WO2004065426A1 - Verfahren zur herstellung eines exopolymers aus sphingomonas adhaesiva und dessen verwendungen - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines exopolymers aus sphingomonas adhaesiva und dessen verwendungen Download PDF

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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • Gellan, Whelan and Rhamsan are used in the production of food, pharmaceuticals and cosmetics, as well as in oil production and many other industries.
  • the exopolysaccharide is preferably obtained from a vegetable or animal source.
  • bacteria of the genus Sphingomonas come into consideration.
  • Mutants of Sphingomonas adhaesiva are preferred.
  • the mutant of Sphingomonas adhaesiva which is listed under the number DSM 15145 in the "German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH "(DSMZ) on August 19, 2002.
  • the invention also provides a process for the preparation of the exopolysaccharide according to the invention, which as
  • Rhamnose is used in industry as a raw material for the production of furanoses or as a raw material in the Maillard reaction for the production of flavorings. So far, the rhamnose required for this has been obtained from rhamnoglycosides of quercetin and rutin, which are isolated from tree bark, fruit and a variety of other natural sources in complex processes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein wasserlösliches Exopolysaccharid mit niedriger Viskosität aus der Familie der Gellan ähnlichen Exopolysaccharide, das als Hauptbestandteil Rhamnose enthält und als weitere Bestandteile Glucose und Uronsäure sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Exopolysaccharids durch Fermentieren eines Bakteriums der Gattung Sphingomonas (Mutante von Sphingomonas adhaesiva mit der Hinterlegungsnummer DSM 15145), Isolieren des Exopolysaccharids aus dem Überstand der Fermentationsbrühe und Lyophilisieren des Verfahrensproduktes. Des weiteren wird die Verwendung von besagtem Exopolysaccharid beschreiben.

Description

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES EXOPOLYMERS AUS SPHINGOMONAS ADHAESIVA UND DESSEN VERWENDUNGEN
Die Erfindung beschreibt ein wasserlösliches Exopolysaccharid mit niedriger Viskosität aus der Familie der Gellan-ähnlichen Exopolysaccharide,. das als Hauptbestandteil Rhamnose und als weitere Bestandteile Glucose und Uronsäure enthält. Des weiteren wird die Verwendung des Exopolysaccharids beschrieben.
In der Lebensmittel-, pharmazeutischen und chemischen Industrie wächst der Bedarf an umweltverträglichen und günstig herstellbaren Polysacchariden mit unterschiedlichsten physikalischen Eigenschaften. Diese Gruppe von Polymeren zeichnet sich besonders durch ihre biologische Abbaubarkeit, ihre viskosen Eigenschaften und ihre Löslichkeit in Wasser aus. Die einzelnen Polysaσcharide unterscheiden sich durch ihre Viskosität, ihre Kompatibilität zu verschiedenen ionisierten Verbindungen, ihre Stabilität gegenüber hohen Temperaturen, pH und Salzkonzentrationen.
Exopolysaccharide wie z.B. Gellan, Whelan und Rhamsan werden aufgrund dieser Eigenschaften für die Herstellung von Lebensmitteln, Pharmaka und Kosmetika, sowie in der Erdölgewinnung und vielen anderen Industriezweigen eingesetzt.
Zu diesen Polysacchariden zählt auch Gellan, das von Bakterien der Gattung Sphingomonas als schleimiges Agglo erat produziert wird. Es setzt sich zusammen aus einer sich wiederholenden linearen Kette von D-Glucose, D-Glucuronsäure und L-Rhamnose im Verhältnis 2:1:1. Weitere Polysaccharide mit ähnlicher Struktur werden in der Familie der Gellan-ähnlichen Biopolymere zusam engefasst . Sie alle besitzen eine ähnliche lineare Struktur, in der wenigstens eine identische Trisaccharid-Sequenz mit der gleichen anomeren Konfiguration wie in Gellan auftritt. Die Hauptunterschiede in der Struktur liegen in der
Lokalisierung der Monosaccharid- und Disaccharid-
Seitenkettengruppierung. Bei einigen Polysacchariden findet sich
Mannose als Alternative zu Rhamnose im Rückgrat des Polysaccharids . Zu dieser Gellan-ähnlichen Familie gehören
Gellan Gum, Welan Gum (S130) , Rhamsan gu (S194), S-657, S-88,
S-198, NW-11 und PS-P4, die sich alle durch eine hohe Viskosität in wässriger Lösung und hohe thermische Stabilität auszeichnen
(R.M. Banik, B. Kanari and S.N. üpadhyay, 2000 "Exopolysaccharide of the gellan family: prospects and
Potential" World Journal of Microbiology & Biotechnology" Vol.
