DE10231589A1

DE10231589A1 - Klonierung und Charakterisierung einer Lipoxygenase aus Phaeodactylum tricornutum

Info

Publication number: DE10231589A1
Application number: DE10231589A
Authority: DE
Inventors: Ivo Dr. Feußner; Toralf Senger; Cornelia Dr. Göbel
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2002-07-11
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2004-01-29
Also published as: WO2004007732A1; AU2003280984A1

Abstract

Von der Kieselalge P. tricornutum wurde die Sequenz eines Klones, der über ESTs als homologer pflanzlicher LOXen identifiziert wurde, mittels 5'RACE erfolgreich verlängert und die Sequenz der komplexen cDNA bestimmt. Die Isolation dieser cDNA aus der zugrunde liegenden Phagen-Bank gelang nicht, weswegen die komplette cDNA-Sequenz aus zwei überlappenden Fragmenten zusammengesetzt wurde. Das eine Fragment entsprach dem vorliegenden cDNA-Klon und das andere Fragment wurde aus der cDNA-Bibliothek isoliert. Da im Bereich der Überlappung eine in der Sequenz unikale Restriktionsschnittstelle eine Endonuklease existierte, konnten diese zwei Fragmente zur vollständigen cDNA-Sequenz zusammengesetzt werden. Da die Reinigung des Enzyms nicht glückte, wurde für die biochemische Charakterisierung das ungereinigte Enzym aus den bakteriellen Zelllysaten eingesetzt. Bei der Umsetzung von Linolsäure durch PtLOX1 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser LOX um eine 13-LOX handelt. Das pH-Optimum des Enzyms wurde anhand der Umsetzung von Linolsäure bestimmt und liegt bei pH 8,2. Um aufzuklären, welche vielfach ungesättigten Fettsäuren von PtLOX1 als Substrate akzeptiert werden und welche Regioisomere dabei bevorzugt entstehen, wurden sieben verschiedene Fettsäuren eingesetzt: Linolsäure (LA), alpha-Linolensäure (alpha-LEA), gamma-Linolensäure (gamma-LEA), Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA) und Docosahexaensäure (DHA). Die Umsetzung von LA ergab nach Reduktion ...

Description

1 Einführung
1.1 Lipoxygenasen
1.1.1 Entdeckung pflanzlicher Lipozygenasen
Bei Lipoxygenasen (Linolear: Sauerstoff Oxidoreduktasen, EC 1.12.11.13; LOX) handelt es sich um Enzyme, die ubiquitär im Pflanzen- und Tierreich verbreitet: sind [18]. Sie enthalten ein nicht-Haem-Eisenatom pro mol Enzym und katalysieren die regio- und stereoselektive Dioxygenierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wobei deren Hydroperoxid-Derivate in S-Konfiguration entstehen [64]. Die erste LOX wurde 1932 von Andre und Hou beschrieben, als Enzym, das die Oxidation von Fettsäuren und den Abbau von Karotenoiden bewirkte [3]. In der Lebensmittelindustrie wurde die enzymatische Aktivität von LOXen schon vor deren Entdeckung genutzt. So wurde Weizenmehl gebleicht, indem darin enthaltenen Karotenoide von LOXen umgesetzt wurden, welche der wirksame Bestandteil von beigemischtem Sojamehl waren [74]. In den Achtziger Jahren begann man mit der Aufklärung der physiologischen und vor allem der biochemischen Eigenschaften [34, 46]. Eine erste umfassende Zusammenfassung des Katalysemechanismus erfolgte 1991 [36]. Insbesondere die Verfügbarkeit der ersten Daten aus den Strukturanalysen durch Röntgenbeugung tierischer [39] sowie pflanzlicher [15, 57, 75] LOXen half Modelle zu erstellen, welche die Substrat- und Positionsspezifität zu erklären versuchen [28]. Bis jetzt sind Sequenzen, die für LOXen kodieren, aus über sechzig Pflanzenarten und Tieren bekannt [18]. Es wurde erst eine mikrobielle LOX aus dem Pilz Gaeumannomyces graminis isoliert [80]. Bei Säugetieren setzen sie u.a. Arachidonsäure um und bilden die Vorstufen von regulatorischen Verbindungen, wie Leukotriene und Lipoxine, die eine wichtige Rolle bei Entzündungs- und Immunreaktionen spielen [50]. Bei Pflanzen dienen die von den LOXen gebildeten Hydroperoxide als Substrate für wenigstens sieben Enzymfamilien [32]. Hier wären vier Stoffwechselwege zu nennen, die verhältnismäßig gut charakterisiert sind: Peroxygenase-, Hydroperoxid-Lyase-, Allenoxid-Synthase- und der Divinylether-Synthase-Weg. Weniger gut charakterisiert ist die Umsetzung durch Epoxyalkohol-Synthasen und durch Reduktasen, ebenso wie die Hydroperoxidase-Aktivität der LOXen [32]. Über die physiologische Funktion vieler pflanzlicher LOXen ist jedoch noch immer, trotz intensiver Untersuchungen, wenig bekannt [18].
1.1.2 Beschreibung des Enzyms
Pflanzliche LOXen sind Enzyme, die ein Molekulargewicht zwischen. 90 und 115 kDa haben. Sie gehören zur Familie der Dioxygenasen und katalysieren den Einbau von molekularem Sauerstoff in ein (1Z,4Z)-Dien-System ungesättigter Fettsäuren [18]. Die dabei entstehenden Hydroperoxide der Fettsäuren besitzen S-Konfiguration und weisen ein (1Z,3E)-Dien-System auf (1). Die meisten Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus wurden an der
Abbildung 1: Allgemeiner Reaktionsmechanismus von LOXen. LOX Isoform 1 aus Soja durchgeführt [28, 36, 84]). Bei der Umsetzung von Linolsäure und α-Linolensäure, den häufigsten Substraten von LOXen in Pflanzen, kann der Sauerstoff an zwei verschiedenen Positionen eingeführt werden. Nach initialer Wasserstoff Abstraktion durch das nicht-Haem Eisenatom am Kohlenstoffatom C₁₁ dieser Fettsäuren, kann eine [+2]- oder [-2]-Umlagerung des Pentadienylradikals erfolgen. Eine Ausnahme bezüglich des Wasserstoffakzeptor bildet der Pilz Gaeumannomyces graminis, bei dem Mangan anstatt des zweiwertigen Eisenatoms im aktiven Zentrum der katalytisch aktiven LOX gefunden wird [80]. Nach Sauerstoffanlagerung und der Reduktion des Peroxy-Radikals zum Hydroperoxid entstehen aus Linolsäure folglich entweder (13S,9Z,11E)-13-Hydroperoxy-9,11-octadecadiensäure (13-HPODE, [+2]-Umlagerung) oder (9S,10E,12Z)-9-Hydroperoxy-10,12-octadecadiensäure (9-HPODE, [-2]-Umlagerung) ([28], 2). Da die Bildung des Verhältnisses dieser Positionsisomere für jedes Enzym spezifisch erfolgt, wird zwischen 9- und 13-LOX bei Pflanzen unterschieden [36]. Eine weiter führende Unterteilung pflanzlicher LOXen basiert auf Sequenzhomologien auf cDNA-Ebene. So besitzen LOXen vom Typ 1 kein chloroplastidäres Signalpeptid, im Gegensatz zu LOXen vom Typ 2 [73].
Abbildung 2: Regiospezifität der LOXen am Beispiel der Umsetzung von Linolsäure.
1.1.3 Metabolismus der Hydroperoxide
Wie schon erwähnt sind bisher neben dem Enzym LOX selbst sechs weitere Enzymfamilien beschrieben worden, welche die Hydroperoxid-Derivate von Fettsäuren weiter umsetzen. Vier Haupt-Stoffwechselwege wurden bis heute charakterisiert ([10, 29], 3, dicke Pfeile)
Abbildung 3: Der LOX-Reaktionsweg (HPL, Hydroperoxid-Lyase; DES, Divinylether-Synthase; AOS, Allenoxid-Synthase; AOC, Allenoxid-Cyclase; EAS, Epoxyalkohol-Synthase; H(P)ODE, Hydro(pero)xylinolsäure; H(P)OTE, Hydro(pero)xylinolensäure; KODE, Ketolinolsäure; KOTE, Ketolinolensäure; 12-Oxo-PDA, 12-Oxophytodiensäure)

1. Der Peroxygenase Weg [10] (früher Hydroperoxid-Isomerase): Durch die Peroxygenase entstehen Hydroxy-, Epoxy- und β-Hydroxyepoxyfettsäuren aus den Hydroperoxiden der Fettsäuren. Die Epoxygruppen können zu Hydroxygruppen reduziert werden, so dass Di- und Trihydroxyfettsäuren entstehen [41].
2. Der Allenoxid-Synthase-Weg (AOS, früher Hydroperoxid-Dehydratase [36]): Die Al lenoxid-Synthase gehört zur Familie der Cytochrom-P₄₅₀-Enzyme [78], Unterfamilie CYP74A. Hier werden die Hydroperoxide zu instabilen Allenoxiden umgesetzt, die in α- und γ-Ketole zerfallen. Bei der Umsetzung von 13-HPOTE kann neben diesem Zerfall zu den Ketolen ein weiterer Reaktionsweg beschritten werden, der zur Bildung von Jasmonsäure führt, der sogenannten Jasmonat-Kaskade [86]. In diesem Falle entsteht aus 13-HPOTE zunächst ein instabiles Allenoxid das durch die hoch spezifische Allenoxidcyclase zu (9S,13S,15Z)-12-Oxo-9,13,15-phytodienonsäure (cis-[+]-12-Oxo-PDA) zyklisiert wird [94]. Anschließend katalysiert die 12-Oxo-PDA-Δ¹⁰-Reduktase die Reduktion der Doppelbindung des Cyclopentanonrings. Diese Reaktion ist NAPH-abhängig [67]. Durch drei anschließende β-Oxidationsschritte wird die Karbonsäureseitenkette verkürzt und es entsteht (3R,7S)-Jasmonsäure, die spontan zu (3R,7R) Jasmonsäure epimerisiert [72]. Beide Verbindungen und deren Methylester sind biologisch aktiv Sie besitzen Phytohormon-ähnliche Eigenschaften und wirken stimulierend oder auch hemmend auf pflanzliche Entwicklungsprozesse, wie Keimung und Seneszenz. Die Frage, ob Jasmonat als hormoneller Regulator der Seneszenz wirkt oder als Stresssignal, das auch Seneszenz auslösen kann, ist noch nicht geklärt [89].
3. Der Hydroperoxid-Lyase-Weg (HPL, früher Hydroperoxid-Isomerase [96]): Das Enzym ist in Pflanzen weit verbreitet [56], besitzt ebenfalls ein Cyrochrom-P₄₅₀ und bildet die Unterfamilien CYP74B und CYP74C. Die Peroxide von Linol- und α-Linolensäure werden in den gesättigten Aldehyd Hexanal oder in ungesättigte (3Z)-Aldehyde und ω-Oxo-Derivate der Fettsäuren gespalten [56]. Durch Alkohol-Dehydrogenasen können die (3Z)-Aldehyde in (3Z)-Alkohole umgewandelt werden, die dann wiederum mit kurzkettigen Karbonsäuren flüchtige Ester bilden können. Alternativ können die Aldehyde vor ihrer Reduktion zu den entsprechenden (2E)-Aldehyden isomerisieren (siehe S. 5). Diese aus der HPL-Reaktion resultierenden Substanzen sind für den charakteristischen Geruch von Pflanzen und Früchten verantwortlich [43].
4. Der Divinylether-Synthase-Weg (DES): Die Enzymaktivität der DES, die Bildung von Divinylethern aus den Fettsäurehydroperoxiden, wurde schon in den 70er Jahren beschrieben [35]. Die Produkte scheinen bei der Abwehr von pathogenen Bakterien und Pilzen eine Rolle zu spielen [90]. Die erste Isolierung einer DES gelang erst Ende 2000 aus Lycopersicum esculentum [48].

Neben diesen vier Haupt-Soffwechselwegen sind drei weitere, weniger gut charakterisierte Enzymaktivitäten bekannt.

1. Die Hydroperoxid-Reduktase ist u.a. bei einer Vielzahl von Ölsaaten am Abbau der Polyenfettsäuren in den Speicherlipiden beteiligt [29]. Der Mechanismus ist nicht vollständig verstanden, aber es wird eine Beteiligung von Glutathion diskutiert [25].
2. Die LOX-katalysierte Peroxidase-Reaktion (Ketodien erzeugender Weg): Bei Sauerstoffmangel können LOXen die homeolytische Spaltung der O-O Bindung katalysieren. Die dabei entstehenden Alkoxy-Radikale können dann zu Ketokonjudienfettsäuren umlagern, wobei zu einem geringeren Anteil auch andere Derivate entstehen können [49, 52].
3. Der Epoxyalkohol-Synthase Weg (EAS): Alternativ zum Peroxygenase-Weg wurde die Umwandlung von (9S)-Hydroperoxiden durch eine EAS beschrieben. Die Charakterisierung des Enzymes gelang u.a. aus den Blättern von Kartoffel [42]. Bei dieser Katalyse entstehen α- und β-Hydroxyepoxy-Derivate der Fettsäuren durch intramolekulare Umlagerung ihrer Hydro(pero)xide, jedoch mit einer anderen absoluten Konfiguration als im Falle der Peroxygenase. Der EAS-Weg wurde bisher nur in Solanaceen gefunden, wobei die dadurch entstehenden Oxylipine bei der Verteidigung gegen Pathogene eine Rolle spielen könnten [38].

