WO2004018494A1 - ４’−チオヌクレオチド - Google Patents

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WO2004018494A1
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thio
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Akira Matsuda
Yuka Kato
Noriaki Minakawa
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Geneticlab Co., Ltd.
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    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/173—Purine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to nucleotide analogs and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to 4, -thioliponucleotides and 4,1-glycidyl 2'-deoxynucleotides, methods for producing these nucleotide analogs, and oligonucleotides using these nucleotide analogs. It relates to a method of manufacturing. Background art
  • 4'-Thiononucleoside is a generic name for nucleosides in which the oxygen atom of the furanoic ring is replaced by a sulfur atom.
  • RNAs or DNAs containing 4, -thioribonucleosides or 4'-thio-1,2-deoxyribonucleosides are resistant to various nucleases and may be used in research reagents and diagnostics. It has been suggested to be useful as a therapeutic drug. '
  • Bellon et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 1992, 184, 797-803) describe the synthesis of oligodoxynucleotides containing 1- (4-thio-1j8-D-lipofuranosyl) thymine. Bellon et al. (Nucleic Acids Res, 1993, 21, 1587-1593), Leydier et al. (Antisense Res. Dev. 1995, 5, 167-174) and Leydier et al.
  • Dukhan et al. (Nucleosides Nucleotides, 1999, 18 1423-1424) describe the synthesis of oligonucleotides containing four 4'-thioliponnucleosides.
  • deoxyliponunucleosides have also been reported.
  • Hancox et al. (Nucleic Acids Res., 1993, 21, 3485-3491) describe the synthesis of 4,1-thio-2'-deoxythymidine and oligodeoxyliponucleotides containing it.
  • Boggon et al. (Nucleic Acids Res., 1996, 24, 951-961) describe the structure of synthetic DNA oligomers containing 4, -thio2, -deoxythymidine.
  • Alexandrova et al. (Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 1995, 7, 237-242) reported the synthesis of 4,1-thio-5-ethyl-2, -deoxyduridine 5, and monotriphosphate and the synthesis of DNA by a DNA synthase. State what is recognized. However, no 4'-thio-dioxy- liponucleoside triphosphate or 4'-thio-lipo-nucleoside triphosphate other than this specific base has been obtained so far. This is thought to be due to the difficulty of stereoselective synthesis.
  • the present invention provides a novel nucleoside triphosphate, a method for synthesizing the same, and a method for producing an oligonucleotide using these nucleoside triphosphates. It is intended to provide a method for doing so. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a compound of formula I:
  • B is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, peracyl, and hypoxanthine
  • the present invention also provides a compound of formula II:
  • B ' is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, thymine, peracyl and hypoxanthin]
  • the 4'-thionucleotides of the present invention have the following properties: they can be recognized and elongated by enzymes such as RNA polymerase and DNA polymerase; therefore, they are resistant to nucleases; It is useful as a monomer unit for performing
  • the present invention provides a compound of formula I:
  • Nucleobase selected from the group consisting of:
  • B is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, peracyl, and hypoxanthine, and R 2 and R 3 are each independently a protecting group for a hydroxyl group at the mouth.
  • the present invention provides a compound of formula II:
  • B is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, thymine, peracyl and hypoxanthine] '
  • the present invention provides a method for synthesizing a 4'-thio-2,2-deoxynucleotide represented by The method has the formula V:
  • B is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, thymine, peracyl and hypoxanthine, and R 2 is protection of the hydroxyl group.
  • the present invention provides a compound of formula VI:
  • B is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, peracyl, and hypoxanthine
  • the present invention provides a method for producing an oligonucleotide containing at least one of the following nucleotide units:
  • the method is characterized in that an RNA chain elongation reaction is carried out by an RNA synthase in the presence of the 4′-thioliponucleotide of the present invention.
  • Examples of the RNA synthase include RNA polymerase.
  • the present invention provides a compound of formula V I I:
  • B is a nucleobase selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, thymine, peracyl and hypoxanthine
  • a method for producing an oligonucleotide comprising at least one nucleotide unit of the present invention comprising: It is characterized in that a DNA chain elongation reaction is performed by a synthase.
  • DNA synthases include DNA polymerase, reverse transcriptase, and terminal deoxynucleotidyl transferase.
  • RNA or DNA containing 4'-thioliponucleoside or 4'-thio2'-deoxyliponucleoside produced by the method of the present invention exhibits resistance to various nucleases.
  • an oligonucleotide can be synthesized using an enzyme, so that a longer-chain oligonucleotide can be easily produced as compared with a conventional chemical synthesis method.
  • cDNA can be synthesized using the RNA as a template, and therefore, it can be used in in vitro selection. It is very useful for BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the synthesis scheme of 4′-thio UTP described in Example 9.
  • FIG. 2 shows the synthesis scheme of 4′-thio CTP described in Example 10.
  • FIG. 3 shows a synthesis scheme of 4′-thio ATP described in Example 11.
  • FIG. 4 shows the synthesis scheme of 4′-thio GTP described in Example 12.
  • FIG. 5 shows a synthetic scheme of 4,1-doxy-1,2-doxy UTP described in Example 13.
  • FIG. 6 shows the synthetic scheme of 4,1-thio-2, -deoxy CTP, 4, -thio-1,2, -deoxy ATP and 4, -thio-1,2, -deoxy GTP described in Example 14.
  • Figure 7 shows the outline of an experiment for incorporation of 4, -thio UTP using T7 RNA polymerase.
  • FIG. 8 shows the results of an experiment of incorporation of 4-thio UTP using T7 RNA polymerase.
  • FIG. 9 shows the outline of the experiment for incorporation of 4, -Cho UTP and 4'-Cho CTP using T7 RNA polymerase.
  • FIG. 10 shows the results of experiments on incorporation of 4, -Cho UTP and 4, -Cho CTP using T7 RNA polymerase.
  • Fig. 11 shows an outline of a cDNA synthesis experiment using reverse transcriptase from RNA containing 4'-thio UTP and 4'-thio CTP.
  • FIG. 12 shows the results of a cDNA transcriptase experiment using reverse transcriptase from RNA containing 4′-thio UTP and 4′-thio CTP.
  • FIG. 13 shows the RNAse resistance of RNA containing 4, -Cho UTP and 4,1-Cho CTP.
  • the nucleoside triphosphate of the present invention can be produced and prepared by starting from a known 4-thio sugar, stereoselectively introducing a base into the sugar, and then selectively introducing a phosphate group at the 5′-position. can do.
  • 4'-thioperidine is 4-monothiosaccharide
  • R 2 and R 3 are independently hydroxyl protecting groups, and R and R 2 and R 9 may be taken together to form a bifunctional hydroxyl xyl protecting group. I].
  • R 3 is an acyl-protecting group having an electron-donating substituent, the stereoselectivity of which is improved, and preferably a 2,4-dimethoxybenzoyl group.
  • the 18-peridine derivative obtained by the Pummeler reaction can be converted to 19-4, -thioperidine by deprotection using ammonium fluoride and methylamine.
  • 4'-thio UTP is synthesized from 19,4'-thioperidine (Fig. 1).
  • Compound 20 is obtained by monomethoxytritylation at the 5'-position and acetylation at the 2'- and 3'-positions of the compound (19). Subsequently, monomethoxytrityl is removed to obtain 21 acetyl groups. From the obtained compound 21, applying the method of Eckstein et al. (Luding, ⁇ and Eckstein, F. (1989) J. Org. Chem “54, 631-635), 24
  • the 28,4-thio CTP can be produced from the 25 N 4 -benzoyl 4, -thiocytidine by the same process as the above-mentioned 4'-thio UTP ( Figure 2).
  • 4'-thio ITP can be produced from 4'-thiohypoxanthine by the same process as that for 4'-thio UTP described above.
  • 4'-Cho ATP and 4, -Cho GTP can be manufactured using the schemes shown in Figures 3 and 4. That is, after appropriately protecting the hydroxyl groups at the 2 'and 3' positions and the amino group of the purine ring, the salicyl phosphorochloridite was converted to salicyl phosphorochloridite according to the method of Eckstein et al. Reaction with pyrophosphoric acid to give the cyclotriphosphite intermediate. Subsequent oxidation, hydrolysis, and deprotection yields 32-4, ⁇ , ⁇ , and 37 '4'-GTP.
  • 4'-Thiothio-2, -deoxyliponucleoside triphosphate can be prepared in the same manner as 4'-thiolipononucleoside triphosphate. Use 4'-thio-2'-doxyliponucleoside as starting material. Then, salicyl phosphorochlorida The resulting intermediate is reacted with pyrophosphoric acid, followed by oxidation, hydrolysis, and deprotection to give the desired 4'-thio-2, -deoxyliponucleoside triphosphate. Can be obtained ( Figures 5 and 6).
  • the 4'-thionucleotides of the present invention can be used as a substrate for a DNA or RNA synthesis reaction using polymerase.
  • RNA polymerase is allowed to act in the presence of an appropriate template to determine whether or not 4′-thioliponucleotide is incorporated into the oligomer. Find out what.
  • the 4'-thionucleotide synthesized according to the present invention was recognized by T7 RNA polymerase and incorporated into the synthetic oligomer chain in the same manner as the natural nucleotide. Was found.
  • the present invention provides a method for producing an oligonucleotide using 4′-thionucleotides.
  • Oligonucleotides can be produced by extending an oligonucleotide chain with an enzyme such as RNA or DNA synthase RNA polymerase or DNA polymerase in the presence of the 4′-mononucleoside triphosphate of the present invention.
  • an enzyme such as RNA or DNA synthase RNA polymerase or DNA polymerase in the presence of the 4′-mononucleoside triphosphate of the present invention.
  • RNA synthase various RNA polymerases derived from various organisms can be used.
  • DNA synthase DNA polymerase, reverse transcriptase, terminal derivatized from various organisms can be used. For example, oxynucleotidyltransferase can be used.
  • the conditions for the extension reaction vary depending on the polymerase used, but those skilled in the art can select appropriate reaction conditions.
  • a natural nucleoside triphosphate or a modified nucleoside triphosphate known in the art may be present in addition to the 4'-thionucleoside triphosphate of the present invention.
  • Oligonucleotides obtained by the method of the present invention are used as diagnostic, therapeutic and research reagents as antisense oligonucleotides, lipozymes, primers, aptamers, antigenes, RNAi, siRNA, probes, etc. be able to.
  • the oligonucleotides of the invention are from about 6 to about 50 nucleotides in length. In a more preferred embodiment of the invention, the oligonucleotide is from about 12 to about 20 nucleotides in length.
  • Oligonucleotides are modified Saccharides, such as sugars having a substituent at the 2 'position, and nucleic acids other than adenine, guanine, cytosine, thymine, and peracil, such as hypoxanthine, 5-alkyl cytidine, 5-alkylperidine, May contain 5-halo uridine, 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine and the like. Further, it may contain an internucleoside bond other than the phosphodiester, for example, a phosphorothioate bond.
  • oligonucleotides of the present invention are suitable for use in vitro and in vivo due to their high nuclease resistance and thermostability, and are particularly useful in gene therapy.
  • RNA containing the 4'-thioliponucleoside of the present invention is recognized by reverse transcriptase to synthesize cDNA, and thus is extremely useful for use in in vitro selection.
