WO2004029259A1 - バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法 - Google Patents

バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004029259A1
WO2004029259A1 PCT/JP2003/012275 JP0312275W WO2004029259A1 WO 2004029259 A1 WO2004029259 A1 WO 2004029259A1 JP 0312275 W JP0312275 W JP 0312275W WO 2004029259 A1 WO2004029259 A1 WO 2004029259A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
gene
baculovirus
virus
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/012275
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshiharu Matsuura
Original Assignee
Osaka Industrial Promotion Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka Industrial Promotion Organization filed Critical Osaka Industrial Promotion Organization
Priority to EP03798509A priority Critical patent/EP1548119A4/en
Priority to JP2004539540A priority patent/JP4431039B2/ja
Priority to AU2003266628A priority patent/AU2003266628A1/en
Publication of WO2004029259A1 publication Critical patent/WO2004029259A1/ja
Priority to US11/086,372 priority patent/US7416890B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV

Definitions

  • the present invention relates to a baculovirus vector that can be suitably used for gene therapy and the like, a method for producing the baculovirus vector, and a method for introducing a gene using the baculovirus vector.
  • retroviruses adenoviruses, and adeno-associated viruses have been mainly used as gene therapy vectors.
  • safety issues such as the emergence of self-sustaining culturing viruses and the activation of cancer genes by random integration of genes, and the improvement of gene transfer efficiency and specific gene transfer methods was not sufficient.
  • problems such as induction of cytotoxicity and immune response, and inactivation by neutralizing antibodies.
  • baculovirus an insect virus, is considered to have no virulent infection in insects until recently, and has been used as a system that can express large amounts of transgenes exclusively using insect cells.
  • Baculovirus is an insect pathogenic virus that infects insects such as Lepidoptera, Hymenoptera, and Diptera, and has a circular double-stranded DNA as a gene.
  • a group of viruses called Nuclear Polyhedorosis Virus (NPV)
  • NDV Nuclear Polyhedorosis Virus
  • the polyhedron is essential for the virus to survive in nature, but is not necessary for the virus to grow itself, so even if a foreign gene to be expressed is substituted for the polyhedron gene, the virus will not Infects, multiplies, and produces large amounts of foreign gene products without any hindrance.
  • AcNPV Autographs caUfornica NPV
  • BmNPV Bombyx mori NPV
  • the present inventors have succeeded in developing the world's highest expression efficiency vector, pAcYMl, for paculovirus vectors (for example, see Non-Patent Document 1). He expressed hepatitis C virus structural protein in a system using this vector, and succeeded in developing an early antibody diagnostic system using that vector as an antigen. The introduction of this diagnostic system led to the development of post-transfusion hepatitis C in Japan. Was almost suppressed.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 gene transfer into mammalian cells using paculovirus has been reported (for example, see Non-Patent Documents 2 and 3). Initially, gene transfer using baculovirus was considered to be specific for hepatocytes, but the present inventors have shown that gene transfer is possible in a wide range of animal cells (e.g., Patent Document 4).
  • baculovirus vectors are able to efficiently express foreign genes without infecting and replicating a wide range of mammalian cells and to replicate them has been highlighted as a potential gene therapy vector. It became so.
  • Baculovirus vectors 1 have a viral gene of 130kbp and can insert a large (less than 15kbp) foreign gene. 2) no viral gene is expressed in mammalian cells, so there is little cytotoxicity and adverse immune response. 3) A recombinant virus can be produced in a short time, and 4) Humans do not have neutralizing antibodies against baculovirus. Having. In order to improve the infection efficiency, the envelope proteins of other viruses such as the vesicular stomatitis virus G protein have been used in the baculovirus itself to improve its efficiency. With gP 64 protein is Putanpaku protein have been reported attempts to present on the particle surface (e.g., see Non-patent document 5) (Fig. 3 left). This drastically improved the efficiency of gene transfer into mammalian cells.
  • Non-Patent Document 6 Fig. 3, right.
  • Non-Patent Document 3 (Non-Patent Document 3)
  • Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document 5)
  • Non-Patent Document 6 (Non-Patent Document 6)
  • An object of the present invention is to solve the conventional problems and achieve the following objects. That is, it is an object of the present invention to provide a novel baculovirus vector capable of presenting a desired protein on the surface of a virus particle without having to show infectivity to insect cells, a method for producing the same, and a method for gene transfer using the baculovirus vector. With the goal.
  • the present inventors have achieved the present invention based on the development of a method for deleting the gp64 gene of the paculovirus and, instead, efficiently incorporating the target protein into the surface of the virus particle.
  • a cotransfectant that cotransfects at least a plasmid containing a gene encoding a protein that can be expressed on the cell surface and any of wild-type, mutant and recombinant paculovirus DNA into insect cells Including a Yong process, and A method for producing a baculovirus vector comprising producing at least a part of a culovirus DNA and producing a pseudotype paculovirus covered with a protein that can be expressed on the cell surface.
  • Baculovirus DNA is a recombinant baculovirus DNA, in which homologous recombination between the polyhedron gene and the first foreign gene and homologous recombination between the gp64 protein and the second foreign gene have been performed.
  • the method for producing a baculovirus vector according to ⁇ 1>, which is a baculovirus DNA is a baculovirus DNA.
  • paculovirus DNA according to ⁇ 1>, wherein the baculovirus DNA is a recombinant baculovirus DNA, and the baculovirus DNA is a paculovirus DNA obtained by homologous recombination between a polyhedrin gene and a first foreign gene. This is a method for producing a paculovirus vector.
  • the vector containing the second foreign gene is simultaneously cotransfected, homologous recombination of the gp64 protein and the second foreign gene occurs, and the baculovirus DNA containing the foreign gene is removed.
  • the method for producing a baculovirus vector according to ⁇ 3>, wherein the pseudotype baculovirus comprising the protein capable of being expressed on the cell surface is produced.
  • ⁇ 5> The method for producing a paculovirus vector according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 4>, wherein the first foreign gene is at least one of a transgene and a marker gene.
  • ⁇ 6> The method for producing a baculovirus vector according to any one of ⁇ 2> and ⁇ 4>, wherein the second foreign gene is at least one of a transgene and a marker gene.
  • ⁇ 7> The method for producing a paculovirus vector according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the protein that can be expressed on the cell surface is a protein that is incapable of infecting insect cells.
  • ⁇ 8> The method for producing a paculovirus vector according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the protein that can be expressed on a cell surface is a protein that can infect insect cells.
  • ⁇ 9> Proteins that can be expressed on the cell surface after the co-transfection step A cell expressing a plasmid containing a gene encoding baculovirus is infected with the first pseudotyped baculovirus generated by the cotransfection step, the virus is amplified, and the second pseudotyped baculovirus is amplified.
  • the paculovirus DNA is a recombinant baculovirus DNA deficient in the gp64 gene, and the cotransfection step further comprises the step of cotransfecting a vector having an introduced gene. This is a method for producing a culovirus vector.
  • Insect cells that transiently express a protein that can be expressed on the cell surface on the cell surface are infected with a pac64 virus deficient in the gp64 gene, which has the gp64 protein covered on the particle surface, and is infected with the cell surface.
  • a method for producing a Bacchus virus vector comprising at least a step of causing a virus particle covered with a highly expressible protein to germinate from the cell surface.
  • ⁇ 12> A paculovirus vector produced by the method for producing a paculovirus vector according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>.
  • Baculovirus is a pseudotyped virus in which the DNA of the paculovirus lacks the gp64 gene and is covered with a protein that cannot infect insect cells.
  • Baculovirus virus is a pseudotyped virus that lacks the gp64 gene and has a protein that can infect insect cells, and that the protein is not a protein expressed from the baculovirus DNA. It is a characteristic paculovirus vector.
  • ⁇ 15> The baculovirus vector according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 14>, wherein the gene can be specifically introduced by selecting cells.
  • ⁇ 16> Using the baculovirus vector according to any one of ⁇ 12> and ⁇ 15> to introduce a gene into any cell in a living body (excluding human) and outside the living body A gene transfer method characterized by the following. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the infection of baculovirus polyhedra into insect cells.
  • Figure 2 shows the life cycle of baculovirus.
  • FIG. 3 is a diagram showing a conventional recombinant vector.
  • FIG. 4 is a diagram showing a conventional exchange vector.
  • FIG. 5 is a diagram showing the production of a new pseudotyped baculovirus.
  • FIG. 6 is a diagram showing the production of a novel pseudotyped paculovirus.
  • FIG. 7 is a diagram showing the production of a novel pseudotyped PacuMouth virus.
  • FIG. 8 is a diagram showing production of a gp64 gene knockout vector.
  • FIG. 9 is a diagram showing the production of PacuMouth virus AcA64 / GFP / LacZ in which the gp64 gene has been deleted.
  • FIG. 10 shows the construction of a plasmid capable of transiently expressing gp64 protein in insect cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing the production of a gp64 gene-deficient virus Ac ⁇ 64 / GFP / LacZ * 64 transiently covered with a gp64 protein.
  • FIG. 12 is a diagram showing amplification of AcA64 / GFP / LacZ * 64.
  • FIG. 13 is a diagram showing the production of Ac ⁇ 64 / GFP / LacZ * 64 having a luciferase gene transiently covering the gp64 protein.
  • FIG. 14 is a diagram showing the production of pseudotype virus covered with the vesicular stomatitis virus G protein.
  • FIG. 15 is a diagram showing the properties of pseudotyped viruses covered with the vesicular stomatitis virus G protein.
  • FIG. 16 is a diagram showing gene transfer by pseudotyped virus covered with the vesicular stomatitis virus G protein.
  • Figure 1 7 is the best mode for carrying out the c invention is a diagram illustrating a result of neutralization test of shea user de type Virus suffered vesicular mouth ⁇ quality Overview of construction of targeting vector
  • PI inositol cell surface
  • coat protein retains infectivity to insect cells, and the type of coat protein is limited. Only proteins with universal infectivity could be selected.
  • the method for producing a baculovirus vector of the present invention comprises the steps of: codifying an insect cell with at least a plasmid containing a gene encoding a protein that can be expressed on the cell surface and any one of wild-type, mutant and recombinant baculovirus DNA.
  • a pseudo-type baculovirus is produced, which comprises a transfection step of transfecting and which comprises at least a part of the DNA of the paculovirus and which is covered with a protein that can be expressed on the cell surface.
  • pseudotyped baculovirus refers to the Paculovirus.
  • a protein having a protein not derived from the viral DNA of the virus on the virus surface refers to a virus covered with a protein that is transiently expressed by a separately introduced plasmid.
  • the term “transiently expressed” refers to expression without being integrated into viral DNA.
  • the protein that can be expressed on the cell surface may be a protein that cannot infect insect cells or a protein that can infect insect cells.
  • the term “protein capable of infecting insect cells” refers to a protein that, when expressed on a paculovirus envelope, enables the virus to enter insect cells. When this vector is used as it is for transfection into humans, etc., it is not necessary to infect insect cells.However, when this vector is used as an intermediate for the production of the final vector, it is propagated by infecting insect cells. To be able to infect insect cells.
  • proteins that can infect insect cells include the gp64 protein, the viral envelope protein of Vircus, and the G protein of vesicular stomatitis virus.
  • the protein that cannot be infected to insect cells is not particularly limited as long as it is a protein that can be expressed on the cell surface, but ligands / receptors corresponding to receptors or antigens specific to cells or tissues to which genes are to be introduced in vivo.
  • a molecule capable of recognizing a cancer-specific antigen or a cell surface molecule different from a normal cell, a receptor molecule for an antigen specifically expressed in a virus-infected cell such as AIDS virus, and the like can be mentioned.
  • insect cells to be transfected are not particularly limited, but Sf9 cells can be suitably used.
  • the plasmid containing the gene encoding the protein that can be expressed on the cell surface is appropriately selected from known plasmids, and the gene encoding the desired protein is selected. It can be manufactured by purchasing. For example, pIB / g P 64 of the following examples, pA3Fb / gp64, and the like.
  • the promoter in the plasmid is preferably a promoter that is well expressed in insect cells other than the gp64 promoter, and an actin promoter is particularly preferable.
  • the baculovirus DNA may be any of wild-type, mutant and recombinant baculovirus virus DNA, but the baculovirus DNA is a recombinant baculovirus DNA, It is preferable that the DNA is a baculovirus virus that has undergone homologous recombination with a foreign gene and homologous recombination between the gp64 protein and a second foreign gene.
  • the baculovirus DNA is preferably a recombinant baculovirus DNA, and is preferably a baculovirus DNA in which homologous recombination between a polyhedrin gene and a first foreign gene has been performed.
  • Ekushiyon step simultaneously co-transfected Hue with a vector comprising a second foreign gene, it is preferable that the homologous recombination with the gp 6 4 protein and a second foreign gene takes place.
  • the homologous recombination foreign gene is preferably either a transgene which is a target gene to be introduced into a target cell, or a marker gene which is used as an indicator for isolation or introduction. More preferably, the foreign gene is a transgene. It is preferable that the homologous and transformed foreign gene has a promoter that is well expressed in insect cells such as a polyhedron promoter. However, when the final vector is adapted to a host, the promoter of the introduced gene should be a host. Use a promoter that is expressed in.
  • CAG promoter consisting of a chicken] 3-actin promoter and CMV enhancer
  • the CMV promoter, the RSV promoter and the like are preferred.
  • the foreign gene to be introduced is not particularly limited as long as it can be expressed by the promoter, but from the viewpoint of usefulness, defective genes involved in various genetic diseases, cytokins, neurotrophic factors, It is preferably a non-self antigen gene, a nucleotide sequence encoding a virus antigen, etc., a tumor suppressor gene, an antisense sequence such as Ras which is a cancer gene, or a suicide gene such as thymidine kinase.
  • the method for producing a pseudotyped baculovirus of the present invention further comprises the step of, after the cotransfection step, adding to the cell in which a plasmid containing a gene encoding a protein that can be expressed on a cell surface is expressed by the cotransfection step.