Zu erwähnen sei auch die weitere Umsetzung der Aldehyde, die durch die HPL-Reaktion entstanden sind. So können sie durch eine (3Z):2E Enal-Isomerase isomerisiert werden [61]. Vorgeschlagen wurde auch die erneute Reaktion mit LOXen, die zur Bildung von Hyxdroxyaldehyden führen würde [37]). Diese Umsetzung gilt jedoch nicht als gesichert. Durch Arbeiten von zwei anderen Gruppen wird eher wie bei den Wirbeltieren eine autoxidative Bildung angenommen [60, 70]. Aus der bei der Umsetzung von 13-HPOTE gebildeten ω-Oxosäure, (9Z)-12-Oxo-9-dodecensäure, entsteht durch Folgereaktionen Traumatin, das durch Oxidation spontan in Traumatinsäure umgewandelt wird [95]. Beide Substanzen werden als Wundhormone bezeichnet, da sie möglicherweise bei der Wundantwort von Pflanzen involviert sind.
1.1.4 Vorkommen von pflanzlichen LOXen
LOX-Isoformen kommen in den meisten Pflanzenzellen vor. Die Expression der LOX ist jedoch abhängig von den Entwicklungs- und Umweltbedingungen der Pflanze [64]. Sie können löslich oder an Membranen gebunden sein. Lösliche LOXen findet man z. B. im Cytosol von Keimlingen und reifenden Samen [85], in späteren Entwicklungsstadien z. B. in Blättern, auch in Vakuolen [82], im Zellkern [27] und im Chloroplasten [8, 27]. Die membrangebundenen LOXen wurden ebenso in den verschiedensten Kompartimenten der pflanzlichen Zellen gefunden. Sie können an der Plasmamembran [59], an der Membran der Lipidkörper von Keimlingen [30, 63] und an der Hüll- und Thylakoidmembran der Chloroplasten von Blättern, Blüten und Früchten [11, 14] gebunden sein.
1.1.5 Mögliche physiologische Funktionen
1. bei der pflanzlichen Entwicklung
Von den 15-LOXen der Wirbeltiere ist bekannt, dass sie in den Abbauprozess von Membranen involviert sein können [69]. In Anlehnung daran wird auch bei pflanzlichen LOXen vermutet, dass sie durch die Umsetzung von Lipiden zu Lipidhydroperoxiden einen Verlust der Membranintegrität hervorrufen [81]. Eine weitere Hypothese ist, dass durch die Zerstörung der Membranen im Keimling der Transport von Speicherstoffen zu dem Embryo ermöglicht wird [45]. Weiterhin wird eine Mitwirkung oder Auslösung der Mobilisierung von Speicherfetten vorgeschlagen [29], da als Hauptbestandteil der Proteinausstattung der Lipidkörper in Gurken-, Sonnenblumen-, Lein-, Anis- und Sojakeimlingen eine membranständige LOX identifiziert werden konnte. Das Enzym aus Gurke wies nach der Bindung an die Membran des Lipidkörpers [26] eine Steigerung der Enzymaktivität und eine Änderung der Regiospezifität auf. Es ist die erste pflanzliche LOX von der gezeigt werden konnte, dass sie direkt veresterte Linol- bzw Linolensäure umsetzen kann [33]. Eine mögliche Funktion dieser Reaktion könnte die Auslösung des Katabolismus von in Lipiden veresterten ungesättigten Fettsäuren sein [29]. Eine weitere Möglichkeit der Rolle von LOXen bei der Keimlingsentwicklung könnte durch den Schutz vor Pathogenen durch die Produktion von antimikrobiellen Substanzen gegeben sein [77].
2. bei der pflanzlichen Stressantwort
Aus den Produkten der LOX-Reaktion können durch weitere enzymatische Reaktionen Verbindungen mit regulatorischen Eigenschaften, wie Jasmonsäure und Traumatin entstehen [89]. Das Wundhormon Traumatin scheint die Zellproliferation [95] an den verwundeten Stellen innerhalb der Pflanze zu fördern. Jasmonsäure oder deren Methylester scheinen als Signaltranduktions-Moleküle der Pflanze bei Verwundung oder Pathogenbefall gebildet zu werden [21]. Sie bewirken die Induktion von Enzymen, die für eine Abwehrreaktion von Bedeutung sind [64]. Bei Pathogenbefall reagieren die Pflanzen mit Aktivierung von Abwehrgenen, der Synthese von antimikrobiellen Verbindungen, wie Phytoalexinen, und hypersensitiven Zelltod, zur Ausbildung von Resistenzen. Auch hierbei spielen LOXen scheinbar eine Rolle [77].
3. als Botenstoffe
LOXen spielen eine kritische Rolle bei der Synthese von Signalstoffen (Pheromonen) von Braun- und Kieselalgen [62]. Durch diese Botenstoffe z.B. werden männliche Spermatozoiden zu den immobilen weiblichen Gameten geleitet, welche diese ausschütten.
Produkte des LOX-HPL-Reaktionswegs spielen ebenso eine Rolle bei der Verteidigung von Braun- und Kieselalgen (Abschnitt 1.1.6).
1.1.6 Lipoxygenasen in Kieselalgen
Kieselalgen (Diatomeen) sind einzellige Algen, die im ozeanischen- und im Frischwasser Phytoplankon auftreten, aber auch in Biofilmen und festen Substraten. Sie sind mit Braun- und Goldalgen enger verwandt als mit Grünalgen, Moosen und höheren Pflanzen. Im Gegensatz zu letzteren bilden Kieselalgen Chrysolaminarin (ein β-1,3-Glucan) anstelle von Stärke (ein β-1,4 Glucan). Generell werden Assimilationsprodukte, wie Öle (in besonderen Ölivakuolen) sowie Chrysolaminarin und volutin, außerhalb der Chromatophoren abgelagert [1]. Ein weiterer Unterscheidungspunkt ist die Anwesenheit von Chlorophyll c anstelle von Chlorophyll b. Chromophoren die Chlorophyll b enthalten (bei höheren Pflanzen, Moose etc.) werden als Chloroplasten bezeichnet. Die Chromophoren bei Kieselalgen werden von vier anstelle von zwei Einheitsmembranen umhüllt. Die beiden inneren sind die eigentlichen Chromatophorenmembranen, die beiden äußeren stellen eine Falte des Endoplasmatischen Reticulums dar. Chromatophoren dieses Bauplans finden sich außer bei Bacillariophyceen (Kieselalgen) auch bei Chrysophyceen; Xanthophyceen, Chloromonadophyceen und Phaeophyceen, mit denen sie zu den Heterokontophyta (Chrysophyta) zusammengefasst werden [1].
In der marinen Nahrungskette stellen Kieselalgen die mit am bedeutendste primare Quelle dar. Sie tragen damit auch global mit bis zu 25 % zur Primärproduktion von Biomaterial bei, mit einem entsprechendem Anteil an der Sauerstoffproduktion [66]. Durch ihre herausragende Rolle als marine Primärquelle stehen sie unter immensen herbivoren Druck Neuere Forschungen haben gezeigt, das LOXen in einem Verteidigungsmechanismus gegen herbivore Organismen im Phytoplankton involviert sind [58, 62]. So werden vermutlich aus hoch ungesättigten Eicosanoiden (Arachidonsäure – ARA, Eicosapentaensäure – EPA) über den LOX-HPL-Weg Aldehyde gebildet, die sich als die wirksame Verreidigungssubstanzen erwiesen. Diese Aldehyde reduzierten den Erfolg beim schlüpfen von Ruderfußkrebsen, die 90 % des Phytoplanktons ausmachen. Da die meisten Kieselalgen von einer hochsstrukturierten Zellwand mit eingelagerten Silikaten umgeben sind, spielen sie auch eine Schlüsselrolle im biogeochemischen Kreislauf von Silikaten [83]. Kieselalgen werden kommerziell für vielfältige Zwecke eingesetzt, wie z.B. als Futter in jeder Form der Wasserzucht, als Quelle für mehrfach ungesättigte Fettsäuren (poly unsaturated fatty acids, PUFAs) oder als Bestandteil pharmazeutischer Arrikel [5].
1.1.7 Phaeodactylum tricornutum
Phaeodactylum tricornutum, eine einzellige Silika-freie Kieselalge, ist eins der am meisten benutzten Modellsysteme für das Studium der Ökologie, der Physiologie, der Biochemie und der molekularen Biologie von Kieselalgen [4]. Sie unterscheidet sich dahingehend signifikant von höheren Pflanzen, dass vom gesamten Fettsäurenbestandteil bis zu 30 % die hoch ungesättigte Fettsäure EPA ist und 11 % Docosahexanensäure (DHA) [71]. Unter optimierten Kultivierungsbedingungen wurden schon 40 % EPA erhalten [92]. P. tricornutum wurde um so attraktiver durch die Etablierung eines Protokolls zur stabilen Transformation, was viele neue Studien über Kieselalgen ermöglicht. So wurde durch die Verfügbarkeit dieser Technik ein Sensor-System demonstriert, das durch P. tricornutum benutzt wird um auf relevante Umwelteinflüsse zu reagieren [23]. Durch diese Technik wurde es auch möglich ein Gen einzuführen, das für einen Glukose-Transporter kodiert. Dadurch wurde eine photoautotrophe Kieselalge in einen heterotrophen Organismus umgewandelt, wodurch sich neue Möglichkeiten der Fermentation in großem Maßstab für die kommerzielle Verwertung eröffnen [93].
Die Anwesenheit dieser in Pflanzenreich seltenen PUFAs wie EPA und DHA macht Phaeodactylum tricornutum ein interessantes Untersuchungsobjekt für Enzyme die in der Synthese und den Abbau dieser Fettsäuren involviert sind.
1.1.8 Aufgabenstellung

Es ist das Ziel dieser Arbeit die erste LOX aus einer Alge zu isolieren. Da sich das Spektrum der PUFAs in Kieselalgen grundlegend von dem höherer Pflanzen unterscheidet, ist zu erwarten, dass PUFA metabolisierende Enzyme andere Substratspezifitäten aufweisen als Enzyme höherer Pflanzen. Daher soll nach erfolgreicher Isolation die Substratspezifität für PtLOX1 mit Substraten bestimmt werden, die in höheren Pflanzen nicht auftreten So ist keine Lipoxygenase im Pflanzenreich bekannt, deren bevorzugtes Substrat ARA, EPA oder DHA ist. 2 Methoden und Materialien 2.1 Materialien 2.1.1 Chemikalien

Agarose	GIBCOBRL^®, Paisley, UK
Arachidonsäure	Cayman Chemicals, USA
Eicosapentaensäure	Cayman Chemicals, USA
BSTFA-Regisil	Pierce, Rockford, IL, USA
Docosapentaensäure	Cayman Chemicals, USA
Docosahexaensäure	Cayman Chemicals, USA
GELCODE^® Blue Stain
Reagent	Pierce, Rockford, IL, USA

α-Linolensäure	Cayman Chemicals, USA
γ-Linolensäure	Cayman Chemicals, USA
Linolsäure	Cayman Chemicals, USA
TALON^® Metal Affinity Resin	Clontech, Palo Alto, USA
Plant Agar	Duchefa, Niederlande

Alle weiteren verwendeten Chemikalien wurden von den Firmen Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Sigma (Deisenhofen) oder Serva (Heidelberg) bezogen. Als HPLC-Laufmittel wurden die Produkte von J.T. Baker (Phillipsburg, N.J., USA) in HPLC-Qualität genutzt. 2.1.2 Vektoren

PQE30^TM Qiagen, Hilden

pGEM-T Promega, Madison, USA

2.1.3 Bakterien

E. coli XL1-Blue [19] recAl endAl gyrA96 thi-1hsdR17 supE44 relA1 lac[F' proAB lac^qZ M15 Tn10(Tet^r)]

E. coli SG 13009[pREP4] [40] Nal^S Str^S rif^S, lac^– ara^– gal^– mtl^– F^– recA⁺ uvr⁺

2.1.4 Antibiotika

Carbenicillin (Stammlösung: 100 mg/ml, Endkonzentration: 100 μg/ml Roth, Karlsruhe)

Kanamycin Stammlösung: 50 mg/ml, Endkonzentration: 25 μg/ml (Duchefa, Niederlande)

2.1.5 Antikörper und Konjugate

anti-CsLb-LOX Antikörper Kaninchen, Dr. I. Feußner, Gatersleben [44]

anti-Kaninchen IgG-Alkalische Phosphatase (ALP) Konjugat Roche Diagnostics, Grenzach

– 10 Zyklen 94°C 30 sek 52-57 °C 30 sek 72 °C 2 min
– 25 Zyklen 94 °C 30 sek 47-52 °C 30 sek 72 °C 2 min, Inkrement 5 sek
– 1 Zyklus 72 °C 5 min