  • TIPDS 1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl TMS trimethylsily ⁇ /
  • FAB-HLRS calculated C26H 45 N0 5 SSi 2 (MH + ) 540.2635.
  • FAB-HLRS calculated value C 25 H 42 0 7 SSi 2 (MH +) 543.2253.
  • Triethylamine (1, 0 ml_, 7.3 mmol) and TMSOTf (2.6 mL, 14.6 mmol) were added to a suspension of peracyl (408 mg) in toluene (20 mL) at room temperature under an argon atmosphere. Was stirred until a solution was obtained.
  • Methylene chloride (10 mL) was added to the reaction solution to form a one-layer solution. At room temperature, the reaction solution was added to a methylene chloride solution (20 mL) of compound 14b (987 mg, 1.8 mmol) in 15 minutes. And dropped.
  • FAB-HLRS calculated value 637.2435.Measured 637.2435.
  • 1- (4-thio- / 3-D-lipofuranosyl) peracyl 131 mg, 0.5 mmol; prepared by deprotecting compound 15 with NH 4 F / MeOH, MeNHs / MeOH.
  • mL solution was added with 4-methoxytrityl chloride (232 mg, 0.75 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 14 hours.
  • Acetic anhydride (188 2 mmol) and DMAP (5 mg, 0.05 mmol) were added under an argon atmosphere, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Methanol was added and the mixture was stirred for 30 minutes, and the reaction solution was evaporated under reduced pressure.
  • the reaction solution was added dropwise to a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and the mixture was separated with ethyl acetate.
  • the aqueous layer was extracted seven times with a black form, and the organic layer was washed with saturated saline (X1) and dried over Na 2 SO 4 . After filtration with a cotton plug, the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Tributyltin hydride (371 [1 L, 1.38 mmol) and then V-70 (57 mg, 0.18 mmol) were added to a dichloromethane (15 mL) solution of compound 40 (519 mg, 0.92 mmol), and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. did. The solvent was distilled off, and the residue was subjected to silica gel chromatography (hexane). Compound 8 (440 mg, 98%) was obtained as a white foam.
  • compound 48 (41 mg, 0.1 mmol) was treated with salicylphosphoric acid mouth ridite (30 mg, 0.15 mmol) to give compound 49 (35 mg, 61%) as a white powder. Obtained.
  • NTP is (1) GTP, (2) GTP + ATP, (3) GTP + ATP + CTP, (4) GTP + ATP + CTP + UTP, and (5) GTP + ATP + CTP + 4'-thio UTP.
  • the above reaction solution was incubated at 37 ° C for 3 hours to stop the reaction. Subsequently, electrophoresis was performed on a 20% denaturing polyacrylamide gel (30 ⁇ 40 ⁇ 0.05 cm, 1800 V, 1 hour, 1 ⁇ TEB) and analyzed by autoradiography.
  • Fig. 8 shows the results.
  • bands corresponding to 2mer and 3mer of G and ladder were observed.
  • lane 2 a band in which chain elongation was stopped was observed at the predicted 6-mer, and a band extending one residue was slightly observed.
  • lane 3 a band at which chain elongation was stopped was observed at the predicted 9-mer, and a band further extended by one residue was observed.
  • lane 4 a full-length product, 26mer, was observed.
  • lane 5 using 4'-thio UTP instead of UTP a band of the full-length product was observed at almost the same ratio as in lane 4.
  • NTP is 1) ATP, GTP, CTP, UTP, 2) A system using 4'-Cho UTP instead of UTP, 3) A system using 4Cho C ⁇ P instead of CTP, 4) UTP and CTP Was replaced with 4'-cho UTP and 4'-cho CTP.
  • the above reaction solution was incubated at 37 ° C for 3 hours to stop the reaction.
  • Example 17 Synthesis of cDNA from RNA strand containing 4'-thio UTP and 4'-thio CTP Using 4'-thio RNA obtained by the transcription reaction in Example 16 as a template, reverse transcriptase was used. And whether cDNA could be obtained. To perform this experiment, RNA with a longer chain length was required, and the 76-mer double-stranded DNA shown in Fig. 11 was used as a template. First, transcription reaction with T7 RNA polymerase was performed in the presence of GTP, ATP, 4'-thio UTP and 4'-thio CTP. The reaction was carried out under the same conditions as in Example 16, and the RNA was efficiently transcribed into 4'-thio RNA. Using the obtained 59-mer 4'-thio RNA as a template, reverse transcription to cDNA was performed using reverse transcriptase.
  • the reaction was performed by the following method.
  • the following dNTPs were added to each solution after mixing the primer 4 iL (20 pmol) and the 59mer RNA 6 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (20 pmol) with the radiolabeled 5 ′ end.
  • Lanes 2, 6 and 10 dTTP, dCTP, dATP, dGTP and above Each reaction solution was incubated at 70 ° C for 15 minutes and immediately incubated at 0 for 1 minute or more. Then add 2 M of 0.1 M DTT, 5X first strand buffer (250 mM Tris-HCI (PH8.3), 375 mM KCI, 15 mM MgCI 2 ) 4 HL, RNase Out 1 n, and Superscript TM II RNase-Reverse Transcript Yuichi (Invitrogen) 1 nL was added. However, in Lane 2 only, 1 L of sterile water was added instead of Superscript TM II RNase-reverse transcriptase.
  • 5X first strand buffer 250 mM Tris-HCI (PH8.3), 375 mM KCI, 15 mM MgCI 2 ) 4 HL, RNase Out 1 n, and Superscript TM II RNase-Reverse Transcript Yuichi (Invitrogen)
  • the reaction was performed in 30 L containing 10 mM Tris-HCI (PH7.4), 5 mM EDTA (PH7,5), 300 mM NaCI, RNase A 0.25 mM, natural RNA or 80 pmol of 4'-thio RNA.
  • the above reaction solution was incubated at 0 ° C. Sampling was performed for 30 seconds, 1 minute, 3 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 4 L of the reaction solution, 10 M urea, 50 mM EDTA, XC (0.1%), and BPB (0.1%).
  • the reaction was stopped by mixing with the loading solution containing the mixture.
  • 4'-thio RNA Under conditions where natural RNA undergoes more than 90% in 30 seconds and undergoes enzymatic degradation, 4'-thio RNA showed high resistance, with a half-life of 12 minutes. The remaining amount of the full-length product after 1 hour of 4'-thio RNA is more than 100 times more stable than RNase A because the remaining amount of the full-length product of natural RNA after 30 seconds is larger than that of natural RNA. It became clear that it was.

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Description

明細書
4 ' ーチォヌクレオチド 技術分野
本発明は， ヌクレオチド類似体およびその製造方法に関する。 より詳細には， 本発明は， 4， ーチオリポヌクレオチドおよび 4， ーチす一 2 ' —デォキシヌク レオチド， これらのヌクレオチド類似体の製造方法， ならびにこれらのヌクレオ チド類似体を用いてオリゴヌクレオチドを製造する方法に関する。 背景技術
4 ' —チォヌクレオシドはフラノ一ス環の酸素原子が硫黄原子に置換されたヌ クレオシドの総称である。
Figure imgf000003_0001
4， ーチオリボヌクレオシドまたは 4 ' —チォ一 2， ーデォキシリボヌクレオ シドを含む R NAまたは D NAは， 種々のヌクレア一ゼに対して抵抗性を示すた め， 研究試薬および診断または治療用の薬剤として有用であることが示唆されて いる。 '