  • the method further comprises the step of infecting the produced insect with the infectious first pseudotyped paculovirus, amplifying the virus, and generating the second pseudotyped paculovirus. It is preferable in that it can be easily amplified.
  • a method for producing a paculovirus vector includes a plasmid containing a gene encoding a protein that can be expressed on the cell surface, a recombinant baculovirus DNA lacking the gp64 gene, and a transgene.
  • the gP 64 recombinant baculovirus DNA lacking a gene is preferably a recombinant Bakyurowi Luz DNA having two types of genes containing polyhedra promoter and marker downstream.
  • a method for producing a paculovirus vector provides a method for producing a pac64 virus, in which a gp64 protein is coated on a particle surface, in an insect cell that transiently expresses a protein that can be expressed on the cell surface on the cell surface.
  • the method is characterized by including at least a step of infecting the deficient paculovirus and germinating virus particles covered with a protein that can be expressed on the cell surface from the cell surface.
  • insect cells that transiently express a protein that can be expressed on the cell surface are referred to as insect cells expressing the protein on a plasmid, and a plasmid encoding the protein.
  • insect cells expressing the protein on a plasmid and a plasmid encoding the protein.
  • the method for producing a baculovirus vector comprises, before the step, a step of producing a paclovirus deficient in the gp64 gene in which the gp64 protein is coated on the surface of a particle; an insect cell in which the gp64 protein is transiently expressed.
  • the method may further comprise the step of transfecting viral DNA in which the gp64 gene has been deleted to germinate a baculovirus having the gp64 protein on the particle surface for only one generation.
  • the baculovirus vector of the present invention is the baculovirus vector of the present invention. It is manufactured by one manufacturing method.
  • a transfer vector incorporating the gene to be expressed, infectious virus DNA, and in the case of the present invention, a plasmid are simultaneously introduced into Sf9 cells (0.8 ⁇ 10 6 cells / 35 mm dish) at the same time. And dilute the culture supernatant on day 4 to form plaques on a 35 mm dish. Suspend it in 40 Om1 culture solution, vortex to elute the virus from agar, and centrifuge to collect the supernatant. This is inoculated transiently into Sf cells that have expressed the envelope protein, cultured again, and the supernatant is removed to obtain a white virus pellet. Plasmid is preferably introduced into Sf9 cells (1 ⁇ 10 6 cells / 35 mm) at about 6 ⁇ l of plasmid DNA 2 ⁇ transfection reagent (UniFector, Bridge, etc.).
  • paculovirus infects mammalian cells and introduces the gene into the nucleus, but does not propagate in the cell. Accordingly, high expression in order to obtain the not high purified infectivity of the virus (1 X 1 0 9 - 1 0 pfu / ml) was prepared, and it is necessary to introduce a gene of high-copy.
  • the Pakyurowirusu lacking the gp64 gene suffered the g P 6 4 protein on the particle surface was expressed transiently the plasmid with the desired protein This can be performed by infecting cells, and can be performed by, for example, the following known methods except that the plasmid is expressed.
  • a purified virus of 0.2 ⁇ 10 10 pfu / m 1 can be obtained from a culture supernatant of 250 to 500 ml.
  • the baculovirus vector according to another embodiment of the present invention has a baculovirus DNA lacking the gp64 gene, that the Shiyudotaipu virus suffered infected non protein insect cells characterized, for example, a gp 6 4 gene containing gp 6 4 promoter region, the region of the polyhedrin Yadenko each polyhedron promoter region
  • the origin of the protein that cannot infect the insect cells is not limited thereto.
  • Another baculovirus vector of the present invention is a pseudotyped virus in which the paculovirus DNA lacks the gp64 gene and has a protein capable of infecting insect cells, and the protein is the paculovirus.
  • the baculovirus vector is a vector that transiently covers the gp64 protein without a transgene, such as AcA64 / GFP / LacZ * 64 (FIGS. 11 and 12) described below. Or a transgene such as AcA64 / GFP / CAGluc * 64 (Fig. 13), which transiently covers the gp64 protein, or a transgene.
  • Te a protein that can be expressed on the cell surface other than g p64 protein, an infectious protein capable insect cells may be those which target one transiently.
  • the pseudotyped paculovirus vector coated with a protein capable of infecting insect cells can be used for propagation and stock of the baculovirus vector in insect cells.
  • the pseudotyped baculo-mouth virus vector which is coated with a protein that cannot infect insect cells, is used as a final vector for introducing a gene into any cell in vivo or in vitro, including humans. Can be used.
  • the paculovirus vector When the paculovirus vector is administered to a living body, it is administered orally or parenterally (for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or intradermal injection, rectal administration, transmucosal administration, Administration via the respiratory tract or into organs.
  • parenterally for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or intradermal injection, rectal administration, transmucosal administration, Administration via the respiratory tract or into organs.
  • the dose and the number of doses can be appropriately adjusted according to the weight of the subject to be administered and the transgene.
  • the gene transfer method of the present invention is characterized by introducing a gene into any of cells in a living body (excluding humans) and outside a living body using the baculovirus vector of the present invention.
  • Gene transfer into mammalian cells can be performed in the same manner as a normal viral vector.
  • a mammalian cell into which a gene is to be introduced is prepared on a plate or dish in a state of 60 to 80% confluent.
  • the method of infection is the same as for general virus immunization.
  • the culture supernatant is removed, and the recombinant virus is inoculated at an infectious titer (moi) of 10 to 100 per cell and adsorbed for 30 to 60 minutes.
  • moi infectious titer
  • the paculovirus may be inactivated by trapping in the serum, it is preferable to inactivate the fetal calf serum in the culture solution in advance.
  • the baculovirus vector of the present invention a method for producing the same, and a method for introducing a gene using the same will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • gp64 gene region Pakyu port virus (AcNPV) EcoRI- Smal fragment (nt 107, 325-1 12, 049 ) and incorporated into the same restriction enzyme site of pUC18, to produce a P UCgp641ocus.
  • the transfer vector pAcGFP—CAGluc (Tani et al.), which incorporates the luciferase gene downstream of the GFP gene and the CAG promoter developed by Takasaki et al. (Niwa et al., 1986) downstream of the polyhedron promoter.
  • the virus Ri we are deficient in g P 64 gene and its promoter region, in order to completely deficient in the envelope protein, do not show the infectious at all. Therefore, the gp64 protein is transiently overlaid on Ac ⁇ 64 / GFP / LacZ so that it can be infected only once.
  • gp64 protein of a plasmid capable of expression in insect cells transiently insect Sf - 9 for intracellularly to produce a plasmid capable of expressing the gp64 protein
  • Spel the gp64 gene from pUCg P 641ocus and Bglll in's a cut, built-in PUC18 cut the fragment with the same restriction enzyme, to prepare a pUCg P 64.
  • Furthermore fragment excised with Hindlll and EcoRI containing the gp64 gene from pUCg P 64, built in pIB / V5-His were cleaved with the same enzyme (Invitrogen n), to prepare the expression vector pIB / gp64.
  • P IB / V5- His Baculovirus Genes inserted downstream of the early gene promoter can be expressed efficiently in insect cells.
  • IE promoter early gene promoter
  • a similar expression vector using an actin promoter that is highly transcribed in insect cells was prepared.
  • gp64-Fw Bgl: MAGATCTACCatggtaagcgctattgttt (SEQ ID NO: 1)
  • gp64-Rv Sal
  • TTGTCGACttaatat tgtctattacggttt SEQ ID NO: 2 were used.
  • the amplified gp64 gene was cut with Bglll and Sail, and integrated into the BamHI and Sail sites of pA3Fb to produce pA3Fb / gp64.
  • the above-described infectious virus DNA of AcLacZ, pUCA64 / GFP, and pIB / gp64 or pA3Fb / gp64 are co-transfected into Sf-9 cells.
  • homologous recombination occurs between the viral DNA and pUCA64 / GFP in the nucleus of the insect cell, and the recombinant virus Ac ⁇ 64 / in which the gp64 gene region of the viral DNA has been replaced with the polyhedron motor and GFP gene.
  • GFP / LacZ occurs.
  • virus lacking the promoter region and gp64 genes since that is similar able to grow in normal insect cells co-transfected Hue transfected with the pIB / gp64 or PA3Fb / gp64 more transformer g p64 protein is provided to the cell surface, Despite deficiency in the gp64 gene, budding can occur while retaining infectivity by covering the gp64 protein.
  • the recombinant virus can be distinguished from the parent AcLacZ by using the expression of GFP as an index. That is, the recombinant virus expresses both LacZ and GFP.
  • the actual virus isolation was performed by homogenization and reintroduction of the culture supernatant 4 days after transfection and Sf-9 cells transfected with pIB / gp64 or pA3Fb / gp64 on the previous day using the usual plaque assay method.
  • the plaques positive for both GFP and LacZ were collected and purified by repeating the plaque assay four times, replacing the gp64 gene region with the polyhedron promoter and GFP gene, and transiently causing the gp64 protein To obtain Ac ⁇ 64 / GFP / LacZ * 64 which retained infectivity.
  • a firefly luciferase gene a red fluorescent protein (DsRed) gene
  • a GFP gene a GFP gene
  • the transferred transfer vector, pAcCAGluc, pAcCAGDsRed, and pAcCAGGFP were used. These vectors are designed to cause homologous recombination in the polyhedrin gene region. The production of pAcCAGluc has already been reported (Tani et al., 2001).
  • pDsRed2-Nl (Clontech) was digested with Kpnl, and the DsRed gene was recovered and incorporated into pAcCAGMCS2 (Shoji et al., 1997) digested with the same restriction enzymes to produce pAcCAGDsRed.
  • pIRES2-EGFP (Clontech) was digested with Ncol, the fragment containing GFP was blunted with klenow fragment, cut with Smal and Notl, and incorporated into pAcCAGMCS2 whose ends were smoothed with klenow fragment to produce pAcCAGGFP.
  • Fig. 13 shows the procedure for producing a recombinant virus using pAcCAGluc.
  • DNA was extracted from Ac ⁇ 64 / GFP / LacZ * 64, and cut at the unique Bsu36I site present in the LacZ gene to linearize the virus DNA.
  • This linear viral DNA, pAcCAGluc, and pIB / gp64 or pA3Fb / gp64 were co-transfected into Sf-9 cells, and GFP-positive and LacZ-negative plaques were collected in the same manner.
  • the black acetic acid was purified four times to prepare a recombinant baculovirus Ac ⁇ 64 / GFP / CAGluc * 64 having a luciferase gene.
  • Fig. 14 Preparation of pseudotyped virus covered with vesicular stomatitis virus G protein
  • the G protein gene of vesicular stomatitis virus was examined.
  • pIB / V5- was a His and pA3Fb the G protein gene of vesicular stomatitis virus to produce a ⁇ off to pIB / VSVG ⁇ Pi P A3Fb / VSVG.
  • the pseudotyped virus Ac ⁇ 64 / GFP / CAGluc * VSVG transiently covered with the vesicular stomatitis virus G protein is the pseudotyped virus Ac ⁇ 64 / GFP transiently covered with the gp64.
  • / CAGluc * 64 it was found that various mammalian cells were efficiently infected.
  • FIG. 16 shows that the infection titers (moi) per cell (moi) of Ac T64 / GFP / CAGluc * 64 and Ac 6464 / GFP / CAGluc * VSVG were inoculated to 293Tcell (manufactured by ATCC), respectively. Represents the result of inoculation.
  • the culture supernatant was removed, the virus was inoculated, and the cells were adsorbed for 60 minutes.
  • the cells are collected 24 to 48 hours after infection, and the value of luciferase gene expression is measured using a Bright-Glo lucit'erase Assay system (Promega).
  • the virus vector and the antibody were mixed at the dilution concentration shown on the horizontal axis of the figure, pre-incubated for 1 hour at room temperature, and then infected with 293Tcel 1 cells as described above to measure expression. did.
  • the concentration of the antibody in the virus vector is 1: 1.
  • the vesicular stomatitis virus can be used without using the infectivity of the G protein to insect cells at all. It has been found that the baculovirus virus vector that has been covered can be obtained by multiplication. Therefore, it was demonstrated that the protein of the desired envelope can be freely applied regardless of whether the insect cell is infected. Also, according to this method, after infecting the cell into which the gene is to be introduced, the envelope protein is not expressed again, and a highly safe PacuMouth virus vector can be prepared.
  • a paculovirus expressing two proteins on the particle surface construction of a paculovirus with two envelope proteins that define the host specificity of measles virus
  • Measles is a highly contagious acute viral infection that kills 100,000 people each year, especially in developing countries.
  • Measles virus has two envelope proteins, H and F, on the particle surface, and the H protein regulates the tissue specificity of the infection. That is, the measles virus strain (Edmonston strain) passaged in the laboratory can use CD46 or SLAM (Signaling lymphocyte activating molecule; CDwl50) as a receptor, whereas fresh isolates from the field only use SLAM as the receptor. It is clear that. Therefore, recombinant baculoviruses expressing H and F proteins from the Edmonston strain or fresh isolates on the particle surface were prepared, and the ability to reproduce the measles virus infection specificity with the paculovirus was examined. did.
  • a plasmid incorporating the measles virus H and F genes derived from the Edmonston strain or a fresh isolate was cotransformed with AcA64 / GFP / CAGluc to obtain AcA64 / GFP. / CAGluc * MV-H / F was prepared.
  • the specificity of the infection of these Paculoviruses was tested in a hamster-derived cell line (CH0 cells) expressing CD46 in SLAM. As a result, it was confirmed that the baculovirus virus vector covering the H and F proteins derived from the Edmonston strain infected SLAM-expressing CH0 cells and CD46-expressing CH0 cells.
  • baculoviruses covered with H and F proteins derived from fresh isolates were able to transfer genes only to C0 cells expressing SLAM.
  • Ac ⁇ 64 / GFP / CAGluc * VSVG a positive control virus, infected all CH0 cell lines
  • Ac ⁇ 64 / GFP / CAGluc which lacked the gp64 protein of the negative control virus, showed no infectivity.
  • This result indicates that two viral proteins can be displayed on the baculovirus particle surface while retaining biological activity. By presenting the two proteins on the particle surface, more accurate targeting will be possible.
  • the viral envelope protein not only the viral envelope protein but also a single receptor antibody of the virus or a single-chain antibody against a cancer antigen can be displayed on the particle surface, and cells or cancer cells that are infected with the virus and express the envelope protein can be obtained. Only by introducing a suicide gene such as thymidine kinase and using it together with a prodrug, it becomes possible to eliminate only the target cells from the living body. In particular, AIDS virus chronically infects and highly expresses envelope proteins on the surface of infected cells.
  • a novel paculovirus vector that can solve the above-mentioned various problems in the related art and can display a desired protein on the surface of a virus particle without having to show infectivity to insect cells, It is possible to provide a production method and a gene transfer method using the baculovirus vector.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、昆虫細胞に感染性を示す必要のない、所望のタンパク質をウイルス粒子表面に提示し得る新規なバキュロウイルスベクター、その製造方法及び該バキュロウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法を提供する。　少なくとも、細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドと、野生型、変異型及び組換えバキュロウイルスDNAのいずれかとを昆虫細胞にコトランスフェクトするコトランスフェクション工程を含み、かつ、該バキュロウイルスDNAの少なくとも一部を含み、該細胞表面に発現可能なタンパク質を被ったシュードタイプバキュロウイルスが生成されることを特徴とするバキュロウイルスベクター製造方法である。

