WO2004015104A1 - 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法 - Google Patents

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WO2004015104A1
WO2004015104A1 PCT/JP2003/003478 JP0303478W WO2004015104A1 WO 2004015104 A1 WO2004015104 A1 WO 2004015104A1 JP 0303478 W JP0303478 W JP 0303478W WO 2004015104 A1 WO2004015104 A1 WO 2004015104A1
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Yoshiji Yamada
Mitsuhiro Yokota
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Nagoya Industrial Science Research Institute
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a detection method using a gene associated with restenosis after coronary angioplasty. More specifically, the present invention relates to a detection method using polymorphisms of a plurality of genes related to restenosis after coronary angioplasty, and a kit used in the method. The present invention can be used as a risk diagnosis of restenosis after coronary angioplasty. Background art
  • Restenos is af ter coronary angioplasty: a mul t ivariate statistical mode I to relative rate ion and procedure variabl es to restenos is.
  • the M- HEART Invest igators. "Am Col I Cardiol 1991; 18: 647-56 .; Weintraub WS, Kos inski AS, Brown CL 3rd, King SB 3rd.Can restenos is af ter coronary angioplasty be predicted from cl inical variables? J Am Co II Cardiol 1993; 21: 6-14 .; Stein B, Weintraub WS, Gebhart SP, et al. Influence of diabetes me II it us on early and late outcome after percutaneous transluminal coronary angioplasty.
  • Circulation 1996; 94: 35-43, reported that neointimal thickening was the most important mechanism in in-stent restenosis (Hoffmann R, Mintz GS, Dussa i A ant GR, et a I. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis.A serial intravascular ultrasound study.Circulation 1996; 94: 1247-5 5.
  • One method to prevent restenosis after coronary angioplasty is To identify restenosis susceptibility genes Angiotensin converting enzymes (Amant C, Bauters C, Bodar t J-C, et a D alele of the angiotensin converting enzyme is a major risk factor for restenosis after cor onary stenting.
  • the angiotensinogen gene 235T variant is associated wi th an increased risk of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty.Cl in Sci 2000; 99: 19-25.), Apolipotan No ⁇ 0 ⁇ E (van Bockxmeer FM, Mamo t te CDS, Gibbons FR, Taylor RR. Apo I i poprote in ⁇ 4 homozygos i ty-a determinant of restenos is af ter coronary angioplasty. ), Platelet glycoprotein I lia (Walter DH, Schachinger V, Eisner M, Dimme Ier S, Zei her AM.
  • the present invention has been made in view of the above background, and an object of the present invention is to provide means for diagnosing a genetic risk of restenosis after coronary angioplasty with high accuracy and high predictive accuracy.
  • the present inventors have estimated the association with coronary atherosclerosis, coronary artery »constriction, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, etc. using several public databases to achieve the above object.
  • a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample comprising the following step (a):
  • a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample comprising the following step (b):
  • a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample comprising the following step (d):
  • a method for diagnosing the risk of restenosis after coronary angioplasty comprising the following steps (i) to (iii):
  • a method for diagnosing risk of restenosis after coronary angioplasty comprising the following steps (iv) to (vi):
  • a method for diagnosing risk of restenosis after coronary angioplasty comprising the following steps (V i i) to (i X):
  • (V i i) a step of analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (12) to (17) in the nucleic acid sample;
  • a method for diagnosing risk of restenosis after coronary angioplasty comprising the following steps (x) to (xii):
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (1) to (6):
  • nucleic acid for analyzing the polymorphism at nucleotide position 3932 of the apolipoprotein E gene
  • nucleic acid for analyzing a polymorphism at base number -482 of apolipoprotein C-1 I I gene (5) nucleic acid for analyzing a polymorphism at base number -482 of apolipoprotein C-1 I I gene
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (7) to (11):
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (12) to (17):
  • (21) Dali a nucleic acid for analyzing a polymorphism at base number 1018 of the coprotein Iba gene
  • (22) a nucleic acid for analyzing a polymorphism at nucleotide position 3932 of the apolipoprotein E gene;
  • An immobilized nucleic acid comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (1) to (7) fixed to an insoluble support,
  • nucleic acid for analyzing the polymorphism at nucleotide position 3932 of the apolipoprotein E gene
  • G-protein a nucleic acid for analyzing the polymorphism at position 825 of the 83-subunit gene
  • nucleic acid for analyzing the polymorphism at nucleotide position 1186 of the thrompospondin 4 gene
  • nucleic acid for analyzing the polymorphism at nucleotide number-863 of the tumor necrosis factor ⁇ gene
  • (21) a nucleic acid for analyzing a polymorphism at base number 1018 of the daricoprotein lba gene
  • FIG. 1 is a table summarizing the 112 gene polymorphisms examined in the screening association analysis in Examples.
  • FIG. 2 is a table summarizing 112 gene polymorphisms examined in the screening association analysis in the same example.
  • FIG. 3 shows the primers (SEQ ID NOS: 31, 32, 33, 28, 29, 30, 16, 16, 17 and 18) used in order to determine the genotype in the examples. , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 25, 26, 27, 19, 20, 20, 21, 5, 2, 5, 3, 5, 4, 5, 7 8, 59, 55, 56), probes (SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67) in order from the top and other conditions It is a table.
  • FITC stands for full-year-old restained isothiocyanate
  • TxR stands for Texas red
  • Biotin stands for big-tin.
  • FIG. 4 shows primers (SEQ ID NOs: 43, 44, 45, 37, 38, 39, 40, 41, 42) in order from the top, which are also used for genotyping in the Examples. , 34, 35, 36, 22, 22, 23, 24) and other conditions.
  • FITC represents full-year-old restained isothiocyanate
  • TxR represents Texas red
  • Biotin represents bi-tin.
  • FIG. 5 is a table summarizing single nucleotide polymorphisms studied in the association analysis of the examples.
  • FIG. 6 is a table summarizing background data of 1620 male lesions that were subjected to association analysis in the example. Each data is expressed as mean soil standard deviation or%. In the table, * 1 indicates P ⁇ 0.0001 (for no restenosis), * 2 indicates P ⁇ 0.001 (for no restenosis), and * 3 indicates ⁇ ⁇ 0.05 (for no restenosis). ) And * 4 represents a large 0.005 (relative to no restenosis).
  • FIG. 7 is a table summarizing the background data of the 771 female lesions that were subjected to the association analysis in the examples. Each data is expressed as mean soil standard deviation or%.
  • * 1 is P 0 0.005 (for no restenosis)
  • * 2 is P 0.05 0.05 (for no restenosis)
  • * 3 is P 0.00 0.0001 (for no restenosis)
  • * 4 represents P ⁇ 0.001 (for no restenosis), respectively.
  • Figure 8 is a table summarizing the results of polymorphisms subjected to association analysis and the results of polynomial mouth dyistic regression analysis (male example).
  • Figure 9 is a table that summarizes the results of polymorphisms and the results of multinomial logistic regression analysis (female examples) targeted for association analysis.
  • Figure 10 is a table showing the results of a step forward selection method of polynomial osteotomy regression analysis for male polymorphisms associated with restenosis after coronary angioplasty (male example).
  • Fig. 11 is a table showing the results (female examples) of the step forward selection method of polynomial dystopic regression analysis for genetic polymorphisms associated with restenosis after coronary angioplasty.
  • FIG. 12 is a table showing the results of a genetic risk diagnosis of restenosis after balloon dilatation using five combination gene polymorphisms in men.
  • Figure 13 is a table showing the results of a genetic risk diagnosis of restenosis after stent insertion using five combination gene polymorphisms in men.
  • FIG. 14 is a table showing the results of a genetic risk diagnosis of restenosis after balloon dilatation using five combination gene polymorphisms in women.
  • Figure 15 is a table showing the results of a genetic risk diagnosis of restenosis after insertion of a stent using the five combination gene polymorphisms in women.
  • Figure 16 is a graph showing the relationship between the cumulative odds ratio of restenosis after coronary angioplasty and the number of single nucleotide polymorphisms. Restenosis after balloon dilatation is ( ⁇ ), Restenosis after stent insertion ( ⁇ ), (A) indicates association in males, (B) indicates association in females.
  • SNP1 ApoE (3932T ⁇ C) polymorphism
  • SNP2 GPIa (1648A ⁇ G) polymorphism
  • SNP3 TNFa (-863C ⁇ A) polymorphism
  • SMP4 G-protein / 33 (825C ⁇ T) polymorphism
  • SNP5 ApoC-II (-482C T) polymorphism
  • SNP6 AGT (-6G ⁇ A) polymorphism.
  • each SP in restenosis after stent implantation is as follows: SNP1: TSP4 (1186G ⁇ C) polymorphism, SNP2: TNFa ( ⁇ 863C ⁇ A) polymorphism, SMP3: TM (2136C ⁇ T) polymorphism, SNP4: TP0 (5713A ⁇ G) polymorphism, SNP5: PAF-AH (994G ⁇ T).
  • each SNP in restenosis after balloon dilatation was SNP1: E-selectin (561A ⁇ C) polymorphism, SNP2: FABP2 (2445G ⁇ A) polymorphism, SNP3: GP Ib ⁇ (1018C ⁇ T) polymorphism Type, SNP4: PAM (-668 / 4G ⁇ 5G) polymorphism, SNP5: P0M (584G ⁇ A) polymorphism, SMP6: ApoE (3932T ⁇ CPA11) polymorphism.
  • SNPs in restenosis after stent insertion are SNP1: PAI1 (-668 / 4G ⁇ 5G) polymorphism, SNP2: ApoC-1 II (-482C ⁇ T) polymorphism, SMP3: PON (584G ⁇ A) polymorphism, SNP4: GPIba (1018C ⁇ T) polymorphism, SNP5: ApoE (3932TC) polymorphism.
  • a first aspect of the present invention relates to a method for detecting a genotype of a nucleic acid sample.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (1) to (6). It is characterized by including.
  • Another embodiment is characterized by including a step of analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (7) to (11).
  • Yet another embodiment is characterized by including a step of analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (12) to (17).
  • Still another embodiment is characterized in that the method includes a step of analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the following (18) to (22).
  • the genetic risk of restenosis after coronary angioplasty can be determined by determining the genotype of the nucleic acid sample from the polymorphism information obtained as a result of the above steps.
  • G-protein; 83 (825C ⁇ T) polymorphism 825C ⁇ T
  • TMFa (-863C ⁇ A) polymorphism Polymorphism at nucleotide number -863 of the Tumor necrosis factor- ⁇ (Tumor necrosis factor- ⁇ ) gene:-863C ⁇ A (hereinafter also referred to as “TMFa (-863C ⁇ A) polymorphism”)
  • E-selectin E-selectin gene: 561A ⁇ C (hereinafter also referred to as “E-selectin (561A ⁇ C) polymorphism”)
  • Plasminogen activator inh ibi tor-1 (Plasminogen activator inh ibitor-1) gene base number-Polymorphism at position 668:-668 / 4G ⁇ 5G (hereinafter, ⁇ 11 (-668 / 4G
  • Apolipoprotein C-III (Apol ipoprotein C-III) gene base number -48 Polymorphism at position 2: -482C ⁇ T (hereinafter also referred to as “ApoC-l II (-482C ⁇ T) polymorphism”)
  • polymorphism at nucleotide number 3932 of the apolipoprotein E gene: 3932T ⁇ C (hereinafter also referred to as “ApoE (3932T ⁇ C) polymorphism”)
  • the notation means that the polymorphism at the base number position consists of two genotypes, which are bases before or after the arrow.
  • -668 / 4G ⁇ 5G is a genotype in which four G (guanine) are continuously present in the 3 'direction from base number -668.
  • the base number of each gene is expressed based on a known sequence registered in the public database GenBank (NCBI).
  • the 3932th base is apolipoprotein E gene. Corresponds to the base at position 3232.
  • SEQ ID NO: 2 accesion No.
  • X17 033 M28249 Human mRNA for integrin alpha-2 subunit
  • the 1648th nucleotide corresponds to the 1648th nucleotide of the glycoprotein la gene
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 The base at position # 97 in System 1 J (Accession No. L11698: Homo sapiens tumor necrosis factor alpha gene, promoter region) corresponds to the base at position ⁇ 863 of the tumor necrosis factor a gene
  • SEQ ID NO: 4 accesion No.
  • M31328 In human guanine nuclein ioti de-bind ng protein beta-3 subunit mRNA, complete cds), the 831rd base corresponds to the 825th base of the G-protein j83 subunit gene, In the accession No. X13367 (SEQ ID NO: 5), the 936th base corresponds to the -48 2nd base of the apolipoprotein C-III gene in Accession No. X13367: Human DNA for apol ipoprotein Cl II 5'-flank. SEQ ID NO: 6 (Accession No. X15323: H.
  • sapiens a ng io tensi nogen gene b region and exon 1) which corresponds to nucleotide position -6 of the 463th 3 ⁇ 4 street or angiotensinogen gene, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (Accession No. Z19585: H. sapiens mRNA) In the thrombospond i n-4), the 1186th base corresponds to the 1186th base of the trombospondin 4 gene, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 (Accession No.
  • Tsuyoshi 210 Homo sapiens gene for thrombomodul in The 2136th base in the precursor, complete cds) corresponds to the 2136th base of the thrombomodulin gene, and the 5753th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 (Accession No. L36051: Human thrombopoiet in gene, complete cds) Thrombopoietin gene In the base sequence of SEQ ID NO: 10 (Accession No.
  • U20157 Hum an platelet-activating factor acetate I hydrolase mRNA, complete cds
  • the 996th base is the platelet activating factor
  • the nucleotide at position 994 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 corresponds to nucleotide position 994 of the acetylhydrolase gene.
  • ELAM-1 Human endothelia ia leukocyte adhesion molecule 1
  • the 2445th base corresponds to the 2445th base of the fatty acid binding protein 2 gene, and the base number is SEQ ID NO: 13 (Accession No. J02940: Human platelet glycoprotein lb alpha chain mRNA, complete cds) In the 524th base is glycoprotein Ibex It corresponds to the 1018 base of the gene, and is the 31st base in the base sequence of SEQ ID NO: 14 (Accession No. X13323: Human gene for plasminogen activator inhibitor 1 (PA I -1)-flank and ex on 1).
  • the nucleotide sequence corresponds to the nucleotide at position 668 of the plasminogen activator inhibitor ichiichi 1 gene.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 (Accession No. 63012: H. sapiens serum paraoxonase (PON) mRNA, complete cds)
  • the 584th base corresponds to the 584th base of the para-xonase gene.
  • analyzing a polymorphism means investigating the genotype of a nucleic acid sample with respect to the gene polymorphism to be analyzed, and the base at the position where the polymorphism exists (base sequence) Is equivalent to examining Typically, taking the analysis of the ApoE (3932T ⁇ C) polymorphism as an example, the genotype of apolipoprotein E in a nucleic acid sample is CC (the 3932 base is homozygous for C in both alleles) and TC (Heterozygotes of the allele of T and C allele at base 3932) and TT (homozygote of alleles at base 3932).
  • the polymorphisms (1) to (6) described above indicate the genetic risk of restenosis after coronary angioplasty in an analysis of Japanese men who underwent balloon dilatation, as shown in the examples below. Is a polymorphism that has been found to be particularly effective for use in the determination of Therefore, the analysis of these polymorphisms should be performed with higher accuracy and higher predictive probability when using males (especially Japanese males) as subjects for balloon dilatation as coronary angioplasty. Make it possible.
  • polymorphisms (7) to (11) described above indicate that restenosis after coronary angioplasty in an analysis of Japanese men who underwent stent insertion, as shown in the examples below. It is a polymorphism that has been found to be particularly effective when used to determine genetic risk. Therefore, analysis of these polymorphisms is intended for stent insertion as a coronary angioplasty procedure, and when using males (especially Japanese males) as subjects, diagnosis with higher accuracy and higher predictive probability is possible. Is possible.
  • the above-mentioned polymorphisms (1 2) to (17) were determined by post-coronary angioplasty in an analysis of Japanese women who underwent balloon dilatation, as shown in the examples below.
  • polymorphisms (18) to (22) described above show that restenosis after coronary angioplasty in an analysis of Japanese women who had stent insertion, as shown in the examples below. It is a polymorphism that has been found to be particularly effective for use in determining genetic risk. Therefore, analysis of these polymorphisms is intended for stent insertion as a coronary angioplasty procedure, and can be predicted with higher accuracy when employing women (particularly Japanese women) as subjects. Enables high-probability diagnosis.
  • the genotype of the nucleic acid sample is further finely classified in proportion to the increase in the number of polymorphisms to be analyzed, whereby the genetic risk of restenosis after coronary angioplasty, which has a higher predictive probability, is increased. Can be diagnosed. From such a viewpoint, it is preferable to detect a genotype by analyzing more polymorphisms among the polymorphisms of the above ( ⁇ to (6).
  • polymorphisms (1) to (6) It is most preferable to analyze all of the polymorphisms (1) to (6).
  • a genotype is detected by combining five or less polymorphisms, it is preferable to preferentially select and use a polymorphism having a high odds ratio, which will be described in Examples described later.
  • a polymorphism having a high odds ratio For example, if five polymorphisms are used in combination, select the five polymorphisms with the highest odds ratio, namely (1), (2), (3), '(4), and (5) Children are preferred.
  • four polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (1), (3), (4), and (5).
  • polymorphisms (7) to (11) when analyzing two or more polymorphisms selected from the polymorphisms (7) to (11), it is most preferable to analyze all these polymorphisms, ie, five polymorphisms.
  • a genotype is detected by combining four or less polymorphisms, it is preferable to preferentially select and use a polymorphism having a high head ratio as described in Examples described later. For example, if four polymorphisms are used in combination, it is preferable to select the four polymorphisms with higher odds ratios, ie, (7), (8), (9), and (10). Similarly, if, for example, three polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (7), (8), and (9).
  • polymorphisms (12) to (17) when analyzing two or more polymorphisms selected from the polymorphisms (12) to (17), it is most preferable to analyze all these polymorphisms, that is, six polymorphisms.
  • a genotype is detected by combining five or less polymorphisms, it is preferable to preferentially select and use a polymorphism having a high odds ratio, which will be described in Examples below. For example, if five polymorphisms are used in combination, select the five polymorphisms with the highest odds ratio, ie, (12), (13), (14), (15), and (16) Is preferred.
  • polymorphisms (18) to (22) when analyzing two or more polymorphisms selected from the polymorphisms (18) to (22), it is most preferable to analyze all these polymorphisms, ie, five polymorphisms.
  • a genotype is detected by combining four or less polymorphisms, it is preferable to preferentially select and use a polymorphism having a high head ratio as described in Examples described later. For example, if four polymorphisms are used in combination, it is preferable to select the four polymorphisms with the highest head ratio, ie, (18), (19), (20), and (21). Similarly, if, for example, three polymorphisms are used in combination, it is preferable to select (18), (19), and (20).
  • the method for analyzing each gene polymorphism is not particularly limited. For example, amplification by PCR method using aryl specific primers (and probes), and a method for analyzing the polymorphism of the amplified product by fluorescence or luminescence, PCR-polymerase chain reaction (PCR) -RFLP (restriction fragment length poIymo rph ism: restriction enzyme fragment length polymorphism) method, PCR-SSCP (single strand conformation poIymo rph ism: single chain) Higher order structure Natl. Acad.
  • PCR-RFLP restriction enzyme fragment length polymorphism
  • PCR-SSCP single strand conformation poIymo rph ism: single chain
  • analysis may be performed by directly sequencing the polymorphic portion to be analyzed.
  • the polymorphism analysis may be performed by arbitrarily combining these methods.
  • a method using a PCR method for example, PCR-RFLP method
  • any of the above analysis methods can be applied after the nucleic acid sample has been amplified (including amplification of a partial region of the nucleic acid sample) in advance by a gene amplification method such as a method applying the PCR method or the PCR method.
  • nucleic acid for polymorphism analysis examples include a nucleic acid having a sequence complementary to a certain region (partial DNA region) containing the polymorphic site in a gene containing the polymorphism to be analyzed.
  • the gene containing the polymorphism to be analyzed has a sequence complementary to a certain region (partial DNA region) containing the polymorphism site, so that a DNA fragment containing the polymorphism portion can be specifically amplified.
  • Nucleic acids (primers) designed as described above can be mentioned.
  • nucleic acid for example, when the polymorphism at position 3932 of the apolipopin tin E gene is to be analyzed, a portion containing the base at position 3932 of the apolipoprotein E gene in which the base at position 3932 is T (thymine)
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the DMA region, or a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region containing the base at position 3932 of the apolipopin tin E gene in which the base at position 3932 is C (cytosine) is applicable.
  • nucleic acid for polymorphism analysis is to design a specific DNA region containing the polymorphic site only when the polymorphic site to be analyzed is any of the genotypes.
  • nucleic acid set include: More specifically, a nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DMA region containing a polymorphic site to be analyzed, wherein the polymorphic site is an antisense strand having any genotype.
  • nucleic acid set include a sense primer specifically hybridizing to a partial DNA region containing the polymorphic site and an antisense primer specifically hybridizing to a partial region of a sense strand. .
  • the partial DMA region containing the base 3939 of the apolipoprotein E gene should be specifically amplified. Designed to A sense primer and a sense strand that specifically hybridize to the partial DNA region containing the 3932 base in the antisense strand of the apolipoprotein E gene in which the 3932 base is T (thymine).
  • a nucleic acid set consisting of an antisense primer that hybridizes specifically to a partial region of the apolipoprotein E gene in which the 3932th base is C (cytosine), or a partial DNA containing the 3932th base in the antisense strand of the apolipoprotein E gene
  • the nucleic acid set includes a sense primer specifically hybridizing to a region and an antisense primer specifically hybridizing to a partial region of the sense strand.
  • the length of the partial DNA region to be amplified is appropriately set within a range suitable for the detection, and is, for example, 50 bp to 200 bp, preferably 80 bp to 150 bp.
  • nucleic acid primer for ApoE 3932T ⁇ C
  • ApoE 3932T ⁇ C
  • the underlined portions in the following sequences represent portions corresponding to polymorphisms.
  • N in the sequence means any of A, T, C, and G.
  • GGACATGGAGGACGTI ⁇ G SEQ ID NO: 16, or
  • CGCGGTACTGCACCAGGC SEQ ID NO: 18
  • a nucleic acid primer having the following sequence as an example of a nucleic acid primer for GPI a (1648A ⁇ G) polymorphism analysis can be exemplified.
  • GAGTCTACCTGTTTACTATCAANAA SEQ ID NO: 19, or
  • GAGTCTACCTGTTTACTATCAANGA SEQ ID NO: 20
  • Antisense primer ACCAGTACTAAAGCAAATTAAACT SEQ ID NO: 21 Similarly, as a nucleic acid primer for TMFa (-863C ⁇ A) polymorphism analysis, one having the following sequence can be exemplified.
  • GGCCCTGTCTTCGTTAANGG SEQ ID NO: 22, or
  • ATGGCCCTGTCTTCGTTAANTG SEQ ID NO: 2 3 '
  • nucleic acid primers for G-protein j83 (825C ⁇ T) polymorphism analysis which have the following sequences can be exemplified.
  • GAATAGTAGGCGGCCACTGA SEQ ID NO: 27
  • ApoC-1II 482C ⁇ T
  • TGTTTGGAGTAAAGGCACAGAA SEQ ID NO: 30
  • a nucleic acid primer for AGT (-6G ⁇ A) polymorphism analysis having the following sequence can be exemplified.
  • CGGCAGCTTCTTCCCNCG SEQ ID NO: 31 or
  • CCACCCCTCAGCTATAAATAGG SEQ ID NO: 33
  • TSP4 n86G ⁇ C
  • GGTCTGCACTGACATTGATGAG SEQ ID NO: 36
  • a nucleic acid primer having the following sequence can be exemplified.
  • CCCGACTCGGCCCTTMCC SEQ ID NO: 37, or
  • CCCGACTCGGCCCTTWTC SEQ ID NO: 38
  • GTCACAGTCGGTGCCAATGT SEQ ID NO: 39
  • TP0 5713A ⁇ G polymorphism analysis
  • CCGACATCAGCATTGTCTNAT SEQ ID NO: 40, or
  • CTGCAGGGAAGGGAGCTGT SEQ ID NO: 42
  • a nucleic acid primer for PAF-AH (994G ⁇ T) polymorphism analysis having the following sequence can be exemplified.