Bellonら (Biochem. Biophys. Res. Comm., 1992, 184, 797-803) は， 1 - ( 4—チォ一 j8— D—リポフラノシル） チミンを含むオリゴデォキシヌクレオチ ドの合成を記載する。 Bellonら (Nucleic Acids Res, 1993, 21 , 1587-1593) , Leydierら (Antisense Res. Dev. 1995, 5, 167-174) および Leydierら
(Nucleosides Nucleotides, 1995, 14, 1027-1030) は， 4 ' 一チォ一 j3— D—ォ リゴリポヌクレオチドが高いヌクレアーゼ耐性を有することを記載する。
Dukhanら (Nucleosides Nucleotides, 1999, 18 1423-1424) は， 4種の 4 ' 一 チオリポヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの合成を記載する。
Bellonら (Nucleic Acids Res., 1993, 21 , 1587-1593) は， 4， -チォゥリジン のみからなる RNAの分解酵素に対する抵抗性を調べ， 天然型 U6と比較して， 4 ' -SU6が種々の分解酵素に対して遙かに強い抵抗性を示すことを報告してい る。
一方， デォキシリポヌクレオシドに関しても， いくつかの合成例が報告されて いる。 Hancoxら （Nucleic Acids Res., 1993， 21， 3485-3491) は， 4， 一チォ一 2 ' ーデォキシチミジンおよびこれを含むオリゴデォキシリポヌクレオチドの合 成を記載する。 Boggonら (Nucleic Acids Res.， 1996, 24， 951 -961) は， 4， — チォー 2， ーデォキシチミジンを含む合成 D N Aオリゴマーの構造を記載する。
Jonesら (Nucleic Acids Res., 1996, 24, 41 7-4122) および Jonesら (Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7, 1275-1278) は， 4， —チォ _ 2， —デォキシヌクレ ォチドを含む合成 D NAオリゴマ一を記載する。 Kumarら （Nucleic Acids Res.， 1997, 25, 2773-2783) は， 4， —チォ— 2， —デォキシシチジンを含む合成 D NAオリゴマーを記載する。
しかし, これらのいずれのオリゴリポヌクレオチド， オリゴデォキシリボヌク レオチドも化学合成により製造されている。 この方法では， 長鎖のオリゴヌクレ ォチドを得ることは困難であり， かつコストが高い。
4， 一チォヌクレオシドから R NAポリメラーゼ， D N Aポリメラーゼ， リバ 一ストランスクリプターゼ等の酵素を用いてオリゴヌクレオチドを合成するため には， 4 ' 一チォヌクレオシドを三リン酸化することが必要である。
Alexandrovaら （Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 1995, 7, 237-242) は， 4， 一チォー 5—ェチルー 2， ーデォキシゥリジン 5， 一三リン酸の合成およ びこれが D NA合成酵素により認識されることを記載する。 しかし， この特定の 塩基以外の 4 ' 一チォデォキシリポヌクレオシド三リン酸または 4 ' ーチオリポ ヌクレオシド三リン酸はこれまでに得られていない。 これは， 立体選択的合成の 困難性のためであると考えられる。
したがって， 当該技術分野においては， RNAポリメラーゼ， D NAポリメラ ーゼ等の酵素により認識され伸長されることができる 4 ' 一チォヌクレオチドを 合成するための新規かつ改良された方法が求められている。
したがって， 本発明は， 新規ヌクレオシド三リン酸， およびこれを合成する方 法， ならびにこれらのヌクレオシド三リン酸を用いてオリゴヌクレオチドを製造 する方法を提供することを目的とする。 発明の開示
本発明は 式 I ：
Figure imgf000005_0001
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基である]
で表される 4 ' ーチオリポヌクレオチドを提供する。
本発明はまた， 式 I I ：
Figure imgf000005_0002
[式中， B ' はアデニン， グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよびヒポキ サンチンからなる群より選択される核酸塩基である]
で表される 4 ' —チォ一 2 ' —デォキシヌクレオチドを提供する。
本発明の 4 ' —チォヌクレオチド類は， ； R N Aポリメラーゼ， DNAポリメラ —ゼ等の酵素により認識され伸長されることができるため， ヌクレア一ゼに対し て抵抗性を有する; RNAまたは D NAを合成するためのモノマー単位として有用 である。
別の観点においては， 本発明は， 式 I ：
Figure imgf000005_0003
[式中， Bはアデニン, グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基である]
で表される 4 ' ーチオリポヌクレオチドを合成する方法を提供する。 該方法は, 式 I I I ：
Figure imgf000006_0001
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基であり， R 2および R 3はそれぞれ独立してヒ ド口キシル基の保護基である ]
の化合物を， 式 I V：
Figure imgf000006_0002
の化合物と反応させ， 得られた中間体をピロリン酸と反応させ， 次にョード酸化， 加水分解および脱保護することを含む。
さらに別の観点においては， 本発明は， 式 I I ：
Figure imgf000006_0003
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよびヒポキサ ンチンからなる群より選択される核酸塩基である] '
で表される 4 ' 一チォー 2， ーデォキシヌクレオチドを合成する方法を提供する。 該方法は， 式 V：
Figure imgf000006_0004
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよびヒポキサ ンチンからなる群より選択される核酸塩基であり， R 2はヒドロキシル基の保護 である]
を， 式 I V：
Figure imgf000007_0001
の化合物と反応させ， 得られた中間体をピロリン酸と反応させ， 次にョード酸化， 加水分解および脱保護することを含む。 '
本発明のさらに別の観点においては， 本発明は， 式 V I ：
Figure imgf000007_0002
[式中, Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基である]
のヌクレオチド単位を少なくとも 1つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法を 提供する。 該方法は， 本発明の 4 ' ーチオリポヌクレオチドの存在下で， R NA 合成酵素により R N A鎖伸長反応を行うことを特徴とする。 R N A合成酵素とし ては， R N Aポリメラーゼが挙げられる。
本発明のさらに別の観点においては， 本発明は， 式 V I I ：
Figure imgf000007_0003
[式中， Bはアデニン, グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよぴヒポキサ ンチンからなる群より選択される核酸塩基であ ]
のヌクレオチド単位を少なくとも 1つ含むォリゴヌクレオチドを製造する方法で あって， 本発明の 4 ' 一チォー 2 ' —デォキシヌクレオチドの存在下で， D NA 合成酵素により DNA鎖伸長反応を行うことを特徴とする。 DNA合成酵素とし ては， DNAポリメラーゼ， リバ一ストランスクリプターゼ， ターミナルデォキ シヌクレオチジルトランスフエラーゼが挙げられる。
本発明の方法により製造される， 4' ーチオリポヌクレオシドまたは 4' ーチ ォー 2' —デォキシリポヌクレオシドを含む RNAまたは DNAは， 種々のヌク レアーゼに対して抵抗性を示すため， 研究試薬および診断または治療用の薬剤と して有用である。 本発明にしたがえば， 酵素を用いてオリゴヌクレオチドを合成 することができるため， 従来の化学合成方法と比較して， より長い鎖のオリゴヌ クレオチドを簡便に製造することができる。 また， 本発明の方法により製造され る， 4' ーチオリポヌクレオシドを含む RNAは， 逆転写酵素により認識される ため， これをテンプレートとして cDNAを合成することができ， したがって， インビトロセレクションにおいて用いるのにきわめて有用である。 図面の簡単な説明
図 1は， 実施例 9に記載される 4' ーチォ UTPの合成スキームを示す。 図 2は， 実施例 10に記載される 4' ーチォ C TPの合成スキームを示す。 図 3は， 実施例 11に記載される 4' ーチォ AT Pの合成スキームを示す。 図 4は， 実施例 12に記載される 4' ーチォ G TPの合成スキームを示す。 図 5は， 実施例 13に記載される 4， 一チォ一 2， ーデォキシ UTPの合成ス キームを示す。
図 6は， 実施例 14に記載される 4， 一チォー 2， —デォキシ CTP， 4， - チォ一 2， ーデォキシ A T Pおよび 4， —チォ一 2， ーデォキシ G TPの合成ス キームを示す。
図 7は， T 7 RN Aポリメラーゼを用いる 4， ーチォ U TPの取り込み実験の 概要を示す。
図 8は， T 7 RNAポリメラーゼを用いる 4， ーチォ U TPの取り込み実験の 結果を示す。
図 9は， T 7 RNAポリメラーゼを用いる 4， ーチォ UTPおよび 4' —チォ C T Pの取り込み実験の概要を示す。 " 図 10は， T7 RNAポリメラーゼを用いる 4， ーチォ UTPおよび 4， ーチ ォ C T Pの取り込み実験の結果を示す。
図 11は， 4' —チォ UTPおよび 4' —チォ CTPを含有する RNAからの 逆転写酵素による c DNA合成実験の概要を示す。
図 12は， 4' —チォ UTPおよび 4' —チォ CTPを含有する RNAからの 逆転写酵素による c DN A合成実験の結果を示す。
図 13は， 4， —チォ UTPおよび 4， 一チォ CTPを含有する RNAの RN a s e耐性を示す。 発明の詳細な説明
本発明のヌクレオシド三リン酸は， 公知の 4ーチォ糖から出発して， 糖に塩基 を立体選択的に導入し， 次に 5' 位に選択的にリン酸基を導入することにより製, 造することができる。
4' 一チォゥリジンは， 4一チォ糖
Figure imgf000009_0001
の 2， 3および 5位のヒドロキシル基を適切に保護し， プンメラー
(Pummerer) 反応を用いて塩基を立体選択的に導入することにより得ることが できる。
Figure imgf000009_0002
[式中， R2および R3は， 独立してヒドロキシル保護基であり， ェと R および R 2と R 9は一緒になつて二官能性のヒド口キシル保護基であってもよ い] 。
R 3は， 電子供与性の置換基をもつァシル保護基であるほど立体選択性が向上し， 好ましくは 2， 4ージメトキシベンゾィル基である。
プンメラー反応によって得られた 18のゥリジン誘導体は， フッ化アンモニゥ ム， メチルァミンを用いて脱保護をおこない， 19の 4， —チォゥリジンへと変 換することができる。 次に， 19の 4， 一チォゥリジンより 4' —チォ UTPを 合成する （図 1) 。
19の化合物の 5' 位をモノメトキシトリチル化および 2' , 3' 位をァセチ ルイ匕して化合物 20を得る。 続いて脱モノメトキシトリチルイ匕を行い， 21のァ セチル体を得る。 得られた化合物 21より， Ecksteinらの方法 （Luding,丄 and Eckstein, F. (1989) J. Org. Chem" 54， 631-635) を応用して， 24の 4， 一チォ
UTPを合成する。 すなわち， サリチルホスホロクロリダイトを用いて 22の中 間体へと導き， ピロリン酸で処理して 23のシクロトリホスフアイト体へ誘導す る。 次にョード酸化， 加水分解および脱ァセチル化を経て， 目的物の 4' —チォ UTPを得ることができる。
28の 4， ーチォ C TPは, 25の N4 -べンゾィルー 4， -チオシチジンから， 上述の 4' ーチォ UTPと同様の工程により製造することができる （図 2) 。
4' ーチォ I T Pは， 4' ーチォヒポキサンチンから， 上述の 4' —チォ UT Pと同様の工程により製造することができる。
4' —チォ AT Pおよび 4， ーチォ GTPは， 図 3および図 4に記載されるス キームにより製造することができる。 すなわち， 2' ， 3' 位のヒドロキシル基 およびプリン環のアミノ基を適切に保護した後， 4' ーチォ C TPの製造と同様 に， Ecksteinらの方法 （上述） にしたがってサリチルホスホロクロリダイトと 反応させ， 次にピロリン酸と反応させてシクロトリホスフアイト中間体を得る。 続いてョード酸化， 加水分解および脱保護を行うことにより， 32の 4， ーチォ 八丁 ぉょび37の4' —チォ GTPを得ることができる。
4' 一チォー 2， —デォキシリポヌクレオシド三リン酸は， 4' ーチオリポヌ クレオシド三リン と同様に製造することができる。 出発物質としては 4' ーチ ォ— 2' —デォキシリポヌクレオシドを用レ 次に， サリチルホスホロクロリダ イトと反応させ， 得られた中間体をピロリン酸と反応させ， 次にョード酸化， 加. 水分解および脱保護することにより， 目的とする 4 ' —チォ—2， ーデォキシリ ポヌクレオシド三リン酸を得ることができる （図 5 , 6 ) 。
本発明の 4 ' ーチォヌクレオチド類は， ポリメラ一ゼを用いる D NAまたは R NAの合成反応の基質として用いることができる。 本発明の 4， ーチオリボヌク レオチドが RN Aポリメラーゼにより認識されることを確認するためには， 適切 なテンプレートの存在下で RNAポリメラーゼを作用させて， 4 ' —チオリポヌ クレオチドがオリゴマー中に取り込まれるか否かを調べる。 実施例 1 5および 1 6に示されるように， 本発明にしたがって合成した 4 ' ーチォヌクレオチドは T 7 RNAポリメラ一ゼにより認識され， 天然のヌクレオチドと同様に合成オリゴ マー鎖中に取り込まれることが見いだされた。