2.2.2 Kolonie-PCR
Zur Identifikation der Bakterienkolonien, die nach Transformation das gewünschte Fragment in der Plasmid-DNA enthalten, wurde Kolonie-PCR durchgeführt. Zellmaterial einer Kolonie wurde mit einem Zahnstocher in 10 μl Wasser suspendiert. Durch Zugabe von 10× Puffer, MgCl₂, dNTP, Tfl-Polymerase und der entsprechenden Primer wurde das oben erwähnte (Abschnitt 2.2.1) PCR-Reaktionsgemisch hergestellt. Es wurde das gleiche Programm durchlaufen und die selben Primer verwendet, die zur Amplifikation des Fragments dienten. Wurde zur Amplifikation ein Primer eingesetzt, der auch im Vektor eine Bindungsstelle besitzt, ist dieser Primer durch Vektor-spezifische Primer ersetzt worden. Wurde das Fragment in diesem Falle nicht gerichtet kloniert (z.B. in pGEM-T), wurde Kolonie-PCR für beide Richtungen mit den entsprechenden Vektor-spezifischen Primern durchgeführt.
Für die Identifikation von Bakterienkolonien, die DNA-Konstrukte im Vektor enthalten, die aus mehr als einem PCR-Fragment zusammengesetzt wurden, ist der 5'-Primer des am 5'-Ende befindlichen Fragments und der 3'-Primer des am 3'-Ende befindlichen Fragments verwendet worden.
2.2.3 EXPAND^TM High Fidelity-PCR
Wenn ein niedrige Fehlerrate bei der PCR essentiell war, wie z.B. für die DNA Sequenz der rekombinanten PtLOX, wurde die Amplifizierung von DNA-Fragmenten mit dem "EXPAND^TM High Fidelity-PCR-System" nach der Vorschrift des Herstellers durchgeführt. Dieses System enthält ein Gemisch aus der thermostabilen Taq-DNA-Polymerase und der ebenfalls hermostabilen Pwo-DNA-Polymerase, die zusätzlich eine 3'-5' Exonuklease Aktivität besitzt. Außerdem wurden statt 35 nur 30 Zyklen durchlaufen. Beides diente dazu, die Fehlerrate niedrig zu halten, um möglichst wenig Mutationen in der zu amplifizierenden DNA zu erhalten.
2.2.4 Ligation von DNA
sDie Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit Vektor-DNA erfolgte durch Ligation mittels T4-DNA-Ligase. Dabei werden endständige 5'-Phosphatgruppen und 3'-Hydroxylgruppen unter Bildung von Phosphordiesterbindungen verbunden. Cofaktor dieser Reaktion ist ATP. Um die intramolekulare bzw intermolekulare Ligation des Vektors zu reduzieren, wurde das DNA-Fragment in etwa dreifachem Überschuss im Vergleich zur Vektor-DNA eingesetzt. Die Ligationsreaktion erfolgte bei 4 °C über Nacht. Die Ligation wurde in einem Volumen von 10 μl oder 20 μl durchgeführt.
Grundsätzlich wurden PCR-amplifizierte DNA-Fragmente zunächst in pGEM-T kloniert. Mit Tfl bzw "EXPAND^TM High Fidelity" amplifizierte Fragmente besitzen einen 3'-Adenin-Überhang, der mit dem 3'-Thymin-Überhang des pGEM-T-Vektors hybridisiert. Unter anderem deshalb ist die Ligationseffizienz dieses Vektors relativ hoch. pGEM-T bietet die Möglichkeit der Blau-Weiß Selektion mit IPTG und X-Gal.
Fragmente, die über Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen aus Vektoren herausgeschnitten wurden (Abschnitt 2.2.6), sind mit entsprechend vorgeschnittenen Vektor ligiert wurden. Der in Tabelle 1 angegebene Ansatz für Ligation unter Benutzung von Restriktionsschnittstellen wurden entsprechend der gegebenen DNA Konzentration variiert, um eine Konzentration von Insert : Vektor von rund 1 μM : 0,3 μM im Ansatz zu erzielen. Bei einer hypothetischen Ligationseffizienz von 100 % ergibt dieser Ansatz rund 15 fmol/μl Ligationsprodukt.
Tabelle 1: Ligation von Vektor- und Donor DNA
2.2.5 Transformation von E. coli
Im Zuge der Klonierung von DNA-Fragmenten wurden die E.coli-Stämme XL1-Blue und SG 13009 transformiert. Es wurden 100 μl kompetente E. coli-Zellen auf Eis aufgetaut und ca. 5 fmol DNA zugegeben. Dies entspricht 10 ng eines 3000 bp DNA-Konstruktes oder 17 ng eines 5000 bp DNA-Konstruktes. Nach 20 min Inkubation im Eis wurden die Bakterien für 50 s bei 42 °C einem Hitzeschock ausgesetzt. Anschließend wurde der Ansatz für 5 min auf Eis belassen, mit 900 μl LB-Medium versetzt und 1 h unter Schütteln bei 37 °C kultiviert. Die Bakterien wurden entsprechend ihrer Resistenz auf Selektionsmedium ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
2.2.6 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen [65]
Restriktionsendonukleasen spalten doppelsträngige DNA sequenzspezifisch durch Hydrolyse kovalenter Bindungen. Dabei werden 4 bis 8 bp lange palindromische Sequenzen erkannt und geschnitten. Bei Spaltungen mit den in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsendonukleasen entstehen Enden, die einen 3'- oder 5'-Überhang tragen.
Restriktionen wurden zur Kontrolle von Bakterienkolonien durchgeführt, die sich für die Klonierungsstrategie eignen (s. Abschnitt 3.1.2, S. 23) und für Gewinnung von DNA-Fragmenten für die Ligation (Abschnitt 2.2.4). Das Ausschneiden der DNA-Fragmente in zwei Schritten. Nach der Restriktion mit dem ersten Enzym erfolgte eine Reinigung des Reaktionsansatzes und dann erst die Restriktion mit den zweiten Enzym. Dies erfolgte um die Ausbeute an korrekt gespaltener DNA dadurch zu erhöhen, dass jedes Enyzm im optimalen Puffer mit 100 % Aktivität ohne unspezifische Nebenreaktion ("Stern-Aktivität") spaltet. Für die Kontrolle von Bakterienkolonien, die sich für die Klonierungsstrategie eignen, wurde pro Ansatz nur ein Enzym eingesetzt, um eine eindeutige Aussage für jedes Enzym zu erhalten. Tabelle 2 zeigt die verwendeten die Ansätze für Restriktionsspaltungen. Als Reaktionspuffer wurde der Tabelle 2: Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
jeweils optimale Puffer nach Herstellerangaben eingesetzt. Der Restriktionsansatz wurde ca. 12 h bei 37 °C inkubiert.
2.2.7 Auftrennung von DNA in Agarose-Gelen [65]
Mit einem 1,5 %igen Agarosegel ließen sich DNA Fragmente von 0,2 bis 4 kb effektiv trennen. Dazu wurden 1,5 % (w/v) Agarose in TAE-Puffer durch Aufkochen in der Mikrowelle gelöst, auf 60 °C abgekühlt und in einen horizontalen Gelträger gegossen. Zur Polymerisation wurde für mindestens 30 min abgekühlt. Die DNA Proben wurden mit 0,1 Volumen Probenpuffer versetzt und bei einer Spannung von 120 V elektrophoretisch getrennt. Als Größenmarker wurde der SMARTLADDER-Standard (Eurogentec, Seraing, Belgien) mit DNA Fragmenten definierter Größe verwendet. Um die DNA-Banden im Gel sichtbar zu machen, wurde das Agarosegel anschließend für 15 bis 20 min in einem Ethidiumbromid-Bad (2 μg/ml) inkubiert und für etwa 5 min in destilliertem Wasser entfärbt. Unter Bestrahlung mit UV-Licht (312 nm) fluoresziert das an die DNA angelagerte Ethidiumbromid. Zur Dokumentation und Auswertung wurden die Agarosegele fotografiert.
2.2.8 Minipräparation von Plasmid DNA
Die Plasmidminipräparation erfolgte entweder mit dem "QIAprep Plasmid MiniPrep Kit" (Qiagen, Hilden) oder mit dem "NucleoSpin^® Plasmid Miniprep Kit" (Macherey-Nagel, Düren), jeweils nach der vom Hersteller angebenen Methode. Diese Methoden basieren auf der Bindung von DNA an Silicagel Membranen bei hohen Konzentrationen von chaotropen Salzen. Die Elution erfolgt mit niedrig konzentrierten Salz-Puffern oder mit Wasser. Mit diese Methode wird die DNA somit von anderen Zellbestandteilen getrennt und in hoher Reinheit erhalten.
2.2.9 DNA-Fragmentisolierung aus Agarosegelen
Die Gel-Bande des zu reinigenden DNA-Fragments wurde unter UV-Licht mit einem Skalpell sauber ausgeschnitten und mit dem "GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit" nach Angaben des Herstellers (Amersham Pharmacia Biotech, UK) gereinigt. Um Mutationen in den DNA-Fragmenten zu vermeiden, wurde bei der Fragmentisolierung darauf geachtet, dass die UV-Bestrahlungszeit nur sehr kurz war.
2.2.10 Sequenzanalyse
Die Sequenzen wurden mit HUSAR (DKFZ, Heidelberg) unter Nutzung der Fragment Assemblierungsprogramme, die Teil des WISCONCIN Packets Version 10.2 sind (Acrylrys, ehemals Genetics Computer Group (GCG), Madison; Wisc.); analysiert. Sequenzen wurden in das Projekt geladen, Bestandteile vom Klonierungsvektor und Phagenbank-Vektor halbautomatisch entfernt und anschließend zu durchgehenden Sequenzen (Contig's) assembliert. Sequenzvergleich gegen die Datenbanken SWISSPROT, TREMBL, PIR und OWL wurde mittels des BLASTX2 Algorithmus [2] durchgeführt.
Ein phylogenetischer Stammbaum wurde mit dem Programm PHYLIP 3.5 erstellt. Ausgehend vom CLUSTALX-Sequenzvergleich der in 26 dargestellten Proteine wurden mittels SEQBOOT einhundert Punktmutationsreihen erstellt (random seed number: 5). PROTPARS erstellt die Stammbäume der einhundert Punktmutionsreihen, indem die evolutionären Abstände zwischen den Proteinen berechnet werden. Mit CONSENS wird aus den einhundert Stammbäumen der wahrscheinlichste berechnet. Die Entfernung zweier Proteine im phylogenetischen Stammbaum beruht auf der Anzahl von Mutationen, die auf DNA-Ebene notwen dig sind, um die Sequenz des einen Proteins dem anderen anzugleichen. Der genetische Code wird dabei berücksichtigt. So sind z.B. drei Punktmutationen für einen Gln/Cys Austausch notwendig. Die unterschiedlichen Mutationsraten von Organismen werden allerdings nicht einbezogen.
2.2.11 Expression des rekombinanten Proteins
Die Expression des rekombinanten Proteins erfolgte im E. coli-Stamm SG 13009. Die Expressionsklone wurden zunächst bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6–0,8 in LB-Medium (mit Carbenicillin und Kanamycin) bei 37 °C inkubiert. Nach Induktion der Expression mit IPTG (Endkonzentration: 1 mM) wurden die Bakterien 2 oder 7 Tage bei 10 °C kultiviert.
2.2.12 Zellaufschluß
Die E. coli-Zellen wurden 20 min bei 4000 ×g und 4abzentrifugiert °C und in Lysispuffer (50 mM Tris⋅HCl, 10 % Glycerin, 0,1 % Tween, 0,5 M NaCl, pH 7,5) aufgenommen (7 ml Lysispuffer pro 250 ml Zellkultur). Mit Ultraschall (zehnmal 1 min, 50 % Leistung, 50 % Impuls) wurden die Zellen aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden 30 min bei 4000 × g 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand mit den löslichen Proteinen wurde abgenommen und bei 4 °C aufbewahrt. Die Aktivität der rekombinant hergestellten Lipoxygenase wurde mit diesem Lysat analysiert.
2.2.13 Aktivitätstest
Mit Linolsäure als Substrat wurde die Lipoxygenase auf Aktivität getestet. Im Gegensatz zum Substrat mit seinen isolierten Doppelbindugen besitzen die gebildeten Hydro(pero)xide durch ihre konjugiertes Dien-System ein Absorptionsmaximum bei 234 nm. Aufgrund der hohen Eigenabsorption des Zelllysates erfolgte diese Bestimmung nicht Spektrophotometer. Die Produkte der Fettsäureumsetzung wurden daher mittels Normal-Phasen-HPLC durchgeführt (s. Abschnitt 2.2.16). Die Umsetzung erfolgte nach dem im folgenden angegebenen Protokoll bei pH 6 und 8.
2.2.14 Bestimmung des pH-Optimums
800 μl der Enzymlösung (s. Abschnitt 2.2.12) wurden mit 1,2 ml pH-Puffer (100 mM Na-Phosphat, pH 5,5–8; 100 mM Tris⋅HCl, pH 8–9,5) und 1 μl (250 μg) Linolsäure versetzt. Die Reaktion erfolgte für 30 min in einem offenem 15 ml-Gefäß bei Raumtemperatur. Die entstandenen Hydroperoxid-Derivate wurden durch Zugabe eines Krümels (≈ 2 mm³) Natriumborhydrid zu den entsprechenden Hydroxid-Derivaten der Fettsäuren reduziert. Nach 2 min wurde mit 100 μl Eisessig auf pH 3 angesäuert um die Reduktion abzustoppen und die Hydroxide der Fettsäuren für die folgende Extraktion in die nicht-ionische Form zu überführen. Um die Produkte zu isolieren, erfolgte eine Extraktion mit Methanol und Chloroform [12] mit einem Verhältnis wässrige Phase/Methanol/Chloroform von 1:1:1 (v/v/v). Nach 10 min Zentrifugation bei 4000 × g zur Phasentrennung wurde die Chloroformphase in ein 1,5 ml-Gefäß überführt, im Stickstoffstrom vollständig eingedampft und dann in dem entsprechenden Laufmittel für die HPLC aufgenommen.
2.2.15 Bestimmung der Substratspezifität
Der Umsatz erfolgte wie oben beschrieben (Abschnitt 2.2.14) bei pH 8,2 mit jeweils 250 μg Substrat. Die unterschiedlichen Substrate lagen in Ethanol gelöst in ungleicher Konzentrationen vor. Die dadurch bedingten abweichenden Volumina Substrat wurden durch Zugabe reinen Ethanols ausgeglichen, um einen Einfluss des Ethanols auf die Aktivität des möglicherweise Membran-assoziierten Enzyms zu nivellieren.
2.2.16 Normal-Phasen-HPLC
Die gebildeten Positionsisomere wurden mit Geräten der AGILENT SERIES IIOO (Hewlett Packard, Waldbronn) unter Benutzung von Normal-Phasen-Säulen (50 × 4,6 mm, 3 μm LUNA SILICA (2), Phenomenex, Aschaffenburg oder 150 × 2,1 mm, 5 μm, ZORBAX RX-SIL, Hewlett Packard, Waldronn) und einem Dioden-Array Detektor analysiert. Bei Verwendung der LUNA SILICA-Säule wurde als Laufmittel ein Gemisch aus Hexan/iso-Propanol/TCA (99:1:0,02, v/v/v, isokratischer Fluß 1 ml/min, 20 min) verwendet, wohingegen bei der ZORBAX RX-SIL-Säule ein Mischungsverhältnis von 98:2:0,02 (v/v/v, isokratischer Fluß 250 μl/min, 20 min) eingesetzt wurde. Da für die Untersuchung der Hydroxide der langkettigen Fettsäuren eine höhere Trennschärfe erforderlich war, wurde für die Untersuchung der Substratspezifität für alle Substrate als unpolareres Laufmittel auf der ZORBAX RX-SIL Säule Hexan/iso-Propanol/TCA im Verhältnis 99:1:0,02 (v/v/v, isokratischer Fluß 250 μl/min, 60 min) benutzt. Zur Identifizierung der gebildeten Hydroxyfettsäuren dienten Standards von Cayman Chemicals (USA). Nicht erwerbliche Hydroxid-Derivate wurden durch Vergleich mit Autooxidationsprodukten (Abschnitt 2.2.18) sowie durch GC/MS (Abschnitt 2.2.19) identifiziert. Die Datenaufnahme und -auswertung erfolgte mit der Software CHEMSTATION FOR LC ₃D (Rev. A.08.01 (783)) von Agilent Technologies, Waldbronn.
2.2.17 Chiral-Phasen-HPLC
Die per Normal-Phasen HPLC gereinigten Fettsäure-Hydroxide wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Systems (Abschnitt 2.2.16), ausgestattet mit einer Chiral-Phasen- Säule (150 × 2,1 mm, 5 μm Daicel Chemical Industrien Ltd. CHIRACEL OD-H, Merk, Darmstadt), auf deren Enantiomeren-Zusammensetzung untersucht. Für die Hydroxide der Linolsäure und α-Linolensäure wurde als Laufmittel Hexan/iso-Propanol/TCA (95:5:0,02, v/v/v, isokratischer Fluß 100 μl/min 20 min) verwendet und für die Hydroxid-Derivate der γ-Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, Docosapentaensäure sowie Docosahexaensäure wurde das Laufmittel Hexan/iso-Propanol/TCA im Verhältnis 98:2:0,02 (v/v/v, isokratischer Fluß 100 μl/min 60 min). Die Datenaufnahme und -auswertung erfolgte mit der Software CHEMSTATION FOR LC ₃D (Rev. A.08.01 (783)) von Agilent Technologies, Waldronn.
2.2.18 Autooxidation von Fettsäuren
250 μg der Fettsäuren wurden in 100 μl Methanol aufgenommen, mit 800 μl eines 100 mM Tris⋅HCl Puffers, pH 9,0 versetzt, eine Spatelspitze Eisen-(II)-sulfat hinzugegeben und die Lösung für 1 h bei 80 °C inkubiert. Alle 10 min wurde hierbei Luft in die Proben eingeblasen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur erfolgte die Zugabe eines Krümels (≈ 2 mm³) Natriumborhydrid zur Reduktion der Hydroperoxide der Fettsäuren zu den entsprechenden Hydroxid-Derivaten. Durch Ansäuerung mit 100 μl Eisessig auf pH 3 nach zwei Minuten wird diese Reaktion gestoppt und die Hydroxide der Fettsäuren in die ungeladene Form überführt für die folgende Extraktion. Die Extraktion erfolgte zweimal mit 1 ml n-Heptan. Um die Phasen zu trennen wurden die Proben zentrifugiert. Die beiden organischen Phasen wurden vereinigt, im Stickstoffstrom vollständig eingedampft und in dem entsprechenden HPLC-Laufmittel aufgenommen.
2.2.19 Derivatisierung von Hydroxyfettsäuren und GC/MS Analysen
Für die GC/MS Analyse werden Hydroxyfettsäuren derivatisiert, um ihre Flüchtigkeit sowie thermische Stabilität zu erhöhen und um die Polarität zu senken [20]. Dadurch wird die gaschromatographische Trennung erhöht und die Detektierbarkeit verbessert. Die Derivatsierung von Hydroxyfettsäuren zu ihren Methylester-Trimethylsilylethern erlaubt die Identifizierung der Verbindung und die Bestimmung der Position der Hydroxy-Gruppe [91].

Ein Viertel des Umsatzes der Ansätze für die Substratbestimmung (Abschnitt 2.2.15) wurde mittels Normal-Phasen-HPLC gereinigt. Die spekulativen Hydroxide der Fettsäuren (Absoption bei 234–237 nm) wurden aufgefangen, im Stickstoffsvom vollständig eingedampft und in 400 μl Methanol aufgenommen. Zur Methylierung wurden dazu 10 μl der EDAC-Stammlösung (100 mg/ml) gegeben und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zugabe von 200 μl 100 mM Tris·HCl, pH 7,5 zur Phasenausbildung wurde zweimal mit 1 ml n-Hexan ausgeschüttelt. Die Hexanphasen wurden nach Vereinigung im Stickstoffstom verdampft. Nach Aufnahme des Methylierungsproduktes in 3 μl Acetonitril wurde 1 μl BSTFA- Regisil (1 %) zur Silylierung zugegeben und die GC/MS Analyse durchgeführt. Die GC/MS Analysen unter folgenden Analysebedingungen von Dr. C. Göbel (IPK, Gatersleben) durchgeführt:

GC	Agilent 6890 Serie
Inj.-Volumen	4 μl (manuell)
Trägergas	Helium, lineare Flußgeschwindigkeit 1,2 ml/min
Trennsäule	30 m × 0,25 mm HP-5MS (Crosslinked 5 % PH ME Siloxane); 0,25 μm Filmdicke; Temperaturprogramm: 60 °C (Inj.-Temperatur) → 25 °C/min → 300 °C (1 min) → 10 °C/min → 270 °C (10 min)
MS	Agilent 5973 Network
Ionisierunsenergie	70 eV
Scangeschwindigkeit	1 scan/s