16, S. 407-414).
Wie auch Gellan werden diese Biopolymere mittlerweile hauptsächlich von Mikroorganismen durch Fermentation hergestellt.
Die hohe Viskosität dieser Exopolysaccharid-Lösungen bringt bei der mikrobiellen Fermentation allerdings Nachteile mit sich, welche die Kosten ihrer Herstellung erhöhen. Die Viskosität erschwert die Trennung der produzierten Exopolysaccharide von den B'akterienzellen und erfordert daher viele Verdünnungsschritte, um die Viskosität der Lösung soweit zu verringern, dass sich die Exopolysaccharide von den Zellen durch Zentrifugation trennen lassen. Die hohe Viskosität erhöht außerdem den Energieaufwand für das Durchmischen der Fermentationsbrühe und die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen.
So beschreibt EP-Al-1176209 ein Fermentationsverfahren zur Gewinnung von Exopoly eren der Gellan-ähnlichen Familie aus verschiedenen Sphingomonas-Mutanten, bei dem die Exopolymere in das umgebende Medium abgegeben und anschließend isoliert werden. Durch die Erzeugung von Mutanten, die das Exopolymer ins Medium abgeben, soll eine Möglichkeit gefunden worden sein, die
Polymere in größeren Maßstäben und vor allem kostengünstig für die Industrie nutzbar zu machen. Bei der Produktion der Exopolymere durch Fermentation besteht auch hier der Nachteil darin, dass die hohe Viskosität von 15.000-30.000 mPa*s in der
Fermentationsbrühe die Trennung der Exopolymere von den Bakterienzellen erschwert.
Gemäß der DE 693 20 067 wurden bei einem Massenscreening eine Reihe von Lactobacillus-Bakterien gefunden, die Exopolysaccharide aus Rhamnose und Glucose im Verhältnis von 1:1 bis 3:7 produzieren, um Exopolysaccharide mit verdickenden und/oder emulsionsstabilisierenden Eigenschaften herzustellen.
Auch einzelne Monomere aus den Polysacchariden der Gellan- ähnlichen Familie, wie z.B. Glucuronsäure und Rhamnose sind für die Industrie von Interesse. So wird z.B. in der EP AI 0 273 076 L-Rhamnose in großen Mengen aus Algen gewonnen. Die Gewinnung von Rhamnose erfolgt dabei mit einem Organismus, der langsamer wächst und aus dem die L-Rhamnose durch vorherigen Aufschluss der Zellen isoliert werden muss, was eine kontinuierliche Produktion von Rhamnose erschwert und die Kosten für die Herstellung in die Höhe treibt.
Die US 4,933,281 beschreibt die Gewinnung von Rhamnose aus Pseudomonas spec. als Rhamnolipid, das anschließend hydrolysiert wird, um das Monomer Rhamnose zu gewinnen.
Allen im Stand der Technik bekannten Verfahren ist jedoch gemein, dass nur auf kostspieligem Wege die Herstellung von Saccharid-Monomeren möglich ist.
Daher besteht ein hoher Bedarf, ein kostengünstiges Verfahren zur Herstellung dieser Saccharid-Monomere und Exopolysaccharide bereitzustellen und Exopolysaccharide mit neuen Eigenschaften für weitere Anwendungsfelder zu erschließen.
Durch intensive Forschung gelang es den Erfindern ein Exopolysaccharid bereitzustellen, das aus einem Bakteriu , das Exopolysaccharide der Gellan-ähnliche Familie produziert, erhältlich ist und sich durch eine Viskosität in der Lösung auszeichnet, die unter 20 mPa*s liegt, herzustellen.
Die vorliegenden Erfindung betrifft daher ein solches Exopolysaccharid, das aus einem Bakterium der Gattung Sphingomonas, das Exopolysaccharide der Gellan-ähnliche Familie produziert, erhältlich ist und eine Viskosität in wässriger Lösung bei 30°C und 0,4% (w/v) von unter 20 mPa*s, bevorzugt unter 15 mPa*s, besonders bevorzugt 10 mPa*s besitzt. Die Viskositätsmessungen sind dabei mit einem Schott-Viskosimeter (Schott, Mainz) durchgeführt worden.