すなわち， 本発明の別の観点においては， 本発明は， 4 ' ーチォヌクレオチド 類を用いるオリゴヌクレオチドの製造方法を提供する。 オリゴヌクレオチドは， 本発明の 4 ' 一チォヌクレオシド三リン酸の存在下で， RNAまたは D NA合成 酵素 RNAポリメラーゼ， D NAポリメラーゼ等の酵素によりオリゴヌクレオチ ド鎖を伸長させることにより製造することができる。 R NA合成酵素としては， 種々の生物に由来する各種の RNAポリメラ一ゼを用いることができ， D NA合 成酵素としては種々の生物に由来する D N Aポリメラ一ゼ， リバーストランスク リプターゼ， ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ等を用いる ことができる。 伸長反応の条件は， 用いるポリメラーゼにより様々であるが， 当 業者は適切な反応条件を選択することができる。 反応においては， 本発明の 4 ' —チォヌクレオシド三リン酸に加えて， 天然のヌクレオシド三リン酸または当該 技術分野において知られる修飾ヌクレオシド三リン酸が存在していてもよい。
本発明の方法により得られるオリゴヌクレオチドは， ァンチセンスォリゴヌク レオチド， リポザィム， プライマ一， ァプ夕マー， アンチジーン， RNA i， s i RNA, プローブ等として， 診断， 治療および研究試薬として使用することが できる。 好ましくは， 本発明のオリゴヌクレオチドは約 6から約 5 0ヌクレオチ ドの長さである。 本発明のより好適な実施態様においては， オリゴヌクレオチド は約 1 2から約 2 0ヌクレオチドの長さである。 オリゴヌクレオチドは， 修飾さ れた糖， 例えば 2 ' 位に置換基を有する糖を含んでいてもよく， アデニン， グァ ニン， シトシン， チミン， ゥラシル以外の核酸， 例えばヒポキサンチン， 5—ァ ルキルシチジン， 5—アルキルゥリジン， 5 _ハロウリジン， 6—ァザピリミジ ン， 6—アルキルピリミジン等を含んでいてもよい。 また， ホスホジエステル以 外のヌクレオシド間結合， 例えばホスホロチォェ一卜結合を含んでいてもよい。 本発明のオリゴヌクレオチドは， ヌクレア一ゼ耐性および熱安定性が高いため, インビトロおよびインビポにおいて使用するのに適しており， 特に遺伝子治療に おいて有用である。 また， 本発明の 4 ' —チオリポヌクレオシドを含む R N Aは 逆転写酵素により認識されて c D NAが合成されるため， インビトロセレクショ ンにおいて用いるのにきわめて有用である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また， 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許出願 2 0 0 2 - 2 4 2 2 5 9号の明細書および図面に 記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。 実施例
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが， これらの実施例は本発明 の範囲を制限するものではない。
実施例においては， 次の略号を用いる
Bz
DMAP 4-
DMBz ジメ卜キシベンゾィル
DMTr 4，4'-ジメトキシトリチル
MMTr 4-メトキシトリチル
Ms メタンスルホニル
Tf トリフルォロエタンスルホニル
TFA トリフルォロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TIPDS 1 ,1 ,3,3-テトライソプロピルジシロキサン- 1，3-ジィル TMS トリメチルシリ^/
Ts p-トルエンスルホニル 実施例 1 2,3,5-トリ -0-P-メトキシベンジル -D-リビ I ル (3)の合成
D-リポース (60 g, 0.4 mol)をァリルアルコール（1.8 L, 26.4 mol)に溶解し， 濃 硫酸 (6.4 mL， 0.12 mol)を 0 °Cにて加え， その後室温にてオーバーへッドで撹拌 した。 次いで反応液に重曹を加えて中和し， 反応液をセライト濾過した。 得られ たろ液を減圧下にて溶媒留去し減圧乾燥して， 黄色油状の残渣を得た。 続いて水 素化ナトリゥム （64 g， 1.6 mol)の THF (700 mL)溶液に， 0°C下にて DMF (300 mL)に溶解した残渣を 3時間かけてカニュレ一ションした。 反応液を再び室温に 戻し 4時間撹拌した後， 再度 0°C下にて塩ィ匕パラメトキシベンジル（190 mL，1.4 mol)を 10 mL/ 15 min の速度で滴下した。 100 mL滴下したところで室温に戻し H2の発生状況をみながら， 慎重に滴下をつづけた。 滴下終了後， 室温にて撹拌 し， 13時間後水素化ナトリウム （4.0 g, 0.1 mol)と塩ィ匕パラメトキシベンジル
(30 ml_， 0.22 mol)を加えて 24時間撹拌し， 反応液を飽和塩化アンモニゥム水溶 液にて中和した。 つづいて酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を水 (X 3)， 飽和食塩水 (X 1)で洗浄し， Na2S04乾燥した。 ついで綿栓ろ過後に溶媒を留 去し， 得られた褐色の残渣を減圧乾燥後， クロ口ホルム (1.2 L)に溶解し， 酸素を 封入した。 そこに水 (800 mL)を加え塩化パラジウム (21.2 g, 0.12 mol)を加え， 50°Cにてォ一バーへッドで撹拌した。 9時間後に塩化パラジウム (7.0 g， 0.04 mol)を加え， 28時間後に反応液を室温に戻してセライトろ過し， 濃縮した後酢 酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を水 (X2), 飽和食塩水 (X 1)で洗浄し， Na2S04乾燥した。 ついで綿栓ろ過後に溶媒を留去し得られた褐色の残渣を減圧 乾燥した。 残渣を乾燥後， メタノール (1.2 L)に溶解し， アルゴン雰囲気下， 0°C にて水素化ホウ素ナトリゥム (30.3 g, 0.8 mol)を加え 20分撹拌後， 室温に戻して 撹拌した。 1時間後， 再び 0°Cにて水素化ホウ素ナトリウム (7.8 g, 0.2 mol)を加 え， 次いで室温に戻して撹拌した。 1.5時間後， 反応液の溶媒を留去し， 残渣を メタノールにて 2回共沸し， 残渣を酢酸ェチルに溶解し水で分液した。 有機層を 水 (X2)， 飽和食塩水 (X 1)で洗浄し， Na2S04乾燥した。 ついで綿栓ろ過後に溶 媒を留去し， 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 5:1 → 1 : 1)により精製し， 化合物 3(162.4 g， 79%)を無色透明の油状物質として得た。 1H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 7.30-6.81 (m， 12H, Ar)， 4.66-4.40 (m， 6H， CH2)， 3.94-3.53 (m， 16H, H-1,2, 3， 4, 5, MeOX3), 2.71 (brs, 1H, 4-OH), 2.36 (brs, 1H, 1-OH). 実施例 2 1,4-アンヒドロ- 2,3,5-トリ- O-p-メトキシベンジル -4-チォ -D-リビトー ル (5)の合成
アルゴン雰囲気下， 化合物 3(162 g， 0.32 mol)のピリジン溶液 (900 mL)に 0°C にて塩化メシル (122 mL， 1.6 mol)を加え， 同温度で 30分撹拌した。 次いで反応 溶液に氷を加え 20分撹拌した。 反応溶液を酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した 有機層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 (X2)， 飽和食塩水 (X1)にて洗浄し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し， トルエンで 3回共沸した。 残渣を減圧乾燥した後， アルゴン雰囲気下 MEK (1 L) に溶解し， 室温にて臭化 リチウム (278 g， 3.2 mol)を加えて加熱還流した。 12時間後反応液を室温に戻し， 酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を水 (X 2)， 飽和食塩水 (X1)にて洗 浄し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し， 得られた残渣を減 圧乾燥した後， アルゴン雰囲気下 DMF(1 L)に溶解し， 室温にて硫化ナトリウム- 九水和物 (92.2 g, 0.38 mol)を加え 100°Cにて 30分撹拌した。 次いで反応溶液を 室温に戻し， 酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を水 (X2), 飽和食塩 水 (X1)にて洗浄し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し， 得ら れた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 10:1 — 1 : 1) で粗精製した後， へキサン， 酢酸ェチルより再結晶した。 化合物 5 (69.1 g, 42%) を白色の結晶として得た。
H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 7.26-6.81 (m， 12H, Ar), 4.52-4.38 (m, 6H, CH2), 4.01-3.95 (m， 1H, H-2), 3.91 (t, 1H, H-3, J3)2=4.0, J3,4=4.0 Hz), 3.80 (s, 9H, MeO X3), 3.66-3.60 (m, 1H, H-4), 3.45-3.40 (m, 2H, H-5a, H-5b), 3.02 (dd, 1H, H-1a,
Figure imgf000014_0001
Hz). 実施例 3 1 ,4-アンヒドロ- 2-0-(4-メトキシベンゾィル )-3，5-0-(1，1 ,3，3-テトライ ソプロピルジシロキサン- 1 ,3-ジィル )-4-チォ -D-リビ I ^一ル Π 3b)の合成
アルゴン雰囲気下化合物 12(997 mg， 2.5 mmol)のピリジン溶液 (15 mL)に 0°C にて， 塩化 4-メトキシベンゾィル (723 L, 5.1 mmol)を加え， 室温にて 18.5時 間撹拌した。 反応液に氷を加え 10分間撹拌した。 次いで， 酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 (X3)，飽和食塩水 (X 1)で 洗浄し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去し， トルエンで 3回 共沸した。 得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 50 1 →35： 1)で精製し， 化合物 13b(1.3 g， 96<¼)を無色油状物質として得た。 FAB-LRMS m/z 527 (MH+).
FAB-HLRS計算値 C25H4206SSi2 (MH+) 527.2319.実測値 527.2311.
H NMR (400 MHz, CDCI3) δ： 7.95-6.61 (m， 4H， Ar), 5.71 -5.69 (m， 1 H， H-2), 4.35 (dd, 1 H, H-3 J3，2 =3.5， J3，4 =9.4 Hz), 4.12 (dd, 1 H， H-5a, J5a, 4 =2.9, J5a，5b =12.6 Hz), 3.98 (dd, 1 H, H-5b, J5b> 4 =3.2, J5b, =12.6 Hz), 3.69 (m， 1 H, H-4), 3.24 (dd, 1 H, H-1 β ,山 e, 2= 3.2, J1 /3 i =12.6 Hz), 3.04 (m， 6H, Me2N), 2.91 (d， H, H-1 a， J1 a， =12.6 Hz), 1.13-0.87 (m, 28H, TIPDS).
13C NMR (100 MHz, CDCI3) δ : 166.40， 153.59, 131 .73， 117.34, 110.94, 110.81 , 75.95， 75.21 , 60.16, 51.29, 40.44, 31.60, 17.84, 17.77, 17.70, 17.66， 17.52, 17.45, 13.87, 13.75, 13.15, 13.09. 実施例 4 1 ,4-アンヒドロ-2-0-(4-ジメチルァミノべンゾィル)-3,5-0-(1 ,1 ,3，3-テ トライソプロピルジシロキサン- 1，3-ジィル) -4-チォ -D-リビトール (13c)の合成
アルゴン雰囲気下 4-ジメチルァミノ安息香酸 (1.1 g, 6.4 mmol)の塩化メチレン 溶液 (40 mL)に， 塩化チォニル (933 L, 12.8 mmol)を加えて 2時間加熱還流し ながら撹拌し， 室温に戻して減圧下溶媒を留去した。 得られた残渣 (533 mg)を アルゴン雰囲気下化合物 12(375 mg, 0.96 mmol)のピリジン溶液 (5 mL)に 0°Cに て加え， 室温にて 8時間撹拌した。 8時間後再び先の残渣を (355 mg)を加え， 21 時間後ピリジン (5 mL)を加えて 50°Cにて 6時間加熱した。 反応夜に氷を加え 10 分間撹拌した。 次いで， 酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を飽和炭酸 水素ナトリゥム水溶液 (X3)，飽和食塩水 (X1)で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿栓濾 過後に減圧下溶媒を留去し， トルエンで 3回共沸した。 得られた残渣をシリカゲ ルクロマトグラフィー (へキサン: AcOEt = 50:1 →20:1)で精製し， 化合物 13c(476 mg, 92%)を無色油状物質として得た。
FAB-LR S m/z 540(MH+).
FAB-HLRS計算値 C26H45N05SSi2(MH+) 540.2635.実測値 540.2637.
1H NMR (400 MHz, CDCI3) <5： 7.95-6.61 (m， 4H， Ar), 5.71-5.69 (m， 1 H， H-2), 4.35 (dd, 1H， H-3 J3,2=3.5, J3,4=9.4 Hz), 4.12 (dd, 1H， H-5a， J5a> 4=2.9, J5a,5b =12.6 Hz), 3.98 (dd, 1H, H-5b, J5b,4=3.5, J5b,5a=12.6 Hz), 3.69 (m, 1H, H-4), 3.24 (dd, 1H, H-1 ]3,
Figure imgf000016_0001
Hz), 3.04 (m, 6H， Me2N) 2.91 (d, 1 H， H-1 a, J1a,le =12.6 Hz), 1.13-0.87 (m, 28H, TIPDS).