Die Datenaufnahme und -auswertung erfolgte mit der Software GI70ICA Version C.00.00 von Agilent Technologies, Waldbronn.
2.2.20 Reinigung von PtLOX
Zur Reinigung der Proteine wurden die Zellen wie unter 2.2.12 beschrieben aufgeschlossen, die Zelltrümmer abzentrifugiert und der Überstand über Nacht bei 4 °C mit "TALON^® Metal Affinity Resin" inkubiert. Die Bindungkapazität beträgt laut Hersteller 5 mg/ml Bettvolumen. Für den Proteinüberstand, der aus 500 ml Zellkultur gewonnen wurde, sind 250– 500 μl TALON^® eingesetzt worden. Anschließend wurde das Säulenmaterial auf eine Leersäule (T.J. Baker, Phillipsburg, N. J., USA) gegeben. Zunächst wurde mit dem zwanzigfachen Säu1envolumen Na-Phosphat-Puffer (50 mM, 300 mM NaCl, pH 8,0) gewaschen. Um die optimalen Reinigungsbedingungen festzustellen, wurde mit jeweils einfachen Bettvolumen von Na-Phosphat-Puffer (50 mM, 150 mM NaCl, pH 8,0) mit steigender Imidazolkonzentration (10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM und 300 mM Imidazol) eluiert. Jeder Elutionsschritt wurde vollständig aufgefangen, mit 10 % Glycerin versetzt und bei -80 °C eingefroren. Nach der Proteinbestimmung [16] wurden jeweils 4 μg Protein auf ein SDS-Proteingel aufgetragen sowie ein Western-Blot durchgeführt, um festzustellen, in welcher(en) Fraktion(en) sich das gereinigte Protein befand.
Die Elution unter optimierten Bedingungen erfolgt mit dreimal mit einfachem Bettvolumen Na-Phosphat-Puffer (50 mM, 150 mM NaCl, pH 8,0) mit 125 mM Imidazol. Anschließende Elution mit 300 sowie 500 mM Imidazol wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass von dem zu reinigenden Protein tatsächlich nichts am TALON® verbleibt. Untersucht wurde dies wieder mittels SDS-PAGE und Western-Blot.
2.2.21 Proteinbestimmung [16]
Die Proteinbestimmung erfolgte mit "BIO-RAD Protein Assay) der Firma Bio-Rad (Hercules, USA) gemäß Herstellerangaben unter Benutzung einer BSA Eichgerade.
2.2.22 SDS-Polyacrylamid-Gelelelktrophorese (SDS-PAGE [54], modifizierte Methode)
Für die SDS-PAGE wurden eine Minigelapparatur von Bio-Rad, Hercules, USA verwendet. Die Proteinproben wurden direkt mit Probenpuffer versetzt oder mit TCA (Trichloressigsäure) gefällt. Dazu wurde 1 ml Probe mit 250 μl 30 %-iger TCA für 30 min auf Eis inkubiert, anschließend 10 min bei 14000 × g zentrifugiert und das erhaltene Präzipitat nochmals mit Wasser gewaschen. Nach der Zentrifugation und der Abnahme des wässrigen Überstandes wurde das Präzipitat geerocknet und in "Roti^®-Load 1" Probenpuffer gelöst. Vor dem Auftragen wurden die Proben 3 min bei 15000 × g zentrifugiert. Alternativ wurden das Präzipitat bei sehr geringen Mengen Protein (≈ 4 μg) nach der TCA-Fällung direkt in "Roti^®-Load 1" Probenpuffer aufgenommen und solange 1 N NaOH zugegeben, bis die gelbe Färbung nach blau umschlug. Die Auftrennung der Proben erfolgte elektrophoretisch in einem 8 %-igem Polyacrylamidgel (Trenngel: 2,15 ml Wasser, 1,2 ml Acrylamid/Merhylbisacrylamid (30 %/ 0,8 %), 1,1 ml 4 × Trenngelpuffer, 14 μl APS (50 %), 3,5 μl TEMED; Sammelgel: 0,87 ml Wasser, 0,24 ml Acrylamid/Methylbisacrylamid (30 %/0,8 %) 0,375 ml 4 × Sammelgelpuffer, 6 μl APS, 3 μl (50 %)). Der Probeneinlauf in das Sammelgel erfolgte für 25 min bei 12,5 mA pro Gel. Die Auftrennung der Proteine im Trenngel wurde bei einer Stromstärke von 25 mA pro Gel für 40 min durchgeführt, bzw. bis die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht hatte. Die aufgetrennten Proteine wurden im Gel angefärbt.
2.2.23 Coomasie-Färbung von Proteingelen
Die Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen wurden nach Herstellerangaben mit dem GELCODE^® Blue Stain Reagent der Firma Pierce (Rockford, IL, USA) angefärbt.
2.2.24 Silberfärbung von Proteingelen [13]
Zur Silberfärbung wurde das Gel dreimal 30 min mit Ethanol/Essigsäure/Wasser (30:5:65, v/v/v) fixiert und anschließend dreimal 10 min mit Wasser gewaschen. Sensibilisierung erfolgte durch Inkubation mit 0,02 %-iger Na-Thiosulfat-Lösung (frisch hergestellt) für 1 min, woraufhin zweimal 1 min mit Wasser gewaschen wurde. Nach Imprägnierung mit Silbernitratlösung (0,025 % Formaldehyd, 0,0125 % AgNO₃) für 30 min wurde darauf geachtet höchstens 15 sek (5–15 sek) mit Wasser zu waschen. Die Inkubation mit Entwicklerlösung (3 % Kaliumcarbonat, 0,01 % Formaldehyd, 0,001 % Na-Thiosulfat) erfolgte solange, bis das Proteingel hinreichend gefärbt war (1–10 min) Abgestoppt wurde durch mehrmaliges Spülen mit 1 %-iger Essigsäure, woraufhin einmal mit dest. Wasser gewaschen wurde.
2.2.2 Western Blot
Nach der elektrophoretischen Auftrennung in einem 8 %-igem Proteingel [54] wurden die Proteine unter Verwendung von Transferpuffer auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (Minigelapparatur von Biorad, Hercules, USA; 75 min mit 65 V). Die Membran wurde 4 h bei Raumtemperatur mit 1 %-iger Ovalbuminlösung (PBST) blockiert und anschließend mit PBST kurz gewaschen. Der primäre Antikörper (anti-Cslb-LOX (1:1000) und anti-his (1:2500)) wurde mit PBST (1 % BSA) verdünnt und 1 h mit der Membran inkubiert. Im Anschluß wurde die Membran dreimal 10 min in PBST gewaschen. Für den kolorimetrischen Nachweis wurde das entsprechende ALP-Konjugat in der Verdünnung 1:5000 1 h mit der Membran inkubiert, zweimal 5 min in PBST gewaschen, einmal 5 min mit PBS und einmal 10 min in AP-Puffer. NBT/BCIP wurde entsprechend der Herstellerangabe in AP-Puffer verdünnt eingesetzt.
3 Ergebnisse
Es wird zuerst beschrieben, wie die Sequenz einer mutmaßlichen Lipoxygenase aus der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum per 5'-RACE verlängert wurde. Die isolierte RNA der Kieselalge P. tricornutum lag in Form einer "Lambda Zap II Express"-cDNA-Bank vor, in die sie gerichtet kloniert wurde. Der zugrunde liegende Vektor war pBK-CMV. Die vollständige Sequenz wurde anschließend in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert. Die folgende biochemische Charakterisierung des rekombinanten aktiven Enzyms umfasste die Bestimmung des pH-Optimums und der Substratspezifität. Da viele der gebildeten Hydroxyfettsäuren nicht als Standardsubstanzen zugänglich waren, wurden sie als kombinierte Methylester- und Trimethylsilylether-Derivate mittels GC/MS-Analyse charakterisiert. Außerdem wurde eine Reinigung für das rekombinante Enzym begonnen.
3.1 Klonierung
Im Rahmen eines Forschungsprojektes wurde von der BASF Plant Science GmbH aus der Kieselalge P. tricornutum eine cDNA-Bank erstellt. Nachdem in diesem Rahmen eine in vivo Exzission durchgeführt wurde, die Plasmide wiedergewonnen sowie in E. coli DH10B transformiert worden waren, wurde automatisiert Plasmid DNA gewonnen und eine Zufallssequen zierung durch die Kettenabruch-Methode durchgeführt. Es wurden 8400 Klone am 5'-Ende sequenziert, zu 3400 nicht-redundanten Sequenzen (Contig's) zusammengefügt und diese annotiert. Durch anschließende Analyse der so entstandenen Datenbank wurden zwei Klone über ihre 5'-Sequenz identifiziert, die Homologien zu pflanzlichen LOXen zeigten. Eine davon war die in dieser Arbeit beschriebene LOX aus P. tricornutum (LOX2:Pt:1 (PtLOX1), Klon Pt001077095r) zeigte auf DNA-Ebene im sequenzierten Bereich von 800 bp des 5'-Endes mit 42 % die größte Homologie zur LOXl aus Pisum sativum. Zur Verifizierung dieses Befundes wurde dann das 3'-Ende dieses cDNA-Klones sequenziert (4, grüne Fragmente). Im Bereich von 170 bp oberhalb des 3'-Ende betrug die Homologie 55 % zur selben LOX aus Pisum sativum. Gleichzeitig zeigte dieser Sequenzvergleich, dass mutmaßlich rund 500 bp vom offenen Leserahmen (ORF) am 5'-Ende fehlten.
3.1.1 Sequenzverlängerung durch 5'-RACE
Ausgehend von der bekannten Sequenz wurde im 5'-Bereich der genspezifischer Primer PrLOX2_5RACE(1) (5'-GAG CCC CTG TCT TCT CGG TAT TG) abgeleitet. Durch 5'-RACE mit diesem genspezifischen und dem vektorspezifischen Primer T3 (5'-GCT CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG) wurden die in 4 dargestellten Fragmente verschiedener Länge erhalten, welche die bekannte Sequenz um rund 650 bp in 5'-Richtung verlängerten (s. Anhang, Seite 67). Eine weitere Sequenzverlängerung mit dem Primer PtLOX2_5RACE(2) (5'-CAATAT CGA TCA AAC CTC GCT AC), der 677 bp aufwärts vom ersten 5'-RACE-Primer bindet, konnte nicht erreicht werden. Aufgrund von Sequenzvergleichen mit pflanzlichen LOXen wur
Abbildung 4: Übersicht über die PtLOX1-Sequenzen. Die grün hervorgehobenen Sequenzen von Klon Pt001077095r ergaben sich aus der Zufallssequenzierung von 8400 Klonen einer cDNA-Bank der Kieselalge P. tricornutum. Mittels 5'-RACE wurden die blau hervorgehobenen Sequenzen gewonnen (s. Anhang, Seite 67). Die Pfeile kennzeichnen die im Text erwähnten Primer. Die obere Kurve zeigt die Güte der Sequenzinformation an, die über die Anzahl und das Maß der Übereinstimmung der Sequenzen definiert ist. de jedoch angenommen, dass die erhaltene Sequenzinformation dennoch ausreichen würde, um Primer abzuleiten, mit der die vollständige DNA-Sequenz der PtLOX1 aus der zugrundeliegenden Phagen-Bank amplifiziert und kloniert werden kann. Da dies jedoch nicht gelang, wurde die vollständige Sequenz aus zwei überlappenden Fragmenten zusammengesetzt. Als Voraussetzung für die Entwicklung der Klonierungsstrategie wurde jener cDNA-Klon, der mittels der Zufallssequenzierung identifiziert worden war (Pt001077095r), zunächst vollständig sequenziert.
3.1.2 Gewinnung der vollständigen cDNA-Sequenz
Ein Bereich von 1336 bp (Fragment 1), der das 5'-Ende der PtLOX Sequenz darstellt, wurde mittels der Primer A (5'-GGT ACC ATG ATG CTC AAC CGG TTG AC) und B (5'-AAA TTC CCGAGC AAA CTC GT) aus der cDNA-Bank von P. tricornutum amplifiziert (vergl. 4). Mit Primer A, der das Startcodon ATG enthält, wurde die Restriktionsschnittstelle für KpnI eingeführt. Das zweite Fragment des Gens lag im pBK Vektor pBK-CMV in Form des Klones vor, mit dem die beiden EST's erhalten wurden. Im überlappenden Bereich von 787 bp der beiden Fragmente befindet sich die in der Sequenz unikal schneidende Restriktionsschnittstelle für SalI. Um die Restriktionsschnittstelle für Hind III am 3'-Ende des zweiten Fragments mit dem Primer C einzuführen, wurde dieses Fragment mit dem Primer M13-rev (5'-GGAAACAGC TAT GAC CAT G) und dem Primer C (5'-CCC AAG CTT CTA TAT GGT GAT GCT GTT GGG CAC) mittels PCR amplifiziert. Beide Fragmente wurden zunächst in den Vektor pGEM-T kloniert und anschließend über unikale sowie mittels PCR eingeführte Restriktionsschnittstellen in pQE30 zur vollständigen Gensequenz zusammengesetzt (5). Über die Abbildung 5: Angewendete Strategie für die Klonierung von PtLX1. gelb Bereich der Überlappung von Fragment eins und zwei, rot Restriktionsschnittstelle für Hind III, grün Restriktionsschnittstelle für Kpn I, blau Restriktionsschnittstelle für Sal I Siehe Text bezüglich detaillierter Erläuterungen.
Restriktionsschnittstellen für SalI und Hind III wurde das Fragment 2 mit dem Expressionsvektor pQE30 ligiert. Nach dem entsprechenden Restriktionsverdau wurde dieses Konstrukt unter Benutzung der Restriktionsschnittstellen für Kpn I sowie Sal I mit Fragment 1 ligiert. Um das Risiko der Einführung einer Mutation möglichst gering zu halten, waren jeweils zwei bzw drei Bakterienkolonien für die Klonierungsexperimente verwendet worden, die das Fragment 1 bzw. 2 enthielten. Nachdem alle getesteten der Klone aktiv waren (Abschnitt 3.3), wurde der Klon mit der Nummer ([52 – 1] + 43)– 1– 1 als PtLOX1 bezeichnet und alle weiteren Tests mit diesem Klon durchgeführt.
3.2 Sequenzanalyse der PtLOX1
Der vollständige cNDA-Klon wurde dann sequenziert, wobei sich die bekannte Sequenz (Übersicht in 4) bestätigte. Mithilfe des BLASTX2-Algorithmus wurde für die vollständige PtLOX1-Sequenz mit 43 % die höchste Homologie zur AtLOX 3 gefunden, einer 13-LOX vom Typ 2, aus Arabidopsis thaliana. Dieses Ergebnis wurde durch den im Rahmen dieser Arbeit erstellten phylogenetischen Stammbaum bestätigt (26). Der ORF von PtLOX1 besteht aus 938 Aminosäuren und hat ein berechnetes Molekulargewicht von 105 kDa. Dabei wurden mögliche Glykosilierungen im Herkunftsorganismus P. tricornutum nicht berücksichtigt. Der berechnete isoelektrische Punkt liegt bei pH 6,69. Ungewöhnlich ist der Anfang der Proteinsequenz mit zwei Methioninen. Das erste Methionin wird als Start-Codon der Translation angesehen und wurde für die Klonierung verwendet. Die cDNA ist in 5'-Richtung 66 bp länger als der für die Klonierung verwendete Sequenzbereich. Da sich kein Start-Methionin in dieser Region befindet, wurde sie als untranslatierter Bereich am 5'-Ende angesehen. Mit der vollständigen Sequenz von PtLOX1 wurde eine Analyse mit dem Programm PSORT auf HUSAR bezüglich möglicher Signalsequenzen durchgeführt. Da diese Datenbank keine chloroplastidären Signalsequenzen berücksichtigt, wurde nur eine 50 %-ige Wahrscheinlichkeit für ein plastidäre Lokalisation gefunden. Der Sequenzvergleich der PtLOX1 mit anderen bekannten LOX-Sequenzen hatte jedoch ergeben, dass die PtLOX1 zur Gruppe der 13-LOXen vom Typ 2 gehört, für die eine chloroplastidäre Signalsequenz charakteristisch ist. Anhand des phylogenetischen Stammbaum (26) wird jedoch ersichtlich, das diese Zuordnung mit einem hohen Unsicherheitsfaktor belastet ist, da PtLOX1 dort ungefähr die gleiche Entfernung zu 13- und 9-LOXen vom Typ 2 aufweist. Zudem sind einige LOXen in diesem Stammbaum falsch eingeordnet, da es sich z.B. bei LOX1:Cs:1, LOX1:Cs:3 und LOX1:Hv:3 um 13-LOXen handelt und nicht um 9-LOXen. Trotzdem kann für die PtLOX1 eine plastidäre Lokalisation diskutiert werden (Abschnitt 4.1.1). Aufgrund geringerer Sicherheitsmodi wurde eine Analyse mit anderen Datenbanken nicht durchgeführt.