Durch die geringe Viskosität des erfindungsgemäß hergestellten Exopolysaccharids ist es erstmals möglich, einen der wichtigsten limitierenden Parameter bei der Produktion von Exopolysacchariden deutlich zu verringern. Durch die geringe Viskosität der Fermentationsbrühe kann die Anzahl der Verfahrensschritte, die für ein effektives Abtrennen der exopolymerhaltigen Lösung von den Zellen notwendig ist, deutlich verringert werden. Die Kosten werden weiterhin durch den geringeren Energieaufwand beim Durchmischen der hochviskosen Fermentationsbrühe verringert.
Die geringe Viskosität wird durch den hohen Anteil an Rhamnose im Exopolysaccharid hervorgerufen. Das Exopolysaccharid enthält demnach als Hauptbestandteil Rhamnose, wobei der Anteil der Rhamnose bei 50-90 Gew.-% liegt. Dies erschließt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Rhamnose (6-Desoxymannose) durch ein einfaches bakterielles Fermentationsverfahren der industriellen Gewinnung zugänglich zu machen. Rhamnose wird von der Industrie als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Furanosen oder als Rohmaterial in der Maillard-Reaktion für die Herstellung von Aromastoffen verwendet .
Das erfindungsgemäße Polysaccharid der Gellan-ähnlichen Familie enthält neben dem Hauptbestandteil Rhamnose auch noch Glucose und Uronsäure und liegt bevorzugt in einer Zusammensetzung von
50-60 Gew.-% Rhamnose, 15-25 Gew.-% Glucose und 20-25 Gew.-% einer Uronsäure sowie gegebenenfalls bis 5% unbestimmbarer Rest vor, wobei die Anteile zusammen 100 Gew.-% ergeben. Eine besonders bevorzugtes Polysaccharid enthält 50 Gew.-% Rhamnose,
20 Gew.-% Glucose und 25 Gew.-% einer Uronsäure, wobei die
Uronsäure Guluronsäure, Glucuronsäure oder Mannuronsäure sein kann. Dabei beträgt die Viskosität in Lösung 10 -mPa*s bei 30°C und 0,4% (w/v) , und das Molekulargewicht dieses Exopolymers liegt zwischen 1 und 2 Millionen.
Neben den bereits erwähnten Vorteilen im Herstellungsverfahren erschließt dieses Exopolymer durch seine viskoelastischen Eigenschaften auch neue Anwendungsfeider für die Industrie, die ein großes Interesse an vielfältigen Exopolysacchariden mit unterschiedlichsten Eigenschaften hat.
Das Exopolysaccharid wird bevorzugt aus einer pflanzlichen oder tierischen Quelle gewonnen. Dabei kommen insbesondere Bakterien der Gattung Sphingomonas in betracht. Bevorzugt kommen Mutanten von Sphingomonas adhaesiva (DSM 7418) in Betracht. Besonders bevorzugt ist die Mutante von Sphingomonas adhaesiva, die unter der Nummer DSM 15145 bei der "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (DSMZ) am 19.08.2002 hinterlegt worden ist.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Exopolysaccharids bereit, das als
Hauptbestandteil Rhamnose enthält, dass die folgenden Schritte umfasst : a. Fermentieren eines Bakteriums der Gattung Sphingomonas, das Exopolysaccharide produziert; b. Isolieren des Exopolysaccharids aus dem Überstand der
Fermentationsbrühe; und c. Lyophylisieren des Verfahrensproduktes aus Schritt b, wobei das Bakterium einen Mutante von Sphingomonas adhaesiva mit der Hinterlegungsnummer DSM15145 ist.
Zur Steigerung der Ausbeute, insbesondere zur Erhöhung der
Rhamnoseausbeute und zur Vorbeugung gegen unerwünschte
Nebenreaktionen kann das Exopolysaccharid Schutzgruppen in der
2- und/oder 3-Position der Zuckermonomere bzw. Monomere der Uronsäure aufweisen. Mit den Schutzgruppen können insbesondere die an den monomeren Bestandteilen des Exopolysaccharids vorhandenen Hydroxylgruppen vor unerwünschten Nebenreaktionen geschützt werden.
