WO2004007732A1 - Klonierung und charakterisierung einer lipoxygenase aus phaeodactylum tricornutum - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hydroperoxyfettsäuren durch Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, besonders von mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismus bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Hydroperoxyfettsäuren aufgrund der Expression einer Lipoxygenase aus Phaeodactylum tricornutum.Außerdem betrifft die Erfindung Expressionskassetten enthaltend eine Nukleinesäure-sequenz, einen Vektor und Organismen enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz bzw. eine Expressionskassette.

Description

Klonierung und Charakterisierung einer Lipoxygenase aus Phaseodactylum tricornutum

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hydroperoxyfettsauren durch Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, besonders durch Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismus bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Hydroperoxyfettsauren aufgrund der Expression einer Lipoxygenase aus Phaeodactylum tricornutum.

Außerdem betrifft die Erfindung Expressionskassetten enthaltend eine Nukleinsäure- sequenz, einen Vektor und Organismen enthaltend mindestens eine Nukleinsäure- sequenz bzw. eine Expressionskassette.

Bei Lipoxygenasen (Linoleat:Sauerstoff Oxidoreduktasen, EC 1.12.11.13; LOX) handelt es sich um Emzyme, die ubiquitär im RIanzen- und Tierreich verbreitet sind [A.R. Brash, J. Biol Chem, 274:23679-23682, 1999]. Sie enthalten ein nicht-Haem- Eisenatom pro mol Enzym und katalysieren die regio- und stereoselektive Dioxy- genierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wobei deren Hydroperoxid-Derivate in S-Konfiguration entstehen [S. Rosahl, Z Naturforsch, 51:123-138,1996]. Die erste Lipoxygenase wurde 1932 von Andre und Hou beschrieben, als Enzym, das die Oxidation von Fettsäuren und den Abbau von Karotenoiden bewirkte [Andre et al., Lieb C R Acad Sei (Paris), 194:645-647, 1932]. In der Lebensmittelindustrie wurde die enzymatische Aktivität von Lipoxygenasen schon vor deren Entdeckung genutzt. So wurde Weizenmehl gebleicht, indem darin enthaltene Karotenoide von Lipoxygenasen umgesetzt wurden, welche der wirksame Bestandteil von beigemischtem Sojamehl waren [J.N. Siedow, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 42:145-188,1991]. In den Achtziger Jahren begann man mit der Aufklärung der physiologischen und vor allem der biochemischen Eigenschaften [Galliard et al., The Biochemistry of Plants, p. 131- 161, Academic Press, London, 1980; D.F. Hildebrand, Physiol. Plant, 76^249-253, 1989]. Eine erste umfassende Zusammenfassung des Katalysemechanismus erfolgte 1991 [H.W. Gardner, Biochim Biophys Acta, 1084:221-239, 1991]. Insbesondere die Verfügbarkeit der ersten Daten aus den Strukturanalysen durch Röntgenbeugung tierischer [Gillmor et al., Nat. Struct. Biol., 4:1003-1009, 1998] sowie pflanzlicher [Boyington et al., Biochem. Soc. Trans, 21:744-748, 1993; Minor et al., Biochemistry, 35:10687-10701 , 1996; Skrzypczak-Jankum et al., Proteins-Structure Function and Genetics, 29:15-31, 1997] Lipoxygenasen half Modelle zu erstellen, welche die Substrat- und Positionsspezifität zu erklären versuchen [Feussner et al.; Enzymes in Lipid Modification, p. 309-336, WileyNCH, Weinheim, 2000]. Bis jetzt sind Sequenzen, die für Lipoxygenasen kodieren, aus über sechzig Rlanzenarten und Tieren bekannt [A.R. Brash, J. Biol Chem, 274:23679-23682, 1999]. Es wurde erst eine mikrobielle Lipoxygenase aus dem Pilz Gaeumannomyces graminis isoliert [Sugio et al., Lipoxygenase, 2002; WO 02/20730]. Bei Säugetieren setzen sie u.a. Arachidonsäure um und bilden die Vorstufen von regulatorischen Verbindungen, wie Leukotriene und Lipoxine, die eine wichtige Rolle bei Entzündungs- und Immunreaktionen spielen [Kühn et al., FEBS Lett, 449:7-11, 1999]. Bei Pflanzen dienen die von den Lipoxygenasen gebilde- ten Hydroperoxide als Substrate für wenigstens sieben Enzymfamilien [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297,2002]. Hier wären vier Stoffwechselwege zu nennen, die verhältnismäßig gut charakterisiert sind: Peroxy-Genase-, Hydroperoxid- Lyase-, Allenoxid-Synthase- und der Divinylether-Synthase-Weg. Weniger gut charakterisiert ist die Umsetzung der Epoxyalkohol-Synthasen und durch Reduktasen, ebenso wie die Hydroperoxidase-Aktivität der Lipoxygenasen [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297,2002]. Über die physiologische Funktion vieler pflanzlicher Lipoxygenasen ist jedoch noch immer, trotz intensiver Untersuchungen, wenig bekannt [A.R. Brash, J. Biol Chem, 274:23679-23682, 1999].

Pflanzliche Lipoxygenasen sind Enzyme, die ein Molekulargewicht zwischen 90 und 115 kDa haben. Sie gehören zur Familie der Dioxygenasen und katalysieren den Einbau von molekularem Sauerstoff in ein (1Z,4Z)-Dien-System ungesättigter Fettsäuren [A.R. Brash, J. Biol Chem, 274:23679-23682, 1999]. Die dabei entstehenden Hydroperoxide der Fettsäuren besitzen S-Konfiguration und weisen ein (1Z,3E)-Dien- System auf (Figur 1). Die meisten Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus wurden an der Lipoxygenase Isoform 1 aus Soja durchgeführt [Feussner et al., Enzymes in Lipid Modification, pages 309-336, Wiley-VCH, Weinheim, 2000; H.W. Gardner, Biochim Biophys Acta, 1084:221-239, 1991; Veldink et al., Studies in Νatural Products Chemistry, p. 559-589, 1991]. Bei der Umsetzung von Linolsäure und α-ünolensäure, den häufigsten Substraten von Lipoxygenasen in Pflanzen, kann der Sauerstoff an zwei verschiedenen Positionen eingeführt werden. Nach initialer Wasserstoff-Abstraktion durch das nicht-Haem Eisenatom am Kohlenstoffattom Cn dieser Fettsäuren kann eine [+2]- oder [-2]-Umlagerung des Pentadienylradikals erfolgen. Eine Ausnahme bezüglich des Wasserstoffakzeptor bildet der Pilz Gaeumannomyces graminis, bei dem Mangan anstatt des zweiwertigen Eisenatoms im aktiven Zentrum der katalytisch aktiven Lipoxygenase gefunden wird [Sugio et al., Lipoxygenase, 2002; WO 02/20730]. Nach Sauerstoffanlagerung und der Reduktion des Peroxy-Radikals zum Hydroperoxid entstehen aus Linolsäure folglich entweder (13S,9Z,11 E)-13-Hydro- peroxy-9,11-octadiensäure (13-HPODE, [+2]-Umlagerung) oder (9S,10E,12Z)-9-Hydro- peroxy-10,12-octadecadiensäure (9-HPODE, [-2]-Umlagerung ([Feussner et al., Enzymes in Lipid Modification, p. 309-336, Wiley-VCH, Weinheim, 2000], Figur 2). Da die Bildung des Verhältnisses dieser Positionsisomere für jedes Enzym spezifisch erfolgt, wird zwischen 9- und 13-Lipoxygenase bei Pflanzen unterschieden [H.W. Gardner, Biochim Biophys Acta, 1084:221-239, 1991]. Eine weiter führende Unterteilung pflanzlicher Lipoxygenasen basiert auf Sequenzhomologien auf cDNA- Ebene. So besitzen Lipoxygenasen vom Typ 1 kein chloroplastizidäres Signalpeptid, im Gegensatz zu Lipoxygenasen vom Typ 2 [Shibata et al, Plant Miol Biol Reporter, 12(2):S41-S42, 1994].

Wie schon erwähnt, sind bisher neben dem Enzym Lipoxygenase selbst sechs weitere Enzymfamilien beschrieben worden, welche die Hydroperoxid-Derivate von Fettsäuren weiter umsetzen. Vier Haupt-Stoffwechselwege wurden bis heute charakterisiert ([E. Blέe, Prog. Lipid Res., 37:33-72, 1998; Feussner et al., Trends Plant Sei, 6:262- 267, 2001], Figur 3, dicke Pfeile):

1. Der Peroxygenaseweg [E. Blee, Prog. Lipid Res., 37:33-72, 1998] früher Hydroperoxid-Isomerase): Durch die Peroxygenase entstehen Hydroxy-, Epoxy- und ß-Hydroxyepoxyfettsäuren aus den Hydroperoxiden der Fettsäuren. Die Epoxygruppen können zu Hydroxygruppen reduziert werden, so dass Di- und Trihydroxyfettsäuren entstehen [M. Hamberg, J Lipid Mediators Cell Signal,

12:283-292, 1995].

2. Der Allenoxid-Synthaseweg (AOS, früher Hydroperoxid-Dehydratase [H.W. Gardner, Biochim Biophys Acta, 1084:221-239, 1991]: Die Allenoxid- Synthase gehört zur Familie der Cytochrom-P₄₅₀-Enzyme [Song et al., Proc Natl

Acad Sei USA, 90:8519-8523, 1993], Unterfamilie CYP74A. Hier werden die Hydroperoxide zu instabilen Allenoxiden umgesetzt, die in α- und γ-Ketole zerfallen. Bei der Umsetzung von 13-HPOTE kann neben diesem Zerfall zu den Ketolen ein weiterer Reaktionsweg beschriften werden, der zur Bildung von Jasmonsäure führt, der sogenannten Jasmonat-Kaskade [Vick et al., Biochem

Biophys Res Commun, 111 :470-477, 1983]. In diesem Falle entsteht aus 13-HPOTE zunächst ein instabiles Allenoxid, das durch die hochspezifische Allenoxidcyclase zu (9S,13S,15Z)-12-Oxo-9,13,15-phytodienonsäure (cis-[+]-12- Oxo-PDA) zyklisiert wird [Ziegler et al., Lipids, 34:1005-1015, 19.99]. Anschlie- ßend katalysiert die 12-Oxo-PDA-Δ ⁰-Reduktase der Doppelbindung des Cyclo- pentanonrings. Diese Reaktion ist NAPH-abhängig [Schaller et al., Planta, 210:979-984, 2000]. Durch drei anschließende ß-Oxidationssch ritte wird die Karbonsäureseitenkette verkürzt und es entsteht (3R,7S)-Jasmonsäure, die spontan zu (3R,7R)-Jasmonsäure epimerisiert [Sembdner et al., Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol, 44:569-589, 1993]. Beide Verbindungen und deren Methylester sind biologisch aktiv. Sie besitzen Phytohormon-ähnliche Eigenschaften und wirken stimulierend oder auch hemmend auf pflanzliche Entwicklungsprozesse, wie Keimung und Seneszenz. Die Frage, ob Jasmonat als hormoneller Regulator der Seneszenz wirkt oder als Stresssignal, das auch Seneszenz auslösen kann, ist noch nicht geklärt [Wastemack et al., Trends

Plant Sei, 2(8):302-307, 1997].

3. Der Hydroperoxid-Lyase-Weg (HPL, früher Hydroperoxid-Isomerase [Zimmermann et al., Plant Physiol, 46:445-453, 1970]: Das Enzym ist in Pflanzen weit verbreitet [K. Matsui, Belgian Journal of Botany, 131 :50-62, 1998], besitzt ebenfalls ein Cytochrom-P₄₅₀ und bildet die Unterfamilien CYP74B und CYP74C. Die Peroxide von Linol- und α-Linolensäure werden in den gesättigten Aldehyd Hexanal oder in ungesättigte (3Z)-Aldehyde und ω-Oxo-Derivate der Fettsäuren gespalten [K. Matsui, Belgian Journal of Botany, 131:50-62, 1998]. Durch Alkohol-Dehydrogenasen können die (3Z)-Aldehyde in (3Z)-Alkohole umgewandelt werden, die dann wiederum mit kurzkettigen Carbonsäuren flüchtige Ester bilden können. Alternativ können die Aldehyde vor ihrer Reduktion zu den entsprechenden (2E)-Aldehyden isomerisieren (siehe S. 5). Diese aus der HPL- Reakation resultierenden Substanzen sind für den charakteristischen Geruch von Pflanzen und Früchten verantwortlich [A. Hatanake, Food Rev Int, 12:303-

350, 1996].

4. Der Divinylether-Synthase-Weg (DES): Die Enzymaktivität des DES, die Bildung von Divinylethern aus den Fettsäurehydroperoxiden, wurde schon in den 70er Jahren beschrieben [Gilliard et al., Biochem, 129:743-753, 1972]. Die Produkte scheinen bei der Abwehr von pathogenen Bakterien und Pilzen eine Rolle zu spielen [Weber et al., Plant Cell, 11:485-493, 1999]. Die erste Isolierung einer DES gelang erst Ende 2000 aus Lycopersicum esculentum [Itoh et al., J Biol Chem, 276(5):3620-3627, 2001].

Neben diesen vier Haupt-Stoffwechselwegen sind drei weitere, weniger gut charakterisierte Enzymaktivitäten bekannt.

1. Die Hydroperoxid-Reduktase ist u.a. bei einer Vielzahl von Ölsaaten am Abbau der Polyenfettsäuren in den Speicherlipiden beteiligt [Feussner et al., Trends

Plant Sei, 6:262-267, 2001]. Der Mechanismus ist nicht vollständig verstanden, aber es wird eine Beteiligung von Glutathion diskutiert [Feussner et al., Advances in Plant Lipid Research, p. 311-333, 1998]. 2. Die Lipoxygenase-katalysierte Peroxidase-Reaktion (Ketodien erzeugender Weg): Bei Sauerstoffmangel können Lipoxygenasen die homeolytische Spaltung der O-O Bindung katalysieren. Die dabei entstehenden Alkoxy-Radikale können dann zu Ketokonjudienfettsäuren umlagern, wobei zu einem geringeren Anteil auch andere Derivate entstehen können [Kühn et al., Biochemistry, 30:10269-

10273, 1991 ; Kühn et al., Eicosanoids, 4:9-14, 1991].

3. Der Epoxyalkohol-Synthase-Weg (EAS): Alternativ zum Peroxygenase-Weg wurde die Umwandlung von (9S)-Hydroperoxiden durch eine EAS beschrieben. Die Charakterisierung des Enzyms gelang u.a. aus den Blättern von Kartoffeln

[M. Hamberg, Lipids, 34:1131-1142, 1999]. Bei dieser Katalyse entstehen α- und ß-Hydroxyepoxy-Derivate der Fettsäuren durch intramolekulare Umlagerung ihrer Hydro(pero)xide, jedoch mit einer anderen absoluten Konfiguration als im Falle der Peroxygenase. Der EAS-Weg wurde bisher nur in Solanaceen gefunden, wobei die dadurch entstehenden Oxylipine bei der Verteidigung gegen Pathogene eine Rolle spielen könnten [Göbel et al., J. Biol. Chem, 276:6267-6273, 2001].

Zu erwähnen sei auch die weitere Umsetzung der Aldehyde, die durch die HPL-Reak- tion entstanden sind. So können sie durch eine (3Z):2E-Enal-lsomerase isomerisiert werden [Phillips et al., Phytochem, 18:401-404, 1979]. Vorgeschlagen wurde auch die erneute Reaktion mit Lipoxygenasen, die zur Bildung von Hydroxyaldehyden führen würde [Gardner et al., Plant Physiol., 116:1359-1366, 1998]. Diese Umsetzung gilt jedoch nicht als gesichert, Durch Arbeiten von zwei anderen Gruppen wird eher wie bei den Wirbeltieren eine autoxidative Bildung angenommen [Noordermeer et al.,

Biochem Biophys Res Commun, 277(1):112.116, 2000; Schneider et al., J Biol Chem, 276(20831-20838), 2001]. Aus der bei der Umsetzung von 13-HPOTE gebildeten ω-Oxosäure, (9Z)-12-Oxo-9-dodecensäure, entsteht durch Folgereaktionen Traumatin, das durch Oxidation spontan in Traumatinsäure umgewandelt wird [Zimmermann et al., Plant Physiol, 63:536-541 , 1979]. Beide Substanzen werden als Wundhormone bezeichnet, da sie möglicherweise bei der Wundantwort von Pflanzen involviert sind.

Lipoxygenase-Isoformen kommen in den meisten Pflanzenzellen vor. Die Expression der Lipoxygenase ist jedoch abhängig von den Entwicklungs- und Umweltbedingungen der Pflanze [S. Rosahl, Z Naturforsch, 51 :123-138, 1996]. Sie können löslich oder an Membranen gebunden sein. Lösliche Lipoxygenasen findet man z.B. im Cytosol von Keimlingen und reifenden Samen [Vernooy-Gerritsen et al., Plant Physiol, 76:1070-1080, 1984], in späteren Entwicklungsstadien z.B. in Blättern, auch in Vakuolen [Tranbarger et al., Plant Cell, 3:973-987, 1991], im Zellkern [Feussner et al., Plant J, 7:949-957, 1995] und im Chloroplasten [Bell et al., Proc NatI Acad Sei USA, 92:8675-8676; 1995, Feussner et al., Plant J, 7:949-957, 1995]. Die menbran- gebundenen Lipoxygenasen wurden ebenso in den verschiedensten Kompartimenten der pflanzlichen Zellen gefunden. Sie können an der Plasmamenbran [Nellen et al., Z Naturforsch, 50(c):29-36, 1995], an der Membran der Lipidkörper von Keimlingen [Feussner et al., FEBS Lett, 298:223-225, 1992; Radetzky et al., Planta, 191:166-172, 1993] und an der Hüll- und Thylakoidmembran der Chloroplasten von Blättern, Blüten und Früchten [Blee et al., Plant Physilogy, 110(2):445-454, 1996; Bowsher et al., Plant Physiol, 100:1802-1807, 1992] gebunden sein.

Folgende mögliche physiologische Funktionen werden für Lipoxygenasen diskutiert:

1. bei der pflanzlichen Entwicklung

Von den 15-üpoxygenasen der Wirbeltiere ist bekannt, dass sie in den Abbauprozess von Membranen involviert sein können [Schewe et al., TIBS, 16:369-373, 1991]. In Anlehnung daran wird auch bei pflanzlichen Lipoxygenasen vermutet, dass sie durch die Umsetzung von Lipiden zu Lipidhydroper- oxiden einen Verlust der Membranintegrität hervorrufen [Thompson et al., Prog Lipid Res, 37:119-141, 1998]. Eine weitere Hypothese ist, dass durch die Zerstörung der Membranen im Keimling der Transport von Speicherstoffen zu dem Embryo ermöglicht wird [D.F. Hildebrand, Current Topics in Plant Biochemistry and Physiology, 7:201-219, 1988]. Weiterhin wird eine Mitwirkung oder Auslösung der Mobilisierung von Speicherfetten vorgeschlagen [Feussner et al., Trends Plant Sei, 6:262-267, 2001], da als Hauptbestandteil der Proteinausstattung der Lipidkörper in Gurken-, Sonnenblumen-, Lein-, Anis- und Soja- keimlingen eine membranständige Lipoxygenase identifiziert werden konnte.

Das Enzym aus Gurke wies nach der Bindung an die Membran des Lipidkörpers [Feussner et al., Biol Chem Hoppe-Seyler, 376:51 , 1995] eine Steigerung der Enzymaktivität und eine Änderung der Regiospezifität auf. Es ist die erste pflanzliche Lipoxygenase, von der gezeigt werden konnte, dass sie direkt veresterte Linol- bzw. Linolensäure umsetzen kann [Feussner et al., Proc NatI Acad Sei

USA, 92:11849-11853, 1995]. Eine mögliche Funktion dieser Reaktion könnte die Auslösung des Katabolismus von in Lipiden veresterten ungesättigten Fettsäuren sein [Feussner et al., Trends Plant Sei, 6:262-267, 2001]. Eine weitere Möglichkeit der Rolle von Lipoxygenasen bei der Keimlingsentwjeklung könnte durch den Schutz vor Pathogenen durch die Produktion von antimikrobiellen

Substanzen gegeben sein [A. Slusarenko, Lipoxygenase and Lipoxygenase Pathway Enzymes, p. 176-197, 1996, AOCS Press Champaign II]. 2. bei der pflanzlichen Stressantwort

Aus den Produkten der Lipoxygenase-Reaktion können durch weitere enzy- matische Reaktionen Verbindungen mit regulatorischen Eigenschaften, wie Jasmonsäure und Traumatin entstehen [Wasternack et al., Trends Plant Sei, 2(8):302-307, 1997]. Das Wundhormon Traumatin scheint die Zellproliferation

[Zimmermann et al., Plant Physiol., 63:536-541, 1979] an den verwundeten Stellen innerhalb der Pflanze zu fördern. Jasmonsäure oder deren Methylester scheinen als Signaltranduktions-Molekül der Rlanze bei Verwundung oder Pathogenbefall gebildet zu werden [Creelman et al., Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48:355-381, 1997]. Sie bewirken die Induktion von Enzymen, die für eine Abwehrreaktion von Bedeutung sind [S. Rosahl et al., Z Naturforsch, 51 :123-138, 1996]. Bei Pathogenbefall reagieren die Pflanzen mit Aktivierung von Abwehrgenen, der Synthese von antimikrobiellen Verbindungen, wie Phyto- alexinen, und hypersensitiven Zelltod, zur Ausbildung von Resistenzen. Auch hierbei spielen Lipoxygenasen scheinbar eine Rolle sein [A. Slusarenko, Lipoxygenase and Lipoxygenase Pathway Enzymes, p. 176-197, 1996, AOCS Press Champaign II].