13C NMR (100 MHz, CDCI3) ά: 166.40, 153.59, 131.73, 117.34, 110.94, 110.81, 75.95, 75,21, 60.16， 50.03, 40.44, 31.60, 17.84, 17.77, 17.71, 17.67, 17.52，
17.45, 13.87, 13.75, 13.15, 13.09. 実施例 5 1,4-アンヒドロ- 2-0-(4-メトキシべンゾィル)-3，5-0-(1,1，3，3-テトライ ソプロピルジシ口キサン -1 ,3-ジィル) -4-チォ -D-リビトール -1 -ォキシド (14b)の合 迹
化合物 13b(1.1 g，2.3mmol)の塩化メチレン溶液 (20mL)に- 78°Cにてオゾンガ スを 20分間バプリングした。 反応液にオゾン臭が消えるまでアルゴンをバプリ ングした後， 室温まで昇温した。 減圧下溶媒を留去した後， 残渣をシリカゲルク ロマ卜グラフィ一 (へキサン: AcOEt = 4: 1 —1 :3)で精製し， 化合物 14b(1.0g， 82%)を無色あめ状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 543 (MH+).
FAB-HLRS計算値 C25H4207SSi2 (MH+) 543.2253.実測値 543.2251.
1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ： 8.06-6.90 (m， 4H， Ar), 5.84-5.82 (m， 1 H， H-2), 4.61 (d, 1H, H-5a,
Figure imgf000016_0002
Hz), 4.17 (dd, 1H， H-3 J3,2=3.5, J3,4=12.0 Hz), 3.86 (s, 3H， MeO), 3.61 (dd, 1H, H-1 , J13i2= 5.3, J1(3,1a =15.5 Hz), 3.48 (dd, 1H， H-4, J4，5b=2.1 , J4,3=12.0 Hz), 2.93 (d, 1 H, H-1 a , J1 a, 1 /3 =15.5 Hz), 1.09-0.87 (m， 28H, TIPDS).
3C NMR (100 MHz, CDCI3) <5： 165.42, 163.84, 132.20, 122.24, 113.96, 73.31， 73.15, 68.48， 55.79, 55.75, 54.59, 17.72, 17.64， 17.58， 17.54, 17.53, 17.49, 17.31 , 17.30, 13.81 , 13.51 , 13.02, 13.00. 実施例 6 1 -ί2-0-(4-メトキシトリチル) -3，5-0-(1 ,1 ,3,3-テトライソプロピルジシ 口キサン- 1 ,3-ジィル) -4-チォ- 3 -D-リポフラノシル 1ゥラシル (15b)
アルゴン雰囲気下， ゥラシル (408 mg)のトルエン懸濁液 (20 mL)に室温にてトリ ェチルァミン (1 , 0 ml_， 7.3 mmol), TMSOTf(2.6 mL, 14.6 mmol)を加え， 反応液 が二層の溶液になるまで撹拌した。 この反応溶液に塩化メチレン (10 mL)を加え, 一層の溶液とし， 室温にてこの反応溶液を化合物 14b(987 mg, 1 .8 mmol)の塩ィ匕 メチレン溶液 (20 mL)に 15分かけて滴下した。 続いてトリェチルァミン (1.0 mL， 7.3 mmol)のトルエン溶液 (10 mL)を室温にて 5分かけて滴下した。 反応溶液に氷 を加え， 10分間撹拌した後酢酸ェチルで希釈し， 水で分液した。 有機層を飽和 炭酸水素ナトリゥム水溶液 (X3)，飽和食塩水 (X 1)で洗浄し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へ キサン： AcOEt = 49: 1 →1 : 1)で精製し， 化合物 15b(904 mg，77%)を白色泡状 物質として得た。
FAB-LRMS m/z 637 (MH+).
FAB-HLRS計算値
Figure imgf000017_0001
637.2435. 実測値 637.2435.
1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ： 9.28 (br s, 1 H， NH)， 8.22 (dd, 1 H.H-6, J6, 5 =8.2), 8.02-6.94 (m, 4H， Ar), 6.01 (s， 1 H, H-1 ')， 5.76 (dd, 1 H, H-5, J5> 6 =8.2, J5， NH =2.1 Hz), 5.62 (d, 1 H， H-2'( J2', 3' =3.5), 4.45 (dd, 1 H, H-3' J3', 2' =3.5， J3', 4' =9.4 Hz), 4.18-4.06 (m， 2H, Η-5'a, Η-5'b), 3.87 (s, 3H， MeO), 3.73-3.71 (m, 1 H， H-4'), 1 .15- 0.86 (m, 28H, TIPDS).
13C NMR (100 MHz, CDCI3) δ : 164.01 , 163.38, 163.10, 15013， 140.653, 131 .79， 121.73, 113.53, 102.19, 102,17， 78.06, 71.24， 62.54, 57.92, 55.40， 55.39, 50.69, 17.47, 17.36, 17.34, 17.27, 16.99, 16.96, 16.83, 16.79, 13.34， 13.18, 13.10, 13.48. 実施例 7 1-ί5-0イ 4-メトキシトリチル) -2,3-0-ジァセチル -4-チォ -/3-D-リボフラ ノシル Iゥラシル (20)
アルゴン雰囲気下， 1 -(4-チォ -/3-D-リポフラノシル） ゥラシル (131 mg， 0.5 mmol;化合物 15を NH4F/MeOH, MeNHs/MeOHで脱保護することにより製造） のピリジン (4 mL)溶液に塩化 4-メトキシトリチル (232 mg, 0.75 mmol)を加え， 室温にて 14時間撹拌した。 アルゴン雰囲気下無水酢酸 (188 2 mmol), DMAP(5 mg, 0.05 mmol)を加え室温にて 2時間撹拌した。 メタノールを加えて 30分撹拌し， 反応液を減圧下溶媒留去した。 残渣を酢酸ェチルに溶解し， 水で 分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 (X3)，飽和食塩水 (X1)で洗浄 し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。 残渣をシリカゲル クロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 2: 1 →1 :1)で精製し， 化合物 20(214 mg, 70%)を無色透明の固体として得た。
1H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 8.07 (br s, 1 H, NH), 7.77 (d, 1H'H-6， J6,5 =7.9)， 7.47-6.85 (m， 14H, MMTr), 6.37 (d, 1H, H-1 '，山.， 2' =7.3)， 5.68 (dd, 1H, Η-2', J2., =7.3, J2',3. =4.0), 5.54-5.51 (m， 1H, H-3'), 5.62 (dd, 1H, H-5, J5,6=7.9, J5， NH =2.6Hz), 3.81 (s, 3H， MeO), 3.62-3.53 (m， 2H， Η-5'a, H-4')， 3.40-3.35 (m， 1H, H- 5'b), 2.12-2.00 (m， 6H， AcOX2). 実施例 8 1イ 2,3-0-ジァセチル -4-チ才-3 -D-リポフラノシル)ゥラシル (21) 化合物 20(199 mg, 0.32 mmol)を 80%酢酸水溶液に溶解し， 室温にて 11時間撹 拌した。 反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に滴下し， 酢酸ェチルで分液し た。 水層をクロ口ホルムで 7回抽出し， 有機層を飽和食塩水 (X1)で洗浄し， Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。 残渣をシリカゲルクロ マトグラフィ一(へキサン ： AcOEt = 2: 1 →AcOEt)で精製し， 化合物 21 (93 mg, 84%)を白色泡状物質として得た。
1H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 8.23 (brs, 1H, NH), 8.08 (d, 1H,H-6, J6,5 =7.9)， 6.36 (d, 1H, H-1',山 ',2. =7.3), 5.85 (m， 1H, H-5), 5.69 (dd, 1H, H-2', J2',i'=7.3, J2',3' =4.0), 5.49 (m， 1H， H-3'), 4.16-4.04 (m, 1H， Η-5'a), 3.86-3.82 (m， 1H， Η-5'b), 3.56-3.55 (m， 1 H, H-4')， 2.42 (br s， 1 H, OH), 2.17 (s， 3H， AcO), 2.06 (s， 3H， AcO) 実施例 9 4'-チォゥリジン 5'-三リン酸（24)
化合物 21 (89 mg, 0.26 mmol)をピリジン共沸し， ピリジン (260 2し)に溶解し た。 アルゴン雰囲気下， ジォキサン (780 し)を加え， 室温にて撹拌した。 サリ チルホスホロクロリダイト (58 mg, 2.9 mmol)のジォキサン溶液を加えて 10分撹 拌した。 0.5M ビスブチルアンモニゥムピロリン酸の DMF溶液 (780 L)を加え, プチルァミン (260 し)を素早く加え 10分攪拌した。 ピリジン /水 (98/2, v/v) 中 1 %ヨウ素 (5 mL)を加え， 5分攪拌した。 5%亜硫酸水素ナ卜リゥム水溶液を数 滴加え 40分攪拌した。 反応液にアンモニア水を (8 mL)加え 3.5時間攪拌し， 減 圧下溶媒留去した。 残渣を水 300 mLに溶解し， イオン交換クロマトグラフィー (H20→ 1 N TEAB )にて精製したのち， 塩交換カラム (H+型)にて精製し， 減圧 下溶媒留去した。 残渣を水 5 mLに溶解し， 塩交換カラム (Na+型)にて精製し， 減圧下溶媒留去した。 化合物 24(80 mg， 55%)を薄黄色油状物質として得た。
FAB-HRMS計算値 C9H12N2Na3O14P3S (M+)563.8893.実測値 563.8892
3 P-NMR(108 MHz, D20) δ： -5.68 (d, J = 20 Hz), -10.56 (d, J = 20 Hz), -21.27 (t， J = 20 Hz). 実施例 1 0 4'-チォ CTP (28) の合成 （図 2 )
N4-ベンゾィル -1-[5-0-(4-メトキシトリチル) -2,3-0-ジァセチル -4-チオ - D-リポ アルゴン雰囲気下， 化合物 25(302 mg, 0.83 mmol)のピリジン (10 mL)溶液に 塩化 4-メトキシ卜リチル (383 mg, 1.2 mmol)を加え， 室温にて 9時間撹拌した。 アルゴン雰囲気下， 無水酢酸 (313 し 3.32 mmol)を加え室温にて 3時間撹拌し た。 メタノールを加えて 5分撹拌し， 反応液を減圧下溶媒留去した。 残渣を酢 酸ェチルに溶解し， 水で分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (X 3)，飽和食塩水 (X 1)で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去 した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン： AcOEt = 2: 1 →
AcOEt)で精製し， 化合物 26 (579 mg， 97%)を白色の泡状物質として得た。 FAB-LRMS m/z 720 (MH+)
1H麵 R (400 MHz, CDCI3) δ： 8.86 (br s, 1 H， NH), 8.32 (d, 1 H,H-6, J6, 5 =7.6), 7.89-7.88 (m, 2H, o-Bz), 7.61-7.27 (m, 15H, MMTr, m-Bz, p-Bz, H-5), 6.90-6.87 (m, 2H, MMTr), 6.53 (d, 1 H, H-1 ', Jr,2'=6.2)， 5.70-5.68 (m， 1 H, H-3'),5.17 (m, 1 H, H-2'), 3.82 (s， 3H， eO), 3.63-3.56 (m, 2H, Η-5'a, H-4'), 3.46-3.44 (m, 1 H， H- 5'b)，2.08 (s, 3H， AcO), 2.06 (s， 3H， AcO).