Description

明 細 書 バキュロウィルスベクター、 バキュロウィルスべクタ一製造方法及び遺伝子導入 方法 技術分野
本発明は、 遺伝子治療等に好適に利用できるバキュロウィルスベクター、 該バキ ュロウィルスべクタ一の製造方法及び該バキュロウィルスベクターを用いた遺伝子 導入方法に関する。 背景技術
遺伝子治療の臨床研究がスタートして 10年が経過し、 必ずしも満足できる成績で はないものの、 本治療法が今世紀の先端医療の要となることは疑いの余地はない。 遺伝子治療の成否を握るのは、 安全に効率よく標的細胞へ遺伝子を導入できる、 大 きな組み込み容量を持つた遺伝子導入べクターの開発である。
これまでの遺伝子治療用ベクターとしては、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 そしてアデノ随伴ウィルスなどが主に利用されてきた。 しかしながら、 自立增殖ゥ ィルスの出現や、 ランダムな遺伝子の組み込みによる癌遺伝子の活性化等、 安全性 に問題があり、 遺伝子導入効率や特異的な遺伝子導入法の改善についても十分では なかった。 また、 細胞毒性や免疫反応の誘導、 中和抗体による不活化等の問題もあ つた。
これに対し、 昆虫ウィルスであるバキュロウィルスは近年まで昆虫にし力感染し ないと考えられており、 専ら昆虫細胞を用いて導入遺伝子を大量に発現できる系と して利用されてきた。
バキュロウィルスは鱗翅目、 膜翅目及ぴ双翅目などの昆虫に感染をおこす昆虫病 原ウィルスで、 環状の二本鎖 DNAを遺伝子として持つ。 その中で、 核多角体病ウィル ス （Nuclear Polyhedorosis Virus, NPV) といわれる一群のウィルスは、 感染後期 には感染細胞の核内に多角体と呼ばれる封入体を全細胞蛋白の 40〜50%に達するほ ど大量に作り、 その中に多数のウィルス粒子を埋め込んでいる （図 1 ) 。 このため 感染により宿主が死滅しても、 この中でウィルスは紫外線や熱などの外界からの不 活化作用から保護され、 長期間感染性を保持することが可能になる（図 2 )。
このように多角体はウィルスが自然界で生存するためには必須であるが、 ウィル スの增殖そのものには必要ないため、 多角体遺伝子の代わりに発現したい外来遺伝 子を揷入してもウィルスは全く支障なく感染、 増殖し、 外来遺伝子産物を大量に産 生する。 現在まで、 キンゥヮパ亜科の Autographs caUfornica NPV (AcNPV) とカイ コの Bombyx mori NPV (BmNPV)の二つのウィルスがベクターとして利用されているが 、 AcNPVを用いた発現例が圧倒的に多い。
本発明者等は、 パキュロウィルスベクターにおいて、 世界で最も発現効率の高い ベクター pAcYMlの開発に成功している （例えば、 非特許文献 1参照） 。 そして、 C 型肝炎ウィルスの構造タンパクを該ベクターを用いた系で発現し、 それを抗原とし た早期抗体診断系の開発に成功し、 この診断系の導入によって我が国における輸血 後 C型肝炎の発生はほぼ制圧された。
近年、 パキュロウィルスを用いた、 哺乳動物細胞への遺伝子導入が報告された （ 例えば、 非特許文献 2及び 3参照） 。 当初、 バキュロウィルスを用いた遺伝子導入 は、 肝細胞に特異的であるとされたが、 本発明者等は広範な動物細胞にも遺伝子導 入が可能であることを明らかにした (例えば、 非特許文献 4参照)。
このように、 バキュロウィルスベクターは、 広範な哺乳動物細胞へ感染し、 複製 することなく、 外来遺伝子を効率よく発現できることが明らかにされたことにより 、 遺伝子治療べクターとしての可能性が注目されるようになった。
バキュロウィルスベクターは 1)ウィルス遺伝子は 130kbpもあり、 大きな （く 15kbp ) 外来遺伝子を挿入できる、 2)ウィルスの遺伝子は全く哺乳動物細胞では発現しな いため、 細胞傷害性がほとんどなく有害な免疫応答の誘導もない、 3)組換えウィル スを短時間で作製できる、 4)ヒトにはバキュロウィルスに対する中和抗体が存在し ない等の点で、 ヒトへの遺伝子導入ベクターとして、 極めて優れた性質を有する。 これまでに感染効率を向上させる目的で、 水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質 等の他のウィルスのエンベロープタンパク質をバキュロウィルス自身のェンベロー プタンパク質である gP64タンパク質とともに粒子表面に提示させる試みが報告され ている （例えば、 非特許文献 5参照） （図 3左)。 これにより哺乳動物細胞への遺伝 子導入効率は飛躍的に向上した。
また、 パキュロウィルスの gp64タンパク質を他のウィルスのエンベロープタンパ ク質と完全に置換することも試みられ、 パキュロウィルスに近縁なウィルスのェン ベロープタンパク質や水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質に置き換えても組換え ウィルスは昆虫細胞で複製できることが報告されている （例えば、 非特許文献 6参 照） （図 3右)。
しかし、 このような従来の方法においては、 感染時に必要な力価のウィルスを得 るためには、 増殖のために昆虫細胞への感染性が必要であり、 前記ウィルス DNAの組 換えによる方法では、 エンベロープタンパクとして特異的な感染性を有するタンパ ク質のみを選択することができなかった。
したがって、 これらのベクターの感染には、 特異性を持たせることができず、 特 異性を付与しうるようなパキュ口ウィルスベクターは報告されていない。 前記バキ ュロウィルスベクターの優れた特性を有し、 かつ、 所望の感染性を付与しうるパキ ュロウィルスベクターの開発が強く求められていた。
(非特許文献 1 )
Matsuura, Y.， Possee, R. D.， Overton, H. A. , ana Bishop, D. H. L. (1987) . Baculovirus expression vectors : the requirements for high level ex pression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233—1250
(非特許文献 2 )
Hofmann, C.， Sandig, V.， Jennings, G.， Rudolph, M.， Schlag, P.， a nd Strauss, M. (1995) . Efficient gene transfer into human hepatocytes by ba culovirus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 92 , 10099—10103.
(非特許文献 3 )
Boyce, F. M.， and Bucher, N. L. R, (1996) . Baculovirus - mediated g ene transfer into mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 2348 - 2352 (非特許文献 4 )
Shoji I.， Aizaki H. , Tani H. , Ishii K.， Chiba T.， Saito I.， Miyam ura T. , and Matsuura Y. (1997) . Efficient gene transfer into various mamma lian cells including non-hepatic cells by baculovirus vectors. J. Gen. Viro 1. 78， 2657-2664.
(非特許文献 5 )
Tani, H. , Nishi jima, M. , Ushijima, H. , Miyamura, T. , and Matsuura ， Y. (2001) . Characterization of cell-surface determinants important for ba culovirus infection. Virology 279, 343-353.
(非特許文献 6 )
Mangor J. T. , Monsam S. A. , Johnson C. M. , and Blissard G. W. (2001) . A gp64— null baculovirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus G prot ein. J. Virol. 75， 2544—2556. 発明の開示
本発明は、 従来における前記諸問題を解決し、 以下の目的を達成することを課題 とする。 即ち、 昆虫細胞に感染性を示す必要のない、 所望のタンパク質をウィルス 粒子表面に提示し得る新規なバキュロウィルスベクター、 その製造方法及び該バキ ュロウィルスベクターを用いた遺伝子導入方法を提供することを目的とする。
発明者らは、 パキュロウィルスの gp64遺伝子を欠損させ、 その代わりに目的のタ ンパク質をウィルス粒子表面に効率よく取り込ませる方法を開発したことに基づき 、 本発明に至った。
すなわち、 本努明の前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
< 1 > 少なくとも、 細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を含 むプラスミドと、 野生型、 変異型及ぴ組換えパキュロウィルス DNAのいずれかとを昆 虫細胞にコトランスフエクトするコトランスフエクシヨン工程を含み、 かつ、 該バ キュロウィルス DNAの少なくとも一部を含み、 該細胞表面に発現可能なタンパク質を 被ったシユードタイプパキュロウィルスが生成されることを特徴とするバキュロウ ィルスべクタ一製造方法である。
< 2 > バキュロウィルス DNAが、 組換えバキュロウィルス DNAであり、 多角体遺 伝子と第一の外来遺伝子との相同組換えと、 gp64タンパク質と第二の外来遺伝子と の相同組換えがなされたバキュロウィルス DNAである前記 < 1〉に記載のバキュロウ ィルスベクター製造方法である。
< 3 > パキュロウィルス DNAが、 組換えバキュロウィルス DNAであり、 多角体遣 伝子と第一の外来遺伝子との相同糸且換えがなされたパキュロウィルス DNAである前記 < 1 >に記載のパキュロウィルスベクター製造方法である。
< 4 > コトランスフエクシヨン工程において、 第二の外来遺伝子を含むベクタ 一を同時にコトランスフエクトし、 gp64タンパク質と第二の外来遺伝子との相同組 換えが起こり、 外来遺伝子を含むバキュロウィルス DNAを含み、 かつ、 該細胞表面に 発現可能なタンパク質を被ったシユードタイプバキュロウィルスが生成される前記 < 3 >に記載のバキュロウィルスベクター製造方法である。