3. als Botenstoffe Lipoxygenasen spielen eine kritische Rolle bei der Synthese von Signalstoffen

(Pheromonen) von Braun- und Kieselalgen [Pohnert et al., Nat. Pro. Rep., 19:108-122, 2002]. Durch diese Botenstoffe z.B. werden männliche Spermato- zoiden zu den immobilen weiblichen Gameten geleitet, welche diese ausschütten. Produkte des Lipoxygenase-HPL-Reaktionswegs spielen ebenso eine Rolle bei der Verteidigung von Braun- Kieselalgen (siehe nächster Absatz).

Kieselalgen (Diatomeen) sind einzellige Algen, die im ozeanischen- und im Frischwasser Phytoplankton auftreten, aber auch in Biofilmen und festen Substraten. Sie sind mit Braun- und Goldalgen enger verwandt als mit Grünalgen, Moosen und höheren Pflanzen. Im Gegensatz zu letzteren bilden Kieselalgen Chrysolaminarin (ein ß-1 ,3- Glucan) anstelle von Stärke (ein ß-1 ,4-Glucan). Generell werden Assimilationsprodukte, wie Öle (in besonderen Ölvakuolen) sowie Chrysolaminarin und Volutin, außerhalb der Chromatophoren abgelagert f www.kieselalaen.coml. Ein weiterer Unterscheidungspunkt ist die Anwesenheit von Chlorophyll c anstelle von Chloro- phyll b. Chromophoren, die Chlorophyll b enthalten (bei höheren Pflanzen, Mossen etc.), werden als Chloroplasten bezeichnet. Die Chromophoren bei Kieselalgen werden von vier anstelle von zwei Einheitsmembranen umhüllt. Die beiden inneren sind die eigentlichen Chromatophorenmembranen, die beiden äußeren stellen eine Falte des Endoplasmatischen Reticulums dar. Chromatophoren dieses Bauplans finden sich außer bei Bacillariophyceen (Kieselalagen) auch bei Chrysophyceen, Xanthophyceen, Chloromonadophyceen und Phaeophyceen, mit denen sie zu den Heterokontophyta (Chrysophyta) zusammengefasst werden abgelagert [www.kieselalQen.com1. In der marinen Nahrungskette stellen Kieselalgen die mit am bedeutendste primäre Quelle dar. Sie tragen damit auch global mit bis zu 25 % zur Primärproduktion von Biomaterial bei, mit einem entsprechenden Anteil an der Sauerstoffproduktion [Scala et al., Cell. Mol Life Sei, 58:1666-1673, 2001]. Durch ihre herausragende Rolle als marine Primärquelle stehen sie unter immensem herbivoren Druck. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Lipoxygenasen in einem Verteidigungsmechanismus gegen herbivore Organismen im Phytoplankton involviert sind [Miralto et al., Nature, 402:173-176, 1999; Pohnert et al., Nat. Pro, Rep., 19:108-122,2002]. Sie werden vermutlich aus hoch ungesättigten Eicosanoiden (Arachidonsäure - ÄRA, Eicosapentaensäure - EPA) über den Lipoygenase-H PL-Weg Aldehyde gebildet, die sich als die wirksamen Verteidigungssubstanzen erwiesen. Diese Aldehyde reduzieren den Erfolg beim Schlüpfen von Ruderfußkrebsen, die 90 % des Phytoplanktons ausmachen. Da die meisten Kieselalgen von einer hochstrukturierten Zellwand mit eingelagerten Silikaten umgeben sind, spielen sie auch eine Schlüsselrolle im bio- geochemischen Kreislauf von Silikaten [Treger et al., Science, 268:375-379, 1995]. Kieselalgen werden kommerziell für vielfältige Zwecke eingesetzt, wie z.B. als Futter in jeder Form der Wasserzucht, als Quelle für mehrfach ungesättigte Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) oder als Bestandteil pharmazeutischer Artikel [Apt et al., J. Phycol, 35:215-226, 1999].

Phaeodactylum tricornutum, eine einzellige Silika-freie Kieselalge, ist eins der am meisten benutzten Modellsysteme für das Studium der Ökologie, der Physiologie, der Biochemie und der molekularen Biologie von Kieselalgen [Apt et al., Mol Gen Genet, 252(5):572-9, 1996]. Sie unterscheidet sich dahingehend signifikant von höheren Pflanzen, dass vom gesamten Fettsäurenbestandteil bis zu 30 % die hoch ungesättigte Fettsäure EPA ist und 11 % Docosahexanensäure (DHA) [Schobert et al., Plant Physiol, 66:215-219, 1980]. Unter optimierten Kultivierungsbedingungen wurden schon 40 % EPA erhalten [Yongmanitchai et al., AppI Environ Mierobiol, 57(2):419-25, 1991]. P. tricornutum wurde um so attraktiver durch die Etablierung eines Protokolls zur stabilen Transformation, was viele neue Studien über Kieselalgen ermöglicht. So wurde durch die Verfügbarkeit dieser Technik ein Sensor-System demonstriert, das durch P. tricornutum benutzt wird, um auf relevante Umwelteinflüsse zu reagieren [Faiciatore et al., Science, 288:2363-2366, 2000]. Durch diese Technik wurde es auch möglich, ein Gen einzuführen, das für einen Glukose-Transporter kodiert. Dadurch wurde photoautotrophe Kieselalge in einen heterotrophen Organismus umgewandelt, wodurch sich neue Möglichkeiten der Fermentation in großem Maßstab für die kommerzielle Verwertung eröffnen [Zaslavskaia et al., Science, 292(5524):2073-5, 2001]. Die Anwesenheit dieser im Pflanzenreich seltenen PUFAs wie EPA und DHA macht aus Phaeodactylum tricornutum ein interessantes Untersuchungsobjekt für Enzyme, die in der Synthese und den Abbau dieser Fettsäuren involviert sind.

Es war ein Ziel dieser Arbeit, die erste Lipoxygenase aus einer Alge zu isolieren. Da sich das Spektrum der PUFAs in Kieselalgen grundlegend von den höheren RIanzen unterscheidet, ist zu erwarten, dass PUFA-metabolisierende Enzyme andere Sub- stratspezifitäten aufweisen als Enzyme höherer Pflanzen. Daher soll nach erfolgreicher Isolation die Substratspezifität für Pt-Lipoxygenase-1 mit Substraten bestimmt werden, die in höheren Pflanzen nicht auftreten. So ist keine Lipoxygenase im Rlanzenreich bekannt, deren bevorzugtes Substrat ÄRA, EPA oder DHA ist.

Wie beschrieben sind oxygenierte Fettsäuren, die sogenannten Oxylipine, bei der pflanzlichen Wund- und Abwehrreaktion von großer Bedeutung. Der erste Schritt der Oxylipinsynthese ist die Bildung von Hydroperoxid-Derivaten vielfach ungesättigter Fettsäuren. Dies führt zur Bildung von Hydroperoxyfettsauren, die wichtige Ausgangsstoffe für die pflanzliche Biosynthese sind und durch eine Vielzahl von Enzymreaktionen weiter umgesetzt werden. Sie sind beispielsweise Ausgangsstoffe für Jasmons- äure und Jasmonsäuremethylester, die innerhalb der Pflanze als Phytohormone fungieren. Produkte der Lipoxygenasereaktion sind beispielsweise an der Regulation von Entwicklungsprozessen (Keimung, Knollenbildung, Seneszenz) durch die Bildung von Blattaldehyden und Blattalkoholen oder an Wundreaktionen und Pathogenabwehr durch die Synthese von Signalmolekülen und Phytoalexinen beteiligt. Weiterhin sind sie an der pflanzlichen Stressantwort beteiligt. So wirken beispielsweise Traumatin und Tramatinsäure wahrscheinlich an der Wundantwort durch Förderung der Zellteilung mit, oder Jasmonate und ihre Octadecan-Vorstufen induzieren nach mechanischer Verwundung sowie Fraßschäden durch Insekten die Expression von Proteinase- Inhibitoren lokal im geschädigten Gewebe. Auch sind sie an der Synthese antimikro- bieller Metaboliten beteiligt.

Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen und besser geeigneten Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese Hydroperoxyfettsauren beteiligt sind und in RIanzen einen Pathogenschutz vermitteln. Weiterhin ist es vorteilhaft, dass diese Nukleinsäuresequenzen es ermöglichen, regioselektiv mehr- fach ungesättigte Fettsäuren in spezifische Hydroperoxyfettsauren umzusetzen.

Um eine möglichst breite Palette von funktionalisierten Fettsäuren herstellen zu können, besteht deshalb ein großer Bedarf an spezifischen Lipoxygenasen, die es ermöglichen spezifische Hydroperoxyfettsauren herzustellen.

Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Herstellung von Hydroperoxyfett- säuren durch Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül in einem Organismus vorteilhaft in einem eukaryontischen Organismus bevorzugt in einer Pflanze zu entwickeln. Weiterhin bestand die Aufgabe darin für das vorgenannte Verfahren vorteilhafte Nukleinsäure- sequenzen zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen gelöst, die für Polypeptide mit Lipoxy- genaseaktivität codieren, ausgewählt aus der Gruppe: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 enthaltenden codierenden Sequenz ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für

Polypeptide mit Lipoxygenaseaktivität codieren und mindestens 40 % Homologie auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2 aufweisen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine Lipoxygenase aus Diatomeen vorteilhaft aus Phaeodactylum tricornutum besonders spezifisch für die Umsetzung von Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure ist, wenn sie vorteilhaft in einem heterologen System exprimiert werden. Mit dieser Lipoxygenase können vorteilhaft Hydroperoxyfettsauren in Pflanzen, nicht-humanen Tieren oder Mikroorganismen hergestellt werden.

Die vorteilhafte Lipoxygenase aus Phaeodactylum tricornutum arbeitet in einem pH- Bereich von 5 bis 9, bevorzugt in einem pH-Bereich von 6 bis 8,5, besonders bevorzugt in einem pH-Bereich von 6,5 bis 8, ganz besonders bevorzugt in einem pH-Bereich von 7 bis 8. Das pH-Optimum der enzymatischen Reaktion liegt bei pH 8,2. Die erfindungsgemäße Lipoxygenase zeigt eine Regiospezifität für die Hydroperoxybildung von Linolsäure am C-Atom 13 (13-LOX) und weist eine chloroplastidiäre Signalsequenz auf.

Dies unterscheidet die gefundene Lipoxygenase neben der erhöhten Regiospezifität und Aktivität von den Enzymen des Standes der Technik.

Der Begriff „Lipoxygenase" im Sinne der Erfindung umfasst Proteine, sowie ihre Homologen, Derivaten oder Analoga, die aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen Hydroperoxyfettsauren bilden vorteilhaft werden als bevorzugte mehrfach ungesättigte Fettsäuren Arachidonsäure (= ÄRA) und/oder Eicosapentaensäure (= EPA) umgesetzt. Aber auch andere mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind Substrat für die enzymatische Reaktion der Lipoxygenase.

Bei einer weiteren Ausführungsform kodieren Derivate des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, wiedergegeben in SEQ ID NO: 1 , Proteine mit mindestens 60 %, vorteilhaft mit mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 75 % und stärker bevorzugt mindestens 80 %, 85 %, 90 %, 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität zur vollständigen Aminosäure- sequenz der SEQ ID NO: 2. Die Identität wurde über den gesamten Aminosäurebzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. AppI. Math. 2; 482-489 (1981)], die im GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzhomologiewerte wurden mit dem Programm Gap über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 8, Length Weight: 2 für Proteine und Gap Weight: 50, Length Weight: 3 für Nukleinsäuresequenzen. Dem Fachmann ist klar, dass, wenn man Homologien von Nukleinsäuresequenzen und nicht Identitäten miteinander vergleicht, die mit den Algorithmen erhaltenen Prozentwerte für die Homologie leicht höher liegen als die vorgenannten Prozentwerte für die Identität. Die Erfindung umfasst zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenzen (und Teilen davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit die gleiche Lipoxygenase kodieren wie diejenige, die von der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert wird. In SEQ ID NO: 3 ist zusätzlich zum codierenden Bereich (siehe SEQ ID NO: 1) noch der 5'- und 3'-Bereich der Nukleinsäuresequenz wiedergegeben. SEQ ID NO: 4 zeigt die korrespondierende Proteinsequenz.

Zusätzlich zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Lipoxygenase -Nukleotidsequenz erkennt der Fachmann, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen der Lipoxygenase führen, innerhalb einer Population existieren können. Diese genetischen Polymorphismen im Lipoxygenase-Gen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund von natürlicher Variation existieren. Diese natürlichen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des Lipoxygenase -Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotid- Variationen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der Lipoxygenase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktionelle Aktivität der Lipoxygenase nicht verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.

Unter mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAS) sind im folgenden doppelt oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die Doppelbindungen aufweisen, zu verstehen. Die Doppelbindungen können konjugiert oder nicht konjugiert sein.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologiescreening verwendet werden. Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen eukaryontischen Organismen wie RIanzen wie speziell Moosen, Diatomeen oder Pilze vorteilhaft aus anderen Diatomeen isolieren.

Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 1 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise den oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Lipoxygenasegenen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäure- art DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standard- bedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA- Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingun- gen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G- + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., „Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G- + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID NO: 1 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Außerdem sind unter Homologen der Sequenz SEQ ID NO: 1 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch lnsertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert wurden.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz(en), die für eine Lipoxygenase codiert/ codieren, können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Lipoxygenase-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der hetero- logen Gene. Diese von RIanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.

Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für das Lipoxygenase-Gen kodieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenz, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die enzymatische Aktivität und spezifische Selektivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch einer Rlanze angepasste, künstliche Nukleotid-Sequenzen.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise die Synthese von Hydroperoxyfett- säuren in Ölen, Lipiden oder als freie Fettsäuren in den eukaryontischen Organismen vorteilhaft in den Pflanzen durch Überexpression des Lipoxygenase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, Lipoxygenase - Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro-Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA- Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P.A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733( 1997) oder bei Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336- 347 (1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Kodon -Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Rlanze leicht ermitteln.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind Sequenzen zu nennen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein Lipoxygenase-Polypeptid oder ein funktioneil äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf Lipoxy- genase-Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signalsequenz für das ER oder ein Transitpeptid, das das Lipoxygenase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.

Vorteilhaft stammen die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuresequenzen aus Diatomeen wie dem Stamm Bacillariophyta, mit den Klassen Centrales, Cosciniodis- cophyceae, Fragilariophyceae, Pennales oder Bacillariophyceae, bevorzugt aus den Ordnungen Centrales oder Pennales, mehr bevorzugt aus den Unterordnungen Araphidineae, Raphidoidineae, Biraphidineae oder Monoraphidineae, besonders bevorzugt aus den Familien Naviculaceae, Cymbellacease, Entomoneidaceae, Nitzschiaceae, Epithemiaceae, Auriculaceae und Surirellaceae oder ganz besonders bevorzugt aus den Gattungen Amphora, Cymbella und Phaeodactylum. Vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen stammen aus den Gattungen und Arten Phaeodactylum tricornutum, Cymbella microcephala, Cymbella leptoceros, Cymbella naviculiformis, Cymbella prostrata, Cymbella sileslaca, Cymbella sinuata, Cymbella trugidula, Cymbella tumida, Encyonema prostratum, Encyonema silesiacum, Reimeria sinuata, Amphora coffeaeformis, Amphora veneta, Amphora ovalis oder Amphora exigua. Vorteilhaft können die Lipoxygenase-Gene im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Beispiele für derartige Gene sind die Acyltransferasen, weitere Desaturasen oder Elongasen.

Unter den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen sind Proteine zu verstehen, die eine in der Sequenz SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die enzymatische Aktivitäten des in SEQ ID NO: 2 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird, das heißt die Fähigkeit Hydroperoxyfettsauren zu bilden bleibt erhalten bzw. ist nicht wesentlich reduziert. Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Enzyme zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 % der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.

Unter Derivaten sind auch funktioneile Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für Lipoxy- genäse codierende Sequenz beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion, das heißt deren enzymatische Aktivität und Substratselektivität nicht wesentlich reduziert ist, zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der Lipoxygenase Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= Enzymaktivität stärker als die Aktivität des Ausgangsenzym, das heißt Aktivität ist höher als 100 %, bevorzugt höher als 110 %, besonders bevorzugt höher als 130 %).

Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäßen Expressionskassette geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine Lipoxy genäse mit den oben beschriebenen Sequenzen kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Hydroperoxyfettsauren in freier Form oder in Ölen oder Lipiden gebunden verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.

Unter der erfindungsgemäßen Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt oder -fragment) sind die in SEQ ID NO: 1 genannte Sequenz, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte „enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Das Lipoxygenase-Gen kann in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in RIanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere ein pflanzliche Promotoren oder Promotoren, die aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vorteil- hafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl^' T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P -Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFα, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285- 294], SSU, OCS, Iib4, STLS1 , B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Lipoxy- genase-Gens in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRP1-Promotor [Ward et al., Plant.Mol. Biol.22(1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin- induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO93/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien- spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen/-organen sicherstellen, in denen die Fettsäurebiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet wie beispielsweise im Endosperm oder im sich entwickelnden Embryo. Insbesondere zu nennen sind vorteilhafte Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der USP-Promotor oder Derivate davon, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder der Napin- Promotor. Der erfindungsgemäß aufgeführte und besonders vorteilhafte USP- Promotor oder dessen Derivate vermitteln in der Samenentwicklung eine sehr früh Genexpression (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991 , 225(3) :459-67). Weitere vorteilhafte samenspezifische Promotoren, die für monokotyle und dikotyle Pflanzen verwendet werden können, sind die für Dikotyle geeignete Promotoren wie ebefalls beispielhaft augeführte Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der Oleosin- Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Leguminosen B4-Promotor (LeB4, Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239) oder für Monokotyle geeignete Promotoren wie die Promotoren die Promotoren des lpt2— oder lpt1 -Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die Promotoren des Gersten Hordein-Gens, des Reis Glutelin-Gens, des Reis Oryzin-Gens, des Reis Prolamin-Gens, des Weizen Gliadin-Gens, des Weizen Glutelin-Gens, des Mais Zein-Gens, des Hafer Glutelin-Gens, des Sorghum Kasirin-Gens oder des Roggen Secalin-Gens, die in WO99/16890 beschrieben werden. Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Rlanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen und Lipiden bzw. deren Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor des Napin-Gens aus Raps (US 5,608,152), des USP- Promotor aus Vicia faba (USP = unbekanntes Samenprotein, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991 , 225 (3): 459-67), des Oleosin-Gens aus Arabidopsis (WO98/45461), des Phaseolin-Promotors (US 5,504,200) oder der Promotor des Legumin B4-Gens (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9). Weiterhin sind zu nennen Promotoren, wie der des lpt2 oder lpt1 -Gens aus Gerste (WO95/15389 und

WO 95/23230), die in monokotylen Pflanzen samenspezifische Expression vermitteln.

In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie das Lipoxygenase-Gen liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese wie Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels, die eine gesteigerte Synthese ermöglichen, ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl- ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure- Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl- Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Triacyl- glycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure- Elongase(n). Beispielsweise seien die Gene für die Δ-15-, Δ-12-, Δ-9-, Δ-6-, Δ-5- Desaturase, ß-Ketoacyl-Reductasen, ß-Ketoacyl-Synthasen, Elongasen oder die verschiedenen Hydroxylasen und Acyl-ACP-Thioesterasen genannt. Vorteilhaft werden Desaturase- und Elongasegene im Nukleinsäurekonstrukt verwendet. Besonders vorteilhaft werden Gene ausgewählt aus der Gruppe Δ-4-Desaturase-, Δ-5- Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desatuase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-9-Elongase im Konstrukt verwendet.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungsgemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allge- meinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'- Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für ein Lipoxygenase- Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in v/fro-Mutagenese, -primerrepair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus

Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHδ entsprechen (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Lipoxygenase-DNA-Sequenz sowie einem Poly- adenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience (1987) beschrieben werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das α-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatasegen, das ß-Glucuronidase-Gen, ß-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphospho- transferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die Lipoxygenase DNA Sequenz operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Piastiden vorteilhaft in Chloroplasten. Aber auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasma- tischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711).