  • TTCTTTTGGTGGAGCAACNGT SEQ ID NO: 43, or
  • TCTTACCTGAATCTCTGATCTTCA SEQ ID NO: 45
  • E-selectin 561 A ⁇ C
  • ACATTCACCGTGGCCANIG SEQ ID NO: 46, or
  • AGCTGCCTGTACCAATACATCC SEQ ID NO: 48
  • nucleic acid primer for FABP2 (2445G ⁇ A) polymorphism analysis has the following sequence: Can be exemplified.
  • TCACAGTCAAAGAATCAAGNGC SEQ ID NO: 49, or
  • nucleic acid primer having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for GPI ba (1018C ⁇ T) polymorphism analysis.
  • CCCAGGGCTCCTGNCG SEQ ID NO: 52, or
  • TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG: SEQ ID NO: 54 one having the following sequence can be exemplified as a nucleic acid primer for PAM (-668 / 4G-5G) polymorphism analysis.
  • GGCACAGAGAGAGTCTGGACACG SEQ ID NO: 55 '
  • GGCCGCCTCCGATGATACA SEQ ID NO: 56
  • P0N 584G ⁇ A
  • Sense Primer ACCCAAATACATCTCCCAGGANCG SEQ ID NO: 57, or
  • AACCCAAATACATCTCCCAGGNCT SEQ ID NO: 58
  • GAATGATATTGTTGCTGTGGGAC SEQ ID NO: 59
  • CACCGTGGCCANTGCAGGAT SEQ ID NO: 62, or
  • CACCGTGGCCANGGCAGGAT SEQ ID NO: 63.
  • GAATCAAGNGCTTTTCGAAACATT SEQ ID NO: 64, or
  • GAATCAAGNACTTTTCGAAACATT SEQ ID NO: 65.
  • PA I 1 (-668 / 4G ⁇ 5G) as a probe for polymorphism analysis
  • TGGACACGTGGGGGAGTCAG SEQ ID NO: 66, or
  • nucleic acid primers and nucleic acid probes are merely examples, as long as nucleic acid primers can perform the desired amplification reaction without hindrance, and nucleic acid probes can perform the desired hybridization reaction without hindrance.
  • Some salt The base sequence may be modified.
  • “partially modified” means that a part of the base has been deleted, substituted, inserted and / or added.
  • the number of bases to be modified is, for example, 77, preferably ⁇ -5, and more preferably 1-3. In addition, such a modification is performed in a portion other than the base corresponding to the polymorphic site in principle.
  • the polymorphism to be analyzed is a PAI 1 (-668 / 4G ⁇ 5G) polymorphism
  • a nucleic acid obtained by modifying a part of the base corresponding to the polymorphic site is used as a primer or a probe. It is also possible. DNA fragments or RNA fragments are used as appropriate for the polymorphism analysis nucleic acid (probe, primer) depending on the analysis method.
  • the base length of the nucleic acid for polymorphism analysis may be any length as long as each function is exhibited, and examples of the base length when used as a primer are about 10 to 50 bp, preferably about 15 to 40 bp, more preferably It is about 15 to 30 bp.
  • mismatch When used as a primer, there may be some mismatch with the type II sequence as long as it hybridizes specifically to the amplification target and can amplify the target DNA fragment. Similarly, in the case of a probe, there may be some mismatch with respect to the sequence to be detected as long as it can specifically hybridize with the sequence to be detected.
  • the degree of mismatch is one to several, preferably one to five, and more preferably one to three.
  • Nucleic acids for polymorphism analysis can be synthesized by a known method such as the phosphodiester method. Regarding the design, synthesis, and the like of the nucleic acid for polymorphism analysis, reference can be made to books (eg, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • the nucleic acid for polymorphism analysis in the present invention can be labeled in advance with a labeling substance. By using such a labeled nucleic acid, polymorphism analysis can be performed using, for example, the labeling amount of the amplification product as an index.
  • amplification products can be obtained.
  • the genotype of the nucleic acid sample can be determined based on the detected labeling substance and labeling amount.
  • Specific examples of detection methods using such labeled primers include two types of nucleic acid primers (aryl-specific sense primers) that specifically hybridize to the sense strand of each genotype constituting the polymorphism.
  • Primer is labeled with a full-year restained isocyanate isoform and a Texas red, respectively, and a partial DNA region containing a polymorphic site is obtained using these labeled primers and an antisense primer that specifically hybridizes to the antisense strand. And a method of detecting the polymorphism by measuring the amount of labeling of each fluorescent substance in the obtained amplification product. If the antisense primer is labeled with, for example, virgin, amplification products can be separated using specific binding between biotin and avidin.
  • labeling substances used for labeling nucleic acids for polymorphism analysis include radioisotopes such as 32 P, fluorescent substances such as full-year reseicin isothiocyanate, tetramethyl rhodamine isothiane cyanate, and Texas red.
  • Labeling methods include 5 'end labeling using alkaline phosphatase and T4 polynucleotide kinase, 3' end labeling using T4 DNA polymerase ⁇ Klenow fragment, nick translation method, random primer method (Mol ecular Cloning, Third Edition, Chapter 9, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • the above-described nucleic acid for polymorphism analysis can be used in a state immobilized on an insoluble support.
  • the nucleic acid sample can be prepared from a subject's blood, skin cells, mucous membrane cells, hair, and the like using known extraction methods and purification methods. Any length of genomic DNA can be used as a nucleic acid sample as long as it contains a gene to be subjected to polymorphism analysis. Also, it is not necessary to use a nucleic acid sample in which all the genes to be analyzed are present on one nucleic acid.
  • nucleic acid sample of the present invention any of those in which all of the genes to be analyzed are present on one nucleic acid, and those in which the genes to be analyzed are separately present on two or more nucleic acids are used. Can be used. It should be noted that even if the gene to be analyzed in the nucleic acid sample is not in an intact state (that is, in a state where the full length of the gene is present), fragmentation or partial fragmentation may occur as long as at least the polymorphic site to be analyzed exists. It may be in the state. Analysis of each gene polymorphism is performed for each gene polymorphism, or a plurality or all of them are simultaneously performed.
  • nucleic acid sample obtained from a subject is dispensed according to the number of polymorphisms to be analyzed, and each polymorphism is individually analyzed.
  • DNA chip or microarray can be used.
  • the term “simultaneous” as used herein does not only mean that all operations in the analysis process are performed simultaneously, but also that some operations (for example, nucleic acid amplification operation, probe hybridization, or detection) are performed simultaneously. Including cases. Polymorphism of each gene can also be analyzed using mRNA which is a transcription product of the gene to be analyzed. For example, after extracting and purifying the mRNA of the gene to be analyzed from the blood, urine, etc.
  • Methods of analyzing using the expression products of such genes include a method of directly analyzing the amino acid at the polymorphic site, and a method of performing an immunological analysis using a change in the three-dimensional structure.
  • a well-known amino acid sequence analysis method (a method using the Edman method) can be used.
  • the latter includes an ELISA method (enzyme-linked immunosorbent assay) using a monoclonal antibody or a polyclonal antibody having a specific binding activity to the expression product of a gene having any genotype constituting the polymorphism.
  • Radioimmunoassay, immunoprecipitation, immunodiffusion, and the like can be used.
  • the polymorphism information obtained by executing the above-described detection method of the present invention can be used for diagnosis of a genetic risk of restenosis after coronary angioplasty. That is, the present invention comprises the steps of determining the genotype of a nucleic acid sample from the polymorphism information obtained by the above detection method, and determining the genetic risk from the determined genotype of the nucleic acid sample.
  • a method for diagnosing the risk of restenosis after plastic surgery is also provided.
  • the genotype determination here typically involves determining which allele of the nucleic acid sample is associated with the polymorphism to be detected. Is determined to have each genotype.
  • the genotype of apolipoprotein E in a nucleic acid sample is TT (homozygous for both allele T at position 3932).
  • CT base 3293 is a heterozygote of the T allele and C allele
  • CC base 3932 is a homozygote of both alleles C.
  • the ApoE (3932T ⁇ C) polymorphism it is determined whether the genotype of the nucleic acid sample is CC or TC or TT.
  • the GP I a (1648A ⁇ G) polymorphism is GG, or it is either AG or AA, or if the TNF a (-863C ⁇ A) polymorphism is AA or CA, Either one, CC or G-protein / 3 3 825C ⁇ T) polymorphism, TT, or CT or CC, ApoC-1 II (- 482 C ⁇ T) If the polymorphism is either TT or CT, or CC, or TT, or CT or CC, AGT (-6G-A ) If it is a polymorphism, it is either AA or GA, or GG, if it is a TSP4 (1 186G ⁇ C) polymorphism, it is either CC or GC, or GG, TM (2136C ⁇ T) polymorphism is either TT or CT or CC or TP0 (571 3A ⁇ G) polymorphism is GG or AG or AA Either, or PAF
  • Diagnosis of the genetic risk of restenosis after coronary angioplasty predicts the likelihood (probability) of restenosis after coronary angioplasty. That is, the risk of restenosis after coronary angioplasty can be evaluated by the diagnostic method of the present invention. Being able to make such an evaluation is extremely clinically significant because it allows the selection of appropriate treatment in advance. Utilizing the genetic information related to the occurrence of restenosis obtained by the present invention, the incidence of restenosis after coronary angioplasty can be reduced.
  • the polymorphism to be analyzed is a genotype that increases the risk of restenosis as a result of performing the diagnostic method of the present invention
  • a gene having a genotype with a low onset risk for the polymorphism is introduced into a living body. If introduced, the expression of the gene can be expected to reduce the risk of restenosis.
  • a similar effect can be expected by introducing an antisense chain to the mRNA of a gene having a genotype having a high risk of restenosis and suppressing the expression of the mRNA.
  • Such a gene or the like can be introduced into a living body by, for example, a method using a plasmid for gene transfer or a virus vector, an electoral poration (Potter, ⁇ ⁇ et al., Proc. Natl. Acad. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), ultrasonic microbubbles (Lawrie, A., et al. Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000)), lipofection (Fe Igner, PL et a, Proc. Nat I Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1984)), microinjection (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Nat I. Acad. Sci. USA 73, 366-370 (1976)). It can be done by a method. Introduction of genes and the like using these methods can be performed directly (in vivo method) or indirectly (e. x vivo method).
  • a gene or the like may be coated in advance (a plasmid for gene transfer or a vector retained in a virus vector may be coated).
  • a device such as a stent may be used simultaneously with or after coronary angioplasty. Gene transfer as described above can also be performed.
  • a kit a kit for genotype detection or a kit for diagnosing restenosis after coronary angioplasty used in the above-described detection method or diagnosis method of the present invention.
  • a kit includes a nucleic acid (polymorphism analysis nucleic acid) for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the above polymorphisms (1) to (6).
  • the kit includes a nucleic acid (polymorphism analysis nucleic acid) for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the above polymorphisms (7) to (11). Constructed.
  • the kit includes a nucleic acid (polymorphism analysis nucleic acid) for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the polymorphisms of the above (12) to (17). Is constructed.
  • the kit includes a nucleic acid (polymorphism analysis nucleic acid) for analyzing two or more polymorphisms selected from the group consisting of the above polymorphisms (18) to (22). Be built.
  • the nucleic acid for polymorphism analysis is analyzed using the analysis method to which it is applied (eg, the method using the PCR method using an aryl-specific nucleic acid, the PCR-RFLP method, the PCR-SSCP, the TaqMan-PCR method, the Invader method, etc.). in), it is designed as capable of specifically amplifying m RN a corresponding to the DMA area or containing the polymorphic portion to be analyzed (primer I) or specifically it can detect (probe).
  • the kit provided in the present invention are shown. It comprises two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (1) to (6) Genotype detection kit,
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the DNA region containing the 3932 base of the apolipoprotein E gene in which the 3932 base is T, or the 3932 position of the apolipoprotein E gene in which the 3932 base is C A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing bases; (2) a nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing bases 1648 of the glycoprotein la gene in which base 1648 is A; Or a nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing the 1648th base of the glycoprotein la gene in which the 1648th base is G,
  • G-protein whose base 825 is C; nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region containing base 825 of 83subunit gene, or G-protein whose base 825 is T a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region containing the base at position 825 of the j83 subunit gene,
  • A-polypoprotein having a base at position -482 is C.
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region containing the -482 base of the C-1 II gene, or an apolipoprotein having a base at -482 is T.
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (1) to (6) to form a kit.
  • the kit may be constituted by selecting two or more nucleic acids from such a group.
  • a nucleic acid set for analyzing the top 5 polymorphisms to construct a kit by selecting two or more nucleic acids, or from (1), (3), (4), and (5)
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acids from a certain group (nucleic acids for analyzing polymorphisms having the highest four odds ratios in the examples described later).
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (7) to 1):
  • nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the base 2136 of the thrombomodulin gene in which the base 2136 is C, or the base 2136 of the thrombomodulin gene in which the base 2136 is T A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the DNA region containing the base at position 5713 of the trombopopoietin gene in which the base at position 5713 is A, or base 5713 of the trumpopopoietin gene in which the base at position 5713 is G A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region, and
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 994th base of the platelet activating factor acetylhydrolase gene in which the 994th base is G, or a platelet activating factor in which the 994th base is T A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing the base at position 994 of the cetyl hydrolase gene.
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (7) to (11) and the kit is selected.
  • the kit may be constituted by arbitrarily selecting two or more of (7) to (11) to form a group and selecting two or more nucleic acids from such a group to constitute a kit.
  • two or more nucleic acid sets are selected from Darup (7) to (10) (nucleic acids for analyzing polymorphisms having the top four rankings in Examples described later).
  • a group consisting of (7) to (9) a nucleic acid for analyzing polymorphisms having the top three odds ratios in the examples described later). You can select and configure the kit.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (12) to 7):
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the base 561 of the E-selectin gene in which the base 561 is A, or the base 561 of the E-selectin gene in which the base 561 is C A nucleic acid having a sequence complementary to the partial DMA region,
  • nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 1018 base of the Dalicoprotein Ibex gene whose C base at position 1018 is C, or the 1018 base of Glycoprotein Tin Ibex gene whose T base at position 1018 is T A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (12) to (17) to constitute a kit, but two or more of (12) to (17) may be arbitrarily selected.
  • a kit may be formed by selecting a group and selecting two or more nucleic acids from the group.
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (12) to (16) (nucleic acids for analyzing polymorphisms with the top five in the examples described below) and the kit is selected.
  • a nucleic acid composed of (12) to (15) (a nucleic acid having an odds ratio of up to 4 in the following examples), and a kit consisting of at least two lini nucleic acids. can do.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acids selected from the group consisting of the following (18) to (22):
  • a nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 584th base of the para-xenonase gene whose 584th base is G, or the 584th base of the paralyxonase gene whose 584th base is A A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DNA region containing
  • nucleic acid having a sequence complementary to the partial DNA region containing the 3932 base of the apolipoprotein E gene in which the 3932 base is T, or the 3932 base of the apolipoprotein E gene in which the 3932 base is C A nucleic acid having a sequence complementary to a partial DMA region.
  • two or more nucleic acids are selected from the group consisting of (18) to (22) to form a kit.
  • the kit may be constituted by selecting two or more nucleic acids from the group.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (18) to (21) (nucleic acids for analyzing polymorphisms having the top four in the examples below).
  • Two or more nucleic acids are included in a kit or a group consisting of (18) to (20) (nucleic acids for analyzing polymorphisms with the highest odds ratio in the examples described below). You can select and configure the kit.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (1) to (6):
  • the nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DMA region containing the base 3932 of the apolipoprotein ⁇ gene, or the base 3939 of the apolipoprotein E gene in the nucleic acid sample is C Only in this case, a nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the base 3932 of the apolipoprotein E gene, (2) position 1648 of the glycoprotein la gene in the nucleic acid sample Only when the base is A, is the nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the base at position 1648 of the glycoprotein la gene, or of the glycoprotein la gene in the nucleic acid sample.
  • the partial DNA region containing the 825th base of the G-protein ⁇ 3 subunit gene can be specifically identified. Only when the position 825 of the G-protein ⁇ 3 subunit gene in the nucleic acid set or nucleic acid sample designed to amplify is ⁇ , the position 825 of the G-protein ⁇ 3 subunit gene A nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing
  • the partial DNA region containing the -482 base of the apolipoprotein C-1 II gene is specifically identified.
  • -482 position of the apolipoprotein C-1II gene only when the base at position -482 of the apolipopin C-1II gene in the nucleic acid set or nucleic acid sample designed to amplify Designed to specifically amplify the partial DMA region containing bases Nucleic acid set, and
  • the partial DNA region containing the ⁇ 6 base of the angiotensinogen gene can be specifically amplified.
  • nucleic acid set c and above designed in the above two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (1) to (6) to form a kit, but (1) to (6) Two or more of these may be arbitrarily selected to form a group, and two or more nucleic acid sets may be selected from such a group to constitute a kit.
  • a group consisting of (1) to (5) (a nucleic acid set for analyzing the top 5 polymorphisms selected in consideration of the odds ratio and P value in the examples described later).
  • a kit is constructed by selecting at least two lini nucleic acid sets, or a group consisting of (1), (3), (4), and (5).
  • Nucleic acid set for analyzing polymorphisms up to the order It is possible to construct a kit by selecting two or more nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (7) to (11):
  • Tumor necrosis factor 0 in the nucleic acid sample Only when the ⁇ 863 base of the gene is C, specifically amplifies the partial DNA region containing the ⁇ 863 base of the tumor necrosis factor a gene Only when the ⁇ 863 base of the tumor necrosis factor a gene in the nucleic acid set or nucleic acid sample designed as described above is A, the partial DNA region containing the ⁇ 863 base of the tumor necrosis factor ⁇ gene is Nucleic acid sets designed to specifically amplify,
  • a kit is configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (7) to (11).
  • the kit may be constituted by selecting two or more nucleic acid sets from the group.
  • two or more nucleic acid sets from the group consisting of (7) to (10) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms in the top four in the examples below) are analyzed.
  • the kit can be selected to form a kit, or a group consisting of (7) to (9) (in the following examples,
  • the kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets from the nucleic acid sets for analyzing the top three polymorphisms.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (12) to (17):
  • the gene for the plasminogen activator inhibitor 1 gene is present only when four Gs are continuously present in the 3 ′ direction from position 668.
  • Specific amplification of partial DMA region including sequence portion Plasminogen activator inhibitor 1 gene in a nucleic acid set or a nucleic acid sample designed to perform plasminogen activator inhibitor 1 gene only when five Gs are present continuously in the 3 ′ direction from position ⁇ 668.
  • nucleic acid sets from a group consisting of (12) to (16) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms having the top five odds ratios in the examples described later) are used.
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (18) to (22): (18) Plasminogen activator inhibitor 1 in the nucleic acid sample only in the case where four Gs are continuously present in the 3 ′ direction from position ⁇ 668 in the gene 1 In the nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the sequence portion of the gene, or the plasminogen activator inhibitor 1 gene in the nucleic acid sample-From position -668 to 3 'direction A nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing the sequence portion of the plasminogen activator inhibitor 1 gene only when there are five Gs in a row.
  • nucleotide at position 3932 of the apolipoprotein E gene in the nucleic acid sample is T Only when the nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the 3932 base of the apolipopin tin E gene, or when the 3932 base of the apolipoprotein E gene in the nucleic acid sample is C Only the nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the 3932th base of the apolipopin tin E gene (in the above, two from the group consisting of (18) to (22)
  • a kit is constructed by selecting the above nucleic acid sets, and two or more of (18) to (22) are arbitrarily selected to form a group, and two or more nucleic acid sets are selected from the group.
  • a group consisting of (18) to (21) (a nucleic acid for analyzing polymorphisms having the top four in the head ratio in the examples described later) may be selected.
  • Set) Select two or more nucleic acid sets from Or two or more nucleic acid sets from the group consisting of (18) to (20) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the highest odds ratio in the examples described below).
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (1) to (6):
  • a sense primer that specifically hybridizes to the partial DNA region containing bases and / or a sense that specifically hybridizes to the partial DNA region containing base 3932 in the apolipoprotein E gene where the 3932 base is C A nucleic acid set comprising: a primer; an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein E gene;
  • An antisense primer that specifically hybridizes to and / or a partial DNA region containing the ⁇ 863 base in the tumor necrosis factor a gene in which the ⁇ 863 base is ⁇ A nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically hybridizes to a gene; and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the tumor necrosis factor ⁇ gene.
  • G-protein j8 A nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the 825th base of the j83 subunit gene, wherein G-protein 3 has a C at the 825th base.
  • a sense primer that specifically hybridizes to the partial DNA region containing the 825th base in the submitt gene and / or a partial DMA region containing the 825th base in the G-protein ⁇ 3 submitt gene where the 825th base is T
  • a nucleic acid set consisting of: a sense primer that specifically hybridizes to, and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the G-protein ⁇ 3 subunit gene.
  • a sense primer that specifically hybridizes to the partial DMA region containing the -482 base in the protein C-III gene and / or T is the -482 base.
  • nucleic acid set designed to specifically amplify the partial DNA region containing the base at position 6 in the angiotensinogen gene, wherein the nucleic acid set in the angiotensinogen gene whose base at position -6 is G is-
  • An antisense primer that specifically hybridizes to a partial DNA region containing a base at position 6 and / or a partial DNA region containing base at position ⁇ 6 in an angiotensin gene that has base A at position A
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that hybridizes specifically and specifically; and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the angiotensinogen gene.
  • kits are configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (1) to (6), but two or more of (1) to (6) are arbitrarily selected.
  • a kit may be formed by selecting two or more sets of nucleic acids from such a group. For example, a group consisting of (1) to (5) (a nucleic acid set for analyzing the top 5 polymorphisms selected in consideration of the odds ratio and P value in the examples described later)
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets, or a group consisting of (1), (3), (4), and (5). Nucleic acid set for analyzing polymorphisms up to the order)
  • the kit can be composed by selecting two or more nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (7) to (11):
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically hybridizes to a primer; and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the tumor necrosis factor ⁇ gene.
  • Sense primer and specifically high Buridizu for the partial DNA region including 571 3-position base Te Roh or 571 3-position base is G Toronbopoi Nucleic acid consisting of a sense primer that specifically hybridizes to a partial DMA region containing the 571-position 3 base in the genetic protein gene, and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the thrombopoietin gene Set, and
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the activation factor acetylhydrolase gene;
  • a kit is configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (i) to ( ⁇ ), but two or more of (to) to (11) are arbitrarily selected.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, two or more nucleic acid sets are selected from a Darup consisting of (7) to (10) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms having the highest four odds ratios in the examples described later).
  • a group consisting of (7) to (9) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the top three in the examples below).
  • a kit can be constructed by selecting the above nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit containing two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (1 2) to (17):
  • a nucleic acid set comprising: an antisense primer that hybridizes specifically and specifically; and a sense primer that specifically hybridizes to a partial region of the E-selectin gene.
  • a nucleic acid set comprising: a hybridizing sense primer; an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the fatty acid binding protein 2 gene;
  • a partial DNA region containing a base position 3932 in the sense primer 1 and / or the apolipopin tin E gene in which the position 3932 is C which specifically hybridizes to a partial DNA region containing
  • a nucleic acid set comprising: a sense primer that hybridizes; and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein E gene.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (1 2) to (17) to constitute a kit.
  • the kit may be arbitrarily selected to form a group, and two or more nucleic acid sets may be selected from the group to constitute a kit.
  • two or more nucleic acid sets from the group consisting of (1 2) to (16) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the top five in the examples below) are analyzed.
  • the kit can be selected to form a kit, or a group consisting of (12) to (15) (
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets from the nucleic acid sets for analyzing polymorphisms with the top four odds ratios).
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (18) to (22):
  • apolipoprotein A nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing the -482 base of the C-1II gene, wherein the apo-base has a -482 base C.
  • a partial DNA region containing the -482 base in the lipoprotein C-III gene, a sense primer that specifically hybridizes to and / or a -482 base in the apolipoprotein C-III gene in which the -482 base is T A nucleic acid set comprising: a sense primer that specifically hybridizes to a partial DNA region, and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein C-III gene.