Auf diese Weise ist es ebenso möglich, durch Wahl geeigneter Schutzgruppen am Polymer die hydrophilen/hydrophoben Eigenschaften des Polymers zu beeinflussen und somit je nach Wahl der Schutzgruppe, bzw. des Substituenten, an den Monomereinheiten auch die Viskositätseigenschaften des Polymers in wässriger Lösung entsprechend einzustellen. Dem Fachmann sind aus dem Stand der Technik zur Übertragung der Schutzgruppen, bzw. der Substituenten in der 2- und/oder 3- Position auf enzymatischem oder chemischem Wege oder Kombinationen davon verschiedene Verfahren bekannt. Für die Übertragung von Schutzgruppen auf die Monomere des Exopolysaccharids in den Positionen 2 und/oder 3 eignen sich in der Chemie allgemein gebräuchliche Derivatisierungsmethoden und enzymatische Modifikationen, die durch Transferasen oder Aldolasen katalysiert werden, bevorzugt durch O-Transacetylase (AlglJF) und Acetyl-CoA.
Die Schutzgruppen an den Positionen 2- und 3- einer Monomereinheit, hier als -R2 und -R3 bezeichnet, die gleich oder unterschiedlich voneinander sein können, können für -O-C1-C30- Alkyl, -O-(C=O)-C1-C30-Alkyl, -0- (C=0) -Aryl, -0- (S02) -Cι-C3o-Alkyl, -0-(S02) -Aryl, N-Acylaminverbindungen, -0- (PO) (OH) w(~O-Cι-C30~ Alkyl)2-W und -O-(PO) (OH) w(-0-Aryl) 2_w stehen, wobei w für 0, 1 oder 2 stehen kann und der Cι-C30-Alkylrest geradkettig, cyklisch oder verzweigt sein kann und gegebenenfalls mit einem oder mehreren von Amino, Heteroatomen, bevorzugt Halogen, substituiert sein kann, oder R2 und R3 zusammen genommen einen Ring -0- (CH2) n-0- mit n = 1 bis 4 bilden können.
Besonders bevorzugt sind die Schutzgruppen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Cx-C2o-Carboxylat, insbesondere For iat, Acetat, Pyruvat, Lactat, Acyl-, Cι-C20-alpha- Aminocarboxylat, Cι-C2o_N-Acyl-Verbindungen wie N-Formyl-, N- Acetyl-, N-Propionyl-, Sulfonat und Phosphat besteht.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich besonders durch den verringerten Energieaufwand während der Fermentation aus, da die geringe Viskosität des gebildeten Exopolymers den Energieaufwand beim Durchmischen der Lösung verringert. Die geringe Viskosität erleichtert außerdem die Isolation des exopolymerhaltigen Teils der Lösung vom Rest der Fermentationsbrühe . In einer bevorzugten Ausführungsform wird für die Isolation des Exopolymers die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen. Dies kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Zentrifugation oder Filtration der Fermentationsbrühe erreicht werden aber auch durch jede andere Methode die sich für diesen Zweck eignet. Nach Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wird das Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung unterzogen. Gefriertrocknung oder Ultrafiltration mit anschließender Ethanol-Präzipitation sind weitere Methoden, die sich für die Gewinnung des Exopolymers einsetzen lassen.
Aufgrund der vorteilhaften rheologischen und physiko-chemischen Eigenschaften eröffnen sich für die Industrie durch dieses Exopolymer neue Einsatzgebiete und Optimierungsmöglichkeiten für bereits bestehende Einsatzgebiete von Exopolysacchariden.
Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung des Exopolysaccharids in der Lebensmittelindustrie als
Verdickungsmittel, Stabilisator, Bindemittel, Geliermittel oder Fettersatzstoff.
Des weiteren lässt es sich in der pharmazeutischen Industrie für die Herstellung von Medikamenten, insbesondere ophthalmische Medikamente oder als Zusatz von Medikamenten zur regulierten Freigabe von Wirkstoffen, einsetzen.
Weiterhin kann es als Geliermittel in der Kosmetikindustrie, der chemischen Industrie oder bei der Herstellung von Zahnpflegemitteln verwendet werden.
Aufgrund des hohen Rhamnosegehaltes eignet es sich unter anderem auch für die industrielle Gewinnung von Rhamnose, die mittels der bisher im Stand der Technik beschriebenen Verfahren nicht möglich gewesen ist.
