲン基板に粘着し、粘着した血小板にリン脂質小胞体が結合して流動している血小板との結合部位を増やし、リン脂質小胞体にさらに血小板が結合したため SCが増大したと考えられる。また、 H12 - PEG (PEG)小胞体について、同条件にて基板上を流動させたところ、 H12 - PEG (PEG)小胞体添カロ系についても同様に PEG小胞体添カ卩系と比較して SCが増加した（表 1 )。これにより、血中滞留性向上のために小胞体表面へ PEG脂質を導入しても H12の認識反応は阻害されないことが示された。

次に H12- PEGの修飾率の異なる H12- PEG (PEG)小胞体を血小板減少血液に添加した場合のコラーゲン基板上への血小板の SCは、図 6のようになった。これは、 H12-PEG-G1U2C18修飾率 0. lmol%以下では基板への血小板の SCが PEG小胞体とほぼ同じであり、修飾率 0. 3mol°/。以上では修飾率とともにその効果も現れることを示した。これは、コラーゲンにて活性化した血小板への H12-PEG (PEG)小胞体の粘着数が H12-PEG- Glu2C18の修飾量につれて増加したためであると考えられた実験例 5 担体に小胞体を使つた場合の血小板との相互作用

血小板減少血漿（ [血小板] =5. 0 X 10⁴/ μ L) 80 Lを調製し、蛍光標識した

HI 2 - PEG (PEG)小胞体 (8. 2 μ Μ, 20 β ΐ) , または蛍光標識した抗体と H12 - PEG (PEG) 小胞体（0. 082 μ Μ, 20 μ L) を添加後、撹拌（30min， 37°C) した。続いてホルムアルデヒド（3. 7%) 固定、 10倍希釈後フローサイトメトリーを用いて計測した。

H12- PEG (PEG)小胞体を添加した血小板について、表 2より抗体の結合量が PBS や PEG小胞体を血小板に添加した系と変わらなかった。また、 H12-PEG (PEG)小胞体そのものも血小板とほとんど相互作用していなかった。従って、血流中にて

H12-PEG (PEG)小胞体は正常血小板と相互作用せず、活性化しないことを確認した。このことから、 H12 - PEG (PEG)小胞体は未活性血小板に膠着しにくいことが確認できた。

(表 2 ) 血小板への PAC-1の結合

Samples PA - 1 bind ing(%) vesicle binding (%) PBS 3.8+0.9 - PEG小胞体 3.4+0.3 1.3+0.7

H 12- PEG(PEG)小胞体 — 3.7 _0.4 1.4+0.6 ―

産業上の利用可能性

フィプリノーゲンの G P I I b / I I I a認識部位に含まれる合成ドデカぺプチドを結合させた結合体は、実質的に活性化された G P I I b Z l I I aとのみ特異的に結合し、血管中で未活性な血小板と凝集を起こすことにより血栓の生成あるいは血液の血管内凝固を誘導することがない。また、本発明のペプチド結合体にはヒト由来の成分を用いておらず、それら成分の合成体及び遺伝子組換え体を用いているため、感染リスクは回避される。従って、本発明のペプチド結合体は血小板代替物として有用である

Claims

請求の範囲

1. 一般式

「（微粒子） ― 〔（リンカ一）一Cy s— H i s一 H i s— L e u— G l y-G 1 y-A 1 a -L y s -G 1 n -A 1 a— G l y— A s p -V a 1 -COOH] _n」、あるいは一般式

Γ (微粒子) 一〔（スぺーサ一）一（リンカー）一Cy s -H i s一 H i s— L e u— G 1 y— G 1 y— A 1 a— L y s— G l n— A l a— G l y— A s p— V a 1 -COOH] J である結合体。

(式中、 nは整数）

2. 微粒子が、小胞体、ミセル、蛋白質重合体、合成高分子の何れか一から選ばれる請求項 1記載の結合体。

3. 微粒子が、小胞体、組換えアルブミン重合体、ラテックス粒子、生分解性高分子の何れか一から選ばれる請求項 1または 2に記載の結合体。

4.微粒子の粒子径が、 50nm以上である請求項 1〜 3の何れか一に記載の結合体。

5. 微粒子の粒子径が、 10 μπι以下である請求項 1〜4の何れか一に記載の結合体。

6. リンカ一が、片末端が SH基と反応し、もう片末端が 0Η基、 C00H基、蘭₂基のいずれか一と反応する化合物である請求項 1〜 5の何れか一に記載の結合体。

7. リンカ一が、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、ビスハロカルボニル化合物、ノヽロカルボニルマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチォカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか一から選ばれる請求項 1 〜 6の何れか一に記載の結合体。

8. リンカ一が、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、ビスマレイミド化合物、.ビスハロカノレボニル化合物、ハロカノレボニノレマレイミド化合物、ジチオマレイミド、ジチォカルボン酸及びマレイミドカルボン酸の何れか 1であり、かつ炭素鎖が C 2〜10である請求項 1〜 7の何れか一に記載の結合体。

9 . スぺーサ一が、ポリオキシエチレン、ポリペプチド、多糖、アルブミン及び抗体から選ばれる 1又はこれらの複数の組み合わせからなる請求項 1〜 8の何れか一に記載の結合体。

1 0 . 微粒子がラテックス粒子、スぺーサ一がアルブミン、リンカ一がジチォ力ルボン酸である請求項 1〜 9の何れか一に記載の結合体。

1 1 . 微粒子が小胞体、スぺーサ一がポリエチレングリコール、リンカ一がマレィミドカルボン酸である請求項 1〜 9の何れか一に記載の結合体。

1 2 . 請求項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体を含む血小板代替剤。

1 3 . 請求項 1〜1 1の何れか一に記載の結合体による血小板凝集の制御方法。

1 4 . 請求項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体の製造方法。

1 5 . 請求項 1〜1 1の何れか一に記載の結合体を含む診断薬又は試薬。

1 6 .血小板機能異常症の診断薬、生物学的 ·医学的な試薬、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤のスクリーニング用の試薬、血管損傷部位及び血栓形成部位の検查用診断薬又は治療剤である請求項 1 5の診断薬又は試薬。

1 7 . 請求項 1〜 1 1の何れか一に記載の結合体を含む薬物運搬体。

1 8 . 薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選択される請求項 1 7に記載の結合体を含む薬物運搬体。

1 9 . 請求項 1〜1 1の何れか一に記載の結合体を含む医薬組成物。

2 0 . 薬物が止血剤、血管収縮剤、抗炎症剤、抗血液凝固剤、抗血小板剤の何れか一から選択される請求項 1 9に記載の結合体を含む医薬組成物。

2 1 . 血管障害、血管損傷及び血栓症の予防又は治療のための請求項 1 9又は 2 0記載の医薬組成物。