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den USP- oder Napin-Promotor), das zu exprimierende Gen und das ER-Retentions- signal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.

Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Rlanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-Serie wie z.B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder PUC19, M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHSl , pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSI , pll_2 oder pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M.A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] und von van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & LL. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi,, [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefepromotoren sind beispielsweise 2μM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHIac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L, 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71 -119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bestehen.

Von Vorteil ist hier die sog. Co-transformation in ihren vielfältigen Ausgestaltungsformen zur Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in den Wirts- Organismus.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.

Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.

Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassette. Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Transformationsvektor pRT ((a) Toepfer et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff.) eingebaut werden. Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.

Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.

Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].

Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31 -39).

Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Rlanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Rlanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBOJ. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispielsweise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentrans- formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von RIanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies, insbesondere von Ölhaltigen Kulturpflanzen, wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakao- bohne verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die genetisch veränderten Rlanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden. Als transgene Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind wie Mikrororganismen, nicht-humane Tiere oder Pflanzen vorteilhaft alle Kulturpflanzen. Beispielhaft seien Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Lein, Calendula oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.

Unter transgenen Organismus bzw. transgener Pflanze im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Transgen bedeutet aber auch wie genannt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt das eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Organismen sind Pilze wie Mortierella oder Pflanzen wie Kulturpflanzen vorteilhaft wie Ölfruchtpflanzen.

"Transgen" meint damit beispielsweise bezüglich einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die für die Lipoxygenase oder deren Derivate codiert, oder einem Organismus transformiert mit dieser Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder a) die Lipoxygenase-Nukleinsäuresequenz, oder b) eine mit der Lipoxygenase-Nukleinsäuresequenz funktioneil verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder c) (a) und (b) sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp.

Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology l 85, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Verwendbare Expressionsstämme z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen codierend für ein Lipoxygenase-Gen oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzenzellen, -geweben oder Rlanzenteilen. Ziel der Verwendung ist die Erhöhung des Gehaltes an Hydroperoxyfettsauren in diesen Organismen.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression des Lipoxygenase-Gens spezifisch in den Blättern, in den Samen, den Knollen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche Lipoxygenase überproduzierenden transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Gegenstand sind transgene Pflanze enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder ein Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die für eine Lipoxygenase codiert.

Die Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthaltend eine Lipoxygenasegensequenz kann darüber hinaus auch zur Transformation der oben beispielhaft genannten Organismen wie Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen, Ciliaten und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Hydroperoxyfettsauren eingesetzt werden. Gegenstand der Erfindung sind wie beschrieben transgene RIanzen, transformiert mit einer Expressionskassette enthaltend eine Lipoxygenase-Gensequenz oder mit dieser hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflan- zen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps und Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen, Moose oder Algen. Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxyperoxyfettsäuren durch Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine oben beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 1 und Derivate) oder mindestens ein erfindungsgemäßes Genkonstrukt (= Nukleinsäurekonstrukt oder Expressionskonstrukt) in einen Organismus vorteilhaft einen Öl produzierenden Organismus wie einer Pflanze oder einem eukaryontischen Mikroorganismus bringt, diesen Organismus anzieht (Anzucht) bzw. kultiviert und dass in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die im Öl enthaltenden Hydroperoxyfettsauren ggf. freisetzt. Die Fettsäuren können aus den Ölen bzw. Lipiden beispielsweise über eine basische Hydrolyse z.B. mit wässriger NaOH oder KOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freigesetzt werden. Danach können sie über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H₂SO₄ isoliert werden. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorher- gehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.

Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren transgene Pflanzen vorteilhaft Kulturpflanzen wie ölhaltige Pflanzen als Organismen verwendet. Diese Pflanzen enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten Hydroperoxyfettsauren und können vorteilhaft direkt vermarktet werden ohne dass, die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze RIanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze abgeleiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Organismen vorteilhaft RIanzen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte Hydroperoxyfettsauren lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Rlanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit

Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Im Falle von Mikroorganismen werden diese nach Ernte beispielsweise direkt ohne weitere Arbeitsschritte extrahiert oder aber nach Aufschluss über verschiedene dem Fachmann bekannte Methoden extrahiert. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/ physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf noch desodoriert.

Die im Verfahren hergestellten Hydroperoxyfettsauren fallen in den Organismen vorteilhaft in Form ihrer Öle, Lipide oder Fettsäuren oder Fraktionen davon an.

In dieser gebundenen Form können sie auch mit den erfindungsgemäßen Lipoxygenasen aus den entsprechenden gebundenen Fettsäuren synthetisiert werden. Auch freie Fettsäuren werden umgesetzt.

Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an freien oder vorteilhaft veresterten Hydroperoxyfettsäure(n) hat. Vorzugsweise ist der Anteil an veresterten Hydroperoxy- fettsäuren ungefähr 30 %, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50 %, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60 %, 70 %, 80 % oder mehr. Je nach Ausgangsorganismus kann der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.

Bei den im Verfahren hergestellten Hydroperoxyfettsauren, handelt es sich beispielsweise um Hydroperoxyfettsauren, die in Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester gebunden sind.

Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden.

Pflanzen werden nach Transformation zunächst wie oben beschrieben regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. angebaut. Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicherweise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Überschuss an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuss von Lösungsmittel zu Biomasse von 1 :4. Das Lösungsmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO₂ erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispiels- weise über Filtration entfernt werden.

Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich. Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise wie oben beschrieben verseift.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:

- Verfahren zur Transformation einer Rlanze dadurch gekennzeichnet, dass man erfindungsgemäße Expressionskassetten enthaltend eine Lipoxygenase- Gensequenz aus Diatomeen oder mit dieser hybridisierende DNA'-Sequenzen in eine Rlanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Rlanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.

Proteine enthaltend die in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert: Beispiele

a) Materialien

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Arachidonsäure (= ÄRA), Docosapen- taensäure (= DPA), Docosahexaensäure (= DHA), Linolsäure, α-Linolensäure und γ-ünolensäure wurden von der Firma Cayman Chemicals, USA, verwendet.

Alle weiteren verwendeten Chemikalien wurden von den Firmen Merck (Darm- Stadt), Roth (Karlsruhe), Sigma (Deisenhofen) oder Serva (Heidelberg) bezogen.

Als HPLC-Laufmittel wurden die Produkte von J.T. Baker (Phillipsburg, N.J., USA) in HPLC-Qualaität genutzt.

b) Vektoren

Verwendete Vektoren:

PQE30™ stammt von Qiagen, Hilden pGem-T stammt von Promega, Madison, USA

c) Bakterien

Als Bakterien wurden verwendet:

E. coli XL1-Blue [Bullock et al., Bio Techniques, 5:376-378, 1987 recA1 endA1 gyrA96 thi-1hsdR17 supE44 relA1 lac[F proAB lac^qZ

MIS TnlOCTef)]

E. coli SG13009[pREP4] [Gottesman et al., J Bacteriol, 148(1):265-73, 1981] Nal^s Str^s rif^s lac^" ara gal^" mtl^" F^" recA⁺ uvr⁺

d) Antibiotika

Zur Selektion wurden folgende Antibiotika verwendet: Carbenicillin Stammlösung: 100 mg/ml, Endkonzentration: 100 μg/ml (Roth, Karlsruhe)

Kanamycin Stammlösung: 50 mg/ml, Endkonzentration: 25 μg/ml

(Dichefa, Niederlande) e) Antikörper und Konjugate

Folgende Antikörper wurden verwendet:

anti-CsLb-Lipoxygenase Antikörper Kaninchen, Dr. I. Feussner, Gatersleben [Hause et al., Planta, 210:708-714, 2000]

anti-Kaninchen IgG-Alkalische

Phosphate (ALP) Konjugat Röche Diagnostics Grenzach

f) PCR-Protokoll

• 10 Zyklen

94°C 30 sek

52-57°C 30 sek

72°C 2 min

• 25 Zyklen

94°C 30 sek

47-52°C 30 sek

72°C 2 min, Inkrement δ sek

• 1 Zyklus

72°C 5 min

Beispiel 1 : Kolonie-PCR

Zur Identifikation der Bakterienkolonien, die nach Transformation das gewünschte Fragment in der Plasmid-DNA enthalten, wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Zell- material einer Kolonie wurde mit einem Zahnstocher in 10 μl Wasser suspendiert.

Durch Zugabe von 10 x Puffer, MgCI₂, dNTP, Tfl-Polymerase und der entsprechenden Primer wurde das oben erwähnte [PCR-Protokoll (f)] PCR-Reaktionsgemisch hergestellt. Es wurde das gleiche Programm durchlaufen und die selben Primer verwendet, die zu Amplifikation des Fragments dienten. Wurde zur Amplifikätion ein Primer eingesetzt, der auch im Vektor eine Bindungsstelle besitzt, ist dieser Primer durch Vektor-spezifische Primer ersetzt worden. Wurde das Fragment in diesem Falle nicht gerichtet kloniert (z.B. in pGEM-T), wurde Kolonie-PCR für beide Richtungen mit den entsprechenden Vektor-spezifischen Primern durchgeführt. Für die Identifikation von Bakterienkolonien, die DNA-Konstrukte im Vektor enthalten, die aus mehr als einem PCR-Fragment zusammengesetzt wurden, ist der 5'-Primer des am 5'-Ende befindlichen Fragments und der 3'-Primer des am 3'-Ende befindlichen Fragments verwendet worden.

Beispiel 2: EXPAND™ High Fidelity-PCR

Wenn eine niedrige Fehlerate bei der PCR essentiell war, wie z.B. für die DNA- Sequenz der rekombinanten Pt-Lipoxygenase, wurde die Amplifizierung von DNA- Fragmenten mit dem „EXPAND™ High Fidelity-PCR-System" nach der Vorschrift des Hersteller durchgeführt. Dieses System enthält ein Gemisch aus der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase und der ebenfalls thermostabilen Pwo-DNA-Polymerase, die zusätzlich eine 3'-5'-Exonuklease-Aktivität besitzt. Außerdem wurden statt 35 nur 30 Zyklen durchlaufen. Beides diente dazu, die Fehlerrate niedrig zu halten, um möglichst wenig Mutationen in der zu amplifizierenden DNA zu erhalten.

Beispiel 3: Ligation von DNA

Die Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA erfolgte durch Ligation mittels T4-DNA-Ligase. Dabei werden endständige 5'-Phosphatgruppen und 3'-Hydroxyl- gruppen unter Bildung von Phosphordiesterbindungen verbunden. Cofaktor dieser Reaktion ist ATP. Um die intramolekulare bzw. intermolekulare Ligation des Vektors zu reduzieren, wurde das DNA-Fragment in etwa dreifachem Überschuss im Vergleich zur Vektor-DNA eingesetzt. Die Ligationsreaktion erfolgte bei 4°C über Nacht. Die Ligation wurde in einem Volumen von 10 μl oder 20 μl durchgeführt.

Grundsätzlich wurden PCR-amplifizierte DNA-Fragmente zunächst in pGEM-T kloniert. Mit Tfl bzw. „EXPAND™ High Fidelity" amplifizierte Fragmente besitzen einen 3'-Adenin-Überhang, der mit dem 3'-Thymin-Überhang des pGEM-T- Vektors hybridi- siert. Unter anderem deshalb ist die Ligationseffizienz dieses Vektors relativ hoch. pGEM-T bietet die Möglichkeit der Blau-Weiß-Selektion mit IPTG und X-Gal.

Fragmente, die über Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen aus Vektoren herausgeschnitten wurden (Beispiel 5), sind mit entsprechend vorgeschnittenem Vektor ligiert worden. Der in Tabelle 1 angegebene Ansatz für Ligation unter Benutzung von Restriktionsschnittstellen wurden entsprechend der gegebenen DNA-Konzentration variiert, um eine Konzentration von Insert: Vektor von rund 1 μM : 0,3 μM im Ansatz zu erzielen. Bei einer hypothetischen Ligationseffiziens von 100 % ergibt dieser Ansatz rund 15 fmol/μl Ligationsprodukt. Tabelle 1 : Ligation von Vektor- und Donor-DNA

Ligationsansatz 5 μl 2x Ligationspuffer, 3 μl DNA (Fragment), 1 μl Vektor,

(pGEM-T Vektor) 1 μl T4-DNA-Ligase (1 U/μl)

Ligationsansatz 2 μl 10x Ligationspuffer, 5-9 μl DNA (Fragment),

(Restriktionsschnittstellen) 1-3 μl Vektor, 2 μl T4-DNA-ügase (1 U/μl), ad 20 μl H₂O

Beispiel 4: Transformation von E. coli

Im Zuge der Klonierung von DNA-Fragmenten wurden die E. coli-Stämme XL1-Blue und SG 13009 transformiert. Es wurden 100 μl kompetente E. coli-Zellen auf Eis aufgetaut und ca. 5 fmol DNA zugegeben. Dies entspricht 10 ng eines 3000 bp DNA- Konstruktes oder 17 ng eines 5000 bp DNA-Konstruktes. Nach 20 min Inkubation im Eis wurden die Bakterien für 50 s bei 42°C einem Hitzeschock ausgesetzt. Anschließend wurde der Ansatz für 5 min auf Eis belassen, mit 900 μl LB-Medium versetzt und 1 h unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Die Bakterien wurden entsprechend ihrer Resistenz auf Selektionsmedium ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Beispiel 5: Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen [Sambrook et al.,

Molecular cloning: A loboratory manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York, 1989]

Restriktionsnukleasen spalten doppelsträngige DNA sequenzspezifisch durch Hydro- lyse kovalenter Bindungen. Dabei werden 4 bis 8 bp lange palindromische Sequenzen erkannt und geschnitten. Bei Spaltungen mit den in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsendonukleasen entstehen Enden, die einen 3'- oder 5'-Überhang tragen.

Restriktionen wurden zur Kontrolle von Bakterienkolonien durchgeführt, die sich für die Klonierungsstrategie eignen (s. Beispiel 28) und für Gewinnung von DNA-Fragmenten für die Ligation (Beispiel 3). Das Ausschneiden der DNA-Fragmente in zwei Schritten. Nach der Restriktion mit dem erste Enzym erfolgte eine Reinigung des Reaktionsansatzes und dann erst die Restriktion mit dem zweiten Enzym. Dies erfolgte, um die Ausbeute an korrekt gespaltener DNA dadurch zu erhöhen, dass jedes Enzym im optimalen Puffer mit 100 % Aktivität ohne unspezifische Nebenreaktion („Stern-Aktivität") spaltet. Für die Kontrolle von Bakterienkolonien, die sich für die Klonierungsstrategie eignen, wurde pro Ansatz nur ein Enzym eingesetzt, um eine eindeutige Aussage für jedes Enzym zu erhalten. Tabelle 2 zeigt die verwendeten Ansätze für Restriktionsspaltungen. Als Reaktionspuffer wurde der jeweils optimale Puffer nach Herstellerangaben eingesetzt. Der Restriktionsansatz wurde ca. 12 h bei 37°C inkubiert. Tabelle 2: Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Restriktionsansatz 1 μl 10x Reaktionspuffer, 2 μl Plasmid-DNA (ca. 0,6 μg), zum Screening 0,21 μl Restriktionsenzym, 1 ,8 μl H₂O

präparativer 5 μMOx Reaktionspuffer, 30 μl Plasmid-DNA (ca. 9 μg),

Restriktionsansatz 2 μl Restriktionsenzym, 13 μl H₂O

Beispiel 6: Auftrennung von DNA in Agarose-Gelen [Sambrook et al., Molecular cloning: A loboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989]

Mit einem 1 ,5 %igen Agarosegel ließen sich DNA-Fragmente von 0,2 bis 4 kb effektiv trennen. Dazu wurden 1 ,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer durch Aufkochen in der Mikrowelle gelöst, auf 60°C abgekühlt und in einen horizontalen Gelträger gegossen. Zur Polymerisation wurde für mindestens 30 min abgekühlt. Die DNA-Proben wurden mit 0,1 Volumen Probenpuffer versetzt und bei einer Spannung von 120 V elektro- phoretisch getrennt. Als Größenmarker wurde der S ARTLADDER-Standard (Eurogentec, Seraing, Belgien) mit DNA-Fragmenten definierter Größe verwendet. Um die DNA- Banden im Gel sichtbar zu machen, wurde das Agarosegel anschließend für 15 bis 20 min in einem Ethidiumbromid-Bad (2 μg/ml) inkubiert und für etwa 5 min in destilliertem Wasser entfärbt. Unter Bestrahlung mit UV-Licht (312 nm) fluoresziert das an die DNA angelagerte Ethidiumbromid. Zur Dokumentation und Auswertung wurden die Agarosegele fotografiert.

Beispiel 7: Minipräparation von Plasmid DNA

Die Plamidminipräparation erfolgte entweder mit dem „QLAprep Plasmid MiniPrep Kit" (Qiagen, Hilden) oder mit dem „NucleoSpin® Plasmid Miniprep Kit" (Macherey-Nagel, Düren), jeweils nach der vom Hersteller angegebenen Methode. Diese Methoden basieren auf der Bindung von DNA an Silicagel Membranen bei hohen Konzentrationen von chaotropen Salzen. Die Elution erfolgt mit niedrig konzentrierten Salz- Puffern oder mit Wasser. Mit dieser Methode wird die DNA somit von anderen Zellbestandteilen getrennt und in hoher Reinheit erhalten. Beispiel 8: DNA-Fragmentisolierung aus Agarosegelen

Die Gel-Bande des zu reinigenden DNA-Fragments wurde unter UV-Licht mit einem Skalpell sauber ausgeschnitten und mit dem „GFT™ PCR DNA und Gel Band Puri- fication Kif nach Angaben des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech, UK) gereinigt. Um Mutationen in den DNA-Fragmenten zu vermeiden, wurde bei der Fragmentisolierung darauf geachtet, dass die UV-Bestrahlungszeit nur sehr kurz war.

Beispiel 9: Sequenzanalyse

Die Sequenzen wurden mit HUSAR (DKFZ, Heidelberg) unter Nutzung der Fragment Assemblierungsprogramme, die Teil des WISCONCIN Packets Version 10.2 sind (Actylrys, ehemals Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.) analysiert. Sequenzen wurden in das Projekt geladen, Bestandteile vom Klonierungsvektor und Phagenbank- Vektor halbautomatisch entfernt und anschließend zu durchgehenen Sequenzen (Contig's) assembliert, Sequenzvergleich gegen die Datenbanken SWISSPROT, TREMBL, PIR und OWL wurde mittels des BLASTX2 Algorithmus [Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25(17):3389-3402, 1997] durchgeführt.

Ein phylogenetischer Stammbaum wurde mit dem Programm PHYLIP ₃₅ erstellt. Ausgehend von CLUSTALX-Sequenzvergleich einer Vielzahl bekannter Lipogenase- Proteine wurden mittels SEQBOOT einhundert Punktmutationsreihen erstellt (random seed number:5). Die bekannten Lipoxygenase-Proteine gliedern sich in drei Stammbaumsegmente, nämlich den Typ 1 13-LOX-, Typ 1 9-LOX- und Typ 2 13-LOX- Stammbaum. PROTPARS erstellt die Stammbäume der einhundert Punktmutationsreihen, indem die evolutionären Abstände zwischen den Proteinen berechnet werden. Mit CONSENS wird aus den einhundert Stammbäumen der wahrscheinlichste berechnet. Die Entfernung zweier Proteine im phylogenetischen Stammbaum beruht auf der Anzahl von Mutationen, die auf DNA-Ebene notwendig sind, um die Sequenz des einen Proteins dem anderen anzugleichen. Der genetische Code wird dabei berücksichtigt. So sind z.B. drei Punktmutationen für eine Gln/Cys Austausch notwendig. Die unterschiedlichen Mutationsraten von Organismen werden allerdings nicht einbezogen.

Beispiel 10: Expression des rekombinanten Proteins

Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte im E. coli-Stamm SG 13009. Die Expressionsklone wurden zunächst bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6 bis 0,8 in LB-Medium (mit Cabenicillin und Kanamycin) bei 37°C inkubiert. Nach Induktion der Expression mit IPTG (Endkonzentration: 1 mM) wurden die Bakterien 2 oder 7 Tage bei 10°C kultiviert. Beispiel 11 : Zellaufschluss

Die E. coli-Zellen wurden 20 min bei 4000 x g und 4°C abzentrifugiert und in Lysinpuffer (50 mM Tris.HCI, 10 % Glycerin, 0,1 % Tween, 0,5 M NaCI, pH 7,5) aufgenommen (7 ml Lysinpuffer pro 250 ml Zellkultur). Mit Ultraschall (zehnmal 1 min, 50 % Leistung, 50 % Impuls) wurden die Zellen aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden 30 min bei 4000 x g, 4°C abzentrifugiert. Der Überstand mit den löslichen Proteinen wurde abgenommen und bei 4°C aufbewahrt. Die Aktivität der rekombinant hergestellten Lipoxygenase wurde mit diesem Lysat analysiert.