< 5 > 第一の外来遺伝子が導入遺伝子及ぴマーカー遺伝子の少なくともいずれ かである前記 < 2 >から < 4 >のいずれかに記載のパキュロウィルスベクター製造 方法である。
< 6 > 第二の外来遺伝子が導入遺伝子及ぴマーカー遺伝子の少なくともいずれ かである前記く 2 >及ぴ< 4 >のいずれかに記載のバキュロウィルスべクター製造 方法である。
< 7 > 細胞表面に発現可能なタンパク質が、 昆虫細胞に感染不可能なタンパク 質である前記 < 1 >から < 6 >のいずれかに記載のパキュロウィルスベクター製造 方法である。
< 8 > 細胞表面に発現可能なタンパク質が、 昆虫細胞に感染可能なタンパク質 である前記 < 1 >から < 6 >のいずれかに記載のパキュロウィルスベクター製造方 法である。
< 9 > コトランスフエクション工程の後に、 細胞表面に発現可能なタンパク質 をコードする遺伝子を含むプラスミドが発現する細胞に、 前記コトランスフヱクシ ョン工程により生成された第一のシユードタイプバキュロウィルスを感染させ、 ゥ ィルスを増幅させ、 第二のシユードタイプパキュロウィルスを生成する増幅工程を さらに含む前記 < 8 >に記載のパキュロウィルス製造方法である。
< 1 0 > パキュロウィルス DNAが gp64遺伝子を欠損した組換えバキュロウィルス DNAであり、 前記コトランスフエクシヨン工程において、 更に、 導入遺伝子を有する ベクターをコトランスフエクトする前記く 1 >に記載のパキュロウィルスベクター 製造方法である。
< 1 1 > 細胞表面に発現可能なタンパク質を細胞表面に一過性に発現させる昆 虫細胞に、 gp64タンパク質を粒子表面に被った gp64遺伝子を欠損するパキュ口ウイ ルスを感染させ、 該細胞表面に発現可能なタンパク質を被ったウィルス粒子を細胞 表面から出芽させる工程を少なくとも含むことを特徴とするバキュ口ウィルスべク ター製造方法である。
< 1 2 > 前記 < 1 >からく 1 1 >のいずれかに記載のパキュロウィルスべクタ 一製造方法により製造されたことを特徴とするパキュロウィルスベクターである。
< 1 3 > パキュロウィルス DNAが gp64遺伝子を欠損し、 昆虫細胞に感染不可能な タンパク質を被ったシユードタイプウィルスであることを特徴とするバキュロウィ ノレスべクタ一である。
く 1 4 > バキュ口ウィルス DNAが gp64遺伝子を欠損し、 昆虫細胞に感染可能なタ ンパク質を被ったシユードタイプウィルスであり、 該タンパク質が該バキュロウィ ルス DNAから発現されたタンパク質ではないことを特徴とするパキュロウィルスべク ターである。
< 1 5 > 細胞を選択して特異的に遺伝子導入が可能である前記く 1 2 >からく 1 4 >のいずれかに記載のバキュロウィルスベクターである。
< 1 6 > 前記く 1 2 >からく 1 5 >のいずれかに記載のバキュロウィルスべク ターを用いて、 生体内 （ヒ トを除く） 及び生体外のいずれかの細胞に遺伝子を導入 することを特徴とする遺伝子導入方法である。 図面の簡単な説明
図 1は、 バキュロウィルスの多角体の昆虫細胞への感染を説明する図である。 図 2は、 バキュロウィルスの生活環を表す図である。
図 3は、 従来の組換えベクターを表す図である。
図 4は、 従来の,袓換えベクターを表す図である。
図 5は、 新規シユードタイプバキュロウィルスの作製を表す図である。
図 6は、 新規シユードタイプパキュロウィルスの作製を表す図である。
図 7は、 新規シユードタイプパキュ口ウィルスの作製を表す図である。
図 8は、 gp64遺伝子ノックァゥトベクターの作製を表す図である。
図 9は、 gp64遺伝子を欠損させたパキュ口ウィルス Ac A 64/GFP/LacZの作製を表す 図である。
図 1 0は、 gp64タンパク質を一過性に昆虫細胞で発現できるプラスミドの作製を 表す図である。
図 1 1は、 gp64タンパク質を一過性に被つた gp64遺伝子欠損ウィルス Ac Δ 64/GFP/ LacZ*64の作製を表す図である。
図 1 2は、 Ac A 64/GFP/LacZ*64の増幅を表す図である。
図 1 3は、 gp64タンパク質を一過性に被ったルシフヱラーゼ遺伝子を持った Ac Δ 6 4/GFP/LacZ*64の作製を表す図である。
図 1 4は、 水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を被ったシユードタイプウィル スの作製を表す図である。
図 1 5は、 水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を被ったシユードタイプウィル スの性状を表す図である。
図 1 6は、 水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を被ったシユードタイプウィル スによる遺伝子導入を表す図である。
図 1 7は、 水疱性口内^ 質を被ったシユードタイプウィル スの中和試験の結果を表す図である c 発明を実施するための最良の形態 ターゲッティングベクターの構築の概要
本発明者等はこれまでにパキュロウィルス粒子の gp64タンパク質が細胞表面のフ ォスファチジ一ルイノシトール （PI) を認識することが、 バキュロウィルスの哺乳 動物細胞への侵入に重要であることを明らかにした（Tani et al. , 2001)。 PIは各種 細胞に広く分布することから、 gp64タンパク質を保持する限りバキュロウィルスべ クタ一に細胞特異性を付与することは不可能である （図 4 ) 。
また、 前述のように、 外被タンパク質をウィルス DNAに組換える方法によれば、 外 被タンパク質が昆虫細胞に感染性を保持することが必須であり、 外被タンパク質の 種類が限られ、 細胞に普遍的な感染性があるようなタンパク質しか選択することが できなかった。
ターグッティングべクターの開発を目指すならば、 gp64タンパク質を完全に欠損 させ、 目的のリガンド分子のみを持った組換えウィルスを作製しなくてはならない 。 そこで、 まず gp64タンパク質を一過性に発現させた昆虫細胞に gp64遺伝子を欠損 させたウィルス DNAをトランスフエクトさせることにより、 一時的に gp64タンパク質 を粒子表面に被ったウィルスを回収できる系を構築する （図 5 ) 。
これらの糸且換えウィルスは一回だけ gp64タンパク質を介して昆虫細胞に感染でき るため、 あらかじめ目的のリガンド分子を細胞表面に発現している昆虫細胞にこの ウィルスを感染させると、 目的のリガンド分子を被ったウィルス粒子が細胞表面か ら出芽してくることになる（図 6及び 7 )。 なお、 プラスミドを用いた外被タンパク 質の発現により一過性にタンパク質を被らせることは、 遺伝子導入効率の点から困 難であると考えられていた。
本発明のバキュロウィルスベクター製造方法は、 少なくとも、 細胞表面に発現可 能なタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドと、 野生型、 変異型及ぴ組換 えバキュロウィルス DNAのいずれかとを昆虫細胞にコトランスフヱクトするコトラン スフヱクシヨン工程を含み、 かつ、 該パキュロウィルス DNAの少なくとも一部を含み 、 該細胞表面に発現可能なタンパク質を被ったシユードタイプバキュロウィルスが 生成されることを特徴とする。
なお、 本発明において、 シユードタイプバキュロウィルスとは、 該パキュロウィ ルスのウィルス DNAに由来しないタンパク質をウィルス表面に有するものをいう。 具 体的には、 別個に導入されたプラスミドにより一過性に発現されたタンパク質を被 つたウィルスをいい、 バキュロウィルスの外被タンパク質である gp64を被ったバキ ュロウィルスであっても、 該パキュロウィルスのウィルス DNAの gp64領域が欠損して いる等の理由で、 該 gP64タンパク質がウィルス DNAに由来せず、 プラスミドに由来す るタンパク質である場合にはシユードタイプバキュロウィルスに含まれる。 ここで 、 一過性に発現とは、 ウィルス DNAに組込まれないで発現されることをいう。
細胞表面に発現可能なタンパク質としては、 昆虫細胞に感染不可能なタンパク質 であっても良いし、 昆虫細胞に感染可能なタンパク質であっても良い。 ここでいう 昆虫細胞に感染可能なタンパク質とは、 パキュロウィルスエンベロープ上に発現さ せた場合に、 昆虫細胞にウィルスの侵入を可能ならしめるタンパク質をいう。 この ベクターをそのままヒト等へのトランスフエクシヨンに用いる場合には、 昆虫細胞 への感染性は必要ないが、 このベクターを最終ベクター製造の中間体として用いる 場合には、 昆虫細胞に感染させて増殖させるため、 昆虫細胞に感染可能であること が必要である。
昆虫細胞に感染可能なタンパク質としては、 例えば、 gp64タンパク質、 バキュ口 ゥィルスに近縁なゥィルスのェンべロープタンパク質及び水疱性口内炎ゥィルスの Gタンパク質等が挙げられる。
昆虫細胞に感染不可能なタンパク質としては、 細胞表面に発現可能なタンパク質 であれば特に制限はないが、 生体内の遺伝子導入したい細胞又は組織に特異的なレ セプターや抗原に対応するリガンドゃレセプターであることが好ましく、 例えば、 癌特異抗原や正常細胞とは異なる細胞表面分子を認識できる分子や、 エイズウィル ス等のウィルス感染細胞に特異的に発現した抗原に対するレセプター分子等が挙げ られる。
ここで、 トランスフヱクトする昆虫細胞は、 特に制限はないが、 Sf9細胞が好適に 用いることができる。
細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドとしては 、 公知のプラスミドの中から適宜選択し、 所望のタンパク質をコードする遺伝子を 揷入することによって、 作製することが出来る。 例えば、 下記の実施例の pIB/gP64 、 pA3Fb/gp64等が挙げられる。
また、 プラスミド中のプロモーターは、 gp64プロモーター以外で、 昆虫細胞中で よく発現するプロモーターが好ましく、 ァクチンプロモーターが特に好ましい。 パキュ口ウィルス DNAは、 野生型、 変異型及ぴ組換えバキュ口ウィルス DNAのいず れであってもよいが、 バキュロウィルス DNAが、 組換えバキュロウィルス DNAであり 、 多角体遺伝子と第一の外来遺伝子との相同組換えと、 gp64タンパク質と第二の外 来遺伝子との相同組換えがなされたバキュ口ウィルス DNAであることが好ましい。 また、 バキュロウィルス DNAが、 組換えバキュロウィルス DNAであり、 多角体遣伝 子と第一の外来遺伝子との相同組換えがなされたバキュロウィルス DNAであることが 好ましく、 この場合には、 コトランスフエクシヨン工程において、 第二の外来遺伝 子を含むベクターを同時にコトランスフエクトし、 gp64タンパク質と第二の外来遺 伝子との相同組換えが起こるものであることが好ましい。