  • a nucleic acid comprising: a sense primer that specifically hybridizes to a partial DMA region containing the 584th base in the gene; and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the para-xonase gene.
  • a nucleic acid set comprising: a sense primer; and an antisense primer that specifically hybridizes to a ⁇ region of the Daricoprotein Iba gene, and
  • (22) A nucleic acid set designed to specifically amplify a partial DNA region containing the 3932 base of the apolipoprotein E gene, wherein the 3932 base is T in the apolipoprotein E gene.
  • Sense primer that specifically hybridizes to the partial DNA region containing the DNA and / or the sense that specifically hybridizes to the partial DNA region containing the 3932 base in the apolipoprotein E gene where the 3932 base is C
  • a nucleic acid set comprising a primer and an antisense primer that specifically hybridizes to a partial region of the apolipoprotein E gene.
  • kits are configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (18) to (22), but two or more of (18) to (22) are arbitrarily selected.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, two or more nucleic acid sets are selected from a group consisting of (18) to (21) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the highest four odds ratios in the examples described later) and a kit is selected. Or a group consisting of (18) to (20).
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets from the nucleic acid sets for analyzing polymorphisms with the top three odds ratios).
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (1) to (6):
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing base 3932 of the gene;
  • the antisense strand of the glycoprotein Ia gene in which the base at position 1648 is A it specifically hybridized to the partial region containing the base at position 1648 and was labeled with the first labeling substance. Specifically hybridizes to the first nucleic acid and the partial region containing the 1648th base in the antisense strand of glycoprotein la gene where the 1648th base is G, and is labeled with the second labeling substance.
  • the first nucleic acid or the first nucleic acid or the 1648th position of the glycoprotein la gene which is used together with the second nucleic acid and specifically hybridizes to a partial region of the sense strand of the glycoprotein la gene.
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing bases;
  • the region specifically hybridizes to the -863 position containing the base and is labeled with the first labeling substance.
  • a second labeling substance that specifically hybridizes to the identified first nucleic acid and a partial region containing the base at position ⁇ 863 in the sense strand of the tumor necrosis factor ⁇ gene where -86 is base A at position ⁇ 86.
  • a second nucleic acid that is specifically hybridized to a partial region of the antisense chain of the tumor necrosis factor a gene, and is used together with the first nucleic acid or the second nucleic acid to form a tumor necrosis factor.
  • a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing a base at position ⁇ 863 of the at gene; and a nucleic acid set comprising:
  • a specific region hybridizing to the partial region containing the 825th base in the antisense strand of the G-protein 3 subunit gene in which the 82th base is C is labeled with the first labeling substance.
  • the second nucleic acid thus obtained, and a G-protein which specifically hybridizes to a partial region of the sense strand of the G-protein / 33 subgene gene and is used together with the first nucleic acid / or the second nucleic acid.
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing the base at position 825 of the 83subunit gene;
  • the first labeling substance which specifically hybridizes to a partial region containing a base corresponding to the base at position -482 in the antisense strand of the apolipoprotein C-III gene in which the base at position -482 is C Specific to the first nucleic acid labeled with, and the partial region containing the base corresponding to the -482 base in the antisense strand of the C-II gene, where the -482 base is T
  • a nucleic acid set consisting of: a third nucleic acid that can be used together with the nucleic acid to specifically amplify a partial DNA region containing the ⁇ 482 base of the apolipoprotein C-III gene; and (6) -6 An position whose base is G Otenshino in the sense strand of one plasminogen gene - 6 A first nucleic acid specifically hybridized to a partial region containing a base, and labeled with a first labeling substance; and at position -6 in the sense strand of the angiotensinogen gene having base A at position -6.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (1) to (6) to form a kit.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, from the group consisting of (1) to (5) (a set of nucleic acids for analyzing the top 5 polymorphisms selected in consideration of the odds ratio and P value in the examples described later)
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets, or a group consisting of (1), (3), (4), and (5).
  • a nucleic acid set for analyzing polymorphisms up to the order can be used to construct a kit by selecting two or more nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (7) to ( ⁇ ):
  • the antisense strand of the thrombosbondin 4 gene in which the base at position 186 is G specifically hybridizes to the partial region containing the base corresponding to base at position 186, and Specific hybridization to the first nucleic acid labeled with the labeling substance and the partial region containing the base corresponding to the base position 86 in the antisense strand of the thrombosbondin 4 gene in which the base position 186 is C And labeled with a second labeling substance And the second nucleic acid and the thrombospondin 4 gene specifically hybridized to a partial region of the sense strand of the tombo spondin 4 gene and used together with the first nucleic acid or the second nucleic acid.
  • a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing the base at position 1186, and a nucleic acid set comprising:
  • a partial region containing a base at position ⁇ 863 specifically hybridizes to and is labeled with the first labeling substance.
  • the nucleic acid and a partial region containing the ⁇ 863 base in the sense strand of the tumor necrosis factor a gene in which the ⁇ 863 base is ⁇ are specifically hybridized to and labeled with a second labeling substance.
  • a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing bases, and a nucleic acid set comprising:
  • the nucleic acid and the partial region containing the base at position 5713 in the antisense gene of the tokubo npopoietin gene whose base at position 5713 is G are specifically high.
  • a second nucleic acid which has been pre-hybridized and labeled with a second labeling substance, and together with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid specifically hybridized to a partial region of the sense strand of the tobacco mouthbopoietin gene
  • a third nucleic acid that can be used to specifically amplify a partial DNA region containing the 57-3 base of the tronpopoietin gene, and a nucleic acid set comprising:
  • a first labeling substance that specifically hybridizes to a partial region containing a base corresponding to the 994th base in the antisense strand of the platelet activating factor acetylhydrolase gene in which the 994th base is G, and Specifically hybridized to the first nucleic acid labeled with, and the partial region containing the base corresponding to base 994 in the antisense strand of the platelet-activating factor acetylhydrolase gene having base T at position 994
  • a second nucleic acid labeled with a second labeling substance and specifically hybridizes to a partial region of a sense strand of a platelet activating factor acetyl hydrolase gene, and the first nucleic acid or the second nucleic acid
  • a kit is configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (7) to (11), but two or more of (7) to (11) are optional.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group.
  • a nucleic acid set consisting of (7) to (10) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the highest odds ratio of 4 in the examples described below) and a nucleic acid set of two or more lines
  • a kit can be constructed by selecting two or more nucleic acid sets. Including two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (12) to (17) Genotype detection kit,
  • the nucleic acid and a partial region containing a base corresponding to the base at position 561 in the sense strand of the E-selectin gene in which the base at position 561 is C were specifically hybridized to and labeled with a second labeling substance.
  • the second nucleic acid and the first nucleic acid or the second nucleic acid specifically hybridizing to a partial region of the antisense strand of the E-selectin gene; and
  • a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing base 561 of the selectin gene, and a nucleic acid set comprising:
  • the antisense strand of the fatty acid binding protein 2 gene in which the base at position 2445 is G specifically hybridizes to the partial region containing the base at position 2445 and is labeled with the first labeling substance.
  • the second nucleic acid specifically hybridized to the nucleic acid and the partial region containing the 2445th base in the antisense strand of the fatty acid binding protein 1 gene in which the 2445th base is A and labeled with a second labeling substance
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing
  • a specific region containing a base corresponding to the base at position 1018 is specifically hybridized with the first region and the first region. Specifically hybridizes to the first nucleic acid labeled with a labeling substance and to a partial region containing a base corresponding to the 1018 base in the antisense strand of the daricoprotein Ibex gene having a T at the 1018 base. And a second nucleic acid labeled with a second labeling substance and a partial region of the sense strand of glyco'protein Iba gene. To specifically amplify and partially amplify the partial DNA region containing the base position 108 of the Dalicoprotein I ba gene when used in conjunction with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid.
  • a set of nucleic acids designed to specifically amplify a partial DNA region containing a polymorphic portion at position -668 of the plasminogen activator inhibitor 1 gene
  • the plasminogen activator inhibitor 1 gene in which four Gs are continuously present in the 3 ′ direction from the position -668, to the ⁇ -type and the nucleic acid amplified using the set of nucleic acids
  • a third nucleic acid that specifically and specifically hybridizes, and a plasminogen activator inhibitor-1 gene having five consecutive G's in the 3'-direction from position -668, wherein the gene is ⁇ -type and said set of nucleic acids
  • a fourth nucleic acid specifically hybridizing to a nucleic acid to be amplified by using a nucleic acid set comprising:
  • a partial region containing the base corresponding to the base at position 584 is specifically hybridized to and labeled with the first labeling substance.
  • a specific region comprising a base region corresponding to base 584 in the antisense strand of the para-xenonase gene having base A at position 584, and the second nucleic acid
  • a second nucleic acid labeled with a labeling substance and specifically hybridizing to a partial region of the sense strand of the para-xonase gene and used together with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid.
  • a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DMA region containing base 584 of the paraoxonase gene; and a nucleic acid set comprising:
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing the base at position 3932.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (12) to (17) to form a kit.
  • the kit may be arbitrarily selected to form a group, and two or more nucleic acid sets may be selected from the group to constitute a kit.
  • two or more nucleic acid sets are selected from the group consisting of (12) to (6) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms having the top five odds ratios in the examples described later).
  • a kit consisting of (1 2) to (15) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the top four in terms of the heads ratio in the examples described later) is composed of two groups.
  • a kit can be constructed by selecting one or more nucleic acid sets.
  • a genotype detection kit comprising two or more nucleic acid sets selected from the group consisting of the following (18) to (22):
  • a set of nucleic acids (first nucleic acid and second nucleic acid) designed to specifically amplify a partial DNA region containing a polymorphic portion at position -668 of the plasminogen activator inhibitor 1 gene
  • the plasminogen activator inhibitor gene which has four consecutive G's in the 3'-direction from position -668, is type I and specific for nucleic acids amplified using the set of nucleic acids
  • a third nucleic acid, which specifically hybridizes, and a plasminogen activator inhibitor-1 gene having five consecutive G's in the 3 'direction from position -668, wherein the A fourth nucleic acid specifically hybridizing to a nucleic acid to be amplified using a nucleic acid set comprising:
  • a partial region containing a base corresponding to the base at position 482 is specifically hybridized.
  • a nucleic acid set comprising: a nucleic acid or a third nucleic acid that can be used together with the second nucleic acid to specifically amplify a partial DNA region containing the ⁇ 482 base of the apolipoprotein C-III gene;
  • a partial region containing a base corresponding to the base at position 584 is specifically hybridized and labeled with the first labeling substance. Specifically hybridized to the first nucleic acid and a partial region containing the base corresponding to the 584th base in the antisense strand of the paraoxonase gene having the A at the 584th base and being labeled with the second labeling substance.
  • a nucleic acid set comprising: a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DMA region containing the base at position 584;
  • the first labeling substance that specifically hybridizes to a partial region containing a base corresponding to the 1018 base in the antisense strand of the glycoprotein I ba gene having a C at the 1018 base, and And a partial region containing a base corresponding to the base at position 1018 in the antisense strand of the dalicoprotein I ba gene having base T at position 1018, and Specifically hybridizes to a second nucleic acid labeled with the labeling substance of No. 2 and to a partial region of the sense strand of the Daricoprotein Ibo; gene, and is used together with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid.
  • a third nucleic acid capable of specifically amplifying a partial DNA region containing the base at position 1018 of the dalicoprotein I ba gene and a nucleic acid set comprising: (22) A specific region that hybridizes specifically to a partial region containing a base corresponding to base 3932 in the antisense strand of the apolipoprotein gene in which base 3939 is T, and Specifically hybridizes to a first nucleic acid labeled with a labeling substance and a partial region containing a base corresponding to base 3932 in the antisense strand of the apolipoprotein ⁇ gene having base C at position 3932, and A second nucleic acid labeled with the labeling substance of 2, and specifically hybridizing to a partial region of the sense strand of the apolipoprotein ⁇ gene, and used together with the first nucleic acid and / or the second nucleic acid.
  • kits are configured by selecting two or more nucleic acid sets from the group consisting of (18) to (22), but two or more of (18) to (22) are arbitrarily selected.
  • a kit may be formed by selecting two or more nucleic acid sets from such a group. For example, two or more nucleic acid sets are selected from a group consisting of (18) to (21) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms having the highest four odds ratios in the examples described later) and a kit is selected. Or a group consisting of (18) to (20) (a nucleic acid set for analyzing polymorphisms with the top three ranked in the examples described later).
  • a kit can be configured by selecting a tool. In the above kit, one or more reagents (buffers, reaction reagents, detection reagents, etc.) according to the method of using the kit may be combined.
  • polymorphisms present in these genes those located in the promoter region ⁇ exon, or those located in the splice donor site and the ⁇ ceptor site and expected to be associated with a change in the function of the gene product, mainly We selected 112 polymorphisms (Figs. 1 and 2).
  • the subjects were 1869 Japanese patients (1313 males and 556 females) who were hospitalized for coronary angioplasty (balloon dilatation or stent insertion) between July 1998 and December 2001.
  • Follow-up coronary angiography was performed 6 months after coronary angioplasty. Coronary artery stenosis lesions that resulted in acute occlusion or subacute intrastent thrombosis after balloon dilatation were excluded from the analysis.
  • vascular stenosis was defined as a minimum vascular stenosis of 50% or more at the site of coronary angioplasty.
  • 7 mL of venous blood was collected into a tube containing 50 mol / L EDTA-2Na, and genomic DNA was extracted using a DMA extraction kit (Qiagen, Chatsworth, CA).
  • the genotype of the monobasic polymorphism was determined by a firefly-luminescent, allyl-specific primer-probe measurement system (Toyobo Gene Analysis, Tsuruga, Japan) (see Figures 3 and 4).
  • the DNA fragment containing the polymorphic site is labeled at the 5 'end with a flueoresceinisothocyanate (FITC) or Texas red (Texas red: TxR) and is labeled with two different aryl-specific senses.
  • FITC flueoresceinisothocyanate
  • TxR Texas red
  • a DMA fragment containing a polymorphic site can be prepared using two different aryl-specific sense (or antisense) primers and an antisense (or sense) primer labeled with a biotin at the 5 'end, or a sense primer.
  • the reaction solution (25 mL) contains 20 ng of DNA, 5 pmol of each primer, 0.2 mmol / L of each dextrin nucleoside triphosphate, 4 mol / L of magnesium chloride, and 1 U of DNA polymerase (rTaq or KODplus). Toyobo, Osaka, Japan), and the respective DMA polymerase buffers were used.
  • the amplification protocol had an initial denaturation of 5 min at 95 ° C, 35-45 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, annealing at 55-67, 5 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C.
  • the amplified DNA was incubated at room temperature in a solution containing streptavidin-bound magnetic beads in each well of a 96-well plate. Place this plate on a magnetic stand, collect the supernatant from each well, transfer it to each well of a 96-well plate containing 0.01M NaOH, and excite FITC using a microplate reader. The wavelengths were measured at 485 nm and 538 nm, and TxR measured fluorescence at excitation and fluorescence wavelengths of 584 nm and 612 nm.
  • amplified DNA was denatured with 0.3 M NaOH and contained either an aryl-specific capture probe immobilized on the bottom of each well of a 96-well plate and 35-40% formamide.
  • Hybridization was performed at 7 ° C for 30 minutes. After the wells were thoroughly washed, alkaline phosphatase-conjugated streptavidin was added to each well, and the plate was shaken at 37 ° C for 15 minutes. Wash the wells again, and 0.8 ⁇ ⁇ 2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitropheny I) -5- (2,4-di su I f op eny l) -2H-tet razo I i A solution containing um (monosod i um sal t) and 0. machine 5-bromo-4-ch I oro-3- i ndo I y I phosphate p-to I uidi ne sa It! ] Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured.
  • genotype determined by the aryl-specific primer-probe measurement system was the same as that determined by the PCR-restriction fragment length polymorphism method or the DNA sequencing method.
  • the statistical analysis in the following related analysis was performed as follows. Clinical data were compared between restenotic and non-restenotic lesions using the unpai red Student's test or the Mann-Whitney U test. Qualitative data was tested using the chute square test. The aryl frequency was estimated by the gene counting method, and the deviation from the Hardy-Weynberg equilibrium was tested by the chi-square test.
  • Example 3 Selection of polymorphisms related to restenosis after coronary angioplasty, and development of a method for diagnosing restenosis after coronary angioplasty
  • the present inventors performed a stepwise forward selection met hod for multinomial logistic regression analysis (FIGS. 10 and 11).
  • FGS. 10 and 11 The present inventors performed a stepwise forward selection met hod for multinomial logistic regression analysis (FIGS. 10 and 11).
  • dominant or recessive genetic models were used based on the P-value (lower P-value) associated with post-coronary restenosis for each of the polymorphisms shown in Figures 8 and 9.
  • the loci on the chromosome of these genes are shown in IH10 and FIG. Although the loci of the tumor necrosis factor ⁇ gene and the platelet activating factor acetylhydrolase gene are close to each other, no association was found in the genotype distribution of the polymorphisms in both subjects.
  • Step-wise forward selection The head-to-head ratio of restenosis after balloon dilatation or stent insertion based on the combination genotype calculated by m ethod, for males, Fig. 12, Fig. 13 and Fig. 16 A, and for females, Fig. 14 and Fig. 15 and Fig. 16B.
  • a combination genotype of six polymorphisms including one polymorphism (AGT (-6G ⁇ A) polymorphism), resulted in a 15.09-year maximum ratio of restenosis after balloon dilatation (Fig. 16A).
  • AGT -6G ⁇ A polymorphism
  • Fig. 16A the combined polymorphism of 5 polymorphisms
  • TNF ⁇ 863C ⁇ A polymorphism
  • TM (2136C ⁇ T) polymorphism
  • TP0 5713A ⁇ G
  • PAF-AH (994G ⁇ T) polymorphism resulted in a maximum odds ratio of in-stent restenosis of 6.64 (Figs. 13 and 16A).
  • multinomial logistic regression analysis revealed that 6 single nucleotide polymorphisms were associated with restenosis after balloon dilatation and 5 single nucleotide polymorphisms were associated with intrastent restenosis in both sexes.
  • the present inventors performed a large-scale association analysis of 2391 coronary artery lesions on the relationship between 19 single nucleotide polymorphisms in males and 18 females and restenosis after coronary angioplasty.
  • the stepwise forward selection method of the multinomial logistic regression analysis showed that the maximum age ratio was 15.09 for male restenosis after balloon dilatation, 6.64 for intrastent restenosis, and 44.54 for female restenosis after balloon dilation.
  • intra-stent restenosis we developed a genetic risk diagnosis method for restenosis after coronary angioplasty using a combination genotype exhibiting 117.83.
  • the major cause of balloon dilatation restenosis is chronic remodeling of the coronary arteries, and the major cause of intrastent restenosis is neointimal hyperplasia (Mintz GS, Popma JJ, Pichard AD, et a Arterial remodeling).
  • G-protein vascular biology
  • E-selectin vascular inflammation
  • hypertension angiotensinogen
  • lipid metabolism a polypoptin
  • E plays a role in apolipoprotein C-III, fatty acid binding protein 2, and para-xonase), platelet function (glycoprotein la and glycoprotein I bo, fibrinolytic system (plasminogen activator inhibitor 1), etc.
  • genes related to in-stent restenosis are vascular biology (thrombosbondin 4), vascular inflammation (tumor necrosis factor ⁇ and platelet-activating factor acetyl hydrolase), and lipid metabolism (apolipoprotein ⁇ ). , Apolipoprotein C-III and para-xonase), platelet function (troponpo) Julin, thrombopoietin, glycoprotein lbQ!), Fibrinolytic system (plasminogen activator inhibitor 1), etc.
  • One polymorphism in males (tumor necrosis factor ⁇ gene) ) are associated with both restenosis after balloon dilatation and in-stent restenosis.
  • apolipoprotein E van Bockxmeer FM, Mamotte CDS, Gibbons FR, Taylor RR. Apo I i poprote in ⁇ 4 homozygos i ty-a determinant of restenos is af ter coronary angioplasty.
  • Angiotensinogen Volzke H, Hertwig S, Re 11igR, Motz W.
  • the angiotensinogen gene) 235T variant is assoc ia ted wi th an i ncreased risk of restenosis af ter percutaneous trans luminal coronary angioplasty.CI in Sci 2000; 99: 19-25.), plasminogen activity inhibitor 1 (Ort lepp) R , Hoffmann R, Ki IIian A, Lauscher J, Merkel bach-Brese S, Han rath P.
  • Atheroscl eros is 2001; 156: 463-468)) and G-protein ⁇ 3 subunit (von Beckerath N, Kastrat i A, Koch W, et a I. G protein ⁇ 3 subun it polymorphism and risk of thrombo sis and restenos is fol lowing coronary stent placement. Atherosclerosis 2000; 149: 151-155.) The gene is thought to be important in the mechanism of restenosis (Matsuno H, Kozawa 0, Niwa M, Uematsu T.
  • tumor necrosis factor a (Clausel lN, de Lima VC, Mo I oss i S, et a I.Expression of tumor necros is factor and accumulation of fibronectin in coronary artery rest enot ic lesions retrieved by atherectomy.Br Heart J 1995; 73: 534-9.) and glycoprotein Ib (Gawaz M, Neumann FJ, Ott I, May A, Rudger S, Schoini g A. Changes in membrane glycoproteins of ci. Heart 1996; 76: 166-72.) may play an important role in the pathology of restenosis.
  • a genotype associated with restenosis after coronary angioplasty is analyzed, and a genotype of a nucleic acid sample is detected.
  • the present invention is an effective means to know in advance the risk of restenosis after performing a specific coronary angioplasty. Therefore, the present invention provides useful information for selecting an optimal treatment method, enables selection of an appropriate treatment method, realizes a high therapeutic effect, and improves the quality of life of patients with coronary artery disease. Can be achieved.
  • the present invention provides useful information for elucidating the mechanism by which restenosis occurs, and is therefore a very important means for establishing a method for preventing restenosis.