N4-ベンゾィル -1 -(2,3-0-ジァセチル -4-チォ- /3 -D-リポフラノシル)シトシン (27) 化合物 26(420 mg， 058 mmol)を 80%酢酸水溶液に溶解し， 室温にて 24時間 撹拌した。 反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に滴下し， クロ口ホルムで分 液した。 水層をクロ口ホルムで 3回抽出し， 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液 (X 1)，飽和食塩水 (X 1)で洗浄し Na2S〇4乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶 媒を留去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 1 : 1 →AcOEt アセトン： AcOEt = ： 3)で精製し， 化合物 27(239 mg, 92%)を白 色泡状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 448 (MH+)
1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ : 9.11 (br s, 1 H, NH), 8.75 (d, 1 H,H-6, J6, 5 =7.6), 7.86-7.84 (m， 2H， o-Bz), 7.60-7.43 (m, 4H， H-5, m-Bz, p-Bz), 6.45 (d, 1 H, H-1 ', Jr, 2' =6.7)， 5.83-5.80 (m, 1 H， H-3')， 5.58-5.68 (m, 1 H, H-2'), 4.45 (br s, 1 H, OH), 4.07-4.04 (m, 1 H, Η-5'a), 3.90-3.86 (m, 1 H， Η-5'b), 3.61 -3.60 (m， 1 H， H-4'), 2.11 (s， 3H， AcO), 2.01 (s, 3H， AcO)
4'-チオシチジン 5'-三リン酸 (28)
化合物 24の合成と同様， 化合物 27(71 mg, 0.16 mmol)をサリチルホスホロク 口リダイト (50 mg, 0.24 mmol)と処理することにより， 化合物 28(68 mg, 75%) を白色の粉状物質として得た。
FAB-HRMS 計算値 C9H12N3Na3013P3S (M-H)+ 563.8893. 実測値 563.8892. 31P-NMR(108 MHz, D20) δ： -6.28 (d, J = 20 Hz), -10.49 (d, J = 20 Hz), -21.24 (t， J = 20 Hz). 実施例 1 1 4'-チォ ATP (32) の合成 （図 3 )
N6-ベンゾィル -9-[5-0-(4-メトキシトリチル) -2,3-0-ジァセチル -4-チォ- β -D-リポ フラノシル]アデニン (30)
アルゴン雰囲気下， 化合物 29(77 mg， 0.2 mmol)のピリジン (2mL)溶液に塩化 4-メトキシトリチル (92 mg， 0.3 mmol)を加え， 室温にて撹拌した。 12時間後， さらに塩化 4-メトキシトリチル (92 mg， 0.3 mmol)を加え， 室温にて撹拌した。 24時間後， 反応液に無水酢酸 (94 ii L, 1.0 mmol)を加え室温にて 12時間撹拌し た。 反応液に氷水を加えて 5分撹拌した後， 減圧下溶媒留ました。 残渣を酢酸 ェチルに溶解し， 水で分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (X3)， 飽和食塩水 (X 1)で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後， 減圧下溶媒を留去し た。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィ一 (へキサン ： AcOEt = 1： 2→AcOEt)で 精製し， 化合物 30(100 mg， 68%)を無色のグラス状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 730 (MH+).
H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 8.99 (br s, 1 H), 8.74 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 8.02 (m, 2H), 7.64-7.28 (m， 15H)， 6.86 (m, 2H), 6.31 (d, 1 H, J = 7.3), 6.02 (m， 1 H), 5.72 (m， 1 H), 3.80 (s, 3H)， 3.68 (m， 1 H), 3.55 (m， 2H), 2.14 and 1.98 (each s, each 3H). ' N6-ベンゾィル -9-(2，3-0-ジァセチル -4-チォ- 8 -D-リポフラノシル)アデ二ン (31) アルゴン雰囲気下， 化合物 30(104 mg， 0.14 mmol)の塩化メチレン (2mL)溶液 に 0°C下， トリフルォロ酢酸 (20 L)を加えた後， 室温に昇温し 5時間撹拌した。 反応液にトリェチルァミン (140 を加え減圧下溶媒を留去した。 残渣をシリカ ゲルクロマトグラフィー (AcOEt : アセトン = 0 : 1→1 : 2)で精製し， 化合物 31 (53 mg, 79%)を白色泡状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 472 (ΜΗ+)·
1H NMR (270 MHz, CDCI3) δ : 8.98 (br s, 1 H)， 8.81 (s， 1 H)， 8.19 (s， 1 H)， 8.00 (m， 2H), 7.59-7.48 (m， 3H), 6.28 (m， 1 H), 6.14 (d, 1 H, J = 7.3), 5.69 (m， 1 H), 4.75 (m， 1 H), 4.09 (m, 1 H)， 3.93 (m， 1 H)， 3.66 (m, 1 H)， 2.16 and 1 .95 (each s, each 3H). 4'-チオアデノシン 5'-三リン酸 (32)
化合物 24の合成と同様, 化合物 31 (53mg， 0.11 mmol)をサリチルホスホロク 口リダイ卜 (25 mg， 0.12 mmol)と処理することにより化合物 32 (45 mg， 68%)を 白色の粉状物質として得た。
FAB-HRMS計算値 C10H13N5Na3O12 P3S (MH+) 589.9265.実測値 589.9268. 31P-NMR(108 MHz, D20) δ： -5.30 (d, J = 20 Hz), -10.39 (d, J = 20 Hz), -20.88 (t, J =20 Hz). 実施例 1 2 4'-チォ GTP (37) の合成 （図 4 )
Ν2-(Ν，Ν'-ジブチルアミノメチレン) -9-(4-チォ - J3 -D-リポフラノシル)グァニン (34) アルゴン雰囲気下， 化合物 33(106 mg， 0.46 mmol)の DMF(3 mL)溶液に Ν,Ν'- ジブチルホルムアミドジメチルァセタール (302 ΐ, 0.92 mmol)をカロえ, 室温に て 3.5時間撹拌した。 反応液を減圧下溶媒留去した後， 残渣をシリカゲルクロマ トグラフィ一 (20%MeOH in CHCI3)で精製し， 化合物 34(139 mg， 69%)を白色の 固体として得た。
FAB- HRMS計算値 C19H30N6O4S (MH+) 439.2153.実測値 439.2156.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ： 8.54 (s， 1 H， N=CH)， 8.08 (s, 1 H， H-8), 5.74(d， 1 H， H-1 *, Jr, 2' =6.6), 5.48(d, 1 H, 2'-OH, J2'-OH'，2' =6.0)， 5.31 (d, 1 H, 3'-OH， J3'-OH', 3， =4.5)， 5.14(m， 1 H, 5'-OH), 4.60-4.55 (m, 1 H, H-2'), 4.19-4.17 (m, 1 H， H-3'), 3.80- 3.55 (m, 2H， Η-5'a, b), 3.48-3.48 (m, 5H， H-4', n-Bu), 1.56-0.82(m, 14H， n-Bu).
N2-(N,N'-ジブチルアミノメチレン) -9-[5-0-(4-メトキシ卜リチル )-2,3-0-ジァセチ ル _4_チォ - i3 -D-リボフラノシル】グァニン (3δ)
アルゴン雰囲気下， 化合物 34(135 mg, 0.31 mmol)のピリジン (4mL)溶液に塩 ィ匕 4-メトキシトリチル (143 mg, 0.47 mmol)を加え， 室温にて撹拌した。 23時間 後， さらに塩化 4-メトキシトリチル (47 mg, 0.16 mmol)を加え， 室温にて撹拌し た。 71時間後， 反応液に無水酢酸 (117 z L, 1.24 mmol)を加え室温にて 3時間撹 拌した。 反応液にメタノールを加えて 5分撹拌した後， 減圧下溶媒留去した。 残渣を酢酸ェチルに溶解し， 水で分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水 溶液 (X3), 飽和食塩水 (X 1)で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後， 減圧下溶 媒を留去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 1 : 2 →AcOEt)で精製し， 化合物 35(158 mg, 64%)を白色の泡状物質として得た。
FAB-HRMS計算値 C43H50N6O7S (MH+) 795.3528.実測値 795.3519.
1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ： 8.64 (s, 1 H， N=CH)， 8.44(br s, 1 H，NH)， 8.00(s, 1 Η,Η-8), 7.47-7.44 (m, 2H， o-Bz), 7.35-7.21 (m, 14H， MMTr, m-Bz, p-Bz), 6.86- 6.83 (m， 2H, MMTr), 6.08-6.05 (m， 1 H , H-3'), 5.87(d， 1 H， H-1 '，山', 2' =4.3), 5.56- 5.12 (m, 1 H, Η-2'), 3.80 (s， 3H， MeO), 3.77-3.70 (m， 1 H, Η-5'a), 3.48-3.29 (m， 6H, H-4', n-Bu, Η-5'b), 2.08 (s, 3H， AcO), 2.01 (s， 3H, AcO), 1.65-0.94(m, 14H, n-Bu).
N2-(N，N'-ジブチルァミノメチレン) -9-(2，3-0-ジァセチル -4-チォ- ]3 -D-リポフラノ シル)グァニン (36)
アルゴン雰囲気下， 化合物 35 (150 (119, 0.19 |7^01)の塩ィ匕メチレン(3 し)溶液 に 0°C下， トリフルォロ酢酸 (30 x L)を加えた後， 室温に昇温し 5時間撹拌した。 次いで， 反応液にトリエヂルァミン (120 し)を加え減圧下溶媒を留去した。 残渣 をシリカゲルクロマトグラフィー (AcOEt : アセトン = 3: 1 →1 : 1)で精製し， 化合物 36 (93 mg, 92%)を白色泡状物質として得た。
FAB-HRMS計算値 C23H34N606S (MH+) 523.2339.実測値 523.2346.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ :8.60 (s， 1 H， N=CH), 8.07 (s， 1 H.H-8), 6.13- 6.11 (m， 1 H， H-2'), 6.06 (d, 1 H, H-1 ',山 .，2' =6.2), 5.69-5.67 (m, 1 H， H-3'), 5.43- 5.41 (m, 1 H, 5'-OH), 3.84-3.79 (m, 1 H， Η-5'a), 3.74-3.66 (m， 1 H， Η-5'b), 3.59- 3.54 (m， 1 H, H-4'), 3.48-3.34 (m, 4H， n-Bu), 2.08 (s, 3H, AcO), 1.97 (s， 3H, AcO), 1.61-0.89 (m, 14H, n-Bu).