Rhamnose wird in der Industrie als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Furanosen oder als Rohmaterial in der Maillard- Reaktion für die Herstellung von Aromastoffen verwendet. Bisher wird die dafür notwendige Rhamnose aus Rhamnoglycosiden von Quercetin und Rutin gewonnen, die aus Baumrinden, Früchten und einer Vielzahl anderer natürlicher Quellen in aufwendigen Verfahren isoliert werden.
Die Erfindung wird nun im Detail anhand des folgenden Beispiels beschrieben.
Entwicklung der Sphingomonas Mutante DSM 15145
Den Zellwänden vieler Bakterien sind mehr oder weniger dicke Schichten stark wasserhaltigen Materials aufgelagert, die als Kapseln oder Schleimhüllen bezeichnet werden. Die Kapseln bestehen meist aus Polysacchariden, die außer Glucose auch noch Aminozucker, Rhamnose, 2-Keto-3-desoxygalactonsäure, Uronsäuren der Zucker und organische Säuren enthalten. Viele dieser Kapselsubstanzen werden als Schleime in die Umgebung abgegeben. Diese schleimigen Polysaccharide werden als Exopolysaccharide oder Exopolymere bezeichnet.
Die Exopolymer-bildende Mutante von Sphingomonas adhaesiva DSM 7418 wurde durch Behandlung mit einem mutationsauslösendem Agens, bevorzugt N-methyl-N' -nitro-N-nitroso-guanidin (NMG) , und durch anschließende phänotypische Selektion der mucoiden Kolonien erhalten. Für die Erzeugung von ungerichteten Mutationen können allerdings auch andere Substanzen, wie zum Beispiel Ethylmethansulfonat, UV-Strahlung, 5-Bromuracil oder salpetrige Säure verwendet werden. Die Selektion der Exopolymer-bildenden Mutanten erfolgte vorzugsweise durch optische Auswertung des Umfangs der Schleimhüllen der einzelnen Bakterienkolonien. Zusätzlich kann die Zugabe von Disacchariden zum Nährmedium die Bildung einer Schleimhülle anregen. Der lichtmikroskopische Nachweis dieser Schleimhüllen ist dabei indirekt in einer suspendierten Lösung der Bakterienkolonien durch Kontrastfärbung der umgebenden Lösung mit Nigrosin, Kongorot oder chinesischer Tusche möglich.
Die bei diesen Versuchen erhaltene Variante des Bakteriums Sphingomonas adhaesiva DSM 7418 wurde am 19. August 2002 bei der "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (DSMZ) in Braunschweig unter der Nummer DSM 15145 hinterlegt.
Das selektierte Bakterium wird danach zur Vermehrung und weiteren Charakterisierung in R2A Medium oder einem anderen dafür geeignetem Nährmedium vorzugsweise bei 30 °C fermentiert. Die Viskositätsmessung der bei der Kultuvierung erhaltenen wässrigen Lösung, die das Exopolymer enthält, wird mittels eines Schott-Viskosimeters durchgeführt.
Zur Kultivierung der Sphingomonas-Bakterien werden in der Regel flüssige Kulturen, die mindestens eine Kohlenstoffquelle, die aus Glucose, Lactose, Sucrose, Maltose oder Maltodextrin ausgewählt wird, enthalten, verwendet. Dazu wird als Stickstoffquelle mindestens eine Substanz aus anorganischem Ammonium, anorganischem Nitrat, organische Aminosäuren ausgewählt oder proteinische Materialien, wie z.B. Hefeextrakt, Sojamehl und Casein verwendet. Weitere Zusatzstoffe sind anorganische Salze und Vitamine. In diesem Herstellungsbeispiel wurde das wie folgt beschriebene R2Ä Medium eingesetzt, dass sich wie folgt zusammensetzt: 0.5 g/1 Hefeextrakt, 0.5 g/1 Proteose-Pepton, 0.5 g/1 Casein-Hydrolysat, 0.5 g/1 Glucose, 0.5 g/1 lösliche Stärke, 0.3 g/1 Natriumpyruvat, 0.3 g/1 Dinatriumhydrogenphosphat, und 0.05 g/1 Magnesiumsulfat. Die Zellen lässt man so lange wachsen, bis sie kurz vor Erreichen der stationären Phase stehen. Danach wird die Kulturbrühe abzentrifugiert, um die exopolysaccharidhaltige Lösung von den Zellen abzutrennen. Aufgrund der niedrigen Viskosität der gebildeten Exopolymerlösung lässt sich dabei dieser Schritt ohne vorherige oder mit wenigen Verdünnungsschritten der gesamten Lösung ausführen.