Beispiel 12: Aktivitätstest

Mit Linolsäure als Substrat wurde die Lipoxygenase auf Aktivität getestet. Im Gegensatz zum Substrat mit seinen isolierten Doppelbindungen besitzen die gebildeten Hydro(pero)xide durch ihr konjugiertes Dien-System ein Absorptionsmaximum bei 234 nm. Aufgrund der hohen Eigenabsorption des Zelllysates erfolgte diese Bestimmung nicht spektrophotometisch. Die Produkte der Fettsäureumsetzung wurden daher mittels Normal-Phasen-HPLC durchgeführt (s. Beispiel 15). Die Umsetzung erfolgte nach dem im folgenden angegebenen Protokoll bei pH 6 und 8.

Beispiel 13: Bestimmung des pH-Optimums

800 μl der Enzymlösung (s. Beispiel 11) wurden mit 1,2 ml pH-Puffer (100 mM Na- Phosphat, pH 5,5 bis 8; 100 mM TrisHCI, pH 8 bis 9,5) und 1 μl (250 μg) Linolsäure versetzt. Die Reaktion erfolgte für 30 min in einem offenen 15-ml-Gefäß bei Raumtemperatur (= 23^CC RT). Die entstandenen Hydroperoxid-Derivate wurden durch Zugabe eines Krümels (« 2 mm³) Natriumborbydrid zu den entsprechenden Hydroxid- Derivaten der Fettsäuren reduziert. Nach 2 min wurde mit 100 μl Eisessig auf pH 3 angesäuert, um die Reduktion abzustoppen und die Hydroxide der Fettsäuren für die folgende Extraktion in die nicht-ionische Form zu überführen. Um die Produkte zu isolieren, erfolgte eine Extraktion mit Methanol und Chloroform [Bligh et al., Can J Biochem Physiol, 37:911-917, 1959]. Mit einem Verhältnis wässrige Phase/ Methanol/Chloroform von 1 :1:1 (v/v/v). Nach 10 min Zentrifugation bei 4000 x g zur Phasentrennung wurde die Chloroformphase in ein 1 ,5-ml-Gefäß überführt, im Stick- Stoffstrom vollständig eingedampft und dann in dem entsprechenden Laufmittel für die HPLC aufgenommen. Beispiel 14: Bestimmung der Substratspezifität

Der Umsatz erfolgte wie oben beschrieben (Beispiel 13) bei pH 8,2 mit jeweils 250 μg Substrat. Die unterschiedlichen Substrate lagen in Ethanol gelöst in ungleicher Konzentration vor. Die daurch bedingten abweichenden Volumina Substrat wurden durch Zugabe reinen Ethanols ausgeglichen, um einen Einfluss des Ethanols auf die Aktivität des möglicherweise Membran-assoziierten Enzyms zu nivellieren.

Beispiel 15: Normal-Phasen-HPLC

Die gebildeten Positionsisomere wurden mit Geräten der AGILENT SERIES IIOO (Hewlett- Packard, Waldbronn) unter Benutzung von Normal-Phasen-Säulen (50 x 4,6 mm, 3 μm LUNA SILICA (2), Phenomenex, Aschaffenburg, oder 150 x 2,1 mm, 5 μm, ZORBAX RX- SIL, Hewlett Packard, Waldbronn) und einem Dioden-Array Detektor analysiert. Bei Verwendung der LUNA SiucA-Säule wurde als Laufmittel ein Gemisch auf Hexan/iso- Propanol/TCA (99:1 :0,02, v/v/v, isokratischer Fluss 1 ml/min, 20 min) verwendet, wohingegen bei der ZORBAX RX-SIL-Säule ein Mischungsverhältnis von 98:2:0,02 (v/v/v, isokratischer Fluss 250 μl/min, 20 min) eingesetzt wurde. Da für die Untersuchung der Hydroxide der langkettigen Fettsäuren eine höhere Trennschärfe erforder- lieh war, wurde für die Untersuchung der Substratspezifität für alle Substrate als unpolares Laufmittel auf der ZORBAX RX-SIL Säule Hexan/iso-Propanol/TCA im Verhältnis 99:1 :0,02 (v/v/v, isokratischer Fluss 250 μml/min, 60 min) benutzt. Zur Identifizierung der gebildeten Hydroxyfettsäuren dienten Standards von Cayman Chemicals (USA). Nicht erwerbliche Hydroxid-Derivate wurden durch Vergleich mit Autooxidationsprodukten (Beispiel 17) sowie durch GC/MS (Beispiel 18) identifiziert. Die Datenaufnahme und -auswertung erfolgte mit der Software CHEMSTATION FOR LC ₃D [Rev. A.08.01 (783)] von Agilent Technologies, Waldbronn.

Beispiel 16: Chiral-Phasen-HPLC

Die per Normal-Phasen HPLC gereinigten Fettsäure-Hydroxide wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Systems (Beispiel 15) ausgestattet mit einer Chiral- PhasenSäule (150 x 2,1 mm, 5 μm Daicel Chemical Industries Ltd. CHIRACEL OD-H, Merk, Darmstadt), auf deren Enantiomeren-Zusammensetzung untersucht. Für die Hydroxide der Linolsäure und α-Linolsäure wurde als Laufmittel Hexan/iso-Propanol/ TCA (95:5:0,2, v/v/v, isokratischer Fluss 100 μl/min, 20 min) verwendet und für die Hydroxid-Derivate der y-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosa- pentaensäure sowie Docosahexaensäure wurde das Laufmittel Hexan/iso-Propanol/ TCA im Verhältnis 98:2:0,02 (v/v/v, isokratischer Fluss 100 μl/min, 60 min). Die Daten- aufnähme und -auswertung erfolgte mit der Software CHE STATION FOR LC ₃D [Rev. A.08.01 (783)] von Agilent Technologies Waldbronn.

Beispiel 17: Autooxidation von Fettsäuren

200 μg der Fettsäuren wurden in 100 μl Methanol aufgenommen, mit 800 μl eines 100 mM TrisHCI Puffers, pH 9,9 versetzt, eine Spatelspitze Eisen-(ll)-sulfat hinzugegeben und die Lösung für 1 h bei 80°C inkubiert. Alle 10 min wurde hierbei Luft in die Proben eingeblasen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur erfolgte die Zugabe eines Krümels (« 2 mm³) Natriumborhydrid zur Reduktion der Hydroperoxide der

Fettsäuren zu den entsprechenden Hydroxid-Derivaten. Durch Ansäuerung mit 100 μl Eisessig auf pH 3 nach 2 min wird diese Reaktion gestoppt und die Hydroxide der Fettsäuren in die ungeladene Form überführt für die folgende Extraktion. Die Extraktion erfolgte zweimal mit 1 ml n-Heptan. Um die Phasen zu trennen, wurden die Proben zentrifugiert. Die beiden organischen Phasen wurden vereinigt, im Stickstoffstrom vollständig eingedampft und in dem entsprechenden HPLC-Laufmittel aufgenommen.

Beispiel 18: Derivatisierung von Hydroxyfettsäuren und GC/MS Analysen

Für die GC/MS Analyse werden Hydroxyfettsäuren derivatisiert, um ihre Flüchtigkeit sowie thermische Stabilität zu erhöhen und um die Polarität zu senken [W.W. Christie, Lipids, 33(4):343-53, 1998]. Dadurch wird die gaschromatographische Trennung erhöht und die Detektierbarkeit verbessert. Die Derivatisierung von Hydroxyfettsäuren zu ihren Methylester-Trimethylsilylethern erlaubt die Identifizierung der Verbindung und die Bestimmung der Position der Hydroxy-Gruppe [Wollard et al., J Chromatogr, 306:1-21 , 1984].

Ein Viertel des Umsatzes der Ansätze für die Substratbestimmung (Beispiel 14) wurde mittels Normal-Phasen-HPLC gereinigt. Die spekulativen Hydroxide der Fettsäuren (Absorption bei 234 bis 237 nm) wurden aufgefangen, im Stickstoffstrom vollständig eingedampft und in 400 μl Methanol aufgenommen. Zur Methylierung wurden dazu 10 μl der EDAC-Stammlösung (100 mg/ml) gegeben und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zugabe von 200 μl 100 mM Tris HCI, pH 7,5 zur Phasenbildung wurde zweimal mit 1 ml n-Hexan ausgeschüttelt. Die Hexanphasen wurden nach Vereinigung im Stickstoffstrom verdampft. Nach Aufnahme des Methylierungs- produktes in 3 μl Acetonitril wurde 1 μl BSTFA-Regisil (1 %) zur Silylierung zugegeben und die GC/MS Analyse durchgeführt. Die GC/MS Analysen unter folgenden Analysebedingungen durchgeführt: GC: Agilent 6890 Serie

Inj.-Volumen 4 μl (manuell)

Trägergas Helium, lineare Flussgeschwindigkeit 1 ,2 ml/min

Trennsäule 30 m x 0,25 mm HP-5MS (Crosslinked 5 % PH ME Siloxane); 0,25 μm Filmdicke; Temperaturprogramm: 60°C (Inj.-Tempera- tur) → 25°C/min → 300°C (1 min) → 10°C/min → 270°C (10 min) MS Aligent 5973 Network lonisierungsenergie 70 eV Scangeschwindigkeit 1 scan/s

Die Datenaufnahme und -auswertung erfolgte mit der Software ENHANCED CHEMSTATION G1701CA Version C.00.00 von Aligent Technologies, Waldbronn.

Beispiel 19: Reinigung von Pt-Lipoxygenase

Zur Reinigung der Proteine wurden die Zellen wie unter Beispiel 11 beschrieben aufgeschlossen, die Zelltrümmer abzentrifugiert und der Überstand über Nacht bei 4°C mit „TALON® Metal Affinity Resin" inkubiert. Die Bindungskapazität beträgt laut Her- steller 5 mg/ml Bettvolumen. Für den Proteinüberstand, der aus 500 ml Zellkultur gewonnen wurde, sind 250 bis 500 μl TALON® eingesetzt worden. Anschließend wurde das Säulenmaterial auf eine Leersäule (T.J. Baker, Phillipsburg, N.J., USA) gegeben. Zunächst wurde mit dem zwanzigfachen Säulenvolumen Na-Phosphat-Puffer (50 mM, 300 mM NaCI, pH 8,0) gewaschen. Um die optimalen Reinigungsbedingungen festzustellen, wurde mit jeweils einfachen Bettvolumen von Na-Phosphat-Puffer

(50 mM, 150 mM NaCI, pH 8,0) mit steigender Imidazolkonzentration (10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM und 300 mM Imidazol) eluiert. Jeder Elutionssohritt wurde vollständig aufgefangen, mit 10 % Glycerin versetzt und bei -80°C eingefroren. Nach der Proteinbestimmung [M.M. Bradford, Anal Bio- chem, 72:248-54, 1976] wurden jeweils 4 μg Protein auf ein SDS-Proteingel aufgetragen sowie ein Western-Blot durchgeführt, um festzustellen, in welcher(en) Fraktion(en) sich das gereinigte Protein befand.

Die Elution unter optimierten Bedingungen erfolgt mit dreimal mit einfachem Bett- volumen Na-Phosphat-Puffer (50 mM, 150 mM NaCI, pH 0,8) mit 125 mM Imidazol. Anschließende Elution mit 300 sowie 500 mM Imidazol wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass von dem zu reinigenden Protein tatsächlich nichts am TALON® verbleibt. Untersucht wurde dies wieder mittels SDS-PAGE und Western-Blot. Beispiel 20: Proteinbestimmung [M.M. Bradford, Anal Biochem, 72:248-54, 1976]

Die Proteinbestimmung erfolgte mit „BIO-RAD Protein Assay) der Firma Bio-Rad (Hercules, USA) gemäß Herstellerangaben unter Benutzung einer BSA Eichgerade.

Beispiel 21 : SDS.Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE [U.K. Laemmli, Nature, 227(259):680-5, 1970], modifizierte Methode)

Für die SDS-PAGE wurde eine Minigelapparatur von Bio-Rad, Hercules, USA, verwendet. Die Proteinproben wurden direkt mit Probenpuffer versetzt oder mit TCA (Trichloressigsäure) gefällt. Dazu wurde 1 ml Probe mit 250 μl 30 %iger TCA für 30 min auf Eis inkubiert, anschließend 10 min bei 14000 x g zentrifugiert und das erhaltene Präzipitat nochmals mit Wasser gewaschen. Nach der Zentrifugation und der Abnahme des wässrigen Überstandes wurde das Präzipitat getrocknet und in „Roti®-Load 1" Probenpuffer gelöst. Vor dem Auftragen wurden die Proben 3 min bei 15000 x g zentrifugiert. Alternativ wurde das Präzipitat bei sehr geringen Mengen Protein (= 4 μg) nach der TCA-Fällung direkt in „Roti®-Load 1" Probenpuffer aufgenommen und solange 1 N NaOH zugegeben, bis die gelbe Färbung nach blau umschlug. Die Auftrennung der Proben erfolgte elektrophoretisch in einem 8 %igen Polyacrylamidgel (Trenngel: 2,15 ml Wasser, 1 ,2 ml Acrylamid/Methylbisacrylamid (30 % / 0,8 %), 1 ,1 ml 4 x Trenngelpuffer, 14 μl APS (50 %), 3,5 μl TEMED; Sammelgel: 0,87 ml Wasser, 0,24 ml Acrylamid/Methylbisacrylamid (30 % / 0,8 %), 0,375 ml 4 x Sammeigelpuffer, 6 μl APS, 3 μl (50 %)). Der Probeneinlauf in das Sammelgel erfolgte für 25 min bei 12,5 mA pro Gel. Die Auftrennung der Proteine im Trenngel wurde bei einer Stromstärke von 25 mA pro Gel für 40 min durchgeführt, bzw. bis die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht hatte. Die aufgetrennten Proteine wurden im Gel angefärbt.

Beispiel 22: Coomasie-Färbung von Proteingelen

Die Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen wurde nach Herstellerangaben mit dem GELCODE® Blue Stain Reagent der Firma Pierce (Rockford, IL, USA) angefärbt. Beispiel 23: Silberfärbung von Proteingelen [Blum et al.; Electrophoresis, 8:93-99, 1987]

Zur Silberfärbung wurde das Gel dreimal 30 min mit Ethanol/Essigsäure/Wasser (30:5:65, v/v/v) [Für alle Puffer und Waschschritte bis/inkl. der Entwicklung wurde 18 MΩ-Wasser verwendet.] fixiert und anschließend dreimal 10 min mit Wasser gewaschen. Sensibilisierung erfolgte durch Inkubation mit 0,02 %iger Na-Thiosulfat- Lösung (frisch hergestellt) für 1 min, woraufhin zweimal 1 min mit Wasser gewaschen wurde. Nach Imprägnierung mit Silbernitratlösung (0,025 % Formaldehyd, 0,0125 % AgNO₃), für 30 min wurde darauf geachtet, höchstens 15 sek (5 bis 15 sek) mit Wasser zu waschen. Die Inkubation mit Entwicklerlösung (3 % Kaliumcarbonat, 0,01 % Formaldehyd, 0,001 % Na-Thiosulfat) erfolgte solange, bis das Proteingel hinreichend gefärbt war (1 bis 10 min). Abgestoppt wurde durch mehrmaliges Spülen mit 1 %iger Essigsäure, woraufhin einmal mit dest. Wasser gewaschen wurde.

Beispiel 24: Western Blot

Nach der elektrophoretischen Auftrennung in einem 8 %igen Proteingel [U.K. Laemmli, Nature, 227(259):680-5, 1970] wurden die Proteine unter Verwendung von Transfer- puffern auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (Minigelapparatur von Bio-Rad, Hercules, USA; 75 min mit 65 V). Die Membran wurde 4 h bei Raumtemperatur mit 1 %iger Ovalbuminlösung (PBST) blockiert und anschließend mit PBST kurz gewaschen. Der primäre Antikörper (anti-CsIb-üpoxygenase (1:1000) und anti-his (1 :2500)) wurde mit PBST (1 % BSA) verdünnt und 1 h mit der Membran inkubiert. Im Anschluss wurde die Membran dreimal 10 min in PBST gewaschen. Für den kolorimetrischen Nachweis wurde das entsprechende ALP Konjugat in der Verdünnung 1 :5000, 1 h mit der Membran inkubiert, zweimal 5 min in PBST gewaschen, einmal 5 min mit PBS und einmal 10 min in AP-Puffer. NBT/BCIP wurde entsprechend der Herstellerangabe in AP-Puffer verdünnt eingesetzt.

Beispiel 25: Isolierung der Phaeodactylum tricornutum Lipoxygenase

Isolierung der Sequenz einer mutmaßlichen Lipoxygenase aus der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum per 5'-RACE. SEQ ID NO: 5 gibt die Consensussequenz aller 5'-RACE-Fragmente wieder. Die isolierte RNA der Kieselalge P. tricornutum lag in Form einer „Lambda Zap II Express"-cDNA-Bank vor, in die sie gerichtet kloniert wurde. Der zugrunde liegende Vektor war pBK-CVM. Die vollständige Sequenz wurde anschließend in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert. Die folgende biochemische Charakterisierung des rekombinanten aktiven Enzyms umfasste die Bestimmung des pH-Optimums und der Substratspezifität. Da viele der gebildeten Hydroxyfettsäuren nicht als Standardsubstanzen zugänglich waren, wurden sie als kombinierte Methylester- und Trimethylsilylether-Derivate mittels GC/MS-Analyse charakterisiert. Außerdem wurde eine Reinigung für das rekombinante Enzym begonnen.

Beispiel 26: Klonierung

Es wurde eine cDNA-Bank aus der Kieselalge P. tricornutum erstellt. Weiterhin wurde eine in vivo Exzission durchgeführt, die Plasmide wiedergewonnen und in E. coli DH1 OB transformiert. Anschließend wurde automatisiert Plasmid DNA gewonnen und eine Zufallssequenzierung durch die Kettenabbruch-Methode durchgeführt. Es wurden 8400 Klone am 5'-Ende sequenziert, zu 3400 nicht-redundanten Sequenzen (Contig's) zusammengefügt und diese annotiert. Durch anschließende Analyse der so entstandenen Datenbank wurden zwei Klone über ihre 5'-Sequenz identifiziert, die Homologien zu pflanzlichen Lipoxygenasen zeigten. Eine davon war die in dieser Arbeit beschriebene Lipoxygenase aus P. tricornutum (LOX2:R:1 (PtLOXI). Klon Pt001077095r) zeigte auf DNA-Ebene im sequenzierten Bereich von 800 bp des 5'- Endes mit 42 % die größte Homologie zur Lipoxygenase- 1 aus Pisum sativum. Zur Verifizierung dieses Befundes wurde dann das 3'-Ende dieses cDNA-Klones sequen- ziert (Figur 4, grauer Bereich). Im Bereich von 170 bp oberhalb des 3'-Endes betrug die Homologie 55 % zur selben Lipoxygenase aus Pisum sativum. Gleichzeitig zeigte dieser Sequenzvergleich, dass mutmaßlich rund 500 bp vom offenen Leserahmen (ORF) am 5'-Ende fehlten.

Beispiel 27: Sequenzverlängerung durch 5'-RACE

Ausgehend von der bekannten Sequenz wurde im 5'-Bereich der genspezifische Primer Pt-LOX2_5RACE(1 ) (5'-GAG CCC CTG.TCT TCT CGG TAT TG) abgeleitet. Durch 5'-RACE mit diesem genspezifischen und dem vektorspezifischen Primer 3 (5'-GCT CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG) wurden die in Figur 4 dargestellten Fragmente verschiedener Länge erhalten, welche die bekannte Sequenz um rund 650 bp in 5'-Richtung verlängerten. Die dunkelgrau hervorgehobenen Sequenzen von Klon Pt001077095r ergaben sich aus der Zufallssequenzierung von 8400 Klonen einer cDNA-Bank der Kieselalge P. tricornutum. Mittels 5'-RACE wurden die hellgrau hervorgehobenen Sequenzen gewonnen. Die Pfeile kennzeichnen die oben erwähnten Primer. Die obere Kurve zeigt die Güte der Sequenzinformation an, die über die Anzahl und das Maß der Übereinstimmung der Sequenzen definiert ist. Eine weitere Sequenzverlängerung mit dem Primer PtLOX2_5RACE(2) (5'-CAA TAT CGA TCA AAC CTC GCT AC), der 677 bp aufwärts vom ersten 5'-RACE-Primer bindet, konnte nicht erreicht werden. Aufgrund von Sequenzvergleichen mit pflanzlichen Lipoxygenasen wurde jedoch angenommen, dass die erhaltene Sequenzinformation dennoch ausreichen würde, um Primer abzuleiten, mit der die vollständige DNA-Sequenz der PtLOXI aus der zugrundeliegenden Phagen-Bank amplifiziert und kloniert werden kann. Da dies jedoch nicht gelang, wurde die vollständige Sequenz aus zwei überlappenden Fragmenten zusammengesetzt. Als Voraussetzung für die Entwicklung der Klonierungsstrategie wurde jener cDNA-Klon, der mittels der Zufallssequenzierung identifiziert worden war (Pt001077095r), zunächst vollständig sequenziert.