相同組換えされた外来遺伝子は、 ターゲットとなる細胞に導入される目的の遺伝 子である導入遺伝子、 単離や導入の指標等に用いられるマーカー遺伝子のいずれか であることが好ましく、 第一の外来遺伝子が導入遺伝子であることがさらに好まし レ、。 また、 相同糸且換えされた外来遺伝子は、 多角体プロモーター等昆虫細胞内でよ く発現するプロモーターを有することが好ましいが、 宿主に適応する最終ベクター にする場合には、 導入遺伝子のプロモーターは宿主で発現するプロモーターを用い る。
ヒ トで発現するプロモータートしては、 特に制限はないが、 ニヮトリの ]3 -ァクチ ンプロモーターと CMVのェンハンサ一からなる C A Gプロモーター、
CMVプロモーター、 R S Vプロモーター等が好ましい。
また、 導入する外来遺伝子としては、 前記プロモーターで発現できるものであれ ば特に制限はないが、 有用性の観点から、 各種遺伝疾患に関与する欠損遺伝子や、 サイト力イン類、 神経栄養因子類、 非自己抗原遺伝子、 ウィルス抗原等をコードす るヌクレオチド配列、 癌抑制遺伝子、 癌遺伝子である R a s等のアンチセンス配列 、 又はチミジンキナーゼのような自殺遺伝子等であることが好ましい。 また、 本発明のシユードタイプバキュロウィルス製造方法は、 前記コトランスフ ェクション工程の後に、 細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を含 むプラスミドが発現する細胞に、 前記コトランスフエクシヨン工程により生成され た昆虫に感染性を有する第一のシユードタイプパキュロウィルスを感染させ、 ウイ ルスを増幅させ、 第二のシユードタイプパキュロウィルスを生成する増幅工程をさ らに含むことが、 容易に増幅が可能である点で好ましい。
また、 本発明の他の態様のパキュロウィルスベクター製造方法は、 細胞表面に発 現可能なタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドと、 gp64遺伝子を欠損し た組換えバキュロウィルス DNAと、 導入遺伝子を有するベクターとを、 昆虫細胞にコ トランスフエタトするコトランスフエクシヨン工程を含み、 かつ、 該細胞表面に発 現可能なタンパク質を被ったシユードタイプバキュロウィルスが生成されることを 特徴とする。 前記 gP64遺伝子を欠損した組換えバキュロウィルス DNAは、 多角体プロ モーターとその下流のマーカーを含む 2種類の遺伝子を有する組換えバキュロウィ ルス DNAであることが好ましい。
また、 本発明の他の態様のパキュロウィルスベクター製造方法は、 細胞表面に発 現可能なタンパク質を細胞表面に一過性に発現させる昆虫細胞に、 gp64タンパク質 を粒子表面に被った gp64遺伝子を欠損するパキュロウィルスを感染させ、 該細胞表 面に発現可能なタンパク質を被ったウィルス粒子を細胞表面から出芽させる工程を 少なくとも含むことを特徴とする。
ここで、 細胞表面に発現可能なタンパク質を細胞表面に一過性に発現させる昆虫 細胞とは、 プラスミドにより、 該タンパク質を発現している昆虫細胞をレ、い、 該タ ンパク質をコードするプラスミドを導入することにより得ることができる。
前記バキュロウィルスベクター製造方法は、 前記工程の前に、 該 gp64タンパク質 を粒子表面に被つた gp64遺伝子を欠損するパキュロウィルスを作製する工程である 、 gp64タンパク質を一過性に発現させた昆虫細胞に gp64遺伝子を欠損させたウィル ス DNAをトランスフエクトすることにより、 一代のみ gp64タンパク質を粒子表面に被 つたバキュロウィルスを発芽させる工程をさらに含んでいてもよい。
本発明の、 バキュロウィルスベクターは、 前記本発明のパキュロウィルスべクタ 一製造方法により製造されたことを特徴とする。
その他、 昆虫細胞の取り扱い方、 遺伝子組換え、 コトランスフヱクシヨンの一般 的な手法については、 周知の昆虫細胞の組換えウィルス作成方法と同様の手法を用 いることができる。 （松浦善治、 タンパク核酸酵素、 37, 211— 222， 1992、 松浦善治 、 バキュロウィルス発現系、 「遺伝子導入と発現'解析法」 横田崇、 新井賢一編、 洋土社、 松浦善治、 細胞 33 (2) 30-34, 2001)
例えば、 発現したい遺伝子を組み込んだトランスファーベクター、 感染性ウィル ス DNA、 及ぴ、 本発明の場合はプラスミドを、 共に S f 9細胞 （0. 8 X 1 06個/3 5mm ディッシュ） に同時に導入し、 4日目の培養上清を希釈して 3 5 mmディ ッシュにプラークを作らせる。 それを 40 Om 1培養液に浮遊させ、 ボルテックス して寒天よりウィルスを溶出させ、 遠心して上淸を回収する。 これを、 一過性にェ ンべロープタンパク質を発現した S f細胞等に接種して、 再度培養後、 上清をとる と、 白いウィルスペレットが得られる。 プラスミ ドの導入は、 S f 9細胞 （1 X 1 06個 / 3 5 mm) にプラスミ ド DNA 2 μ トランスフエクション試薬 （UniFector, Bridge社製等） 6 μ 1程度が好ましい。
また、 パキュロウィルスは哺乳動物細胞に感染し、 遺伝子を核内まで導入するも のの、 細胞内で増殖することはない。 したがって、 高い発現を得るには精製して高 い感染価のウィルス （1 X 1 09— 1 0 p f u/m l ) を準備し、 ハイコピーの遺伝 子を導入する必要がある。 本発明のパキュロウィルス製造方法では、 該 gP 64タンパ ク質を粒子表面に被った gp64遺伝子を欠損するパキュロウィルスを、 所望のタンパ ク質を有するプラスミドを一過性に発現させた細胞に感染させることにより、 これ を行うことができ、 プラスミドを発現させておく以外は、 例えば以下のような公知 の方法で行うことができる。
S f 9細胞 （1 X 1 07個 Z1 0 c m ディッシュ） にストックウィルス （通常 1 X I 07-8 p f u/m l ) を 0. 5〜1. 0 m 1接種し、 感染 4日後に培養上清を回 収し、 軽く遠心 （6 0 0 0 g， 1 0分間） して細胞片を除いて保存しておく。 この 上清を SW2 8ローター （B e c kma n) で 2 5 0 0 0 r pm， 6 0分間 4°Cで 遠心し、 得られたウィルスペレットを l m lの PB Sに懸濁する。 これを 1 0〜6 0%のショ糖勾酉己にのせ、 SW41ローター （B e c kma n) で 25000 r p m， 60分間 4°Cで遠心しウィルスパンドで回収する。 これを PB Sに懸濁後、 S W41ローターで 25000 r pm、 60分間 4°Cで遠心し、 得られた精製ウィル スのペレツトを lm 1の PB Sに懸濁し 4°Cで遮光保存する。 精製ウィルスの感染 価は S f 9細胞を用いてプラックアツセィで測定することができる。 通常 250— 500m 1の培養上清から 0. 2 X 1010p f u/m 1の精製ウィルスが得られる また、 本発明の他の態様のバキュロウィルスベクターは、 バキュロウィルス DNAが gp64遺伝子を欠損し、 昆虫細胞に感染不可能なタンパク質を被ったシユードタイプ ウィルスであることを特徴とし、 例えば、 gp64プロモーター領域を含む gp64遺伝子 と、 多角体遣伝子との領域に、 それぞれ多角体プロモーター領域を有するマーカー 遺伝子を導入したパキュロウィルス DNAを含み、 プラスミドに由来する一過性に細胞 表面に発現可能なタンパク質であって、 昆虫細胞に感染不可能な任意のタンパク質 を被ったバキュロウィルスベクターなどが挙げられるが、 該昆虫細胞に感染不可能 なタンパク質の由来については、 これに制限されるものではない。
また、 本楽明の他のバキュロウィルスベクターは、 パキュロウィルス DNAが gp64遺 伝子を欠損し、 昆虫細胞に感染可能なタンパク質を被ったシユードタイプウィルス であり、 該タンパク質が該パキュロウィルス DNAから発現されたタンパク質ではない バキュロウィルスベクターである。 前記バキュロウィルスベクターとしては、 後述 の AcA64/GFP/LacZ*64(図 1 1及ぴ図 12)のように導入遺伝子を含まずに gp64タン パク質を一過性に被っているものであってもよいし、 AcA64/GFP/CAGluc*64(図 13 )のように導入遺伝子が組込まれていて gp64タンパク質を一過性に被っているもので あってもよいし、 また導入遺伝子が組込まれていて gp64タンパク質以外の細胞表面 に発現可能なタンパク質であって、 昆虫細胞に感染可能なタンパク質を一過性に被 つているものであってもよい。
前記昆虫細胞に感染可能なタンパク質を被ったシユードタイプパキュロウィルス ベクターは、 昆虫細胞における該バキュロウィルスベクターの增殖や、 ストックに 用いることができる。 また、 前記昆虫細胞に感染不可能なタンパク質を被ったシユードタイプバキュ口 ウィルスベクターは、 ヒトを含む生体内及ぴ生体外のいずれかの細胞に遺伝子を導 入するための最終的なベクターとして用いることができる。
前記パキュロウィルスベクターは、 生体に投与する場合には、 経口的又は非経口 的 （例えば、 静脈内、 筋肉内、 腹腔内、 皮下又は皮内等への注射、 直腸内投与、 経 粘膜投与、 経気道投与、 臓器内投与など） に投与することができる。
投与量、 投与回数は、 投与対象の体重や導入遺伝子に併せて、 適宜調節すること が出来る。
生体への遺伝子発現は補体による不活化が障害となる場合があるため、 捕体系の タンパク分解阻害剤のフサンを同時に適用することにより不活化を回避できる。 本発明の遺伝子導入方法は、 前記本発明のバキュロウィルスベクターを用いて、 生体内 （ヒトを除く） 及び生体外のいずれかの細胞に遺伝子を導入することを特徴 とする。
哺乳動物細胞への遺伝子導入は、 通常のウィルスベクターと同様に行うことがで きる。 例えば、 遺伝子を導入したい哺乳動物細胞を 6 0〜8 0 % c o n f l u e n tの状態でプレートもしくはディッシュに用意する。 感染方法は一般のウィルス接 種と同じである。 まず、 培養上清を除去し、 組換えウィルスを細胞当たりの感染価 (m o i ) 1 0〜1 0 0で接種し、 3 0〜6 0分間吸着する。 その後、 培地を加え て 3 7 °Cで培養する。 感染後 2 4〜4 8時間で細胞を回収し、 遺伝子の発現を調べ る。 また、 パキュロウィルスは血清中の捕体により不活化されることがあるため、 培養液中の牛胎仔血清は予め非働化しておくことが好ましい。
実施例
以下に本発明のバキュロウィルスベクター、 及ぴその製造方法並びにこれを用い た遺伝子導入方法について、 実施例より更に詳しく説明するが、 本発明はこれに限 定されるものではない。
(実施例 1 )
gp64遺伝子ノックァゥトベクターの作製
