WO2004058817A1 - 新規タンパク質およびその用途 - Google Patents

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WO2004058817A1
WO2004058817A1 PCT/JP2003/016655 JP0316655W WO2004058817A1 WO 2004058817 A1 WO2004058817 A1 WO 2004058817A1 JP 0316655 W JP0316655 W JP 0316655W WO 2004058817 A1 WO2004058817 A1 WO 2004058817A1
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seq
amino acid
cancer
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PCT/JP2003/016655
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Eiji Sunahara
Takafumi Ishii
Koji Yamamoto
Shuji Sato
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein, a polynucleotide encoding the same, a method for producing the same, a cancer preventive / therapeutic agent or diagnostic agent, an apoptosis promoting agent, a cancer preventive / therapeutic agent, or screening for an apoptosis promoting agent.
  • a novel protein a polynucleotide encoding the same, a method for producing the same, a cancer preventive / therapeutic agent or diagnostic agent, an apoptosis promoting agent, a cancer preventive / therapeutic agent, or screening for an apoptosis promoting agent.
  • Recent advances in microarray and oligonucleotide array technologies have enabled comprehensive analysis of gene expression. It has also been predicted that the disease state of cancer can be evaluated by gene microarray profiling, and in fact, it has been reported that leukemia can be classified by gene expression profile in leukemia. To clarify gene expression profiles of individual cancer tissues and accumulate their classification to predict responsiveness to specific cancer treatments and to discover new drug discovery target proteins for specific cancers It will be possible. Specifically, when the expression of a certain protein is increased in a certain cancer, the expression level of the protein is decreased in a newly diagnosed antigen-positive patient; Antitumor activity can be induced by methods such as suppressing functions, and (iii) eliciting a host immune response to the protein.
  • Semaphor in family is a large family of proteins, both secreted and membrane-bound, with at least 19 vertebrate and three invertebrate genes reported (Cell 97). Vol. 551-552, 1999).
  • Semaphor in family is a widespread typified by neural axon guidance and synapse formation It is known to be involved in the peripheral neurogenesis process.
  • the involvement of semaphor in family in the immune system (Trends in I. unol. 22, 670-676, 2001) and its involvement in 11 organ development and angiogenesis are becoming apparent.
  • Semaphor in 3B and Semaphor in 3F derived from human belonging to Semaphor in family have been reported as tumor suppressor genes (Proc. Natl Acad. Sc. USA 98, 13954-13959, 2001; Cancer Res. 62, 542-546, 2002, Cancer Res. 62, 2637-2643, 2002).
  • Semaphor in 3C has been reported to be upregulated in human lung cancer tissues (J. Surg. Oncol. 72, 18-23, 1999, Proc. Natl Acad. Sc. USA 94, 14713-718, 1997). Semaphor in 3E has been reported to be expressed in metastatic cells (Cancer Res. 58: 1232-1244, 1998).
  • Semaphorin 4B having 41% homology to Semaphorin4D at the amino acid level (hereinafter sometimes abbreviated as SEMA4B) is registered in GenBank as a gene predicted from the genome sequence (GenBank Accession No. XMJ44533). SEMA4B has been reported as one of the genes whose expression increases under hypoxic conditions (TO 02/46465). In addition, it has been reported that hundreds of nucleotide sequences, including SEMA4B, can be used to diagnose lung cancer or to search for compounds that treat lung cancer based on gene chip analysis (W02 / 86443) SEMA4B and amino acid levels N0V7 with 93% homology has been reported to be expressed in cancer (W002 / 06329).
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, found a novel gene whose expression is significantly increased in lung cancer tissues, and the antisense oligonucleotide of this gene promotes apoptosis of cancer cells. I also found out. Further studies based on this knowledge have led to the completion of the present invention.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide of (4) or a part thereof,
  • (21) A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein according to (1), which comprises using the protein or partial peptide thereof or a salt thereof according to (1);
  • (22) a kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein of (1), which comprises the protein of (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • (22a) a compound or a salt thereof, which inhibits the expression of the protein of (1), obtained by using the screening method of (21) or the screening kit of (22);
  • (22b) a medicine comprising the compound of (22a) or a salt thereof described above; (23) the protein gene of (1), characterized by using the polynucleotide of (4) above; A method for screening a compound that inhibits the expression of
  • an apoptosis-promoting agent comprising a substance that inhibits the expression of the protein or the partial peptide thereof according to (1) or the expression of the gene of the protein,
  • an apoptosis-promoting agent comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • a prophylactic / therapeutic agent for cancer comprising an antibody against a protein having the same or colder amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof ,
  • a cancer cell growth inhibitory agent comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof ,
  • (31) a base complementary or substantially complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • (32) a medicament comprising the polynucleotide according to (31); (33) a medicament according to (32), which is an apoptosis-promoting agent;
  • an apoptosis-promoting agent which comprises a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding a partial peptide thereof; Screening kit,
  • an amino acid identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 A substance that inhibits the expression of a protein containing a sequence or a partial peptide or a salt thereof; (ii) a substance that inhibits the expression of a gene of the protein or a partial peptide thereof; or (iii) a protein or a part thereof.
  • a method for promoting apoptosis of cancer cells which comprises administering an effective amount of a peptide or a salt thereof to the subject.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10
  • a method for promoting apoptosis of cancer cells which comprises inhibiting the expression of a salt thereof, or inhibiting the expression of the gene for the protein or its partial peptide.
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 (hereinafter referred to as the present invention) Protein or the protein used in the present invention) is a cell of a human warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chick, egret, bush, sheep, hidge, monkey, etc.).
  • a human warm-blooded animal eg, guinea pig, rat, mouse, chick, egret, bush, sheep, hidge, monkey, etc.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 95% or more, preferably about 98% or more, preferably about 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Amino acid sequences having a homology of 99% or more.
  • an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1 And a protein having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 examples include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 .
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 described above. However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferred. ' Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • Examples of the protein containing the f-amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 described above. And a protein having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 includes, for example, an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 Is mentioned.
  • proteins having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include, for example, those substantially identical to the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 10
  • a protein having an amino acid sequence and having substantially the same activity as a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is preferred.
  • the homology of amino acid sequences can be calculated using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National-Center for Biotechnology Information Basic Basic Alignment Search).
  • Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) identical. Therefore, the activity of the protein of the present invention may be equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Although preferred, the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • Examples of the protein used in the present invention include: (1) (i) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (eg, about 1 to 50, preferably 1 to 50) An amino acid sequence in which about 30 amino acids have been deleted, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably about 1 to 5 amino acids, (ii) SEQ ID NO: 1 1 or 2 or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 50, ) Amino acid sequence; (iii) one or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30 and more preferably about 1 to 50 amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) Is an amino acid sequence having about 1 to 10 amino acids, more preferably (1 to 5) amino acids, and (iv) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, An amino acid sequence in which about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more
  • (2) an amino acid sequence in which one or two amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 are deleted; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 has 1 or more amino acid sequences (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably An amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids are added, and more preferably (1 to 5) amino acids;
  • (iii) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 0.7 or SEQ ID NO: 10 (Iv) one or two amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10; An amino acid sequence in which one amino acid has been replaced with another amino acid, or (V) an amino acid that combines them So-called mucins such as proteins containing sequences are also included.
  • mucins such as proteins containing sequences are also included
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the protein has a N-terminus at the left end (amino terminus) and a C-terminus at the right end (capillary terminus) according to the convention of peptide notation.
  • the protein used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminal lipoxyl group (-C00H), carboxylate (-C00-), amide (-C0NH) 2 ) or ester (-C00R).
  • R in the ester is, for example, methyl, ethyl, n-propyl Le, isopropyl, C, such as n- butyl, _ 6 alkyl groups, for example, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, shed - C 6, such as naphthyl - 12 Ariru group , for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl - _ 14 Ararukiru groups such as C Bok 2 a one Nafuchiru al kill such as an alkyl group or a flying one naphthylmethyl, etc.
  • Pipa Roi Ruo carboxymethyl group is used.
  • the protein used in the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned ester at the terminal or the like is used.
  • the protein used in the present invention the amino acid residue (e.g.,. Mechionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., such as C M Ashiru group such Arukanoiru such formyl group, Asechiru group) N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation,
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., such as C M Ashiru group such Arukanoiru such formyl group, Asechiru group
  • N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation
  • Substituent on the side chain of amino acid in the molecule eg, ⁇ H, —SH, amino, group, imidazole group, indole group, Guanijino group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., ho mill group, those protected by Asechiru like Ashiru groups such
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the like are examples of the protein used in the present invention.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein used in the present invention described above, and is preferably any one having the same properties as the protein used in the present invention described above. It may be something.
  • At least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably Peptides having an amino acid sequence of preferably 100 or more, most preferably 200 or more are used.
  • the partial peptide used in the present invention may have one or two or more amino acids in the amino acid sequence thereof (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5 ) Amino acids are deleted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5 ) Amino acids, or 1 or 2 or more (preferably about 1-20, more preferably about 1-10, and more preferably about 1-10 amino acids) in the amino acid sequence. 5)) amino acids, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20; more preferably about 1 to 10; more preferably several) in the amino acid sequence. (More preferably about 1 to 5) amino acids are replaced with other amino acids It may be.
  • the partial peptide used in the present invention may be anything Re at the.
  • the partial peptides used in the present invention include those having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, and the N-terminal amino acid residue, as in the above-mentioned protein used in the present invention.
  • carboxyl group or carboxylate
  • N-terminal amino acid residue as in the above-mentioned protein used in the present invention.
  • methionine residue whose amino group is protected by a protecting group, N-terminal cleavage in vivo, dalminamine residue generated by pyroglutamine oxidation, side chain of amino acid in the molecule
  • glycopeptide such as a so-called glycopeptide.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid, an organic acid
  • a base eg, an alkali metal salt
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Acids, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the cells or tissues of the above-mentioned human ⁇ warm-blooded animal by a known method for purifying protein. It can also be produced by culturing a transformant containing the encoding DNA. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below. '
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • resins include, for example, chlorotyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4_ (2', 4'dimethoxyphenyle Fm oc aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target protein according to various condensation methods known per se.
  • protein or partial peptide is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their peptide Obtain the amide form.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or pre-protected as a symmetrical anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after the activation of the amino acid.
  • a racemization inhibitor additive eg, HOBt, HOOBt
  • pre-protected as a symmetrical anhydride or HOBt ester or HOOBt ester it can be added to the resin after the activation of the amino acid.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulphoxides such as dimethylsulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxyl-ponyl, C 1 _Z, Br—Z, and adaman Tiloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, an alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (e.g., benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, etc. Can be protected.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohex
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower (Cw) alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group are used.
  • a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 one B zl, 2_ nitrobenzyl, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • protecting group for histidine imidazole for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used. .
  • Examples of the activated carbonyl group of the raw material include, for example, corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOB t)].
  • alcohol for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and esters with HOB t
  • As the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoramide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc.
  • Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, treatment with base using diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Is also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. (to 40 ° C.).
  • a cation scavenger such as anisol, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • a cation scavenger such as anisol, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 4
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, and the activation of the functional group involved in the reaction can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide of a protein or partial peptide for example, first, amidating the 0! -Hydroxyl group of the carpoxy terminal amino acid and protecting it, and then attaching a peptide (protein) chain to the amino group side of the desired After extending to the chain length, a protein or partial peptide from which only the N-terminal ⁇ -amino group-protecting group of the peptide chain has been removed and a partial peptide and only the C-terminal lipoxyl group-protecting group have been removed. Are produced, and these proteins or peptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the ⁇ -lipoxyl group of the terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of a protein or peptide, An ester of the desired protein or peptide can be obtained.
  • the partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be prepared by a known peptide synthesis method, or by converting the protein used in the present invention into a suitable peptide. It can be produced by cutting with lyase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide which can constitute the partial peptide used in the present invention is obtained by condensing an amino acid and the remaining part, and when the product has a protecting group, removing the protecting group to obtain the desired peptide. Can be manufactured. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (V).
  • the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by combining crystals and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained by a salt, a known method or Can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Also, the cell described above. Reverse RNA was directly prepared using total RNA or mRNA fraction prepared from tissue. It can also be amplified by the Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter referred to as RT-PCR method).
  • the DNA encoding the protein used in the present invention includes, for example, (i) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a highly stringent condition with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein having a base sequence that hybridizes under the following, and encoding a protein having substantially the same properties as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 95% or more, preferably about 98 or more, and more preferably DNA containing a base sequence having about 99% or more homology is used.
  • Examples of DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 under high stringent conditions include, for example, a base having 99.9% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 DNA containing a sequence is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 under high stringent conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 DNA containing a base sequence having 99.9% or more homology is used.
  • Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringent conditions include, for example, 99.9% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • a DNA containing a base sequence or the like is used.
  • Hybridization can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringency conditions.
  • High stringency end conditions refer to, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C.
  • a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM
  • a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C.
  • the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO:
  • the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, etc. is used as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • DNA or DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6; and (iii) DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes SEQ ID NO: DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 or DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 encodes (iv) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 DNA or SEQ ID NO containing the base sequence that is: such as DN A is used which contains a nucleotide sequence represented by 12.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention includes a base sequence encoding the partial peptide used in the present invention described above. Any material containing a row may be used. Further, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include, for example, a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11.
  • the DNA of the present invention which comprises a DNA having the sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11 and a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions
  • DNA containing a part of DNA encoding a protein having substantially the same activity as a protein is used.
  • DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11 has the same significance as described above.
  • DNA that completely encodes the protein or partial peptide used in the present invention (hereinafter, these may be simply referred to as the protein of the present invention in the description of the cloning and expression of the DNA encoding the same).
  • DNA amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or a DNA incorporated into an appropriate vector is used for the cloning of the present invention.
  • Selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment coding for a part or the entire region of the protein or labeled with synthetic DNA.
  • the hybridization method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0DA-LA PCR method. , Gapped duplex method, Kunkel method, etc. You can do it in the following way:!?
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to
  • the vector examples include a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast ( For example, pSH19, pSH15), bacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., ⁇ 1_11, ⁇ XT1, pRcZCMV, pRc / RSV, pc DNA IZNeo is used. '
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when animal cells are used as hosts, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. ,
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus promoter
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter,? Otsupu opening motor -, ⁇ ⁇ ⁇ promoter, Ding?
  • the host is a Bacillus genus, SPOL promoter, SP ⁇ 2 promoter, penP promoter, etc.
  • the host is yeast, PHO5 promoter, PGK Promoters, GAP promoters, ADH promoters and the like are preferred.
  • polyhedrin promoter overnight, P10 promoter evening, and the like are preferable.
  • an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV400 ri), and the like, if necessary, may be used as the expression vector.
  • the selection Ma one car, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [Mesotorekise Ichito (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r) , neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance).
  • dh fr gene is used as a selection marker by using dh fr gene-deficient Chinese eight muster cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA 'signal sequence, a 0-A signal sequence, etc.
  • a signal sequence such as an amylase * signal sequence and a subtilisin signal sequence, If the host is yeast, MFo! Signal sequence, SUC2, signal sequence, etc.
  • the host is a animal cell, insulin signal sequence, ⁇ ; —interferin signal sequence, antibody molecule A signal sequence or the like can be used.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, konjac, animal cells and the like are used.
  • Escherichia include, for example, Escherichia coli.
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, 24, 255 (1983)
  • 207-21 Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used. .
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD-5D, 20B—12, Schizosaccharomyces poinbe N CYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastori (Pichia pastoris) KM 71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), an MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and a High Five derived from the egg of Trichoplusia ni TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. If the virus is NPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori cell; BmN cell) or the like is used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (above, Vaughn, J.L., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Neichia- (Nature), 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CH ⁇ (hereinafter, CHO (dh fr ”) Cells, mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeoma cells, mouse ATDC 5 cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • CHO Chinese hamster cell CHO
  • yeast can be transformed according to the method described in, for example, Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, 1929 (1978). Can be.
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-. 55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium for cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liqueur, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potatoes.
  • examples of inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8. .
  • a culture medium for culturing the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burk Folder (Burkholder) Minimal Medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 t for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant in which the host is an insect, the culture medium may be supplemented with Grace's Insect Medium (Nature, 195,788 (1962)) with appropriate addition of immobilized 10% serum or other additives. Are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the culture medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology , 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The
  • the pH is between about 6 and 8.
  • Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane, or outside the cells. '
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, lysozyme and Z or freeze-thawed. After the cells or cells are disrupted, a method of obtaining a crude oil effluent of the protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM. If protein is secreted into the culture, the cells may be secreted after the culture by a method known per se. Separate the supernatant from the cells or cells and collect the supernatant.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, etc.
  • Method using difference in electric charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, etc.
  • a method utilizing the difference in hydrophobicity a method utilizing the difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, a method known per se or analogous thereto Depending on the method, it can be converted into a free form or other salts.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay or Western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. Is also good.
  • an antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof uses the protein of the present invention as an antigen, Known antibodies Alternatively, it can be produced according to a method for producing an antiserum.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse is selected, and spleen or lymph nodes are collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [ Nature , 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene daricol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS_1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells to be used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, for 1 to 10 minutes.
  • anti-immunoglobulin which is obtained by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, a microplate) onto which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then labeling with a radioactive substance, an enzyme, or the like
  • a method of adding a hybridoma culture supernatant to the adsorbed solid phase, adding a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like, and detecting a monoclonal antibody bound to the solid phase can be used.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • a serum-free medium for culturing eight hybridomas SF M_101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain the antibody. You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dis
  • the polyclonal antibody of the present invention can be obtained by a method known per se or a method analogous thereto. Therefore, it can be manufactured. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance of the protein of Example 1 and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier protein and hapten are determined by cross-linking carrier protein to immunization. Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the hapten.However, for example, serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. are converted to hapten 1 by weight. On the other hand, a method of coupling at a rate of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used. '
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier protein, but a dartalaldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production during administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as in the above-described monoclonal antibody separation and purification.
  • Polynucleotides encoding the protein or partial peptide used in the present invention eg, DNAs (hereinafter, in the description of antisense polynucleotides, these DNAs may be abbreviated as DNAs of the present invention)
  • An antisense polynucleotide having a basic or substantially complementary base sequence or a part thereof includes a complementary or substantially complementary base sequence of a polynucleotide (eg, DNA) of the present invention.
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it contains the nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA, and antisense DNA is preferable.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • Base sequences having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology are exemplified.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention for example, An antisense polynucleotide having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence near the start codon, etc.
  • an antisense polynucleotide which directs RNA degradation by RNaseH it is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 80% or more, complementary to the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention including introns.
  • Antisense polynucleotides having about 90% or more, most preferably about 95% or more homology are each suitable.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to a base sequence of a DNA containing, or a part thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12, or a part thereof And an antisense polynucleotide having the same.
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting the antisense DNA should be chemically modified, for example, with phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted with a decorated phosphate residue.
  • the sugar (deoxy report) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2, -O-methylation, or the base (pyrimidine, purine) may be chemically modified. And any one that hybridizes to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • an antisense polynucleotide (nucleic acid) corresponding to the gene of the protein of the present invention, which can inhibit the replication or expression of the gene, is cloned or the determined protein is copied. It can be designed and synthesized based on the base sequence information of DNA.
  • Such antisense polynucleotides can hybridize to the RNA of the protein gene of the present invention, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the protein-associated RNA of the present invention.
  • the expression and expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled.
  • Polynucleotides complementary to the selected sequence of the protein-related RNA of the present invention, and polynucleotides that can specifically hybridize with the protein-related RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of protein genes, and is also useful for treating or diagnosing diseases.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a nucleotide, base sequence or a specific sequence of a nucleic acid including a gene.
  • nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and a protein usually refers to the amino acids of the protein (as specified by the instructions) derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • Antisense polynucleotides are polynucleotides containing 2-doxy-D-reports, polynucleotides containing D-reports, or other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • polymers having a non-nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • polymers containing special bonds provided that the polymer is not contained in DNA or RNA.
  • They may be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, DNA: RNA hybrid, and may further comprise unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • nucleic acid may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such a modification
  • the product may contain methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functional groups such as ethers, amines, etc. May be converted to
  • the antisense polynucleotide of the present invention is an RNA, a DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be designed, for example, as follows. I.e., to make the antisense polynucleotide more stable in the cell, to enhance the cell permeability of the antisense polynucleotide, to increase the affinity for the target sense strand, and to increase the toxicity.
  • the toxicity of the antisense polynucleotide is reduced. Many such modifications have been reported in, for example, Pharm Tech Japan, 8, 247 or 395, 1992, Antisense Research and Appli cations, CRC Press, 1993.
  • the antisense polynucleotides of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, are provided in special forms such as liposomes, microspheres, or are applied by gene therapy. Or can be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which increase the interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( Hydrophobic substances such as, for example, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.).
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense polynucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. .
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof may be abbreviated as the protein of the present invention
  • a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention eg, DNA
  • DNA a polynucleotide encoding the protein or partial peptide of the present invention
  • the DNA of the present invention may be abbreviated
  • an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • the antisense of the DNA of the present invention The use of the polynucleotide (hereinafter, sometimes abbreviated as the antisense polynucleotide of the present invention) will be described.
  • Pharmaceuticals containing salts or antibodies against the protein of the present invention include, for example, cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, It can be used as a preventive and therapeutic agent for bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor, etc., and an apoptosis promoter
  • the expression of the protein of the present invention is enhanced in cancer tissues. Furthermore, when the activity of the protein of the present invention is inhibited, cancer cells undergo apoptosis. Therefore, compounds or salts thereof that inhibit the activity of the protein of the present invention include, for example, cancer (eg, colon) Cancer, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, ovary, testis, thyroid, kidney, brain, blood It can be used as a preventive and therapeutic agent, an apoptosis promoting agent, etc. Therefore, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • cancer eg, colon
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention.
  • a host transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • a host for example, animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method of culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the method of culturing the transformant of the present invention described above.
  • -Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the activity of the protein of the present invention in the case of the above ⁇ (ii) is inhibited by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared with the case of the above (i).
  • the test compound to be tested can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxicity drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • compounds that inhibit the expression of the gene of the protein of the present invention or salts thereof include, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer) , Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain cancer, blood tumor, etc.) ⁇ Can be used as a therapeutic agent, apoptosis promoting agent, etc.
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention.
  • the screening methods include (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (iv) culturing cells capable of producing the protein used in the present invention in the presence of a test compound.
  • a screening method characterized by performing a comparison with the case where the method is performed.
  • the expression level of the gene in the cases (ii) and (iv) (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody that recognizes the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like by a method such as Western analysis or ELISA method or a method analogous thereto. It can be measured according to
  • the amount of mRNA can be measured by a known method, for example, by using a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 or a part thereof as a probe.
  • the gene expression in the case (iv) is compared with the case (iii).
  • a test compound that inhibits about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
  • the screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plants.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention can be used.
  • the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention and the compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention can be, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer) , Gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It is useful as a low toxic and safe drug.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer
  • Gastric cancer eg, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • carriers and excipients for tablets include lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate. A shim or the like is used.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, Includes dosage forms such as intra-articular injections.
  • Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable solubilizing agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) add of hydrogenated catalyst)] and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) add of hydrogenated catalyst)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • Suppositories to be used for rectal administration are prepared by mixing the above-mentioned compound or a salt thereof with a usual suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections.
  • the compound contains 5 to 10 O mg, and other dosage forms contain 10 to 25 O mg of the above compound.
  • compositions may contain other active ingredients as long as the compound and the above-mentioned compound do not cause an undesirable interaction.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, higgs, bushus, puppies, pumas, birds, cats, dogs). , Monkeys, chimpanzees, etc.) orally or parenterally.
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, higgs, bushus, puppies, pumas, birds, cats, dogs.
  • Monkeys, chimpanzees, etc. orally or parenterally.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • the protein of the present invention may be used.
  • a compound or its salt that inhibits the expression of a quality gene is orally administered, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1 to 100 mg of the compound or its salt per day is administered. 0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, the target disease, and the like.
  • the gene of the protein gene of the present invention may be used.
  • a compound that inhibits expression or a salt thereof usually in the form of an injection
  • the compound or a salt thereof is injected into the cancer lesion at a rate of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient to administer by In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which is characterized in that:
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • a monoclonal antibody against the protein of the present invention hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention
  • tissue staining or the like May use the antibody molecule itself, or F (ab ') 2 , Fab, or the Fab fraction of the antibody molecule.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, antigen, or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (eg, the amount of protein) in the test solution is measured. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope e.g., [125 1], [131 1] ', [3 ⁇ 4], C 14 C] and the like.
  • the above enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, / 3-galactosidase, 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. .
  • the fluorescent substance examples include cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, and the like. You.
  • cyanine fluorescent dyes eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)
  • fluorescamine fluorescein isothiocyanate
  • fluorescein isothiocyanate examples of the fluorescent substance.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined.
  • Primary reaction and The secondary reaction may be performed in the reverse order, simultaneously, or at a different time.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase or the antibody for labeling is not necessarily required to be one type, and two or more types may be used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. A mixture of bodies may be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction differs in the binding site of the protein of the present invention.
  • Antibodies are preferably used. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method. '
  • the competitive method after the antigen in the test wave and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( BZF separation), B, or F labeling is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test wave is Is allowed to react with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test wave.
  • the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured.
  • Lithium or the like is preferably used.
  • the system for measuring the protein of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and documents.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, visceral cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or in the future It can be diagnosed as having a high possibility of being affected.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, visceral cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • the preparation of the antibody column used for purifying the protein of the present invention and the protein of the present invention in each fraction at the time of purification were performed. It can be used for detecting proteins, analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, and the like.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, by using it as a probe to produce human or blood-purified animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA that encode the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the decreased expression or increased DNA or mRNA is useful as a diagnostic agent for gene overexpression and the like.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the known Northern hybridization ⁇ PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989, Proceedings of the National Academy of Sciences). of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)).
  • cancer eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate
  • Cancer esophageal, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, ovary, testis, thyroid, kidney, brain, blood, etc.
  • testis thyroid, kidney, brain, blood, etc.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which complementarily binds to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA, has low toxicity, and has the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo. It can suppress the action and induce apoptosis of cancer cells, and can be used for cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, Renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor sputum, blood tumor, etc.) It can also be used as an apoptosis accelerator.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, Renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer,
  • said antisense polynucleotide said prophylactic or therapeutic agents when used in such accelerators, formulated according to a method known per se, also f can be administered, for example, alone or retro the antisense polynucleotides
  • a suitable vector such as a viral vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector
  • the cells After insertion into a suitable vector such as a viral vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector, the cells are inserted into a human or mammal (eg, a rat, a egret, a sheep, a pig, a pig, a cat) in a conventional manner. , Dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake
  • the antisense polynucleotide is formulated alone or in combination with a carrier such as ribosome (injection), and is intravenously, subcutaneously, etc. May be administered.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the purpose of treating breast cancer, it is generally used.
  • an adult body weight 60 kg
  • about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a lipozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, etc.
  • the expression of the gene of the present invention can be suppressed and the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in vivo can be suppressed, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer) , Lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It can be used as a preventive / therapeutic agent, apoptosis promoter, etc.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer
  • prostate cancer esophageal cancer
  • stomach cancer liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer
  • testis cancer thyroid cancer
  • kidney cancer brain tumor, blood tumor, etc.
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, vol. 41i, p. 494, 2001).
  • the lipozyme can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention which can be cleaved by a known lipozyme.
  • RNA or lipozyme When the above-described double-stranded RNA or lipozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide. (5) a drug containing the antibody of the present invention
  • the antibody of the present invention has apoptosis-inducing activity of cancer cells, it can be used, for example, in cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, Prevention and treatment of bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, genital cancer, brain tumor, blood tumor, etc. (eg, vaccines, etc.) (preferably lung cancer, ovarian cancer, pentine cancer, etc.) Can be used as an apoptosis promoter, etc.
  • cancers eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, Prevention and treatment of bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, genital cancer, brain tumor, blood tumor, etc. (eg, vaccines
  • the prophylactic / therapeutic agents and promoters for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention have low toxicity, and can be used as they are as liquids or as pharmaceutical compositions in appropriate dosage forms, in humans or mammals (eg, rats, egrets, higgies). Can be administered orally or parenterally (eg, intravascular, subcutaneous, etc.) to mice, monkeys, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Preferably, it can be administered as a vaccine according to a standard method.
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition.
  • Pharmaceutical compositions used for administration include the antibody of the present invention and salts thereof, and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. It may be. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, vaccines, etc. are used.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Dosage forms may be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method. Injection preparations can be prepared, for example, by dissolving, suspending, or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline ice, isotonic solution containing glucose and other adjuvants is used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Polypropylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxythylene (50 mol) adduct of hydrogenated cast oil)), etc. Good.
  • a suitable solubilizing agent for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Polypropylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxythylene (50 mol) adduct of hydrogenated cast oil)), etc. Good.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain carriers, diluents or excipients usually used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the antibody content is usually 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially 5 to 100 mg for injection, and 10 to 250 mg for other dosage forms. Is preferred.
  • the dosage of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent or modulator containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, it is used for the treatment and prevention of adult breast cancer.
  • the amount of the antibody of the present invention per dose is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, and more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided in a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the antibody of the present invention may contain other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5_fluorouracil, etc.), anticancer antibiotics (eg, mitomycin, Adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carpoplatin, etopoxide, etc.
  • alkylating agents eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.
  • antimetabolites eg, methotrexate, 5_fluorouracil, etc.
  • anticancer antibiotics eg, mitomycin, Adriamycin, etc.
  • plant-derived anticancer agents eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.
  • cisplatin carpoplatin, etopoxide, etc.
  • the protein of the present invention can also be used as a cancer vaccine to activate the immune system of cancer patients.
  • a strong antigen-presenting cell eg, a dendritic cell
  • adoptive immunotherapy or the like in which the protein is phagocytosed and then returned to the patient's body after phagocytosis, is preferably applied.
  • the dendritic cells returned into the body can kill cancer cells by inducing and activating cytotoxic T cells specific for cancer cells.
  • the protein of the present invention may be, for example, a cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis) Safely administered to mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, pigs) as vaccine preparations for the prevention or treatment of cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumors, blood tumors, etc. You can also.
  • a cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis
  • mammals eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, pigs
  • vaccine preparations for the prevention or treatment of cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumors, blood tumors, etc. You can also
  • the vaccine formulation usually contains the protein of the invention and a physiologically acceptable carrier.
  • the carrier include liquid carriers such as water, saline (including physiological saline), buffers (eg, phosphate buffer), and alcohols (eg, ethanol). '
  • the vaccine preparation can be prepared according to a usual vaccine preparation manufacturing method.
  • the protein of the present invention is dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier.
  • the protein of the present invention and a physiologically acceptable carrier may be separately prepared, and these may be mixed and used at the time of use.
  • an adjuvant eg, aluminum hydroxide gel, serum albumin, etc.
  • a preservative eg, thimerosal, etc.
  • a soothing agent eg, glucose
  • cytotoxicity eg, inleucin-leukins such as interleukin-12, inleatherin-feron such as interferon-alpha, etc. is further added. You may mix.
  • the protein of the present invention When used as a vaccine preparation, the protein of the present invention may be used as an active form, but the protein of the present invention may be denatured to enhance antigenicity. Denaturation of the protein of the present invention is usually performed by heat treatment and treatment with a protein denaturant (eg, formalin, guanidine hydrochloride, urea). The resulting vaccine preparation has low toxicity, and may be usually administered as an injection, for example, subcutaneously, intradermally, or intramuscularly, or may be locally administered to or near a cancer cell mass.
  • a protein denaturant eg, formalin, guanidine hydrochloride, urea
  • the dosage of the protein of the present invention varies depending on, for example, the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the protein of the present invention is subcutaneously administered to an adult (body weight: 60 kg) suffering from cancer as an injection.
  • the dose is usually about 0.1 to 300 mg, preferably about 100 to 300 mg per dose.
  • the vaccine preparation may be administered once, but the vaccine preparation may be administered 2 to 4 times at intervals of about 2 weeks to about 6 months in order to increase the amount of antibody produced.
  • the present invention has a DNA encoding an exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the DNA transgenic animal of the present invention can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the ribofection method It can be produced by transferring the desired DNA by a coagulation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention is transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and the cell culture and tissue culture are performed.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can be produced by fusing these cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • Non-human mammals include, for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, gray egrets, and birds. Nu, cats, guinea pigs, eight-star, mice, rats, etc. are used. Above all, rodents and biological cycles are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, pure strains such as C57BLZ6 and DBA2) As the crossing strain, a BeCSF strain, a BDFi strain, a BeDSFi strain, a BALB / c strain, an ICR strain, etc.) or a rat (eg, Wistar, SD, etc.) are preferable.
  • mice for example, pure strains such as C57BLZ6 and DBA2
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal, not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal.
  • Examples of the mutant DNA of the present invention include those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of bases, DNA with substitution or the like is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA refers to a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of a normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same or different species as the animal of interest.
  • DNs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • having the DNA of the present invention having high homology to the DNA are transferred.
  • a DNA construct eg, a vector
  • a human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing A into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacterium such as ⁇ phage, a phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the expression of DN ⁇ include, for example, (i) viruses derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • viruses derived from viruses eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • DNA promoters (ii) promoters derived from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, perovrakin II, elastase, Erythropoietin, endoselin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratins Kl, K10 and K14, collagen types I and II, cyclic AMP Dependent protein kinase i3 I-subunit, dystrophy Insulin, tartrate-resistant alkaline rifos phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor thymic synthase (generally abbreviated as Tie 2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATP) ase), nu
  • the above vector is a messenger R of interest in DNA-transferred mammals.
  • Yuichi Mineta a sequence that terminates the transcription of NA
  • a sequence of each DNA derived from a virus and various mammals can be used, and preferably The Simian virus SV40 Yuichi Mineta is used.
  • translation of splicing signal of each DNA, enhancer region, part of intron of eukaryotic DNA, etc. to 5 'upstream of promoter region and promoter region for the purpose of further expressing the target foreign DNA Linking between regions or 3 ′ downstream of the translation region is also possible depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention includes DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.).
  • Complementary protein prepared by known methods as all or part of genomic DNA from one of various commercially available genomic DNA libraries, or from RNA derived from kidney, kidney, thyroid cells, or fibroblasts
  • the foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above-described cells or tissues by a point mutation induction method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated to the downstream of the aforementioned promoter and optionally to the upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the transfer of the DNA indicates that all the progeny of the produced animal and the exogenous DN of the present invention will be present in all of the germinal cells and somatic cells.
  • the progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain exogenous DNA by mating, and should be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done.
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer indicates that all the offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. Means that. The offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the normal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately promoted by promoting the function of endogenous normal DNA. It may develop advanced disease and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and examination of methods for treating these diseases. It is possible.
  • a preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention such as a cancer
  • a cancer Examples: colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor It can also be used for screening tests for preventive and therapeutic agents for blood tumors.
  • the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably retained by the crossing. Can be done. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. D with promoter
  • the NA construct can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, and the function of the protein of the present invention is ultimately reduced by inhibiting the function of endogenous normal DNA.
  • Inactive refractory disease may occur, and the disease can be used as a si model animal. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functionally inactive refractory state of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of a normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention. Action).
  • a preventive / therapeutic agent for the protein of the present invention or a functionally inactive type refractory disease for example, Cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney It can also be used for screening tests of prophylactic and therapeutic agents for cancer, brain tumors, blood tumors, etc.).
  • Cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney It can also be used for screening tests of prophylactic and therapeutic agents for cancer, brain tumors, blood tumors, etc.).
  • cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
  • the DNA-transferred animal of the present invention in order to use the DNA-transferred animal of the present invention to develop a treatment for a disease associated with the protein of the present invention, including a refractory inactive type of the protein of the present invention, Using a test method and a quantitative method, it is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease. Further, using the DNA transfer product of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to study and develop a method for treating a DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is controlled under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a reporter gene eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, which suppresses the expression ability of the DNA, Alternatively, the DNA substantially does not have the ability to express the protein of the present invention by substantially losing the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • the knockout DNA of the present invention refers to embryonic stem cells of non-human mammals (hereinafter abbreviated as ES cells).
  • the method for artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. Due to these mutations, for example,
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of the promoter or disrupting the function of the promoter or exon.
  • non-human mammalian embryonic stem cells of the present invention in which the DNA is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by the non-human mammal described above is isolated and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or a lacZ galactosidase gene), cat (clo Inserting a reporter gene such as the ramphenicol acetyltransferase gene, etc., disrupts exon function, or terminates gene transcription in the intron between exons (eg, poly) A signal, etc.) to prevent synthesis of complete messenger RNA, A DNA chain having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene (hereinafter, abbreviated as "gettering vector”) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homolog
  • the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, and the method of the known Evans and Kaufma may be used. It may be newly established according to. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background.
  • BDF mice C57BLZ6 and DBA / 2 BDFi mice can be used favorably because they have a high number of eggs collected and their eggs are robust, and they have C57BLZ6 mice as their background.
  • the ES cells obtained as described above can be advantageously used when a pathological model mouse is created, because the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germ line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), 'The primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor required in the early stage of culture.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • LIF 1-10000 U / ml
  • 5% CO 2, 90% air at about 37 ° C.
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.01 to 0.5% trypsin Z 0.1 to 5 mM EDTA (Preferably about 0.1% Tribcine ZlmM EDTA) to obtain a single cell
  • a method of seeding on one cell is used.
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 'days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature, 292, 154, 1981; GR Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; Doetschman et al., Journal of Embryology 'and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985
  • cells of the present invention lacking the expression of the DNA of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention. Is useful in cell biology studies of the proteins of the invention in vitro.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the evening-getting vector into the DNA of the present invention. Is knocked out by homologous recombination in which the DNA sequence in which is inactivated replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination be able to.
  • the cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a target for the DNA sequence on the southern hybridization analysis or evening getter vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe. It can be determined by analysis by PCR using the DNA derived from the mouse and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention as a primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell When a non-human mammalian embryonic stem cell is used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage. Hi And injected into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all tissues are more artificial than the population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting an individual composed of cells having the DNA locus of the present invention in which a mutation has been added to, for example, by judging a color.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual having a heterozygous expression of the protein of the present invention. An individual with poor homo-expression can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to human mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the animal obtained by crossing is confirmed to be knocked out of the D and NA, and is bred in a normal breeding environment. Can do it.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention Since it lacks various inducible biological activities, it can serve as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying therapeutic methods. It is.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof, which has a therapeutic / preventive effect on diseases caused by the above, for example, cancer.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma, and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and the change in each organ, tissue, symptom of disease or the like of the animal is used as an index.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection, or the like is used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal healing, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney Screening compounds with therapeutic and preventive effects against cancer, brain tumors, blood tumors, etc.
  • test compound When a test compound is administered to a non-human mammal deficient in the expression of DNA, the difference in the degree of onset of cancer and the degree of healing of cancer in the non-administered group of the test compound can be monitored over time in the above tissues. To observe.