Im Vergleich mit anderen pflanzlichen LOX zeigt PtLOX1 einige interessante Unterschiede auf der Ebene der Proteinsequenz. So sind im aktiven Zentrum von LOXen drei Determinanten bestimmt worden, die Einfluss auf die Substrat- und Positionsspezifität haben, wobei die BORNGRÄBER- und SLOANE-Determinante hervorzuheben sind (zusammengefasst in [28]). So wurde am Boden der Bindungstasche bei allen pflanzlichen LOXen ein höchst konserviertes Arginin identifiziert, das bei der Umwandlung der Lipidkörper 13-LOX aus Gurke in eine 9-LOX eine kritische Rolle spielt (R758 der CslbLOX) [47]. Dieses Arginin tritt unabhängig von der Substrat- und Positionsspezifität auf und ihm geht in über 90 % der Fälle ein Asparagin voran. Als einzige Ausnahme decken sich in PtLOX1 zwei Histidin mit diesem Asparagin-Arginin-Tandem. Konserviert ist hingegen die Aminosäure, die sich im Sequenzvergleich mit der SLOANE-Determinante [76] deckt. An dieser Stelle befindet sich in 9-LOXen eine kleine Aminosäure wie Valin und in 13-LOXen eine große wie Phenylalanin. Eine Ausnahme bilden die oben erwähnten LOX1:Cs:1 und LOX1:Cs:3 (H statt F) sowie LOX1:Hv:3 (V statt F). Diese Diskrepanz mag ihre Ursache darin haben, dass in diesen Fällen keine "klassischen" 13-LOX vorliegen [32]. In PtLOX1 liegt jedoch die voluminöse Aminosäure Phenylalanin vor, wie für eine 13-LOX erwartet. An der Position im Sequenzvergleich, die sich mit der BORN-GRÄBER-Determinante deckt, ist ist es schwieriger konservierte Unterschiede zwischen 13- und 9 LOXen zu finden. Meist findet man eine Kombination aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, die von der kleinen Aminosäure Glycin oder der hydrophoben Aminosäure Cystein getrennt werden (z.B. S515, G516, V517 in LOX1:Nt:1). Bezüglich der Kombination von hydrophober-/hydrophiler Aminosäure finden sich konservierte Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. PtLOX1 unterscheidet sich dahingehend von allen anderen LOXen, dass bei ihr zwei hydrophobe Aminosäuren von der hydrophilen Aminosäure Threonin getrennt werden. Der C-Terminus ist wie bei allen anderen LOXen hoch konserviert, mit dem kleinen Unterschied, dass sich an vorletzter Position Threonin anstatt Serin befindet, wie bei allen anderen LOXen.
3.3 Biochemische Charakterisierung der PtLOX1
Zunächst wurde überprüft, ob das rekombinante Enzym aktiv war. Da Linolsäure ein generelles Substrat für LOXen darstellt [32], wurde die Aktivität des Enzyms zunächst gegenüber dieser Fettsäure bestimmt. Aufgrund der hohen Eigenabsorption des Rohextraktes nach dem Aufschluss der E. coli-Zellen, erfolgte diese Bestimmung nicht am Spektrophotometer. Die Produkte der Fettsäureumsetzung wurden mittels Normal-Phasen-HPLC analysiert. Es zeigte sich, dass alle getesteten Klone aktiv waren, da bei der Umsetzung mit Linolsäure 13-HODE in S-Konfiguration entstand. Bei der Zusammensetzung des 5' und 3' Bereichs der Sequenz im Zuge der Klonierung wurden sechs verschiedene Kombinationen erhalten (Abschnitt 3.1.2}. Von jeder Kombination wurden zwei Klone getestet.
Im Anschluss wurde der pH-Wert bestimmt, bei dem das Enzym die maximale Aktivität zeigt. Dabei wurde auch der Frage nachgegangen, ob sich die Produkt- und Regiospezifität des Enzyms in diesem pH-Bereich ändert. Außerdem wurde untersucht, welche anderen Fettsäuren als Substrate von der PtLOX1 akzeptiert werden. Dabei wurden zum einen die Struktur der entstandenen Hydroxyfettsäuren genauer analysiert und zum anderen auch das bevorzugte Substrat dieses Enzyms ermittelt.
3.3.1 pH-Optimum
Das pH-Optimum wurde mittels einer Endpunktbestimmung mit Hilfe der Normal-Phasen-HPLC für die Umsetzung von Linolsäure ermittelt. Für die Analysen wurden Zellaufschlüsse (Abschnitt 2.2.12) der Proteinexpression bei 10 °C verwendet. Die Lysate wurden sofort nach ihrer Herstellung weiter verwendet, um die Stabilität der Proteine durch Einfrieren und Autauen der Proben nicht herabzusetzen. Die Zellaufschlüsse wurden mit Linolsäure inkubiert und die entstandenen Hydroperoxid-Derivate mit Natriumborhydrid zu den entsprechenden Hydroxiden reduziert, die nach der sauren Extraktion mittels Normal-Phasen-HPLC (SP-HPLC) analysiert wurden. Ausgewertet wurden die Flächen der integrierten HODE-Signale bei 234 nm und der Linolsäure bei 202 nm. Aus 6 ist ersichtlich, dass die maximale Aktivität der PtOX1 für Linolsäure bei pH-Werten zwischen pH 8,0 und pH 8,4 erreicht wird.
Abbildung 6: pH-Optimum von rekombinanter PtLOX1. Linolsäure wurde im Substrat-Überschuß für 30 min mit Enzymrohextrakt inkubiert und die entstandenen Hydroperoxide zu den Hydroxiden reduziert. Nach saurer Extraktion wurde das Substrat-Produktspektrum mittels SP-HPLC analysiert. Die Summe der Fläche aller integrierten HODE-Signale bei 234 nm wurde ins Verhältnis zur Fläche des integrierten Linolsäure-Signals bei 202 nm gesetzt. Die Darstellung zeigt den Durchschnitt und den Standardfehler für zwei Experimente.
3.3.2 Analyse der Regiospezifität gegenüber Linolsäure
Ein charakteristisches Merkmal von LOXen ist ihre Regiospezifität bei der Einfühung von molekularen Sauerstoff [28]. Da Linolsäure sowohl im Tierreich als auch im Pflanzenreich ein Substrat für LOXen darstellt und im Gegensatz dazu Arachidonsäure im Pflanzenreich nicht oder nur in Speicherlipiden auftritt, werden pflanzliche LOXen in Bezug auf die Positionsspezifität der Oxygenierung von Linolsäure klassifiziert [36]. Sauerstoff kann entweder am Kohlenstoffatom 9 (9-LOX) oder 13 (13-LOX) der Linolsäure eingeführt werden.
Die Trennung der gebildeten Regioisomere erfolgte wiederum mittels SP-HPLC nach der Reduktion der Hydroperoxide zu den entsprechenden Hydroxiden [51]. Dabei wurden Standards der jeweiligen Hydroxid-Derivate vor oder nach den Messungen der Zellaufschluss-Extrakre eingesetzt und die Retentionszeiten der Signale miteinander verglichen. Das Verhältnis von 9- zu 13-HODE wurde durch Integration der jeweiligen Signale bei 234 nm ermittelt. In 7 wurde für jeden pH-Wert das Verhältnis von Gesamtprodukt zu Substrat gebildet und außerdem der jeweilige Anteil von 13- und 9-HODE am Gesamtprodukt dargestellt. Das Verhältnis von 13- zu 9-HODE ist außerdem in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Vorhersage aus dem Sequenzvergleich (26 und Abschnitt 3.2), dass es sich bei PtLOX1 um eine 13-LOX handelt, wurde somit durch biochemische Daten bestätigt.
Durch die Analyse der Enantiomeren-Zusammensetzung mittels Chiral-Phasen-HPLC (CP-HPLC) kann zwischen den Produkten der enzymatischen Lipidperoxidation und der nicht-enzymatischen Autoxidation unterschieden werden. Die Umsetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch pflanzliche LOXen führt zur Bildung der Hydroxid-Derivate in S-Konfiguration, wohingegen bei der Autoxidation die Enantiomere in einem racemischen Verhältnis entstehen [32]. Wie 7 zeigt, liegen über das gesamte untersuchte pH-Spektrum mehr als 90 % des gemessenen 13-HODE in S-Konfiguration vor, wohingegen das Verhältnis der 9-HODE-Enatitiomere racemisch ist. Da die Menge des bei den verschiedenen pH-Werten gebildeten 9-HODE mit der Enzymaktivität korreliert, ist die Bildung dieses Hydroxid-Derivates möglicherweise nicht autoxidativen Vorgängen geschuldet, sondern resultiert aus einer enzymatischen Aktivität (s. 7 und Tabelle 3). Die Nebenprodukte bei der Umsetzung von Linolsäure durch LOXen unter aeroben Bedingungen, sind die Ketooctadecadiensäuren (KODEs), welche ein Absorptionsmaximum bei 273 nm besitzen. Bei der Linolsäure-Umsetzung durch die PtLOX1 wurden keine KODE gebildet durch PtLOX1.
Tabelle 3: Regiospezifität von PtLOX1 gegenüber Linolsäure. Das R/S-Verhältnis von 13-HODE betrug über den gesamten pH-Bereich 7%/93%, wohingegen 9-HODE racemisch war. Diese Daten sind Bestandteil der Abbildung 7.
Abbildung 7: Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1 in Bezug auf Linolsäure. Linolsäure wurde im Substrat-Überschuss für 30 min mit Enzymrohextrakt inkubiert und die entstandenen Hydroperoxide zu den Hydroxiden reduziert. Nach saurer Extraktion wurde das Substrat-Produktspektrum mittels SP-HPLC analysiert. Die integrierten Signale von 9-HODE und 13-HODE bei 234nm wurde ins Verhältnis zum integrierten Linolsäure-Signal bei 202 nm gesetzt. Die Darstellung zeigt den Durchschnitt und den Standardfehler für zwei Experimente.
3.3.3 Substratspezifität von PtLOX1 und Analyse der gbildeten Regioisomere
Um aufzuklären, welche vielfach ungesättigten Fettsäuren von PtLOX1 als Substrate akzeptiert werden und welche Regioisomere dabei bevorzugt entstehen, wurden sieben verschiedene Fettsäuren eingesetzt: Linolsäure (LA), α-Linolensäure (α-LEA), γ-Linolensäure (γ-LEA), Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA), Docosapentaensäure (DPA) und Docosahexaensäure (DHA). Diese Fettsäuren unterscheiden sich in ihrer Länge sowie in der Anzahl und Position der Doppelbindungen (s. Tabelle 4). Mit Ausnahme von LA kommen in diesen Fettsäuren für die initiale Wasserstoff Abstraktion durch das nicht-Haem Eisen im reaktiven Zentrum der LOXen mehrere bisallylische Methylengruppen in Frage. Durch die [+2]- und [-2]-Radikalumlagerung an jeder bisallylischen Methylengruppe kann die Sauerstoffanlagerung daher zur Bildung von je vier Hydroperoxid-Derivaten aus α-LEA (9-, 13-, 12-, 16-α-HPOTE) und γ-LEA (6-, 10-, 9-, 13-γ-HPOTE), sechs aus ARA (5-, 9-, 8-, 12-, 11-, 15- HPETE), acht aus EPA (5-, 9-, 8-, 12-, 11-, 15-, 14-, 18-HEPE), acht aus DPA (7-, 11-, 10-, 14-, 13-, 17-, 16-, 20-HPDPE) und zehn aus DHA (4-, 8-, 7-, 11-, 10-, 14-, 13-, 17-, 16-, 20-HPDHE) führen.
Um einen ersten Hinweis zu erhalten, welche der vielfach ungesättigten Fettsäuren PtLOX1 als bevorzugte Substrate dienen, wurde in 8 für jedes Substrat die Summe der inte grierten Signale aller Hydroxid-Derivate, die nach der Reduktion der entsprechenden Hydroperoxide entstanden, aufgetragen. Dabei wurden die unterschiedlichen Extinktionskoeffizien
Abbildung 8: Substratspezifität von rekombinanter PtLOX1. Das Enzym wurde mit verschiedenen Substraten bei pH 8,4 inkubiert und die Produktanalyse mittels SP-HPLO durchgeführt. Für den Umsatz jeder Fettsäure wurde die Summe der integrierten Signale aller Hydroxid-Derivate aufgetragen. Die unterschiedlichen Extinktionskoeffizienten der Hydroxide wurden bei der Integration nicht berücksichtigt. Die Darstellung zeigt den Durchschnitt und den Standardfehler von zwei Experimenten. ten der Hydroxid-Derivate (bei 234 nm) nicht berücksichtigt, da sie nicht für alle der gebildeten Hydroxide bekannt sind. Der Vergleich des molaren Extinktionskoeffizienten von HOTE (ε = 23.000 l/mol⋅cm, 234 nm) mit dem von HETE (ε = 27.0001/mol⋅cm 236 nm) lässt darauf schließen, dass dieser Wert mit steigender Anzahl an Doppelbindungen zunimmt. Aus diesem Grunde ist die bevorzugte Umsetzung von ARA gegenüber γ-LEA nicht ganz so ausgeprägt wie im Diagramm dargestellt. Nichtsdestoweniger kann man aus diesem Diagramm schließen, dass die C₂₀-Fettsäuren Arachidonsäure und Eicosapentaensäure bevorzugt umgesetzt werden im Vergleich zu C₁₈- und C₂₂-Fettsäuren. Die Identifizierung der Regioisomere der gebildeten Hydroxide dieser Fettsäuren erfolgte entweder über Standards, die bei den jeweiligen HPLC-Analysen eingesetzt wurden oder mittels GC/MS-Analysen (Abschnitt 2.2.19 und 3.3.4). Es stellte sich heraus (Tabelle 4), dass von den in Frage kommenden bisallylischen Methylengruppen für jedes Substrat hauptsächlich nur eine für die initiale Entfernung von Wasserstoff benutzt wurde. Dies betraf die Methylengruppe an Position (n-8) im Fall von LA und α-LEA und jeweils (n-11) für γ-LEA, ARA, EPA, DPA und DHA. Unter der Vorausserzung, dass bei 13-LOXen das Substrat mit dem Methylende voran in die Bindungstasche ein taucht [32], kann man abschätzen, dass der Abstand des Wasserstoffakzeptor und dem Boden der Bindungstasche rund elf Methylengruppen beträgt. Ein Überblick über alle Umsetzungen, auf die nun näher eingegangen wird, liefert Tabelle 4. Tabelle 4: Überblick über die Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1.
Wie schon in Abschnitt 3.3.2 behandelt, führt die Umsetzung von Linolsäure zur 90 % zur Bildung von 13-HODE in S-Konfiguration. Das Chromatogram der SP-HPLC-Analyse ist in 9 dargestellt. Die Kontroll-Umsetzung wurde durchgeführt mit dem Zellaufschluss von SG 13009 Zellen, die den Leervektor trugen. Wie schon oben (Abschnitt 3.3.2) erläurert, zeigt das Chromatogram dieser Umsetzung (9, unterer Teil), dass 9-HODE enzymatisch gebildet wurde und nicht durch Autoxidation entsteht. Auch für die anderen Fettsäuren wurden jeweils gleiche Mengen des Umsatzes der Fettsäure mit rekombinanter PtLOX1 und der Kontroll-Umsetzung analysiert.
Für α-LEA als Substrat beträgt der Anteil der beiden möglichen Oxidationsprodukte in [+2]- und [-2]-Position bezüglich des Kohlenstoffs (n-8) an den gesamt gebildeten Hydro(pero)xid-Derivaten (10) 92 % und ist damit mit dem Umsatz von LA vergleichbar. Das Verhältnis der [+2]- zu [-2]-Oxidationsprodukte sinkt von 6,7 für 13-/9-HODE auf 2,7 für 13-/9-α-HOTE. Der Faktor 6,7/2,7 ≈ 2,5 der damit berechnet werden kann, wurde bei der Änderung der Anzahl der Doppelbindungen oder der Anzahl der Methylengruppen noch häufiger beobachtet. Die denkbaren Hydroxylierunsprodukte von α-LEA 12- und 16-α-HOTE, die bei initialer Wasserstoffentfernung an C₁₄ (n-5) entstehen können, haben einen vernachlässigbar kleinen Anteil an den Hydro(pero)xy-Derivaten von α-LEA.
Abbildung 9: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der SP-HPLC des Umsatzes von Linolsäure (18:2 all-cis-Δ^9,12) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4. Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 13-HODE, B 9-HODE
Abbildung 10: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der SP-HPLC des Umsatzes von α-Linolensäure (18:3 all-cis-Δ^9,12,15) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4. Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 13-α-HOTE, B 12-α-HOTE, C 9-α-HOTE
Bei γ-LEA in 11, wurde die bisallylische Methylengruppe in Position (n-11) bevorzugt durch den Wasserstoffakzeptor angegriffen, was zur Bildung von 10- und 6-γ-HOTE führt. Die Methylengruppe an Position (n-8), bei der die Hydro(pero)xid-Derivate 13- und 9-α-HOTE entstehen, spielen mit einem Gesamtanteil von rund 17 % an den gesamten Hydro(pero)xid-Derivaten eher eine untergeordnete Rolle. Aber auch hier ist das Verhältnis zugunsten des [+2]-Hydro(pero)xid-Derivates. Das Verhältnis der Hauptprodukte 10- zu 6-γ-HOTE ist vergleichbar mit dem von 13- zu 9-α-HOTE von α-LEA. Für LA, α-LEA und γ-LEA ist das jeweilige [-2]-Hydro(pero)xid-Derivat racemisch.
Abbildung 11: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der Normal-Phasen SP-HPLC des Umsatzes von γ-Linolensäure (18:3 all-cis-Δ^6,9,12) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4. Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 13-γ-HOTE, B 10-γ-HOTE, C 6-γ-HOTE