Isolierung des Exopolymers aus der Kultur
Um das Exopolymer aus dem zuvor gewonnenen Zeilüberstand zu isolieren und zu konzentrieren, werden alle anderen Bestandteile vom Zeilüberstand abgetrennt.
Für die Präzipitation wird Isopropanol (nach Linn, C.C. und Casida, L.E. (1984) Applied & Environmental Microbiology; 47:427-429), kaltes Ethanol (nach Ligio, O.M. und Correia, I.Sa. (1991) Biotechnology & Applied Biochemistry; 14:357-364), Gefriertrocknung oder Ultrafiltration mit anschliessender Ethanol-Präzipitation eingesetzt. Bei der Ultrafiltration werden asymmetrische Membranen mit verschieden großen Poren an Unter- und Oberseite und verschiedenen Ausschlussgrenzen aus Cellulose, Celluloseester, Polyethersulfon oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) verwendet.
Der Zeilüberstand wird mittels Druckdifferenzen oder Zentrifugation durch die Membranen gepresst. Dadurch kann das Probevolumen ohne Veränderung der Salzkonzentration verringert werden. Durch diesen Konzentrierungsschritt wird das Volumen an Ethanol verringert, das bei der angeschlossenen Ethanol- Präzipitation des Exopolysaccharids benötigt wird. Zuvor wird die konzentrierte Lösung vorzugsweise mit 5 M Trichloressigsäure behandelt, um die Proteine aus der Lösung zu entfernen. Nach der Neutralisierung mit Natronlauge erfolgt die eigentliche Ethanol- Präzipitation des Exopolysaccharids aus der Lösung.
Für die Gewinnung des reinen Exopolysaccharid-Pulvers wird das Präzipitat bei -70°C eingefroren und lyophylisiert .
Charakterisierung des gewonnenen Exopolymers
'Zur Bestimmung des gesamt Kohlenhydratgehaltes (Anthron-Test) im Exopolymer werden 100 μl einer eisgekühlten Probe des gelösten Exopolymers mit 1 ml eiskaltem Anthron-Reagenz gemischt. Das Anthron-Reagenz setzt sich zusammen aus 0,2 g Anthron (9(10H)- Anthracenon) , 8,0 ml Ethanol (96%, w/v) , 30,0 ml H20 (bidest.) und 100 ml H2S0 (95 bis 97%, w/v, p.A.). Diese Lösung wird für 5 min auf Eis gelagert und anschließend für 7 min bei 95 °C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Extinktion bei einer Wellenlänge von 644 nm gemessen. Zur Bestimmung der Kohlenhydrat-Konzentration wird eine Eichgerade mit D-Glucose im Bereich von 0 bis 100 μg/ l erstellt.
Für den Uronsäurenachweis werden 0,2 ml der Exopolymer-Lösung mit 1,2 ml H2S04-Tetraborat-Lösung (0,0125 M Dinatriumtetraborat in konz. H2S04) vermischt und 10 min in einem Eisbad äquilibriert . Danach wird diese Lösung für 5 min bei 100 °C inkubiert und danach für 5 min im Eisbad abgekühlt. Anschließend werden 20 μl m-Hydroxydiphenyl-Lösung (0,15% (w/v) in 0,5% (v/v)
NaOH (0,125 M) ) hinzu pipettiert und für 45 s gemischt. Die
Extinktion wird nach weiteren 10 min bei 520 nm gemessen
(Leerwertkontrolle enthält H20 (dest.) anstatt der Probe). Zur
Bestimmung der Uronsäure-Konzentration wird eine Eichgerade mit Alginatlösung (0,2 mg/ml in H20 (dest.)) im Bereich von 10 bis 200 μg/ml erstellt.
Für die Bestimmung des Rhamnosegehaltes werden 100 μl Proben einer Exopolymerlösung mit 900 μl einer Lösung zusammengegeben, die 0,19% Orcin (in 53% (v/v) H2S0) enthält. Dieses Gemisch wird für 30 min bei 80°C inkubiert und anschließend für 15 min auf Raumtemperatur heruntergekühlt. Die Extinktion der Proben wird bei einer Wellenlänge von 421 nm gemessen. Zur Bestimmung der Rhamnose-Konzentration wird eine Eichgerade mit Rhamnose-Lösung im Bereich von 0 bis 50 μg/ml erstellt.