  • test compound when administered to a test animal, the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic and / or preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a medicament such as a safe and low toxic prophylactic / therapeutic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be similarly used.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals). And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, maleic acid) Acids, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, maleic acid
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dosage of the compound or its salt varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered, it is generally an adult (assuming a body weight of 60 kg).
  • the conjugate per day. l-100mg Preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like.
  • the compound is usually in the form of an injection for an adult (with a body weight of 60 kg).
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the present invention provides a test compound administered to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, wherein the DNA of the present invention is inactivated by introducing a repo all-over-one gene.
  • a gene which can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same one as described above is used, and a j8-galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is suitable.
  • the reporter By tracing the expression of a substance encoded by the gene, the activity of the promoter can be detected.
  • the tissue of the present invention expressing the protein of the present invention originally / 3-galactosidase is expressed instead of evening protein.
  • a reagent serving as a substrate for 3-galactosidase such as lyl / 3-galactopyranoside (X-gal)
  • the expression state of the protein of the present invention in an animal body can be easily determined. Can be observed.
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or After reacting at 37 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the ⁇ -galactosidase reaction is stopped by washing the tissue sample with ImM EDTA / PBS solution, and the color is observed. Just fine. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may be a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) or a base (eg, a).
  • a physiologically acceptable acid eg, an inorganic acid
  • a base eg, a
  • a salt with an alkali metal salt or the like is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid
  • benzoic acid methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity against DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention and inhibit the function of the protein, and thus, for example, cancer (eg, colon cancer) , Breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, ovary, testis, thyroid, kidney, brain, blood, etc.) It is useful as a preventive and therapeutic agent.
  • cancer eg, colon cancer
  • a compound derived from the compound obtained in the above-mentioned screening can also be used.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method is produced in the same manner as the above-described drug containing the protein of the present invention or a salt thereof. be able to.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is orally administered, generally the adult For a breast cancer patient weighing 60 kg, the compound is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that inhibits promoter activity against DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection.
  • the compound should be used in an amount of about 0.01 to
  • the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of promoter of DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by DNA expression deficiency of the invention or the development of therapeutic agents.
  • transgene a DNA containing the entire promoter region of the protein of the present invention
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and this is injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgene. If a nick animal (transgenic animal) is created, it will be possible to specifically synthesize the protein and examine its effects on the living body. Further, by binding an appropriate repo overnight gene to a portion of the above promoter and establishing a cell line that expresses the gene, the protein of the present invention itself can be specifically promoted or suppressed in its production ability in the body. It can be used as a search system for low-molecular compounds that have an action.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine
  • HONB trihydroxy-5-norpolene-2,3-dicarpoxyimide DCC
  • SEMA4B indicates the nucleotide sequence of DNA including the full length gene encoding Ml. [SEQ ID NO: 7]
  • SEMA4B Shows the nucleotide sequence of DNA including the full length gene encoding M2. [SEQ ID NO: 1'0]
  • SEMA4B shows the amino acid sequence of M3.
  • Example 3 shows the base sequence of the antisense oligonucleotide used in Example 2, Example 3, Example 15 and Example 16.
  • Example 3 shows the nucleotide sequences of the oligonucleotides used in Example 2, Example 3, Example 15 and Example 16.
  • Example 3 shows the base sequence of the oligonucleotide used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
  • [SEQ ID NO: 21] 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 6.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of peptide 1 used in Example 8.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of peptide 2 used in Example 8.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of peptide 3 used in Example 8.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of peptide 4 used in Example 8.
  • the transformant Escherichia coli TOP10 / SEMA4B-Ml / pCR4-T0P0 obtained in Example 4 described below has been used since March 4, 2003 at 1-1, Tsukuba-Higashi 1-chome, Central No. 6 (mail number 305 -8566) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, under the deposit number FERM BP-8316.
  • M2 / pCR4-T0P0 has been deposited at the Patent Organism Depositary at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture since March 4, 2003. Deposited under number FERM BP-8317.
  • Example 1 The transformant Escherichia coli TOP 10 / SEMA4B-M3 / pCR4-T0P0 obtained in Example 4 described below has been used since March 4, 2003, at 1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki Prefecture, Central No. 1 (postal number 305-8566) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the deposit number FERM BP-8318.
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • oligonucleotide microarray Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Affymetrix
  • total RNA Table 1 extracted from 4 cases of cancer tissue and 5 cases of normal lung tissue.
  • the experimental method followed Affymetrix's experiment guide (Expression analysis technical manual).
  • Semaphorin 4B Semaphorin 4B
  • Semaphorin 4B-M1 Semaphorin 4B-M2
  • Semaphorin 4B-M3 Semaphorin 4B-M3
  • Lung cancer tissue (lot.0011-192-01293) 9.5 Lung cancer tissue (lot. 0011-192-01297) 1.
  • human non-small cell lung cancer cell line NCI-HI703 purchased from American Type Culture Collection (ATCC) was added to RPMI-1640 medium (containing 25 mM HEPES).
  • the antiserum in a 5% carbon dioxide gas stream, the antiserum is specifically expressed by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 13 an antisense oligonucleotide sequence that hybridizes to the 3 ′ untranslated region sequence of the protein having the protein
  • anti-sense Abbreviated as sense oligonucleotide
  • control the reverse sequence (SEQ ID NO: 14) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 was similarly phosphorothiated, purified by HPLC and used (hereinafter referred to as “control”). Abbreviated as oligonucleotide)).
  • the antisense oligonucleotide or control oligonucleotide diluted with Opti-MEM (Invitrogen) was diluted 5-fold with Opti-MEM (Invitrogen) and left at room temperature for 5 minutes. : 3 ratio
  • the 7th oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) showed approximately 1.6 times the apoptosis-inducing activity as compared to the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), showing a statistically significant difference. ⁇ 0.01) (Table 3).
  • SEMA4B antisense oligonucleotide reduces gene expression
  • the human non-small cell lung cancer cell line NCI-HI 703 used in Example 2 was suspended in the same medium as in Example 2, and a 24-well flat-bottom tissue culture was performed at a cell density of 60,000 cells / well (0.6 ml medium volume). The seeds were seeded on a culture plate (BD Falcon). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, antisense oligonucleotides were transfected according to the method of Example 2.
  • the amount of oligonucleotide added was 240 L per well, and two types of antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) and two types of control oligonucleotide (SEQ ID NO: 15) were used. No .: 14 and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 16) were used.
  • antisense oligonucleotides and control oligonucleotides derived from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 15 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10
  • Reverse transcription was performed using Transcription Reagents (Applied Biosystems) according to the attached protocol.
  • a cDNA corresponding to 7 to 9 ng of total RNA was designated as type I, and SEMA4B and SEMA4B were prepared using two primers (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).
  • SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes was measured.
  • the expression amount of the 3-actin gene was measured using TaqMan i3-actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
  • the non-transfection group When distilled water was used instead of the oligonucleotide solution (hereinafter referred to as the non-transfection group), the sum of SEMA4B, SEMA4B-MK, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 gene expression was expressed as / 3-actin gene expression Of the antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) were 0.98% and 1.1% in the administration group, which was statistically significant ⁇ 0.05). A decrease in the actual quantity was observed.
  • control oligonucleotide SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16
  • the expression levels were 4.1% and 3.4%, and no statistically significant decrease in the expression level was observed as compared with the non-transfection group.
  • PCR was performed using two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20).
  • the reaction solution 501 was composed of 11 of the above cDNA, 2.5 U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE), 1.0 M of each primer (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20), 200 M dNTPs, and 25 1 x GC Buffer I (Takara Shuzo).
  • the PCR reaction is repeated at 95 ° C for 1 minute, followed by 30 cycles of 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 4 minutes, followed by an extension reaction at 72 ° C for 5 minutes.
  • To add dATP to the 3 'end of the PCR reaction product 5 U of Ex Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo) was added and incubated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN). This was subcloned into the plasmid vector pCR4-TOP0 (Invitrogen) according to the prescription of the T0P0 TA PCR Cloning Kit (Invitrogen).
  • SEQ ID NOS: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11 correspond to nucleotides 1 to 237 and 2749 to 3766 of the SEMA4B gene (GeneBank Accession No. XM-0444533 gene).
  • the nucleotide sequences added to the 5, 5 and 3 'ends of the nucleotide sequence represented by, respectively, are shown as SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 And SEQ ID NO: 12.
  • amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 completely matched the SEMA4B protein encoded by the SEMA4B gene (GeneBank Accession No. XM-0444533 gene).
  • SEMA4B-M3 is a protein containing SEMA4B-Ml; a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 is SEMA4B-M2; SEQ ID NO: 11 A protein having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1.0) encoding the base sequence represented by is designated as SEMA4B-M3.
  • the 90th g of the DNA sequence encoding SEMA4B corresponds to a, and the 111th g to a.
  • the 623th g is replaced by t, respectively, and the 623th substitution is accompanied by an amino acid substitution.
  • the 150th g of the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B corresponds to a, and the 489th g to a.
  • the 528th c is replaced with t
  • the 1266th is replaced with a
  • the 1588th c is replaced with a
  • the 2343th a is replaced with g
  • the 489th substitution is accompanied by an amino acid substitution.
  • nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B-M3 (SEQ ID NO: 11)
  • the 1092th g of the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B (SEQ ID NO: 2) has been replaced with t, It is accompanied by amino acid substitution.
  • SEMA4B / pCR4-T0P0 a plasmid having a DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 was converted to a DNA having a nucleotide sequence represented by SEMA4B-Ml / pCR4-T0P0, SEQ ID NO: 8
  • the plasmid having the DNA having the base sequence represented by SEMA4B-M2 / pCR4-TOP0 and SEQ ID NO: 11 was named SEMA4B-M3 / PCR4-TOP0, respectively.
  • the transformant into which the plasmid SEMA4B / pCR4-T0P0 was introduced was transformed into Escherichia coli TOP 10 / SEMA4B / pCR4-TOPO, and the transformant into which the plasmid SEMA4B-Ml / pCR4-TOPO was introduced was transformed into Escher i chi Transformants into which aco li TOP10 / SEMA4B-Ml / pCR4-TOPO and plasmid SEMA4B-M2 / pCR4-TOPO have been introduced are transformed into Escher i chia col i
  • Total RNA was prepared from the above 91 cell lines using RNeasy Mini Total Thigh Kit (QIAGEN). Using this 1 ⁇ tal RNA as a type II cDNA and preparing a cDNA by reverse transcription using random primers and performing a quantitative PCR reaction, the SEA4B gene (SEQ ID NO: 2) and the SEMA4B-M1 gene (SEQ ID NO: : Five ) ,
  • SEMA4B-M2 gene SEQ ID NO: 8
  • SEMA4B-M3 gene SEQ ID NO: 11
  • the PCR reaction was performed using the cDNA obtained from 3 to 4 ng of the above total RNA as type III, and the PCR reaction was performed under the same conditions as in Example 3, and SEMA4B, SEMA4B-MK, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3
  • SEMA4B, SEMA4B-MK, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 The number of gene expression copies was calculated.
  • Table 4 shows the relative expression rates obtained by standardizing the expression level of the whole gene with the expression level of] 3-actin gene.
  • Plasmid SEMA4B / PCR4-TOP0 obtained in Example 4 was used as type III to amplify the PCR SEMA4B gene.
  • the composition of the reaction solution used was 2 ng of SEMA4B / pCR4-T0P0 as type II, 2.5 U of Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE), two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 2). 1) was added to each of 1 M, dNTPs was added to 200 ⁇ l, and lOx Pfu Buffer was added to 51 to make a liquid volume of 50 1.
  • PCR reaction a cycle of 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 4 minutes was repeated 25 times.
  • the PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN), and then treated with restriction enzymes Xbal and Eco RI. Plasmid p3xFLAG-CMV_14 (Sigma) was also treated with XbaI and EcoRI.
  • Each DNA fragment was purified using a PCR Purification Kit, and a ligation reaction was performed using a DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Bio). After introducing the ligation reaction mixture into E. coli ⁇ 0 ⁇ 0, the transformed E.
  • An expression vector for animal cells expressing a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C-red end of the SEMA4B protein was constructed. Transformation was performed according to the method described in Example 6, except that the primer pair used for amplifying the SEMA4B gene by PCR was changed to another primer pair (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). The selected E. coli was screened. As a result, a plasmid pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG containing a cDNA fragment encoding a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C-terminal of the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was obtained.
  • SEQ ID NO: 1 Preparation and purification of peptide antibodies
  • SEMA4B protein SEQ ID NO: 1
  • SEMA4B-M1 protein SEQ ID NO: 4
  • SEMA4B-M2 protein SEQ ID NO: 7
  • SEMA4B-M3 protein SEQ ID NO: 10
  • amino acid sequence of peptide 1 [Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-lie-Asn-Ser-Ser-Cys (SEQ ID NO: 22)] is the amino acid sequence of SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1). This is a sequence in which Cys has been added to the C-terminus of the amino acid sequence from the 2nd to the 412th.
  • amino acid sequence of peptide 2 [Ser-Vat-Vat Ser-Pro-Ser-Phe-Vat-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 23)] is SEMA4B This is the sequence from the 582th position to the 596th position of the protein (SEQ ID NO: 1).
  • amino acid sequence of peptide 3 [Pro-Leu-Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys (SEQ ID NO: 24)] is the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 24). No .: This is a sequence in which Cys has been added to the C-terminal of the amino acid sequence from positions 781 to 794 in 1).
  • amino acid sequence of peptide 4 is the SEMA4B protein (SEQ ID NO: .. 1) This is a sequence in which Cys has been added to the C-terminal of the amino acid sequence from positions 797 to 809 of the protein.
  • the immunized animal used one male male egret KBL: JW (11-week-old, Oriental yeast), the first sensitization was complete Freund's adjuvant (Difco) suspension, and the second and subsequent times were incomplete Freund's adjuvant (Difco) The suspension was used. Sensitization was performed by subcutaneous injection into the back. One sensitization was performed using 0.5 mg of each antigen, and was repeated three times every 14 days after the first sensitization. On the 52nd day after the first sensitization, blood was collected from an artery under anesthesia to obtain about 50 ml of Suzuki.
  • the serum thus obtained was concentrated by ammonium sulfate salting out method,
  • the total amount of the obtained crude IgG fraction was purified by protein A affinity ram (Amersham-Bioscience), and about 103 mg and about 103 mg, respectively, were obtained from rabbits immunized with peptide 1, peptide 2, peptide 3 or peptide 4. 76 mg, about 112 mg and about 122 mg of purified IgG were obtained.
  • an IgG fraction that binds to a column on which each immunogenic peptide was immobilized was obtained.
  • Cys at the C-terminus of each peptide was used and coupled to a Sepharose column (Amersham-Bioscience) using a borate buffer.
  • the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was detected using the purified antibody prepared in Example 8 and a peptide antibody.
  • 1.5 ⁇ 10 6 NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer were suspended in 10 ml of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and seeded on a 10 cm diameter petri dish. The cells were cultured at 37 ° C under a 5% carbon dioxide gas flow.
  • Phosphatase Inhibitor Cocktail-2 (Sigma)] was added and left at 4C for 30 minutes. Collect the RIPA buffer and centrifuge at 15,000 rpm for 20 minutes. The liquid was used as a cell-free extract.
  • This cell-free extract and sample buffer for double concentration SDS-PAGE (125 mM Tris' hydrochloric acid buffer, ⁇ 6.8, 40% glycerol, 4% SDS, 0.04% bromophenol blue and 5% 2-mercapto [Ethanol] was mixed in equal volumes and heated at 95 ° C for 5 minutes, and then 10x1 was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel.
  • the proteins separated by electrophoresis were transferred to CLEARBUT® membrane (ATT0) according to a conventional method, and then a blocking solution [50 mM Tris. In a hydrochloric acid buffer, pH 7.5, 500 mM sodium chloride, 0.1% Tween 20, 5% skim milk] for 1 hour at room temperature.
  • a blocking solution [50 mM Tris. In a hydrochloric acid buffer, pH 7.5, 500 mM sodium chloride, 0.1% Tween 20, 5% skim milk] for 1 hour at room temperature.
  • the peptide antibody AS-2531, AS-2532, AS-2591 or AS-2592 prepared in Example 8 was diluted with a blocking solution so as to have a concentration of 3 g / ml. Reacted. Subsequently, it was left at room temperature for 1 hour in an HRP-labeled anti-Egret IgG antibody (Amersham-Bioscience) diluted 50,000 or 100,000 with a blocking solution.
  • SEMA4B protein was detected
  • Example 7 Using the plasmid pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG obtained in Example 7, a cell-free extract was prepared in the same manner as in Example 9. A cell-free extract 400 was added to a suspension 501 in which Protein G-Sepharose FF (Amersham-Bioscience) was suspended in an equal volume of RIPA buffer, and the peptide antibodies AS-2531, AS -2532,
  • a mixed solution to which either one of AS-2591 or AS-2592 was added was prepared, and stirred at 4 ° C. After washing the protein G-Sepharose 4FF co-precipitated fraction with RIPA buffer, 501 sample buffer for SDS-PAGE (62.5 mM Tris-HCl buffer, pH 6.8, 20% glycerol, 2% SDS , 0.02% bromophenol alcohol and 2.5% 2-mercaptoethanol] and heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 51 or 10 I was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. Detection was in accordance with the method described in Example 9.
  • a mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) diluted to 0.2 g / ml or 0.1 g / ml with a blocking solution was used as the primary antibody, and an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham-Bioscience) was used as the primary antibody. Those diluted 15,000-fold or 50,000-fold with a blocking solution were used as secondary antibodies.
  • immunoprecipitation was performed using any of the peptide antibodies AS-2531, AS-2532, AS-2591 and AS-2592, a specific band derived from the SEMA4B protein was observed near the molecular weight of 100kD.
  • H1703; ovarian cancer cell lines SK0V-3 and TOV-21G; prostate cancer cell line DU145; and JI-extracted cancer cell line PANC-1 were cultured on two 10 cm diameter Petri dishes.
  • One petri dish of each cell was dispersed with trypsin-EDTA (Invitrogen), and the number of cells was counted. Based on the number of cells counted, add 1 ml of ice-cold RIPA buffer (described in Example 9) to 5 ⁇ 10 6 cells to one remaining Petri dish, and add 4 ° C For 30 minutes. The RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15, OOikpm for 20 minutes was used as a cell-free extract.
  • the Size TM X ProteinG Immunoprecipitation Kit Pieris
  • Cells were harvested from the wells in which one to three cells had proliferated and formed colonies, and were seeded equally in 2 wells of a 48 well plate. After culturing was continued until the cell density reached 50% or more, 50 ⁇ l of the sample buffer for SDS-PAGE described in Example 10 was added to 1 ⁇ l of cells to prepare a cell lysate. After heat treatment at 95 ° C for 5 minutes, 5x1 was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. According to the method described in Example 9, Western blotting was performed using the peptide antibody AS-2532 to search for stably expressing cells that constitutively express the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1).
  • the cells recovered from the other well were diluted to 0.7 cells per well, and then seeded on a 96-well plate.
  • the culture was continued at 37 ° C. under a 5% carbon dioxide gas flow while changing the G418 selection medium every 3 or 4 days until the cell density reached about 50%.
  • inoculate the same amount in a 1-well plate of 48-well plate, continue culturing until the cell density becomes 50% or more, and use the cell lysate prepared from 1-well cells in the same manner as described above. Blotting was performed.
  • a clone that highly expressed the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was selected to obtain a SEMA4B / S358 stable cell line.