Bei Arachidonsäure (12) erfolgt die Hydro(pero)xydierung an Position [+2] und in geringem Maße an Position [-2] bezüglich der bisallylischen Methylengruppe an Position (n-11). Das Verhältnis der Hydro(pero)xylierung an Position [+2] zu [-2] ist deutlich in Richtung [+2] verschoben im Vergleich zu α- oder γ-LEA. Hier wird beobachtet, was schon erwähnt wurde und auch später wieder beobachtet wurde: Beim Vergleich zweier Fettsäuren bezüglich der Methylengruppe, von der Wasserstoff abstrahiert wurde, führte die Einführung einer Doppelbindung in "[-X]"-Position, also am Carboxy-Ende, zu einer Verschiebung der Hydro(pero)xydierung zugunsten der [+2]-Produktes, ebenso wie die Einführung zweier Methylengruppen in "[+X]"-Position (am Methylende). Umgekehrt kommt es zu einer Verschiebung zugunsten des [-2]-Produktes, wenn eine Doppelbindung in "[+X]"-Position eingeführt wurde (wie schon bei γ- und α-LEA beobachtet), oder zwei Methylengruppen in "[-X]"-Position (dem Carboxylende) hinzukamen. Bezüglich des [+2] zu [-2] Verhältnisses wurde im ersten Fall eine Erhöhung um Faktor 2-4 beobachtet und im zweiten Fall eine Erniedrigung um Faktor 2-4. Diese Beobachtung ist rein empirisch und muss diskutiert werden. Es sollte hervorgehoben werden, dass hierbei lediglich Charakteristika bezüglich der Position der betreffenden bisallylischen Methylengruppe beschrieben werden, die in keiner Weise die biochemische Einführung von Merhylengruppen oder Doppelbindungen reflektieren. Im Vergleich zu α- und γ-LEA ist Arachidonsäure bezüglich der benutzten bisallylischen Methylengruppe in "[+X]"-Position zwei Merhylengruppen länger (×4) und in "[-X]"-Position kommt eine Doppelbindung hinzu (×4). Daraus resultiert eine Erhöhung des Verhältnisses der [+2]- zu [-2]-Hydro(pero)xid-Derivate 12-HETE zu 8-HETE von 4 × 4 = 16 im Vergleich zu den entsprechenden Produkten bei γ-LEA: 2,8 × 16 = 44,8. Das gemessene Verhältnis von 12-HETE zu 8-HETE beträgt 46,3 (97 %:2,1 %). Das Hauptprodukt 12-HETE lag unerwarteterweise nur zu 79 % in S-Konfiguration vor, obwohl die vergleichende Analyse in 8 dafür spricht, dass ARA oder EPA die bevorzugten Substrate darstellen. Das Nebenprodukt 8-HETE lag in S-Konfiguration vor.
12: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der SP-HPLC des Umsatzes von Arachidonsäure (20:4 all-cis-Δ^5,8,11,14) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4. Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 12-HETE, B 8-HETE Gemäß obiger Erläuterungen erniedrigt die Einführung einer Doppelbindung am Methylende bei EPA im Vergleich zu ARA das Verhältnis von [+2] zu [-2] der gebildeten Hydroxid- Derivate bezüglich der bisallylischen Methylengruppe. Als einzige Ausnahme in der Reihe lässt sich das Ausmaß der Erniedrigung um Faktor sechzehn hier nicht erklären, da die eben erwähnte Doppelbindung in allen anderen Fällen zu einer Veränderung um Faktor 2-4 führte (LA/ α-LEA, γ-LEA/ARA, DPA/DHA). Das Verhältnis von 12- zu 8-HEPE beträgt hier also 46,3/(4 × 4) = 2,9 ≈ 3,01 (75,1 %:24,9 %). Beide Hydroxid-Derivate liegen nahezu 100 % in S-Konfiguration vor.
Abbildung 13: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der SP-HPLC des Umsatzes von Eicosapentaensäure (20:5 all-cis-Δ^5,8,11,14,17) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4. Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 12-HEPE, B 8-HEPE
Die Verlängerung um zwei Methylengruppen auf der Carboxyseite bezüglich der bisallylischen Methylengruppe (n-9) von DPA (14) erniedrigt erwartungsgemäß das Verhältnis der Oxidationsprodukte an Position [+2] zu [-2] im Vergleich zu EPA. Auch ist der Faktor mit 3 im Rahmen dessen, was mit obiger Ausnahme immer beobachtet wurde. 14- zu 10-HDPE wurde im Verhältnis 3/(3) = 1 (51 %:49 %) gebildet. Wie schon bei Arachidonsäure ist der Anteil der S-Konfiguration am Hauptprodukt (hier 14-HDPE) mit 68 % erstaunlich niedrig.
Auch der Vergleich der Umsetzung von DHA (15) mit der von DPA passt sich gut in das Bild ein: Die zusätzliche Doppelbindung auf der Carboxyseite der (n-9) Methylengruppe begünstigt die Bildung des [+2]-Produktes, mithin von 14-HDHE. Im Vergleich zum (51 % : 49 %) Verhältnis von 14- zu 10-HDPE ist das Verhältnis von 14- zu 10-HDHE um den Faktor 2,9 erhöht und beträgt somit 2,9 = 74,3 %:25,7 %. Für das Hauptprodukt
Abbildung 14: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der SP-HPLC des Umsatzes von Docosapentaensäure (22:5 all-cis-Δ^{7,10,13,16,19}) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4. Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 14-HDPE, B 10-HDP 14-HDHE wurde bei der CP-Analyse eine Aufspaltung des Signals des S-Positionsisomers festgestellt. Ein dazu nahezu identisches Chromatogram wurde auch bei einer von vier Chiral-Phasen-Analysen von 12-HEPE beobachtet, daher wurde das R zu S Verhältnis von I 4-HDHE in Tabelle 4 auf Grundlage der Signale R₁ und S₁ in 15 berechnet. Gegebenenfalls müsste diese Analyse noch einmal durchgeführt werden.
Bei Arachidonsäure wurden die oben erwähnten (Abschnitt 3.3.2) Nebenprodukte bei aeroben Verhältnissen, namentlich die Keto-Säuren, in äußerst geringem Ausmaß von 1,2 % bei 273 nm detektiert. Außerdem traten sie bei der Umsetzung von DPA und DHA mit jeweils rund 0,7 % auf.
3.3.4 GC/MS-Analyse der Fettsäure-Hydroxide
Die Produkte der Umsetzung von PtLOX1 mit LA, α-LEA und γ-LEA konnten mir Standards eindeutig durch die Normal-Phasen HPLC identifiziert werden. Von den möglichen Hydroxiden ist 10-γ-HOTE nicht als Standard verftigbar gewesen. Auch der Vergleich mit den Autoxidationsprodukten der γ-LEA führte nicht zu einer sicheren Identifizierung. Daher wurden für die Identifizierung der restlichen Hydroxide der eingesetzten Fettsäuren in Zusammenarbeit mit Frau Dr. C. Göbel (IPK, Gatersleben) GC/MS Analysen durchgeführt. Hierfür wurden die Hydroxide der Fettsäuren in ihre kombinierten Methylester- und Trimethylsilylether-
Abbildung 15: Analyse der Substrat- und Regiospezifität von rekombinanter PtLOX1. Chromatogram der SP-HPLC des Umsatzes von Docosahexaensäure (22:6 all-cis-Δ^{4,7,10,13,16,19}) durch PtLOX1 und durch den Kontrollansatz bei pH 8,4, Eingesetzt sind die Chiral-Phasen Analysen der Hydroxide: A 14-HDHE, B 10-HDPE Derivate überführt, um ihre Flüchtigkeit sowie thermische Stabilität zu erhöhen und um die Polarität zu senken [20]. Dadurch wird die gaschromatographische Trennung erhöht und die Detektierbarkeit verbessert. Die derivatisierten Fettsäuren hatten bei den Analysen eine Retentionszeit zwischen 16 min und 20 min. In diesem Bereich des Chromatograms wurden die im folgenden dargestellten Massenspektren aufgenommen. Meist wurde ein charakteristisches Fragment des Zerfalls der Verbindung im Massenspektrum detektiert, wobei zusätzlich Signale das Molgewicht der unfragmentierten Verbindung, das M-15-Signal(ohne Methylgruppe) und das M-31-Signal (ohne Methoxy-Gruppe) detektiert wurden. Die möglichen Zerfallsprodukte sind mit ihren Molgewichten in dem jeweiligen Diagramm dargestellt. Der charakteristischen Zerfall erlaubt die Identifizierung der Verbindung und die Bestimmung der Position der Hydroxy-Gruppe [91].
Wie in 16 ersichtlich, wurde anhand der charakteristischen Massen (im Diagram dargestellt) somit bestätigt; dass es sich bei der fraglichen Verbindung des γ-LEA-Umsatzes um 10-γ-HOTE handelte. Auch 8-HETE, für das nach der HPLC-Analyse keine eindeutige Aussage getroffen werden konnte, wurde auf diese Weise verifiziert (17).
Mit Ausnahme von dem mutmaßlichen 10-HDHE konnten alle Hydroxide der Fettsäuren EPA, DPA DHA bestimmt werden. 18 und 19 zeigen die Massenspektren der identifizieren Produkte der Umsetzung von PtLOX1 mir EPA, 12-HEPE bzw. 8-HEPE. Die Hydroxide von DPA erwiesen sich als 14-HDPE (20) und 10-HDPE (21). Da mir zunehmender Kettenlänge der zu analysierenden Verbindung das Zerfallsmuster unspezifischer wird, fällt die Identifizierung in diesem Maße immer schwerer. So konnte 14-HDHE (22) noch identifiziert werden, aufgrund verschiedener Limitierungen, die schon bei 8-HETE, 8-HEPE und 10-HDPE auftraten, gelang die Analyse von 10-HDHE nicht. Aufgrund mechanistischer Überlegungen sowie der Tatsache, dass sich die Produkte von ARA und EPA gleichen (12-/8-HETE, 12-/8-HEPE) und auch 14-HDPE sein Equivalent in Form von 14-HDHE hat, ist davon auszugehen, dass es sich tatsächlich um 10-HDHE handelt.
Abbildung 16: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 10-HOTE identifiziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
Abbildung 17: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 8-HETE identifiziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
Abbildung 18: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 12-HEPE identifiziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
Abbildung 19: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 8-HEPE identifziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
Abbildung 20: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 14-HDPE identifiziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
Abbildung 21: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 10-HDPE identifiziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
Abbildung 22: GC-MS-Analyse von Hydroxyfettsäuren. Anhand des dargestellten Massenspektrum des Methylester/TMS Derivat der unbekannten Hydroxyfettsäure wurde die Verbindung als 14-HDHE identifiziert. Das Masse/Ladungsverhältnis der charakteristischen Peaks sowie die Massen der möglichen Fragmente wurde angegeben. ()*-Molgewicht, Molgewicht-Methylgruppe (-15), Molgewicht-Methoxygruppe (-31)
3.4 Reinigung des Enzyms
Für eine detaillierte kinetische Untersuchung der PtLOX1 sollte das rekombinante Enzym zunächst aufgereinigt werden. Dazu wurde PtLOX1 im Vektor pQE30 mir einem N-terminalen hexa-Histidin-Tag exprimiert und anschließend eine Affinitätsreinigung mit TALON^® durchgeführt. Diese Reinigung basiert auf der Komplexierung des am TALON^® fixierten Cobalts durch Histidin. Die Elution des Proteins erfolgt über kompetitive Verdrängung des Histidins durch Imidazol oder einem Chelator zweiwertiger Metallionen (z.B. EDTA). Alternativ kann durch Senkung des pH-Wertes eluiert werden, da protoniertes Histidin vom dem zweiwertigen Metall abgestoßen wird.
3.4.1 SDS-PAGE and Western-Blot Analyse der Reinigung
Zunächst wurde das Protein in E. coli nach IPTG-Zugabe rund 60 h bei 10°C produziert. Dann wurden verschiedene Methoden zur Elution des affinitätsgebundenen Proteins verwendet: Elution mit EDTA bzw Imidazol sowie durch Senkung des pH-Wertes. In 23a ist die SDS-PAGE zur Untersuchung der optimalen Elutionsbedingungen mir Imidazol dargestellt. Das zu reinigende Protein hat eine berechnete Größe von 105 kDa. In diesem Bereich waren deutlich mehrere Proteinbanden bei der Auftragung des Zellaufschlusses nach der Induktion und in den Fraktionen der Elution mit Imidazol zu erkennen (23a, schwarzer und roter Pfeil). Um zu verifizieren, dass es sich bei einer der Banden im Bereich von 105 kDa um PtLOX1 handelte, wurde die in 23b dargestellte Immunodetektion durchgeführt. Es wurde dafür ein monospezifischer Antikörper verwendet, der gegen die Lipidkörper-LOX der Gurke (Cslb-LOX) gerichtet war [44]. Dieser Antikörper weist die meisten anderen pflanzlichen LOXen aufgrund seiner hohen Kreuzreaktivität nach. hohe Kreuzreaktivität gegenüber anderen LOXen auf. Auch im Western-Blot wurde vor allem eine Bande knapp unterhalb von 105 kDa detektiert (23b, Spur 5, roter Pfeil) Die Vielzahl der mir der Immunodetektion erhaltenen, vermutlich unspezifischen, Signale resultieren möglicherweise aus der Art der Antikörper-Gewinnung. Für das gereinigte rekombinante Protein (Cslb-LOX) wurde das selbe Expressionssystem verwendet wie für die PtLOX1 (Vektor pQE30 in SG 13009 E.coli-Zellen). Aus diesem Grunde zeigt die Antikörperfraktion, die mit der gereinigten rekombinanten Cslb-LOX erhalten wurde, auch Reaktivität gegen andere Proteine aus diesem System, die daher in allen Fraktionen, auch der Leervektorreinigung, detektiert wurden.
Das Ergebnis der SDS-PAGE und des Western-Blots zusammengenommen bedeutete, dass PtLOX1 nicht an das TALON^® bindet. Eine vergleichende Aktivitätsbestimmung zwischen den einzelnen Proteinfraktionen könnte Klärung verschaffen bei Einsatz von jeweils gleichen Mengen an Protein. Da bei diesem Experiment lediglich genug Protein für ein SDS-Gel und eine
Abbildung 23: Reinigung von rekombinanter PtLOX1 – A mit Silber gefärbtes SDS-Gel, B mit α-CslbLOX/IgG-ALP gefärbter Western-Blot. Der rote Pfeil kennzeichnet PtLOX1. 1 Proteinstandard, 2 Kontrolle (Lysat von SG 13009-Zellen, die mit Leervektor pQE30 transformiert wurden), 3 Lysat von SG 13009-Zellen (transformiert mit PtLOX1 in pQE30) vor Induktion mit IPTG, 4 Lysat von SG 13009-Zellen (transformiert mit PtLOX1 in pQE30) nach Induktion mit IPTG 5 Durchfluss nach Affinitätsbindung des bakteriellen Proteinextraktes an TALON^®, 6 Waschschritt mit Na-Phosphat Puffer, 7-15 Elution mit Imidazol steigender Konzentration: 10 mM, 30 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM, 30 mM Western-Blot-Analyse vorhanden war, konnte dies mir dieser Reinigung nicht weiter verfolgt werden. Daher wurde eine erneute Reinigung im präparativen Maßstab durchgeführt. Es wurde auch mit EDTA und durch das Senken des pH-Wertes eluiert, wobei konsequenterweise das selbe Ergebnis erhalten wurde, da PtLOX1 nicht an das TALON^® band.
3.4.2 Präparative Reinigung
Für die präparative Reinigung wurde unter modifizierten Bedingungen das rekombinante Protein exprimiert. Nach Induktion der Translation mit IPTG erfolgte eine weitere Inkubation über Nacht bei 28°C und über die Dauer von sieben Tagen bei 10 °C. Statt stufenweiser Elution (Abschnitt 3.4.1) wurde hier nur mit 5 mM Imidazol gewaschen und das an der Säule verbliebene Protein im Anschluß mit 125 mM Imidazol eluiert {s. Abschnitt 2.2.20). Die Reinigung bestätigt, dass nur in den Fraktionen der Reinigung nach Expression von PtLOX1 bei 10 °C das als PtLOX1 identifizierte Protein vorhanden war (24, Spur 19, 20, roter Pfeil). Der Western-Blot der Expression bei 10°C (25b) bestätigt, dass PtLOX1 nicht an das TALON^® band, da wieder im Durchfluss sowie in der Na-Phosphat Waschfraktion eine Bande der richtigen Größe detektiert wurde (Spur 19 u. 20, roter Pfeil). Weder bei der Reinigung des Zelllysates nach der Expression des Leervektors, noch bei der Expression von
Abbildung 24: mit Coomasie gefärbtes SDS-Gel der präparativen Reinigung von rekombinanter PtLOX1 aus E coli. Der rote Pfeil kennzeichnet PtLOX1. Es wurden SG 13009 Zellen mit folgenden Vektoren transformiert und unter den im Text angegebenen Bedingungen nach IPTG Zugabe exprimiert: 1-8 pQE30 28 °C, 9-72 u. 15-18 PtLOX1 (Expression bei 28 °C), 79-26 PtLOX1 (Expression bei 10 °C) 1,9,19 Durchfluss nach Affinitätsbindung des bakteriellen Proteinextraktes an TALON^®, 2,10,20 Waschschritt mit Na-Phosphat Puffer, 3,11,21 Waschschritt mit 5 mM Imidazol, 13,14 Proteinstandard; Elution mit Imidazol: 4,12,22 125 mM-1, 5, 75,23 125 mM-2, 6,16,24 125 mM-3, 7,17,25 300 mM, 8,18,26 500 mM