パキュロウィルスの gP64遺伝子領域を多角体プロモーターと緑色蛍光タンパク質（ GFP)遺伝子とで置換することによってその発現を消失させるため、 ノックァゥトべ クタ一 PUC Δ 64/GFPを図 8に示す手順で作製した。
パキュ口ウィルス（AcNPV)の gp64遺伝子領域を含む EcoRI- Smal断片 （nt 107， 325-1 12, 049) を、 pUC18の同様の制限酵素サイトに組み込み、 PUCgp641ocusを作製した。 次に多角体プロモーターの下流に GFP遺伝子及ぴ宫崎らによって開発された CAGプ口 モーター （Niwa et al. , 1986) の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだトラン スファーベクター pAcGFP— CAGluc (Tani et al. , 2001) を EcoRVと SnaBIで切断して 、 多角体プロモーターと GFP遺伝子を含む断片を回収し、 pUCgp641ocusを Spel (nt 1 09, 761) と Bglll (nt 108, 039) で切断後 klenow fragmentで平滑末端化した部位に 組み込んで、 gp64遺伝子のノックアウトベクター、 pUC A 64/GFPを作製した。
(実施例 2 )
gp64遺伝子を欠損させたバキュ口ウィルス Ac A 64/GFP/LacZの作製 （図 9 )
多角体プロモーターの下流に -ガラクトシダーゼ (LacZ)遺伝子を組み込んだ組換 えパキュ口ウィルス（AcLacZ)の感染性ウィルス DNAを抽出し、 gp64遺伝子のノックァ ゥトベクター、 PUC A 64/GFPと共に、 Sf - 9細胞にコトランスフエクトすると、 昆虫細 胞の核内で、 ウィルス DNAと pUC A 64/GFPが相同組換えを起こし、 ウィルス DNAの gp64 遺伝子領域が多角体プロモーターと GFP遺伝子に置換された組換えゥィルス Ac Δ 64/G FP/LacZが生じる。 このウィルスは gP64遺伝子とそのプロモーター領域が欠損してお り、 エンベロープタンパク質を完全に欠損するため、 感染性を全く示さない。 そこ で、 一過性に gp64タンパク質を Ac Δ 64/GFP/LacZに被せて、 一回だけ感染できるよう に改変する。
(実施例 3 )
gp64タンパク質を一過性に昆虫細胞で発現できるプラスミドの作製 （図 1 0 ) 昆虫由来の Sf - 9細胞内で gp64タンパク質を発現できるプラスミドを作製するため 、 pUCgP641ocusから gp64遺伝子を Spelと Bglllで切りだし、 その断片を同じ制限酵素 で切断した PUC18に組み込み、 pUCgP64を作製した。 さらに pUCgP64から gp64遺伝子を 含む断片を Hindlllと EcoRIで切り出し、 同じ酵素で切断した pIB/V5-His (Invitroge n) に組み込み、 発現ベクター pIB/gp64を作製した。 PIB/V5- Hisのバキュロウィルス 初期遺伝子プロモーター（IEプロモーター）の下流に挿入された遺伝子は昆虫細胞で 効率よく発現させることが可能である。 また、 昆虫細胞で高率に転写されるァクチ ンプロモーターを利用した同様の発現ベクターを作製した。 まず、 pUCgp641ocusを 鎵型とした PCR法によって、 gp64遺伝子を増幅した。 primerには、 gp64- Fw (Bgl) ： MAGATCTACCatggtaagcgctattgttt (配列番号 1 )と、 gp64- Rv (Sal) ： TTGTCGACttaatat tgtctattacggttt (配列番号 2 )を用いた。 増幅させた gp64遺伝子を Bglllと Sailで切 断し、 pA3Fbの BamHIと Sailサイトに組み込み、 pA3Fb/gp64を作製した。
(実施例 4 )
gp64タンパク質を一過的に被つた gp64遺伝子欠損ウィルス Ac A 64/GFP/LacZ*64の作 製 （図 1 1 )
上記の AcLacZの感染性ウィルス DNA、 pUC A 64/GFP、 及ぴ、 pIB/gp64あるいは pA3Fb /gp64を共に、 Sf- 9細胞にコトランスフエタトする。 これにより昆虫細胞の核内で、 ウィルス DNAと pUC A 64/GFPが相同組換えを起こし、 ウィルス DNAの gp64遺伝子領域が 多角体プ口モーターと GFP遺伝子に置換された組換えゥィルス Ac Δ 64/GFP/LacZが生 じる。 このウィルスは gp64遺伝子とそのプロモーター領域を欠損するため、 通常の 昆虫細胞では増殖できながコトランスフエクトした pIB/gp64あるいは pA3Fb/gp64に より トランスに gp64タンパク質が細胞表面に供給されるため、 gp64遺伝子を欠損し ているにもかかわらず、 gp64タンパク質を被って感染性を保持して出芽できる。 さ らに組換えウィルスは GFPの発現を指標に、 親の AcLacZと識別可能である。 即ち組換 えウィルスは LacZと GFPの両方を発現する。 実際のウィルス分離はトランスフヱクト 後 4日目の培養上清を、 前日に pIB/gp64あるいは pA3Fb/gp64をトランスフヱクトし た Sf-9細胞を用いて、 通常のプラックアツセィ法で相同,祖換えを起こしたと思われ る GFPと LacZの両方が陽性のプラックを回収し、 プラックアツセィを 4回繰り返して 純化して、 gp64遺伝子領域を多角体プロモーターと GFP遺伝子に置換し、 一過的に gp 64タンパク質を被つて感染性を保持した Ac Δ 64/GFP/LacZ*64を得た。
(実施例 5 )
Ac A 64/GFP/LacZ*64の増幅 （図 1 2 )
上記で単離した Ac A 64/GFP/LacZ*6は、 一過性に gp64タンパク質を被っているが、 gp64遺伝子を欠失していることから、 通常の Sf - 9細胞には一回しか感染できず増幅 はできない。 しかしながら、 予め pIB/gp64あるいは PA3Fb/gp64をトランスフエタト して gP64タンパク質を細胞表面に発現させた Sf- 9細胞に感染させることによって、 高力価のストックウィルスを容易に調整することが可能である。
(実施例 6 )
各種リポーター遺伝子を発現する組換えウィルスの作製
遺伝子導入する標的哺乳動物細胞内で導入遺伝子を発現させるため、 CAGプ口モー ターの下流に 3種のレポーター遺伝子、 ホタルのルシフェラーゼ遺伝子、 赤色蛍光 タンパク質 (DsRed)遺伝子、 GFP遺伝子をそれぞれ,袓み込んだトランスファ一べクタ 一、 pAcCAGluc、 pAcCAGDsRed、 及ぴ pAcCAGGFPを用いた。 これらのベクターは多角体 遺伝子領域で相同組換えを起こすように設計されている。 pAcCAGlucの作製は既に報 告している （Tani et al. , 2001) 。 pDsRed2- Nl (Clontech) を Kpnlで切断し、 DsRe d遺伝子を回収し、 同じ制限酵素で切断した pAcCAGMCS2 (Shoji et al. , 1997)に組み 込み、 pAcCAGDsRedを作製した。 pIRES2- EGFP (Clontech) を Ncolで切断し、 GFPを含 む断片を klenow fragmentで平滑化後、 Smalと Notlで切断し、 klenow fragmentで平 滑末端化した pAcCAGMCS2に組み込んで pAcCAGGFPを作製した。
図 1 3に pAcCAGlucを用いた組換えウィルスの作製手順を示す。 Ac Δ 64/GFP/LacZ* 64から DNAを抽出し、 LacZ遺伝子内に存在するユニークな Bsu36Iサイトで切断してゥ ィルス DNAを直鎖状にした。 この直鎖ウィルス DNA、 pAcCAGluc, 及ぴ、 pIB/gp64ある いは pA3Fb/gp64を共に Sf- 9細胞にコトランスフエクトして、 同様の手法で GFP陽性で LacZ陰性のプラークを回収した。 ブラックアツセィを 4回繰り返して純化して、 ル シフェラーゼ遺伝子を持つ組換えバキュロウィルス Ac Δ 64/GFP/CAGluc*64を作製し た。 このウィルスを予め pIB/gp64あるいは pA3Fb/gp64をトランスフエクトして gp64 タンパク質を発現している Sf - 9細胞に感染させることによって、 高力価のストツク ウィルスを調整した。
(実施例 7 )
水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を被つたシユードタイプウィルスの作製 （図 1 4 ) 導入遺伝子の一例として、 水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質遺伝子について 検証した。 pIB/V5- His及び pA3Fbに水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質遺伝子を揷 入した pIB/VSVG及ぴ PA3Fb/VSVGを作製した。 これらのいずれかのプラスミドを Sf- 9 細胞にトランスフエタトし、 24時間後に Ac Δ 64/GFP/CAGluc*64を感染させることに よって、 gP64タンパク質の代わりに水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を被つた シユードタイプウィルス Ac A 64/GFP/CAGluc*VSVGを作製した。 これらのウィルスが g p64タンパク質を欠損し、 水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を保持していること を、 精製ゥィルスの抗 gp64抗体及ぴ抗水疱性口内炎ウイルス抗体を用レ、た免疫ブ口 ットで確認した （図 1 5 ) 。 また、 前記水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質を一 過性に被つたシユードタイプウィルス Ac Δ 64/GFP/CAGluc*VSVGは、 前記 gp64を一過 性に被つたシユードタイプウイルス Ac Δ 64/GFP/CAGluc*64同様各種哺乳動物細胞に 効率よく感染することが分かつた。 図 1 6は、 Ac Δ 64/GFP/CAGluc*64と Ac Δ 64/GFP/ CAGluc*VSVGとを各々 293Tcell (A T C C社製） へ細胞あたりの感染価 (moi) 1 0、 3 0及び 5 0で接種した結果を表す。 培養上清を除去してウィルス接種し、 6 0分 間吸着した後、 培地を加え 3 7 °Cで培養した。 感染後 2 4から 4 8時間で細胞を回 収し、 luciferase遺 子の発 を Bright- Glo lucit'erase Assay system (Promega社 製） により測定した数値を表す。