Beispiel 28: Gewinnung der vollständigen cDNA-Sequenz

Ein Bereich von 1336 bp (Fragment 1), der das 5'-Ende der PtLOX Sequenz darstellt, wurde mittels der Primer A (5'-GGJ_ACC ATG ATG CTC AAC CGG TTG AC) und B (5'-AAA TTC CCG AGC AAA CTC GT) aus der cDNA-Bank von P. tricornutum amplifiziert (vergl. Figur 4). Mit Primer A, der das Startcodon ATG enthält, wurde Restriktionsschnittstelle für Kpnl eingeführt. Das zweite Fragment des Gens lag im Vektor pBK-CMV in Form des Klones vor, mit dem die beiden EST's erhalten wurden. Im überlappenden Bereich von 787 bp der beiden Fragmente befindet sich die in der Sequenz unikal schneidende Restriktionsschnittstelle für Sal I. Um die Restriktionsschnittstelle für Hind III am 3'-Ende des zweiten Fragments mit dem Primer C ein- zuführen, wurde dieses Fragment mit dem Primer M13-rev (5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G) und dem Primer C (5'-CCC AAG CTT CTA TAT GGT GAT GCT GTT GGG CAC) mittels PCR amplifiziert. Beide Fragmente wurden zunächst in den Vektor pGEM-T kloniert und anschließend über unikale sowie mittels PCT eingeführte Restriktionsschnittstellen in pQE30 zur vollständigen Gensequenz zusammengesetzt. Über die Restriktionsschnittstellen für Sal I und Hind III wurde das Fragment 2 mit dem Expressionsvektor pQE30 ligiert. Nach dem entsprechenden Restriktionsverdau wurde dieses Konstrukt unter Benutzung der Restriktionsschnittstellen für Kpn I sowie Sal I mit Fragment ! ligiert. Um das Risiko der Einführung einer Mutation möglichst gering zu halten, waren jeweils zwei bzw. drei Bakterienkolonien für die Klonierungs- experimente verwendet worden, die das Fragment 1 bzw. 2 enthielten. Nachdem alle getesteten der Klone aktiv waren (Beispiel 30), wurde der Klon mit der Nummer ([52-1]+43)-1-1 als PtLOXI bezeichnet und alle weiteren Tests mit diesem Klon durchgeführt.

Beispiel 29: Sequenzanalyse der PtLOXI

Die vollständige cDNA-Klon wurde dann sequenziert, wobei sich die bekannte Sequenz (Übersicht in Figur 4) bestätigte. Mithilfe des BLASτX2-Algorithmus wurde für die vollständige PtLOXI -Sequenz mit 43 % die höchste Homologie zur AtLOX3 gefunden, einer 13-LOX vom Typ 2, aus Arabidopsis thaliana. Dieses Ergebnis wurde durch den im Rahmen dieser Arbeit erstellten phylogenetischen Stammbau bestätigt. Der ORF von PtLOXI besteht aus 938 Aminosäuren und hat ein berechnetes Molekulargewicht von 105 kDa. Dabei wurden mögliche Glykosilierungen im Herkunftsorganismus P. tricornutum nicht berücksichtigt. Der berechnete isoelektrische Punkt liegt bei pH 6,69. Ungewöhnlich ist der Anfang der Proteinsequenz mit zwei Methioni- nen. Das erste Methionin wird als Start-Codon der Translation angesehen und wurde für die Klonierung verwendet. Die cDNA ist in 5'-Richtung 66 bp länger als der für die Klonierung verwendete Sequenzbereich. Da sich kein Start-Methionin in dieser Region befindet, wurde sie als untranslatierter Bereich am 5'-Ende angesehen. Mit der voll- ständigen Sequenz von PtLOXI wurde eine Analyse mit dem Programm PSORT auf HUSAR bezüglich möglicher Signalsequenzen durchgeführt. Da diese Datenbank keine chloroplastidären Signalsequenzen berücksichtigt, wurde nur eine 50 %ige Wahrscheinlichkeit für eine plastidäre Lokalisation gefunden. Der Sequenzvergleich der PtLOXI mit anderen bekannten Lipoxygenase-Sequenzen hatte jedoch ergeben, dass die PtLOXI zur Gruppe der 13-Lipoxygenasen vom Typ 2 gehört, für die eine chloroplastidäre Signalsequenz charakteristisch ist. Anhand des phylogenetischen Stammbaum wird jedoch ersichtlich, dass dies Zuordnung mit einem hohen Unsicher- heitsfaktor belastet ist, da PtLOXI dort ungefähr die gleiche Entfernung zu 13- und 9-Sipoxygenasen vom Typ 2 aufweist. Zudem sind einige Lipoxygenasen in diese Stammbaum falsch eingeordnet, da es sich z.B. bei LOX1 :Cs:1 , LOX1 :Cs:3 und

LOX1 :Hv:3 und 13-üpoxygenasen handelt und nicht um 9-Lipoxygenasen. Trotzdem kann für die RLOX1 eine plastidäre Lokalisation diskutiert werden. Aufgrund geringerer Sicherheitsmodi wurde eine Analyse mit anderen Datenbanken nicht durchgeführt.

Im Vergleich mit anderen pflanzlichen Lipoxygenasen zeigt PtLOXI einige interessante Unterschiede auf der Ebene der Proteinsequenz. So sind im aktiven Zentrum von Lipoxygenasen drei Determinanten bestimmt worden, die Einfluss auf die Substrat- und Positionsspezifität haben, wobei. die BORNGRÄBER- und SLOANE-Determinante hervorzuheben sind (zusammengefasst in [Feussner et al., Enzymes in Lipid Modification, p. 309-336, Wiley,-VCH, Einheim, 2000]). So wurde am Boden der Bindungstasche bei allen pflanzlichen Lipoxygenasen ein höchst konserviertes Arginin identifiziert, das bei der Umwandlung der Lipidkörper 12-Lipoxygenasen aus Gurke in eine 9-Lipoxygenase eine kritische Rolle spielt (R758 der CsIbLOX [Hornung et al., Proc NatI Acad Sei USA, 96(7):4192-4197, 1999]. Dieses Arginin tritt unabhängig von der Substrat- und Positionsspezifität auf und ihm geht in über 90 % der Fälle ein Aparagin voran. Als einzige Ausnahme decken sich in PtLOXI zwei Histidin mit diesem Asparagin-Arginin- Tandem. Konserviert ist hingegen die Aminosäure, die sich im Sequenzvergleich mit der SLOANE-Determinante [Sloane et al., Nature, 354:149-152, 1991] deckt. An dieser Stelle befindet sich in 9-Lipoxygenasen eine kleine Aminosäure wie Valin und in 13-üpoxygenasen eine große wie Phenylalanin. Eine Ausnahme bilden die oben erwähnten LOX1:Cs:1 und LOX1:Cs:3 (H statt F) sowie LOX1:Hv:3 (V statt F). Diese Diskrepanz mag ihre Ursache darin haben, dass in diesem Fällen kein „klassischen" 13-Lipoxygenasen vorliegen [Feussner et al., Annu. Rev, Plant. Biol., 53:275-297, 2002]. In PtLOXI liegt jedoch die voluminöse Aminosäure Phenylalanin vor, wie für eine 13-Lipoxygenase erwartet. An der Position im Sequenzvergleich, die sich mit der BoRNGRÄBER-Determinante deckt, ist es schwieriger, konservierte Unterschiede zwischen 13- und 9-Lipoxygenasen zu finden. Meist findet man eine Kombination aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, die von der kleinen Aminosäure Glycin oder der hydrophoben Aminosäure Cystein getrennt werden (z.B. S515,G516,V517 in LOX1 :Nt:1 ). Bezüglich der Kombination von hydrophober-/hydrophiler Aminosäure finden sich konservierte Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. PtLOXI unterscheidet sich dahingehend von allen anderen Lipoxygenasen, dass bei ihr zwei hydrophobe Aminosäuren von der hydrophilen Aminosäure Threonin getrennt werden. Der C-Terminus ist wie bei allen anderen Lipoxygenasen hoch konserviert, mit dem kleinen Unterschied, dass sich an vorletzter Position Threonin anstatt Sein befindet, wie bei allen anderen Lipoxygenasen.

Beispiel 30: Biochemische Charakterisierung der PtLOXI

Zunächst wurde überprüft, ob das rekombinante Enzym aktiv war. Da Linolsäure ein generelles Substrat für Lipoxygenasen darstellt [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002], wurde die Aktivität des Enzyms zunächst gegenüber dieser Fettsäure bestimmt. Aufgrund der hohen Eigenabsorption des Rohextraktes nach dem Aufschluss der E. coli-Zellen, erfolgte diese Bestimmung nicht Spektophotometer. Die Produkte der Fettsäureumsetzung wurden mittels Normal-Phasen-HPLC analysiert. Es zeigte sich, dass alle getesteten Klone aktiv waren, da bei der Umsetzung mit Linolsäure 13-HODE in S-Konf iguration entstand. Bei der Zusammensetzung des 5'- und 3'-Bereichs der Sequenz im Zuge der Klonierung wurden sechs verschiedene Kombinationen erhalten (Beispiel 28). Von jeder Kombination wurden zwei Klone getestet.

Im Anschluss wurde der pH-Wert bestimmt, bei dem das Enzym die maximale Aktivität zeigt. Dabei wurde auch der Frage nachgegangen, ob sich die Produkt- und Regiospezifität des Enzyms in diesem pH-Bereich ändert. Außerdem wurde untersucht, welche anderen Fettsäuren als Substrate von der PtLOXI akzeptiert werden. Dabei wurden zum einen die Struktur der entstandenen Hydroxyfettsäuren genauer analysiert und zum anderen auch das bevorzugte Substrat dieses Enzyms ermittelt. Beispiel 31 : pH-Optimum

Das pH-Optimum wurde mittels einer Endpunktbestimmung mit Hilfe der Normal- Phasen-HPLC für die Umsetzung von Linolsäure ermittelt. Für die Analysen wurden Zellaufschlüsse (Beispiel 11 ) der Proteinexpression bei 10°C verwendet. Die Lysate wurden sofort nach ihrer Herstellung weiter verwendet, um die Stabilität der Proteine durch Einfrieren und Auftauen der Proben nicht herabzusetzen. Die Zellaufschlüsse wurden mit Linolsure inkubiert und die entstandenen Hydroperoxid-Derivate mit Natriumborhydrid zu den entsprechenden Hydroxiden reduziert, die nach der sauren Extraktion mittels Normal-Phasen-HPLC (SP-HPLC) analysiert wurden. Ausgewertet wurden die Flächen der integrierten HODE-Signale bei 234 nm und er Linolsäure bei 202 nm. Aus Figur 6 ist ersichtlich, dass die maximale Aktivität der PtLOXI für Linolsäure bei pH-Werten zwischen pH 8,0 und pH 8,4 erreicht wird.

Linolsäure wurde im Substrat-Überschuss für 30 min mit Enzymextrakt und die entstandenen Hydroperoxide zu den Hydroxiden reduziert. Nach saurer Extraktion wurde das Substrat-Produktspektrum mittels SP-HPLC analysiert. Die Summe der Fläche aller integrierter HODE-Signale bei 234 nm wurde ins Verhältnis zur Fläche des integrierten Linolsäure-Signals bei 202 nm gesetzt. Die Darstellung in Figur 6 zeigt den Durchschnitt und den Standardfehler für zwei Experimente.

Beispiel 32: Analyse der Regiospezifität gegenüber Linolsäure

Ein charakteristisches Merkmal von Lipoxygenasen ist ihre Regiospezifität bei der Ein- führung von molekularem Sauerstoff [Feussner et al., Enzymes in Lipid Modification, p. 309-336, Wiley-VCH, Weinheim, 2000]. Da Linolsäsure sowohl im Tierreich als auch im Pflanzenreich ein Substrat für Lipoxygenasen darstellt und im Gegensatz dazu Arachidonsäure im Pflanzenreich nicht oder nur in Speicherlipiden auftritt, werden pflanzliche Lipoxygenasen in Bezug auf die Positionsspezifität der Oxygenierung von Linolsäure klassifiziert [H.W. Gardner, Biochim Biophys Acta, 1084:221-239, 1991]. Sauerstoff kann entweder am Kohlenstoffatom 9 (9-Lipoxygenase) oder 13 (13-Lipoxy- genase) der Linolsäure eingeführt werden.

Die Trennung der gebildeten Regioisomere erfolgte wiederum mittels SP-HPLC nach der Reduktion der Hydroperoxide zu den entsprechenden Hydroxiden [Kühn et al., Anal Biochem, 160:24-34, 1987]. Dabei wurden Standards der jeweiligen Hydroxid- Derivate vor oder nach den Messungen der Zellaufschluss-Extrakte und die Reten- tionszeiten der Signale miteinander verglichen. Das Verhältnis von 9- zu 13-HODE wurde durch Integration der jeweiligen Signale bei 234 nm ermittelt. In Figur 7 wurde für jeden pH-Wert das Verhältnis von Gesamtprodukt zu Substrat gebildet und außerdem der jeweilige Anteil von 13- und 9-HODE am Gesamtprodukt dargestellt.

Linolsäure wurde im Substrat-Überschuss für 30 min mit Enzym rohextrakt inkubiert und die entstandenen Hydroperoxide zu den Hydroxiden reduziert. Nach saurer Extraktion wurde das Substrat-Produktspektrum mittels SP-HPLC analysiert. Die integrierten Signale von 9-HODE und 13-HODE bei 234 nm wurde ins Verhältnis zum integrierten Linolsäure-Signal bei 20 nm gesetzt. Die Darstellung in Figur 7 zeigt den Durchschnitt und den Standardfehler für zwei Experimente.

Das Verhältnis von 13- zu 9-HODE ist außerdem in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Vorhersage aus dem Sequenzvergleich (Beispiel 29), dass es sich bei PtLOXI um eine 13-Lipoxygenase handelt, wurde somit durch biochemische Daten bestätigt.

Durch die Analyse der Enantiomeren-Zusammensetzung mittels Chiral-Phasen-HPLC (CP-HPLC) kann zwischen den Produkten der enzymatischen Lipidperoxidation und der nicht-enzymatischen Autoxidation unterschieden werden. Die Umsetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch pflanzliche Lipoxygenasen führt zur Bildung der Hydroxid-Derivate in S-Konfiguration, wohingegen bei der Autoxidation die Enantiomere in einem racemischen Verhältnis entstehen [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002]. Wie Figur 7 zeigt, liegen über das gesamte untersuchte pH-Spektrum mehr als 90 % des gemessenen 13-HODE in S-Konfiguration vor, wohingegen das Verhältnis der 9-HODE-Enantiomere racemisch ist. Da die Menge des bei den verschiedenen pH-Werten gebildeten 9-HODE mit der Enzymakativität korreliert, ist die Bildung dieses Hydroxid-Derivates möglicherweise nicht autoxidativen Vorgängen geschuldet, sondern resultiert aus einer enzymatischen Aktivität (s. Figur 7 und Tabelle 3). Die Nebenprodukte bei der Umsetzung von Linolsäure durch Lipoxygenasen unter aeroben Bedingungen sind die Ketooctadecadiensäuren (KODEs), welche ein Absorptionsmaximum bei 273 nm besitzen. Bei der Linolsäure-Umsetzung durch PtLOXI wurden keine KODE gebildet durch PtLOXI .

Tabelle 3: Regiospezifität von PtLOXI gegenüber Linolsäure. Das R/S-Verhältnis von 13-HODE betrug über den gesamten pH-Bereich 7 %/93 %, wohingegen 9-HODE racemisch war. Diese Daten sind Bestandteil der Figur 7.

Beispiel 33: Substratspezifität von PtLOXI und Analyse der gebildeten Regioisomere

Um aufzuklären, welche vielfach ungesättigten Fettsäuren von PtLOXI als Substrate akzeptiert werden und welche Regioisomere dabei bevorzugt entstehen, wurden sieben verschiedene Fettsäuren eingesetzt: Linolsäure (LA), α-Linolensäure (α-LEA), Y-Linolensäure (γ-LEA), Arachidonsäure (ÄRA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosa- pentaensäure (DPA) und Docosahexaensäure (DHA). Diese Fettsäuren unterscheiden sich in ihrer Länge sowie in der Anzahl und Position der Doppelbindungen (s. Tabelle 4). Mit Ausnahme von LA kommen in diesen Fettsäuren für die initiale Wasserstoff-Abstraktion durch das nicht-Haem Eisen im reaktiven Zentrum der Lipoxygenasen mehrere bisallylische Methylengruppen in Frage. Durch die [2+]- und [-2]-Radikalumlagerung an jeder bisallylischen Methylengruppe kann die Sauerstoffanlagerung daher zur Bildung von je vier Hydroperoxid-Derivaten aus α-LEA (9-,13-,12-,16-α-HPOTE) und γ-LEA (6-,10-,9-,13-γ-HPOTE), sechs aus ARA (5-,9-,8-,12-,11-,15-HPETE), acht aus EPA (5-,9-,8-,12-,11-,15-,14-,18- HEPE), acht aus DPA (7-,11-,10-,14-,13-,17-,16-,20-HPDPE) und zehn aus DHA (4-,8-,7-,11-,10-,14-,13-,17-,16-,20-HPDHE) führen.

Um einen ersten Hinweis zu erhalten, welche der vielfach ungesättigten Fettssäuren PtLOXI als bevorzugte Substrate dienen, wurde in Figur 8 für jedes Substrat die Summe der integrierten Signale aller Hydroxid-Derivate, die nach der Reduktion der entsprechenden Hydroperoxide entstanden, aufgetragen.

Das Enzym wurde mit verschiedenen Substraten bei pH 8,4 inkubiert und die Produktanalyse mittels SP-HPLC durchgeführt. Für den Umsatz jeder Fettsäure wurde die Summe der integrierten Signale aller Hydroxid-Derivate aufgetragen. Die unterschied- liehen Extinktionskoeffizienten der Hydroxide wurden bei der Integration nicht berücksichtigt. Die Darstellung zeigt in Figur 8 den Durchschnitt und den Standardfehler von zwei Experimenten.

Dabei wurden die unterschiedlichen Extinktionskoeffizienten der Hydroxid-Derivate (bei 234 nm) nicht berücksichtigt, da sie nicht für alle der gebildeten Hydroxide bekannt sind. Der Vergleich des molaren Extinktionskoeffizienten von HOTE (ε = 27000 l/mol x cm 234 nm) mit dem von HETE (ε = 27000 l/mol x cm 236 nm) lässt darauf schließen, dass dieser Wert mit steigender Anzahl an Doppelbindungen zunimmt. Aus diesem Grunde ist die bevorzugte Umsetzung von ÄRA gegenüber γ-LEA nicht ganz so ausgeprägt wie im Diagramm dargestellt. Nichtsdestoweniger kann man aus diesem Diagramm schließen, dass die C₂₀-Fettsäuren Arachidonsäure und Eicosapentaensäure bevorzugt umgesetzt werden im Vergleich zu Cι₈- und C₂₂-Fettsäuren. Die Identifizierung der Regioisomere der gebildeten Hydroxide dieser Fettsäuren erfolgte entweder über Standards, die bei den jeweiligen HPLC-Analysen eingesetzt wurden oder mittels GC/MS-Analysen (Beispiel 18 und Beispiel 34). Es stellte sich heraus (Tabelle 4), dass von den in Frage kommenden bisallylischen Methylengruppen für jedes Substrat hauptsächlich nur eine für die initiale Entfernung von Wasserstoff benutzt wurde. Dies betraf die Methylengruppe an Position (n-8) in Fall von LA und α- LEA und jeweils (n-11) für γ-LEA, ÄRA, EPA, DPA und DHA. Unter der Voraussetzung, dass bei 13-Lipoxygenasen das Substrat mit dem Methylende voran in die Bindungstasche eintaucht [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002], kann man abschätzen, dass der Abstand des Wasserstoffakzeptors und dem Boden der Bindungstasche rund elf Methylengruppen beträgt. Ein Überblick über alle Umsetzungen, auf die nun näher eingegangen wird, liefert Tabelle 4.