PtLOXl bei 28 °C ist in 24 an dieser Stelle eine Proteinbande deutlich erkennbar.
Als zusätzliche Bestätigung der Western-Bloe-Analysen wurde eine Aktivitätsbestimmung für Tabelle 5: Analyse der Aktivität einzelner Fraktionen der präparativen Reinigung von PtLOX1. Dargestellt sind die Ergebnisse für die Expression rekombinanter PtLOX1 bei 10 °C nach IPTG-Zugabe. Es wurden jeweils 40 μg Protein und 250 μg Substrat eingesetzt, 2 h inkubiert und gleiche Mengen per Normal-Phasen HPLC analysiert.
ausgewählte Fraktionen der Reinigungen von rekombinanter PtLOX1, die bei 20 °C bzw bei 28 °C exprimiert wurden, mit jeweils gleichen Mengen an Protein durchgeführt (Abschnitt 2.2.14). Die Auswertung für die Reinigung von rekombinanter PtLOX, die bei 10 °C exprimiert wurde, ist in Tabelle 5 dargestellt. Die Enzymaktivität der Expression von PtLOX1 bei 28 °C war nicht auswertbar. Als Maß für die Aktivität wurde die Summe der Flächen von 13- und 9-HODE herangezogen. Um autoxidative Prozesse abzuschätzen wurde das Verhältnis von 13- zu 9-HODE zusätzlich angegeben. Es zeigte sich, dass die LOX-Aktivität ausschließlich im Durchfluss und in der Waschfraktion zu messen ist. Es sollte hervorgehoben werden, dass der zum Waschen verwendete Na-Phophat-Puffer kein Imidazol enthielt. Somit bestätigte
Abbildung 25: Präparative Reinigung von PtLOX1. SG 13009 Zeilen wurden mit PtLOX1 transformiert und nach IPTG Zugabe bei 10 °C rund 60 h exprimiert. – A mit Coomasie gefärbtes SDS-Gel, B mit α-CslbLOX/IgG-ALP gefärbter Western-Blot. Der rote Pfeil kennzeichnet PtLOX1. 19 Durchfluss nach Affinitätsbindung des bakteriellen Proteinextraktes an TALON^®, 20 Waschschritt mit Na-Phosphat Puffer, 21 Waschschritt mit 5 mM Imidazol, 22-26 Elution mit Imidazol: 125 mM-1, 125 mM-2, 125 mM-3, 300 mM, 500 mM sich, dass PtLOX1 nicht an TALON^® bindet. Der aktive Klon PtLOX1 wurde nun im Expressionsvektor pQE30 durchsequenziert, wobei bei der Benutzung der Vektor-spezifischen Primer für die Sequenzierung der äußeren Enden von PtLOX1 (3'- und 5'-Ende) die Sequenzierung fehl schlug. Eine nochmalige Sequenzierung mit diesen Primern wäre aber notwendig um zu bestätigen, dass der Vektor pQE30 tatsächlich die sechs Histidinreste in seiner kodierenden Sequenz enthält.
Insgesamt belegen die durchgeführten Analysen, dass das erhaltene Enzym weder in ausreichender Reinheit noch in genügenden Mengen, die für die geplanten kinetischen Messungen benötigt werden, gewonnen werden konnte.
4 Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine LOX aus der Kieselalge P. tricornutum isoliert und rekombinant in E. coli exprimiert. Bisher wurde keine isolierte Sequenz beschrieben, die eine LOX aus Kieselalgen kodiert. Die LOX weist im Vergleich zu pflanzlichen LOXen eine außergewöhnliche Subsrratspezifität auf.
4.1 Klonierung der Lipoxygenase
In 26 ist die Einordnung der LOX aus P. tricornutum in den phylogenetischen Stammbaum pflanzlicher Lipoxygenasen dargestellt. Der Übersichtlichkeit halber wurde nur eine Auswahl pflanzlicher LOXen berücksichtigt. Es ist offensichtlich, dass alle Typ 1- und Typ 2-LOX individuelle Äste dieses Stammbaums bilden. Zudem bilden 9- und 13-LOXen Gruppen, in denen sich Untergruppen abzeichnen, wie jene der Mono- und Dikotyledonen. Einige LOXen sind in diesem Stammbaum falsch eingeordnet, da es sich z.B. bei LOX1:Cs1, LOX1:Cs:3 und LOX1:Hv:3 um 13-LOXen handelt und nicht um 9-LOXen. Da diese Ausnahmen jedoch eine eingeschränkte Spezifität für 13-Lipoxygenierung haben, ist es möglich, dass es sich nicht um "klassische" 13-LOXen handelt [32].
Die Zuordnung von PtLOX1 zur Gruppe der 13-LOXen vom Typ 2 is mit einem hohen Unsicherheitsfaktor belastet, da sie im Stammbaum ungefähr die gleiche Entfernung zu 13- und 9-LOXen vom Typ 1 aufweist. Bei LOXen vom Typ 2 handelt es sich um LOXen chloroplastidärer Signalsequenz. Tabelle 6 zeigt eine statistische Analyse eines Ausschnitts des Sequenzvergleichs, dar dem Phylogeniebaum zugrundeliegt. Für diese Tabelle wurde der Ver Tabelle 6: Statistische Analyse eines Ausschnitts des Phylogeniebaumes in Abbildung 26. Die Analyse wurde mit dem Programm GENDOC mit einem Ausschnitt des CLUSTALX-Alignments durchgeführt. Aus jeder Gruppe bzw. Untergruppe wurde jeweils der Vertreter mit der höchsten Homologie zu PtLOX ausgewählt. Der obere Wert kennzeichnet den Prozentsatz identischer Aminosäuren, der untere den ähnlicher Aminosäuren (konservative Substitutionen). Zu den Bezeichnungen siehe Abbildung 26.
treter aus den einzelnen Gruppen mit PtLOX1 verglichen, der jeweils die höchsten Homologie mit PtLOX1 aufwies. Insofern sich Untergruppen innerhalb der Gruppen zeigten, wurden die LOX innerhalb der Untergruppe mit der höchsten Homologie zu PtLOX1 ebenfalls berücksichtigt. PtLOX1 weist zu den Vertretern der verschiedenen Gruppen relativ geringe Homolo
Abbildung 26: Phylogenetischer Stammbaum. Die Analyse wurde mit dem Programm PHYLIP 3.5 durchgeführt (siehe Seite 15). Die verwendeten Bezeichnungen der Proteine sind auf die entsprechenden accession numbers in der Datenbank bezogen. Zur Vereinfachung wurden die Sequenzen nur bestimmter Pflanzenspezies verwendet und diese teilweise nach der Nomenklatur von Shibata [73] umbenannt (übernommen mit freundlicher Genehmigung von Dr. C. Göbel): Arabidopsis thaliana: LOX1:At:1 (AtLOX1, Q06327), LOX2:At:1 (AtLOX2, P38418), LOX2:At:2 (AtLOX3, AAF79461), LOX2:At:3 (AtLOX4, AAF21176), LOX1:At:2 (AtLOX5, CAC19365), LOX2:At:4 (AtLOX6, AAG52309); Cucumis sativus: LOX1:Cs:1 (AAC61785), LOX1:Cs:2 (CsULOX, AAA79186), LOX1:Cs:3 (CsLBLOX, CAA63483), LOX1:Cs:4 (CAB83038); Glycine max: LOX1:Gm:1 (Soybean LOX1, AAA33986), LOX1:Gm:2 (Soybean LOX2, AAA33987), LOX1:Gm:3 (Soybean LOX3; CAA31664), LOX1:Gm:4 (Soybean vixa, BAA03101), LOX1:Gm:5 (Soybean vixb, AAB67732), LOX1:Gm:6 (Soybean vixc, AAA96817), LOX1:Gm:7 (Soybean vixd, S13381), LOX1:Gm:8 (Soybean vixe, AAC49159); Hordeum vulgare: LOX1:Hv:1 (HvLOXA, Barley LOXA, AAA64893), LOX1:Hv:2 (HvLOXB, Barley LOXB, AAB60715), LOX1:Hv:3 (HvLOXC, Barley LOXC, AAB70865), LOX2:Hv:1 (HvLOX1, AAC12951); Lycopersicon esculentum: LOX1:Le:1 (tomLOXA, P38415), LOX1:Le:2 (tomLOXB, P38416), LOX1:Le:3 (tomLOX-tox, AAG21691), LOX2:Le:1 (tomLOXC, AAB65766), LOX2:Le:2 (tomLOXD, AAB65767); Nicotiana tabacum: LOX1:Nt:1 (NtLOX, S57964); Oryza sativa: LOX1:Os:1 (CAA45738), LOX2:Os:1 (ORYSALOXC, BAA03102), LOX2:Os:2 (OsLOX, CAC01439); Pisum sativum: LOX1:Ps:1 (AAB71759), LOX1:Ps:2 (CAA55318), LOX1:Ps:3 (CAA55319), LOX1:Ps:4 (Pea LOX, CAA30666), LOX1:Ps:5 (Pea LOX2, CAA34906), LOX1:Ps:6 (Pea LOXG, CAA53730), LOX1:Ps:7 (CAC04380); Solanum tuberosum: LOX1:St:1 (SOLTULOX1, S44940), LOX1:St:2 (STLOX, AAD09202), LOX1:St:3 (StLOX1, S73865), LOX1:St:4 (CAA64766), LOX1:St:5 (CAA64765), LOX1:St:6 (POTLX-2, AAB67860) LOX1:St:7 (POTLX-3, AAB67865), LOX1:St:8 (POTLX1, AAB67858), LOX1:St:9 (AAD04258), LOX1:St:10 (pLOX2, AAB81595), LOX1:St:11 (pLOX1, AAB81594), LOX1:St:12 (CAB65460), LOX2:St:1 (StLOXH1, CAA65268), LOX2:St:2 (StLOXH3, CAA65269).
gie auf der Basis des Sequenzvergleichs auf. Der durchschnittliche Wett der Homologie unter Einbeziehung jeweils aller Vertreter der 9- und 13-LOXen vom Typ 1 beträgt jeweils 36 %. Bemerkenswert ist, dass PtLOX1 auch innerhalb der Gruppe der 13-LOXen vom Typ 2 durchschnittlich nur 33 % Homologie aufweist, anstatt der unter den Gruppenmitgliedern sonst üblichen 45 % (s. Tabelle 7). All diese Befunde sprechen dafür, dass die Abspaltung von PtLOX1 von der Entwicklung der LOXen höherer Pflanzen während der Evolution relativ früh eintrat. Dies ist in Übereinstimmung mit dem evolutionären Abstand zwischen Kieselalgen und höheren Pflanzen, der auch auf anderen Ebenen gefunden wird. Tabelle 7: Homologie der LOX-Gruppen zueinander. Schnittpunkte der Gruppe mit sich selber entsprechen der Homologie der LOXen innerhalb der Gruppe. Grundlage der Berechnung mit GENEDOC bildete der Sequenzvergleich der Sequenzen in Abbildung 26. Es wurde der Durchschnittswert der Kombination aller Sequenzen gebildet, die für den jeweilligen Vergleich relevant waren (zwischen 130 und 900 Kombinationen). Angaben in Prozent.
4.1.1 Zelluläre Lokalisation
Die intrazellulare Lokalisation wird als Hinweis auf die physiologische Funktion von LOXen betrachtet (zusammengefasst in [32]). Ein gleichzeitiges Auftreten von LOXen wurde in Vakuolen, im Cytoplasma und in Plastiden beobachtet. Es wird angenommen, das die zeitliche und räumliche Trennung der Aktivität verschiedener LOX-Isoformen die Grundlage für die Beschreiten eines der sechs verschiedenen Reaktionswege für LOX-Produkte bildet (s Abschnitt 1.1.3) [32]. Zumindest in zwei Fällen wurde nachgewiesen, dass das Auftreten einer Lipidkörper LOX bei der Mobilisierung von Speicherlipiden eine Rolle spielt [29] und eine chloroplastidäre LOX essenziell für Die Jasmonsäüre-Synthese ist [21].
Gemäß dem phylogenetischen Stammbaum in 26 gehört PtLOX1 scheinbar den LOXen vom Typ 2 an, welche durch eine chloroplastidäre Signalsequenzen charakterisiert sind. Allerdings ist, wie im vorherigen Abschnitt diskutiert, der evolutionäre Abstand zu allen Gruppen der LOXen ungefähr gleich groß. Zudem sind einige LOXen in dem Stammbaum falsch eingeordnet, da es sich z.B. bei LOX1:Cs:3 und LOX1:Hv:3 um 13-LOXen handelt und nicht um 9-LOXen, wie man dem Stammbaum entnehmen könnte. Da somit nicht eindeutig ist, ob PtLOX1 nun tatsächlich eher vom ZOX2-Typ ist oder vom ZOX1-Typ, wurde genauer untersucht, ob PtLOX1 eine Signalsequenz aufweist. Im Sequenzvergleich mit einer Auswahl pflanzlicher LOXen (26), weist PtLOX1, wie alle LOXen vom LOX2-Typus, eine N-terminale Verlängerung von rund 50 AS im Vergleich zu LOXen vom Typ 1 auf. Dies spricht stark für eine plastidäre Signalsequenz, da aber PtLOX1 mutmaßlich evolutionär weit entfernt ist von LOXen höherer Pflanzen, kann dies auch andere Ursachen haben.
Chloroplastidäre Signalsequenzen, auch Transitpeptide genannt, können sehr unterschiedlich in Bezug auf ihre Aminosäuresequenz sein, aber enthalten gewisse diagnostische Merkmale. Sie haben außergewöhnlich hohen Grad an hydroxylierten Aminosäuren (Serin, Threonin) und sind zudem immer positiv geladen. Die pro-Proteine weisen eine Schnittstelle für Signal-Peptidasen auf die in Landpflanzen und Chlamydomonas eingeschränkt konserviert ist [55]. Aufgrund dieser relativ schlechten Identifizierbarkeit wurden Programme entwickelt, mit denen eine Vorhersage für diese Transitpeptide getroffen werden kann.
Wie schon erwähnt, konnte aufgrund geringer Sicherheitsmodi keine Analyse mit Programmen wie CHLOROP [22] oder dem moderneren PCLR [68] für PtLOX1 durchgeführt werden. CHLOROP basiert auf einem neuronalen Netzwerk das mit Sequenzen von Proteinen trainiert wurde, von denen die Präsenz einer N-terminalen chloroplastidärer Signalsequenz bekannt ist. Daher weist es eine schon recht bemerkenswerte Genauigkeit in der Vorhersage auf. Ein Kritikpunkt dieses Programmes ist die Schwierigkeit die Kriterien zu interpretieren, aufgrund derer eine Vorhersage getroffen wird. Aus diesem Grunde wurde eine Methode entwickelt, welche die Vorhersage ausschließlich aufgrund der Häufigkeit verschiedener Aminosäuretypen in der N-terminalen Region des Proteins trifft [68]. Damit werden Ergebnisse in der Vorhersage erzielt, doe CHLOROP in der Genauigkeit der Vorhersage bei weiterem übertreffen.
Mit diesen beiden Programmen wurde eine Analyse auf Signalsequenzen für alle LOXen durchgeführt, die in 2b dargestellt sind. Daraufhin wurde die Sequenz im mutmaßlichen Schnittbereich positiver Kandidaten mit dem bekannten konservierten Schnittbereich von Landpflanzen und mit PtLOX1 verglichen. Erwartungsgemäß wurde nur für 13-LOXen vom LOX2-Typ eine chloroplastidäre Signalsequenzen vorhergesagt. Wie erwähnt, besitzen Landpflanzen eine konservierte Region im Bereich der Schnittstelle für stromale Peptidasen. Diese Ergebnisse wurden mit PtLOX1 verglichen, woraufhin eine mutmaßliche Schnittstelle für stromale Signalpeptidasen gefunden wurde. Tabelle 8 zeigt für einige 13-LOX vom Typ 2 die Vorhersage von PCLR und CHLOROP , den konservierten Schnittbereich von Landpflanzen sowie die mögliche Schnittstelle von PtLOX1. Diese Befunde sprechen recht deutlich für eine plastidäre Lokalisation, was durch immuncytochemische Untersuchungen bestätigt werden müsste. Im Vergleich zu höheren Pflanzen unterscheiden sich Heterokontophyta (Chrysophyta), zu denen auch die Kieselalgen zählen, durch die bemerkenswerte Tatsache, dass die Plastide vier umschließenden Membranen besitzen. Es wird angenommen, dass dieses Merkmal die Evolution dieser Organismen durch sekundäre Endosymbiose reflektiert, indem ein photosynthetischer Eukaryot {der durch primäre Endosymbiose entstand) durch eine eukaryotische heterotrophe Wirtszelle aufgenommen wurde [5]. Als Ergebnis scheinen die inneren zwei Membranen den Hüllmembranen der Plastide höherer Pflanzen zu entsprechen, die nächs Tabelle 8: Schnittstellen stromaler Peptidasen in Kieselalgen und höheren Pflanzen. Schnittstellen für den LOX2-Typus pflanzlicher LOXen wurden mit CHLOROP und PCLR berechnet.
te Membran ist ein Rest der endosymbiontischen Plasmamembran und die vierte Membran geht fließend in das Endoplasmatische Retikulum (ER) über. Es ist bekannt, dass plastidäre Proteine in Heterokontophyta eine zusätzliche Signalsequenz für den Eintritt in das ER besitzen [55, 9]. Es ist allerdings nicht bekannt, wie die zweite Membran vom Lumen des ER aus überwunden wird. Schnittstellen für Eukaryotische Signalpeptidasen werden werden gewöhnlich im Bereich an Position 15-18 von Pre-Pro-Proteinen durch die Methode von von HEIJNE [87] vorhergesagt. SIGNALSEQ was Bestandteil von HUSAR ist, nutzt diese Methode und sagt für PtLOX1 an Position 14 (ASA↓FR) eine Schnittstelle voraus (P_max = 0, 4350). Da allerdings auch für LOX2:At:1 eine Schnittstelle in diesem Bereich mit einer ähnlichen Wahrscheinlichkeit vorhergesagt wird, kann dieser Befund nur bedingt die These unterstützen, dass PtLOX1 N-terminal bezüglich des Transitpeptides für plastidäre Lokalisation über ein ER-Signalpeptid verfügt.
Ein weiterer Indiz für plastidäre Lokalisation von PtLOX1 ist das pH-Optimum von 8,2 (siehe unten).
4.2 pH-Optimum
