WO2004018618A1 - 半透膜付き細胞培養マイクロチャンバー - Google Patents

半透膜付き細胞培養マイクロチャンバー Download PDF

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WO2004018618A1 PCT/JP2003/010763 JP0310763W WO2004018618A1 WO 2004018618 A1 WO2004018618 A1 WO 2004018618A1 JP 0310763 W JP0310763 W JP 0310763W WO 2004018618 A1 WO2004018618 A1 WO 2004018618A1
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis

Definitions

  • the present invention in this application relates to a cell culture microchamber for culturing one cell at a time while observing the state of a specific cell with a microscope in the field of biotechnology using microorganisms and cells. . Background art
  • the microchamber proposed in the present invention makes it possible to create a microchamber shape using a glass microfabrication technique or the like, and to use the shape to culture cells.
  • a substrate material having a reactive residue such as an amino group, a carboxyl group, or a SH group, or a glass or a substrate. It was necessary to use a material that covalently bonds to silanol groups, such as a silicone substrate.
  • the above-mentioned substrate material is used to process the surface
  • a plurality of processes such as exposure and etching are required, and the production cost is increased. For this reason, the selection of the substrate material has been restricted in the conventional microchamber configuration, and the processing process has been cumbersome.
  • the invention of this application is based on the considerations of the inventors so far, and, for a microchamber that enables cell culture on a cell-by-cell basis, a plastic, a resin, or any other material that can constitute a substrate. It is an object of the present invention to provide a new cell culture microchamber that can be used, can be easily and inexpensively manufactured. Disclosure of the invention
  • the invention of this application firstly has no absorption for light having a wavelength of at least a specific visible region, is transparent, and has at least one cell unit.
  • a silane-coupling thin film is provided on a substrate on which a plurality of holes as a culture vessel capable of culturing cells at a temperature are arranged, and a semi-permeable membrane is provided on the surface of the thin film via a binding biological material.
  • the invention of the present application also provides, secondly, a micro-chamber in which the melting point of the substrate is 90 or more and less than 400, and thirdly, the thickness of the thin film is 20 angstroms.
  • a microchamber whose thin film material is at least one of silicon, silicon chloride, chromium, aluminum, iron, and titanium, 5 provides a microchamber wherein the biological material is avidin and biotin.
  • the thin film of a material that is covalently bonded to a silanol group is provided on the surface of a substrate constituting a microchamber, and has a silanol group at one end,
  • a divalent reagent having an amino group or a hydroxyl group or an SH group An amino group, a sulfoxyl group, or an SH group is introduced into the surface of the thin film.
  • a biological substance that strongly binds to another biological substance, such as piotin or avidin is immobilized on a surface into which an amino group, a carboxylic acid group, or an SH group is introduced. Then, a semipermeable membrane modified with a separate biomaterial so as to strongly bind to the biomaterial is fixed.
  • the semipermeable membrane coated and arranged in this way enables the exchange of culture solution.
  • a micro-chamber is manufactured simply and inexpensively by using a ⁇ type by using a material that deforms at a temperature of about 100 to 150 at a temperature of, for example, as a substrate material.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the basic configuration of the invention of this application.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a procedure for preparing the culture microchamber shown in FIG.
  • the cell culture microchamber 100 with a semipermeable membrane according to the present invention comprises a plurality of cell culture vessels 102 on an optically transparent substrate 101, and each cell 102 contains a cell culture vessel. 10 3 is added so that it can be cultured.
  • a thin film 106 of silicon, silicon oxide, chromium, aluminum, iron, titanium or the like, which is a material capable of coupling with a silanol group and silane is deposited or sputtered. .
  • the thickness of the thin film 106 should be at least 20 angstroms.
  • the binding to the substrate and the binding to the semipermeable membrane to be coated thereon may not always be sufficient. More practically, about 200 ⁇ or more and about 200 ⁇ or less are considered.
  • an amino group, a lipoxyl group, or an SH group is introduced into the surface of the thin film 106 by a divalent reagent having a silanol group at one end and an amino group, a lipoxyl group, or an SH group at the other end.
  • a biotin is covalently bonded to the surface of the thin film 106 into which the amino group, carboxyl group, or SH group is introduced, and then the avidin-modified semipermeable membrane 105 is bonded thereto.
  • the avidin-modified semipermeable membrane 105 is bonded thereto.
  • FIG. 2 shows an example of a procedure for actually creating the microchamber 100 shown in FIG.
  • an optically transparent material such as PET, whose shape is easily changed by heat of about 120: such as PET is used for the substrate 201.
  • PET optically transparent material
  • a microstructure can be easily formed by applying a heated mold to the substrate surface.
  • the processing procedure is described below. First, a substrate 201 is prepared. Next, with vapor deposition or sputtering a thin film on a top surface of the substrate 2 0 1, for example, to form a thin film 2 0 2 silicon oxide (S i 0 2).
  • the thin film 202 is described earlier.
  • any material that can be silanol-coupled with silane such as silicon, chromium, aluminum, iron, or titanium, may be used.
  • the pre-formed micro-shaped mold 203 is pressed against the substrate 201 while being heated to a hundred and several tens of degrees to form the micro-shaped on the substrate 201. ⁇ The micro shape can be easily created by removing the mold.
  • the biological material is fixed to the surface of the thin film 202 by silane coupling, and the semipermeable membrane 105 is fixed to the surface.
  • the substrate 201 made of a single material has been described in the above embodiments, different materials may be combined or the substrates may be stacked in layers.
  • a polymer layered on a glass substrate can be treated in exactly the same procedure as described in the above embodiment.
  • the substrate varies depending on the method of forming the micro-shape and the temperature in the case of using the ⁇ type as one of the methods, but from the viewpoint of handling, the melting point of the substrate is generally 9%. It is preferable that the value be 0 or more and less than 400. Further, one that deforms at a temperature of 100 to 150 is mentioned as an example.