Um auszuschließen, dass primäre Amine im Exopolymer enthalten sind, wird eine Aminosäurebestimmung durchgeführt. Dazu wird das Exopolymer in 6 M HCl-Lösung (1 mg/100 ml) für 12 h hydrolisiert, anschließend lyophilisiert und im gleichen Volumen destilliertem Wasser gelöst. Die so erhaltenen hydrolisierten Exopolymer-Proben werden einer Vorsäulenderivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA) unterzogen, um anschließend in einer Reversed-Phase-Chromatographie (RP) primäre Amine nachweißen zu können. Für die Derivatisierung werden 460 μl einer Exopolymer- Probe mit 200 ml eines 0,5 M Borat-Puffers (pH 9,5) und 100 μl OPA Reagenz vermischt. Nach 200 s Inkubation bei Raumtemperatur werden 50 μl 0,75 M HCl-Lösung zugegeben, um den pH Wert auf 7,0 bis 7,5 einzustellen und damit die Derivatisierungsreaktion zu stoppen. Für die RP Analyse werde 100 μl der Lösung aus der Derivatisierungsreaktion mit 400 μl Elutions-Lösung gemischt (26:74 Methanol/50 mM Natriumacetat) ..Von dieser Mischung werden 20 μl auf die zuvor mit Elutions-Lösung äquilibrierten RP Säule (0,46 x 12,5 cm, RP18 Techsphere ODS-2; Kontron Instruments) gegeben. Die aus primären Aminosäuren und OPA gebildeten Isoindolderivate werden mit einem Methanol/50 mM Natriumacetat Gradienten eluiert, bei dem der Methanol-Gehalt bei 40 °C und einer Flußrate von 1 ml/min-1 von 26 auf 75% (v/v) linear zunimmt. Die gebildeten Isoindolderivate können dann bei 330/450 nm (Extinktion/Emission) fluorimetrisch bestimmt werden (Modell: 1046A Fluoreszenzdetektor von Hewlett Packard) . Die Kalibrierung des Gerätes erfolgt mit einer reinen Aminosäurelösung (chromatographisch rein, Sammlung AS-10 von Serva Feinbiochemica) .
Bei der Bestimmung des Gehaltes an primären Aminosäuren im Exopolymer, dass aus dem Sphingomonas Bakterium isoliert worden ist, konnten primäre Amine nicht nachgewiesen werden.
Die Bestimmung des Molekulargewichts des Exopolymers erfolgt mittels einer Gelper eationschromatographie (GPC) . Dazu werden 2 bis 3 mg des lyophilisierten Polymers in Eppendorf- Reaktionsgefäßen in 1 ml Laufpuffer resuspendiert. Der Laufpuffer setzt sich zusammen aus 9, 0 g Na2HP04-12 H20 und 1,5 g KH2P04 ad 1000 ml (pH 7,0, H20 (bidest.)). Die suspendierten Proben werden danach in Autosampler-Gefäße N8-1 (Fa. Machery Nagel) überführt.
Vor der Auftrennung der zu untersuchenden Proben wird die Säule zwei Stunden lang mit dem Laufpuffer äquilibriert . Nach der Äquilibrierung wird ein Probevolumen von 20 μl mit Hilfe des Autosampiers Basic (Fa. Marathon, Groß-Umstadt, D) in die GPC- Apparatur eingespritzt. Mittels einer HPLC-Pumpe 64 (Fa. Knauer, Groß-Umstadt, D) werden die Proben dann für 35 min, bei einer Flussrate von 1 ml/min über zwei in Serie geschaltete Hydroxy- Ethyl-Methacrylat-Säulen, HemaBio 1000 und HemaBio 100 (Fa. Polymer Standard Service, PSS, Mainz, D) aufgetrennt. Zur Detektion wird ein Differential-Refraktometer (Fa. Knauer, Groß- Umstadt, D) verwendet.

Claims

Patentansprüche :
1. Exopolysaccharid, das durch Kultivieren eines Bakteriums der Gattung Sphingomonas, das Exopolysaccharide produziert, erhältlich ist, zur Familie der Gellan-ähnlichen Exopolysaccharide gehört und eine Viskosität in wässriger Lösung bei 30°C und 0,4% (w/v) von unter 20 mPa*s besitzt.