Tabelle 4: Überblick über die Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOXI

^a' Struktur wurde nicht durch GC/MS verifiziert

Wie schon in Beispiel 32 behandelt, führt die Umsetzung von Linolsäure zu 90 % zur Bildung von 13-HODE in S-Konfiguration. Das Chromatogram der SP-HPLC-Analyse ist in Figur 9 dargestellt. Die Kontroll-Umsetzung wurde durchgeführt mit dem Zell- aufschluss von SG 13009 Zellen, die den Leervektor trugen. Wie schon in Beispiel 32 erläutert, zeigt das Chromatogram dieser Umsetzung (Figur 9, unterer Teil), dass 9-HODE enzymatisch gebildet wurde und nicht durch Autoxidation entsteht. Auch für die anderen Fettsäuren wurden jeweils gleiche Mengen des Umsatzes der Fettsäure mit rekombinanter PtLOXI und der Kontroll-Umsetzung analysiert.

Für α-LEA als Substrat beträgt der Anteil der beiden möglichen Oxidationsprodukte in [+2]- und [-2]-Position bezüglich des Kohlenstoffs (n-8) an den gesamt gebildeten Hydro(pero)xid-Derivaten (Figur 10) 92 % und ist damit mit dem Umsatz von LA vergleichbar. Das Verhältnis der [+2]- zu [-2]-Oxidationsprodukte sinkt von 6,7 für 13-/9-HODE auf 2,7 für 13-/9-α-HOTE. Der Faktor 6,7/2,7 « 2,5 der damit berechnet werden kann, wurde bei der Änderung der Anzahl der Doppelbindungen oder der Anzahl der Methylengruppen noch häufiger beobachtet. Die denkbaren Hydroxy- lierungsprodukte von α-LEA 12- und 16-α-HOTE, die bei initialer Wasserstoffent- fernung an C₁ (n-5) entstehen können, haben einen vernachlässigbar kleinen Anteil an den Hydro(pero)xy-Derivaten von α-LEA.

Bei γ-LEA in Figur 11 wurde die bisallylische Methylengruppe in Position (n-11) bevorzugt durch den Wasserstoffakzeptor angegriffen, was zur Bildung von 10- und 6-γ-HOTE führt. Die Methylengruppe an Position (n-8), bei der die Hydro(pero)xid- Derivate 13- und 9-α-HOTE entstehen, spielen mit einem Gesamtanteil von rund 17 % an den gesamten Hydro(pero)xid-Derivaten eher eine untergeordnete Rolle. Aber auch hier ist das Verhältnis zugunsten des [+2]-Hydro(pero)xid-Derivates. Das Verhältnis der Hauptprodukte 10- zu 6-γ-HOTE ist vergleichbar mit dem von 13- zu 9-α-HOTE von α-LEA. Für LA, α-LEA und γ-LEA ist das jeweilige [-2]-Hydro(pero)xid-Derivat racemisch.

Bei Arachidonsäure (Figur 12) erfolgt die Hydro(pero)xydierung an Position [+2] und in geringem Maße an Position [-2] bezüglich der bisallylischen Methylengruppe an Position (n-11). Das Verhältnis der Hydro(pero)xylierung an Position [+2] zu [-2] ist deutlich in Richtung [+2] verschoben im Vergleich zu α- oder γ-LEA. Hier wird beobachtet, was schon erwähnt wurde und auch später wieder beobachtet wurde: Beim Vergleich zweier Fettsäuren bezüglich der Methylengruppe, von der Wasserstoff abstrahiert wurde, führte die Einführung einer Doppelbindung in ,,[-X]"- Position, also am Carboxyende, zu einer Verschiebung der Hydro(pero)xylierung zugunsten des [+2]-Produktes, ebenso wie die Einführung zweier Methylengruppen in ,,[+X]"-Position (am Methylende). Umgekehrt kommt es zu einer Verschiebung zugunsten des [-2]- Produktes, wenn eine Doppelbindung ,,[+X]"-Position eingeführt wurde (wie schon bei Y- und α-LEA beobachtet), oder zwei Methylengruppen in ,,[-X]"-Position (dem Carboxylende) hinzukamen, Bezüglich des [+2] zu [-2] Verhältnisses wurde im ersten Fall eine Erhöhung um Faktor 2 bis 4 beobachtet und im zweiten Fall eine Erniedrigung um Faktor 2 bis 4. Diese Beobachtung ist rein empirisch und muss diskutiert werden. Es sollte hervorgehoben werden, dass hierbei lediglich Charakteristika bezüglich der Position der betreffenden bisallylischen Methylengruppe beschrieben werden, die in keiner Weise die biochemische Einführung von Methylengruppen oder Doppelbindungen reflektieren. Im Vergleich zu α- und γ-LEA ist Arachidonsäure bezüglich der benutzten bisallylischen Methylengruppen in ,,[+X]"-Position zwei Methylengruppen länger (x4) und in ,,[-X]"-Position kommt eine Doppelbindung hinzu (x4). Daraus resultiert eine Erhöhung des Verhältnisses der [+2]- zu [-2]-Hydro(pero)xid- Derivate 12-HETE zu 8-HETE von 4 x 4 = 16 im Vergleich zu den entsprechenden Produkten bei γ-LEA; 2,8 x 16 = 44,8. Das gemessene Verhältnis von 12-HETE zu 8-HETE beträgt 46,3 (97 %). Das Hauptprodukt 12-HETE lag unerwarteterweise nur zu 79 % in S-Konfiguration vor, obwohl die vergleichende Analyse in Figur 8 dafür spricht, dass ÄRA oder EPA die bevorzugten Substrate darstellen. Das Nebenpropdukt 8-HETE lag in S-Konfiguration vor.

Gemäß obiger Erläuterungen erniedrigt die Einführung einer Doppelbindung am Methylende bei EPA im Vergleich zu ÄRA das Verhältnis von [+2] zu [-2] der gebildeten Hydroxid-Derivate bezüglich der bisallylischen Methylengruppe. Als einzige Ausnahme in der Reihe lässt sich das Ausmaß der Erniedrigung um Faktor sechzehn hier nicht erklären, da die eben erwähnte Doppelbindung in allen anderen Fällen zu einer Veränderung um Faktor 2 bis 4 führte (LA / α-LEA, γ-LEA / ÄRA, DPA / DHA). Das Verhältnis von 12- zu 8-HEPE beträgt hier also 46,3 / (4 x 4) = 2,9 * 3,01 (75,1 % : 24,9 %). Beide Hydroxid- Derivate liegen nahezu 100 % in S-Konfiguration vor.

Die Verlängerung um zwei Methylengruppen auf der Carboxyseite bezüglich der bisallylischen Methylengruppe (n-9) von DPA (Figur 14) erniedrigt erwartungsgemäß das Verhältnis der Oxidationsprodukte an Position [+2] zu [-2] im Vergleich zu EPA. Auch ist der Faktor mit 3 im Rahmen dessen, was mit obiger Ausnahme immer beobachtet wurde. 14- zu 10-HDPE wurde im Verhältnis 3 / (3) = 1 (51 % : 49 %) gebildet. Wie schon bei Arachidonsäure ist der Anteil der S-Konfiguration am Hauptprodukt (hier 14-HDPE) mit 68 % erstaunlich niedrig.

Auch im Vergleich der Umsetzung von DHA (Figur 15) mit der von DPA passt sich gut in das Bild ein: Die zusätzliche Doppelbindung auf der Carboxyseite der (n-9) Methylengruppe begünstigt die Bildung des [+2]-Produktes, mithin von 14-HDHE. Im Vergleich zum (51 % : 49 %) Verhältnis von 14- zu 10-HDPE ist das Verhältnis von 14- zu 10-HDHE um den Faktor 2,9 erhöht und beträgt somit 2,9 = 74,3 % : 25,7 %. Für das Hauptpodukt 14-HDHE wurde bei der CP-Analyse eine Aufspaltung des Signals des S-Positionsisomers festgestellt. Ein dazu nahezu identisches Chromatogram wurde auch bei einer von vier Chiral-Phasen-Analysen von 12-HEPE beobachtet, daher wurde das R- zu S- Verhältnis von von 14-HDHE in Tabelle 4 auf Grundlage der Signale R und Si in Figur 15 berechnet. Gegebenenfalls müsste diese Analyse noch einmal durchgeführt werden.

Bei Arachidonsäure wurden die oben erwähnten (Beispiel 32) Nebenprodukte bei aeroben Verhältnissen, namentlich die Keto-Säuren, in äußerst geringem Ausmaß von 1 ,2 % bei 273 nm detektiert. Außerdem traten sie bei der Umsetzung von DPA und DHA mit jeweils rund 7,0 % auf. Beispiel 34: GC/MS-Analyse der Fettsäure-Hydroxide

Die Produkte der Umsetzung von PtLOXI mit La, α-LEA und γ-LEA konnten mit Standards eindeutig durch die Normal-Phasen HPLC identifiziert werden. Von den möglichen Hydroxiden ist 10-γ-HOTE nicht als Standard verfügbar gewesen. Auch der Vergleich mit den Autoxidationsprodukten der γ-LEA führte nicht zu einer sicheren Identifizierung. Daher wurden für die Identifizierung der restlichen Hydroxide der eingesetzten Fettsäuren in Zusammenarbeit mit Frau Dr. C. Göbel (IPK, Gaterieben) GC/MS-Analysen durchgeführt. Hierfür wurden die Hydroxide der Fettsäuren in ihre kombinierten Methylester- und Trimethylsilylether-Derivate überführt, um ihre Flüchtigkeit sowie thermische Stabilität zu erhöhen und um die Polarität zu senken [W.W. Christie, Lipids, 33(4):343-53, 1998]. Dadurch wird die gaschromatographische Trennung erhöht und die Detektierbarkeit verbessert. Die derivatisierten Fettsäuren hatten bei den Analysen eine Retentionszeit zwischen 16 min und 20 min. In diesem Bereich des Chromatograms wurden die im folgenden dargestellten Massenspektren aufgenommen. Meist wurde ein charakteristisches Fragment des Zerfalls der Verbindung im Massenspektrum detektiert, wobei zusätzlich Signale das Molgewicht der unfragmentierten Verbindung, das M-15-Signal (ohne Mehtylgruppe) und das M-31 Signal (ohne Methoxygruppe) detektiert wurden. Die möglichen Zerfallsprodukte sind mit ihren Molgewichten in dem jeweiligen Diagramm dargestellt. Der charakteristische Zerfall erlaubt die Identifizierung der Verbindung und die Bestimmung der Position der Hydroxygruppe [Woollard et al., J Chromatogr, 306:1-21 , 1984].

Wie in Figur 16 ersichtlich, wurde anhand der charakteristischen Massen (im Diagram dargestellt) somit bestätigt, dass es sich bei der fraglichen Verbindung des γ-LEA- Umsatzes um 10-γ-HOTE handelte. Auch 8-HETE, für das nach der HPLC-Analyse keine eindeutige Aussage getroffen werden konnte, wurde auf diese Weise verifiziert (Figur 17).

Mit Ausnahme von dem mutmaßlichen 10-HDHE konnten alle Hydroxide der Fettsäuren EPA, DPA, DHA bestimmt werden. Figur 18 und Figur 19 zeigen die Massenspektren der identifizierten Produkte der Umsetzung von PtLOXI mit EPA, 12-HEPE bzw. 8-HEPE. Die Hydroxide von DPA erwiesen sich als 14-HDPE (Figur 20) und 10-HDPE (Figur 21). Da mit zunehmender Kettenlänge der zu analysierenden Ver- bindung das Zerfallsmuster unspezifischer wird, fällt die Identifizierung in diesem Maße immer schwerer. So konnte 14-HDHE (Figur 22) noch identifiziert werden, aufgrund verschiedener Limitierungen, die schon bei 8-HETE, 8HEPE und 10-HDPE auftraten, gelang die Analyse von 10-HDHE nicht. Aufgrund mechanistischer Überlegungen sowie der Tatsache, dass sich die Produkte von ÄRA und EPA gleichen (12-/8-HETE, 12-/8-HEPE) und auch 14-HDPE sein Equivalent in Form von 14-HDHE hat, ist davon auszugehen, dass es sich tatsächlich um 10-HDHE handelt.

Beispiel 35: Reinigung des Enzyms

Für eine detaillierte kinetische Untersuchung der PtLOXI sollte das rekombinante Enzym zunächst aufgereinigt werden. Dazu wurde PtLOXI im Vektor pQE30 mit einem N-terminalen hexa-Histidin-Tag exprimiert und anschließend eine Affinitätsreinigung mit TALON® durchgeführt. Diese Reinigung basiert auf der Komplexierung des am TALON® fixierten Cobalts durch Histidin. Die Elution des Proteins erfolgt über kompetiti- ve Verdrängung des Histidins durch Imidazol oder einem Chelator zweiwertiger Metallionen (z.B. EDTA). Alternativ kann durch Senkung des pH-Wertes eluiert werden, da protoniertes Histidin vom zweiwertigen Metall abgestoßen wird.

Beispiel 36: SDS-PAGE und Western-Blot Analyse der Reinigung

Zunächst wurde das Protein in E. coli nach IPTG-Zugabe rund 60 h bei 10°C produziert. Dann wurden verschiedene Methoden zur Elution des affinitätsgebundenen Proteins verwendet: Elution mit EDTA bzw. Imidazol sowie durch Senkung des pH- Wertes. In Figur 23a ist die SDS-PAGE zur Untersuchung der optimalen Elutions- bedingungen mit Imidazol dargestellt.

A mit Silber gefärbtes SDS-Gel, B mit αCsIbLOX/lgG-ALP gefärbter Western-Blot. Der Pfeil kennzeichnet PtLOXI. 1 Proteinstandard, 2 Kontrolle (Lysat von SG 13009- Zellen, die mit Leervektor pQE30 transformiert wurden), 3 Lysat von SG 13009-Zellen (transformiert mit PtLOXI in pQE30) vor Induktion mit IPTG, 4 Lysat von SG 13009- Zellen (transformiert mit PtLOXI in pQE30) nach Induktion mit IPTG, 5 Durchfluss nach Affinitätsbindung des bakteriellen Proteinextraktes an TALON® , 6 Waschschritt mit Na-Phosphat-Puffer, 7 bis 15 Elution mit Imidazol steigender Konzentration: 10 mM, 30 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM.

Das zu reinigende Protein hat eine berechnete Größe von 105 kDa. In diesem Bereich waren deutlich mehrere Proteinbanden bei der Auftragung des Zellaufschlusses nach der Induktion und in den Fraktionen der Elution mit Imidazol zu erkennen (Figur 23a, Pfeile). Um zu verifizieren, dass es sich bei einer der Banden im Berich von 105 kDa um RLOX1 handelte, wurde die in Figur 23b dargestellte Immunodetektion durchgeführt. Es wurde dafür ein monospezifischer Antikörper verwendet, der gegen die Lipidkörper-Lypoxygenase der Gurke (CsIb-LOC) gerichtet war [Hause et al., Planta, 210:708-714, 2000]. Dieser Antikörper weist die meisten anderen pflanzlichen Lipoxy- genasen aufgrund seiner hohen Kreuzreaktivität gegenüber anderen Lipoxygenasen auf. Auch im Western-Blot wurde vor allem eine Bande knapp unterhalb von 105 kDa detektiert (Figur 23b, Spur 5, Pfeil). Die Vielzahl der mit der Immunodetektion erhaltenen, vermutlich unspezifischen Signale resultieren möglicherweise aus der Art der Antikörper-Gewinnung. Für das gereinigte rekombinante Protein (CsIb-LOX) wurde dasselbe Expressionssystem verwendet wie für die PtLOXI (Vektor pQE30 in SG 13009 E. coli-Zellen). Aus diesem Grunde zeigt die Antikörperfraktion, die mit der gereinigten rekombinanten Cslb-Lipoxygenase erhalten wurde, auch Reaktivität gegen andere Proteine aus diesem System, die daher in allen Fraktionen, auch der Leervektorreinigung, detektiert wurden.

Das Ergebnis der SDS-PAGE und des Westem-Blots zusammengenommen bedeutete, dass PtLOXI nicht an das TALON® bindet. Eine vergleichende Aktivitätsbestimmung zwischen den einzelnen Proteinfraktionen könnte Klärung verschaffen bei Einsatz von jeweils gleichen Mengen an Protein. Da bei diesem Experiment lediglich genug Protein für ein SDS-Gel und eine Western-Blot-Analyse vorhanden war, konnte dies mit dieser Reinigung nicht weiter verfolgt werden. Daher wurde eine erneute Reinigung im präparativen Maßstab durchgeführt. Es wurde auch mit EDTA und durch das Senken des pH-Wertes eluiert, wobei konsequenterweise dasselbe Ergebnis erhalten wurde, da PtLOXI nicht an das TALON® band.

Beispiel 37: Präparative Reinigung

Für die präparative Reinigung wurde unter modifizierten Bedingungen das rekombinante Protein exprimiert. Nach Induktion der Translation mit IPTG erfolgte eine weitere Inkubation über Nacht bei 28°C und über die Dauer von sieben Tagen bei 10°C. Statt stufenweiser Elution (Beispiel 36) wurde hier nur mit 5 mM Imidazol gewaschen und das an der Säule verbliebene Protein im Anschluss mit 125 mM Imidazol eluiert (s. Beispiel ,19).. Die Reinigung bestätigt, dass nur in den Fraktionen der Reinigung nach Expression von PtLOXI bei 10°C das als PtLOXI identifizierte Protein vorhanden war (Figur 24, Spur 19, 20, Reil). Der Western-Blot der Expression bei 10°C (Figur 25b) bestätigt, dass RLOX1 nicht an das TALON® band, da wieder im Durchfluss sowie in der Na- Phosphat-Waschfraktion eine Bande der richtigen Größe detektiert wurde (Spur 19 und 20, Reil).

SG 13009-Zellen wurden mit PtLOXI transformiert und nach IPTG-Zugabe bei 10°C rund 60 h exprimiert. - A mit Coomasie gefärbtes SDS-Gel, B mit α-CsIbLOX/lgA-ALP gefärbter Western-Blot. Der Pfeil kennzeichnet PtLOXI . 19 Durchfluss nach Affinitätsbindung des bakteriellen Proteinextraktes an TALON®, 20 Waschschritt mit Na- Phosphat-Puffer, 21 Waschschritt mit 5 mM Imidazol, 22 bis 26 Elution mit Imidazol: 125 mM^'1 , 125 mM^"2, 125 mM^"3, 300 mM, 500 mM. Weder bei der Reinigung des Zelllysates nach der Expression des Leervektors, noch bei der Expression von PtLOXI bei 28°C ist in Figur 24 an dieser Stelle eine Proteinbande deutlich erkennbar.

Der Pfeil kennzeichnet PtLOXI. Es wurden SG 13009-Zelien mit folgenden Vektoren transformiert und unter den im Text angegebenen Bedingungen nach IPTG Zugabe exprimiert: 1 bis 8 pQE2028°C, 9 bis 12 und 15 bis 18 PtLOXI (Expression bei 28°C), 19 bis 26 PtLOXI (Expression bei 10°C) 1 ,9,19 Durchfluss nach Affinitätsbindung des bakteriellen Proteinextraktes an TALON®, 2,10,20 Waschschritt mit Na-Phosphat-Puffer,

3.11.21 Waschschritt mit 5 mM Imidazol, 13,14 Proteinstandard; Elution mit Imidazol:

4.12.22 125 mM-1 , 5,15,23 125 mM^"2, 6,16,24 125 mM^"3, 7,17,25300 mM, 8,18,26 500 mM.

Als zusätzliche Bestätigung der Western-Blot-Analysen wurde eine Aktivitätsbestimmung für ausgewählte Fraktionen der Reinigung von rekombinanter PtLOXI, die bei 10°C bzw. bei 28°C exprimiert wurde, mit jeweils gleichen Mengen an Protein durchgeführt (Beispiel 13). Die Auswertung für die Reinigung von rekombinanter PtLOX, die bei 10°C exprimiert wurde, ist in Tabelle 5 dargestellt. Die Enzymaktivität der Expression von PtLOXI bei 28°C war nicht auswertbar. Als Maß für die Aktivität wurde die Summe der Flächen von 13- und 9-HODE herangezogen. Um autoxidative Prozesse abzuschätzen, wurde das Verhältnis von 13- zu 9-HODE zusätzlich angegeben. Es zeigte sich, dass die LOX-Aktivität ausschließlich im Durchfluss und in der Waschfraktion zu messen ist. Es sollte hervorgehoben werden, dass der zum Waschen verwendete Na-Phosphat-Puffer kein Imidazol enthielt. Somit bestätigte sich, dass PtLOXI nicht an TALON® bindet. Der aktive Klon PtLOXI wurde nun im Expressionsvektor pQE30 durchsequenziert, wobei bei der Benutzung der Vektor-spezifischen Primer für die äußeren Enden von PtLOXI (3'- und 5'-Ende) die Sequenzierung bestätigen, dass der Vektor pQE30 tatsächlich die sechs Histidinreste in seiner kodierenden Sequenz enthält.