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Abstract

少くとも特定の可視領域の波長の光に対して吸収を持たず、透明性であって、少くとも1細胞単位での細胞培養が可能とされ穴が培養容器102として複数配置された基板101上に、シランカップリングする薄膜106が配設され、この薄膜106の表面には結合性生体物質を介して半透膜105が被覆されているマイクロチャンバー100とし、プラスチックや樹脂やその他の基板を構成できる任意の素材を用いることができ、しかも簡便に、安価に製造することのできる細胞培養マイクロチャンバーとする。

Description

明 細 書 半透膜付き細胞培養マイクロチャンバ一 技術分野
この出願の本発明は、 微生物や細胞を用いたバイオテクノロジーの研 究分野において、 特定の細胞の状態を顕微鏡観察しながら、 1細胞単位 で培養するための細胞培養マイクロチヤンバ一に関するものである。 背景技術
従来の生物学、 医学、 薬学の分野では、 細胞の状態の変化、 あるいは 細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、 細胞集団の値の平均値をあ たかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。 しかし、 実際には細 胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、 各々の細胞 が異なった周期でタンパク質を発現している。 これらの問題を解決する ベく、 この出願の発明者らは、 新たに特定の一細胞のみを選択し、 その 一細胞を細胞株として培養し、 これを観察し、 細胞の溶液環境条件を制 御し、 かつ、 容器中での細胞濃度を一定に制御すること、 あるいは相互 作用する細胞を特定しながら培養観察することを特願 2 0 0 0— 3 5 6 8 2 7の発明として提案した。
この発明で提案したマイクロチヤンバ一は、 ガラス微細加工技術等を 用いてマイクロチヤンバーの形状を作成し、 その形状を利用して細胞を 培養することを可能としている。
しかしながら、 このマイクロチャンバの場合には、 基板の素材表面に ピオチンあるいはアビジンなどの生体物質を固定するためには、 ァミノ 基、 カルボキシル墓、 S H基などの反応残基を持つ基板素材あるいは、 ガラスやシリコーン基板のようなシラノール基と共有結合する素材を 用いる必要があった。 また上記基板素材は、 その表面に加工を施すため に、 露光やエッチング等の複数の工程が必要であり、 製作単価が高くな るという問題があった。 このようなことから、 これまでのマイクロチヤ ンバーの構成においては基板素材の選択には制約があり、 加工プロセス も面倒なものとなっていた。
そこで、 この出願の発明は、 これまでの発明者らの検討を踏まえ、 1 細胞単位での細胞培養を可能とするマイクロチヤンバーについて、 ブラ スチックや樹脂やその他の基板を構成できる任意の素材を用いること ができ、 しかも簡便に、 安価に製造することのできる、 新しい細胞培養 マイクロチヤンパーを提供することを課題としている。 発明の開示
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものとして、 第 1には、 少 くとも特定の可視領域の波長の光に対して吸収を持たず、 透明性であつ て、 少くとも 1細胞単位での細胞培養が可能とされる培養容器としての 穴が複数配置された基板上に、 シランカツプリングする薄膜が配設され、 この薄膜の表面には結合性生体物質を介して半透膜が被覆されている ことを特徴とする半透膜付き細胞培養マイクロチャンパ一を提供する。 また、 この出願の発明は、 第 2には、 前記基板の融点は 9 0で以上 4 0 0で未満であるマイクロチャンパ一を、第 3には、前記薄膜の厚さは、 2 0オングストロ一ム以上であるマイク口チャンパ一を、 第 4には、 薄 膜の素材が、 シリコン、 塩化シリコン、 クロム、 アルミニウム、 鉄、 お よびチタンのうちの少くとも 1種であるマイクロチャンバ一を、 第 5に は、 前記の生体物質が、 アビジンとピオチンであるマイクロチャンバ一 を提供する。