  • Biotin was labeled using Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics). Subsequently, using 1 ml of the cell-free extract prepared according to the method of Example 9 and 5 g of the peptide AS-2591 prepared in Example 8, immunoprecipitation was performed according to the method of Example 10, followed by SDS-PAGE. Was done. Detection using HRP-labeled streptavidin (Amersham-Bioscience) revealed a band derived from the SEMA4B protein near the molecular weight of lOOkD. The SEMA4B protein, SEMA4B-Ml protein, and SEMA4B-M2 protein And that the SEMA4B-M3 protein was localized on the cell surface.
  • the human non-small cell lung cancer cell lines NCI-H2228 and NCI-H358 and SEMA4B / H358 described in Example 12 were each seeded on a Petri dish having a diameter of 10 cm, and cultured until they became subconfluent. After washing each cell with PBS, PBS containing 0.5% BSA and 5 mM EDTA was added, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes to disperse the cells. Next, use Buffer A (HBSS containing 2% fetal bovine serum (JRH) and 0.1% sodium azide (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen)) at 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Buffer A HBSS containing 2% fetal bovine serum (JRH) and 0.1% sodium azide (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen)
  • the cells were suspended to a final concentration of 10 mg / ml, and AS-2532 or non-immune rabbit (Jackson) was added to a final concentration of 10 g / ml, and left on ice for 3 hours. After washing the cells with buffer A, the cells were suspended in buffer A containing 10 g / ml of Alexa488-labeled anti-Peacock IgG pups (Molecular Probes), and left on ice for 2 hours. After washing again with buffer A, analysis was performed with FACScan (BD Biosciences).
  • NCI-H358 was suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRHRH, ImM sodium pyruvate and 25 mM HEPES), and the cell density was 8 ⁇ 10 3 cells / ⁇ (medium volume) 80 / ⁇ 1) NCI-H358 was seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) and cultured overnight at 37 ° C in a 5% charcoal gas stream.
  • RPMI-1640 medium Invitrogen
  • JRHRH 10% fetal calf serum
  • HEPES fetal calf serum
  • the apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotide was measured according to the attached protocol of Diagnostics) and Caspase-Glo 3/7 assay (Promega II).
  • the antisense oligonucleotide showed 1.42 and 1.77 times the apoptosis-inducing activity, respectively, compared to the control oligonucleotide used as a negative control, with statistically significant differences (P ⁇ 0.01) (Tables 5 and 6).
  • Apo Bok one cis-inducing activity (A 4 5 -. A 492 ) Mean value Standard deviation blank 0.2 1 7 0.007 Con Bok roll oligonucleotides 0.330 0.041
  • RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), ImM sodium pyruvate and 25 mM HEPES was used.
  • ACL-4 medium (ATCC) containing 10% FBS was used for CI-H1651.
  • NCI-H23 contains RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (JRH) and 25 mM HEPES. (Invitrogen) was used.
  • LipofectAMINE transfection reagent (Invitrogen) 0.41 was added, and the mixture was further left at room temperature for 15 minutes. The whole amount of the mixture was added to the culture solution of each cell, and the culture was continued for 3 days, and then the apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotide was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PUiS (Roche Diagnostics).
  • the antisense oligonucleotide was compared to the control oligonucleotide used as a negative control, respectively.
  • NCI-H2228) shows 1.58-fold (NCI-H2228), 1.21-fold (NCI-H1651) and 1.25-fold (NCI-H23) apo1 cis-inducing activity, with a risk factor of P ⁇ 0.05 (NCI-H228), P ⁇ 0.05 (NCI-H228). -H1651) and P ⁇ 0.01 (NCI-H23).
  • the results showed statistically significant differences (Table 7, Table 8, and Table 9).
  • Cis-inducing activity (A 4 Q 5 — A 492 ) Mean standard deviation Blank 0.5 2 3 0. 0 9 1 Control oligonucleotide 1. 1 5 2 0. 1 0 1
  • Apoptosis inducing activity (A 4 Q 5 — A 492 ) Mean Standard deviation Blank 0.6 0.78 0.02 8 Control oligonucleotide 1.0 8 1 0. 0 5 0
  • Antisense Sense Rigonucleide 1.3 5 1 0. 0 5 8
  • the human non-small cell lung cancer cell line NCI-H2228 was treated with the egret peptide antibodies AS-2531 and AS-2532 obtained in Example 8, and the apoptosis-inducing activity of these egret peptide antibodies was measured.
  • NCI-H2228 was suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), ImM sodium pyruvate and 25 mM HEPES to a cell density of 4 ⁇ 10 3 cells / well.
  • the cells were seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) coated with type I collagen, and cultured at 37 in a 5% carbon dioxide gas stream.
  • the egret peptide antibodies (AS-2531, AS-2532, and non-immune egret IgG Oackson) obtained in Example 8 were diluted with PBS, and the final concentration of each antibody was 15 g / ml, 458/1111 and 150 ⁇ g / ml.
  • the protein used in the present invention is specifically expressed in cancer cells, and is a diagnostic marker for cancer. Therefore, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene, an antisense polynucleotide of the present invention, and an antibody of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, Breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, ovary, testis, thyroid, kidney, brain, blood, etc. ) Prevention-Can be used safely as a therapeutic agent, apoptosis promoting (inducing) agent, etc.
  • cancer eg, colon cancer, Breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, ovary, testis, thyroid, kidney, brain, blood, etc.
  • Prevention-Can be used safely as a therapeutic agent
  • the protein used in the present invention or the polynucleotide encoding the same, the antibody of the present invention, etc. may be used for cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen)
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen
  • cancer eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen
  • prophylactic and therapeutic agents for cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, blood tumor,

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Abstract

　配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現または該タンパク質遺伝子の発現などを阻害する化合物、該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体などは、癌などの予防・治療剤、アポトーシス促進剤などとして有用である。

Description

明 細書 新規タンパク質およびその用途 技術分野
本発明は、 新規タンパク質、 それをコードするポリヌクレオチド、 その製造 法、 癌の予防 ·治療剤または診断薬、 アポトーシス促進剤、 癌の予防 ·治療剤 またはアポト一シス促進剤のスクリ一二ングなどに関する。 背景技術
近年のマイクロアレイ ·オリゴヌクレオチドアレイ技術の進歩により、 遺伝 子発現の網羅的な解析が可能となってきた。 癌においても遺伝子のマイクロア レイプロフアイリングデ一夕でその病態が評価しうることも予見され、 実際、 白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であるこ とが報告されている。 また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかに し、 その分類を積み重ねることによって、 特定の癌治療法に対する反応性を予 測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが 可能となると考えられる。 具体的には、 ある種の癌である種のタンパク質の発 現亢進が認められる場合には、 新たに抗原陽性と診断された患者に対して （i) その発現量を低下させる、 （i i) 機能を抑制する、 （i i i) 該タンパク質に対す る宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によつて抗腫瘍活性を導くことが可能 となる。 これと同時に、 抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への 切替が迅速に行えるなど、 患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想さ れる。 以上のように発現プロファイル解析は、 癌の分子診断と分子標的治療薬 の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
Semaphor inファミリ一は分泌型分子と膜結合型分子の両方から構成される大 きなタンパク質ファミリーで、 脊椎動物で少なくとも 19種、 非脊椎動物で 3種の 遺伝子が報告されている （Cel l 97巻， 551- 552頁， 1999年） 。
Semaphor i nファミリーは神経軸索誘導やシナプス形成などに代表される広範 囲な神経発生過程に関わることが知られている。 近年になり、 Semaphor inファ ミリ一の免疫系への関与 （Trends in I画 unol . 22巻， 670- 676頁， 2001年） や、 11器発生 ·血管新生における関与が明らかになりつつある。 Semaphor inフアミ リ一に属するヒト由来の Semaphor in 3B、 Semaphor in 3Fは、 癌抑制遺伝子とし て報告されている (Proc. Nat l Acad. Sc i . USA 98巻， 13954-13959頁， 2001年、 Cancer Res. 62巻， 542-546頁， 2002年、 Cancer Res. 62卷， 2637- 2643頁， 2002年） 。 Semaphor in 3Cは、 ヒト肺がん組織で発現が亢進しているという報告 がある （J. Surg. Oncol . 72巻， 18-23頁， 1999年、 Proc. Nat l Acad. Sc i . USA 94巻， 14713- 718頁， 1997年） 。 Semaphor in 3Eは転移性細胞で発現して いると報告されている （Cancer Res. 58巻， 1238- 1244頁， 1998年） 。
Semaphorin4Dとアミノ酸レベルで相同性が 41 %の Semaphor in 4B (以下、 SEMA4Bと略すこともある） は GenBankにゲノム配列から予想された遺伝子として 登録されている (GenBank Access ion No. XMJ44533) 。 SEMA4Bは低酸素条件下 で発現が上昇する遺伝子のひとつとして報告されている （TO 02/46465) 。 また、 ジーンチップ解析に基づき SEMA4Bなどを含む数百種の塩基配列が、 肺癌の診断. または肺癌を治療する化合物の探索などに使用できるとの報告もある （W0 02/86443) SEMA4Bとアミノ酸レベルで 93%の相同性を有する N0V7は、 癌で発 現宂進していることが報告されている （W0 02/06329) 。
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、 癌細胞の増殖阻害を誘導する安 全な薬剤が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 肺癌組 織で発現が顕著に増加する新規遺伝子を見出し、 この遺伝子のアンチセンスォ リゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進することも見出した。 この知 見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質または その塩、
(2) 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 10で表されるアミノ酸 配列からなるタンパク質またはその塩、
(3) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(4) 上記 （1) 記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 11で表される塩基配列 を含有する上記 （5) 記載のポリヌクレオチド、
(7) 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 11で表される塩基配列 からなるポリヌクレオチド、
(8) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、
(9) 上記 （8) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、
(10) 上記 （9) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク質 またはその部分ペプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする上記 （1) 記 載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(11) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有してなる医薬、
(12) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(13) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(14) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体、
(15) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(16) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(17) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
(18) 上記 （17) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(19) 上記 （14) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の タンパク質の定量方法、 (20) 上記 （19) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 （1) 記 載のタンパク質またはその機能が関連する疾患の診断方法、
(21) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載のタンパク質の発現を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有してなる、 上記 （1) 記載のタンパク質の発現を阻害する化合物または その塩のスクリ一ニング用キット、
(22 a) 上記 （21) 記載のスクリーニング方法または上記 （22) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質の発 現を阻害する化合物またはその塩、
(22 b) 上記 （22 a) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 ' (23) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記 ( 1 ) 記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法、
(24) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 上記 （1).記載 のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング用 キット、
(24 a) 上記 （23) 記載のスクリーニング方法または上記 （24) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩、
(24b) 上記 （24 a) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (25) 癌の予防 ·治療剤である上記 （1 1) 、 （12) 、 （15) または (18) 記載の医薬、
(25 a) 癌が、 肺癌、 卵巣がんまたは塍臓癌である、 上記 （25) 記載の医 薬、
(25 b) 癌の予防 ·治療剤である上記 （22 b) または （24 b) 記載の医 薬、
(26) (癌細胞の） アポトーシス促進剤である上記 （11) 、 （12) 、 (15) または （18) 記載の医薬、
(26 a) (癌細胞の） アポトーシス促進剤である上記 （22 b) または （2 4b) 記載の医薬、
(26 b) 癌細胞の増殖阻害促進剤である上記 （1 1) 、 （12) 、 （1 5) 、 (18) 、 （22 b) または （24 b) 記載の医薬、
(27) 癌の診断薬である上記 （13) または （16) 記載の診断薬、
(28) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドの発現または 該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなるアポトーシス促進 剤、
(29) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体を含有してなるアポトーシス促進剤、
(30) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは寒質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
(30 a) 癌が、 肺癌、 卵巣癌または塍臓癌である上記 （30) 記載の予防 · 治療剤、
(30 b) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体を含有してなる癌細胞の増殖阻害促進剤、
(31) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部を含有するポリヌクレオチド、
(32) 上記 （31) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、 . (33) アポトーシス促進剤である上記 （32) 記載の医薬、
(33 a) 癌細胞の増殖阻害促進剤である上記 （32) 記載の医薬、
(34) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用 ることを特徴とするアポト一シス促進剤のスクリーニング 方法、
(35) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有することを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニン グ用キット、
(35 a) 上記 （34) 記載のスクリーニング方法または上記 （35) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうるアポト一シス促進剤、
(36) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドの発現または該夕 ンパク質の遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなるアポトーシス促進剤、
(36 a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの遺伝子の発現 を阻害する物質を含有してなる癌細胞の増殖阻害促進剤、
(37) 哺乳動物に対し、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7ま たは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の発 現を阻害する物質、 （ii) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の 発現を阻害する物質、 または （iii) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする、 癌の予防-治 療法、
(38) 哺乳動物に対し、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号'： 7ま たは配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の発 現を阻害する物質、 （ii) 該^ンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の 発現を阻害する物質、 または （iii) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩に対する钪体の有効量を投与することを特徴とする、 癌細胞のアポ ト一シス促進方法、
(39) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を！^害する、 または 該タンパク質もしくはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害することを特徴 とする癌の予防 ·治療法、
( 4 0 ) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： Ίまたは配列番号： 1 0で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の発現を阻害する、 または 該タンパク質もしくはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害することを特徴 とする癌細胞のアポ卜一シス促進方法、
( 4 1 ) 癌の予防 ·治療剤を製造するための （i ) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドま たはその塩の発現を阻害する物質 (i i) 該タンパク質もしくはその部分ぺプ チドの遺伝子の発現を阻害する物質、 または （i i i) 該タンパク質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
( 4 2 ) 癌細胞のアポト一シス促進剤を製造するための （i) 配列番号： 1、 配 列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する物質、 （i i ) 該タンパク質もしくは その部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質、 または （i i i ) 該タンパク質 もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用などを提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパ ク質 （以下、 本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称す ることもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例、 肝細胞、 脾 細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 iS細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ラ ンゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊 維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T 細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜紬胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細 胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは 癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳 の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 .海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕齓 腎齓 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆の う、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパク質であっても よい。
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列として は、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 9 5 %以上、 好ましくは約 9 8 % 以上、 好ましくは約 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられ る。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列,を含有 するタンパク質としては、 例 ば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 ましい。
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する ァミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 4で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 ましい。 ' 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有する アミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の fミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 7で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列 I号： 7で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好 'ましい。
配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と 9 9 . 9 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する夕ンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 0で表されるァミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 0で表されるァ ミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質な どが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (Nat ional- Center for Bi otechnology Informat ion Bas ic Local Al ignment Search
Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10；ギャップを許す；マトリクス = BL0SUM62；フィルタリング =0FF) にて計算することができる。
実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に （例、 生理学的に、 または薬理 学的に） 同質であることを示す。 したがって、 本発明のタンパク質の活性が同 等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜1 0倍、 より好ましく は 0 . 5〜2倍) であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク質 の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （1 ) (i) 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましく は数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好まし くは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1で表され るアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1 〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5 ) 個），のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または （V) そ れらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイ ン、 （2 ) (i) 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表される アミノ酸配列中の 1または 2個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配 列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列に 1 または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付 加したアミノ酸配列、 （i i i) 配列番号： 4、 配列番号：.7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列に 1または 2個のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配 列、 （iv) 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミ ノ酸配列中の 1または 2個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質など ,のいわゆるムティンも含まれる。 ，
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿 入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明で用い られるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 （-C00H) 、 カルポキシレート（- C00— ) 、 アミド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの C ,_ 6アルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C 3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 ひ—ナ フチルなどの C 6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル — C卜 2アルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの a一ナフチルー アル キル基などの _14ァラルキル基、 ピパロィルォキシメチル基などが用いられる。 本発明で用いられるタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカル ポキシレート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル 化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含ま る。 この場合のェ ステルとしては、 例えば上記したじ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、. メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基など の アルカノィルなどの C Mァシル基など） で保護されているもの、 生体内 で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば—〇H、 — S H、 ァミノ,基、 イミ ダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホ ルミル基、 ァセチル基などの d_6アルカノィル基などの ァシル基など） で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複 合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 4で表されるァミノ 酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有す るタンパク質、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で 用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明 で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでも よい。
例えば、 本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくと も 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好 ましくは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有する ペプチドなどが角いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さら に好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配 列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0 個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そ のアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好まし くは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入さ · れ、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個 程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましく は 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （- C00H) 、 カルポキシレート （- C00—) 、 アミド （_C0NH2) またはエステル （- C00R) の何 れであってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられ るタンパク質と同様に、 C末端以外にカルボキシル基 （またはカルポキシレ一 ト） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のアミ ノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル 夕ミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換 基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖 ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いるこ とができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的 に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などと の塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このよ うな塩としては、 例えば、 無機酸 （例、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） と の塩、 あるいは有機酸 （例、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン 酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホ ン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知の夕ンパク質の精製方 法によつ T製造することもできるし、 タンパク質をコードする D NAを含有す る形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述の ぺプチド合成法に準じて製造することもできる。 '
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一 を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩、 または そのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで きる。 そのような榭脂としては、 例えば、 クロロ チル樹脂、 ヒドロキシメチ ル榭脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシ ベンジルアルコール樹脂、 4 _メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリル アミド樹脂、 4— ( 2 ' ， 4 ' ージメトキシフエ二ル―ヒドロキシメチル） フ エノキシ榭脂、 4 _ ( 2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチ ル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α— ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の 配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最 後に樹脂から夕ンパク質または部分べプチドを切り出すと同時に各種保護基を 除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目 的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボ ジイミド類としては、 D C C、 N， N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N— ェチルー N'— ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t， H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物ま たは H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミ ノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護ァ,ミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク 質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド, N—メ チルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲ ン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスル ホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 用いられる。 反応温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られ ている範囲から適宜選択され、 通常約 _ 2 0〜5 0 °Cの範囲から適宜選択され る。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行 なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチ ルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の 反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t 一ペンチルォキ シカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C 1 _ Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフル ォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4 _ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 （Cw) アルカノィル基、 ベンゾィル塞などのァロイル基、.ベンジルォ キシカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが 用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テ トラヒドロピラニル基、 t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12 一 B z l、 2_ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキ シ— 2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2, 4, 5—トリクロロフエノ一ル、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 20° (〜 40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフイド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオール などのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾ一ル保護基として用いられる 2， 4—ジニトロフェニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記の 1， 2一エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 '希アンモニ ァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の 0!—力ルポキシル基をアミド化して保護した 後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を'所望の鎖長まで延ばした後、 該 ペプチド鎖の N末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部 分ペプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質また は部分べプチドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したよ うな混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、 上記方法に よりすベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ること ができる。 この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の夕ンパク質またはペプチドのァ ミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 力ルポキシ末 端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エス テルとした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望の夕 ンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。 '
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチド の合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダ ーゼで切断することによつて製造することができる。 ぺプチドの合成法として は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本 発明で用いられる部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしぐはアミノ酸と 残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離すること により目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱 離としては、 例えば、 以下の （i) 〜 （V) に記載された方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszkyおよび M.A. Ondetti、 ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii) Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド（The Peptide) , Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマ卜グ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用い られる部分ペプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べ プチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。 本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前 述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するもので あればいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとして は、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいず れでもよい。
ライブラリーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞。組織 より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PC R法と田各称す る） によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 (i) 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩 基配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質 と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコード： Tる DNA、
■ (ii) 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 5で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(iii) 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(iv) 配列番号： 11で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番 号： 1 1で表される塩基配列とハイストリンジエンドな条件下でハイブリダィ ズする塩基配列を含有し、 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパグ質をコードする DN Aであ れば何れのもので ょい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と 95%以上、 好ましくは約 98以上、 好ましくは約 99%以上の相同性を有す る塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 5で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 5で表される塩基配列と 99. 9 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 8で表される塩基配列と 99. 9%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 11で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 1 1で表される塩基配 列と 99. 9%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いら れる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例 ば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ ィブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従つて行なうこ とができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうこ とができる。
ハイストリンジエンドな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 60〜65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有 する DNAまたは配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DNAなどが、 (ii) 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する DNAまたは 配列番号： 6で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、 （iii) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DN Aとしては、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNAまたは配列番号： 9で表さ れる塩基配列を含有する DNAなどが、 （iv) 配列番号： 10で表されるアミ ノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 11 で表される塩基配列を含有する DNAまたは配列番号： 12で表される塩基配 列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DN A) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配 列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞'組織由来の cDNA、 前記した細 胞 ·組織由来の cDN Aライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配 列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩 基配列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または配列番号： 2、 配列 番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配列とハイスト リンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明のタン パク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DN Aの一部分 を含有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 11で表され る塩基配列とハイブリダイズできる D N Aは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダィゼ一ションの方法および八イストリンジェントな条件は前記と 同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする DNAのクロ一ニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明の夕 ンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニングの 手段としては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合 成 DN Aプライマーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なべク 夕一に組み込んだ D N Aを本発明の夕ンパク質の一部あるいは全領域をコ一ド する DNA断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼ . —ションによって選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えは、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 巿 販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 (株) ) 、 Mutan™- K (宝酒造 (株) ,) 等を用いて、 0DA-LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいばそれらに準じ る方法に従って行なうことが：!?きる。
クローン化されたタンパク質をコードする DNAは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有 し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAG を有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DN Aアダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質 をコ一ドする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 3 25， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 11 0, pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， p SH 15) 、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρΑ1_ 11、 ρ XT1、 pRcZCMV、 pRc/RSV, p c DNA I ZN e oなどが用い られる。'
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモー夕 であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる塲合は、 SRひプロモータ一、 SV40プロモ一夕一、 L TRプロモ一ター、 CMVプロモータ一、 HS V-TKプロモータ一などが挙げ られる。 ，
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモ一夕一、 SRaプロ モータ一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプロモー夕一、 r e cAプロモーター、 ？乙プ 口モータ—、 ι ρ ρプロモーター、 丁？プロモーターなどが、 宿主がバチルス 属菌である場合は、 SPOlプロモータ一、 SP〇2プロモータ一、 p e nP プロモータ一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGK プロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿 主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモ一夕一、 P 10プロモー夕一 などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ 、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V400 r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が 挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズ八ムスター細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカ一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA'シグナル 配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ーァ ミラ一ゼ*シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MFo! ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 ο;—インターフエ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコ一ドする DN Aを含有す るべクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 , 崑虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌の具体例としては、 例えば, ェシェリヒア ·コリ
(Escherichia coli) K 12 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 卷， 160(1968)〕 ， JM 103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309 (1981)〕 ， J A221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517(1978)〕 , HB 101 [Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39 巻, 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔Gene, 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 [Journal of Biochemistry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R—， NA 87 - 11 A, DKD- 5D, 2 0B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces poinbe) N CYC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) KM 71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； Sf細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが NPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori 細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 Sf細胞としては、 例えば、 Sf9細胞 （ATCC CRL1711) 、 Sf21細胞 (以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン 'ヴィポ .（In Vivo) ,13, 213- 217，（1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ ― (Nature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下'、 CHO細胞と略記） ， dh f r遺伝子欠損チヤ ィニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウスミエ口一マ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラッ卜 GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69巻， 2110(1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従つて行なうことができる。 酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182- 187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻, 1929 (1978)などに記載の方法に 従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6， 47 -. 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ 口トコ一ル. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻， 456 (1973)に記載 , の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成 長促進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜 8が望ましい。 .