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Abstract

高精度で予知確率の高い冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを診断する手段を提供する。以下の工程を含んでなる方法により冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断を行う。(i)バルーン拡張術後再狭窄との関連が認められた6個の遺伝子多型、又はステント挿入後再狭窄との関連が認められた5個の遺伝子多型から二つ以上の多型を解析する工程、(ii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び(iii)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める工程。

Description

明 細 書 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法 技術分野
本発明は冠動脈形成術後の再狭窄に関連する遺伝子を利用した検出方法に関す る。 詳しくは冠動脈形成術後の再狭窄に関連する複数の遺伝子の多型を利用した 検出方法及び該方法に用いられるキッ 卜に関する。 冠動脈形成術後の再狭窄のリ スク診断として本発明を利用することができる。 背景技術
冠動脈形成術は冠動脈疾患の治療として広く行われているが、 再狭窄が大きな 問題である (McBride W, Lange RA, Hi l l i s LD. Restenosis af ter successful coronary angioplasty. Pathophysiology and prevent ion. U Engl J Med 1998;318: 1734-7. )0 冠動脈内ステン卜の使用により再狭窄の頻度は減少したが、 依然として 10- 20%の再狭窄が認められる （Serruys PW, de 」aegere P, Kiemenei j F, et aし A comparison of bal l oon - expandabl e - stent implantat ion wi th bal loon angiopl asty in pat ients wi th coronary artery disease. Benes ten t Study Group. N Engl J Med 1994; 331 :489-95. )„ 高血圧 ·糖尿病 ■ 高脂血症 · 不安定狭心症 ■ 高度冠動脈狭窄および長い狭窄病変などの多くの臨床所見■血管造影所見が冠動 脈形成術後再狭窄のリスクを増加させることが報告されてきたが （Hi rshfel d J J r, Schwartz JS, Jugo R, et a I . Restenos is af ter coronary angioplasty: a mul t ivariate statist ical mode I to rel ate l es ion and procedure variabl es to restenos is. The M- HEART I nvest igators. 」 Am Col I Cardiol 1991 ; 18 : 647-56.； Weintraub WS, Kos i nski AS, Brown CL 3rd, King SB 3rd. Can restenos is af ter coronary angioplasty be predicted from cl inical variables? J Am Co I I Cardiol 1993;21 :6-14.； Stein B， Weintraub WS， Gebhart SP， et al . Inf luence of diabetes me I I i t us on early and late outcome after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Ci rculation 1995 ; 91： 979-89.； Violaris AG, Melkert R， Serruys P . Long-term luminal renarrowi ng after successful elective coronary angioplasty of total occlusions. A quantitative angiographic ana lysis. Circulation 1995;91 :2140-50. ) 再狭窄の分子メカニズムは未だ不明である。 ヒ 卜の血管内超音波による研究から、 バルーン拡張術では慢性リモデリング （血管 収縮） が主要なメカニズムであり （Mintz GS， Popma JJ, Pichard AD， et al, Arterial re mo del ing after coronary angioplasty: a serial intravascular ul trasound study. Ci rculation 1996;94:35-43,)、 ステント内再狭窄では新生内 膜の肥厚が最も重要なメカニズムであることが報告された （Hoffmann R， Mintz GS， Dussa i I I ant GR, et a I . Patterns and mechanisms of in - stent restenosis. A serial intravascular ul trasound study. Ci rculation 1996 ; 94: 1247- 5 。 冠 動脈形成術後再狭窄を予防するための一つの方法は再狭窄感受性遺伝子を同定す ることである。 今までにゲノム疫学的研究によりアンギオテンシン変換酵素 (Am ant C， Bau ters C， Bodar t J- C， et a D al lele of the angiotensin ト converting enzyme is a major risk factor for restenosis after coronary stenting. Circulation 1997； 96： 56-60.； R i b i ch i n i F, Steffenino G, Del I ava I I e A， et a Plasma activity and insert i on/de I e t i on po I ymorph ism of angiotensin ト converting enzyme： a major risk factor and a marker of risk for coronary stent restenosis. Ci rculation 1998;97:147-154·)、 アンギ才テンシノ一ゲン ( Vo I zke H, Her twig S, Re 11 i g R, Mo tz W. The angiotensinogen gene 235T variant is associated wi th an increased risk of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. Cl in Sci 2000;99:19-25.)、 ァポリポタン ノヽ0ク E (van Bockxmeer FM, Mamo t te CDS, Gibbons FR, Taylor RR. Apo I i poprote i n ε 4 homozygos i ty-a determinant of restenos i s af ter coronary angioplasty. Atheroscleros is 1994; 110: 195-202. )、 血小板糖タンパク I l i a (Wal ter DH, Schach i nger V, Ei sner M, D imme I er S, Ze i her AM. Platelet glycoprotein I l ia polymorphisms and risk of coronary stent thrombos is. Lancet 1997 ;350 : 1217 - 1219·)、ストロメライシン- 1 (Humph r i es S, Bauters C， Mei rhaeghe A, Luong L, Bert rand , Amouye I P. The 5A6A polymorphism in the promoter of the s t rome I s i n-1 (M P3) as a risk factor for restenosis. Eur Heart J 2002;23:721-725. ) などの遺伝子多型とバルーン拡張術後再狭窄あるいはステン 卜内再狭窄との関連が報告されているが、 再狭窄感受性遺伝子は未だ十分に同定 されていない。 発明の開示
以上のように、 今までに数多くの遺伝子多型と冠動脈形成術後再狭窄との関連 解析が行われてきた。 しかし多くの研究についてはその意義について一定の見解 は得られていない。 その主な理由は多くの研究においては対象集団の大きさが十 分でないことと、 遺伝子多型のみならず環境因子が人種間で異なっていることに 起因する。 さらに、 たとえ再狭窄との関連が認められたとしても、 大規模集団に おける解析では相対危険度 （ォッズ比） が低いのが一般的である。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、 その目的は高精度で予知確 率の高い冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを診断する手段を提供することで ある。 本発明者らは、 以上の目的を達成するために数種類の公的データベースを用い て冠動脈硬化、 冠動脈 »縮、 高血圧、 糖尿病、 高脂血症などとの関連が推定され る 71遺伝子を抜粋し、遺伝子の機能変化との関連が予想されるものなどを中心に 112多型を選択した。 続いて、 この 71遺伝子 112多型に関して心筋梗塞との関連 解析を心筋梗塞 445例と対照 464例について行い、 男性で 19個、 女性で 18個の —塩基多型 （SNP： single nucleotide polymorphism) が心筋梗塞発症と関連する ことを見出したが （Yamada Y, Izawa H, lchihara S, et al . Genetic risk d i a gnosis system for myocardial infarction developed by a large acale assoc iation study of 112 gene polymorphisms in 5061 individuals(in press). )、 それらの多型群の中には冠動脈形成術後再狭窄の候補遺伝子も含まれていた。 そ こで、 これらの SNPと冠動脈形成術後再狭窄との関連について大規模関連解析を 行った。 その結果、 冠動脈形成術後再狭窄と関連する SNPを男性で 10個、 女性で 7 個同定することに成功した。 更に、 これらの多型を組み合わせて解析すること により、 多因子ロジスティック回帰分析の stepwise forward selection method によって、 冠動脈形成術後再狭窄の最大才ッズ比が、 バルーン拡張術後再狭窄に おいては男性で 15.09、女性で 44.54を呈し、ステン卜内再狭窄では男性で 6.64、 女性で 1Π.83を呈し、過去に報告された関連解析の中で最大の才ッズ比を示した。 この結果から、 これらの SNPの中から複数の SNPを選択し、 各 SNPを解析した結 果を組み合わせて用いれば、 信頼性が高く、 予知確率の高い冠動脈形成術後再狭 窄のリスク診断が行えるとの知見が得られた。 本発明は以上の知見に基づくもの であって、 次の構成を提供する。
[1 ] 以下の工程（a)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(a) 核酸試料における、 以下の（1)~(6)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(1)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(2)ダリコプロテイン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型、
(3)腫瘍壊死因子 a遺伝子の塩基番号- 863位の多型、 (4) G-プロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型、 ，
(5)アポリポプロテイン C- I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、 及び
(6)アンギオテンシノ一ゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型。
[2] 以下の工程（b)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(b) 核酸試料における、 以下の（7)~(11)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(7) 卜ロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(8)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(9)卜口ンポモジュリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型、
(10) 卜ロンポポイエチン遺伝子の塩基番号 5713位の多型、 及び
(11)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型 c
[3] 以下の工程（c)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(c)核酸試料における、以下の（12)〜（17)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型、
(13)脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型、
(14)ダリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1 遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(16)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型。
[4] 以下の工程（d)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(d)核酸試料における、 以下の（18)〜（22)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(18)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(19)ァポリポプロティン C- 1 I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(20)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、
(21)ダリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型。
[5] 以下の工程（i)~(iii)を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診 断方法、
(i)核酸試料における、以下の ）〜（6)からなるグループより選択される二つ以 上の多型を解析する工程、
(1)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(2)ダリコプロテイン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型、
(3)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(4) G-プロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型、
(5)ァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、 及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型。
(i i)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(i i i)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める 工程。
[6] 以下の工程（iv)~(vi)を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診 断方法、
(iv)核酸試料における、以下の（7) ~ (11)からなるグループよリ選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(7) トロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(8)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型、 (9) ト口ンボモジュリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型、 '
(10) トロンポポイエチン遺伝子の塩基番号 5713位の多型、 及び
(11)血小板活性化因子ァセチルヒドロラ一ゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型 (V)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(vi)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求めるェ 程。
[7] 以下の工程（V i i：)〜（i X)を含んでなる、冠動脈形成術後再狭窄のリスク診 断方法、
(V i i )核酸試料における、以下の（12) ~ (17)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(12) E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型、
(U)脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型、
(14)グリコプロテイン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号 - 668位の 多型、
(16)パラォキソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(vi i i)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する 工程、 及び
( i X )決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求めるェ 程。
[8] 以下の工程（x)~(xii)を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診 断方法、
(X)核酸試料における、以下の（18) ~ (22)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(18)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビタ一 1 遺伝子の塩基番号 - 668位の 多型、
(19)ァポリポプロティン C- I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(20)パラォキソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、
(21)ダリコプロテイン lbc¾遺伝子の塩基番号 1018位の多型、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(xi)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(xi i)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める 工程。
[9] 以下の（1)~(6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含ん でなる遺伝子型検出用キッ ト、 .
(1)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸、
(2)ダリコプロティン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型を解析するための核酸,
(3)腫瘍壊死因子 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(4) G-プロティン i83サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型を解析するための核酸,
(5)ァポリポプロティン C- 1 I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、 及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸。
[1 0] 以下の（7)~(11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を 含んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(7) トロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(8)腫瘍壊死因子 a 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(9) トロンボモジュリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型を解析するための核酸、
(10) トロンポポイエチン遺伝子の塩基番号 5713 位の多型を解析するための核 酸、 及び
(11)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型を 解析するための核酸。
[1 1 ] 以下の（12)~ (17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を 含んでなる遺伝子型検出用キッ ト、 .
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型を解析するための核酸、
(13)脂肪酸結合夕ンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型を解析するための 核酸、
(14)ダリコプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(16)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び '
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸。
[1 2] 以下の（18)〜（22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を 含んでな^)遺伝子型検出用キッ 卜、
(18)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(19)ァポリポプロティン C-l I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(20)パラ才キソナ一ゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、
(21)ダリ,コプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸。
[1 3] 以下の（1)~(7)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不 溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(1)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸、
(2)グリコプロティン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型を解析するための核酸、
(3)腫瘍壊死因子 a 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(4) G-プロティン；83サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型を解析するための核酸,
(5)アポリポプロテイン C-l I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、 及び
( 6 )アンギオテンシノ一ゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸。
[1 4] 以下の（7)〜（11)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が 不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(7) トロンポスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(8)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(9) 卜口ンボモジュリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型を解析するための核酸、
(10) 卜ロンボポイエチン遺伝子の塩基番号 5713 位の多型を解析するための核 酸、 及び (11)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型を 解析するための核酸。
[1 5] 以下の（12)~(17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が 不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型を解析するための核酸、
(13)脂肪酸結合夕ンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型を解析するための 核酸、
(14)ダリコプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(16)パラ才キソナ一ゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸。
[1 6] 以下の（18)〜（22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が 不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(18)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(19)ァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(20)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、
(21)ダリコプロテイン lb a 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸。 図面の簡単な説明
図 1 は実施例におけるスクリ一二ング関連解析において検討した 112遺伝子多 型をまとめた表である。
図 2は同じく実施例におけるスクリ一二ング関連解析において検討した 112遺 伝子多型をまとめた表である。
図 3は実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマー （上か ら順に配列番号 3 1 、 3 2、 3 3、 2 8、 2 9、 3 0、 1 6、 1 7、 1 8、 4 6、 4 7、 4 8、 4 9、 5 0、 5 1 、 2 5、 2 6、 2 7、 1 9、 2 0、 2 1 、 5 2、 5 3、 5 4、 5 7、 5 8、 5 9、 5 5、 5 6 )、 プローブ （上から順に配列番号 6 0、 6 1 、 6 2、 6 3、 6 4、 6 5、 6 6、 6 7 ) 及びその他の条件をまとめた 表である。 図中、 FITCはフル才レセインイソチ才シァネー卜を、 TxRはテキサス レッ ドを、 Biotinはビ才チンをそれぞれ表す。
図 4は同じく実施例において遺伝子型を決定するために使用されるプライマー (上から順に配列番号 4 3、 4 4、 4 5、 3 7、 3 8、 3 9、 4 0、 4 1 、 4 2、 3 4、 3 5、 3 6、 2 2、 2 3、 2 4 ) 及びその他の条件をまとめた表である。 図中、 FITCはフル才レセインイソチオシァネートを、 TxRはテキサスレッ ドを、 B iotinはビ才チンをそれぞれ表す。
図 5は実施例の関連解析において検討した一塩基多型をまとめた表である。 図 6は実施例における関連解析の対象とした男性 1620 病変の背景データをま とめた表である。 各データは平均土標準偏差、 又は％で表される。 表中、 *1 は P く 0.0001 (再狭窄なしに対して） を、 *2は Pく 0.001 (再狭窄なしに対して） を、 * 3は Ρ〈0·05 (再狭窄なしに対して） を、 *4は Ρく 0.005 (再狭窄なしに対して） を それぞれ表す。 図 7は実施例における関連解析の対象とした女性 771病変の背景データをまと めた表である。 各データは平均土標準偏差、 又は％で表される。 表中、 *1 は Pく 0. 005 (再狭窄なしに対して） を、 *2は Pく 0.05 (再狭窄なしに対して） を、 *3は P く 0.0001 (再狭窄なしに対して） を、 *4は P〈0.001 (再狭窄なしに対して） をそれ ぞれ表す。
図 8は関連解析の対象とした遺伝子多型と多項口ジスティック回帰分析の結果 (男性例） をまとめた表である。
図 9は関連解析の対象とした遺伝子多型と多項ロジスティック回帰分析の結果 (女性例） をまとめた表である。
図 1 0は冠動脈形成術後再狭窄と関連のある遺伝子多型における多項口ジステ イツク回帰分析の step forward select ion methodを行った結果 (男性例) を示 す表である。
図 1 1 は冠動脈形成術後再狭窄と関連のある遺伝子多型における多項口ジステ イツク回帰分析の step forward select ion methodを行った結果 （女性例) を示 す表である。
図 1 2は男性における 5個の組合せ遺伝子多型を用いたバルーン拡張術後再狭 窄の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
図 1 3は男性における 5個の組合せ遺伝子多型を用いたステン卜挿入後再狭窄 の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
図 1 4は、 女性における 5個の組合せ遺伝子多型を用いたバルーン拡張術後再 狭窄の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
図 1 5は女性における 5個の組合せ遺伝子多型を用いたステン卜挿入後再狭窄 の遺伝的リスク診断を行った結果を示す表である。
図 1 6は冠動脈形成術後再狭窄の累積ォッズ比と一塩基多型の数の関連を表し たグラフである。 バルーン拡張術後再狭窄は （〇） で、 ステン卜挿入後再狭窄は (·) で表され、 （A) は男性、 （B)は女性における関連を示す。 （A)のバルーン拡 張術後再狭窄における各 SMPは、 SNP1： ApoE(3932T→C)多型、 SNP2:GPIa(1648A→G) 多型、 SNP3:TNFa (- 863C→A)多型、 SMP4:G-プロテイン /33 (825C→T)多型、 SNP5:ApoC-l I I (- 482C T)多型、 SNP6： AGT (- 6G→A)多型である。 同様にステン卜揷 入後再狭窄における各 S Pは、 SNP1 :TSP4(1186G→C)多型、 SNP2:TNFa (- 863C→A) 多型、 SMP3:TM(2136C→T)多型、 SNP4： TP0 (5713A→G)多型、 SNP5： PAF-AH (994G→T) である。 （B) のバルーン拡張術後再狭窄における各 SNP は、 SNP1:E セレクチン (561A→C)多型、 SNP2:FABP2 (2445G→A)多型、 SNP3: GP I b α (1018C→T)多型、 SNP4:PAM (- 668/4G→5G)多型、 SNP5:P0M(584G→A)多型、 SMP6:ApoE(3932T→CPA11) 多型であ る 。 同 様 に ステ ン 卜 挿入後再狭窄 に お け る 各 SNP は、 SNP1 :PAI1 (- 668/4G→5G)多型、 SNP2:ApoC- 1 I I (- 482C→T)多型、 SMP3： PON (584G→A) 多型、 SNP4:GPIba (1018C→T)多型、 SNP5： ApoE (3932T C)多型である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の第 の局面は核酸試料の遺伝子型を検出する方法に関し、 その一態様 は以下の（1)~(6)からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析するェ 程を含むことを特徴とする。他の態様としては、 以下の（7)〜（11)からなるグルー プょり選択される二つ以上の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。 更に 他の態様としては、以下の（12)~(17) からなるグループよリ選択される二つ以上 の多型を解析する工程を含むことを特徴とする。更に他の態様としては、以下の（1 8)〜（22) からなるグループより選択される二つ以上の多型を解析する工程を含 むことを特徴とする。 尚、 以上の工程の結果得られる多型情報から核酸試料の遺 伝子型を決定することにより冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求めること ができる。
(1)アポリポプロテイン E (Apol ipoprotein E) 遺伝子の塩基番号 3932位の多 型 ： 3932T→C (以下、 「ApoE(3932T→C)多型」ともいう）
(2)グリコプロテイン la (Glycoprotein la)遺伝子の塩基番号 1648位の多型 ： 1648A→G (以下、 「GPla(1648A→G)多型」ともいう）
(3)腫瘍壊死因子 z (Tumor necrosis factor-α ) 遺伝子の塩基番号- 863位の 多型 ： -863C→A (以下、 「TNFa (- 863C→A)多型」ともいう）
. (4)G-プロテイン 3サブユニッ ト （G- protein /33 subun i t) 遺伝子の塩基番 号 825位の多型 ： 825C→T (以下、 「G-プロテイン；83 (825C→T)多型」ともいう）
(5)アポリポプロテイン C-l I I (Apol ipoprotein C- 1 I I) 遺伝子の塩基番号- 482 位の多型 ： -482C→T (以下、 「ApoC- 1 I I (- 482C→T)多型」ともいう）
(6)アンギオテンシノーゲン （Angiotensinogen) 遺伝子の塩基番号- 6 位の多 型 ： - 6G→A (以下、 「AGT(- 6G→A)多型」ともいう）
(7) 卜口ンボスポンジン 4 (Thrombospondin 4) 遺伝子の塩基番号 1186位の多 型 ： 1186G—C (以下、 「TSP4(1186G→C)多型」ともいう）
(8)腫瘍壊死因子 a (Tumor necrosis factor-α ) 遺伝子の塩基番号- 863位の 多型 ： - 863C→A (以下、 「TMFa (- 863C→A)多型」ともいう）
(9) 卜口ンポモジュリン （Thrombomodul in) 遺伝子の塩基番号 2136位の多型： 2 136C→T (以下、 「TM(2136C→T)多型」ともいう）
(10) 卜ロンボポイエチン（Thotombopoietin)遺伝子の塩基番号 5713位の多型： 5713A→G (以下、 「TPO(5713A→G)多型」ともいう）
(11)血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ （Platelet- activating factor a cetylhydrolase) 遺伝子の塩基番号 994位の多型 ： 994G→T (以下、 「PAF- AH(994 G→T)多型」ともいう）
(12)E-セレクチン （E- select in) 遺伝子の塩基番号 561 位の多型： 561A→C (以 下、 「Eセレクチン（561A→C)多型」ともいう）
(13)脂肪酸結合タンパク質 2 (Fatty acid-binding protein 2) 遺伝子の塩基 番号 2445位の多型 ： 2445G→A (以下、 「FABP2 (2445G→A)多型」ともいう）
(14)グリコプロテイン Iba (Glycoprotein Iba) 遺伝子の塩基番号 1018位の 多型 ： 1018C→T (以下、 「GPIba (1018C→T)多型」ともいう）
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1 (Plasminogen activator inh ibi tor- 1) 遺伝子の塩基番号- 668位の多型： - 668/4G→5G (以下、 ΓΡΑ 11 (- 668/4G
→5G)多型」ともいう）
(16)パラ才キソナ一ゼ （Paraoxonase) 遺伝子の塩基番号 584 位の多型 ： 584G →A (以下、 「P0N(584G→A)多型」ともいう）
(17)アポリポプロテイン E (Apol i pop rote in E) 遺伝子の塩基番号 3932位の多 型 ： 3932T→C (以下、 「ApoE(3932T→C)多型」ともいう）
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1 (Plasminogen activator inh ibi tor-1) 遺伝子の塩基番号- 668位の多型： - 668/4G—5G (以下、 「PAM (-668/4G →5G)多型」ともいう）
(19)アポリポプロテイン C- 1 I I (Apol ipoprotein C- I I I ) 遺伝子の塩基番号 - 48 2位の多型 ： - 482C→T (以下、 「ApoC-l I I (- 482C→T)多型」ともいう）
(20)パラォキソナーゼ （Paraoxonase) 遺伝子の塩基番号 584 位の多型 ： 584G →A (以下、 「P0N(584G→A)多型」ともいう）
(21)グリコプロテイン Iba (Glycoprotein I b a ) 遺伝子の塩基番号 1018位の 多型 ： 1018C→T (以下、 「GPIba (1018C→T)多型」ともいう）