そして、 より具体的には、 この出願の発明においては、 たとえば、 マ ィクロチャンバを構成する基板表面にシラノール基と共有結合する素 材の前記薄膜を配設し、 片端にシラノール基を持ち、 他端にアミノ基ぁ るいは力ルポキシル基あるいは S H基を持つ二価性試薬等によって上 記薄膜の表面にアミノ基あるいは力ルポキシル基あるいは S H基を導 入する。 また、 アミノ基あるいは力ルポキシル基あるいは S H基を導入 した表面にピオチンあるいはアビジン等の他の生体物質と強く結合す る生体物質を固定する。 そして、 この生体物質と強く結合するように別 途生体物質で修飾した半透膜を固定する。
このようにして被覆配設された半透膜は、 培養液の交換を行うことを 可能としている。
また、 この出願の発明では、 基板素材として、 たとえば 1 0 0で〜 1 5 0で程度の温度で変形する素材を用いることで、 铸型を用いて簡便に 安価にマイクロチャンバ一を製作する。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の基本構成の一例を示す模式図である。 図 2は、 図 1で示した培養マイクロチャンバ一の作成手順を示す模式 図である。
なお、 図中の符号は次のものを示す。
1 0 0 マイクロチヤンバー
1 0 1 2 0 1 板
1 0 2 2 0 4 細胞培養容器
1 0 3 細胞
1 0 4 2 0 2
1 0 5 半透膜
2 0 3 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下にそ の実施の形態について説明する。
まず、 この本発明の半透膜付き細胞培養マイクロチヤンバーの基本構 成の一例を図 1の実施例を用いて説明する。 この発明の半透膜付き細胞 培養マイクロチャンバ一 1 0 0は、 光学的に透明な基板 1 0 1に複数の 細胞培養容器 1 0 2が構成されており、 各容器 1 0 2中に、 細胞 1 0 3 を入れて培養することができるようにしている。 この基板 1 0 1の上面 にはシリコン、 あるいは酸化シリコン、 あるいはクロム、 あるいはアル ミニゥム、 あるいは鉄、 あるいはチタン等の、 シラノール基とシラン力 ップリングする素材の薄膜 1 0 6が蒸着あるいはスパッタリングされ ている。 この薄膜 1 0 6の厚さは 2 0オングストロ一ム以上あればよレ 。 2 0オングストローム未満の塌合には、 基板との結合性やその上に被覆 する半透膜との結合性が必ずしも充分でないことがある。 より実際的に は 2 0オングストローム以上 2 0 0オングストロ一ム以下程度が考慮 される。 この薄膜 1 0 6の表面に、 たとえば、 片端にシラノール基を持 ち、 他端にアミノ基あるいは力ルポキシル基あるいは S H基を持つ二価 性試薬等によってアミノ基あるいは力ルポキシル基あるいは S H基を 導入し、 次に、 このアミノ基あるいはカルボキシル基あるいは S H基を 導入した薄膜 1 0 6表面に、 たとえばピオチンを共有結合させ、 次に、 アビジン修飾した半透膜 1 0 5を結合させることで基板 1 0 1上面に 半透膜 1 0 5をシールする。 なお、 この実施例では、 基板 1 0 1の薄膜 1 0 6の表面にピオチンを、 半透膜 1 0 5にアビジンを結合させたが、 その反対であってもよい。