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular
Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好まし レ^ ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 β —インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 43 °Cで約 3〜 24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホールダー (Burkholder) 最小培地 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 .
巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Ϊ>ΓΟ Natl. Acad. Sci. USA, 81巻， 5330(1984)〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整する のが好ましい。 培養は通常約 20°C〜35tで約 24〜72'時間行ない、.必要 'に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195,788 (1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清 等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要 に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122巻， 501 (1952)〕 ， D MEM培地 [Virology, 8巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 〔The
Journal of the American Medical Association, 199巻， 519 (1967〕 ， 199培 地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73
巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は 通常約 30〜 40 °Cで約 15〜 60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加 える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の夕 ンパク質を生成せしめることができる。 '
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗油出液を得る方法などが適 宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X— 100™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に夕 ンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ある いは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質 の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈驟法などの溶解度を利用 する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換ク 口マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグ ラフィ一などの特異的親和性を禾 ij用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利 用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、， 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られ た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタン パク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべプチ ドを部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテインキ ナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィやウェスタンブロッテイングなどにより測定することができ る。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩を 認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れで あってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合があ る） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体 または抗血清の製造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクロ一ナル抗体産生細胞の作製
本発明の夕ンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。.投与に際して抗体産生 能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行 われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよ びラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノク口一ナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性 を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ—ラーとミルスタインの方法 〔ネィチヤ— （Nature；)、 256、 495 (1975)] に 従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレンダリ コール (PEG) やセンダイゥィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEG が用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS_ 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— l などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6 000) が 10〜 80%程度の濃度で添加され、 20〜40°C、 好ましくは 3 0〜37°Cで 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
モノクロ一ナル抗体産生八イブリドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ た固相 （例、 マイクロプレート） にハイブリド一マ培養上清を添加し、 次に放 射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン坊体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫 グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合 したモノクロ一ナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地 としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M l 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ） あるいは八イブリドーマ培養用無血清培地 （S F M_ 1 0 1、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ま しくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ド一マ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定 できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロプリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により 抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行な うことができる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） 自体、 あ るいはそれとキャリア一タンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナ ル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明の夕 ンパク質に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより 製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一タンパク質との 複合体に関し、 キヤリァ一夕ンパク質の種類およびキヤリァ一タンパク質とハ プテンとの混合比は、 キャリア一タンパク質に架橋させて免疫したハプテンに 対して抗体が効率良くできれば、 どのようなものをどのような比率で架橋させ てもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァ ニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の 割合でカプルさせる方法が用いられる。 '
また、 ハプテンとキャリアータンパク質の力プリングには、 種々の縮合剤を 用いることができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活 性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が 用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担.体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ —ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレ ォチド （例、 D NA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 これらの D NAを本発明の D NAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス ポリヌクレオチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) の塩基 配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセン スポリヌクレオチドであってもよく、 アンチセンス DNAが好ましい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは 約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが 挙げられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻 害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク の N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリ ヌクレオチドが、 （口） RNa s eHによる RNA分解を指向するアンチセン スポリヌクレオチドの場合は、 イントロンを含む本発明の D N Aの全塩基配列 の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレ ォチドがそれぞれ好適である。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 12で表わさ れる塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補 的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 好 ましくは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 1または配列番号： 12で表わさ れる塩基配列を含有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部 分を有するァンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 10〜40個程度、 好ましくは 15 〜30個程度の塩基から構成される。 ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセンス D NAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホ スホロチォエー卜、 メチルホスホネー卜、 ホスホロジチォネートなどの化学修 飾リン酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシ リポース） は、 2 , —O—メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていても よいし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであっても よく、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D NAにハイブリダィズす るものであればいずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチ ドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害するこ とのできる該遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 ク ローン化した、 あるいは決定されたタンパク質をコ一ドする D N Aの塩基配列 情報に基づき設計し、 合成しうる。 かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、 本発明のタンパク質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することができるか、 あるいは本発明のタンパク質 関連 R NAとの相互作用を介して本発明めタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制 御することができる。 本発明のタンパグ質関連 R N Aの選択された配列に相補 的なポリヌクレオチド、 および本発明のタンパク質関連 R N Aと特異的にハイ プリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で本発 明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気など の治療または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌク レオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的 であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とタンパク質との 間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘 導される （指令にある） タンパク質のアミノ酸を通常指している。 タンパク質 遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア。 リピート、 ' 5 ' 端非 翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳 終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 .' 端パリンドローム領域または 3 ' 端ヘア ピンループなどは、 好ましい対象領域として選択しうるが、 タンパク質遺伝子 内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関 係については、 目的核酸が対象領域とハイブリダィズすることができる場合は、 その目的核酸は、 当該対象領域のポリヌクレオチドに対して 「7ンチセンス」 であるということができる。 7ンチセンスポリヌクレオチドは、 2ーデォキシ —D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D—リポースを含有してい るポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるそ の他のタイプのポリヌクレオチド、 非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリ マー （例えば、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマ一） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマ一は D N Aや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置を もつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 D NA： R NAハイブリッドで あってもよく、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリゴヌクレオ チド） 、 公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のある もの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレ ォチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例え ば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホル アミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含 有結合 （例、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォェ一トなど） を持つもの、 例えばタンパク質 （例、 ヌクレア一ゼ、 ヌクレアーゼ ·インヒビ夕一、 トキシ ン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 （例、 モノサッカ ライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インタ一カレント化合物 （例、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放 射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化 剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマー型の核酸 など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および
「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾され たその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 このような修飾 物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよび ピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌ クレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 またはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 R NA、 D NAまたは修飾され た核酸 （R N A、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては、 核酸の 硫黄誘導体、 チォホスフェート誘導体、 ポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌク レオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。 本発明のアンチセン スポリヌクレオチドは、 例えば、 以下のように設計されうる。 すなわち、 細胞 内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、 アンチセンス ポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親 和性をより大きなものにする、 また、 もし毒性があるような場合はアンチセン スポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。 このような修飾は、 例え ば Pharm Tech Japan, 8巻， 247頁または 395頁， 1992年、 Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、 修飾され た糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リポゾ一ム、 ミクロスフエアのような 特殊な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態 で与えられることができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例、 ホスホリピド、 コレステロールなど） などの疎水性のものが挙げられる。 付加 するに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例、 コレステリ ルクロロホルメ一ト、 コール酸など） が挙げられる。 こ したものは、 核酸の 3 ' 端または 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド 結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端 または 5 ' 端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキヤップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレン グリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護 基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明 の生体内や生体外の遺伝子発現系、 または本発明のタンパク質の生体内や生体 外の翻訳系を用いて調べることができる。 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べ プチドをコードするポリヌクレオチド （例、 D NA) (以下、 本発明の D N A と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそ の塩に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 および本発 明の D NAのアンチセンスポリヌクレオチド （以下、 本発明のアンチセンスポ リヌクレオチドと略記する場合がある） の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、 癌組織で発現が増加するので、 疾患マーカ一として 利用することが出来る。 すなわち、 癌組織における早期診断、 症状の重症度の 判定、 疾患進行の予測のためのマーカ一として有用である。 よって、 本発明の タンパク質をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、 本発明の夕ンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明の夕ンパ ク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 または本発明のタンパ ク質に対する抗体を含有する医薬は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 アポトーシス促進剤として使用することができる。
( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進してしており、 さら 、 本発明の ダンパク質の活性を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。 従って、 本発 明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば癌 （例、 大腸 癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍な ど） の予防 ·治療剤、 アポ卜一シス促進剤などとして使用することができる。 したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を阻害する 化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明 のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提 供する。
具体的には、 例えば、 （i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞 の活性と、 （i .i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合 物の混合物の活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻 害する化合物またはその塩のスクリ一二ング方法が用いられる。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述し た本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するべクタ一で形質転換され た宿主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C HO細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スク リーニングには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタン パク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本発明の夕， ンパク質を発現し得る細胞の培養 法は、 前記した本発明の形質変換体の培養 法と同様である。 ' - 試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあ げられる。
例えば、 上^ (i i) の場合における本発明のタンパク質の活性を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合 物として選択することができる。 ―
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタン パク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。 さらに、 本発明のタンパク質の遺伝子も、 癌組織において発現が増加するの で、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、 例 えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳 虛瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 アポト一シス促進剤などとして使用す ることができる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 D NA) は、 本発明のタンパ ク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための 試薬として有用である。 ' '
スクリーニング方法としては、 （i i i) 本発明のタンパク質を產生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明で用いられ るタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うこと を特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （i i i) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 ' (具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mR NA量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識す る抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウェスタン 解析、 E L I S A法などの方法または れに準じる方法に従い測定することが できる。
mR NA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プローブとして配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配列または その一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダィゼーシヨン、 あるいは プライマーとして配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番 . 号： 1 1で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いる P C R法 またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （i i i) の場合に比 ベて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻 害させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物 として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしく は部分ペプチドまたはその塩、 または本発明で用いられるタンパク質もしくは 部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク 質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明の タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタン Λク質の塩と同様のものが用 いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 および本発明の タンパク質の遺伝子の 現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾 臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の治療 '予防剤、 アポトーシス促進剤などとして低毒性で安全 な医薬として有用である。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ一ニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に 従って製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的 には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあ げられる。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野におい て通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネ シゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 伊!!えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関 節内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例えば、 上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしく は油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液 としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液など が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポ リアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非ィ オン界面活性剤 〔例、 ポリソルベート 8 0、 H C O - 5 0 (polyoxyethylene (50mol) adduc t of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油 性液としては、 例えば、 マ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安 息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射 液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上 記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。 上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 O m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記化合物が含有され ていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用 を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口 的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク 質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的 に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物またはその塩の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などに っても異なるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタン パク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人
(体重 60kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物またはその塩を約 0. 01〜30mg、 好ましくは約 0. 1〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを癌病変部 に注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たり に換算した量を投与することができる。
( 2 ) 本発明のタンパク質の定量
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定 量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徼とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提 供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部 を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的に は、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定 法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合 法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1251〕 、 〔1311〕' 、 〔¾〕 、 C14C] などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダ一ゼ、 3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ 酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 シァニン蛍光色 素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製） な ど） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチォシァネートなどが用いられ る。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリ ン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結 合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹 脂、 あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明の夕ンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらし て行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用お体ある いは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感 度を向上させる等の目的で 2種類以上の坊体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノク口一ナル抗体は、 本発明の夕ン パク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体 が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体 は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができ る。 '
競合法では、 被検波中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 (B) とを分離し (BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 ' 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検波中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ一ネフ口メ卜 リ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の'タンパク質の測定 系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成 書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYJ Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol .
73 (Immunochemical Techniques (Par t B) )、 同書 Vol . 74 (Immunochemical Techniques (Par t C) )、 同書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D:Sel ec ted Immunoassays)) , 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Par t E :Monoc lonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) , 同書 Vol . 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and
Monoc lonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク 質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の夕ンパク質の濃度を定量すること によって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎 癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍 など） である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン パク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を 精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタン パク質の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのた めに使用することができる。
(3) 遺伝子診断薬
本発明の DN Aは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は瘟血動物，（例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明の タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aまたは mRN Aの異常 (遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRN Aの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加ある レ は発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン ハイブリダィゼーションゃ P CR— S S CP法 （Genomics,第 5巻， 874〜879頁 (1989年 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 第 86巻， 2766〜2770頁（1989年））などにより実施することが できる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーシヨンにより発現過多が検出された場合 や PC R— S S CP法により DNAの突然変異などが検出された場合は、 例え ば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） である可能性が高いと診断することができる。
(4) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の DNAに相補的に結合し、 該 DNAの発現を抑制することができる 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発 明のタンパク質または本発明の DNAの機能や作用を抑制し、 癌細胞のアポト 一シスを誘導することができるので、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前 立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵 巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫痰、 血液腫瘍など） の予防，治療剤、 アポト一シス促進剤などとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤、 促進剤などして 使用する場合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる f また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロ ウィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシェ一テツ ドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチ センスポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲル力 テ一テルのようなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化し て吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目 的に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリボゾームなどの担 体とともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —トなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のアンチセ ンスポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg) においては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0. 1〜100mg投与する。
さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一 ブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコード する R NAの一部を含有する二重鎖 R NA、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部を含有するリポザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制する ことができ、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用 いられる D NAの機能を抑制することができるので、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱 癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 鹧臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の 予防 ·治療剤、 アポトーシス促進剤などとして使用することができ,る。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 41 i巻， 494頁， 2001年） に準じ て、 本発明のポリヌクレオチドの配列 ¾基に設計して製造することができる。 リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medic ine, 7巻， 221 頁， 2001年)，に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造 することができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコ一ドする R N Aの一部に 公知のリポザィムを連結することによって製造することができる。 本発明の夕 ンパク質をコードする R NAの一部としては、 公知のリポザィムによって切断 され得る本発明の R NA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げら れる。
上記の二重鎖 R N Aまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用する場 合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することがで さる。 ( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 癌細胞のアポト一シス誘導活性を有するため、 例えば癌 (例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 膳臓癌、 脳腫瘍、 血 液腫瘍など） の予防 ·治療剤 （例、 ワクチンなど） （好ましくは、 肺癌、 卵巣 癌、 滕臓癌などの予防 ·治療剤など） 、 アポトーシス促進剤等として使用する ことができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤、 促進剤は低毒性であり、 そのまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳 動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に 対して経口的または非経口的 （例、 血管内投与、 皮下投与など） に投与するこ とができる。 好ましくはワクチンとして定法に従つて投与することができる。 本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物と して投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体お よびその塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むも のであっても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する 剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が 用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴 注射剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って 調整できる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはそ の塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩氷、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補 助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピ レンダリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリ ソルペート 8 0、 H C O— 5 0 (po lyoxye thyl ene (50mol) adduc t of hydrogenated cas t or o i l) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、， 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコール等を併用してもよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填 されることが好ましい。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩 を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液伴の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、：散剤、 カプセル 剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用い られる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦 形剤としては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが 用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の 剤形としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤 が挙げられる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 と りわけ注射剤では 5〜100mg、 その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有され ていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防 ·治療剤、 調節剤の投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の 治療'予防のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01 〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. 1 〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射に より投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれ に準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応 じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形 として提供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、 本発明の抗体は、 他の薬剤、 例えばアルキル化剤 （例、 サイクロフ ォスフアミド、 ィフォスフアミド等） 、 代謝拮抗剤 （例、 メソトレキセート、 5 _フルォロウラシル等） 、 抗癌性抗生物質 （例、 マイトマイシン、 アドリア マイシン等） 、 植物由来抗癌剤 （例、 ビンクリスチン、 ビンデシン、 タキソ一 ル等） 、 シスブラチン、 カルポプラチン.、 エトポキシドなどと併用してもよい。 本発明の抗体および上記薬剤は、 同時または異なった時間に、 患者に投与すれ ばよい。 ( 6 ) 本発明のタンパク質を含有する医薬
本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、 癌患者の免疫系を 活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。 例えば、 強力な抗原提示細胞 （例、 樹状細胞） を本発明のタン Λク質存在下 に培養し、 該タンパク質を貪食させた後に、 再び患者の体内に戻す、 所謂養子 免疫療法などを好ましく適用し得る。 体内に戻された榭状細胞は癌坊原特異的 な細胞障害性 T細胞を誘導、 活性化することにより癌細胞を死滅させることが' 可能である。
また、 本発明のタンパク質は、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺 癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防または治療のため のワクチン製剤として、 安全に、 哺乳動物 （例、，ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ） に投与することもできる。
該ワクチン製剤は、 通常、 本発明のタンパク質および生理学的に許容されう る担体を含有する。 担体としては例えば、 水、 食塩水 （生理食塩水を含む） 、 緩衝液 (例、 リン酸緩衝液） 、 アルコ一ル （例、 エタノール） などの液体の担 体があげられる。 '
ワクチン製剤は、 通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することがで きる。
通常、 本発明のタンパク質は、 生理学的に許容されうる担体に溶解または懸 濁される。 また、 本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々 に調製し、 用時それらを混合して用いてもよい。
ワクチン製剤には、 本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体 に加え、 アジュバント （例、 水酸化アルミニウムゲル、 血清アルブミンなど） 、 防腐剤 （例、 チメロサールなど） 、 無痛化剤 （例、 ブドウ糖、 ベンジルアルコ ールなど） などを配合させてもよい。 また、 本発明のタンパク質に対する抗体 産生を促進させるために、 例えばサイト力イン （例、 インタ一ロイキン一 2な どのィン夕ーロイキン類、 インターフェロン一ァなどのイン夕一フエロン類な ど） をさらに配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、 本発明のタンパク質は活性体として用いても よいが、 抗原性を高めるために本発明のタンパク質を変性させてもよい。 本発 明のタンパク質の変性は、 通常、 加熱処理、 タンパク質変性剤 （例、 ホルマリ ン、 塩酸グァニジン、 尿素） による処理により行われる。 得られたワクチン製剤は低毒性であり、 通常注射剤として、 例えば皮下、 皮 内、 筋肉内に投与してもよく、 また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与し てもよい。
本発明のタンパク質の投与量は、 例えば対象疾患、 投与対象、 投与ル一卜な どによって異なるが、 例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人 （体重 ■ 60kg) に皮下的に注射剤として投与する場合、 1回当たり通常 0.1〜300mg程度、 好ましくは 100〜300mg程度である。 ワクチン製剤の投与回数は 1回でもよいが、 抗体産生量を高めるために、 約 2週間〜約 6ヶ月の間隔をあけて、 該ワクチン製 剤を 2〜4回投与することもできる。
(7) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする DNA (以下、 本発明 の外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DN Aと略記する場合がある） を有する非ヒ卜哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 D N Aまたはその変異 D N Aを有する非ヒト哺乳動物；
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物におい て発現しうる組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒ卜哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公 知の細胞融合法により融合させることにより本発明の D N A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ 。 ヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が'容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 57BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 BeCSF 系統， BDFi系統， BeDSFi系統， BALB/c系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外 性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。 該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意 味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現 させる DNAなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させるに あたっては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合し た DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出すること ができる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯 草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオ. ファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィル スまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DN Α発現調節を行なうプロモ一夕一としては、 例えば、 （i) ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロ モ一ター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハ ムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 ェン ドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチォ ン S—トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン Kl, K10お よび K14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク 質キナーゼ i3 Iサブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵扰性アル力リフォス ファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ (一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵 素 （Na, K-ATP a s e) 、 ニュ一口フィラメント軽鎖、 メタロチォネィ ン Iおよび I IA、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒピター、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン —水酸化酵素、 甲状 腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) 、 βァ クチン、 αおよび i3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、.ミエリン基礎夕 ンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VN P) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン ( 、 平滑 筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモーター などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウ ィルスプロモーター、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 α) のプロモー 夕一、 ヒトおよびニヮトリ ;3ァクチンプロモータ一などが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R
NAの転写を終結する配列 （ 般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有しているこ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネタ 一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DN Aのイントロンの一部な どをプロモーター領域の 5'上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳 領域の 3' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の 肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリ一よりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または 臓、 腎 臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補
DNAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DNAは、 上 記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘 発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、 前 記のプロモータ一の下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の DN A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 DN Aが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N
Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを有す る。 本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 . 受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能宂進症を発症することがあり、 その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病 態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 のタンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾 患に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食 道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤のスクリー二 ング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモータ一との D NAコンストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相 同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病 siモデル 動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用 いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの 疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質によ る正常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとな る。
また、 本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活 性型不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣 癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤のス クリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
( i ) 組織培養のための細胞源としての使用、 (i i) 本発明の D N A転移動物の組織中の D NAもしくは R N Aを直接分析す るか、 または D NAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本 発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性 についての解析、
(i i i) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （i i i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該 疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D N A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などのタンパク質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養 またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明の夕 ンパク質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 ま たはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなど ができ、 本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料とな る。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活 性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療華の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療 薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の D NA転 移動物または本発明の外来性 D N A発現ベクターを用いて、 本発明のタンパク 質が関連する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。
( 8 ) ノックアウト動物 本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
' (7) 該: DNAがレポ一ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の )3—ガラクトシダ一ゼ 遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺 乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の 発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質 の活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のタンパク 質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがあ る） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物として _は、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壌す ることにより本発明のノックアウト DN Aを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の DN A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l ac Z ガラクトシダ ーゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 p o l y A付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメ ッセンジャー RNAを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊 するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングべ クタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配列を プローブとしたサザンハイブリダィゼ一ション解析あるいはターゲッティング ベクタ一上の D N A配列とターゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列をプライマ一とした PC R法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BLZ6マ ウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBAノ 2との交雑により改善した BDF マウス （C 57 BLZ6と DBA/2との を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫で あるという利点に加えて、 C 57 BLZ 6マウスを背景に持つので、 これを用 いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BLZ6マ ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代え ることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、' 培養初期における ES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 .早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細陴の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜 10000 U/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5 %炭酸ガス、 95% 空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37°Cで培養するなど の方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0, 0 01〜 0.5 %トリプシン Z 0.1 ~ 5 mM E D T A、 好ましくは約 0.1 %ト リブシン ZlmM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ 一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜3 '日毎 に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた 場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, Nature, 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.第 78卷、 7634頁、 1981年； Τ· C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジー 'アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87 巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化させて得られる本発明の DNA 発現不全細胞は、 インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討 において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 した夕一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入により夕ーゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の DN Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DN Aをノックアウトさせることができる。
本発明の DNAがノックアウトされた細胞は、 本発明の DNA上またはその 近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハィブリダイゼ一ション解析または 夕一ゲッティングベクタ一上の DNA配列と、 ターゲッティングベクターに使 用したマウス由来の本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列とをプライマ —とした PCR法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の DNAが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。
' 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 こ のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個 体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの 産仔から本発明の夕ンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D N A溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D, N Aがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴー ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質によ り誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活 性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因 究明及び治療法の検討に有用である。
( 8 a ) 本発明の D N Aの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病、 例えば癌などに対して治療 ·予防効果を有 する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物 であってもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択することができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の 性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癒、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） に対して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリー二 ングする場合、 本発.明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組 織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 · . 予防効果を有する化合物として選択することができる。 "
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起 こされる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低 毒性な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることがで ' さる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。. このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 齚 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸な ど） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