4'-チォグアノシン 5'-三リン酸 (37)
化合物 24の合成と同様， 化合物 36 (52mg，0.1 mmol)をサリチルホスホロク 口リダイト (20 mg, 0.15 mmol)と処理することにより化合物 37(25 mg, 41%)を 白色の粉状物質として得た。 FAB-HRMS計算値 C10H14N5Na3O13 P3S (MH+) 605.9215.実測値 605.9214. 31P-NMR(108 MHz, D20) δ ： -5.15 (d, J = 20 Hz), -10.41 (d， J = 20 Hz), -20.79 (t， J =20 Hz). 実施例 1 3 4'-チォ -2'-デォキシ UTP (45) の合成 （図 5 )
1 -[2-プロモ-2-デォキシ-3，5-0-(1，1 ,3，3-テトライソプロピルジシロキサン- 1，3-ジ ィル) -4-チォ- 3 -D-リポフラノシル]ゥラシル (40)
化合物 39 (757 mg, 1.5 mmol)のジクロロメタン (15 mL)溶液にジメチルァミノ ピリジン (733 mg, 6.0 mmol), トリフルォロメ夕ンスルホン酸無水物 (0.5 mL, 3.0 mmol)を加え， 室温で 1 0分撹拌した。 反応液に酢酸ェチルを加え， 水で分液し た。 有機層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 (X3)，飽和食塩水 (X 1)で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。 得られた残渣をトルェ ンで共沸した後， 1，4-ジォキサン （15 mL)に溶解した。 その溶液に臭化リチウム (195 mg, 2.25 mmol)と三フッ化ホウ素ージェチルエーテルコンプレックス (285 μ±, 2.25 mmol)を加え, 50 °Cで 1 .5時間加熱した。 反応液に酢酸ェチルを加え， 水で分液した。 有機層を飽和食塩水 (X 1)で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿栓濾過 後に減圧下溶媒を留去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 2:1→1 :1)で精製し， 化合物 40 (561 mg, 66%)を白色の泡状物質として 得た。
FAB-LRMS m/z 566, 568 (MH+)
1H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 8.65 (br s, 1 H), 8.41 (d, 1 H， J =8.6), 5.99 (s, 1 H), 5.68 (dd, 1 H, J = 2.0 and 8.6)， 4.31 (m， 1 H)， 4.14-3.98 (m, 3H)， 3.67 (m, 1 H), 1.57-0.92 (m, 28H). 1 -【2-デォキシ -3,5-0-(1 ,1，3,3-テトライソプロピルジシロキサン- 1，3-ジィル )-4-チ ォ - jS -D-リポフラノシル】ゥラシル (41 )
化合物 40 (519 mg, 0.92 mmol)のジクロロメタン (15 mL)溶液に水素化トリブ チルスズ (371 [1 L, 1.38 mmol)続いて V-70 (57 mg, 0.18 mmol)を加え室温で 1 0 分間撹拌した。 溶媒を留去し， 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサ ン ：八(；0 1 = 10:1→2:1)で精製し， 化合物 41 (440 mg， 98%)を白色の泡状物質 として得た。
FAB-LRMS m/z 487 (MH+)
1H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 8.62 (br s, 1 H), 8.28 (d, 1 H, J ==8.6), 5.97 (d, 1 H， J = 6.6), 5.68 (dd， 1 H, J = 2.0 and 8.6), 4.37(m, 1 H)， 4.11 (dd, 1 H, J = 3.3 and 12.5), 3.30 (m, 1 H), 2.45 (m, 1 H)， 2.24 (m， 1 H)， 1.61-0.94 (m， 28H).
1 -(2-デォキシ -4-チォ- /3 -D-リポフラノシル)ゥラシル (42)
化合物 41 (437 mg， 0.9 mmol)のメタノール (20 mL)溶液にフッ化アンモニゥム (666 mg， 18 mmol)を加え， 70 °Cで加熱還流した。 1時間後溶媒を留去し， 残 渣をシリ力ゲルク口マトグラフィー (MeOH in CHCI3 = 5%→25%)で精製し， ィ匕 合物 42 (193 mg, 88%)を白色固体として得た。
FAB-LRMS m/z 245 (MH+)
1H NMR (270 MHz, DMSO-d6 + D20) 6： 7.95 (d, 1 H， J = 7.9), 6.22 (dd, 1 H, J = 7.4 and 8.0)， 5.65 (d, 1 H, J = 7.9), 4.31 (m, 1 H)， 3.54 (m， 1 H)， 3.26 (m， 1 H)， 2.13 (m, 2H).
1-【2-デォキシ -5-0-(4，4'-ジメトキシ卜リチル) -3-0-ァセチル -4-チォ- β -D-リポフ ラノシル]ゥラシル (43)
アルゴン雰囲気下， 化合物 42(122 mg, 0.5 mmol)のピリジン (3 mL)溶液に塩 化 4,4'-ジメトキシトリチル (203 mg, 1.5 mmol)を加え， 室温にて 12時間撹拌し た。 アルゴン雰囲気下, 無水酢酸 (141 L， 3.32 mmol)を加え室温にて 1時間撹 拌した。 メタノールを加えて 5分撹拌し， 反応液を減圧下溶媒留去した。 残渣 を酢酸ェチルに溶解し， 水で分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 ( 3)，飽和食塩水(ズ1)で洗浄し^2304乾燥した。 綿栓濾過後に減圧下溶媒を留 去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキサン ： AcOEt = 2:1→1 :2)で 精製し， 化合物 43(233 mg, 79%)を白色の泡状物質として得た。
FAB-LRMS m/z 589 (MH+)
H NMR (270 MHz, CDCI3) δ： 8.24 (br s， 1 H)， 7.65 (d, 1 H, J = 8.0)， 7.42-7.25 (m, 9H), 6.83 (m, 4H)， 6.44 (m, 1 H), 5.41 (m, 2H)， 3.78 (s, 6H)， 3.59 (m, 1 H)， 3.48 (m, 1 H), 3.29 (m, 1 H), 2.46 (m, 1 H), 2.11 (m, 1 H), 2.09 (s, 3H).
1 -[2-デォキシ -3-0-ァセチル -4-チォ - ;8 -D-リポフラノシル】ゥラシル (44)
化合物 43(420 mg， 058 mmol)のジク口ロメ夕ン溶液 （2 mL) に卜リフルォ口 酢酸 （200 ii L) を加え， 室温で撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで希釈し， 飽和 炭酸水素ナトリゥム水溶液 (X 2)，飽和食塩水 (X 1 )で洗浄し Na2S04乾燥した。 綿 栓濾過後に減圧下溶媒を留去した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (へキ サン ： AcOEt = 1 :2→AcOEt)で精製し， 化合物 44 (30 mg， 32%)を白色泡状物質 として得た。
FAB-LRMS m/z 287 (MH+)
1H N R (270 MHz, CDCI3) δ： 9.25 (br s, 1 H), 8.07 (d, 1 H, J = 8.0), 6.43 (m， 1 H), 5.79 (d, 1 H， J = 8.0), 5.41 (m, 1 H), 3.98 (m, 1 H), 3.77 (m, 1 H), 3.57 (m, 1 H)， 2.75 (br s， 1 H), 2.50 (m, 1 H)， 2.35 (m， 1 H), 2.09 (s， 3H).
4'-チォ -2'-デォキシゥリジン 5'-三リン酸 (45)
化合物 24の合成と同様， 化合物 44 (28 mg， 0.1 mmol)をサリチルホスホロク 口リダイト (30 mg, 0.15 mmol)と処理することにより化合物 45 (40 mg， 72%)を 白色の粉状物質として得た。
FAB-HRMS計算値 C9H13N2Na3013P3S (MH+) 550.9044.実測値 550.9023.
31P-NMR(108 MHz, D20) δ： -6.51 (d， J = 20 Hz), -10.42 (d， J = 20 Hz), -21 .08 (t， J = 20 Hz). 実施例 1 4 4'-チォ -2'-デォキシ CTP (47), -ΑΤΡ (49), および -GTP (51 ) の合成 (図 6 )
4'-チォ -2'-デォキシシチジン 5'-三リン酸 (47)
化合物 24の合成と同様， 化合物 46 (39 mg, 0.1 mmol)をサリチルホスホロク 口リダイト (30 mg, 0.15 mmol)と処理することにより化合物 47 (36 mg, 65%)を 白色の粉状物質として得た。 FAB-HRMS計算値 C9H14N3Na3012P3S (MH+) 549.9204.実測値 549.9219. 31P-躍 R(108 MHz, D20) δ： -6.18 (d， J = 20 Hz), -10.37 (d， J = 20 Hz), -21.21 (t， J = 20 Hz). 4'-チォ -2'-デォキシアデノシン 5'-三リン酸 (49)
化合物 24の合成と同様， 化合物 48 (41 mg, 0.1 mmol)をサリチルホスホロク 口リダイト (30 mg, 0.15 mmol)と処理することにより化合物 49 (35 mg, 61%)を 白色の粉状物質として得た。
FAB-HRMS 計算値 C10H14N5Na3O11P3S (MH+) 573.9316.実測値 549,9237. 31P-NMR(108 MHz, D20) δ :-5.54 (d, J = 20 Hz), -10.54 (d， J = 20 Hz), -20.64 (t, J = 20 Hz).