2. Exopolysaccharid nach Anspruch 1, das als Hauptbestandteil Rhamnose enthält.
3. Exopolysaccharid nach Anspruch 2, dessen Rhamnoseanteil bei 50-90 Gew.-% liegt.
4. Exopolysaccharid nach Anspruch 3, das als Hauptbestandteil Rhamnose sowie Glucose und Uronsäure enthält.
5. Exopolysaccharid nach Anspruch 4, das 50-60 Gew.-% Rhamnose, 15-25 Gew.-% Glucose und 20-25 Gew.-% Uronsäure sowie gegebenenfalls bis 5% eines unbestimmbaren Restes enthält, wobei die Anteile zusammen 100 Gew.-% ergeben.
6. Exopolysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Viskosität in wässriger Lösung bei 30 °C und 0 , 4 % (w/v) bei 10 mPa*s liegt.
7. Exopolysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bakterium eine Mutante von Sphingomonas adhaesiva ist .
Exopolysaccharid nach Anspruch 7, wobei das Bakterium eine Mutante von Sphingomonas adhaesiva mit der Hinterlegungsnummer DSM15145 ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines Exopolysaccharids gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dass die folgenden Schritte umfasst : a. Fermentieren eines Bakteriums der Gattung Sphingomonas, das Exopolysaccharide produziert; b. Isolieren des Exopolysaccharids aus dem Überstand der Fermentationsbrühe; und c. Lyophylisieren des Verfahrensproduktes aus Schritt b, wobei das Bakterium eine Mutante von Sphingomonas adhaesiva mit der Hinterlegungsnummer DSM15145 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Exopolysaccharid aus Schritt b. vor dem Lyophilisieren einer Reaktion zur Übertragung von Schutzgruppen in der 2- und/oder 3-Position der Monomereinheit, ausgewählt aus Rhamnose, Glucose und Uronsäure, auf enzymatischem und/oder chemischem Wege unterzogen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Schutzgruppen -R2 und - R3, die gleich oder unterschiedlich voneinander sein können, für -O-Cι-C30-Alkyl, -0- (C=0) -Cι-C30-Alkyl, -0- (C=0) -Aryl, -0-
(S02) -Cι-C3o-Alkyl, -0- (S02) -Aryl, N-Acylaminverbindungen, -0-
(PO) (OH)w(-0-C1-C3o-Alkyl)2-w und -0- (PO) (OH) „ (-O-Aryl) 2-w stehen, wobei w für 0, 1 oder 2 stehen kann und der Cι-C30- Alkylrest geradkettig, cyklisch oder verzweigt sein kann und gegebenenfalls mit einem oder mehreren von Amino,
Heteroatomen, bevorzugt Halogen, substituiert sein kann, oder
R2 und R3 zusammengenommen einen Ring -0-(CH2)n-0- mit n = 1 bis 4 bilden können.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Schutzgruppen -R2 und - R3, die gleich oder unterschiedlich voneinander sein können, aus der Gruppe ausgewählt werden, die Cι-C2o~Carboxylat, insbesondere Formiat, Acetat, Pyruvat, Lactat, Acyl-, Cι-C2o- alpha-Aminocarboxylat und Cι-C2o-N-Acyl-Verbindungen, insbesondere N-Formyl-, N-Acetyl-, N-Propionyl-, Sulfonat und Phosphat umfasst.
13. Verfahren nach Anspruch 9-12, wobei zur Isolierung des Exopolymers die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei nach der Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile das
Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung, unterzogen wird.
15. Exopolymer, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14.
16. Verwendung des Exopolymers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 15 zur Herstellung von Rhamnose.
17. Verwendung des Exopolymers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 15 als Zusatzstoff für Lebensmittel, insbesondere als Verdickungsmittel, Stabilisator, Bindemittel, Geliermittel, oder Fettersatzstoff.
18. Verwendung des Exopolymers aus einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 15 bei der Herstellung von Medikamenten, insbesondere ophthalmischen Medikamenten, oder solchen zur regulierten Freigabe des Wirkstoffes.
19. Verwendung des Exopolymers aus einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 15 als Zusatzstoff bei kosmetischen Erzeugnissen.
20. Mutante von Sphingomonas adhaesiva mit der Hinterlegungsnummer DSM15145. 29
21. Verwendung der Mutante nach Anspruch 20 zur Herstellung von Rhamnose .
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