(22)ァポリポプロティン E (Apol ipoprotein E) 遺伝子の塩基番号 3932位の多 型 ： 3932T→C (以下、 「ApoE(3932T→C)多型」ともいう） 以上において 3932T→Cのような表記は、当該塩基番号位置の多型が矢印の前又 は後の塩基である二つの遺伝子型からなることを意味する。 但し、 - 668/4G→5G は塩基番号- 668位から 3'方向に G (グァニン） が連続して 4個存在する遺伝子型 と 5個存在する遺伝子型からなる多型を意味する。 各遺伝子における塩基番号は公共のデータベースである GenBank (NCBI) に登 録されている公知の配列を基準として表される。 尚、 配列番号 1 の塩基配列 （Ac cession No. M10065 J03053 J03054： Human apol ipoprotein E (.eps i I on-4 a I I e le) gene, complete cds)において 3932番目の塩基がアポリポプロテイン E遺伝 子の 3932位塩基に相当する。 同様に配列番号 2の塩基配列 （Accession No. X17 033 M28249 ： Human mRNA for integrin alpha - 2 subun i t) において 1648番目の 塩基がグリコプロテイン la遺伝子の 1648位塩基に相当し、 配列番号 3の塩基配 歹1 J (Accession No. L11698： Homo sapiens tumor necrosis factor alpha gene, promoter region) において〗97番目の塩基が腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩 基に相当し、 配列番号 4の塩基配列 （Accession No. M31328： Human guanine nu c I eo t i de-b i nd i ng protein beta - 3 subun i t mRNA, complete cds) において 831 番目の塩基が G-プロテイン j83サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基に相当し、 配列 番号 5の塩基酉己歹 ϋ (Access ion No. X13367： Human DNA for apol ipoprotein C-l I I 5'-f lank) において 936番目の塩基がアポリポプロテイン C- I I I遺伝子の - 48 2位塩基に相当し、 配列番号 6の塩基配列 （Accession No. X15323： H. sapiens a ng i o tens i nogen gene b region and exon 1 )において 463番目の ¾巷かアンギオ テンシノ一ゲン遺伝ギの- 6位塩基に相当し、 配列番号 7の塩基配列 （Accession No. Z19585： H. sapiens mRNA for th rombospond i n-4) において 1186番目の塩基 が卜ロンポスポンジン 4遺伝子の 1186位塩基に相当し、配列番号 8の塩基配列（A ccess i on No. 剛 210 : Homo sapiens gene for thrombomodul in precursor, com plete cds)において 2136番目の塩基がトロンボモジユリン遺伝子の 2136位塩基 に相当し、 配列番号 9の塩基配列 （Accession No. L36051 ： Human thrombopoiet in gene, complete cds) において 5753番目の塩基がトロンボポイエチン遺伝子 の 5713位塩基に相当し、 配列番号 1 0の塩基配列 （Accession No. U20157： Hum an platelet-activating factor ace ty I hyd ro I ase mRNA, complete cds) におい て 996番目の塩基が血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩基 に相当し、 配列番号 1 1 の塩基配列 （Accession No. 24736： Human endothel ia I leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) mRNA, complete cds) において 561 番目の塩基が E-セレクチン遺伝子の 561位塩基に相当し、配列番号 1 2の塩基配 歹 lj (Access ion No. Ml 8079 J03465： Human, intestinal fatty acid binding pr o te i n gene, complete cds, and an A I u repetitive element.) において 2445 番目の塩基が脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の 2445位塩基に相当し、配列番号 1 3の塩基酉己歹 ϋ (Access i on No. J02940： Human platelet glycoprotein lb alpha chain mRNA, complete cds)において 524番目の塩基がグリコプロテイン Ibex 遺 伝子の 1018位塩基に相当し、 配列番号 1 4の塩基配列 （Accession No. X13323 ： Human gene for plasminogen activator inhibitor 1 (PA I -1) - f lank and ex on 1) において 〗31 番目の塩基がプラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1 遺 伝子の- 668位塩基に相当し、 配列番号 1 5の塩基配列 （Accession No. 63012 ： H. sapiens serum paraoxonase (PON) mRNA, complete cds) において 584番目の 塩基がパラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基に相当する。 本発明において「多型を解析する」とは、 解析対象の遺伝子多型について核酸試 料がどのような遺伝子型を有するかを調べることを意味し、 多型が存在する位置 の塩基 （塩基配列） を調べることと同義である。 典型的には、 ApoE(3932T→C)多 型の解析を例に採れば、 核酸試料におけるァポリポプロティン Eの遺伝子型が CC ( 3932位塩基が両アレル共に Cのホモ接合体）、 TC (3932位塩基が Tのアレルと Cのアレルとのヘテロ接合体）、 及び TT (3932位塩基が両アレル共に Tのホモ接 合体） の中のいずれであるかを調べることを意味する。 上記の（1 )〜（6)の多型は、 後述の実施例で示されるように、 バルーン拡張術を 受けた日本人男性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リス クの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。 従ってこれらの多 型を解析対象とすることは、 冠動脈形成術としてバルーン拡張術を対象とし、 被 験者として男性 （特に日本人男性） を採用するときに、 より高精度で予知確率の 高い診断を可能とする。
同様に、 上記の（7) ~ ( 1 1 )の多型は、 後述の実施例で示されるように、 ステン卜 挿入を行った日本人男性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺伝 的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。 従ってこれ らの多型を解析対象とすることは、冠動脈形成術としてステン.卜挿入を対象とし、 被験者として男性 （特に日本人男性） を採用するときに、 より高精度で予知確率 の高い診断を可能とする。 同様に、 上記の（1 2) ~ ( 1 7)の多型は、 後述の実施例で示されるように、 バル一 ン拡張術を受けた日本人女性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の 遺伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。 従って これらの多型を解析対象とすることは、 冠動脈形成術としてバルーン拡張術を対 象とし、 被験者として女性 （特に日本人女性） を採用するときに、 より高精度で 予知確率の高い診断を可能とする。
同様に、 上記の（1 8) ~ (22)の多型は、 後述の実施例で示されるように、 ステン ト挿入を行った日本人女性を対象とした解析において冠動脈形成術後再狭窄の遺 伝的リスクの判定に利用することが特に有効と認められた多型である。 従ってこ れらの多型を解析対象とすることは、 冠動脈形成術としてステン卜挿入を対象と し、 被験者として女性 （特に日本人女性） を採用するときに、 より高精度で予知 確率の高い診断を可能とする。 ここで、 原則的には解析する多型の数の増加に比例して核酸試料の遺伝子型が よリ細かく分類され、 これによつて一層予知確率の高い冠動脈形成術後再狭窄の 遺伝的リスクの診断を行うことができる。 かかる見地から、 上記の（υ ~ (6)の多 型の中でより多くの多型を解析して遺伝子型を検出することが好ましい。従って、
(1 ) ~ (6)のすベての多型を解析することが最も好ましい。 五つ以下の多型を組み 合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、 後述の実施例で示されるォッズ比の高 い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。 例えば五つの多型を組み合わ せて用いるのであれば、 ォッズ比が上位である五つの多型、 即ち（1 )、 （2)、 （3)、' (4)、 及び（5)を選択するこどが好ましい。 同様に、 例えば四つの多型を組み合わ せて用いるのであれば（1 )、 （3)、 （4)、 及び（5)を選択することが好ましい。 同様 に、 例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば（1 )、 （3)、 及び（4)を選択 することが好ましい。
(7)〜（1 1 )の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、これ らすべての多型、 即ち五つの多型を解析することが最も好ましい。 四つ以下の多 型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、 後述の実施例で示される才ッ ズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。 例えば四つの多型を 組み合わせて用いるのであれば、ォッズ比が上位である四つの多型、即ち（7)、（8)、 (9)、 及び（1 0)を選択することが好ましい。 同様に、 例えば三つの多型を組み合わ せて用いるのであれば（7)、 （8)、 及び（9)を選択することが好ましい。 同様に、 例 えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば（7)及び（8)を選択することが好 ましい。 (12) ~ (17)の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、 こ れらすべての多型、 即ち六つの多型を解析することが最も好ましい。 五つ以下の 多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、 後述の実施例で示されるォ ッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。 例えば五つの多型 を組み合わせて用いるのであれば、才ッズ比が上位である五つの多型、即ち（12)、 (13)、 （14)、 （15)、 及び（16)を選択することが好ましい。 同様に、 例えば四つの 多型を組み合わせて用いるのであれば（12)、 （13)、 （14)、 及び（15)を選択するこ とが好ましい。同様に、例えば三つの多型を組み合わせて用いるのであれば（12)、 (13)、 及び（14)を選択することが好ましい。
(18)〜（22)の多型から選択される二つ以上の多型を解析する場合も同様に、 こ れらすべての多型、 即ち五つの多型を解析することが最も好ましい。 四つ以下の 多型を組み合わせて遺伝子型の検出を行う場合には、 後述の実施例で示される才 ッズ比の高い多型を優先的に選択して用いることが好ましい。 例えば四つの多型 を組み合わせて用いるのであれば、才ッズ比が上位である四つの多型、即ち（18)、 (19)、 （20)、 及び（21)を選択することが好ましい。 同様に、 例えば三つの多型を 組み合わせて用いるのであれば（18)、（19)、及び（20)を選択することが好ましい。 同様に、 例えば二つの多型を組み合わせて用いるのであれば（18)及び（19)を選択 することが好ましい。 各遺伝子多型を解析する方法は特に限定されるものではなく、 例えばァリル特 異的プライマー （及びプローブ） を用い、 PCR 法による増幅、 及び増幅産物の多 型を蛍光又は発光によって解析する方法や、 PCR(polymerase chain reaction)法 を利用した PCR- RFLP(restriction fragment length po I ymo rph i sm： 制限酵素断 片長多型）法、 PCR- SSCP(single strand conformation po I ymo rph i sm：単鎖高次構 造多型）法（Orita，M. et al. , Proc. Nat I. Acad. Sci. , U.S.A., 86， 2766-2770 (1989)等）、 PCR-SSO(specif ic sequence o I i gonuc I eo t i de：特異的配列才リゴヌ クレオチド）法、 PCR- SS0法とドッ トハイプリダイゼーシヨン法を組み合わせた A S0(al lele specif ic o I i gonuc I eo t i de：アレル特異的才リゴヌクレオチド）ハイプ リダィゼ一シヨン法（Saiki, Nature, 324, 163- 166 (1986)等）、 又は TaqMan- PCR 法（Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143 (1999) , Mo r r i s, T. et aし， J. CI in. icrob iol., 34, 2933 (1996)), I nvade r法（Lyam ί chev V et al., Nat Biotechnol, 17, 292 (1999))、 プライマ一伸長法を用いた MALD卜 T0F/MS(matrix)法（Haff LA, Smi rnov IP, Genome Res 7, 378 (1997) ) , RCA (ro M ing cycle amp I i f i ca t i on) ;¾ (L i zard i PM et al., Nat Gene t 19, 225 (1998) )、 DNAチップ又はマイクロアレイを用いた 方法（Wang DG et al. , Science 280， 1077 (1998)等）、 プライマ一伸長法、 サザン プロッ トハイプリダイゼーシヨン法、 ドッ トハイプリダイゼーシヨン法 （Southe rn,E., J. Mo I. Biol. 98, 503-517 (1975)) 等、 公知の方法を採用できる。 さら に、解析対象の多型部分を直接シークェンスすることにより解析してもよい。尚、 これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。 核酸試料が少量の場合には、 検出感度ないし精度の面から PCR法を利用した方 法 （例えば、 PCR- RFLP法） により解析することが好ましい。 また、 PCR法又は PC R 法を応用した方法などの遺伝子増幅法により核酸試料を予め増幅 （核酸試料の 一部領域の増幅を含む） した後、 上記いずれかの解析方法を適用することもでき る。
一方、 多数の核酸試料を解析する場合には、 ァリル特異的 PCR法、 ァリル特異 的ハイプリダイゼーシヨン法、 TaqMan-PCR法、 Invader法、 プライマー伸長法を 用いた MALD卜 T0F/MS (matrix)法、 RCA(ro M ing cycle amp I i f i cat i on)法、 又は D チップ又はマイクロアレイを用いた方法等、 多数の検体を比較的短時間で解析 することが可能な解析方法を用いることが特に好ましい。 以上の方法では、 各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸 （本発明にお いて、 「多型解析用核酸」ともいう）が使用される。多型解析用核酸の例としては、 解析対象の多型を含む遺伝子において、 当該多型部位を含む一定領域 （部分 DNA 領域） に相補的な配列を有する核酸を挙げることができる。 また、 解析対象の多 型を含む遺伝子において、 当該多型部位を含む一定領域 （部分 DNA領域） に相補 的な配列を有し、 当該多型部分を含む DNAフラグメン卜を特異的に増幅できるよ うに設計された核酸 （プライマー） を挙げることができる。 このような核酸とし ては、例えばァポリポプ口ティン E遺伝子の 3932位の多型が解析対象の場合には、 3932位の塩基が T (チミン）であるアポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基を 含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 3932位の塩基が C (シトシ ン）であるァポリポプ口ティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DMA領域に相補 的な配列を有する核酸が該当する。 多型解析用核酸の他の具体例としては、 解析対象の多型部位がいずれかの遺伝 子型である場合にのみ、 当該多型部位を含む部分 D N A領域を特異的に増幅するよ うに設計された核酸セッ トを挙げることができる。 より具体的には、 解析対象の 多型部位を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜で あって、 多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を 含む部分 DNA領域に対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマーとセン ス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーか らなる核酸セッ トを例示することができる。 このような核酸セッ トとしては、 ァ ポリポプロティン E遺伝子の 3932位の多型が解析対象の場合には、ァポリポプ口 ティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計 された核酸セッ トであって、 3932位塩基が T (チミン） であるァポリポプロティ ン E遺伝子のアンチセンス鎖において 3932位塩基を含む部分 DNA領域、に対して 特異的にハイブリダィズするセンスプライマーとセンス鎖の一部領域に対して特 異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーからなる核酸セッ 卜、又は 39 32位塩基が C (シトシン） であるアポリポプロテイン E遺伝子のアンチセンス鎖 において 3932位塩基を含む部分 D N A領域、に対して特異的にハイブリダィズする センスプライマーとセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズするァ ンチセンスプライマ一からなる核酸セッ トが該当する。 ここで、 増幅される部分 DNA領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され、例えば 50 bp~ 200 bp、 好 ましくは 80 bp~ 1 50bpである。 より具体的には、 例えば ApoE (3932T→C)多型解析 用の核酸プライマ一として次の配列を有するものを例示できる。 尚、 以下の配列 の下線部は多型に対応する部分を表す。 また、 配列中の Nは A、 T、 C、 及び Gの いずれかであることを意味する。
アンチセンスプライマー
GGACATGGAGGACGTI^G： 配列番号 1 6、 又は
CGGACATGGAGGACGTNTG： 配列番号 1 7
センスプライマー
CGCGGTACTGCACCAGGC： 配列番号 1 8 同様に、 GP I a (1 648A→G)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有する ものを例示できる。
センスプライマ一
GAGTCTACCTGTTTACTATCAANAA： 配列番号 1 9、 又は
GAGTCTACCTGTTTACTATCAANGA： 配列番号 2 0
アンチセンスプライマー ACCAGTACTAAAGCAAATTAAACT： 配列番号 2 1 同様に、 TMF a (-863C→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有する ものを例示できる。
アンチセンスプライマ一
GGCCCTGTCTTCGTTAANGG： 配列番号 2 2、 又は
ATGGCCCTGTCTTCGTTAANTG： 配列番号 2 3 '
センスプライマー
CCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATC： 配列番号 2 4 同様に、 G-プロティン j8 3 (825C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配 列を有するものを例示できる。
センスプライマー
TCTGCGGCATCACGTNCG： 配列番号 2 5、 又は
TCTGCGGCATCACGTNTG： 配列番号 2 6
アンチセンスプライマー
GAATAGTAGGCGGCCACTGA：配列番号 2 7 同様に、 ApoC- 1 I I (-482C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有 するものを例示できる。
センスプライマー
CGGAGCCACTGATGCNCG： 配列番号 2 8、 又は
CGGAGCCACTGATGCNTG： 配列番号 2 9
アンチセンスプライマー
TGTTTGGAGTAAAGGCACAGAA： 配列番号 3 0 同様に、 AGT (-6G→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するもの を例示できる。
アンチセンスプライマ一
CGGCAGCTTCTTCCCNCG： 配列番号 3 1 、 又は
CGGCAGCTTCTTCCCNTG： 配列番号 3 2
センスプライマー
CCACCCCTCAGCTATAAATAGG： 配列番号 3 3 同様に、 TS P4 ( n 86G→C)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有する ものを例示できる。
センスプライマ一
CGAGTTGGGAACGCACNCT： 配列番号 3 4、 又は
CGAGTTGGGAACGCACNGT： 配列番号 3 5
アンチセンスプライマー
GGTCTGCACTGACATTGATGAG： 配列番号 3 6 同様に、 TM (2 1 36C→T)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するも のを例示できる。
センスプライマ一
CCCGACTCGGCCCTTMCC： 配列番号 3 7、 又は
CCCGACTCGGCCCTTWTC： 配列番号 3 8
ァンチセンスプライマー
GTCACAGTCGGTGCCAATGT： 配列番号 3 9 同様に、 TP0 (571 3A→G)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有するも のを例示できる。
センスプライマー
CCGACATCAGCATTGTCTNAT： 配列番号 4 0、 又は
CCGACATCAGCATTGTCTNAT： 配列番号 4 1
アンチセンスプライマー
CTGCAGGGAAGGGAGCTGT：配列番号 4 2 同様に、 PAF- AH (994G→T)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有する ものを例示できる。
センスプライマ一
TTCTTTTGGTGGAGCAACNGT： 配列番号 4 3、 又は
ATTCTTTTGGTGGAGCAACNTT： 配列番号 4 4
アンチセンスプライマー
TCTTACCTGAATCTCTGATCTTCA： 配列番号 4 5 同様に、 Eセレクチン（561 A→C)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を 有するものを例示できる。
アンチセンスプライマ一
ACATTCACCGTGGCCANIG： 配列番号 4 6、 又は
CATTCACCGTGGCCANGG： 配列番号 4 7
センスプライマー
AGCTGCCTGTACCAATACATCC： 配列番号 4 8 同様に、 FABP2 (2445G→A)多型解析用の核酸プライマーとして次の配列を有す るものを例示できる。
センスプライマ一
TCACAGTCAAAGAATCAAGNGC： 配列番号 4 9、 又は
ATTCACAGTCAAAGAATCAAGNAC： 配列番号 5 0
アンチセンスプライマー
CAAAAACAACTTCAATGTTTCGA： 配列番号 5 1 同様に、 GP I b a (1 01 8C→T)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有す るものを例示できる。
センスプライマ一
CCCAGGGCTCCTGNCG： 配列番号 5 2、 又は
CCCCAGGGCTCCTGNTG： 配列番号 5 3
ァンチセンスプライマ一
TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG： 配列番号 5 4 同様に、 PA M (- 668/4G—5G)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有す るものを例示できる。
センスプライマー
GGCACAGAGAGAGTCTGGACACG： 配列番号 5 5 '
アンチセンスプライマー
GGCCGCCTCCGATGATACA： 配列番号 5 6 同様に、 P0N (584G→A)多型解析用の核酸プライマ一として次の配列を有するも のを例示できる。
センスプライマ一 ACCCAAATACATCTCCCAGGANCG： 配列番号 5 7、 又は
AACCCAAATACATCTCCCAGGNCT： 配列番号 5 8
アンチセンスプライマー
GAATGATATTGTTGCTGTGGGAC： 配列番号 5 9
—方、 プローブの具体例として以下のものを挙げることができる,
ApoC- l I I (- 482C→T)多型解析用プローブとして
AGCCACTGATGCNCGGTCT： 配列番号 6 0、 又は
AGCCACTGATGCNTGGTCT： 配列番号 6 1 。
Eセレクチン（561 A—C)多型解析用プローブとして
CACCGTGGCCANTGCAGGAT：配列番号 6 2、 又は
CACCGTGGCCANGGCAGGAT： 配列番号 6 3。
FABP2 (2445G→A)多型解析用プローブとして
GAATCAAGNGCTTTTCGAAACATT： 配列番号 6 4、 又は
GAATCAAGNACTTTTCGAAACATT： 配列番号 6 5。
PA I 1 (-668/4G→5G)多型解析用プローブとして
TGGACACGTGGGGGAGTCAG： 配列番号 6 6、 又は
TGGACACGTGGGGAGTCAGC： 配列番号 6 7。 以上の核酸プライマ一、 核酸プローブは単なる一例であって、 核酸プライマー であれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、 他方核酸プローブであ れぱ目的のハイプリダイゼーション反応を支障なく行える限度において一部の塩 基配列に改変が施されたものであってもよい。 ここでの「一部の改変」とは、 塩基 の一部が欠失、 置換、 挿入及びノ又は付加されていることを意味する。 改変にか かる塩基数は、 例えば 〜 7個、 好ましくは 〗〜 5個、 更に好ましくは、 1〜3個で ある。 尚、 このような改変は、 原則として多型部位に対応する塩基以外の部分に おいて行われる。ただし、解析対象の多型が PAI 1 (- 668/4G→5G)多型の場合には、 多型部位に対応する塩基の一部を改変して得られる核酸をプライマー又はプロ一 ブとして用いることも可能である。 多型解析用核酸 （プローブ、 プライマ一） には、 解析方法に応じて適宜 DNA断 片又は RNA断片が用いられる。 多型解析用核酸の塩基長はそれぞれの機能が発揮 される長さであればよく、 プライマーとして用いられる場合の塩基長の例として は 10~50bp程度、好ましくは 15~40bp程度、 更に好ましくは 15~30bp程度であ る。
尚、 プライマーとして用いられる場合には増幅対象に特異的にハイブリダィズ し、 目的の DNAフラグメントを増幅することができる限り錶型となる配列に対し て多少のミスマッチがあってもよい。 プローブの場合も同様に、 検出対象の配列 と特異的なハイブリダィズが行える限り、 検出対象の配列に対して多少のミスマ ツチがあってもよい。 ミスマッチの程度としては、 1 〜数個、 好ましくは 1 〜 5 個、 更に好ましくは 1 ~ 3個である。
多型解析用核酸 （プライマー、 プローブ） はホスホジエステル法など公知の方 法によって合成することができる。 尚、 多型解析用核酸の設計、 合成等に関して は成書 （例えば、 Mol ecular Cloning, Thi rd Edi t ion, Cold Spring Harbor Lab oratory Press, New York) を参考にすることができる。 本発明における多型解析用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。 このような標識化核酸を用いることにより、 例えば増幅産物の標識量を指標とし て多型の解析を行うことができる。 また、 多型を構成する各遺伝子型の遺伝子に おける部分 DMA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された 2種類のブラ イマ一を互いに異なる標識物質で標識しておけば、 増幅産物から検出される標識 物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。 このような標識化プ ライマーを用いた検出方法の具体例としては、 多型を構成する各遺伝子型のセン ス鎖にそれぞれ特異的にハイプリダイズする 2種類の核酸プライマ一 （ァリル特 異的センスプライマ一） をフル才レセインイソチ才シァネ一卜とテキサスレッ ド でそれぞれ標識し、 これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブ リダィズするアンチセンスプライマ一とを用いて多型部位を含む部分 D N A領域を 増幅し、 得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出す る方法を挙げることができる。 尚、 ここでのアンチセンスプライマ一を例えばビ 才チンで標識しておけば、 ピオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅 産物の分離を行うことができる。 多型解析用核酸の標識に用いられる標識物質としては 32P などの放射性同位元 素、 フル才レセインイソチ才シァネー卜、 テ卜ラメチルローダミンイソチ才シァ ネ一卜、 テキサスレッ ドなどの蛍光物質を例示でき、 標識方法としてはアルカリ フォスファターゼ及び T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた 5'末端標識法、 T4 DNAポリメラーゼゃ Kl enow断片を用いた 3'末端標識法、ニック トランスレーショ ン法、 ランダ厶プライマー法 (Mol ecular Cloning, Thi rd Edi t ion, Chapter 9， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) などを例示できる。 以上の多型解析用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。 固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、 ビーズ状などに加工しておけば、 こ れら固定化核酸を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。 核酸試料は、 被験者の血液、 皮膚細胞、粘膜細胞、 毛髪等から公知の抽出方法、 精製方法を用いて調製することができる。 多型解析対象の遺伝子を含むものであ れば、 任意の長さのゲノム DNAを核酸試料として用いることができる。 また、 必 ずしも解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在する核酸試料を用いる必要 はない。 即ち、 本発明の核酸試料としては、 解析対象の遺伝子のすべてが一の核 酸上に存在しているもの、 解析対象の遺伝子が二以上の核酸上に分かれて存在し ているもののいずれをも用いることができる。 尚、 核酸試料において解析対象の 遺伝子が完全な状態 （即ち、 遺伝子の全長が存在する状態） でなくても、 少なく とも解析される多型部位が存在している限りにおいて断片的、 部分的な状態であ つてもよい。 各遺伝子多型の解析は遺伝子多型ごとに、又は複数若しくは全部を同時に行う。 前者の場合としては、 例えば被験者から得た核酸試料を解析対象の多型の数に合 わせて分注し、 各多型の解析を個別に行う。 後者の場合としては、 例えば DNAチ ップまたはマイクロアレイによって行うことができる。 尚、 ここでいう同時とは 解析過程のすべての操作が同時に行われることのみを意味するのではなく、 一部 の操作 （例えば、 核酸増幅操作、 プローブのハイブリダィズ、 又は検出） が同時 に行われる場合も含む。 解析対象の遺伝子の転写産物である mRNA を利用して各遺伝子の多型を解析す ることもできる。 例えば、 被験者の血液、 尿等から解析対象である遺伝子の mRNA を抽出、 精製した後、 ノーザンプロッ ト法 （Molecular Cl oning, Thi rd Edi t ion, 7.42, Col d Spring Harbor Laboratory Press, New York), ドッ 卜ブロッ 卜法 (M o I ecu I ar Clon ing, Th i rd Ed i t i on, 7.46, Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York)、 RT— PCR法 (Mo I ecu I ar Cloning, Thi rd Ed i t ion, 8.46, Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York)、 DNAチップ （DNAアレイ） を用いた方法な どを実行することにより、 mRNAを出発材料として多型解析を行うことができる。 さらに、 上記の多型の中でアミノ酸の変化を伴うものについては、 解析対象の 遺伝子の発現産物を用いて多型解析を行うこともできる。 この場合、 多型部位に 対応するアミノ酸を含んでいる限り、 部分タンパク質、 部分ペプチドであっても 解析用試料として用いることができる。 このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、 多型部位のアミ ノ酸を直接分析する方法、 又は立体構造の変化を利用して免疫学的に分析する方 法などが挙げられる。 前者としては、 周知のアミノ酸配列分析法 （エドマン法を 利用した方法） を用いることができる。 後者としては、 多型を構成するいずれか の遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナ ル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、 E L I S A法 （酵素結合免疫吸着定量 法）、 ラジオィ厶ノアツセィ、 免疫沈降法、 免疫拡散法等などを用いることができ る。 以上説明した本発明の検出方法を実行することにより得られる多型情報は、 冠 動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクの診断に利用することができる。 即ち、 本発 明は以上の検出方法によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定す る工程、 及び決定された核酸試料の遺伝子型から遺伝的リスクを求める工程を含 んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方法も提供する。 ここでの遺伝子 型の決定は、 典型的には、 検出対象の多型に関して核酸試料の両アレルがいずれ の遺伝子型をそれぞれ有するかを決定することである。 ApoE (3932T→C)多型が検 出対象である場合を例に採れば、 典型的には核酸試料におけるァポリポプロティ ン Eの遺伝子型が TT ( 3932位塩基が両アレル共に Tのホモ接合体）、 CT ( 3932位 塩基が Tのアレルと Cのアレルとのヘテロ接合体）、 及び CC ( 3932位塩基が両ァ レル共に Cのホモ接合体） の中のいずれであるかを決定することである。 後述の実施例で得られた結果を考慮すれば、 高精度かつ予知確率の高い冠動脈 形成術後再狭窄の遺伝的リスクの診断を可能とするために、例えば ApoE (3932T→ C)多型であれば核酸試料の遺伝子型が CC又は TCのいずれかであるか、 それとも TTであるかが決定される。 同様に、 GP I a (1 648A→G)多型であれば GGであるか、 それとも AG又は AAのいずれかであるか、 TNF a (- 863C→A)多型であれば AA又は CAのいずれかであるか、 それとも CCであるか、 G-プロテイン/ 3 3 (825C→T)多型 であれば TTであるか、 それとも CT又は CCのいずれかであるか、 ApoC- 1 I I (- 482 C→T)多型であれば TT又は CTのいずれかであるか、 それとも CCであるか、 或は TTであるか、 それとも CT又は CCのいずれかであるか、 AGT (- 6G—A)多型であれ ば AA又は GAのいずれかであるか、それとも GGであるか、 TSP4 (1 186G→C)多型で あれば CC又は GCのいずれかであるか、それとも GGであるか、 TM (21 36C→T)多型 であれば TT又は CTのいずれかであるか、 それとも CCであるか、 TP0 (571 3A→G) 多型であれば GGであるか、 それとも AG又は AAのいずれかであるか、 PAF- AH (99 4G→T)多型であれば TT又は GTのいずれかであるか、 それとも GGであるか、 Eセ レクチン（561 A→C)多型であれば CC又は ACのいずれかであるか、 それとも AAで あるか、 FABP2 (2445G→Aであれば AA又は GAのいずれかであるか、 それとも GG であるか、 GP I b a ( 1 01 8C→T)多型であれば TT又は CTのいずれかであるか、 それ とも CCであるか、 PA I 1 (- 668/4G→5G)多型であれば 5G/5G又は 4G/5Gのいずれか であるか、 それとも 4G/4Gであるか、 P0N (584G→A)多型であれば AA又は GAのい ずれか、 それとも GGであるかが決定される。 冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを診断することにより、 冠動脈形成術後 に再狭窄を生ずるおそれの程度 （生じ易さ） が予測される。 即ち、 本発明の診断 方法によって冠動脈形成術後に再狭窄を生ずるリスクの評価が行える。 このよう な評価を行えることは、 事前に適切な治療法の選択を可能とすることから臨床上 極めて有意義である。 本発明で得られる再狭窄の発生に関連する遺伝情報を利用して、 冠動脈形成術 後の再狭窄発生率を低下させることができる。 例えば、 本発明の診断方法を実施 した結果、 解析対象の多型が再狭窄の発生リスクを高める遺伝子型であった場合 に、 当該多型について発症リスクの低い遺伝子型を有する遺伝子を生体内に導入 すれば、 当該遺伝子の発現によって再狭窄の発生リスクが低減することを期待で きる。再狭窄発生リスクの高い遺伝子型を有する遺伝子の mRNAに対するアンチセ ンス鎖を導入し、当該 mRNAの発現を抑制することによつても同様の効果が期待さ れる。 このような遺伝子等の生体への導入は、 例えば遺伝子導入用プラスミ ド又はゥ ィルスベクターを用いた方法、 エレク ト口ポーレーシヨン（Potter, Η· et al.， P roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81， 7161-7165 (1984) )、超音波マイクロバブル（ L awrie, A. , et al. Gene Therapy 7, 2023-2027 (2000))、 リポフエクシヨン（Fe Igner, P. L. et aに， Proc. Nat I . Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417 (1984)), マイクロインジェクション (Graessmann, M. & Graessmann, A.， Proc. Nat I . Acad. Sci. U.S.A. 73, 366- 370 (1976))等の方法により行うことができる。 これらの方 法を利用した遺伝子等の導入は生体に対して直接的 （in vivo法） 又は間接的 （e x vivo法） に行うことができる。
また、 予め遺伝子等をコーティングした （遺伝子導入用プラスミ ドやウィルス ベクターに保持させたものなどをコ一ティングしてもよい） ステン卜等の器具を 用いて冠動脈形成術と同時に、 又は冠動脈形成後に以上のような遺伝子導入を行 うこともできる。 本発响の第 2の局面は、 上述した本発明の検出方法又は診断方法に使用される キッ ト （遺伝子型検出用キッ 卜、 又は冠動脈形成術後再狭窄診断用キッ ト） を提 供する。 かかるキッ 卜には上記の（1)〜（6)の多型からなるグループより選択され る二つ以上の多型を解析するための核酸 （多型解析用核酸） が含まれる。 他の態 様としては上記の（7) ~ (11)の多型からなるグループより選択される二つ以上の 多型を解析するための核酸 （多型解析用核酸） を含んでキッ トが構築.される。 更 に他の態様としては上記の（12) ~ (17)の多型からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析するための核酸 （多型解析用核酸） を含んでキッ トが構築さ れる。 更に他の態様としては上記の（18) ~ (22)の多型からなるグループより選択 される二つ以上の多型を解析するための核酸 （多型解析用核酸） を含んでキッ ト が構築される。
多型解析用核酸は、 それが適用される解析方法 （上述したァリル特異的核酸等 を用いた PCR法を利用する方法、 PCR- RFLP法、 PCR- SSCP、 TaqMan- PCR法、 Invad er法等） において、 解析対象の多型部分を含む DMA領域又はそれに対応する mRN A を特異的に増幅できるもの （プライマ一） 又は特異的に検出できるもの （プロ ーブ） として設計される。 以下に本発明において提供されるキッ トの具体例を示 す。 以下の（1 ) ~ (6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでなる 遺伝子型検出用キッ ト、