また、 前記 Ac A 64/GFP/CAGluc*64及び Ac A 64/GFP/CAGluc*VSVGについて、 gp64及 び水疱性口内炎ウィルスの Gタンパク質 （VSVG) それぞれに対する特異抗体 （Anti- gp64 ： 抗 gp64抗体 clone #AcVl (Virology 125，p432-444 (1983) )、 Anti-VSVG ： 抗 VSVG抗体） で、 細胞接種前に中和し、 293Tcell細胞に感染させて中和試験を行った ところ、 Ac Δ 64/GFP/CAGluc*VSVGは、 VSVGに対する特異抗体でよく中和された （図 1 7 ) 。 中和試験は、 前記ウィルスベクターと抗体とを図の横軸に示す希釈濃度に なるように混合し、 室温で 1時間プレインキュベートした後、 前記と同様に 293Tcel 1細胞に感染させ、 発現を測定した。 図の横軸において、 1 / 2のとき、 ウィルスべ クタ一を抗体が 1 ： 1になっている濃度を示す。
このことから、 本発明のバキュロウィルス製造方法によれは、 水疱性口内炎ウイ ルスの Gタンパク質の昆虫細胞への感染性を全く用いることなく、 該タンパク質を 被ったバキュ口ウィルスべクターを増殖して得ることができることが分かった。 し たがって、 所望のエンベロープのタンパク質を、 その昆虫細胞への感染の有無にか かわらず、 自由に被せることができることが実証された。 また、 この方法によれば 、 遺伝子導入される細胞に感染した後には、 再度そのエンベロープタンパク質が発 現されることはなく、 安全性の高いパキュ口ウィルスベクターを作成することがで きる。
(実施例 8 )
二つの蛋白質を粒子表面に発現するパキュロウィルス：麻疹ウィルスの宿主特異性 を規定する二つのエンベロープ蛋白質を持つパキュロウィルスの作製
麻疹は強い感染性を示す急性ウィルス感染症で、 発展途上国を中心に毎年 1 0 0 万人の命を奪っている。 麻疹ウィルスは粒子表面に Hと Fの二つのエンベロープ蛋白 質を持ち、 H蛋白質が感染の組織特異性を規定している。 即ち、 実験室で継代された 麻疹ウィルス株（Edmonston株）では CD46あるいは SLAM (Signaling lymphocyte activa ting molecule ; CDwl50)をリセプタ一として利用できるのに対し、 野外からの新鮮 分離株は SLAMのみをリセプターとすることが明らかにされている。 そこで、 Edmonst on株あるいは新鮮分離株由来の Hと F蛋白質をそれぞれ粒子表面に発現した組換えバ キュロウィルスを作製し、 麻疹ウィルスの感染特異性をパキュロウィルスで再現で きる力否かを検討した。
実施例 7の pA3Fb/VSVGの替わりに、 Edmonston株あるいは新鮮分離株由来の麻疹ゥ ィルスの Hおよび F遺伝子を組み込んだプラスミドを、 Ac A 64/GFP/CAGlucとコトラン スフヱタトし、 Ac A 64/GFP/CAGluc*MV - H/Fを作製した。 次に、 これらのパキュロウ ィルスの感染特異性を SLAMあるレヽは CD46を発現しているハムスター由来細胞株 (CH0 細胞）で検定した。 その結果、 Edmonston株由来の Hおよび F蛋白質を被ったバキュ口 ウィルスベクターは SLAMを発現する CH0細胞及ぴ CD46を発現する CH0細胞への感染が 確認された。 一方、 新鮮分離株由来の Hおよび F蛋白質を被ったバキュロウィルスは S LAMを発現する CH0細胞にのみに遺伝子導入が可能であった。 陽性対照ウィルスの Ac Δ 64/GFP/CAGluc*VSVGはいずれの CH0細胞株にも感染し、 陰性対照ウィルスの gp64蛋 白質を欠損した Ac Δ 64/GFP/CAGlucは全く感染性を示さなかつた。 この成績は、 バキュロウィルスの粒子表面に二つのウィルス蛋白質を生物活性を 保持した形で提示できることを示すものである。 二つの蛋白質を粒子表面に提示す ることで、 より精度の高いターゲッティングが可能となると思われる。 また、 ウイ ルスのエンベロープ蛋白質だけでなく、 逆にウィルスのリセプタ一分子や癌抗原に 対する単鎖抗体を粒子表面に提示すれば、 ウィルスに感染してエンベロープ蛋白質 を発現している細胞や癌細胞だけにチミジンキナーゼ等の自殺遺伝子を導入し、 プ ロドラッグとの併用によって目的の細胞だけを生体から排除することが可能となる 。 特に、 エイズウイルスは慢性持続感染し、 感染細胞表面にエンベロープ蛋白質を 高度に発現するので、 エイズウイルスのリセプターとコリセプターを提示させた組 換えバキュロウィルスにより、 生体から感染細胞だけを排除することが期待される 本発明によると、 従来における前記諸問題を解決することができ、 昆虫細胞に感 染性を示す必要のない、 所望のタンパク質をウィルス粒子表面に提示し得る新規な パキュロウィルスベクター、 その製造方法及ぴ該バキュロウィルスベクターを用い た遺伝子導入方法を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 少なくとも、 細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を含むプ ラスミドと、 野生型、 変異型及ぴ糸且換えパキュロウィルス DNAのいずれかとを昆虫細 胞にコトランスフエタトするコトランスフエクシヨン工程を含み、 かつ、 該バキュ 口ウィルス DNAの少なくとも一部を含み、 該細胞表面に発現可能なタンパク質を被つ たシユードタイプバキュロウィルスが生成されることを特徴とするバキュ口ウィル スベクター製造方法。
2 . パキュロウィルス DNAが、 組換えバキュロウィルス DNAであり、 多角体遺伝子 と第一の外来遺伝子との相同組換えと、 gp64タンパク質と第二の外来遺伝子との相 同組換えがなされたバキュ口ウィルス DNAである請求の範囲第 1項に記載のバキュ口 ウィルスベクター製造方法。
3 . パキュロウィルス DNAが、 組換えパキュロウィルス DNAであり、 多角体遺伝子 と第一の外来遺伝子との相同組換えがなされたパキュロウィルス DNAである請求の範 囲第 1項に記載のバキュ口ウィルスベクター製造方法。
4 . コトランスフエクシヨン工程において、 第二の外来遺伝子を含むベクターを 同時にコトランスフエクトし、 gP64タンパク質と第二の外来遺伝子との相同組換え が起こり、 外来遺伝子を含むパキュロウィルス DNAを含み、 かつ、 該細胞表面に発現 可能なタンパク質を被ったシユードタイプバキュロウィルスが生成される請求の範 囲第 3項に記載のバキュ口ウィルスべクター製造方法。
5 . 第一の外来遺伝子が導入遺伝子及ぴマーカー遺伝子の少なくともいずれかで ある請求の範囲第 2項から第 4項のいずれかに記載のバキュ口ウィルスベクター製 造方法。
6 . 第二の外来遺伝子が導入遺伝子及ぴマーカー遺伝子の少なくともいずれかで ある請求の範囲第 2項及ぴ第 4項のいずれかに記載のバキュロウィルスベクター製 造方法。
7 . 細胞表面に発現可能なタンパク質が、 昆虫細胞に感染不可能なタンパク質で ある請求の範囲第 1項から第 6項のいずれかに記載のパキュ口ウィルスべクター製 造方法。
8 . 細胞表面に発現可能なタンパク質が、 昆虫細胞に感染可能なタンパク質であ る請求の範囲第 1項から第 6項のいずれかに記載のバキュ口ウィルスベクター製造 方法。
9 . コトランスフヱクシヨン工程の後に、 細胞表面に発現可能なタンパク質をコ ードする遺伝子を含むプラスミドが発現する細胞に、 前記コトランスフエクシヨン 工程により生成された第一のシユードタイプバキュ口ウィルスを感染させ、 ウィル スを増幅させ、 第二のシユードタイプバキュロウィルスを生成する増幅工程をさら に含む請求の範囲第 8項に記載のバキュロウィルス製造方法。
1 0 . パキュロウィルス DNAが gp64遺伝子を欠損した ,袓換えパキュロウィルス DNA であり、 前記コトランスフエクシヨン工程において、 更に、 導入遺伝子を有するベ クターをコトランスフエクトする請求の範囲第 1項に記載のパキュロウィルスべク ター製造方法。
1 1 . 細胞表面に発現可能なタンパク質を細胞表面に一過性に発現させる昆虫細 胞に、 gp64タンパク質を粒子表面に被った gp64遺伝子を欠損するパキュロウィルス を感染させ、 該細胞表面に発現可能なタンパク質を被ったウィルス粒子を細胞表面 から出芽させる工程を少なくとも含むことを特徴とするバキュロウィルスベクター 製造方法。
1 2 . 請求の範囲第 1項から第 1 1項のいずれかに記載のバキュロウィルスべク ター製造方法により製造されたことを特徴とするバキュロウィルスベクター。
1 3 . パキュロウィルス DNAが gp64遺伝子を欠損し、 昆虫細胞に感染不可能なタン パク質を被ったシユードタイプウィルスであることを特徴とするパキュロウィルス ベ々タ一。
1 4 . パキュロウィルス DNAが gP64遺伝子を欠損し、 昆虫細胞に感染可能なタンパ ク質を被ったシユードタイプウィルスであり、 該タンパク質が該パキュロウィルス D NAから発現されたタンパク質ではないことを特徴とするパキュロウィルスベクター
1 5 . 細胞を選択して特異的に遺伝子導入が可能である請求の範囲第 1 2項から 第 1 4項のいずれかに記載のバキュロウィルスベクター。
1 6 . 請求の範囲第 1 2項から第 1 5項のいずれかに記載のバキュロウィルスべ クタ一を用いて、 生体内 （ヒトを除く） 及ぴ生体外のいずれかの細胞に遺伝子を導 入することを特徴とする遺伝子導入方法。
PCT/JP2003/012275 2002-09-25 2003-09-25 バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法 WO2004029259A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03798509A EP1548119A4 (en) 2002-09-25 2003-09-25 BACULAR VIRUS VECTOR, METHOD OF CONSTRUCTING THE BACULAR VIRUS VECTOR AND GENTRANSFER METHOD
JP2004539540A JP4431039B2 (ja) 2002-09-25 2003-09-25 バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法
AU2003266628A AU2003266628A1 (en) 2002-09-25 2003-09-25 Baculovirus vector, method of constructing baculovirus vector and gene transfer method
US11/086,372 US7416890B2 (en) 2002-09-25 2005-03-23 Baculovirus vector, method of producing thereof and method of gene transfer