図 2は、 図 1で示したマイクロチャンバ一 1 0 0を実際に作成する手 順の一例を示したものである。 ここでは、 例えば基板 2 0 1に P E T等 の 1 20 :程度の熱で容易に形状が変化する光学的に透明な素材を用い る。 前記基板 2 0 1を用いた場合、 加熱した铸型を基板表面に当てるこ とで簡単にマイクロストラクチャを形成することができる。 以下に加工 手順を説明する。 まず、 基板 2 0 1を用意する。 次に基板 2 0 1の上面 に薄膜を蒸着あるいはスパッタリングして、 たとえば酸化シリコン （S i 0 2 ) の薄膜 2 0 2を形成する。 ここで薄膜 2 0 2は、 先に述べたよ うにシリコン、 あるいはクロム、 あるいはアルミニウム、 あるいは鉄、 あるいはチタン等の、 シラノール基とシランカツプリングする素材であ ればよい。 次に、 あらかじめ作成していたマイクロ形状をかたどった铸 型 2 0 3を百数十度に加熱しながら基板 2 0 1に押し付けマイクロ形 状を基板 2 0 1に形成する。 铸型を取り除くと、 マイクロ形状を簡単に 作成することができる。 この後、 図 1の説明で述べたように、 シラン力 ップリングによって薄膜 2 0 2表面に生体物質を固定して前記の半透 膜 1 0 5を表面に固定する。
なお、 以上の実施例では単一の素材から構成される基板 2 0 1を示し たが、 異なる素材が複合化されていてもよいし、 層状に積み上げられた 基板であってもよい。 たとえば、 ガラス基板上に、 高分子を層状に積層 したものについて、 この高分子層は、 上記実施例で述べた手順と全く同 様な手順で扱うことができる。
そして、 基板については、 マイクロ形状の形成方法や、 その一つの方 法としての铸型の使用の場合の温度等によっても異なるが、 取扱いの観 点からは、 一般的に基板の融点は、 9 0で以上 4 0 0で未満とすること が好適である。 さらには 1 0 0で〜 1 5 0での温度で変形するものがそ の一例として挙げられる。
もちろん、 この出願の発明は以上の例示に限定されることはない。 'そ の細部について様々な形状が可能であることは言うまでもない。 ― 産業上の利用可能性
以上記述したように、 この出願の発明により、 加工工程が大幅に簡素 化された安価なマイクロチャンパァレイを作成することが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 少なくとも特定の可視領域の波長の光に対して吸収を持たず、 少 くとも 1細胞単位での細胞培養は可能とされる培養容器としての穴が 複数配置された基板上に、 シランカップリングする薄膜が配設され、 こ の薄膜の表面には結合性生体物質を介して半透膜が被覆されているこ とを特徴とする半透膜付き細胞培養マイクロチャンバ一。
2 . 前記基板の融点は、 9 0で以上 4 0 0で未満であることを特徴と する請求項 1の半透膜付き細胞培養マイクロチャンパ一。
3 . 前記薄膜の厚さは、 2 0オングストローム以上であることを特徴 とする請求項 1の半透膜付き紬胞培養マイクロチャンバ一。
4 . 前記薄膜は、 その素材が、 シリコン、 酸化シリコン、 クロム、 ァ ルミ二ゥム、 鉄、 およびチタンのうちの少くとも 1種ことを特徴とする 請求項 1の半透膜付き細胞培養マイクロチヤンバー。
5 . 前記生体物質が、 アビジンとピオチンであることを特徴とする請 求項 1記載の半透膜付き細胞培養マイクロチャンバ一。
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