(1 ) 3932位塩基が Tであるァポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部 分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸、又は 3932位塩基が Cであるァポリポプ ロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 (2) 1 648位塩基が Aであるグリコプロテイン l a遺伝子の 1 648位塩基を含む部 分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸、又は 1 648位塩基が Gであるグリコプロ ティン l a遺伝子の 1 648位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(3) -863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA 領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 863 位塩基が Aである腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(4) 825位塩基が Cである G-プロテイン ；8 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基を 含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 825位塩基が Tである G-プ 口ティン j8 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配 列を有する核酸、
(5) -482位塩基が Cであるァポリポプロティン C- 1 I I 遺伝子の- 482位塩基を含 む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 482位塩基が Tであるァポリ ポプロティン C- M I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有 する核酸、 及び
(6) -6位塩基が Gであるアンギオテンシノ一ゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 6位塩基が Aであるアンギオテンシ ノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸。 以上では、 （1 ) ~ (6)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキッ トを 構成しているが、 （1 ) ~ (6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグ ループから二つ以上の核酸を選択してキッ トを構成してもよい。例えば、（1 )〜（5) からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比と P値を考慮して選択される 上位 5位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸を選択し てキッ トを構成したり、 （1)、 （3)、 （4)、 及び（5)からなるグループ （後述の実施 例においてォッズ比が上位 4位までの多型を解析するための核酸） より二つ以上 の核酸を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（7)〜 1 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ ト、
(7) 1186位塩基が Gである トロンポスポンジン 4遺伝子の 1186位塩基を含む部 分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 1186位塩基が Cである トロ,ンボス ボンジン 4遺伝子の 1186位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(8) - 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 ex 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA 領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 863 位塩基が Aである腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸、
(9) 2136位塩基が Cである 卜ロンボモジュリン遺伝子の 2136位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 2136位塩基が Tである 卜ロンボモジ ユリン遺伝子の 2136位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(10) 5713位塩基が Aである 卜ロンポポイエチン遺伝子の 5713位塩基を含む部 分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 5713位塩基が Gである 卜口ンボポ イエチン遺伝子の 5713位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、 及び
(11) 994位塩基が Gである血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 99 4位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 994位塩基が T である血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核酸。
以上では、（7)~ (11)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜を 構成しているが、 （7)~ (11)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグ ループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜を構成してもよい。例えば、 （7)~ (1 0)からなるダループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 4位までの多型を解 析するための核酸） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成したり、 (7)~(9)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 3位までの多 型を解析するための核酸） よリニつ以上の核酸を選択してキッ 卜を構成すること ができる。 以下の（12)〜 7)からなるグループよリ選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ ト、
(12)561位塩基が Aである E-セレクチン遺伝子の 561位塩基を含む部分 DNA領 域に相補的な配列を有する核酸、 又は 561 位塩基が Cである E-セレクチン遺伝子 の 561位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、
(13) 2445位塩基が Gである脂肪酸結合夕ンパク質 1遺伝子の 2445位塩基を含 む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 2445位塩基が Aである脂肪酸 結合タンパク質 2遺伝子の 2445位塩基を含む部分 D M A領域に相補的な配列を有す る核酸、
(14) 1018位塩基が Cであるダリコプロテイン Ibex 遺伝子の 1018位塩基を含む 部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 1018位塩基が Tであるグリコプ 口ティン Ibex 遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する 核酸、
(15)- 668位から 3'方向に連続して 4個の Gが存在するプラスミノ一ゲン活性化 因子インヒビ夕一 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有 する核酸、又は- 668位から 3'方向に連続して 5個の Gが存在するプラスミノーゲ ン活性化因子ィンヒビ夕ー 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域に相補的な 配列を有する核酸、
( 1 6) 584位塩基が Gであるパラォキソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DN A領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 584位塩基が Aであるパラ才キソナー ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 及び (1 7) 3932位塩基が Tであるァポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む 部分 DMA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 3932位塩基が Cであるアポリポ プロテイン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 D N A領域に相補的な配列を有する核 酸。
以上では、 （1 2)〜（1 7)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜 を構成しているが、 （1 2)〜（1 7)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かか るグループから二つ以上の核酸を選択してキッ トを構成してもよい。 例えば、 （1 2 ) ~ ( 16 )からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 5位までの多 型を解析するための核酸）より二つ以上の核酸を選択してキッ トを構成したり、（1 2)〜（1 5)からなるダル一プ （後述の実施例においてォッズ比が上位 4位までの核 酸） よリニつ以上の核酸を選択してキッ トを構成することができる。 以下の（ 1 8 ) ~ ( 22 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ ト、
(1 8) - 668位から 3 '方向に連続して 4個の Gが存在するプラスミノ一ゲン活性化 因子インヒビ夕一 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有 する核酸、又は- 668位から 3 '方向に連続して 5個の Gが存在するプラスミノーゲ ン活性化因子ィンヒビター 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DMA領域に相補的な 配列を有する核酸
(1 9) - 482位塩基が Cであるァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を含 む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、 又は- 482位塩基が Tであるァポリ ポプロティン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有 する核酸、
(20) 584位塩基が Gであるパラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DN A領域に相補的な配列を有する核酸、 又は 584位塩基が Aであるパラ才キソナー ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(21 ) 1 01 8位塩基が Cであるダリコプロテイン I b a 遺伝子の 1 01 8位塩基を含む 部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 1018位塩基が Tであるグリコプ 口ティン I b a 遺伝子の 1 01 8位塩基を含む部分 DNA領域に相補的な配列を有する 核酸、 及び '
(22) 3932位塩基が Tであるァポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む 部分 DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は 3932位塩基が Cであるァポリポ プロテイン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DMA領域に相補的な配列を有する核 酸。
以上では、 （1 8)〜（22)からなるグループから二つ以上の核酸を選択してキッ 卜 を構成しているが、 （1 8)〜（22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かか るグループから二つ以上の核酸を選択してキッ トを構成してもよい。 例えば、 （1 8)〜（21 )からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 4位までの多 型を解析するための核酸） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成し たり、 （1 8) ~ (20)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 3位 までの多型を解析するための核酸） より二つ以上の核酸を選択してキッ トを構成 することができる。 以下の（1 )〜（6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含ん でなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(1 )核酸試料中のアポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基が Tである場合に のみ、該ァポリポプロティン Ε遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DMA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のアポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基が Cである場合にのみ、該ァポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 (2)核酸試料中のグリコプロテイン l a遺伝子の 1 648位塩基が Aである場合にの み、 該グリコプロテイン l a遺伝子の 1 648位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のグリコプロテイン l a 遺伝子の 1 648位塩基が Gである場合にのみ、該グリコプロテイン l a遺伝子の 1 6 48位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、 (3)核酸試料中の腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基が Cである場合にのみ、 該腫瘍壊死因子 α 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中の腫瘍壊死因子 遺伝子の- 863 位塩基が Aである場合にのみ、 該腫瘍壊死因子 α 遺伝子の- 863位塩基を含む部 分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、
(4)核酸試料中の G-プロテイン jS 3サブユニッ ト遺伝子の 825位塩基が Cであ る場合にのみ、該 G-プロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中の G - プロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基が Τである場合にのみ、該 G -プ ロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ ト、
(5)核酸試料中のアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子の- 482位塩基が Cである場 合にのみ、該ァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域 を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のアポリポプ 口ティン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基が Τである場合にのみ、 該ァポリポプロティ ン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計 された核酸セッ 卜、 及び
(6)核酸試料中のアンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基が Gである場合に のみ、 該アンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のアンギオテンシノ一 ゲン遺伝子の- 6位塩基が Aである場合にのみ、該アンギオテンシノーゲン遺伝子 の- 6位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト c 以上では、 （1 ) ~ (6)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキ ッ トを構成しているが、 （1 )〜（6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例 えば、 （1 ) ~ (5)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比と P値を考慮 して選択される上位 5位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） よリニつ以上 の核酸セッ トを選択してキッ トを構成したり、 （1 )、 （3)、 （4)、 及び（5)からなる グループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 4位までの多型を解析するため の核酸セッ ト） よリニつ以上の核酸セッ トを選択してキッ 卜を構成することがで さる。 以下の（ 7 )〜（ 1 1 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(7)核酸試料中の卜口ンボスポンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基が Gである場合に のみ、該トロンポスポンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のトロンポスポンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基が Cである場合にのみ、該卜ロンボスボン-ジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(8)核酸試料中の腫瘍壊死因子 0； 遺伝子の- 863位塩基が Cである場合にのみ、 該腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中の腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863 位塩基が Aである場合にのみ、 該腫瘍壊死因子 α 遺伝子の- 863位塩基を含む部 分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(9)核酸試料中の卜口ンボモジユリン遺伝子の 2136位塩基が Cである場合にの み、該トロンボモジュリン遺伝子の 2136位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のトロンボモジュリン遺伝 子の 2136位塩基が Tである場合にのみ、 該卜ロンポモジュリン遺伝子の 2136位 塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セヅ 卜、
(10)核酸試料中の卜口ンボポイエチン遺伝子の 5713位塩基が Aである場合にの み、該卜ロンポポイエチン遺伝子の 5713位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のトロンポポイエチン遺伝 子の 5713位塩基が Gである場合にのみ、 該トロンポポイエチン遺伝子の 5713位 塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 及び
(11)核酸試料中の血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の 994位塩基 が Gである場合にのみ、 該血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994 位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又 は核酸試料中の血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラ一ゼ遺伝子の 994位塩基が丁 である場合にのみ、 該血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩 基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト。
以上では、（7)~ (11)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキ ッ 卜を構成しているが、 ひ）〜（11)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ 卜を構成してもよい。 例 えば、 （7) ~ ( 10)からなるグループ（後述の実施例において才ッズ比が上位 4位ま での多型を解析するための核酸セッ ト） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキ ッ トを構成したり、 （7)〜（9)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比 が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜 を選択してキッ トを構成することができる。 以下の（12) ~ (17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(12)核酸試料中の E-セレクチン遺伝子の 561位塩基が Aである場合にのみ、該 E-セレクチン遺伝子の 561位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように 設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中の E-セレクチン遺伝子の 561位塩基が C である場合にのみ、該 E-セレクチン遺伝子の 561位塩基を含む部分 DNA領域を特 異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(13)核酸試料中の脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の 2445位塩基が Gである場合 にのみ、該脂肪酸結合夕ンパク質 2遺伝子の 2445位塩基を含む部分 DMA領域を特 異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中の脂肪酸結合タン パク質 2遺伝子の 2445位塩基が Aである場合にのみ、該脂肪酸結合タンパク質 1 遺伝子の 2445位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核 酸セッ 卜、
(14)核酸試料中のダリコプロティン Iba 遺伝子の 1018位塩基が Cである場合 にのみ、 該グリコプロテイン Iba 遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DNA領域を特 異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のグリコプロティ ン Iba 遺伝子の 1018位塩基が Tである場合にのみ、該グリコプロティン I b α 遺 伝子の 1018位塩基を含む部分 D Ν Α領域を特異的に増幅するように設計された核酸 セッ 卜、
(15)核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子において - 668位から 3'方向に Gが 4個連続して存在する場合にのみ、プラスミノーゲン活 性化因子インヒビター 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DMA領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因 子インヒビター 1遺伝子において- 668位から 3 '方向に Gが 5個連続して存在する 場合にのみ、 該プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子の該配列部分 を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、
(1 6)核酸試料中のパラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基が Gである場合にのみ、 該パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のパラ才キソナーゼ遺伝子の 584 位塩基が Aである場合にのみ、 該パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部 分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 及び
(1 7)核酸試料中のアポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基が Tである場合に のみ、アポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のアポリポプロテイン E 遺伝子の 3932位塩基が Cである場合にのみ、該ァポリポプ口ティン E遺伝子の 3 932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜。 以上では、 （1 2) ~ (1 7)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ 卜を構成しているが、（1 2) ~ (1 7)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ 卜を構成してもよい。 例えば、 （1 2)〜（1 6)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 5 位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択し てキッ トを構成したり、 （1 2)〜（1 5)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ比が上位 4位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） よリニつ以上の核酸 セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（1 8)〜（22)からなるグループよリ選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、 (1 8)核酸試料中のプラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1 遺伝子において -668位から 3 '方向に Gが 4個連続して存在する場合にのみ、プラスミノ一ゲン活 性化因子インヒビター 1 遺伝子の該配列部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のプラスミノーゲン活性化因 子インヒビ夕一 1遺伝子において- 668位から 3 '方向に Gが 5個連続して存在する 場合にのみ、 該プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子の該配列部分 を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(1 9)核酸試料中のアポリポプロテイン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基が Cである場 合にのみ、該ァポリポプ口ティン C- I I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域 を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のアポリポプ ロティン C- I I I 遺伝子の- 482位塩基が Tである場合にのみ、 該ァポリポプロティ ン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計 された核酸セッ 卜、
(20)核酸試料中のパラオキソナーゼ遺伝子の 584位塩基が Gである場合にのみ、 該パラ才キソナ一ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のパラ才キソナ一ゼ遺伝子の 584 位塩基が Aである場合にのみ、 該パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部 分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、
(21 )核酸試料中のグリコプロティン I b a 遺伝子の 1 01 8位塩基が Cである場合 にのみ、 該グリコプロテイン I b ex 遺伝子の 1 01 8位塩基を含む部分 DMA領域を特 異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜、 又は核酸試料中のグリコプロティ ン I b a 遺伝子の 1 01 8位塩基が Tである場合にのみ、該グリコプロティン I b o; 遺 伝子の 1 01 8位塩基を含む部分 D M A領域を特異的に増幅するように設計された核酸 セッ ト、 及び
(22)核酸試料中のアポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基が Tである場合に のみ、該ァポリポプ口ティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 D N A領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ ト、 又は核酸試料中のアポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基が Cである場合にのみ、該ァポリポプ口ティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ ト ( 以上では、 （1 8) ~ (22)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ 卜を構成しているが、（1 8)〜（22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ トを構成してもよい。 例えば、 （1 8)〜（2 1 )からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 4 位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択し てキッ トを構成したり、 （1 8) ~ (20)からなるグループ （後述の実施例においてォ ッズ比が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸 セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（1 ) ~ (6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含ん でなる遺伝子型検出用キッ ト、
( 1 )ァポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 3932位塩基が Tであるアポリポ プロティン E遺伝子において 3932位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマー及び 又は 3932位塩基が Cであるアポリポ プロテイン E遺伝子において 3932位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的に ハイプリダイズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン E遺伝子の一部領 域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核 酸セッ 卜、
(2)ダリコプロテイン l a遺伝子の 1 648位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 1 648位塩基が Aであるグリコプロ ティン l a遺伝子において 1 648位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハ ィプリダイズするセンスプライマー及び/又は 1 648位塩基が Gであるダリコプロ ティン l a遺伝子において 1 648位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的に八 イブリダィズするセンスプライマーと、グリコプロテイン i a遺伝子の一部領域に 対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セ ッ ト、
(3)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅す るように設計された核酸セッ 卜であって、- 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 α 遺伝子において- 863位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダイ ズするアンチセンスプライマー及び/又は- 863位塩基が Αである腫瘍壊死因子 a 遺伝子において- 863位塩基を含む部分 D N A領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズするアンチセンスプライマーと、腫瘍壊死因子 α 遺伝子の一部領域に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 からなる核酸セッ 卜、
(4) G-プロティン j8 3サブュニッ ト遺伝子の 825位塩基を含む部分 DNA領域を特 異的に増幅するように設計された核酸セッ トであって、 825位塩基が Cである G - プロテイン 3 3サブュニッ 卜遺伝子において 825位塩基を含む部分 DNA領域、 に 対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマー及び 又は 825位塩基が T である G-プロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子において 825位塩基を含む部分 DMA 領域、 に対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 G-プロテイン β 3 サブユニッ ト遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチ センスプライマーと、 からなる核酸セッ ト、
(5)ァポリポプロティン C- 1 I I 遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域を特異 的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 -482位塩基が Cであるアポ リポプロティン C- I I I 遺伝子において- 482位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して 特異的にハイプリダイズするセンスプライマー及び/又は- 482位塩基が Tである ァポリポプロティン C- I I I遺伝子において- 482位塩基を含む部分 DMA領域、 に対 して特異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン C - 1 I I 遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマ 一と、 からなる核酸セッ ト、 及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の- 6位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 -6位塩基が Gであるアンギ才テ ンシノーゲン遺伝子において- 6位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハ イブリダィズするアンチセンスプライマー及び/又は- 6位塩基が Aであるアンギ 才テンシノ ゲン遺伝子において- 6位塩基を含む部分 D N A領域、 に対して特異的 にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 アンギオテンシノーゲン遺伝 子の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 からな る核酸セッ ト。
以上では、 （1 )〜（6)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （1 )〜（6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ トを構成してもよい。 例 えば、 （1 ) ~ (5)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比と P値を考慮 して選択される上位 5位までの多型を解析するための核酸セッ ト） より二つ以上 の核酸セッ トを選択してキッ トを構成したり、 （1 )、 （3)、 （4)、 及び（5)からなる グループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 4位までの多型を解析するため の核酸セッ ト） よリニつ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ トを構成することがで きる。 以下の（7)〜（1 1 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ 卜を含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(7) 卜ロンボスボンジン 4遺伝子の 1 1 86位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 1 1 86位塩基が Gである トロンボ スポンジン 4遺伝子において 1 1 86位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的に ハイプリダイズするセンスプライマー及び/又は 1 1 86位塩基が Cである トロンボ スポンジン 4遺伝子において 1 1 86位塩基を含む部分 D N A領域、に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマーと、 トロンボスボンジン 4遺伝子の一部領 域に対して特異的にハイプリダイズするアンチセンスプライマーと、 からなる核 酸セッ ト、
(8)腫瘍壊死因子 a 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅す るように設計された核酸セッ 卜であって、- 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 a 遺伝子において- 863位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダィ ズするアンチセンスプライマー及び 又は- 863位塩基が Aである腫瘍壊死因子 α 遺伝子において- 863位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズするアンチセンスプライマーと、腫瘍壊死因子 α 遺伝子の一部領域に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 からなる核酸セッ 卜、