'該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60kgとして） の乳癌患者においては、 一日につき該ィ匕合物を約 0。 l〜100mg、 好ましくは約 1.0〜50mg、 より好ましくは約 1.0〜20mg投与する。 非経口的に投 与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異 なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60k.gとして） の乳癌 患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0.01〜30mg、 好ましくは約 0.1〜 20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(8 b) 本発明の DN Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化 合物のスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一ター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対する プロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物 としては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の DNAがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕 一遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポ一ター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 j8—ガラクトシ ダ一ゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはル シフェラ一ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DNAをレポ一タ一遺伝子で置換された本発明の DNA発現不全非 ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の DNAに対するプロモータ一 の支配下に存在するので、 レポ一ター遺伝子がコードする物質の発現をトレ一 スすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の /3_ガラクトシダーゼ遺伝子 ( 1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明 のタンパク質の発現する組織で、 本発明の夕ンパク質の代わりに /3—ガラクト シダーゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ—4一クロロー 3—インド リル一 /3—ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような ;3—ガラクトシダーゼ の基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明の夕ンパク質の 動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的に.は、 本発明の タンパク質欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温 または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D TA/P B S溶液で洗浄することによって、 β—ガラクトシダ一ゼ反応を 停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該ィ匕合 物の塩とレては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 ァ ルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コ ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ 酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩な どが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性を阻畲する化合物またはその塩は、 本発明の夕ンパク質の発現の阻害、 該タンパク質の機能を阻害することができ るので、 例えば癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓 癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍 臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリーニングで βられた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモーター活性を阻害 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） の乳癌患者 においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 よ り好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1 回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （体 重 60kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜
30mg、 好ましくは約 0. 〜 20mg、 より好ましくは約 0. 〜 l Oingを静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量 を投与することができる。
このように、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに 対するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ 一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
' また、 本発明のタンパク質のプロモ一夕一領域を含有する D NAを使って、 その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細 胞に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれ ば、 特異的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも 可能となる。 さらに上記プロモ一夕一部分に適当なレポ一夕一遺伝子を結合さ せ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのもの の体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物 の探索系として使用できる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る'置用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学 異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シ卜シン
RNA ： リポ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d ATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
d GTP ：デォキシグアノシン三リン酸
d CTP ペデォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリ,ゥム
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
L eu ：ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸 L y s : リジン
A r g ：アルギニン
H i s ： ヒスチジン
Ph e ： フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ： プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
S e c (selenocysteine)
:セレノシスティン また、 本明細書中で繁用される置換基
dする。
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
Ph ： フエニル基
TC ：チアゾリジン一 4 一力ルポキサミド基
T o s ： p—トルエンスル
CHO ：ホルミル
B z 1
Cl2-Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 z
B r -Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル B o c t一ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル T r t ： 卜リチル
Bum ： t—ブトキシメチル
Fm o c ： N- 9:一フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t
HOOB t ： 3， 4ージヒドロ一 3—ヒド キシー 4一ォキソ一
1, 2, 3一べンゾトリアジン
HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2， 3 -ジカルポキシイミド DCC 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
SEMA4Bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する S EMA 4 Bをコードする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
SEMA4Bをコードする全長遺伝子を含む DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
S EMA4 B— Mlのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有する S EMA 4 B— Mlをコード する D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
SEMA4B— Mlをコ一ドする全長遺伝子を含む D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 7〕
S EMA4 B— M2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する SEMA 4 B— M 2をコード する DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 9〕
SEMA4B— M2をコ一ドする全長遺伝子を含む DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 1'0〕
SEMA4B— M3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する SEMA4B— M3をコ一 ドする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
SEMA4B-M3をコードする全長遺伝子を含む DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 13〕
実施例 2、 実施例 3、 実施例 15および実施例 16で用いられたアンチセン スオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 2、 実施例 3、 実施例 15および実施例 16で用いられたオリゴヌク レオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
実施例 3で用いられたァンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。 〔配列番号： 16〕
実施例 3で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
実施例 3で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
実施例 3で用いられたプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
実施例 4、.実施例 6および実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 20〕
実施例 4および実施例 7で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕 実施例 6で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
実施例 8で用いられたぺプチド 1のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
実施例 8で用いられたぺプチド 2のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
実施例 8で用いられたべプチド 3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 25〕
実施例 8で用いられたべプチド 4のアミノ酸配列を示す。 後述の実施例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli TOP10/SEMA4B- Ml/pCR4-T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター に、 寄託番号 FERM BP- 8316として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli TOP10/SEMA4B-
M2/pCR4-T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター に、 寄託番号 FERM BP- 8317として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli TOP 10/SEMA4B- M3/pCR4- T0P0は、 2003年 3月 4日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター に、 寄託番号 FERM BP- 8318として寄託されている。 以下において、 実施例により本発明をより具体的にするが、 この発明はこれ らに限定されるものではない。 実施例 1
遺伝子発現解析
肺がん組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、 肺が ん組織 4例、 正常肺組織 5例から抽出された total RNA (表 1 ) を材料とし、 oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Affymetrix社） を用いて遺伝子発現解析を行った。 実験方法は、 Affymetrix社 の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。
その結果、 肺がん組織 3例 (lot.0011-192-01285, lot.001卜 192-01293および lot.0011-192-01297) において、 Semaphorin 4B (SEMA4B) および後述の実施例 4記載の Semaphorin 4B-M1 (SEMA4B-M1) 、 Semaphorin 4B-M2 (SE A4B-M2) な らびに Semaphorin 4B-M3 (SEMA4B-M3) 遺伝子の発現亢進が検出された （表 2) 。
〔表 1〕
RNAを抽出した組織 販売兀
肺がん組織 (lot. 0009- -192-00122) BioCl inical Partners 社
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01285) BioClinical Partners 社
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01293) BioClinical Partners 社
肺がん組織 (lot. 0011- -192-01297) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0009- -192-00150) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0009- -192-00168) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01283) BioCl inical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01285) BioClinical Partners 社
正常肺組織 (lot. 0011- -192-01297) BioCl inical Partners 社
〔表 2〕 組織 遺伝子発現量
肺がん組織 (lot.0009-192-00122) ND
肺がん組織 (lot.0011-192-01285) 10
肺がん組織 (lot.0011-192-01293) 9.5 肺がん組織 (l ot. 0011-192-01297) 1. 9
正常肺組織 (lot . 0009-192-00150) ND
正常肺組織 (lot . 0009-192-00168) ND
正常肺組織 (lot. 0011-192-01283) ND
正常肺組織 ( l ot . 0011-192-01285) ND
正常肺組織 （lot. 001卜 192- 01297) ND
遺伝子発現量は、 ol igonuc leot ide mi croarrayで発現が検出された
全遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。
, D; not detec ted 実施例 2
ヒト肺癌細胞株のアポト一シス誘発
SEMA4Bおよび後述の実施例 4記載の SEMA4B-M1、 SEMA4B- M2ならびに SEMA4B - M3 遺伝子の発現を抑制することにより、 ヒト肺がん細胞株のァ トーシスが誘発 されるか否かを調べた。
まず、 ァメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC) より購入したヒト 非小細胞肺がん細胞株 NCI- HI 703を、 RPMI- 1640培地 （25mM HEPES含有）
(Invi t rogen社） に牛胎仔血清 （ATCC) を 10%加えた培地で懸濁し、 1ゥエル当 たり 1万個の細胞密度 （培地液量 0. 1ml) で 96穴平底組織培養プレート （BDファ ルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、 アンチセ 具体的には、 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7および配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の 3'非翻訳領域配列にハイブ リダィズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列 (配列番号： 1 3 ) を設計 後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、 HPLC精製して導入実験 に用いた （以下、 アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する） 。 コントロール としては、 配列番号： 1 3で示される塩基配列のリバ一ス配列 （配列番号： 1 4 ) を同様に phosphorothi oate化し、 HPLC精製して用いた （以下、 コントロー ルオリゴヌクレオチドと略する） 。
Opti-MEM (Invitrogen社） で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまた はコントロールオリゴヌクレオチドを、 Opti-MEM (Invitrogen社） で 5倍に希釈 し室温で 5分間放置したオリゴフエクトァミン （Invitrogen社） と 8:3の割合
(容量比） で混合し、 1ゥエル当たり 40^Lの割合でプレートに添加した。 オリ ゴヌクレオチドの終濃度は 250nMとなるよう調整した。 上記の条件で更に 3日間 培養した後、 Cell Death Detection ELISAPLUSキット (Roche Diagnostics社） を用いて添付プロトコールに従い、 上記の 2種類のオリゴヌクレオチドのアポト 一シス誘導活性を測定した。
その結果、 7ンチセンスォリゴヌクレオチド (配列番号： 1 3) はコント口 —ルオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) に比べて約 1.6倍のアポトーシス誘 導活性を示し、 統計学的に有意な差 ≤0.01) を示した （表 3) 。
〔表' 3〕
アポト一シス誘
平均値 標準偏差 ブランク 0. 2 1 2 0. 032 コント口ール才リゴヌクレ才チド 0. 4 1 0 0. 01 7
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 0. 538 0. 035
(配列番号： 1 3) 実施例 3
SEMA4Bァンチセンスォリゴヌクレオチドによる遺伝子発現量の低下
ァンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、 SEMA4Bおよび後述の実施例 4 記載の SEMA4B- Ml、 SEMA4B- M2ならびに SEMA4B- M3遺伝子の発現量が低下するか否 か調べた。
実施例 2で用いたヒト非小細胞肺がん細胞株 NCI- HI 703を実施例 2と同じ培地 に懸濁し、 1ゥエル当たり 6万個の細胞密度 （培地液量 0.6ml) で 24穴平底組織培 養プレート （BDファルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培 養した後、 実施例 2の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチドをトラン スフエクシヨンした。 伹し、 オリゴヌクレオチドの添加量は 1ゥエル当たり 240 Lとし、 アンチセンスオリゴヌクレオチドとして 2種類 （配列番号： 1 3およ び配列番号： 15) 、 コント口一ルォリゴヌクレオチドとして 2種類 （配列番 号： 14および配列番号： 1 6) のオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号： 15および配列番号： 16に由来するアンチセンスオリゴヌクレ ォチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドに関しては、 配列番号： 1、 配 列番号： 4、 配列番号： 7および配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有 する夕ンパク質の 3'非翻訳領域配列にハイブリダイズするァンチセンスォリゴ ヌクレオチド配列 （配列番号： 1 5) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌ クレオチドを合成し、 HPLC精製して導入実験に用いた。 配列番号： 15で示さ れる塩基配列のリバース配列 （配列番号： 1 6) を同様に phosphorothioate化 し、 HPLC精製して用いた。
トランスフエクシヨン後、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24時間培養を継続した 後に RNeasy (登録商標) Mini Total RNA Kit (QIAGEN社) を用いてトータル RNA を抽出した。 約 300ngの] タル RNA 錶型として、 TaqMan Reverse
Transcription Reagents (Applied Biosystems社） を用いて添付プロ卜コーレ に従い逆転写反応した。 トータル RNAにして 7〜9ngに相当する cDNAを铸型とし、 2種類のプライマ一 （配列番号： 1 7および配列番号： 18) と SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems社） を用いて SEMA4B、 SEMA4B-MK SEMA4B-M2 および SEMA4B- M3遺伝子の発現コピー数を測定した。 同量の铸型 cDNA中に含まれ る )3 -ァクチン遺伝子発現量を TaqMan i3-actin Control Reagents (Applied Biosystems社） を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチド溶液の代わりに蒸留水を用いた場合 （以下、 非トランス フエクシヨン群と略する） では、 SEMA4B、 SEMA4B-MK SEMA4B- M2および SEMA4B - M3遺伝子発現量の総和は /3-ァクチン遺伝子発現量の 6.6%であったのに対し、 アンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 13および配列番号： 1 5) 投 与群では 0.98%および 1.1%であり、 統計学的に有意 ≤0.05) な遺伝子の発 現量低下が認められた。
一方、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14および配列番号： 16) 投与群では 4.1%および 3.4%であり、 非トランスフエクシヨン群と比べ て統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これより、 SEMA4 、 SEMA4B-MK SEMA4B-M2および SEMA4B-M3遺伝子の発現抑制 とアポ卜一シス誘導とは相関することがわかった。 実施例 4
SE A4B, SEMA4B-MK SEMA4B- M2および SEMA4B- M3をコードする cDNAのクロ一ニン グと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株 (A549) 由来の Marathon-Ready cDNA (CL0NTECH社） を铸型 とし、 2種のプライマ一 （配列番号： 19および配列番号： 20) を用いて PCR 反応を行った。 該反応液 50 1は、 1 1の上記 cDNA、 2.5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） 、 各 1.0 Mのプライマ一 （配列番号： 19お よび配列番号： 20) 、 200 M dNTPs、 および 25 1 x GC Buffer I (宝酒造 社） を含む組成とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 1分、 60°C · 1分,、 72°C · 4分を 30サイクル繰り返し、 さらに 72°C · 5分間伸長反応を行った。 PCR反 応産物の 3'端に dATPを付加するため、 5Uの Ex Taq DNA Polymerase (宝酒造社） を添加して 72°C · 7分間保温した。 得られた PCR反応産物は、 PCR Purification Kit (QIAGEN社） を用いて精製した。 これを T0P0 TA PCRクロ一ニングキット (Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクタ一 pCR4- T0P0 (Invi trogen社) へサブクローニングした。 これを大腸菌 TOP 10に導入後、 アンピシリンを含む LB 寒天培地中で cMAを持つクローンを選択した。 個々のクローンについて塩基配 列を解析した結果、 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 および配列 番号： 11で表される cDNAの塩基配列がそれぞれ得られた。
SEMA4B遺伝子 （GeneBank Accession No. XM— 044533遺伝子） の塩基配列の 1〜 237番目および 2749〜3766番目の塩基配列を、 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配 列番号： 8および配列番号： 11で表される塩基配列の 5，端および 3'端にそれぞ れ付加した塩基配列を、 それぞれ配列番号： 3、 配列番号： 6、 配列番号： 9 および配列番号： 1 2に示す。
配列番号： 2で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 ) は、 SEMA4B遺伝子 (GeneBank Access ion No. XM— 044533遺伝子） がコード する SEMA4Bタンパク質と完全に一致した。
配列番号： 5で表される塩基配列がコ一ドするアミノ酸配列 （配列番号：
4 ) を含有するタンパク質を SEMA4B- Ml、 配列番号： 8で表される塩基配列がコ ードするアミノ酸配列 （配列番号： 7 ) を含有するタンパク質を SEMA4B- M2、 配 - 列番号： 1 1で表される塩基'配列がコ一ドするアミノ酸配列 （配列番号： 1 . 0 ) を含有するタンパク質を SEMA4B-M3とそれぞれ命名した。
SEMA4B- Mlのアミノ酸配列 （配列番号： 4 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列 番号： 1 ) の 208番目の Serが l ieに置換されている。
SEMA4B- Mlをコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 5 ) では、 SEMA4Bをコ一 ドする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 90番目の gが aに、 111番目の gが aに、 623番目の gが tにそれぞれ置換されており、 623番目の置換がァミノ酸置換を伴 つている。
SEMA4B- M2のアミノ酸配列 （配列番号： 7 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配列 番号： 1 ) の 163番目の Metが l ieに置換されている。
SEMA4B-M2をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 8 ) では、 SEMA4Bをコ一 ドする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 150番目の gが aに、 489番目の gが aに、 528番目の cが tに、 1266番目の に、 1588番目の cが aに、 2343番目の aが gにそ れぞれ置換されており、 489番目の置換がアミノ酸置換を伴っている。
SEMA4B- M3のアミノ酸配列 （配列番号： 1 0 ) は、 SEMA4Bのアミノ酸配列 （配 列 号： 1 ) の 3Μ番目の Lysが Asnに置換されている。
SEMA4B- M3をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 1 1 ) では、 SEMA4Bをコ —ドする D NAの塩基配列 （配列番号： 2 ) の 1092番目の gが tに置換されてお り、 アミノ酸置換を伴っている。
配列番号： 2で表される塩基配列を有する DNAを有するプラスミドを
SEMA4B/pCR4-T0P0, 配列番号： 5で表される塩基配列を有する DNAを有するブラ スミドを SEMA4B- Ml/pCR4-T0P0、 配列番号： 8で表される塩基配列を有する DNA を有するプラスミドを SEMA4B-M2/pCR4- T0P0、 配列番号： 1 1で表される塩基配 列を有する DNAを有するプラスミドを SEMA4B- M3/PCR4- T0P0とそれぞれ名付けた。 さらに、 プラスミド SEMA4B/pCR4-T0P0が導入された形質転換体を Escher i ch i a co l i TOP 10/SEMA4B/pCR4- TOPO、 プラスミド SEMA4B- Ml/pCR4- TOPOが導入された 形質転換体を Escher i chi a co l i TOP10/SEMA4B-Ml/pCR4-TOPO、 プラスミド SEMA4B-M2/pCR4- TOPOが導入された形質転換体を Escher i ch i a col i
TOP 10/SEMA4B-M2/pCR4-T0P0, プラスミド SEMA4B_M3/pCR4- TOPOが導入された形 質転換体を Escher i ch i a co l i TOP10/SEMA4B-M3/pCR4- TOPOとそれぞれ命名した。 実施例 5
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株 SK- N-M SK-N-AS, SK-N-BE, SK-N-DZ, SK- N- FI、 SK - N - SH、 D341Med、 Daoy、 DBTRG-05MG、 U-1 18 MG、 U-87 MG、 CCF-STTG1 および SW 1088；ヒト乳癌細胞株 HCC1937、 ZR-75-K AU565, MCF-7および MDA-MB- 31； ヒト大腸癌細胞株 Caco- 2、 C0L020K COLO 205、 COLO 320DM,
HCT- 8、 HT- 29、 LoVo、 LSI 23、 SNU-CK SK-CO - 1、 SW 403、 SW 48、 SW480, SW . 620、 SW 837および SW 948； ヒト胎児腎臓細胞株 HEK293； ヒ卜小細胞肺癌細 胞株 NCI- H187、 NCI-H378, NCI-H526, NCI-H889, NCI-H1672, NCI- HI 836、 NCI-H2227, NCI-N417および SHP- 77； ヒト非小細胞肺癌細胞株 A549、. NCI- H23、 NCI-H226, NCI-H358, NCI- H460、 NCI-H522 , NCI-H66K NCI-H810, NCI- H1 155、 NCI-H1299, NCI-H1395, NCI-H1417, NCI-H1435, NCI-H158K NCI-H165 K NCI- H1703, NCI - H1793、 NCI- H1963、 NCI- H2073、 NCト讓 5、 NCI-H2106, NCI - H2228, NCI- H2342および NCI- H2347；ヒト卵巣癌細胞株 ES- 2、 Caov-3,
MDAH2774, NIH: 0VCAR3, 0V - 90、. SK-0V - 3、 T0V- 112Dおよび T0V- 21G；ヒト滕臓 癌細胞株 PANC- 1、 MIA-PaCa-2, AsPC- 1、 BxPC-3, Capan- 1および Capan - 2； ヒ ト前立腺癌細胞株 DU145； ヒト網膜芽腫細胞株 WERI- Rb- 1および Y79；ヒト精 巣癌細胞株 Cat es-1Bの 86株は、 ATCCより購入した。 ヒト正常気道上皮細胞 SAECおよびヒト正常前立腺上皮細胞 HPrECは、 Cl onet i cs社より購入した。 ヒ ト大腸癌細胞株 C0CM1、 ヒト非小細胞肺癌細胞株 VMRC- LCDおよびヒ卜前立腺 癌細胞株 PC3は、 JCRBより購入した。 これら細胞株は実施例 9以降の実施例 でも用いることがある。
上記細胞株 91株より RNeasy Mini Tot al 腿 Ki t (QIAGEN社) を用いて卜 一タル RNAを調製した。 この 1 ^一タル RNAを铸型としてランダムプライマーを 用いた逆転写反応で cDNAを調製し、 定量的 PCR反応を行うことにより、 SE A4B遺伝子 （配列番号： 2 ) 、 SEMA4B-M1遺伝子 （配列番号： 5 ) 、
SEMA4B- M2遺伝子 （配列番号： 8 ) および SEMA4B-M3遺伝子 （配列番号： 1 1 ) の発現量を検討した。
該 PCR反応は、 上記ト一タル RNA 3〜4ngより得られた cDNAを铸型として使 用し、 実施例 3と同一条件で PCR反応を行い、 SEMA4B、 SEMA4B-MK SEMA4B-M2 および SEMA4B- M3遺伝子の発現コピ一数を算出した。 並行して TaqMan™ Human /3 -ac t in Cont rol Reagents (Appl i ed. Bi osys terns ¾) を用レて上 Βΰ卜——夕リレ RNA 1 ngに含まれる 0 -ァクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。 上記遺伝子全体の発現量を、 ]3 -ァクチン遺伝子発現量で標準化した相対的 発現率を表 4に示す。
上記遺伝子発現量の総量が β _ァクチン遺伝子発現量の 1 %を超える癌細胞 株が 17株見出され、 上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
〔表 4〕
% of % of % of 細胞株 i3~actin 細胞株 j3-actin 細胞株 j3-actin
SK-N-MC 0.02 COLO 201 0.66 NCI-H889 0.07
SK-N-AS 0.07 COLO 205 0.40 NCI-H1672 0.10
SK-N-BE 0.04 COLO 320DM 0.12 NCHH1836 0.08
SK-N-DZ 0.05 HCT-8 0.36 NCI-H2227 0.15
SK-N-FI 0.20 HT-29 0.52 NCI-N41 7 0.04
SK-N-SH 0.1 1 LoVo 0.58 SHP-77 0.16
D341 Med 0.05 LS123 0.04 A549 0.35
Daoy 0.08 SNU-C1 0.52 NCI-H23 0.98
DBTRG-05MG 0.01 SK-CO-1 0.45 NCI-H226 0.04
U-1 18 MG 0.01 SW 403 0.31 NCI-H358 1.09
U-87 MG 0.20 SW 48 0.06 NCI-H460 0.08
CCF-STTG1 0.23 SW 480 0.03 NCI-H522 0.05
SW 1088 0.06 SW 620 0.12 NCI-H661 0.05
HCC1937 0.17 SW 837 0.59 NCI-H810 0.03
ZR-75-1 0.30 SW 948 0.18 NC卜 H1 155 0.07
AU565 0.06 HEK293 0.05 NCHH1299 0.10
MCF-7 0.06 SAEC 1.73 NCI-H1395 0.39
MDA-MB-231 0.06 NG卜 H187 0.38 NCHH1417 0.21
Caco-2 0.04 NCI-H378 0.17 NCI-H1435 0.26
COCM1 0.10 NCI-H526 0.14 NCHH1581 0.16
NCI-H1651 1.03 ES-2 0.02 BxPC-3 0.17
NCI-H1 703 0.21 Caov-3 0.13 Capan-1 0.07
NCI-H1793 0.29 MDAH2774 0.37 Capan-2 0.27
NCHH1963 0.12 NIH:OVCAR3 0.14 HPrEC 2.87
NC卜 H2073 0.15 OV-90 0.23 DU 145 3.05
NGI-H2085 0.02 SK-OV-3 2.44 PC3 0.43
NCI-H2106 0.07 TOV-1 12D 0.06 ERI-Rb-1 0.90
NC卜 H2228 1.89 TOV-21 G 1.00 Y79 0.06
NC卜 H2342 0.18 PANG - 1 1.88 Cates-1 B 0.01
NC卜 H2347 0.24 MIA-PaCa - 2 0.02
VMRC - LCD 0.09 AsPC-1 0.24 実施例 6
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