Tabelle 5: Analyse der Aktivität einzelner Fraktionen der präparativen Reinigung von PtLOXI . Dargestellt sind die Ergebnisse für die Expression rekombinanter PtLOXI bei 10°C nach IPTG-Zugabe. Es wurden jeweils 40 μg Substrat eingesetzt, 2 h inkubiert und gleiche Mengen per Normal-Phasen PHLC analysiert.

Insgesamt belegen die durchgeführten Analysen, dass das erhaltene Enzym weder in ausreichender Reinheit noch in genügenden Mengen, die für die geplanten kinetischen Messungen benötigt werden, gewonnen werden konnte.

Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurde Lipoxygenase aus der Kieselalge P. tricornutum isoliert und rekombinant in E. coli exprimiert. Bisher wurde keine isolierte Sequenz beschrieben, die eine Lipoxygenase aus Kieselalgen kodiert. Die Lipoxygenase weist im Vergleich zu pflanzlichen Lipoxygenasen eine außergewöhnliche Substratspezifität auf.

Die Zuordnung von PtLOXI zur Gruppe der 13-Lipoxygenasen vom Typ 2 ist mit einem hohen Unsicherheitsfaktor belastet, da sie im Stammbaum ungefähr die gleiche Entfernung zu 13- und 9-üpoxygenasen vom Typ 1 aufweist. Bei Lipoxygenasen vom Typ 2 handelt es sich um Lipoxygenasen chloroplastidärer Signalsequenz. PtLOXI weist zu den Vertretern der verschiedenen Gruppen relativ geringe Homologie auf der Basis des Sequenzvergleiches auf.

Der durchschnittliche Wert der Homologie unter Einbeziehung jeweils aller Vertreter der 9- und 13-Lipoxygenasen vom Typ 1 beträgt jeweils 36 %. Bemerkenswert ist, dass PtLOXI auch innerhalb der Gruppe der 13-Lipoxygenasen vom Typ 2 durchschnittlich nur 33 % Homologie aufweist, anstatt der unter den Gruppenmitgliedern sonst üblichen 45 % (s. Tabelle 6). All diese Befunde sprechen dafür, dass die Abspaltung von PtLOXI von der Entwicklung der Lipoxygenasen höherer Pflanzen während der Evolution relativ früh eintrat. Dies ist in Übereinstimmung mit dem evolutionären Abstand zwischen Kieselalgen und höheren Pflanzen, der auch auf anderen Ebenen gefunden wird.

Tabelle 6: Homologie der Lipoxygenasegruppen zueinander. Schnittpunkte der Gruppe mit sich selber entsprechen der Homologie der Lipoxygenasen innerhalb der Gruppe. Grundlage der Berechnung mit GENEDOC bildete der Sequenzvergleich bekannter Sequenzen. Es wurde der Durchschnittswert der Kombination aller Sequenzen gebildet, die für den jeweiligen Vergleich relevant waren (zwischen 130 und 900 Kombinationen). Angaben in Prozent.

Die intrazelluläre Lokalisation wird als Hinweis auf die physiologische Funktion von Lipoxygenasen betrachtet (zusammengefasst in [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002]. Ein gleichzeitiges Auftreten von Lipoxygenasen wurde in

Vakuolen, im Cytoplasma und in Piastiden beobachtet. Es wird angenommen, dass die zeitliche und räumliche Trennung der Aktivität verschiedener Lipoxygenase-Isoformen die Grundlage für das Beschreiten eines der sechs verschiedenen Reaktionswege für Lipoxygenase-Produkte bildet [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002]. Zumindest in zwei Fällen wurde nachgewiesen, dass das Auftreten einer

Lipidkörper-Lipoxygenase bei der Mobilisierung von Speicherlipiden eine Rolle spielt [Feussner et al., Trends Plant Sei, 6:262-267, 2001] und eine chloroplastidäre Lipoxygenase essenziell für die Jasmonsäure-Synthese ist [Creelman et al., Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48:355-381, 1997].

Gemäß dem phylogenetischen Stammbaum gehört PtLOXI scheinbar den Lipoxygenasen vom Typ 2 an, welche durch eine chloroplastidäre Signalsequenz charakterisiert sind. Allerdings ist, wie im vorherigen Abschnitt diskutiert, der evolutionäre Abstand zu allen Gruppen der Lipoxygenasen ungefähr gleich groß. Zudem sind einige Lipoxygenasen in dem Stammbaum falsch eingeordnet, da es sich z.B. bei LOX1 :Cs:3 und LOX1:Hv:3 um 13-Lipoxygenasen handelt und nicht um 9-Lipoxygenasen, wie man dem Stammbaum entnehmen könnte. Da somit nicht eindeutig ist, ob PtLOXI nun tatsächlich eher vom LOX2-Typ ist oder vom LOX1 -Typ, wurde genauer untersucht, ob PtLOXI eine Signalsequenz aufweist. Im Sequenzvergleich mit einer Auswahl pflanzlicher Lipoxygenasen weist PtLOXI , wie alle Lipoxygenasen vom LOX2-Typus, eine N-terminale Verlängerung von rund 50 AS im Vergleich zu Lipoxygenasen vom Typ 1 auf. Dies spricht stark für eine plastidäre Signalsequenz, da aber PtLOXI mutmaßlich evolutionär weit entfernt ist von Lipoxygenasen höherer RIanzen, kann dies auch andere Ursachen haben.

Chloroplastidäre Signalsequenzen, auch Transitpeptide genannt, können sehr unterschiedlich in Bezug auf ihre Aminosäuresequenz sein, aber enthalten gewisse diagnostische Merkmale. Sie haben einen außergewöhnlich hohen Grad an hydroxy- lierten Aminosäuren (Serin, Threonin) und sind zudem immer positiv geladen. Die pro-Proteine weisen eine Schnittstelle für Signal-Peptidase auf, die in Landpflanzen und Chlamydomonas eingeschränkt konserviert ist [Lang et al., J. Biol. Chem., 273(47):30973-30978, 1998]. Aufgrund dieser relativ schlechten Identifizierbarkeit wurden Programme entwickelt, mit denen eine Vorhersage für diese Transitpeptide getroffen werden kann.

Wie schon erwähnt, konnte aufgrund geringer Sicherheitsmodi keine Analyse mit Programmen wie CHLOROP [Emanuelsson et al., Protein Sei, 8(5):978-84, 1999] oder dem moderneren PCLR [Schein et al., Nucleic Acids Res. 29(16):E82, 2001] für PtLOXI durchgeführt werden CHLOROP basiert auf einem neuronalen Netzwerk, das mit Sequenzen von Proteinen trainiert wurde, von denen die Präsenz einer N-terminalen chloroplastidären Signalsequenz bekannt ist. Daher weist es eine schon recht bemerkenswerte Genauigkeit in der Vorhersage auf. Ein Kritikpunkt dieses Programmes ist die Schwierigkeit die Kriterien zu interpretieren, aufgrund derer eine Vorhersage getroffen wird. Aus diesem Grunde wurde eine Methode entwickelt, welche die Vor- hersage ausschließlich aufgrund der Häufigkeit verschiedener Aminosäuretypen in der N-trminalen Region des Proteins trifft [Schein et al., Nucleic Acids Res. 29(16):E82, 2001]. Damit werden Ergebnisse in der Vorhersage erzielt, die CHLOROP in der Genauigkeit der Vorhersage bei weitem übertreffen.

Mit diesen beiden Programmen wurde eine Analyse auf Signalsequenzen für alle Lipoxygenasen durchgeführt. Daraufhin wurde die Sequenz im mutmaßlichen Schnittbereich positiver Kandidaten mit dem bekannten konservierten Schnittbereich von Landpflanzen und mit PtLOXI vergleichen. Erwartungsgemäß wurde nur für 13-Lipoxygensen vom LOX2-Typ eine chloroplastidäre Signalsequenz vorher- gesagt. Wie erwähnt, besitzen Landpflanzen eine konservierte Region im Bereich der Schnittstelle für stromale Peptidasen. Diese Ergebnisse wurden mit PtLOXI verglichen, woraufhin eine mutmaßliche Schnittstelle für stromale Signalpeptidasen gefunden wurde. Tabelle 7 zeigt für einige 13-Lipoxygenasen vom Typ 2 die Vorhersage von PCLR und CHLOROP, den konservierten Schnittbereich von Landpflanzen sowie die mögliche Schnittstelle von PtLOXI . Diese Befunde sprechen recht deutlich für eine plastidäre Lokalisation, was durch immuncytochemische Untersuchungen bestätigt werden müsste. Im Vergleich zu höheren Pflanzen unterscheiden sich Heterokontophyta (Chrysophyta), zu denen auch die Kieselalgen zählen, durch die bemerkenswerte Tatsache, dass die Plastide vier umschließende Membranen besitzen. Es wird angenommen, dass dieses Merkmal die Evolution dieser Organismen durch sekundäre Endosymbiose reflektiert, indem ein photosynthetische Eukaryot (der durch primäre Endosymbiose entstand) durch eine eukaryotische heterotrophe Wirtszelle aufgenommen wurde [Lang et al., J. Biol. Chem., 273(47):30973-30978, 1998]. Als Ergebnis scheinen die inneren zwei Membranen den Hüllmembranen der Plastide höherer Pflanzen zu entsprechen, die nächste Membran ist ein Rest der endosymbiontischen Plasmamembran und die vierte Membran geht fließend in das Endoplasmatische Retikulum (ER) über. Es ist bekannt, dass plastidäre Proteine in Heterokontophyta eine zusätzliche Signalsequenz für den Eintritt in das ER besitzen [Lang et al., J. Biol. Chem., 273(47): 30973-30978, 1998; Bhaya et al., Mol Gen Genet, 229(3):400-4, 1991]. Es ist allerdings nicht bekannt, wie die zweite Membran vom Lumen des ER aus überwunden wird. Schnittstellen für Eurkaryotische Signalpeptid- asen werden gewöhnlich im Bereich an Position 15 bis 18 von Pre-Pro-Proteinen durch die Methode von HEIJNE [G. von Heijne, Nucleic Acids Res, 14(11):4683-90, 1986] vorhergesagt. SIGNALSEQ, was Bestadteil von HUSAR ist, nutzt die Methode und sagt für PtLOXI an Position 14 (ASAJFR) eine Schnittstelle voraus (P_max = 0,4350). Da allerdings auch für LOX2:At:1 eine Schnittstelle in diesem Bereich mit einer ähnlichen Wahrscheinlichkeit vorhergesagt wird, kann dieser Befund nur bedingt die These unterstützen, dass RLOX1 N-terminal bezüglich des Transitpeptides für plastidäre Lokalisation über ein ER-Signalpeptid verfügt.

Tabelle 7: Schnittstellen stromaler Peptidasen in Kieselalgen und höheren Pflanzen, Schnittstellen für den LOX2-Typus pflanzlicher Lipoxygenasen wurden mit CHLOROP und PCLR berechnet.

Auf das Vorhandensein einer Signalsequenz wird bei CHLOROP ab Werten größer als 0,5 und bei PCLR ab 0,42 geschlossen. einfacher Reil, mutmaßliche Schnittposition durch CHLORP berechnet; Doppelpfeil, durch N-terminalβ Sequenzierung bestimmt. c) Aufgrund von Sequenzhomologie bestimmt Fucoxanthin-Chlorophyll a/c bindendes Protein von P. tricornutum [Lang et al., J. Biol. Chem., 273(47):30973-

30978, 1998] eennttsspprreecchheenndd den Referenzen [Lang et al., J. Biol. Chem., 273(47):30973-30978, 1998; Emanuelsson, Protein Sei,

8(5):978-84, 1999]

OOddooiinnttella sinensis (Kieselalge), entsprechend der Referenz [Lang et al., J. Biol. Chem., 273(47):30973-30978,

1998]

Ein weiteres Indiz für plastidäre Lokalisation von PtLOXI ist das pH-Optimum von 8,2 (siehe unten).

pH-Optimum

Das pH-Optima der PtLOXI wurde mittels Normal-Phasen-HPLC durch die Umsetzung von Linolsäure bestimmt. Es wurde die Methode der Endwert-Bestimmung ange- wendet, bei der die Menge des gebildeten Produkts nach einer gewissen Zeit unter differierenden Bedingungen bestimmt wird. Sie ist aus dem Grunde ungeeignet, da in keinem Fall linearer Produktanstieg und Substratabnahme für alle Bedingungen garantiert werden kann, was insbesondere lange Umsatzzeiten und hohe Enzymaktivität betrifft. Aus diesem Grunde repräsentieren die erhaltenen Optimumskurven, bei dem Vergleich der Aktivität unter verschiedenen Bedingungen, in keinem Fall das wahre Verhältnis der Aktivitäten. Nichtsdestoweniger lassen sich bei entsprechender Wahl der Menge des eingesetzten Enzyms und der Umsatzzeit ein guter Hinweis auf die optimalen Bedingungen erhalten. Im Vergleich zu diesem Fehler spielen unter- schiedliche Enzym- oder Substratmengen im Ansatz (durch Pipetierfehler) sowie unterschiedliche lonenstärke des Puffers, Temperatur usw. eher eine untergeordnete Rolle. Andere Verfahren zur pH-Optimumbestimmung wären über die „online" Verfolgung des Sauerstoffverbrauchs bei der Lipoxygenase-Reaktion über eine Sauer- stoffelektrode oder die Messung der Produktbildung durch die Verfolgung der Absorp- tionszunahme bei 234 nm am Spektrophotometer möglich [Axelrod et al., Methods

Enzymol, 71:441-451, 1981]. Über das pH-Optimum der Enzyme lassen sich Aussagen über die Lokalisierung der Enzyme treffen und damit auch Schlussfolgerungen auf die mögliche physiologische Funktionen ziehen. In den einzelnen Kompartimenten der Pflanzenzelle sind, z.T. zeitlich abhängig, verschiedene pH-Werte. So besitzen Vakuolen und Peroxisomen ein saures Milieu. Im Stroma der Chloroplasten steigt tagsüber der pH-Wert von 7,0 auf rund 8, da durch die aktiven Photosysteme in der Thylakoidmembran Protonen aus dem Stroma in die Thylakoiden gepumpt werden. Das pH-Optimum von RLOX von 8,2 ist somit in Übereinstimmung mit der chloro- plastidären Signalsequenz, die für PtLOXI identifiziert wurde. Zudem dient es als Hinweis, dass PtLOXI während der Lichtreaktion aktiv wird. Es gibt auch chloroplastidäre Lipoxygenasen mit einem sauren pH-Optimum (z.B LOX2:Hv:1 (LOX-100) [Kohlmann et al., Eur. J. Biochem., 260:885-895, 1999]. Sinkt der pH-Wert im Stroma auf dieses Niveau durch Stress oder durch Beschädigung der Membranen, so nimmt man an, dass diese Lipoxygenasen aktiv werden und den weiteren Abbau der Zelle induzieren können (Jasmonsäurebildung, Abbau der Membranen usw.). Es wurde beschrieben, dass Produkte des LOX-HPL-Reaktionswegs (Aldehyde) rapide nach mechanischer Beschädigung von Kieselalgen gebildet wurden. Da diese Aldehyde drastisch den Erfolg beim Schlüpfen von Ruderfußkrebsen, den Feinden von Kieselalgen im Phytoplankton, verminderte, spricht dies für eine Wund-induzierte Ver- teidigung. Dass Jasmonsäure durch die Aktivität von PtLOXI den Verteidigungsmechanismus bei P. tricornutum induzieren könnte, ist äußerst unwahrscheinlich, da die zur Synthese notwendige α-Linolensäure mit 0,2 % Anteil am Fettsäureinhalt [Schobert et al., Plant Physiol, 66:215-219, 1980] zu vernachlässigen ist. Sollte PtLOXI eine Rolle spielen bei der Wund-induzierten Freisetzung von Aldehyden, stellt sich somit die Frage der Aktivierung. Jasmonsäure als Aktivator von Stress-induzierten Genen kann, wie eben erläutert, keine Rolle spielen und eine Aktivierung durch den Zusammenbruch des stromalen pH-Gradienten ist aufgrund des pH-Optimums von PtLOXI auch auszuschließen. Somit scheint unwahrscheinlich, dass RLOX1 in diesem Verteidigungsmechanismus involviert ist. In unbeschädigten Zellen wurden nahezu keine Degradationsprodukte oxidierter Fettsäuren festgestellt [Pohnert et al., Nat. Pro. Rep., 19:108-122, 2002].

Reinigung

Für genaue kinetische Untersuchungen ist es notwendig, gereinigtes Enzym einzusetzen. So kann zwar der K_M auch mit ungereinigtem Enzym bestimmt werden, wobei sich aber ein Unsicherheitsfaktor aufgrund der Präsenz anderer Proteine im Ansatz ergibt. Da durch die vergleichbare Analyse der verschiedenen Substrate in Figur 8 ein Hin- weis für eine Bevorzugung für ÄRA und EPA ergeben hat, wäre es von Interesse, den K_M und ^_M für alle Substrate zu bestimmen. Dadurch könnte eine viel präzisere Aussage über die Substratspezifität von PtLOXI getroffen werden. Es wird angenommen, dass die Reinigung über das Histidin-Metallkomplex-System nicht gelang, weil das rekombinante Protein die N-terminale Sequenz von sechs Histidin nicht aufweist. Als möglich Ursache könnte in Frage kommen, dass die Translation des Proteins nicht an der im Expressionsvektor dafür vorgesehenen Stelle begann, sondern erst am Start-Methionin der RLOX1 -Sequenz.

Substratspezifität

Pflanzliche Lipoxygenasen werden aufgrund ihrer Positionsspezifität gegenüber Linolsäure in 9- und 13-Lipoxygenasen eingeteilt, da Linolsäure ein ubiquitär verbreitetes Substrat bei RIanzen darstellt. Wichtig für die Bildung der unterschiedlichen Produkte sind die Aminosäuren im aktiven Zentrum des Enzyms [Feussner et al., Enzymes in Lipid Modification, p. 309-336, Wiley-VCH, Weinheim, 2000]. Es wurden zwei Hypothesen entwickelt, welche die Positionsspezifität von Lipoxygenasen zu erklären versuchen (zusammengefasst in [Feussner et al., Enzymes in Lipid Modification, p. 309-336, Wiley-VCH, Weinheim, 2000]. Die eine Hypothese geht davon aus, dass der verfügbare Raum über die Position der Sauerstoffeinführung ent- scheidet. So gleitet die ungesättigte Fettsäure mit dem Methylende voran soweit wie möglich in die Substratbindungstasche ein. Die bisallylische Methylgruppe, die dann in größter Nähe zum Wasserstoffakzeptor ist, wird in der Folge angegriffen, wonach eine [+2]- oder [-2]-Umlagerung des entstehenden Pentadienylradikals stattfinden kann. Es ist allerdings schwierig, mit diesem Modell genau diese Umlagerung zu erklären, weswegen eine zweite Hypothese entwickelt wurde. Dabei ist die Orientierung des Substrates in der Substratbindungstasche darüber entscheidend, ob Sauerstoff an der [+2]- oder [-2]-Position eingeführt wird. Soll bei 13-Lipoxygenasen das Substrat, wie auch bei dem Raum-Modell, mit dem Methylende voraus in die Bindungstasche gleiten, wohingegen bei 9-Lipoxygenasen die ungesättigte Fettsäure mit dem Carboxylende voran in die Tasche gleitet. Teil des Bodens der Bindungstasche ist bei allen pflanzlichen Lipoxygenasen ein höchst konserviertes Arginin, das bei der Umwandlung der Lipidkörper 13-Lipoxy- genase aus Gurke in eine 9-Lipoxygenase von zentraler Bedeutung ist (R758 der CsIbLOX) [Hornung et al., Proc NatI Acid Sei USA, 96(7):4192-4197, 1999]. Dieses Arginin tritt unabhängig von der Substrat- und Positionsspezifität auf und ihm geht in über 90 % der Fälle ein Asparagin voran. Als einzige Ausnahme unter pflanzlichen Lipoxygenasen sind an dieser Stelle im Sequenzvergleich bei PtLOXI zwei Histidine anstelle des Asparagin-Arginin-Tandem. Es ist davon auszugehen, dass diese auch bei PtLOXI den Boden der Tasche bilden, da dieser Bereich ansonsten hoch konserviert ist. Das Arginin am Boden der Bindungstasche wurde durch die H608V Mutation von CsIbLOX demaskiert, wobei durch die Salzbrücke zwischen der Carboxylgruppe des Substrates und dem Arginin die Energie des Einbringens einer Carboxylgruppe in eine hydrophobe Umgebung stark gesenkt wird [Hornung et al., Proc NatI Acad Sei USA, 96(7):4192-4197, 1999]. Auch wenn der pK-Wert der Histidine im Protein nicht genau abgeschätzt werden kann (pK = 6,5), so ist es im Vergleich zu Arginin (rund pK = 12) sicherlich unwahrscheinlicher, dass sie eine positive Ladung tragen. Aus diesem Grunde ist es unwahrscheinlich, dass es einen nahen Verwandten von PtLOXI mit 9-Lipoxygenase-Aktivität gibt, welcher der Orientation-bezogenen Theorie gerecht wird. Da selbst bei dieser Theorie bei einer 12-Lipoxygenase diese Position maskiert ist und somit keine Rolle spielt, scheint dieses außergewöhnliche Auftreten von Histidin anstatt von Arginin keine Bedeutung für den Katalysemechanismus zu haben.