(9)卜口ンポモジュリン遺伝子の 21 36位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 21 36位塩基が Cである 卜ロンボモ ジュリン遺伝子において 21 36位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的にハイ プリダイズするセンスプライマー及び/又は 21 36位塩基が Τである 卜口ンポモジ ュリン遺伝子において 21 36位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的にハイブ リダィズするセンスプライマーと、 トロンポモジュリン遺伝子の一部領域に対し て特異的にハイプリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セッ 卜、 ( 1 0) 卜口ンポポイエチン遺伝子の 571 3位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 571 3位塩基が Aである トロンポポ イエチン遺伝子において 571 3位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的にハイ ブリダィズするセンスプライマー及びノ又は 571 3位塩基が Gである トロンボポィ ェチン遺伝子において 571 3位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的にハイブ リダィズするセンスプライマーと、 トロンボポイエチン遺伝子の一部領域に対し て特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セッ ト、 及び
( 1 1 )血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩基を含む部分 DN
A領域を特異的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 994位塩基が G である血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子において 994位塩基を含む 部分 DMA領域、 に対して特異的にハイプリダイズするセンスプライマ一及び/又 は 994位塩基が Tである血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子において 994位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダィズするセンスプ ライマーと、 血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の一部領域に対して 特異的にハイプリダイズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セッ 卜。 以上では、ひ）〜（Π )からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （了）〜（1 1 )の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ トを構成してもよい。 例 えば、 （7)〜（1 0)からなるダループ（後述の実施例においてォッズ比が上位 4位ま での多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ トを選択してキ ッ トを構成したり、 （7)〜（9)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比 が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ ト） よリニつ以上の核酸セッ 卜 を選択してキッ トを構成することができる。 以下の（1 2) ~ ( 1 7)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
( 1 2) E-セレクチン遺伝子の 56 1位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅する ように設計された核酸セッ トであって、 56 1位塩基が Aである E-セレクチン遺伝 子において 561位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダィズす るアンチセンスプライマ一及び/又は 561位塩基が Cである E-セレクチン遺伝子 において 561位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイブリダィズする アンチセンスプライマ一と、 E-セレクチン遺伝子の一部領域に対して特異的にハ イブリダィズするセンスプライマーと、 からなる核酸セッ ト、
(13)脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の 2445位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 2445位塩基が Gである脂肪酸 結合タンパク質 1遺伝子において 2445位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異 的にハイブリダィズするセンスプライマー及び Z又は 2445位塩基が Aである脂肪 酸結合タンパク質 2遺伝子において 2445位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、 脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子 の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 か らなる核酸セッ 卜、
(14)ダリコプロティン Iba 遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DMA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ トであって、 1018位塩基が Cであるグリコ プロティン Iba 遺伝子において 1018位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異 的にハイプリダイズするセンスプライマー及びノ又は 1018位塩基が Tであるグリ コプロティン Iba 遺伝子において 1018位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、グリコプロテイン Ibo: 遺伝子の —部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 から なる核酸セッ ト、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の- 668位における多型 部分を含む部分 D N A領域を特異的に増幅するように設計された一組のプライマ一 と、並びに- 668位から 3'方向に Gが 4個連続して存在するプラスミノ一ゲン活性 化因子インヒビ夕ー1 遺伝子において該配列部分を含む部分 DNA領域、 に対して 特異的にハイプリダイズするプローブ及び/又は- 668位から 3 '方向に Gが 5個連 続して存在するプラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子において該配 列部分を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイプリダイズするプローブと、 からなる核酸セッ ト、
(1 6)パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜であって、 584位塩基が Gであるパラ才キソナ ーゼ遺伝子において 584位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイプリ ダイズするセンスプライマー及び/又は 584位塩基が Aであるパラ才キソナーゼ 遺伝子において 584位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズするセンスプライマ一と、 パラ才キソナーゼ遺伝子の一部領域に対して特異的 にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セッ ト、 及び
(1 7) アポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 3932位塩基が Tであるァポリ ポプロティン E遺伝子において 3932位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的 にハイプリダイズするセンスプライマ一及び/又は 3932位塩基が Cであるァポリ ポプ口ティン E遺伝子において 3932位塩基を含む部分 DMA領域、に対して特異的 にハイプリダイズするセンスプライマーと、 ァポリポプロティン E遺伝子の一部 領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる 核酸セッ ト。
以上では、 （1 2) ~ (1 7)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ 卜を構成しているが、（1 2)〜（1 7)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ トを構成してもよい。 例えば、 （1 2) ~ (1 6)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 5 位までの多型を解析するための核酸セッ ト） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択し てキッ トを構成したり、 （1 2)〜（1 5)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ比が上位 4位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸 セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（1 8) ~ (22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
( 1 8)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の- 668位における多型 部分を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するように設計された一組のプライマー と、並びに- 668位から 3 '方向に Gが 4個連続して存在するプラスミノ一ゲン活性 化因子インヒビター 1 遺伝子において該配列部分を含む部分 DNA領域、 に対して 特異的にハイプリダイズするプロ一プ及び Z又は- 668位から 3 '方向に Gが 5個連 続して存在するプラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕一〗 遺伝子において該配 列部分を含む部分 DMA領域、 に対して特異的にハイプリダイズするプローブと、 からなる核酸セッ 卜、
( 1 9)ァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA領域を特異 的に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 -482位塩基が Cであるアポ リポプロテイン C- I I I 遺伝子において- 482位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して 特異的にハイブリダィズするセンスプライマー及び 又は- 482位塩基が Tである アポリポプロテイン C- I I I 遺伝子において- 482位塩基を含む部分 DNA領域、 に対 して特異的にハイプリダイズするセンスプライマーと、 アポリポプロテイン C - I I I 遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマ —と、 からなる核酸セッ 卜、
( 20 )パラ才キソナーゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅 するように設計された核酸セッ 卜であって、 584位塩基が Gであるパラ才キソナ —ゼ遺伝子において 584位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異的にハイプリ ダイズするセンスプライマー及び/又は 584位塩基が Aであるパラォキソナーゼ 遺伝子において 584位塩基を含む部分 DMA領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズするセンスプライマ一と、 パラ才キソナーゼ遺伝子の一部領域に対して特異的 にハイプリダイズするアンチセンスプライマーと、 からなる核酸セッ 卜、
(21)ダリコプロテイン Ibex 遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DNA領域を特異的 に増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 1018位塩基が Cであるダリコ プロティン Ibex 遺伝子において 1018位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特異 的にハイプリダイズするセンスプライマー及び 又は 1018位塩基が Tであるグリ コプロテイン Ibex 遺伝子において 1018位塩基を含む部分 DNA領域、 に対して特 異的にハイブリダィズするセンスプライマーと、ダリコプロテイン Iba 遺伝子の —部領域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 から なる核酸セッ 卜、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅するように設計された核酸セッ 卜であって、 3932位塩基が Tであるアポリポ プロテイン E遺伝子において 3932位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的に ハイブリダィズするセンスプライマ一及び/又は 3932位塩基が Cであるアポリポ プロティン E遺伝子において 3932位塩基を含む部分 DNA領域、に対して特異的に ハイプリダイズするセンスプライマ一と、 アポリポプロテイン E遺伝子の一部領 域に対して特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマーと、 からなる核 酸セッ 卜。
以上では、 （18)~(22)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ 卜を構成しているが、（18)~(22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例えば、 （18)~(21)からなるグループ （後述の実施例においてォッズ比が上位 4 位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ トを選択し てキッ トを構成したり、 （18)〜（20)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ比が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸 セッ トを選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（ 1 ) ~ ( 6 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含ん でなる遺伝子型検出用キッ ト、
(1 ) 3932位塩基が Tであるアポリポプロテイン E遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 3932位塩基が Cであるァポリ ポプロティン E遺伝子のアンチセンス鎖において 3932位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及びアポリポプロテイン E遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハイブリダイズし且つ前記第 1 核酸 又は前記第 2核酸とともに使用さ れてァポリポプロティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(2) 1 648位塩基が Aであるグリコプロティン I a遺伝子のアンチセンス鎖におい て 1 648位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 1 の標 識物質で標識された第 1 核酸と、 1 648位塩基が Gであるグリコプロテイン l a遺 伝子のアンチセンス鎖において 1 648位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハ イブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びグリコプロテ イン l a 遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィズし且つ前 記第 1 核酸 又は前記第 2核酸とともに使用されてグリコプロテイン l a 遺伝子 の 1 648位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(3) - 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 a遺伝子のセンス鎖において- 863位塩 基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 1 の標識物質で標 識された第 1 核酸と、 -86 3位塩基が Aである腫瘍壊死因子 α 遺伝子のセンス鎖 において- 863位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、及び腫瘍壊死因子 a 遺伝子のアンチセン ス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記 第 2核酸とともに使用されて腫瘍壊死因子 at 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DN A領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(4) 82 5位塩基が Cである G-プロティン 3サブュニッ 卜遺伝子のアンチセンス 鎖において 825位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ 第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 82 5位塩基が Tである G-プロティン β 3 サブユニッ ト遺伝子のアンチセンス鎖において 825位塩基を含む部分領域、 に 対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及び G-プロテイン /3 3サブュニッ 卜遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的 にハイブリダィズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されて G -プロティン ；8 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に 増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、
( 5) - 482位塩基が Cであるアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子のアンチセンス鎖 において- 482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリ ダイズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 -482位塩基が Tであるァ ポリポプ口ティン C- l I I遺伝子のアンチセンス鎖において- 482位塩基に対応する 塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で 標識された第 2核酸と、 及びアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子のセンス鎖の一部 領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸 Z又は前記第 2核酸と ともに使用されてアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA 領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、 及び (6) - 6位塩基が Gであるアンギオテンシノ一ゲン遺伝子のセンス鎖において - 6 位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 1 の標識物質 で標識された第 1 核酸と、 -6位塩基が Aであるアンギオテンシノーゲン遺伝子の センス鎖において- 6位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダイズし 且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びアンギオテンシノーゲン遺伝 子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸 Z又は前記第 2核酸とともに使用されてアンギオテンシノ一ゲン遺伝子の - 6 位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からな る核酸セッ 卜。
以上では、 （1 )〜（6)からなるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （1 )〜（6)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例 えば、 （1 )〜（5)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比と P値を考慮 して選択される上位 5位までの多型を解析するための核酸セッ ト） より二つ以上 の核酸セッ トを選択してキッ トを構成したり、 （1 )、 （3)、 （4)、 及び（5)からなる グループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 4位までの多型を解析するため の核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することがで さる。 以下の（7) ~ ( Π )からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ 卜を含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(7) 1 1 86位塩基が Gである 卜ロンボスボンジン 4遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 1 1 86位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1核酸と、 1 1 86位塩基が Cである トロン ボスボンジン 4遺伝子のアンチセンス鎖において Π 86位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及びト口ンボスポンジン 4遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使用さ れてトロンポスポンジン 4遺伝子の 1186位塩基を含む部分 D N A領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(8)- 863位塩基が Cである腫瘍壊死因子 α遺伝子のセンス鎖において- 863位塩 基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 1 の標識物質で標 識された第 1 核酸と、 -863位塩基が Αである腫瘍壊死因子 a 遺伝子のセンス鎖 において- 863位塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、及び腫瘍壊死因子 α 遺伝子のアンチセン ス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィズし且つ前記第 1核酸/又は前記 第 2核酸とともに使用されて腫瘍壊死因子 α 遺伝子の- 863位塩基を含む部分 DN A領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(9) 2136位塩基が Cであるトロンポモジュリン遺伝子のアンチセンス鎖におい て 2136位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 1 の標 識物質で標識された第 1核酸と、 2136位塩基が Tである トロンボモジユリン遺伝 子のアンチセンス鎖において 2136位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイ プリダィズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びトロンポモジュ リン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使用されてトロンボモジュリン遺伝子の 213 6位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 から なる核酸セッ 卜、
(10) 5713位塩基が Aである トロンボポイエチン遺伝子のアンチセンス鎖におい て 5713位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 1 の標 識物質で標識された第 1 核酸と、 5713位塩基が Gである 卜口ンボポイエチン遺伝 子のアンチセンス鎮において 5713位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイ プリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びト口ンボポイエ チン遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されて卜ロンポポイエチン遺伝子の 57 1 3位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 から なる核酸セッ 卜、 及び
( 1 1 ) 994位塩基が Gである血小板活性化因子ァセチルヒドロラーゼ遺伝子のァ ンチセンス鎖において 994位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異 的にハイブリダィズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 994 位塩基 が Tである血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 994位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及び血小板活性化因子ァセチ ルヒ ドロラーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし 且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸とともに使用されて血小板活性化因子ァセ チルヒドロラーゼ遺伝子の 994位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅するこ とが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト。
以上では、（ 7 ) ~ ( 1 1 )からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキ ッ 卜を構成しているが、 （7) ~ ( 1 1 )の二つ以上を任意に選択してグループとし、 か かるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例 えば、 （7)〜（1 0)からなるダループ（後述の実施例において才ッズ比が上位 4位ま での多型を解析するための核酸セッ ト） よリニつ以上の核酸セッ トを選択してキ ッ トを構成したり、 （7) ~ (9)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比 が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜 を選択してキッ トを構成することができる。 以下の（1 2)〜（1 7)からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ 卜、
(12) 561位塩基が Aである E-セレクチン遺伝子のセンス鎖において 561位塩基 に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的に八イブリダィズし且つ第 1 の 標識物質で標識された第 1 核酸と、 561位塩基が Cである E-セレクチン遺伝子の センス鎖において 561 位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的に ハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、及び E-セレクチ ン遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前 記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸と; tもに使用されて E-セレクチン遺伝子の 561位 塩基を含む部分 DN A領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる 核酸セッ 卜、
(13) 2445位塩基が Gである脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子のアンチセンス鎖に おいて 2445位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 2445位塩基が Aである脂肪酸結合タンパク 質 1遺伝子のアンチセンス鎖において 2445位塩基を含む部分領域、に対して特異 的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及び脂肪酸 結合タンパク質 2遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダィズ し且つ前記第 1 核酸 Z又は前記第 2核酸とともに使用されて脂肪酸結合夕ンパク 質 2遺伝子の 2445位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(14) 1018位塩基が Cであるダリコプロテイン I ba 遺伝子のアンチセンス鎖に おいて 1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的に八イブリダ ィズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 1018位塩基が Tであるダリ コプロテイン I b ex 遺伝子のアンチセンス鎖において 1018位塩基に対応する塩基 を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識 された第 2核酸と、及びグリコ'プロテイン I b a 遺伝子のセンス鎖の一部領域に対 して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使 用されてダリコプロテイン I b a 遺伝子の 1 01 8位塩基を含む部分 DNA領域を特異 的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(1 5)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の- 668位における多型 部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組の核酸 （第 1 核酸及び第 2核酸） と、 -668位から 3 '方向に Gが 4個連続して存在するプラスミ ノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕一 1 遺伝子を錶型とし且つ前記一組の核酸を用い て増幅される核酸に対して特異的にハイブリダィズする第 3核酸と、及び- 668位 から 3'方向に Gが 5個連続して存在するプラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕 —1 遺伝子を錶型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異 的にハイブリダィズする第 4核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(1 6) 584位塩基が Gであるパラ才キソナーゼ遺伝子のァンチセンス鎖において 5 84位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且 つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 584位塩基が Aであるパラ才キソナ ーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において 584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びパラ才キソナ一ゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダ ィズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されてパラォキソナ一 ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが可能な第 3 核酸と、 からなる核酸セッ ト、 及び
(1 7) 3932位塩基が Tであるアポリポプロテイン E遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 3932位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1核酸と、 3932位塩基が Cであるァポリ ポプロティン E遺伝子のアンチセンス鎖において 3932位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及びアポリポプ口ティン E遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使用さ れてァポリポプ口ティン E遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜。
以上では、 （1 2)〜（1 7)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ 卜を構成しているが、（1 2)〜（1 7)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択してキッ 卜を構成してもよい。 例えば、 （1 2)〜り 6)からなるグループ （後述の実施例において才ッズ比が上位 5 位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択し てキッ トを構成したり、 （1 2) ~ (1 5)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ比が上位 4位までの多型を解析するための核酸セッ ト） より二つ以上の核酸 セッ 卜を選択してキッ 卜を構成することができる。 以下の（ 1 8 ) ~ ( 22 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸セッ トを含 んでなる遺伝子型検出用キッ ト、
(1 8)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の- 668位における多型 部分を含む部分 DNA領域を特異的に増幅するように設計された一組の核酸 （第 1 核酸及び第 2核酸） と、 -668位から 3 '方向に Gが 4個連続して存在するプラスミ ノーゲン活性化因子インヒビ夕一〗 遺伝子を錶型とし且つ前記一組の核酸を用い て増幅される核酸に対して特異的にハイプリダイズする第 3核酸と、及び- 668位 から 3 '方向に Gが 5個連続して存在するプラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕 - 1, 遺伝子を錶型とし且つ前記一組の核酸を用いて増幅される核酸に対して特異 的にハイブリダィズする第 4核酸と、 からなる核酸セッ ト、
(1 9) - 482位塩基が Cであるァポリポプ口ティン C- 1 I I遺伝子のアンチセンス鎮 において- 482位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリ ダイズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 -482位塩基が Tであるァ ポリポプ口ティン C-l I I遺伝子のアンチセンス鎖において- 482位塩基に対応する 塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で 標識された第 2核酸と、 及びアポリポプロテイン C- I I I遺伝子のセンス鎖の一部 領域に対して特異的にハイプリダイズし且つ前記第 1 核酸ノ又は前記第 2核酸と ともに使用されてアポリポプロテイン C- I I I 遺伝子の- 482位塩基を含む部分 DNA 領域を特異的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(20) 584位塩基が Gであるパラォキソナ一ゼ遺伝子のァンチセンス鎖において 5 84位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且 つ第 1 の標識物質で標識された第 1核酸と、 584位塩基が Aであるパラォキソナ ーゼ遺伝子のアンチセンス鎖において 584位塩基に対応する塩基を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識された第 2核酸と、 及びパラ才キソナーゼ遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダ ィズし且つ前記第 1核酸/又は前記第 2核酸とともに使用されてパラ才キソナー ゼ遺伝子の 584位塩基を含む部分 DMA領域を特異的に増幅することが可能な第 3 核酸と、 からなる核酸セッ 卜、
(21) 1018位塩基が Cであるグリコプロテイン I ba 遺伝子のアンチセンス鎖に おいて 1018位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダ ィズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 1018位塩基が Tであるダリ コプロテイン I ba 遺伝子のアンチセンス鎖において 1018位塩基に対応する塩基 を含む部分領域、 に対して特異的にハイプリダイズし且つ第 2の標識物質で標識 された第 2核酸と、及びダリコプロテイン Ibo; 遺伝子のセンス鎖の一部領域に対 して特異的にハイブリダイズし且つ前記第 1 核酸/又は前記第 2核酸とともに使 用されてダリコプロティン I ba 遺伝子の 1018位塩基を含む部分 DNA領域を特異 的に増幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ ト、 及び (22) 3932位塩基が Tであるァポリポプロティン Ε遺伝子のアンチセンス鎖にお いて 3932位塩基に対応す'る塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイプリダイ ズし且つ第 1 の標識物質で標識された第 1 核酸と、 3932位塩基が Cであるァポリ ポプロティン Ε遺伝子のアンチセンス鎖において 3932位塩基に対応する塩基を含 む部分領域、 に対して特異的にハイブリダィズし且つ第 2の標識物質で標識され た第 2核酸と、 及びアポリポプロテイン Ε遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して 特異的にハイブリダイズし且つ前記第 1核酸/又は前記第 2核酸とともに使用さ れてァポリポプ口ティン Ε遺伝子の 3932位塩基を含む部分 DNA領域を特異的に増 幅することが可能な第 3核酸と、 からなる核酸セッ 卜。