実施例 4で得たプラスミド SEMA4B/PCR4- T0P0を铸型とし、 PCR SEMA4B遺 伝子を増幅した。 該反応における反応液の組成は SEMA4B/pCR4-T0P0 2ngを铸 型として使用し、 Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE社） を 2.5U、 2種類のプライマ一 （配列番号： 1 9および配列番号： 2 1) を各 1 M、 dNTPs を 200 Μ、 および lOx Pfu Bufferを 5 1加え、 50 1 の液量とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 1分、 60°C · 1分、 72°C · 4分のサイクル を 25回繰り返し行った。 次に PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて該 PCR 反応産物を精製した後、 制限酵素 Xbalおよび Eco RIにて処理した。 プラス ミド p3xFLAG-CMV_14 (Sigma社） も Xba Iおよび Eco RIにて処理した。 それ ぞれの DNA断片は PCR Purification Kitにて精製し、 DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Bio社） を用いてライゲ一シヨン反応を行った。 ライゲ一ショ ン反応液を大腸菌 Τ0Π0に導入した後、 形質転換された大腸菌をアンピシリン を含む LB寒天培地中で選択し個々のクローンを解析した結果、 SEMA4B遺伝子 (配列番号： 2) に相当する cDNA断片を含むプラスミド pCMV- 14- SEMA4Bを 得た。 実施例 Ί
組換え型タグ付き完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
SEMA4Bタンパク質の C朱端に 3xFLAGタグを融合したタンパク質を発現する 動物細胞用発現ベクターを構築した。 SEMA4B遺伝子を PCRで増幅する時に用 いるプライマ一ペアを、 別のプライマ一ペア （配列番号： 1 9および配列番 号： 2 0) に変更したこと以外は実施例 6記載の方法に従い、 形質転換した大 腸菌の選別を行った。 その結果、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) の C末 端に 3xFLAGタグが融合したタンパク質をコードする cDNA断片を含むプラスミ ド pCMV-14- SEMA4B- 3xFLAGを得た。 実施例 8 ペプチド抗体の作製と精製
SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) 、 SEMA4B-M1タンパク質 （配列番号： 4) 、 SEMA4B-M2タンパク質 （配列番号： 7) および SEMA4B-M3タンパク質 (配列番号： 1 0) のアミノ酸配列に基づき、 12〜15アミノ酸からなる以下 の 4種のペプチド （ペプチド 1〜4) を Fmoc固相合成法により合成した。
ぺプチド 1のアミノ酸配列 〔Asn - Ser- Ala-Arg - Glu - Arg- Lys- lie- Asn - Ser- Ser-Cys (配列番号： 2 2) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) の 402 番目から 412番目までのアミノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した配列である。 ぺプチド 2のアミノ酸配列 〔Ser- Va卜 Va卜 Ser- Pro-Ser-Phe- Va卜 Pro- Thr - Gly-Glu-Lys-Pro-Cys (配列番号： 2 3) 〕 のアミノ酸配列は、 SEMA4Bタンパ ク質 （配列番号： 1) の 582番目から 596番目までの配列である。
ぺプチド 3のアミノ酸配列 〔Pro- Leu- Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu- Ser-Asp-Ser-Pro-Cys (配列番号： 24) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番 号： 1) の 781番目から 794番目までのアミノ酸配列の C末端に、 Cysを付加 した配列である。
ぺプチド 4のアミノ酸配列 〔Ser-Arg_Va卜 Phe- Thr- Glu- Ser- Glu-Lys_Arg - Pro-Leu-Ser-Cys (配列番号： 2 5) 〕 は、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： .. 1) の 797番目から 809番目までのアミノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した 配列である。
上記べプチド 1、 ぺプチド 2、 ぺプチド 3およびべプチド 4のそれぞれのぺ プチドに、 キ一ホールリンペットへモシァニン （KLH) をキャリア一タンパク 質として結合させ抗原とし、 以下のように、 ゥサギポ.リクローナル抗体を作製 した。
免疫動物は雄性ゥサギ KBL:JW (11週齢、 オリエンタル酵母） 一羽を用い、 初回感作は完全フロインドアジュバンド （Difco社） 懸濁液、 2回目以降は不 完全フロインドアジュバンド （Difco社） 懸濁液を用いた。 感作は背部皮下注 射により行い、 1回の感作には各抗原 0.5mgを用い、 初回感作後 14日毎に 3 回繰り返した。 初回感作後 52日目に麻酔下類動脈採血を行い、 珠清約 50mlを 得た。 このようにして得られた血清を硫酸アンモニゥム塩析法により濃縮し、 得られた粗. IgG画分全量をプロティン Aァフィ二ティ一力ラム （Amersham - Bioscience社） により精製し、 ペプチド 1、 ペプチド 2、 ペプチド 3または ペプチド 4を免疫したゥサギから、 それぞれ約 103mg、 約 76mg、 約 112mgおよ び約 122mgの精製 IgGを得た。 さらに、 各々の免疫源ペプチドを固定化した力 ラムに結合する IgG画分を取得した。 固定化には各ペプチドの C末端の Cysを 利用し、 ホウ酸緩衝液を用いてセファロ一スカラム （Amersham-Bioscience 社） にカップリングした。 カラムからの溶出には 8M尿素 Zリン酸緩衝化生理 食塩水 （PBS) を用いた。 溶出液を PBSに対して透析して尿素を除いた後、 限 外濃縮、 フィルタ一ろ過滅菌することにより、 ペプチド 1、 ペプチド 2、 ぺプ チド 3およびペプチド 4に対するァフィ二ティ一精製抗体 AS- 2531、 AS- 2532、 AS - 2591および AS- 2592を、 約 15mg、 約 126mg、 約 17mgおよび約 35mgずつ取 得した。 実施例 9
ゥサギペプチド抗体を用いたウェスタンプロッティング
SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) の検出は、 実施例 8で作製した精製べ , プチド抗体を用いて行った。 ヒト非小細胞肺癌由来 NCI-H358細胞 1.5X106個 を 10%牛胎仔血清 （JRH社） を含む RPMI- 1640培地 （Invi trogen社） 10 mlに 懸濁し、 直径 10cmのペトリディッシュに播種した。 5%炭酸ガス気流下、 37°C でー晚培養した。 実施例 6で作製したプラスミド pCMV- 14- SEMA4B 6 g と Plus試薬 （Invi trogen社） および 0PTI- MEM I (Invi trogen社） とを混合し、 室温で 15分間放置した後、 Lipofect AMINE トランスフエクシヨン試薬
(Invitrogen社） および 0PTI-MEM Iを添加し、 さらに室温で 15分間放置し た。 この混合液を培養液に滴下して培養を継続した。 発現プラスミド導入 2日 , 後に細胞を氷冷した PBSで洗浄し、 氷冷した RIPA緩衝液 〔50mMトリス。塩酸 緩衝液、 PH 7.5、 150 mM塩化ナトリウム、 l%Triton X- 100、 0.1%SDS、 \% デォキシコール酸、 Co即 lete™タブレット (Roche Diagnostics社） 、
Phosphatase Inhibitor Cocktail-2 (Sigma社) 〕 lmlを添加し 4Cで 30分間 放置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15，000rpmで 20分間遠心分離した上澄 液を無細胞抽出液とした。 この無細胞抽出液および 2倍濃度 SDS-PAGE用サン プルバッファ一 〔125mM トリス '塩酸緩衝液、 ρΗ6· 8、 40%グリセロール、 4% SDS、 0. 04%ブロモフエノールブルーおよび 5 % 2 -メルカプトエタノール〕 を 等容量で混合し、 95°Cで 5分間加熱した後、 10 x 1を 10%ァクリルアミドゲル での SDS- PAGEに ί共した。 泳動分離したタンパク質は、 常法に従いクリアブ口 ット Ρ膜 （ATT0社） に転写した後、 ブロッキング溶液 〔50mMトリス。塩酸緩 衝液、 pH 7. 5、 500 mM塩化ナトリウム、 0. 1 % Tween 20、 5 %スキムミルク〕 中に 1時間室温放置した。 次に、 実施例 8で作製したペプチド抗体 AS-2531、 AS-2532, AS-2591または AS- 2592を、 3 g/mlの濃度となるようブロッキング 溶液で希釈し、 4°Cにてー晚反応させた。 続いて、 ブロッキング溶液で 5万倍 または 10万倍に希釈した HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 （Amersham- Biosc i ence 社） 中で 1時間室温放置した。 検出には ECL plus (Amersham- Biosc ience社） を用い、 添付プロトコールに従い SEMA4Bタンパク質を検出した。
AS- 2531を除き、 AS-2532, AS- 2591および AS - 2592のいずれを用いた場合で も、 分子量 100kD近傍の位置に SEMA4Bタンパク質に由来する特異的なバンド が認められた。 実施例 1 0
ゥサギぺプチド抗体を用いた免疫沈降
実施例 8で作製した精製ペプチド抗体を用いて、 SEMA4Bタンパク質の免疫 沈降を非変性状態にて行つた。
実施例 7で得たプラスミド pCMV- 14- SEMA4B- 3xFLAGを用いて、 実施例 9と同 様の操作で無細胞抽出液を調製した。 Protein G-Sepharose FF (Amersham - Biosc ience社） を等容量の RIPA緩衝液で懸濁した懸濁液 50 1に無細胞抽出 液 400 を加え、 さらに実施例 8記載のペプチド抗体 AS- 2531、 AS-2532、
AS-2591または AS-2592のいずれか一つを 加えた混合液を調製し、 4°Cに てー晚撹拌した。 Protein G-Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液にて洗 浄後、 50 1 の SDS-PAGE用サンプルバッファ一 〔62. 5mM トリス ·塩酸緩衝液、 pH6. 8、 20%グリセロール、 2 %SDS、 0. 02%ブロモフエノールブル一および 2.5% 2-メルカプトエタノール〕 に懸濁し、 95°Cで 5分間加熱した後、 5 1 または 10 Iを 10%ァクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 検出は実施 例 9記載の方法に準拠した。 但し、 マウス抗 FLAG M2抗体 （Sigma社） をプロ ッキング溶液で 0.2 g/mlまたは 0.1 g/mlとなるように希釈したものを一次 抗体として、 HRP標識抗マウス IgG抗体 （Amersham- Bioscience社） をブロッ キング溶液で 1.5万倍または 5万倍に希釈したものを二次抗体として用いた。 ペプチド抗体 AS- 2531、 AS- 2532、 AS-2591および AS- 2592のいずれを用いて 免疫沈降を行った場合にも、 分子量 lOOkD近傍に SEMA4Bタンパク質に由来す る特異的なバンドが認められた。
これより、 ペプチド抗体 AS-253 AS - 2532、 AS-2591および AS- 2592は、 未 変性の EMA4Bタンパク質と結合することが明らかとなつた。 実施例 1 1
癌細胞株における SEMA4Bタンパク質の発現検討
Ji巿癌細胞株 NCI-H2228、 NCI-H165K NCト薦、 NCI-H23ならびに NCI -
H1703；卵巣癌細胞株 SK0V-3ならびに TOV- 21G；前立腺癌細胞株 DU145；およ び JI萃癌細胞株 PANC- 1を、 直径 10cmのぺトリディッシュ 2枚で培養した。 各々 の細胞についてペトリディッシュ 1枚分をトリプシン · EDTA (Invitrogen 社） で分散し、 細胞数を計測した。 計測した細胞数を基にして、 5X106個の細 胞に対して 1 mlの割合で氷冷 RIPA緩衝液 （実施例 9に記載） を残りのぺトリ ディッシュ 1枚に添加し、 4°Cで 30分間放置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15， OOikpmで 20分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とした。 一方、 Size™ X ProteinG Immunoprecipitation Kit (Pierce社） の添付プロトコ一ルに従 い実施例 8記載のペプチド坊体 AS- 2531を ProteinG-Sepharose 4FF
(Amersham- Bioscience社） に架橋した樹脂を用意し、 等容量の RIM緩衝液 で懸濁した。 この懸濁液 30 lに前述の無細胞抽出液 400 lを加え、 4°Cにて ー晚撹拌を行った。 ProteinG- Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液にて洗 浄後、 実施例 1 0記載の SDS- PAGE用サンプルバッファー 30 1に懸濁し 95°C で 5分間加熱した後、 20 1を 10%ァクリルアミドゲルでの SDS-PAGEに供し た。 検出はペプチド抗体 AS- 2532を用いて実施例 9記載の方法に準じて行った。 上記 9種類の細胞株の中で、 NCI-H2228 NCI-H358, NCI- H23、 SK0V - 3、 DU145および PANC- 1の各細胞株において、 分子量 lOOkD近傍に、 SEMA4Bタン パク質に由来する特異的なバンドが認められた。 これより、 SEMA4Bタンパク 質が、 上記 6種類の癌細胞株で高発現していることが明らかとなった。 実施例 12
組換え型完全長夕ンパク質安定発現細胞株の樹立
ヒト非小細胞肺がん由来 NCI- 細胞 2. OX 105個を 10%牛胎仔血清 （JRH 社） 、 ImMピルビン酸ナトリゥムおよび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地
(Invitrogen社） 2 mlに懸濁し、 6ゥエルプレートに播種した後、 5%炭酸ガ ス気流下、 37°Cでー晚培養した。 一方、 OPT I- MEM I (Invi trogen社） で希釈 した実施例 6記載のプラスミド pCMV- 14- SEMA4B 1 gを Plus試薬
(Invitrogen社） 6 1と混合し室温で 15分間放置した後、 OPTI-MEM I で希 釈した LipofectAMINE トランスフエクシヨン試薬 （Invi trogen社） を添 加し、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液を培養液に滴下してさらに 1日培養を継続した後、 トリプシン 'EDTA (Invitrogen社） で細胞を分散し、 上記の培養培地に G418 (プロメガ社） を 400 g/mlとなるように加えた培地 で 10倍に希釈して 24ゥエルプレートに播種した。 3日または 4日ごとに G418 を含む上記培地 （G418選択培地） を交換しながら 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで 培養を継続した。 1個〜 3個の細胞が増殖しコロニ一を形成したゥエルから細 胞を回収し、 48ゥエルプレートの 2ゥエルに等しく播種した。 細胞密度が 50%以上になるまで培養を継続した後、 1ゥエル分の細胞に実施例 10記載の SDS- PAGE用サンプルバッファ一 50^1を加え、 細胞溶解液を調製した。 95°C で 5分間加熱処理した後、 5 x 1を 10%ァクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供 した。 実施例 9で記載した方法に準じ、 ペプチド抗体 AS- 2532を用いてウェス タンブロッテイングを行い、 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) を構成的に 発現する安定発現細胞を探索した。 もう一方のゥエルから回収した細胞を、 1 ゥエルあたり 0.7個となるように希釈後、 96ゥエルプレートに播種した。 G418選択培地を 3日あるいは 4日ごとに交換しながら細胞密度が 50%程度に なるまで、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで培養を継続した。 再び、 48ゥエルプレ ートの 1ゥエルに等しく播種し、 細胞密度が 50%以上になるまで培養を継続 し、 1ゥエル分の細胞から調製した細胞溶解液を用いて、 上記と同様にウェス 夕ンブロッティングを行った。 SEMA4Bタンパク質 （配列番号： 1) を最も高 発現するクローンを選び、 SEMA4B安定発現細胞株 SEMA4B/H358を得た。 実施例 13
SEMA4Bタンパク質の局在性検討 （ピオチン標識）
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228ならびに NCI_H358、 および実施例 12 で作製した組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株 （SEMA4B/H358) を用 いて、 細胞表層上に露出しているタンパク質を Cellular Labeling and
Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics社) を用いてビォチン標識し た。 続いて、 実施例 9の方法に従い調製した無細胞抽出液 lmlと実施例 8で作 製したペプチド坊体 AS- 2591 5 gとを用いて、 実施例 10の方法に従って免 疫沈降し SDS- PAGEを行った。 HRP標識したストレプトアビジン （Ame r s h am - Bioscience社） を用いて検出したところ、 分子量 lOOkD近傍に SEMA4Bタン パク質に由来するバンドが認められ、 .SEMA4Bタンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク 質、 SEMA4B-M2タンパク質および SEMA4B-M3タンパク質が細胞表面上に局在し ていることが明らかとなった。 実施例 14
SEMA4Bタンパク質の局在性検討 （FACS解析）
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228ならびに NCI-H358、 および実施例 12 に記載した SEMA4B/H358を、 直径 10cmのペトリディッシュにそれぞれ播種し、 サブコンフルェントになるまで培養した。 各細胞を PBSで洗浄後、 0 5%BSA および 5mM EDTAを含む PBSを加え室温で 15分間放置し、 細胞を分散した。 次 に、 緩衝液 A 〔2%牛胎仔血清 （JRH社） および 0.1%アジ化ナトリウムを含む HBSS (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen社） 〕 で 4X106個/ ml の濃度になるように細胞を懸濁し、 終濃度 10 g/mI となるよう AS-2532また は非免疫ゥサギ IgG (Jackson社） を加え、 氷中に 3時間放置した。 緩衝液 A で細胞を洗浄後、 10 g/mlの Alexa488標識抗ゥサギ IgG坊体 (Molecular Probes社） を含む緩衝液 Aで懸濁し、 氷上にて 2時間放置した。 緩衝液 Aで 再び洗浄後、 FACScan (BDバイオサイエンス社） にて解析した。 その結果、 い ずれの細胞においてもゥサギぺプチド抗体 AS-2532特異的に染色され、 SEMA4B 夕ンパク質、 SEMA4B- Ml夕ンパク質、 SEMA4B-M2タンパク質および SEMA4B- M3 タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。 実施例 1 5
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI - H358のアポトーシス誘導
実施例 2に記載の NCI-H1703以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアン チセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検 討した。
10%牛胎仔血清 （JRH社 Γ、 ImM ピルビン酸ナトリウムおよび 25mM HEPES を含む RPMI-1640培地 （Invitrogen社） で NCI- H358を懸濁し、 1ゥエル当た り 8X103個の細胞密度 （培地液量 80/^1) となるよう、 NCI-H358を 96穴平底 組織培養プレート （BDファルコン社） に播種し、 5%炭^ガス気流中、 37°Cで · 一晩培養した。 一方、 実施例 2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配列 番号： 1 3) およびコントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) 各 0.06 gを 0ΡΠ-ΜΕΜ I (Invi trogen社） で希釈し、 Plus試薬 (Invitrogen 社） 0.5 1と混合した後、 室温で 15分間放置した。 0PTI-MEM I で希釈した LipofectAMINEトランスフエクシヨン試薬 （Invi trogen社） 0.4^1を加え、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液全量を NCI- H358の培養液に添加し 3日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche
Diagnostics社） および Caspase- Glo 3/7 assay (Pr omega ¾) の添付プロト コールに従い、 上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。 その結果、 NCI- H358においては、 Cell Death Detection ELISA および Caspase-Glo 3/7 assayともに、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象 として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、 それぞれ 1.42倍およ び 1.77倍のアポトーシス誘導活性を示し、 統計学的に有意な差 （P≤0.01) を 示した （表 5および表 6) 。
〔表 5〕
アポ卜一シス誘導活性 （A4。5— A 492) 平均値 標準偏差 ブランク 0. 2 1 7 0. 007 コン卜ロールオリゴヌクレオチド 0. 330 0. 041
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 0. 467 0， 029 (配列番号： 1 3)
〔表 6〕
アポ卜一シス誘導活性 （CP S)
平均値 標準偏差 ブランク 7625 235 コント口ール才リゴヌクレオチド 8727 1 88
(配列番号： 1 4)
アンチセンスオリゴヌクレ才チド 1 5452 570
(配列番号： 1 3) 実施例 16
ァンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI - H2228, NCI-H1651および NCI-H23のアポ! シス誘導
NCI-H1703 (実施例 2) および NCト H358 (実施例 15 ) 以外のヒト非小細胞 肺癌細胞株においても、 アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポト一 シスが誘発されるか否かを検討した。
NCI-H2228には、 10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 ImM ピルビン酸ナトリウムお よび 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 (Invi trogen社) を用いた。 CI- H1651には、 10%FBSを含む ACL- 4培地 (ATCC) を用いた。 NCI- H23には、 10%牛胎仔血清 （JRH社） および 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 (Invitrogen社） を用いた。 各細胞をそれぞれの培地に懸濁し、 1ゥエル当 たり 7.5X103個 (NCI-H2228) 、 7.5X103個 (NCI-H1651) および 5X103個 (NCI- H23)の細胞密度 （培地液量 125 1) となるよう 96穴平底組織培養プレ —ト （BD ファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した。 一方、 実施例 2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 13) お よびコントロールォリゴヌクレオチド (配列番号： 14) 各 0.1352 gを OPT I -MEM I (Invi trogen社） で希釈し、 Plus試薬 （Invi trogen社） 0.75 il と混合した後、 室温で 15分間放置した。 0PTI- MEM I で希釈した
LipofectAMINEトランスフエクシヨン試薬 （Invi trogen社） 0.4 1を加え、 さらに室温で 15分間放置した。 この混合液全量を各細胞の培養液に添加し 3 日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISAPUiS(Roche Diagnostics 社)の添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポト一シス誘導活 性を測定した。
その結果、 いずれの細胞株においても、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは 陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、 それぞれ
1.58倍 （NCI-H2228) 、 1.21倍 （NCI-H1651) および 1.25倍 (NCI- H23)のアポ 1 シス誘導活性を示し、 危険率は P≤0.05 (NCI-H22 8) 、 P≤0.05 (NCI- H1651) および P≤0.01(NCI-H23).と算出され、 統計学的に有意な差を示した (表 7、 表 8および表 9)。
〔表 7〕
アポ! ^一シス誘導活性 （A4。5— A 492) 平均値 標準偏差
ブランク 0. 3 1 2 0. 009
コント口ール才リゴヌクレ才チド 0. 526 0. 043
(配列番号： 1 4) ,
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 0. 829 0. 1 23
(配列番号： 1 3) 〔表 8〕
アポ! ^一シス誘導活性 （A4Q5— A 492) 平均値 標準偏差 ブランク 0. 5 2 3 0. 0 9 1 コントロールオリゴヌクレ才チド 1 . 1 5 2 0. 1 0 1
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレオチド 1 . 3 9 0 0. 1 0 4
(配列番号： 1 3)
〔表 9〕
アポ卜一シス誘導活性 （A4Q5— A 492) 平均値 標準偏差 ブランク 0. 6 7 8 0. 0 2 8 コントロールオリゴヌクレオチド 1 . 0 8 1 0. 0 5 0
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 1 . 3 5 1 0. 0 5 8
(配列番号： 1 3) 実施例 1 7
ゥサギぺプチド抗体を用いたアポトーシス誘発
ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H2228を実施例 8で取得したゥサギペプチド抗 体 AS-2531および AS-2532で処理し、 これらゥサギペプチド抗体のアポトーシ ス誘導活性を測定した。
NCI-H2228を、 10%牛胎仔血清 （JRH社） 、 ImM ピルビン酸ナトリウムおよ び 25mM HEPESを含む RPMI- 1640培地 （Invi trogen社） に懸濁し、 1ゥエル当 たり 4X103個の細胞密度になるよう I型コラーゲンをコートした 96穴平底組 織培養プレート （BDファルコン社） に播種し、 5%炭酸ガス気流中、 37 で一 晚培養した。 実施例 8で取得したゥサギペプチド抗体 AS-2531、 AS- 2532、 お よび非免疫ゥサギ IgG Oackson社） を PBSで希釈し、 各抗体について終濃度 が 15 g/ml、 45 8/1111ぉょび150 8/1111となるよう培養液にそれぞれ添加し た。 さらに 5日間培養を継続した後、 Cell Death Detection ELISA S (Roche Diagnostics社） の添付プロトコールに従い、 上記ゥサギペプチド抗体のアポ ト一シス誘導活性を測定した。 その結果、 45 ^ g/mlおよび 15 ^ g/mlの AS- 2531存在下では、 同濃度の非免 疫ゥサギ IgGに比べ、 1. 26倍および 1. 31倍のアポトーシス誘導活性を示した (P≤0. 05および P≤0. 01) また、 150 g/mlの AS- 2532存在下では、 同濃 度の非免疫ゥサギ IgGに比べ、 1. 27倍のアポト一シス誘導活性を示した （P≤ 0. 01) 。
このように、 SEMA4Bタンパク質、 SEMA4B- Mlタンパク質、 SEMA4B- M2タンパ ク質および SEMA4B- M3タンパク質は、 ヒト肺癌細胞の生存維持に重要な働きを していることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明で用いられるタンパク質は、 癌細胞に特異的に発現し、 癌の診断マー 力一である。 したがって、 該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明のアンチセ ンスポリヌクレオチド、 本発明の抗体は、 例えば、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺 癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、'胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮 癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 -治 療剤、 アポトーシス促進 （誘導） 剤などとして安全に使用することができる。 また、 本発明で用いられるタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチ ド、 本発明の抗体などは、 癌 （例、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 卵巣癌、 精巣癌、 甲 状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療剤、 アポトーシス促進 (誘導） 剤などのスクリーニングに有用である。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質または その塩。
2 . 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸 配列からなるタンパク質またはその塩。
3 . 請求項 1記載のタンパク質の部分べプチドまたはその塩。
4. 請求項 1記載の夕ンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド。
5 . D NAである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配列 を含有する請求項 5記載のポリヌクレオチド。
7 . 配列番号： 5、 配列番号： 8または配列番号： 1 1で表される塩基配列 からなるポリヌクレオチド。
8 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべク夕一。
9 . 請求項 8記載の組換えべク夕一で形質転換された形質転換体。
1 0 . 請求項 9記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質また はその部分べプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする請求項 1記載の夕 ンパク質またはその部分べプチドまたはその塩の製造法。
1 1 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 含有してなる医薬。
1 2 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
' 1 3 . '請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断藥。
1 4. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体。
1 5 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる医薬。
1 6 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドに相補的または'実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
1 8 . 請求項 1 7記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 9 . 請求項 1 4記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のタン パク質の定量方法。
2 0 . 請求項 1 9記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の タンパク質またはその機能が関連する疾患の診断方法。
2 1 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 用いることを特徴とする、 請求項 1記載の夕ンパク質の発現を阻害する化合物 . またはその塩のスクリーニング方法。
2 2 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を 含有してなる、 請求項 1記載のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその 塩のスクリーニング用キット。
2 3 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 請求項 1記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリ一二 ング方法。
2 4 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 請求項 1記載の夕 ンパク質遺伝子の発現を ¾害する化合物またはその塩のスクリ一ニング用キッ 卜。
2 5 . 癌の^防 ·治療剤である請求項 1 1、 請求項 1 2、 請求項 1 5または 請求項 1 8記載の医薬。 '
2 6 . アポトーシス促進剤である請求項 1 1、 請求項 1 2、 請求項 1 5また は請求項 1 8記載の医薬。
2 7 . 癌の診断薬である請求項 1 3または請求項 1 6記載の診断薬。
2 8 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドの発現または該 タンパク質の遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなるアポトーシス促進剤 2 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体を含有してなるアポトーシス促進剤。
3 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
3 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリ ヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部を含有するポリヌクレオチド。
3 2 . 請求項 3 1記載のポリヌクレオチドを含有してなる医 。
3 3 . アポトーシス促進剤である請求項 3 2記載の医薬。
3 4. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを用いることを特徴とするアポ] ^一シス促進剤のスクリーニング 方法。
3 5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレォチドを含有することを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニン グ用キット。
3 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの発現または該タ ンパク質の遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなるアポト一シス促進剤。 3 7 . 哺乳動物に対し、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7ま たは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発 現を阻害する物質、 （i i) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の 発現を阻害する物質、 または （i i i) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする、 癌の予防 '治 療法。
3 8 . 哺乳動物に対し、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7ま たは配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する夕ンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の発 現を阻害する物質、 （i i) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の 発現を阻害する物質、 または （i i i) 該タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする、 癌細胞のアポ 卜一シス促進方法。
3 9 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する、 または ' 該タンパク質もしくはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害することを特徴 とする癌の予防 ·治療法。
4 0 . 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する、 または 該夕ンパク質もしくはその部分べプチドの遺伝子の発現を阻害することを特徴 とする癌細胞のアポトーシス促進方法。
4 1 . 癌の予防 ·治療剤を製造するための （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩の発現を阻害する物質、 （i i) 該タンパク質もしくはその部分ぺプ チドの遺伝子の発現を阻害する物質、 または （i i i) 該タンパク質もレくはその 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用。
4 2 . 癌細胞のアポト一シス促進剤を製造するための （i) 配列番号： 1、 配 列番号： 4、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する物質、 （i i) 該タンパク質もしくは その部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質、 または （i i i) 該タンパク質 .もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体の使用。
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