Konserviert ist hingegen die Aminosäure, die sich im Sequenzvergleich mit der SLOANE- Determinante [Sloane et al., Nature, 354:149-152, 1991] deckt. An dieser Stelle befindet sich in 9-Lipoxygenasen eine kleine Aminosäure wie Valin und in 13-Lipoxy- genasen eine große wie Phenylalanin. Eine Ausnahme bilden die 13-Lipoxygenasen LOX1 :Cs:1 und LOX1 :Cs:3 (H statt F) sowie LOX1:Hv:3 (V statt F). Diese Diskrepanz mag ihre Ursache darin haben, dass in diesen Fällen keine „klassischen" 13-üpoxy- genasen vorliegen [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002]. In PtLOXI liegt jedoch die voluminöse Aminosäure Phenylalanin vor, wie für eine 13-üpoxygenase erwartet.

An der Position im Sequenzvergleich, die sich mit der BoRNGRÄBER-Determinante deckt, ist es schwieriger, konservierte Unterschiede zwischen 13- und 9-Lipoxygenasen zu finden. Meist findet man eine Kombination aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, die von der kleinen Aminosäure Glycin oder hydrophoben Aminosäure Cystein getrennt werden (z.B. S515,G516,V517 in LOX1:Nt:1). Bezüglich der Kombination von hydrophober/hydrophiler Aminosäure finden sich konservierte Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. PtLOXI unterscheidet sich dahingehend von allen anderen Lipoxygenasen, dass bei ihr zwei hydrophobe Aminosäuren von der hydrophilen Aminosäure Threonin getrennt werden. Diese beiden hydrophoben Aminosäuren (Isoleucin deckt sich mit V542 der CsIbLOX, Alanin mit Y544 der CsIbLOX) existieren an dieser Stelle des Sequenzvergleichs bei keiner anderen Lipoxygenase, obwohl unmittelbar davor und dahinter PtLOXI höchste Homologie mit allen anderen Lipoxygenasen aufweist. Da diese Positionen als Bestandteil der Substratbindungstasche identifiziert wurden und ein Einfluss auf die Positionsspezifität nachgewiesen wurde [Feussner et al., Annu. Rev. Plant. Biol., 53:275-297, 2002], muss davon ausgegangen werden, dass dieser Unterschied Einfluss auf die Art und Weise haben könnte, wie das Substrat gebunden oder fixiert wird. Da Aminosäuren ähnlichen Charakters und ähnlicher Größe an zwei dieser Positionen (vor und hinter dem Threonin) in anderer Kombination auch bei anderen Lipoxygenasen gefunden werden, ist die Art dieses Einflusses nicht unmittelbar ersichtlich.

Für 13- Lipoxygenasen ist in beiden Modellen die Entfernung der bisallylisschen

Methylengruppe von dem Methylende des Substrates entscheidend, ob die einleitende Wasserstoffabstraktion an dieser Stelle stattfindet. Es stellte sich heraus (Tabelle 4), dass von den in Frage kommenden bisallylischen Methyiengruppen für jedes der eingesetzten Substrate hauptsächlich nur eine für die initiale Wasserstoffentfernung be- nutzt wurde. Dies betraf die Methylengruppe an Position (n-8) im Fall von LA und α- LEA und jeweils (n-11) für γ-LEA, ÄRA, EPA, DPA und DHA. Man kann somit abschätzen, dass der Abstand des Wasserstoffakzeptors von dem Boden der Bindungstasche rund elf Methylengruppen beträgt. Auffallend ist besonders im Fall von γ-LEA, dass von den beiden möglichen Positionen der Wasserstoffabstraktion (C₈ und Cn) jene benutzt wurde, bei der das Substrat maximal in die Bindungstasche eintaucht (C₈ entspricht (n-11)). Dies ist auch bei α-LEA der Fall, auch wenn hier gezwungenermaßen zum hypothetischen Boden der Bindungstasche noch drei Methylengruppen Platz bleibt. Bei allen langkettigen Fettsäuren ab ÄRA (20:4) wird immer das C-Atom (n-11) benutzt. Aufgrund dieser Beobachtung und durch die vergleichende Analyse in Figur 8 ist davon auszugehen, dass entweder ÄRA oder EPA die bevorzugten Substrate von PtLOXI sind. DPA ist aus dem Grunde unwahrscheinlich, da beide Produkte ([+2]- und [-2]-Umlagerung) im Verhältnis 1:1 entstehen und zudem die Menge an gebildetem Produkt im Vergleich zu ÄRA und EPA wieder abnimmt. Die Produkte aus DHA entstehen dagegen im selben Verhältnis wie die EPA-Produkte, wobei allerdings die Produktmenge geringer ist als bei ÄRA und EPA. In Anbetracht dessen, dass EPA rund dreimal mehr als DHA in P: tricornutum vorkommt [Schobert et al., Plant Physiol, 66:215-219, 1980], scheint durch PtLOX bevorzugt dieses Substrat umgesetzt zu werden. Für die Verschiebung der Verhältnisse der Oxidation an [+2] zu [-2] bei Änderung der Anzahl der Doppelbindungen oder Methylengruppen diesseits oder jenseits der benutzten bisallylischen Methylengruppe konnte keine rationale Erklärung gefunden werden. Scheinbar stabilisieren Doppelbindungen auf der Carboxyseite der benutzten bisallylischen Methylengruppe da [+2]-Radikal, wohingegen Doppelbindungen auf der Methylseite das [-2]-Radikal stabilisieren. Da sp² hybridisierter Kohlenstoff eine höhere Elektronegativität als sp³ hybridisierter Kohlenstsoff besitzt, ist dieses Ergebnis das Gegenteil von dem, was man aufgrund dieses Elektronenzuges sp² hybridisierten Kohlenstoffs erwarten würde. Auch die Verschiebung des Verhältnisses bei der Änderung der Anzahl der Methylengruppen bei gleichbleibender Doppelbindungsanzahl kann nicht mit induktiven Effekten der Methylengruppen (+) erklärt werden. Hier werden [-2]-Radikale durch Einführung von Methylengruppen auf der Carboxyseite der benutzten bisallylischen Methylengruppe scheinbar stabilisiert und umgekehrt.

Als Erklärung bleibt die Möglichkeit, die Fixierung des Substrates durch die Bindungstasche anzuführen (Figur 26). So ändert sich durch eine Doppelbindung die Struktur des Substrates. Nimmt man an, dass im Fall von ÄRA das Substrat am Methyl- sowie am Carboxylende optimal arretiert ist für die Oxidation am C₁₂, so ändert sich die Möglichkeit der Interaktion des Bodens der Bindungstasche mit EPA durch die Einführung einer Doppelbindung an dieser Stelle. Ist EPA weniger fest fixiert, kann die Positionsänderung während der Katalyse die Positionsspezifität nachteilig beeinflussen. Ähnliche Effekte mögen bei den anderen Substraten auftreten. Der Bereich von C₁₈ bis C₇ bei γ-LEA (Bildung von 10-16-γ-HOTE) ist identisch mit dem Bereich C₂₀ bis C₉ von ÄRA (Bildung von 12-/-HETE). Der Unterschied ist die fehlende Arretierung am Kopfende (Carboxyl-) von γ-LEA durch die Bindungstasche. Durch denselben Effekt könnte ÄRA (20:4) und EPA (20:5) am Kopfende optimal arretiert sein und DPA (22:5) durch die Entfernung der Caboxylgruppe vom Eingang der Bindungstasche eine Arretierung unmöglich machen. Die Einführung der Doppelbindung an dieser Position in DHA (22:6) könnte dies rückgängig machen, da das Substrat durch die Doppel- bindung in den Freiheitsgraden eingeschränkt („versteift") wird. In diesem Zusammenhang könnten auch die stereochemischen Unterschiede zwischen den Hauptprodukten erklärt werden und diese These untermauern: Wird das Substrat am Methyl- sowie Carboxylende fest durch Interaktion mit Aminosäuren der Bindungstasche arretiert, könnte dies die nahezu 100-%-Enantiomerenreinheit im Fall der Umsetzung von EPA und DHA für jeweils beide Produkte erklären. Die oben angeführte Lockerung der Interaktion am Carboxylende bei DPA könnte dann auch das Absinken des S- zu R- Verhältnisses für 14-HDPE bedingen. Im Fall von γ-LEA ist genau dieselbe Erklärung anzuführen, da das Substrat bei der Bildung von 10-/6-γ-HOTE so tief in die Bindungstasche eintaucht, dass das Carboxylende nicht mehr mit den möglichen Determianten der Substratfixierung am Kopfende der Bindungstasche interagieren kann. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass PtLOXI auf Basis der vergleichenden Substratumsetzung (Figur 8) ÄRA bzw. EPA bevorzugt umsetzt. Nimmt man die Ergebnisse der Positionsspezifität und der Enantiomerenanalyse hinzu, spricht dies für EPA als bevorzugtes Substrat. Im Vergleich zu ÄRA ist das Verhältnis zwischen Haupt- und Nebenprodukt zwar deutlich zugunsten des Hauptproduktes verschoben, welches dafür in nahezu enantiomerer Reinheit vorliegt. Damit wurde im Vergleich zu pflanzlichen Lipoxygenasen eine außergewöhnliche Substratspezifität gefunden. Auch andere pflanzliche 13-Lipoxygenasen, die chloroplastidär lokalisiert sind, waren in der Lage, Arachidonsäure umzusetzen (z.B. LOX2:Hv:1 , [Vöros et al., Eur J Biochem, 251:36-44, 1998]. Dabei wurde für gewöhnlich 15-HPETE in S-Konfiguration gebildet sowie eine Reihe racemischer Produkte, aber nicht 12- und 8-HETE in S-Konfiguration.

Ketokonjudienfettsäuren wurden durch PtLOX unter den Bedingungen der Analyse nicht gebildet. KODE werden hauptsächlich bei geringem Sauerstoffpartialdruck gebildet, aber von einigen pflanzlichen Lipoxygenasen, z.B. Lipoxygenase-2 aus Sojabohne und Lipoxygenase-1 aus Erbse, ist bekannt, dass sie diese auch bei normalem Sauerstoffpartialdruck in ungewöhnlich hohen Mengen von bis zu 50 % bezogen auf HODE bilden [Axelrod et al., Methods Enzymol, 71:441-451, 1981; Kühn et al., Eicosanoids, 4:9-14, 1991]. Auch die Umsetzung von komplexen Lipiden ist von Lipoxygenasen aus anderen RIanzen bekannt. So ist z.B. die Lipidkörper- Lipoxygenase aus Gurkenkeimlingen in der Lage, Triacylglyceride umzusetzen [Feussner et al., FEBS Lett; 431(3):433-436, 1998]. Wahrscheinlich sind diese Lipoxygenasen bei der Mobilisierung von Speicherfetten bei der Keimung beteiligt [Feussner et al., Trends Plant Sei, 6:262-267, 2001]. PtLOX verfügt zwar über Öl- vakuolen rwww.kieselalαen.coml. aber da die Fortpflanzung durch vegetative Zellteilung geschieht, ist eine Einbeziehung von Lipoxygenasen bei der Mobilisierung von Speicherlipiden wie bei manchen höheren Pflanzen auszuschließen. Auch die Umsetzung von Phosphatidylcholin kann durch Lipoxygenasen stattfinden. Lipoxy- genase-1 aus Sojabohnen setzte dieses Substrat zuerst zu Monohydroperoxy- Linoleoyl-Phosphatidylcholin und dann weiter zum Dihydroperoxid um [Brash et al., Biochemistry, 26:5465-5471, 1987]. In Arabidopsis wurde zudem ein neues Oxolipin identifiziert [Stelmach et al., J Biol Chem, 276(16): 12832-12838, 2001]. Es handelt sich dabei um ein sn-1-O-(12-Oxophytodienyl)-sn2-O-(hexadekatrienoyl)-monogalactosyl- diglycerid. Man könnte daher aufgrund dieser Befunde und früherer Hypothesen

[Feussner et al., Fett-üpid, 100:146-152, 1998] annehmen, dass Lipoxygenasen Mono- galactosyldiglyceride, die Hauptbestandteile der Chloroplastenmembran, als Substrate akzeptieren und eine Hydroperoxidgruppe in die Fettsäure, die sich in der sn1 -Position befindet, einbauen. In Pflanzen gibt es Hinweise, dass bei Existenz eines solchen Weges letztendlich Jamonsäure gebildet wird. Obwohl dies bei PtLOXI aufgrund der geringen Menge an veresterter α-Linolensäure unwahrscheinlich ist, sollte eine weitere Untersuchung auch komplexe Lipide der veresterten Fettsäuren wie EPA und AA in Form von Phosphatidylcholin und Monogalactosyldiglycenden berücksichtigen.

Abkürzungsverzeichnis

APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosin-5'-triphosphat BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-indoxylphosphat BLAST Basic LocalAlignment Search Tool - Suche der nächsten

Homologen einer Sequenz durch Vergleich mit Sequenzen in verschiedenen Datenbanken bp Basenpaar

BSA Bovine Serum Albumin - Rinderserumalbumin BSTFA N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide cDNA komplementräge Desoxyribonukleinsäure

C-Terminus Carboxy-Terminus

DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotid-5'-triphosphate EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EDAC N-Dimethylamino-propyl-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid g (Formelzeichen) Erdbeschleunigung g (Einheit) Gramm

GC/MS Gaschromatograph/Massenspektrometer 17-H(P)DHE (17S,4Z,7Z,10Z,13Z,15E,19Z-17-Hydro(pero)xy-4,7,10,13,15,

19-docosahexaensäure

14-H(P)DPE (14S,7Z,10Z,12E,16Z,19Z)-14-Hydro(pero)xy-7,10,12,16,19- docosapentaensäure

10-H(P)DPE (10S,7Z,11 E,13Z.16Z.19Z)-10-Hydro(pero)xy-7,11 ,13,15,19- docosapentaensäsure

12-H(P)EPE (12S,5Z,8Z, 10E,14Z, 17Z)-12-Hydro(pero)xy-5,8, 10,14,17- eicosapentaensäure

8-H/P)EPE (8S,5Z,9E, 11 E, 14Z, 17Z)-8-Hydro(pero)xy-5,9, 11 ,14,17-eicosa- pentaensäure -H(P)ETE (5S,6E,8Z,11Z,14Z)-5-Hydro(pero)xy-6,8,11,14-eicosatetraen- säure -H(P)ETE (8S,5Z,9E,11Z,14Z)-8-Hydro(pero)xy-5,9,11 ,14-eicosatetraen- säure -H(P)ETE (9S,5Z,7E,11Z,14Z)-9-Hydro(pero)xy-5,7,11 ,14-eicosatetraen- säure 11-H(P)ETE (11S,5Z,8Z,12E,14Z)-11-Hydro(pero)xy-5,8,12,14-eicosa- tetraensäure

12-H(P)ETE (12S.5Z.8Z, 10E, 14Z)-12-Hydro(pero)xy-5,8, 10, 14-eicosa- tetraensäure 15-H(P)ETE (15S,5Z,8Z,11Z,13E)-15-Hydro(pero)xy-5,8,11,13-eicosa- tetraensäure

HPLC High Performance Liquid Chromatography -Hochleistungs- Flüssigchromatographie

9-H(P)ODE (9S, 10E, 12Z)-9-Hydro(pero)xy-10, 12-octadecadiensäure 13-H(P)ODE (13S,9Z,11 E)-13-Hydro(pero)xy-9,11 -octadecadiensäure 9-α H(P)OTE (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydro(pero)xy-10,12,15-octadecatrien- säure

12-α H(P)OTE (12S.9Z.13E, 15Z)-12-Hydro(pero)xy-9, 13,15-octadecatrien- säure 13-α H(P)OTE (13S,9Z,11E,15Z)-13-Hydro(pero)xy-9,11 ,15-octadecatrien- säure

16-α H(P)OTE (16S.9Z, 12Z, 14E)-16-Hydro(pero)xy-9, 12, 14-octadecatrien- säure

6-γ H(P)OTE (6S,7E,9Z,12Z)-6-Hydro(pero)xy-7,9,12-octadecatriensäure

9-γ H(P)OTE (9S,6Z,10E,12Z)-9-Hydro(pero)xy-6,10,12-octadecatriensäure

10-γ H(P)OTE (10S,6Z,8E, 12Z)-10-Hydro(pero)xy-6,8, 12-octadecatriensäure

13-γ H(P)OTE (13S,6Z,9Z, 11 E)-13-Hydro(pero)xy-6,9,11 -octadecatriensäure

IEP isoelektrischer Punkt

IPTG Isopropyl-ß-thiogalaktopyranosid kDa Kilodalton

MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure mRNA messenger Ribonukleinsäure

NBT Natriumnitrotetrazoliumblau

N-Terminus Amino-Terminus

OD optische Dichte bezogen auf 1 cm Küvettenbreite

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS Phosphat gepufferte Saline

P/C/l Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration

RACE Rapid Amplification of cDNA End - Methods zur Sequenzverlängerung

RNA Ribonukleinsäure

SDS Natriumdodecylsulfat

SSC Natrium-Natriumchlorid TAE Tris-Acetat-EDTA

TCA Trichloressigsäure

TE Tris-EDTA

TEAA Triethylamonium-Acetat

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylendiamin

TENS Tris-EDTA-NaCI-SDS

Tris Tris-(hydoxymethyl)-aminomethan

TMS Trimethylsilyl-

ORF Open Reading Frame - offener Leserahmen

U unit; Einheit der Enzymaktivität [μmol/min]

UV ultraviolett var. Varietät

V „volume", Volumen w „weight", Gewicht

X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-ß-Galaktosid

Claims

Patentansprüche

1. Lipoxygenase aus Phaeodactylum tricornutum mit einem pH-Optimum von 8,2 und einer Regiospezifität für die Hydroperoxybildung von Linolsäure am C-Atom 13 (13-LOX).

2. Isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Lipoxygenaseaktivi- tät codieren, ausgewählt aus der Gruppe: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz, b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 enthaltenden codierenden Sequenz ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit Lipoxygenaseaktivität codieren und mindestens 60 % Identität auf Aminosäureebene mit SEQ ID NO: 2 aufweisen.

3. Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei die Sequenz von Diatomeen stammt.

4. Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Sequenz aus Phaeodactylum tricornutum stammt.

5. Aminosäuresequenz, die von einer isolierten Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 codiert wird.

6. Genkonstrukt, enthaltend eine isolierte Nukleinsäure nach einem der

Ansprüche 2 bis 4, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen verbunden ist.

7. Genkonstrukt nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoff- wechsels enthält ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP-Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Äcyl- transferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-

Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure- Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid- Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure-Elongase(n).

8. Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 2 bis 4 oder ein Genkonstrukt nach Anspruch 6.

9. Transgener nicht-humaner Organismus, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 2 bis 4, ein Genkonstrukt nach Anspruch 6 oder einen Vektor nach Anspruch 8.

10. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 9, wobei der Organismus ein Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze ist.

11. Transgener nicht-humaner Organismus nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Organismus eine Pflanze ist.

12. Verfahren zur Herstellung von Hydroperoxyfettsauren durch Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei Doppelbindungen im Fettsäuremolekül, wobei das Verfahren das Züchten eines transgenen Organismus umfasst, der eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 2 bis 4, ein Genkonstrukt nach Anspruch 6 oder einen Vektor nach Anspruch 8 umfasst, kodierend für eine Lipoxygenase, die ein pH-Optimum von 8,2 und einer Regiospezifität für die Hydroperoxybildung von Linolsäure am

C-Atom 13 hat.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei im Verfahren Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oxidiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Hydroperoxyfettsauren aus dem Organismus in Form eines Öls, Lipids oder einer freien Fettsäure isoliert werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Organismus ein Mikroorganismus, ein nicht-humanes Tier oder eine Pflanze ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der Organismus eine transgene Rlanze ist.