以上では、 （18)~(22)からなるグループから二つ以上の核酸セッ トを選択して キッ 卜を構成しているが、（18)〜（22)の二つ以上を任意に選択してグループとし、 かかるグループから二つ以上の核酸セッ 卜を選択してキッ 卜を構成してもよい。 例えば、 （18)〜（21)からなるグループ （後述の実施例においてォッズ比が上位 4 位までの多型を解析するための核酸セッ 卜） より二つ以上の核酸セッ 卜を選択し てキッ トを構成したり、 （18)~ (20)からなるグループ （後述の実施例において才 ッズ比が上位 3位までの多型を解析するための核酸セッ ト） よリニつ以上の核酸 セッ 卜を選択してキッ トを構成することができる。 以上のキッ トにおいては、 キッ トの使用方法に応じた一又は二以上の試薬 （バ ッファー、 反応用試薬、 検出用試薬など） などを組み合わせてもよい。
以下、 実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
<実施例 1 > 遺伝子多型の選択
PubMed [Nat i ona I Center for Biological Information (NCBI)] , Onl ine Mend e I i an inheritance in Men (NCBI), Single Nucleotide Polymorphism (NCBI)な どの数種類の公的データベースを用いて、 今までに報告された遺伝子の中から血管生 物学、 血小板 ·白血球生物学、 凝固線溶系、 脂質 '糖 'その他の代謝因子などの総合的 側面から冠動脈硬化、 冠動脈攣縮、 高血圧、 糖尿病、 高脂血症などとの関連が推 定される 71遺伝子を抜粋した。さらにこれらの遺伝子に存在する多型の中でプロ モーター領域ゃェクソンに存在するもの、 あるいはスプライスドナー部位ゃァク セプター部位に位置し、 遺伝子産物の機能変化との関連が予想されるものを中心 に 112多型を選択した （図 1 及び図 2)。
<実施例 2 > 遺伝子多型の決定
対象は 1998年 7月から 2001年 12月の間に冠動脈形成術（バルーン拡張術またはス テント挿入） のために入院した日本人 1869例 （男性 1313例、 女性 556例） である。 バルーン拡張術を行った冠動脈狭窄病変 1390箇所 （男性 910箇所、 女性 480箇所） およびステント挿入を行った 1001箇所 （男性 710箇所、 女性 291箇所） について検 討した。経過観察の冠動脈造影は冠動脈形成術後 6か月で行った。バルーン拡張術 後の急性閉塞あるいは亜急性ステン卜内血栓を生じた冠動脈狭窄病変は解析から 除外した。 定量的冠動脈計測は拡張末期で行い、 再狭窄は冠動脈形成術を行った 部位の最小血管内径狭窄が 50%以上と定義した。 それぞれの対象から静脈血 7mLを 50關 ol /L EDTA- 2Naを含むチューブに採血し、 ゲノム DNAを DMA抽出キッ ト （Qiagen, Chatsworth, CA) を用いて抽出した。 一塩 基多型の遺伝子型の決定は蛍 ·発光法によるァリル特異的プライマー · プロ一 ブ測定システム （東洋紡ジーンアナリシス、 敦賀、 日本） により行った （図 3及 び図 4を参照）。 多型部位を含む DNA断片は 5'末端にフル才レセィンィソチ才シォ ネ一卜 （f l uorescein i soth i ocyanate： FITC) またはテキサスレッド （Texas re d： TxR) で標識した 2種類のァリル特異的センス （またはアンチセンス） プライマ 一と 5'末端をピオチンで標識したアンチセンス （またはセンス） プライマ一を用 いて polymerase chain react ion (PCR) により増幅した。 また別法として、 多型 部位を含む DMA断片は 2種類のァリル特異的センス （またはアンチセンス） プライ マーと 5'末端をピオチンで標識したアンチセンス （またはセンス） プライマーを 用いて、 またはセンスプライマーと 5'末端をビ才チンで標識したアンチセンスプ ライマ一を用いて PCRにより増幅した。 反応溶液 （25mL) には 20ngの DNA、 5pmol の各プライマー、 0.2mmol/Lの各デ才キシヌクレオシド三リン酸、 卜 4 關 ol/Lの塩 化マグネシウム、 1Uの DNAポリメラーゼ（rTaq or KODpl us; 東洋紡、 大阪、 日本） を含み、 それぞれの DMAポリメラーゼ緩衝液を用いた。増幅プロ トコ一ルは初期変 性が 95°Cで 5分、 35- 45サイクルで変性が 95°Cで 30秒、 アニーリングが 55-67, 5°C で 30秒、 伸展が 72°Cで 30秒、 そして最終伸展が 72°Cで 2分とした。 蛍光法による遺伝子型の決定では、 増幅した DNA を 96穴プレー卜の各ゥエルで ス卜レブ卜アビジン結合磁気ビーズを含む溶液中で室温ィンキュベー卜した。 こ のプレー卜を磁気スタンド上に置き、 各ゥエルから上清を採取し、 0.01M NaOHを 含む 96穴プレー卜の各ゥエルに移した後、 マイクロプレー卜リ一ダ一により FITC は励起 ' 蛍光波長が 485nmと 538nm、 TxRは励起 · 蛍光波長が 584nmと 612 nmで蛍光 を測定した。 また発光法による遺伝子型の決定では、 増幅した DNA を 0.3M NaOH で変性させ、 96穴プレー卜の各ゥエルの底面に固定したいずれかのァリル特異的 補足プローブと 35- 40 %ホルムアミ ドを含むハイブリダィゼーシヨン緩衝液で 3
7°C、 30分間ハイプリダイゼーシヨンを行った。 ゥエルを十分に洗浄した後、 アル 力リフォスファターゼ結合ストレプ卜アビジンを各ゥエルに加え、 プレー卜を 3 7°C、 15分間振騰した。 ゥエルを再度洗浄し、 0· 8ιηΜ 2-(4-iodophenyl)-3-(4-ni t ropheny I ) -5- (2, 4-d i su I f op eny l)-2H-tet razo I i um (monosod i um sal t)と 0.械 5-bromo-4-ch I oro-3- i ndo I y I phosphate p-to I u i d i ne sa I tを含む溶液を力！]えた 後、 450nmでの吸光度を測定した。
本方法による遺伝子型決定の精度を確認するために、 50人の DNAサンプルを無作 為に選び PCR-制限酵素断片長多型法または PCR産物の直接塩基配列決定法を行つ た。 いずれのサンプルにおいてもァリル特異的プライマ一 ■ プローブ測定システ 厶により決定された遺伝子型は PCR-制限酵素断片長多型法または DNA塩基配列決 定法によって決定されたものと同一であった。 尚、 以下の関連解析における統計解析は次のように行った。 臨床データは再狭 窄病変と非再狭窄病変との間で unpai red Student' s t test または Mann- Whi tne y U testを用いて比較した。 定性的データは ch卜 square testで検定した。 ァリ ル頻度は gene count ing methodにより推定し、 Hardy- We ί nberg平衡から逸脱して いるかどうかは chi-square test によって検定した。 本発明者らは危険因子を補 正した多項ロジスティック回帰分析を行った。 再狭窄を従属因子とし、 年齢、 bo dy mass index (BMI)、 喫煙状況 （0=非喫煙， 1=喫煙）、 代謝因子 （0=糖尿病 ·高コ レステロール血症 ·高尿酸血症の経歴なし、 1=経歴あり）、 各多型の遺伝子型を独 立因子とした。 それぞれの遺伝子型は dominant (優性）、 recessive (劣性）、 add i t ive (付加） 遺伝モデルで解析し、 P値、 才ッズ比、 95%信頼区間を算出した。 組 み合わせ遺伝子型解析では、 ロジスティック回帰分析の stepwise forward selec t ion method によりそれぞれの遺伝子型についてのォッズ比を算出した。
<実施例 3 > 冠動脈形成術後再狭窄に関連する多型の選択、 及び冠動脈形成術 後再狭窄診断方法の開発
本発明者らは先の報告において 71候補遺伝子 112多型と心筋梗塞との関連解析 を男性 451例 （心筋梗塞 219例、 対照 232例） と女性 458例 （心筋梗塞 226例、 対照 2 32例） について行った （Yamada Y, Izawa H, l chihara S, et a I . Genet i c risk diagnos i s system for myocardial infarct ion developed by a large aca I e as sociat ion study of 112 gene polymorphisms in 5061 individuals (in pres s).)。 この研究により男性で 19個、 女性で 18個の一塩基多型が心筋梗塞発症と関 連することを見出したが、 それらの多型群の中には冠動脈形成術後再狭窄の候補 遺伝子も含まれていた （図 1 、 図 2、 図 5を参照）。 本実施例ではこれらの一塩基 多型とバルーン拡張術後再狭窄あるいはステント内再狭窄との関連について 2391 冠動脈病変の大規模関連解析を行った。 検討した全 2391冠動脈病変 （男性 1620病変、 女性 771病変） の背景データを図 6 と図 7に示す。 男性では、 バルーン形成術においては、 高血圧と糖尿病の頻度が 非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、 年齢が非再狭窄病変に比較し再 狭窄病変で有意に低かった。 ステン卜挿入においては、 喫煙、 糖尿病と高尿酸血 症の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、 年齢が非再狭窄病変 に比較し再狭窄病変で有意に低かった （図 6 )。 女性では、 バルーン形成術におい ては、 年齢、 喫煙と糖尿病の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高 かった。 ステント挿入においては、 年齢、 糖尿病の頻度が非再狭窄病変に比較し 再狭窄病変で有意に高く、 喫煙、 高血圧と高尿酸血症の頻度が非再狭窄病変に比 較し再狭窄病変で有意に低かった （図 7 )。 また女性においては、 バルーン形成術 においては、 右冠動脈の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に高く、 左回旋枝の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に低かった。 ステント 挿入においては、 左前下行枝の頻度が非再狭窄病変に比較し再狭窄病変で有意に 高かった （図 7 )o 男性 19多型、女性 18多型と冠動脈形成術後再狭窄との関連解析において、年齢、 B L および喫煙、 高血圧、 糖尿病、 高コレステロール血症、 高尿酸血症の頻度を 補正した多項ロジスティック回帰分析により男女それぞれにバルーン拡張術で 6 個、 ステン卜挿入で 5個の多型が再狭窄と有意な関連を示した（dominantまたは re cess ive遺伝モデルのいずれかが Pく 0.05) (図 8は男性例、 図 9は女性例のデータ を示す）。
本発明者らは多項ロジスティック回帰分析の stepwise forward selection met hodを行った（図 1 0、 図 1 1 )。 本法では、 図 8と図 9に示したそれぞれの多型の 冠動脈形成術後再狭窄との関連における P値 （より低い P値） に基づいて dominant または recessive遺伝モデルを採用した。これらの遺伝子の染色体上の遺伝子座を IH 1 0と図 1 1 に示す。 腫瘍壊死因子 α遺伝子と血小板活性化因子ァセチルヒ ド 口ラーゼ遺伝子の遺伝子座は近接しているが、 両_者の多型における遺伝子型の分 布には関連を認めなかった。 同様に、 プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1 遺伝子とパラォキソナ一ゼ遺伝子の遺伝子座は近接しているが、 両者の多型に おける遺伝子型の分布には関連を認めなかった。 Stepwise forward selection m ethodにより算出した組み合わせ遺伝子型によるバルーン拡張術またはステン卜 挿入後再狭窄の才ッズ比を、 男性については図 1 2、 図 1 3と図 1 6 Aに、 女性に ついては図 1 4、 図 1 5と図 1 6 Bに示す。 男性では、 5個の多型の組み合わせ遺 伝子型 (ApoE(3932T→C)多型、 GP I a (1648A→G)多型、 TNF cz (- 863C—A)多型、 G - プロテイン；83 (825C→T)多型、 及び ApoC- 1 I I (- 482C→T)多型） により、 バルーン 拡張術後再狭窄の最大才ッズ比が 10.55となった （図 1 2、 図 1 6A)。 さらにもう —つの多型（AGT(-6G→A)多型）を加えた 6個の多型の組み合わせ遺伝子型により、 バルーン拡張術後再狭窄の最大才ッズ比が 15.09となった （図 1 6A)。 同じく男性 では、 5個の多型の組み合わせ遺 ί云子型 （TSP4(1186G→C)多型、 TNF α (- 863C→A) 多型、 TM(2136C→T)多型、 TP0(5713A→G)多型、 及び PAF- AH (994G→T)多型） によ り、 ステント内再狭窄の最大ォッズ比が 6.64となった （図 1 3、 図 1 6A)。 女性 では、 5個の多型の組み合わせ遺伝子型 （Eセレクチン（561A→C)多型、 FABP2 (24 45G→A)多型、 GPI ba (1018C→T)多型、 PAN (-668/4G→5G)多型、及び PON (584G→A) 多型）により υレーン拡張術後再狭窄の最大才ッズ比が 37.43となった（図 1 4、 図 1 6 Β)。 さらにもう一つの多型 （ApoE(3932T→C)多型） を加えた 6個の多型の組 み合わせ遺伝子型により レーン拡張術後再狭窄の最大才ッズ比が 44.54となつ た （図 1 6 Β)。 同じく女性では、 5個の多型の組み合わせ遺伝子型 （ΡΑΙ 1 (- 668/4 G→5G)多型、 ApoC- I I I (- 482C→T)多型、 POM (584G→A)多型、 GP I b α (1018C→T)多 型、 及び ApoE(3932T→C)多型） により、 ステン卜内再狭窄の最大才ッズ比が 117. 83となった （図 1 5、 図 1 6 B)。 以上のように、 多項ロジスティック回帰分析により男女共に 6個の一塩基多型 がバルーン拡張術後再狭窄と、 5個の一塩基多型がステン卜内再狭窄と関連した。 即ち、 本発明者らは男性で 19個、 女性で 18個の一塩基多型と冠動脈形成術後再 狭窄との関連について 2391冠動脈病変について大規模関連解析を行い、男女それ ぞれにおいてバルーン拡張術後再狭窄と関連する多型を 6個、 ステント内再狭窄 と関連する多型を 5個同定した。 さらに、 多項ロジスティック回帰分析の stepwi se forward select ion method により最大才ッズ比が男性のバルーン拡張術後再 狭窄では 15.09、 ステン卜内再狭窄では 6.64、 女性のバルーン拡張術後再狭窄で は 44.54、 ステン卜内再狭窄では 117.83を呈する組み合わせ遺伝子型を用いた冠 動脈形成術後再狭窄の遺伝子リスク診断法を開発した。 バルーン拡張術再狭窄の主要な原因は冠動脈の慢性リモデリングであり、 ステ ント内再狭窄の主要な原因は新生内膜肥厚である （Mintz GS， Popma JJ, Pichar d AD, et a Arterial remodel ing af ter coronary angioplasty: a seri al in t ravascu I ar ul trasound study. Ci rcu l at ion 1996； 94 :35-43.； Hof fmann R, Mi n tz GS, Dussai I I ant GR, et a I . Patterns and mechanisms of in - stent reste nos is. A serial intravascul ar ul trasound study. Ci rcul at ion 1996:94: 1247 -54.)。 本発明者らは血管生物学、 血小板 · 白血球生物学、 線溶系、 脂質 ·糖 -そ の他の代謝因子などの包括的視点に基づいて男性 19個、 女性 18個の一塩基多型 と冠動脈形成術後再狭窄との関連について検討した。 実際、 再狭窄と関連した遺 伝子群はその病態において多彩な役割を有していた。 バルーン拡張術後再狭窄と 関連した遺伝子は血管生物学（G-プロティン ；83サブユニッ ト及び E セレクチン）、 血管の炎症 （腫瘍壊死因子）、 高血圧 （アンギオテンシノーゲン）、 脂質代謝 （ァ ポリポプ口ティン E、 アポリポプロテイン C- I I I、 脂肪酸結合タンパク質 2、 及び パラ才キソナーゼ）、 血小板機能 （グリコプロテイン la、 及びグリコプロテイン I bo 、 線溶系 （プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1) などに役割を有して いた。 また、 ステント内再狭窄と関連した遺伝子は血管生物学 （トロンボスボン ジン 4)、 血管の炎症 （腫瘍壊死因子 α、 及び血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラ 一ゼ）、 脂質代謝 （アポリポプロテイン Ε、 アポリポプロテイン C- I I I 、 及びパラ 才キソナーゼ）、 血小板機能 （卜ロンポモジュリン、 トロンボポイエチン、 及びグ リコプロテイン lbQ!)、 線溶系 （プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1) な どに役割を有していた。 男性においては 1個の多型 （腫瘍壊死因子 α遺伝子） が バルーン拡張術後再狭窄とステント内再狭窄の両者に関連し、 女性においては 4 個の多型 （プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子 、 パラ才キソナー ゼ遺伝子、 ダリコプロテイン I ba 遺伝子、 及びアポリポプロテイン E遺伝子） が バルーン拡張術後再狭窄とステント内再狭窄の両者に関連した。 本発明の遺伝子 リスク診断方法は冠動脈形成術後再狭窄の最大才ッズ比が、 バルーン拡張術再狭 窄においては男性で 15.09、女性で 44.54を呈し、ステント内再狭窄では男性で 6. 64、 女性で 117.83を呈し、 今までに報告された関連解析の中で最大の才ッズ比を 示した。 冠動脈形成術後再狭窄と関連した 15個の多型のうち、アポリポプロテイン E(v an Bockxmeer FM， Mamo t te CDS, Gibbons FR， Taylor RR. Apo I i poprote i n ε 4 homozygos i ty-a determinant of restenos i s af ter coronary angioplasty. At h erosclerosis 1994;110: 195-202. ), アンギオテンシノ一ゲン （Volzke H, Hertw i g S， Re 11 i g R， Mo tz W. The ang i o tens i nogen gene 235T variant is assoc i a ted wi th an i ncreased risk of restenosis af ter percutaneous trans luminal coronary angioplasty. CI in Sci 2000;99: 19 - 25. )、プラスミノーゲン活性ィヒ因 子インヒビター 1 (Ort lepp 」R， Hoffmann R, Ki I I ian A， Lauscher J, Merkel ba ch-Brese S， Han rath P. The 4G/5G promoter polymorphism of the p I asm i noge n act ivator inhi bi tor - 1 gene and late l uminal loss af ter coronary stent placement in smoking and nonsmoking pat ients. Cl in Cardiol 2001； 24： 585-5 91.)、 及び Eセレクチン （Rauchhaus M， Gross M， Schul z S， et al . The E-sel ectin SER123ARG gene polymorphism and restenosis af ter successful corona ry angioplasty, !nt J Cardiol 2002;83:249-257. ) の遺伝子多型については再 狭窄との関連が今までに報告されている。 グリコプロテイン la遺伝子 （von Bee kerat h N， Koch , Meh i I I i J , et a I . Glycoprotein I a C807T po lymorphism a nd risk of restenosi s fol lowing coronary s ten t i ng. Atheroscl eros is 2001； 156:463-468· ) と G -プロティン β 3サブュニッ 卜 （von Beckerath N， Kastrat i A, Koch W， et a I . G protein β 3 subun i t polymorphism and risk of thrombo sis and restenos is fol lowing coronary stent placement. Atherosclerosis 2 000; 149: 151-155. )遺伝子は再狭窄の機序において重要であると考えられるが（M atsuno H， Kozawa 0， N i wa M， Uematsu T. I nhi bi t ion of von Wi l l ebrand fact or binding to pl atel et GP l b by a f ract ionated au r i n t r i ca r boxy I ic acid p reven ts restenos is af ter vascular injury in hamster carot id artery. C i rc ulat ion 1997; 96: 1299-304.； l accarino G, Smi thwi ck LA, Lefkowi tz RJ， Koch WJ . Targeting r s i gna I i ng in arterial vascu I ar smooth muscle pro I i f er at i on : a novel strategy to l imi restenosis. Proc Nat I Acad Sci USA 199 9;96:3945-50.), 本発明者らの結果とは逆に、 以前の報告ではそれらの多型と再 狭窄との関連は認められなかった。 その他の 9個の多型については、 冠動脈形成 術後再狭窄と関連については検討されていない。 それらの多型の中で、 腫瘍壊死 因子 a (Clausel l N, de Lima VC, Mo I oss i S, et a I . Expression of tumor ne c ros i s factor and accumulation of f ibronectin i n coronary artery rest enot i c lesions retrieved by atherectomy. Br Heart J 1995 ; 73 : 534-9. ) とグ リコプロテイン I b (Gawaz M, Neumann FJ, Ott I, May A, Rud iger S, Schoini g A. Changes in membrane glycoproteins of ci rculating latelets after co ronary stent implantation. Heart 1996;76:166-72.) は再狭窄の病態において 重要な役割を有すると考えられる。 本実施例で検討した多型のいくつかは、 その近傍に存在する冠動脈形成術後再 狭窄と真に関連する遺伝子の多型と連鎖不平衡にある可能性がある。 しかしなが ら、 本発明者らの結果は男性で 10個、 女性で 7個の遺伝子が日本人の冠動脈形成 術後再狭窄感受性遺伝子座であることを示した。 さらに、 これらの遺伝子多型の 組み合わせ遺伝子型はバルーン拡張術後再狭窄またはステント内再狭窄の遺伝的 リスク診断に有用であることも示した。 本発明の遺伝子リスク診断方法は冠動脈 形成術後再狭窄の予知および最も適切な治療法の選択に有用な情報を提供するこ とによリ、 冠動脈疾患患者の生活の質の改善のみならず医療費の削減に貢献でき ると考えられる。 この発明は、 上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるもので はない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。 産業上の利用の可能性
本発明によれば冠動脈形成術後の再狭窄に関連する遺伝子多型が解析され、 そ して核酸試料の遺伝子型が検出される。 この遺伝子型の検出によって得られる多 型情報を用いることにより、 冠動脈形成術後の再狭窄について高精度で予知確率 の高いリスク診断を行うことができる。 即ち、 本発明は特定の冠動脈形成術を施 した後に再狭窄が生ずるリスクを事前に知る有効な手段となる。 従って、 本発明 は最適な治療法を選択するための有用な情報を提供することとなり、 適切な治療 法の選択を可能とし、 もって高い治療効果の実現、 及び冠動脈疾患患者の生活の 質の向上を図ることができる。 更には、 不適切な治療を繰り返すことによる治療 費の増大といつた問題を解決することができ、 即ち医療経済への多大な貢献が期 待ざれる。 一方で本発明は、 再狭窄が生ずるメカニズムを解明する上での有用な 情報を提供することから、 再狭窄の予防法の確立にとつて極めて重要な一手段と もなる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の工程（a)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(a) 核酸試料における、 以下の（1)~ (6)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(1)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(2)ダリコプロティン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型、
(3)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(4) G-プロテイン /33サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型、
(5)アポリポプロテイン C- I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、 及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型。
2. 以下の工程（b)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(b) 核酸試料における、 以下の（7)~(11)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(7)トロンポスポンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(8)腫瘍壊死因子 α遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(9)ト口ンボモジュリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型、
(10) 卜口ンボポイエチン遺伝子の塩基番号 5713位の多型、 及び
(11)血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型。
3. 以下の工程（c)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(c)核酸試料における、以下の（12) ~ (17)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(12) E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型、
(13)脂肪酸結合タンパク質 1遺伝子の塩基番号 2445位の多型、 (14)ダリコプロティン Ibex遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(16)パラォキソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型。
4. 以下の工程（d)を含んでなる、 核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
(d)核酸試料における、 以下の（18)〜（22)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(19)アポリポプロテイン C-I I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(20)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、
(21)ダリコプロティン lbc¾遺伝子の塩基番号 1018位の多型、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型。
5. 以下の工程（i)~(i i i)を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方 法、
( i )核酸試料における、以下の（ 1 ) ~ ( 6 )からなるグループより選択される二つ以 上の多型を解析する工程、
(1)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(2)グリコプロテイン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型、
(3)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(4) G-プロティン β 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型、
(5)アポリポプロテイン C-l I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、 及び (6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6位の多型、
(i i)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(i i i)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める 工程。
6. 以下の工程（iv：)〜（vi)を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方 法、
( i v)核酸試料における、以下の（7) ~ (11)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(7)トロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型、
(8)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型、
(9) トロンボモジユリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型、
(10) 卜口ンポポイエチン遺伝子の塩基番号 5713位の多型、 及び
(11)血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型、
(V)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(vi)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求めるェ 程。
7. 以下の工程（ V i ί )〜（ i X )を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方 法、
(vii)核酸試料における、以下の（12)〜（17)からなるグループより選択される二 つ以上の多型を解析する工程、
(12)E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型、 (13)脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型、
(14)グリコプロテイン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型、
(15)プラスミノーゲン活性化因子インヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
) (16)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、 及び
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(viii)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する 工程、 及び
(ix)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求めるェ
8. 以下の工程（x)~(xii)を含んでなる、 冠動脈形成術後再狭窄のリスク診断方 法、
(X)核酸試料における、以下の（18) ~ (22)からなるグループより選択される二つ 以上の多型を解析する工程、
(18)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の 多型、
(19)ァポリポプロティン C-l I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型、
(20)パラォキソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型、
(21)ダリコプロテイン Iba遺伝子の塩基番号 1018位の多型、 及び
(22)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型、
(xi)前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定するェ 程、 及び
(xi i)決定された遺伝子型から冠動脈形成術後再狭窄の遺伝的リスクを求める 工程。
9. 以下の（1)〜（6)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含んでな る遺伝子型検出用キッ 卜、
(1)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸、
(2)ダリコプロテイン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型を解析するための核酸、
(3)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(4) G-プロティン 3サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型を解析するための核酸、
(5)アポリポプロテイン C- I I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、 及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸。
1 0.以下の（7) ~ (11)からなるグループよリ選択される二つ以上の核酸を含んで なる遺伝子型検出用キッ ト、
(7)トロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(8)腫瘍壊死因子 α 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(9)卜口ンポモジュリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型を解析するための核酸、 (10) トロンボポイエチン遺伝子の塩基番号 5713 位の多型を解析するための核 酸、 及び
(Π)血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型を 解析するための核酸。 1 1 - 以下の（12)~(1了）からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含ん でなる遺伝子型検出用キッ ト、
(12) E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型を解析するための核酸、
(13)脂肪酸結合夕ンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型を解析するための 核酸、
(14)ダリコプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(16)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(17)ァポリポプロティン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸。
1 2. 以下の（18)~(22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸を含ん でなる遺伝子型検出用キッ ト、
(18)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビ夕一 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(19)アポリポプロテイン C-l I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(20)パラォキソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、
(21)ダリコプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、 及び
(22)ァポリポプ口ティン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核
1 3. 以下の（1)~(7)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性 支持体に固定されてなる固定化核酸、
(Όァポリポプロテ,ィン Ε遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸、
(2)グリコプロテイン la遺伝子の塩基番号 1648位の多型を解析するための核酸,
(3)腫瘍壊死因子 a 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(4) G-プロティン /33サブュニッ 卜遺伝子の 825位の多型を解析するための核酸,
(5)ァポリポプロティン C- 1 I I 遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、 及び
(6)アンギオテンシノーゲン遺伝子の塩基番号- 6 位の多型を解析するための核 酸。
1 4.以下の（ 7 ) ~ ( 11 )からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶性 支持体に固定されてなる固定化核酸、
(7)卜ロンボスボンジン 4遺伝子の塩基番号 1186位の多型を解析するための核 酸、
(8)腫瘍壊死因子 a 遺伝子の塩基番号- 863位の多型を解析するための核酸、
(9)卜ロンボモジユリン遺伝子の塩基番号 2136位の多型を解析するための核酸、
(10) 卜ロンボポイエチン遺伝子の塩基番号 5713 位の多型を解析するための核 酸、 及び
(11)血小板活性化因子ァセチルヒ ドロラーゼ遺伝子の塩基番号 994位の多型を 解析するための核酸。
1 5. 以下の（12)~ (17)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶 性支持体に固定されてなる固定化核酸、 (12) E-セレクチン遺伝子の塩基番号 561位の多型を解析するための核酸、
(13)脂肪酸結合タンパク質 2遺伝子の塩基番号 2445位の多型を解析するための 核酸、
(14)グリコプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、
(15)プラスミノ一ゲン活性化因子ィンヒビタ一 1遺伝子の塩基番号 - 668位の多 型を解析するための核酸、
(16)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 及び
(17)アポリポプロテイン E遺伝子の塩基番号 3932位の多型を解析するための核 酸。
1 6. 以下の（18)〜（22)からなるグループより選択される二つ以上の核酸が不溶 性支持体に固定されてなる固定化核酸、
(18)プラスミノーゲン活性化因子インヒビター 1遺伝子の塩基番号- 668位の多 型を解析するための核酸、
(19)ァポリポプロティン C- 1 I I遺伝子の塩基番号- 482位の多型を解析するため の核酸、
(20)パラ才キソナーゼ遺伝子の塩基番号 584位の多型を解析するための核酸、 (21)グリコプロティン Iba 遺伝子の塩基番号 1018位の多型を解析するための 核酸、 及び
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