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002278469 2002-09-25
JP2002-278469 2002-09-25

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/086,372 Continuation US7416890B2 (en) 2002-09-25 2005-03-23 Baculovirus vector, method of producing thereof and method of gene transfer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004029259A1 true WO2004029259A1 (ja) 2004-04-08

Family

ID=32040427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/012275 WO2004029259A1 (ja) 2002-09-25 2003-09-25 バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1548119A4 (ja)
JP (1) JP4431039B2 (ja)
AU (1) AU2003266628A1 (ja)
WO (1) WO2004029259A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2363462A1 (en) 2006-02-09 2011-09-07 Educational Foundation Jichi Medical University Novel baculoviral vector
US9327018B2 (en) 2006-02-09 2016-05-03 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
RU2588464C2 (ru) * 2006-02-09 2016-06-27 Эдьюкейшнл Фаундейшн Дзити Медикал Юниверсити Бакуловирусный вектор и его применение
CN114317608A (zh) * 2020-12-28 2022-04-12 陕西杆粒生物科技有限公司 一种基因敲除型杆状病毒表达载体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008284664B2 (en) * 2007-08-07 2014-05-15 Educational Foundation Jichi Medical University Baculoviral vectors with a dual vertebrate and baculovirus promoter controlling an immunogenic fusion gene

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19735593A1 (de) * 1997-08-15 1999-02-18 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6183993B1 (en) * 1996-09-11 2001-02-06 The General Hospital Corporation Complement-resistant non-mammalian DNA viruses and uses thereof
CA2264966A1 (en) * 1996-09-11 1998-03-19 The General Hospital Corporation Expression of an exogenous gene in a mammalian cell by use of a non-mammalian dna virus having an altered coat protein
US6607912B2 (en) * 2000-08-11 2003-08-19 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. GP64-null baculoviruses pseudotyped with heterologous envelope proteins
WO2002072853A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Ark Therapeutics Limited Avidin-pseudotyped viral vectors and their use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19735593A1 (de) * 1997-08-15 1999-02-18 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MANGOR, J. T. ET AL.: "A GP64-null baculovirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus G protein", J. VIROL, vol. 75, no. 6, 2001, pages 2544 - 2556, XP002209173 *
OOMENS, A. G. ET AL.: "Requirement for GP64 to drive efficient budding of autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus", VIROLOGY, vol. 254, no. 2, 1999, pages 297 - 314, XP004440038 *
R. W. OLD ET AL., TRANSLATED BY MUTSO SEKIGUCHI ET AL.: "idenshi sosa no genri gensho 5th edition", 10 June 2000, BAIFUKAN CO., LTD., pages: 330 - 333, XP002977423 *
See also references of EP1548119A4 *
TANI, H. ET AL.: "Characterization of cell-surface determinants important for baculovirus infection", VIROLOGY, vol. 279, no. 1, 2001, pages 343 - 353, XP002973847 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2363462A1 (en) 2006-02-09 2011-09-07 Educational Foundation Jichi Medical University Novel baculoviral vector
EP2363463A1 (en) 2006-02-09 2011-09-07 Educational Foundation Jichi Medical University Novel baculoviral vector
US9023365B2 (en) 2006-02-09 2015-05-05 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
US9327018B2 (en) 2006-02-09 2016-05-03 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
RU2588464C2 (ru) * 2006-02-09 2016-06-27 Эдьюкейшнл Фаундейшн Дзити Медикал Юниверсити Бакуловирусный вектор и его применение
CN114317608A (zh) * 2020-12-28 2022-04-12 陕西杆粒生物科技有限公司 一种基因敲除型杆状病毒表达载体
CN114317608B (zh) * 2020-12-28 2023-08-22 陕西杆粒生物科技有限公司 一种基因敲除型杆状病毒表达载体

Also Published As

Publication number Publication date
EP1548119A1 (en) 2005-06-29
AU2003266628A1 (en) 2004-04-19
EP1548119A4 (en) 2006-08-02
JP4431039B2 (ja) 2010-03-10
JPWO2004029259A1 (ja) 2006-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11236307B2 (en) Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
Kitagawa et al. Ligand-directed gene targeting to mammalian cells by pseudotype baculoviruses
Jooss et al. Cytotoxic T-lymphocyte target proteins and their major histocompatibility complex class I restriction in response to adenovirus vectors delivered to mouse liver
Barsoum et al. Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis virus G glycoprotein
AU702830B2 (en) Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell
JP2001520050A (ja) 遺伝子供給ベクター類及びそれらの使用
CN104136613B (zh) 带有毒性基因的载体、方法及其用途
Stanbridge et al. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer
KR950001993B1 (ko) B형 간염 표면항원의 제조방법
US7416890B2 (en) Baculovirus vector, method of producing thereof and method of gene transfer
WO2004029259A1 (ja) バキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法
EP0327626B1 (en) Expression vectors for the synthesis of proteins and plasmid replicons and sequence cassettes for use in constructing such vectors
Keeler Jr et al. Construction of an infectious pseudorabies virus recombinant expressing a glycoprotein gIII-β-galactosidase fusion protein
Airenne et al. 11 Baculovirus-Mediated Gene Transfer: An Emerging Universal Concept
Airenne et al. Baculovirus-mediated gene transfer: an evolving new concept
CN103045544B (zh) 预防西尼罗河病毒的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E及疫苗与应用
Sandro et al. Baculovirus: A Powerful Tool for Various Biotechnological Applications
AP58A (en) Epression vectors for the synthesis of protein and plasmid and replicons and sequence cassettes for use in constructing such vectors
MXPA97002132A (en) Use of a non-myamiferous dna virus to express an exogenous gene in a mamif cell

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004539540

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11086372

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003266628

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003798509

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003798509

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2003798509

Country of ref document: EP