4'-チォ -2'-デォキシグアノシン 5'-三リシ酸 (51)
化合物 24の合成と同様， 化合物 50 (46 mg， 0.1 mmol)をサリチルホスホロク ロリダイト (30 mg, 0.15 mmol)と処理することにより化合物 51 (32 mg, 55%)を 白色の粉状物質として得た。
FAB-HRMS計算値 C10H14N5Na3O12P3S (MH+) 589.9265. 実測値 589.9239· 31P-NMR(108 MHz, D20) δ： -5.30 (d, J = 20 Hz), -10.68 (d, J = 20 Hz), -20.60 (t, J = 20 Hz). 実施例 1 5 T7 RNAポリメラーゼによる 4'-チォ UTPの RNA鎖への取り込み 実施例 9で得られた 4'-チォ UTPを用いて， T7 RNAポリメラーゼを用いた取 り込み実験を行った。 実験には， T7プロモーター配列を含む二本鎖 DNAを用 いた （図 7 ) 。 ATP, GTP, CTP, UTPすべてのヌクレオチドが存在する場合， 図 に示される相補的な 26 merの RNAが合成されるはずである。
反応は， 40 mM Tris-HCI, PH8.0, 8 mM MgCI2 2 mMスペルミジン， 5 mM DTT, 0.4 mM NTP, 17nM [ r -32P]GTP, 2.0 / M テンプレート DNAおよび 10OUの T7 RNAポリメラーゼを含む 20 し中で行つた。 NTPはそれぞれ， ( 1 ) GTP, ( 2 ) GTP + ATP, ( 3 ) GTP + ATP + CTP, ( 4 ) GTP + ATP + CTP + UTP, および ( 5 ) GTP + ATP + CTP + 4'-チォ UTPであった。 上記の 反応溶液を 37°Cで 3時間インキュベーションし， 反応を停止した。 つづいて， 20%変性ポリアクリルアミドゲル (30 X 40 X 0.05 cm, 1800 V， 1 時間， 1 X TEB)に て電気泳動を行い， オートラジオグラフィ一にて解析した。
結果を図 8に示す。 レーン 1では， Gの 2 merと 3merに対応するバンド， お よびラダーが見られた。 レーン 2では予測された 6merで鎖伸長の停止したバン ドが観察され， さらに 1残基伸長したバンドがわずかに見られた。 レーン 3で は予測された 9merで鎖伸長の停止したバンドが観察され， さらに 1残基伸長し たバンドがわずかに見られた。 レーン 4では全長産物である 26merのパンドが 観察された。 UTPのかわりに 4'-チォ UTPを用いたレーン 5では， レーン 4と ほぼ同程度の割合で全長産物のバンドが観察された。 すなわち， 4'-チォ UTPも 天然の UTPと同様に T7 RNAポリメラ一ゼにより基質として認識され， RNA鎖 に取り込まれることが示された。 実施例 1 6 T7 RNAポリメラーゼによる 4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTPの RNA鎖への取り込み
4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTPを用いて， T7 RNAポリメラ一ゼを用いた取 込み実験を行った。 実験には， T7プロモ一夕一配列を含む 47mer 2本鎖 DNA を用いた （図 9 ) 。 ATP, GTP, CTP, UTPすべてのヌクレオチドが存在する場合, 図に示される 30merの RNAが合成されるはずである。
反応は， 40 mM Tris-HCI, pH8.0， 8mM MgCI2, 2mMスペルミジン， 5mM DTT, 0.4 mM NTP, 17 nM [ r -32P]GTP, 2.0 uM テンプレート DNAおよび 100Uの T7 RNAポリメラ一ゼを含む 20 / L中で行った。 NTPはそれぞれ 1 ) ATP, GTP, CTP, UTP, 2 ) UTPの代わりに 4'-チォ UTPを用いた系， 3 ) CTPの代わりに 4チォ C†Pを用いた系， 4 ) UTPおよび CTPを 4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTPに置き換えた系であった。 上記の反応溶液を 37 で 3時間ィンキュベー 卜し， 反応を停止した。 つづいて， 20%変性ポリアクリルァミドゲル （30 X 40 X 0.05 cm， 1800 V， 1時間， 1 XTEB) にて電気泳動を行い， オートラジオグラ フィ一にて解析した。 UTPの代わりに 4'-チォ UTPを用いた系， CTPの代わりに 4'-チォ CTPを用 いた系， 両 NTPを修飾 NTPに置換した系のいずれにおいても， 全長産物であ る 30 mer RNAが観察された。 天然 NTPを用いた場合の転写効率を 100とした 場合の相対効率を図 1 0に示す。 この結果から， 4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTPも T7 RNAポリメラーゼにより基質として認識され， RNA鎖に効率よく取 り込まれることが示された。 実施例 1 7 4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTP含有 RNA鎖からの cDNAの合成 実施例 1 6において転写反応によって得られた 4'-チォ RNAをテンプレートと し， 逆転写酵素を用いて， cDNAが得られるかについて検討した。 本実験を行う ためには， より鎖長の長い RNAが必要であり， 図 1 1に示す 76mer 2本鎖 DNAをテンプレートとして用いた。 まず GTP， ATP, 4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTP存在下， T7 RNAポリメラーゼによる転写反応を行った。 反応は実施例 1 6と同様の条件で行い， 効率良く 4'-チォ RNAへと転写できた。 得られた 59merの 4'-チォ RNAをテンプレートとして逆転写酵素による cDNAへの逆転 写を行った。
反応は以下の方法で行った。 5'末端をラジオラベルしたプライマー 4 i L(20pmol), 59merRNA 6 β Ι (20 pmol),を混和後それぞれの溶液に以下の dNTP を加えた。
レーン 1 ： プライマー
レーン 2 ： 酵素なし
レーン 3およびレーン 7 dTTP
レーン 4およびレーン 8 dTTP, dTCP
レーン 5およびレーン 9 dTTP, dCT dATP
レーン 2およびレーン 6およびレーン 1 0 ： dTTP, dCTP, dATP, dGTP 以上各々の反応溶液を 70°C, 15分ィンキュベートし， ただちに 0でにて 1分 以上インキュベートした。 ついで上記の溶液に 0.1 M DTT 2 L，5 Xファースト ストランドバッファ一 （250mM Tris-HCI(PH8.3), 375mM KCI, 15mM MgCI2) 4 H L， RNase Out 1 nし， Superscript™ II RNase—リバーストランスクリプ夕一ゼ (Invitrogen) 1 n Lを加えた。 ただし， レーン 2のみは Superscript™ II RNase—リ バーストランスクリプ夕ーゼのかわりに滅菌水 1 Lを加えた。 上記の反応溶液 を混和した後 42°Cにて 50分間ィンキュベート後反応を停止し， 12<½変性ポリァ クリルアミドゲル (30 X 30 X 0.05 cm, 1300V, 1時間， 1 X TBE)にて電気泳動を行 い，ォ一トラジオグラフィーにて解析した。 結果を図 1 2に示す。
4'-チォ RNAをテンプレートとした場合でも逆転写反応は進行し， 天然 RNA をテンプレートとした場合と遜色ない効率で cDN Aへと逆転写できることが明 かとなつた。 また得られた cDNAはシークェンシングを行い， これにより配列 に誤りがないことを確認した。 実施例 1 8 4'-チォ UTPおよび 4'-チォ CTP含有 RNA鎖の RNase A耐性
実施例 1 6で得られた 59 merの 4'-チォ RNAの酵素耐性の実験を RNase A を用いて行った。
反応は 10mM Tris-HCI(PH7.4), 5mM EDTA(PH7,5)， 300m M NaCI, RNase A 0.25mM,天然型 RNAあるいは 4'-チォ RNA80pmolを含む 30 ^ L中で行った。 上記の反応溶液を 0°Cにてィンキュベ一トした。 サンプリングは 30秒， 1分， 3 分， 5分， 10分， 30分， 60分， にて反応溶液 4 Lを， 10M尿素， 50mM EDTA, XC(0.1%), BPB(0.1%), を含むローディング溶液 7 しと混和し反応を停 止させた。 つづいて， 16%変性ポリアクリルアミドゲル (30 X 30 X 0.05 cm, 600V, 1時間 30分， 1 X TBE)にて電気泳動を行い， ォートラジオォグラフィ一にて解 祈した。 結果を図 1 3に示す。
天然型 RNAが 30秒で 90%以上， 酵素分解を受ける条件下， 4'-チォ RNAは 高い抵抗性を示し， その半減期は 12分であった。 4'-チォ RNAの 1時間後の完 全鎖長産物の残存量は， 天然型 RNAの 30秒後の完全鎖長産物の残存量より多 いことから， RNase Aに対して 100倍以上安定であることが明らかとなった。

Claims

請求の範囲 式 I
Figure imgf000031_0001
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基である]
の化合物。
2 . 式 I I ：
Figure imgf000031_0002
[式中， B ' はアデニン， グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよびヒポキ サンチンからなる群より選択される核酸塩基である]
の化合物。 3 式 I
Figure imgf000031_0003
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基である]
の化合物を合成する方法であって， 式 I I I ：
Figure imgf000032_0001
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基であり， R 2および R 3はそれぞれ独立してヒ ドロキシル基の保護基である]
の化合物を， 式 I V：
Figure imgf000032_0002
の化合物と反応させ， 得られた中間体をピロリン酸と反応させ， 次にョード酸化， 加水分解および脱保護することにより式 Iの化合物を得ることを含む方法。 式 I I
Figure imgf000032_0003
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよびヒポキサ ンチンからなる群より選択される核酸塩基である]
の化合物を合成する方法であって， 式 V：
Figure imgf000032_0004
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン， チミン， ゥラシルおよびヒポキサ ンチンからなる群より選択される核酸塩基であり， R 2はヒドロキシル基の保護 基である]
の化合物を， 式 I V：
Figure imgf000033_0001
の化合物と反応させ， 得られた中間体をピロリン酸と反応させ， 次にョード酸化， 加水分解および脱保護することにより式 Vの化合物を得ることを含む方法。 5 式 V I
Figure imgf000033_0002
[式中, Bはアデニン， グァニン， シトシン， ゥラシルおよびヒポキサンチンか らなる群より選択される核酸塩基である]
のヌクレオチド単位を少なくとも 1つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法で あって， 請求項 1の化合物または請求項 3に記載の方法により製造される化合物 の存在下で， RNA合成酵素により R NA鎖伸長反応を行うことを特徴とする方 法。
6 . 式 V I I
Figure imgf000033_0003
[式中， Bはアデニン， グァニン， シトシン チミン， ゥラシルおよびヒポキサ ンチンからなる群より選択される核酸塩基である]
のヌクレオチド単位を少なくとも 1つ含むオリゴヌクレオチドを製造する方法で あって， 請求項 2の化合物または請求項 4記載の方法により製造される化合物の 存在下で， D NA合成酵素により D NA鎖伸長反応を行うことを特徴とする方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010101951A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
WO2011123621A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc. 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides
WO2018212271A1 (ja) 2017-05-18 2018-11-22 国立大学法人京都大学 脊髄小脳変性症３６型の予防又は治療用組成物
JP2021522197A (ja) * 2018-04-19 2021-08-30 サウザーン リサーチ インスチチュート 癌の治療のための４’−チオ−ヌクレオチドおよび−ヌクレオシドプロドラッグ

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000004866A2 (en) * 1998-07-23 2000-02-03 Southern Research Institute Preparation of thioarabinofuranosyl compounds and use thereof
US20020019363A1 (en) * 2000-02-18 2002-02-14 Ismaili Hicham Moulay Alaoui Method for the treatment or prevention of flavivirus infections using nucleoside analogues

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE902574A1 (en) * 1989-07-17 1991-02-27 Univ Birmingham Antiviral pyrimidine nucleosides
US6004939A (en) * 1995-07-06 1999-12-21 Ctrc Research Foundation Board Of Regents Methods for modulation and inhibition of telomerase
EP1572902B1 (en) * 2002-02-01 2014-06-11 Life Technologies Corporation HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000004866A2 (en) * 1998-07-23 2000-02-03 Southern Research Institute Preparation of thioarabinofuranosyl compounds and use thereof
US20020019363A1 (en) * 2000-02-18 2002-02-14 Ismaili Hicham Moulay Alaoui Method for the treatment or prevention of flavivirus infections using nucleoside analogues

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDROVA L.A. ET AL.: "4'-thio-5-ethyl-2'-deoxyuridine 5'-triphoshate (TEDUTP): synthesis and substrate properties in DNA-synthesizing systems", ANTIVIRAL CHEMISTRY & CHEMOTHERAPY, vol. 7, no. 5, 1996, pages 237 - 242, XP002116568 *
HUANG BAO-GUO ET AL.: "The chemical synthesis of 4'-thio-2'-deoxythymidine-5'-triphosphate and its effects on DNA synthesis", vol. 38, no. 14, 1993, pages 1177 - 1180, XP002964762 *
PARKER W.B. ET AL.: "Metabolism of 4'-thio-beta-d-arabinofuranosylcytosine", BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 60, 2000, pages 1925 - 1932, XP002964761 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010101951A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
EP2669290A1 (en) 2009-03-02 2013-12-04 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Nucleic Acid Chemical Modifications
EP3424939A1 (en) 2009-03-02 2019-01-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Nucleic acid chemical modifications
WO2011123621A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc. 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides
WO2018212271A1 (ja) 2017-05-18 2018-11-22 国立大学法人京都大学 脊髄小脳変性症３６型の予防又は治療用組成物
JP2021522197A (ja) * 2018-04-19 2021-08-30 サウザーン リサーチ インスチチュート 癌の治療のための４’−チオ−ヌクレオチドおよび−ヌクレオシドプロドラッグ
JP7419259B2 (ja) 2018-04-19 2024-01-22 サウザーン リサーチ インスチチュート 癌の治療のための４’－チオ－ヌクレオチドおよび－ヌクレオシドプロドラッグ

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