Das pH-Optima der PtLOX1 wurden mittels Normal-Phasen-HPLC, durch die Umsetzung von Linolsäure bestimmt. Es wurde die Methode der Endwert-Bestimmung angewendet, bei der die Menge des gebildeten Produkts nach einer gewissen Zeit unter differierenden Bedingungen bestimmt wird. Sie ist aus dem Grunde ungeeignet, da in keinem Fall linearer Produktanstieg und Substratabnahme für alle Bedingungen garantiert werden kann, was insbesondere langen Umsatzzeiten und hohe Enzymaktivität betrifft. Aus diesem Grunde repräsentieren die erhaltenen Optimumskurven, bei dem Vergleich der Aktivität unter verschiedenen Bedingungen, in keinem Falle das wahre Verhältnis der Aktivitäten. Nichtsdestoweniger lassen sich bei entsprechender Wahl der Menge des eingesetzten Enzyms und der Umsatzzeit ein guter Hinweis auf die optimalen Bedingungen erhalten. Im Vergleich zu diesem Fehler spielen unterschiedlich Enzym- oder Substratmengen im Ansatz (durch Pipetierfehler) sowie unterschiedliche Ionenstärke des Puffers, Temperatur usw. eher eine untergeordnete Rolle. Andere Verfahren zur pH-Optimumsbestimmung wären über die "online" Verfolgung des Sauerstoffverbrauchs bei der LOX-Reaktion über eine Sauerstoffelektrode oder die Messung der Produktbildung durch die Verfolgung der Absorptionszunahme bei 234 nm am Spektrophotometer möglich [7]. Über das pH-Optimum der Enzyme lassen sich Aussagen über die Lokalisierung der Enzyme treffen und damit auch Schlussfolgerungen auf die mögliche physiologische Funktionen ziehen. In den einzelnen Kompartimenten der Pflanzenzelle sind, z.T. zeitlich abhängig, verschiedene pH-Werte. So besitzen Vakuolen und Peroxisomen ein saures Milieu. Im Stroma der Chloroplasten steigt der tagsüber der pH-Wert von 7,0 rund 8, da durch die aktiven Photosysteme in der Thylakoidmembran Protonen aus dem Stroma in die Thylakoiden gepumpt werden. Das pH-Optimum von PtLOX von 8,2 ist somit in Übereinstimmung mit der chloroplastidären Signalsequenz, die für PtLOX1 identifiziert wurde. Zudem dient es als Hinweis, das PtLOX1 während der Lichtreaktion aktiv wird. Es gibt auch chloroplastidäre LOXen mit einem saurem pH-Optimum (z.B. LOX2:Hv:1 (LOX-100) [53]). Sinkt der pH-Wert im Stroma auf auf dieses Niveau durch Stress oder durch Beschädigung der Membranen, so nimmt man an, dass diese LOXen aktiv werden und den weiteren Abbau der Zelle induzieren können (Jasmonsäurebildung, Abbau der Membranen usw.). Es wurde beschrieben, dass Produkte des LOX-HPL-Reaktionswegs (Aldehyde) rapide nach mechanischer Beschädigung von Kieselalgen gebildet wurden. Da diese Aldehyde drastisch den Erfolg beim Schlüpfen von Ruderfußkrebsen, den Feinden von Kieselalgen im Phytoplankton, verminderte, spricht dies für eine Wund-induzierte chemische Verteidigung. Das Jasmonsäure durch die Aktivität von PtLOX1 den Verteidigungsmechanismus bei p. tricornutum induzieren könnte ist äußerst unwahrscheinlich, da die zur Synthese notwendige α-Linolensäure mit 0,2 % Anteil am Fettsäureinhalt [71] zu vernachlässigen ist. Sollte PtLOX1 eine Rolle spielen bei der Wund-induzierten Freisetzung von Aldehyden, stellt sich somit die Frage der Aktivierung. Jasmonsäure als Akvator von Stress-induzierten Genen kann, wie eben erläutert, keine Rolle spielen und eine Aktivierung durch den Zusammenbruch des stromalen pH-Gradienten ist aufgrund des pH-Optimums von PtLOX1 auch auszuschließen. Somit scheint unwahrscheinlich, das PtLOX1 in diesem Verteidigungsmechnismus involviert ist. In unbeschädigten Zellen wurden nahezu keine Degradationsprodukte oxidierter Fettsäuren festgestellt [62].
4.3 Reinigung
Für genaue kinetische Untersuchungen ist es notwendig gereinigtes Enzym einzusetzen. So kann zwar der K_M auch mit ungereinigtem Enzym bestimmt werden, wobei sich aber ein Unsicherheitsfaktor aufgrund der Präsenz anderer Proteine im Ansatz ergibt. Da durch die vergleichende Analyse der verschiedenen Substrate in 8 ein Hinweis für eine Bevorzugung für ARA und EPA ergeben hat, wäre es von Interesse den K_M und k_cat/K_M für alle Substrate zu bestimmen. Dadurch könnte eine viel präzisere Aussage über die Substratspezifität von PtLOX1 getroffen werden. Es wird angenommen das die Reinigung über das Histdin-Metallkomplex-System nicht gelang, weil das rekombinante Protein die N-terminale Sequenz von sechs Histidin nicht aufweist. Als mögliche Ursache könnte in Frage kommen, dass die Translation des Proteins nicht an der im Expressionsvekror dafür vorgesehenen Stelle begann, sondern erst am Start-Methionin der PtLOX1-Sequenz.
4.4 Substratspezifität
Pflanzliche LOXen werden aufgrund ihrer Positionsspezifität gegenüber Linolsäure in 9- und 13-LOXen eingeteilt, da Linolsäure ein ubiquitär verbreitetes Substrat bei Pflanzen darstellt. Wichtig für die Bildung der unterschiedlichen Produkte sind die Aminosäuren im aktiven Zentrum des Enzyms [28]. Es wurden zwei Hypothesen entwickelt, welche die Positionsspezifität von LOXen zu erklären versuchen (zusammengefasst in [28]). Die eine Hypothese geht davon aus, dass der verfügbare Raum über die Position der Sauerstoffeinführung entscheidet. So gleitet die ungesättigte Fettsäure mit dem Methylende voran soweit wie möglich in die Substratbindungstasche ein. Die bisallylische Methylgruppe, die dann in größrer Nähe zum Wasserstoffakzeptor ist, wird in der Folge angegriffen, wonach eine [+2] oder [-2] Umlagerung des enstehenden Pentadienylradikals srattfinden kann. Es ist allerdings schwierig mit diesem Modell genau diese Umlagerung zu erklären, weswegen eine zweite Hypothese entwickelt wurde. Dabei ist die Orientierung des Substrates in der Substratbindungstasche darüber entscheidend, ob Sauerstoff an der [+2] oder [-2] Position eingeführt wird. So soll bei 13-LOXen das Substrat, wie auch bei dem Raum-Modell, mit dem Methylende voraus in die Bindungstasche gleiten, wohingegen bei 9-LOXen die ungesättigte Fettsäure mit dem Carboxylende voran in die Tasche gleitet.
Teil des Bodens der Bindungstasche ist bei allen pflanzlichen LOXen ein höchst konservier tes Arginin, das bei der Umwandlung der Lipidkörper 13-LOX aus Gurke in eine 9-LOX von zentraler Bedeutung ist (R758 der CslbLOX) [47]. Dieses Arginin tritt unabhängig von der Substrat- und Positionsspezifität auf und ihm geht in über 90 % der Fälle ein Asparagin voran. Als einzige Ausnahme unter pflanzlichen LOXen sind an dieser Stelle im Sequenzvergleich bei PtLOX1 zwei Histidin anstelle des Asparagin-Arginin-Tandem. Es ist davon auszugehen, dass diese auch bei PtLOX1 den Boden der Tasche bilden, da dieser Bereich ansonsten hoch konserviert ist. Das Arginin am Boden der Bindungstasche wurde durch die H608V Mutation von CslbLOX demaskiert, wobei durch die Salzbrücke zwischen der Carboxylgruppe des Substrates und dem Arginin die Energie des Einbringens einer Carboxylgruppe in eine hydrophobe Umgebung stark gesenkt wird [47]. Auch wenn der pK-Wert der Histidine im Protein nicht genau abgeschätzt werden kann (pK ≈ 6,5), so ist es im Vergleich zu Arginin (rund pK ≈ 12 sicherlich unwahrscheinlicher, dass sie eine positive Ladung tragen. Aus diesem Grunde ist es unwahrscheinlich, dass es einen nahen Verwandten von PtLOX1 mit 9-LOX Aktivität gibt, welcher der Orientation-bezogenen Theorie gerecht wird. Da selbst bei dieser Theorie bei einer 13-LOX diese Position maskiert ist und somit keine Rolle spielt, scheint dieses außergewöhnliche Auftreten von Histidin anstatt von Arginin keine Bedeutung für den Katalysemechanismus zu haben.
Konserviert ist hingegen die Aminosäure, die sich im Sequenzvergleich mit der SLOANE-Determinante [76] deckt. An dieser Stelle befindet sich in 9-LOXen eine kleine Aminosäure wie Valin und in 13-LOXen eine große wie Phenylalanin. Eine Ausnahme bilden die 13-LOXen LOX1:Cs:1 und LOXI:Cs:3 (H sttat F) sowie LOX1:Hv:3 (V statt F). Diese Diskrepanz mag ihre Ursache darin haben, dass in diesen Fällen keine "klassischen" 13-LOX vorliegen [32]. In PtLOX1 liegt jedoch die voluminöse Aminosäure Phenylalanin vor, wie für eine 13-LOX erwartet.
An der Position im Sequenzvergleich, die sich mit der BORNGRÄBER-Determinante deckt, ist ist es schwieriger konservierte Unterschiede zwischen 13- und 9 LOXen zu finden. Meist findet man eine Kombination aus hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, die von der kleinen Aminosäure Glycin oder der hydrophoben Aminosäure Cystein getrennt werden (z.B. S515,G516,V517 in LOX1:Nt:1). Bezüglich der Kombination von hydrophober-/hydrophiler Aminosäure finden sich konservierte Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. PtLOX1 unterscheidet sich dahingehend von allen anderen LOXen, dass bei ihr zwei hydrophobe Aminosäuren von der hydrophilen Aminosäure Threonin getrennt werden. Diese beiden hydrophoben Aminosäuren (Isoleucin deckt sich mit V542 der CslbLOX, Alanin mit Y544 der CslbLOX) existieren an dieser Stelle des Sequenzvergleichs bei keiner anderen LOX, obwohl unmittelbar davor und dahinter PtLOX1 höchste Homologie mit allen anderen LOX auf weist. Da diese Positionen als Bestandteil der Substratbindungstasche identifiziert wurden und ein Einfluss auf die Positionsspezifität nachgewiesen wurde [32], muss davon ausgegangen werden, dass dieser Unterschied Einfluss auf die Art und Weise haben könnte, wie das Substrat gebunden oder fixiert wird. Da Aminosäuren ähnlichen Charakters und Größe an zwei dieser Positionen (vor und hinter dem Threonin) in anderer Kombination auch bei anderen LOXen gefunden werden, ist die Art dieses Einflusses nicht unmittelbar ersichtlich.
Für 13-LOXen ist in beiden Modellen die Entfernung der bisallylischen Methylengruppe von dem Methylende des Substrates entscheidend, ob die einleitende Wasserstoffabstraktion an dieser Stelle stattfindet. Es stellte sich heraus (Tabelle 4), dass von den in Frage kommenden bisallylischen Methylengruppen für jedes der eingesetzten Substrate hauptsächlich nur eine für die initiale Wasserstoff Entfernung benutzt wurde. Dies betraf die Methylengruppe an Position (n-8) im Fall von LA und α-LEA und jeweils (n-11) für γ-LEA, ARA, EPA, DPA und DHA. Man kann somit abschätzen, dass der Abstand des Wasserstoffakzeptor von dem Boden der Bindungstasche rund elf Methylengruppen beträgt. Auffallend ist besonders im Fall von γ-LEA, dass von den beiden möglichen Positionen der Wasserstoffabstraktion (C₈ und C₁₁) jene benutzt wurde, bei der das Substrat maximal in die Bindungstasche eintaucht (C₈, entspricht (n-11)). Dies ist auch bei α-LEA der Fall, auch wenn hier gezwungenermaßen zum hypothetischen Boden der Bindungstasche noch drei Methylengruppen Platz bleibt. Bei alle langkettigen Fettsäuren ab ARA (20:4) wird immer das C-Atom (n-11) benutzt. Aufgrund die ser Beobachtung und durch die vergleichende Analyse in 8 ist davon auszugehen, des entweder ARA oder EPA die bevorzugten Substrate von PtLOX1 sind. DPA ist aus dem Grunde unwahrscheinlich, da beide Produkte ([+2] und [-2] Umlagerung) in Verhältnis von rund 1:1 entstehen und zudem die Menge an gebildeten Produkt im Vergleich zu ARA und EPA wieder abnimmt. Die Produkte aus DHA entstehen dagegen im selben Verhältnis wie die EPA-Produkte, wobei allerdings die die Produktmenge geringer ist als bei ARA und EPA In Anbetracht dessen, das EPA rund dreimal mehr als DHA in P. tricornutum vorkommt [71], scheint durch PtLOX bevorzugt dieses Substrat umgesetzt zu werden.
Für die Verschiebung der Verhältnisse der Oxidation an [+2] zu [-2] bei Änderung der Anzahl der Doppelbindungen oder Methylengruppen diesseits oder jenseits der benutzten bisallylischen Methylengruppe, konnte keine rationale Erklärung gefunden werden. Scheinbar stabilisieren Doppelbindungen auf der Carboxyseite der benutzten bisallylischen Methylengruppe das [+2]-Radikal, wohingegen Doppelbindungen auf der Methylseite das [-2]-Radikal stabilisieren. Da sp² hybridisierter Kohlenstoff eine höhere Elektronegativität als sp³ hybridisierter Kohlenstoff besitzt, ist dies Ergebnis genau das Gegenteil von dem, was man aufgrund dieses Elektronenzuges sp² hybridisierten Kohlenstoffs erwarten würde. Auch die Verschiebung des Verhältnisses bei der Änderung der Anzahl der Methylengruppen bei gleichbleibender Doppelbindungsanzahl kann nickt mit induktiven Effekten der Methylgruppen (+I) erklärt werden.
Hier werden [-2]-Radikale durch Einführung von Methylengruppen auf der Carboxyseite der benutzten bisallylischen Methylengruppe scheinbar stabilisiert und umgekehrt.
Als Erklärung bleibt die Möglichkeit die Fixierung des Substrates durch die Bindungstasche anzuführen (27). So ändert sich durch eine Doppelbindung die Struktur des Abbildung 27: Mögliche Bindungstasche von PtLOX1. Dargestellt ist die mutmaßliche Position aller Hydroxyfettsäuren in der Bindungstasche, die durch [+2]-Radilcalumlagerung entstanden sind. Diese stellten im Vergleich zur [-2]-Radikalumlagerung immer das Hauptprodukt dar (vergl. mit Tabelle 4). Blau unterlegt sind die Bereiche, die als Bindungstaschenboden und -öffnung aufgrund experimenteller Ergebnisse angenommen werden.
Substrates. Nimmt man an, das im Fall von ARA das Substrat am Methyl- sowie am Carboxylende optimal arretiert ist für Oxidation am C₁₂, so ändert sich die Möglichkeit der Interaktion des Bodens der Bindungstasche mit EPA durch die Einführung einer Doppelbindung an dieser Stelle. Ist EPA weniger fest fixiert, kann die Positionsänderung während der Katalyse die Positionsspezifität nachteilig beeinflussen. Ähnlich Effekte mögen bei den anderen Substraten auftreten: Der Bereich von C₁₈ bis C₇ bei γ-LEA (Bildung von 10-/G-γ-HOTE) ist identisch mit dem Bereich C₂₀ bis C₉ von ARA (Bildung von 12-/8-HETE). Der Unterschied ist die fehlende Arretierung am Kopfende (Carboxyl-) von γ-LEA durch die Bindungstasche. Durch den selben Effekt könnte ARA (20:4) und EPA (20:5) am Kopfende optimal arretiert sein und DPA (22:5) durch die Entfernung der Carboxylgruppe vom Eingang der Bindungstasche eine Arretierung unmöglich machen. Die Einführung der Doppelbindung an dieser Position in DHA (22:6) könnte dies rückgängig machen, da das Substrat durch die Doppelbindung in den Freiheitsgraden eingeschränkt ("versteift") wird. In diesem Zusammenhang könnten auch die stereochemischen Unterschiede zwischen den Hauptprodukten erklärt werden und diese These untermauern: Wird das Substrat am Methyl- sowie Carboxylende fest durch Interaktion mit Aminosäuren der Bindungstasche arretiert, könnte dies die nahezu 100 % Enantiomerenreinheit im Fall der Umsetzung von EPA und DHA für jeweils beide Produkte erklären. Die oben angeführte Lockerung der Interaktion am Carboxylende bei DPA könnte dann auch das Absinken des S zu R Verhältnisses für 14-HDPE bedingen. Im Fall von n-LEA ist genau die selbe Erklärung anzuführen, da das Substrat bei der Bildung von 10-/G-γ-HOTE so tief in die Bindungstasche eintaucht, dass das Carboxylende nicht mehr mit den möglichen Determinan ten der Substratfixierung am Kopfende der Bindungstasche interagieren kann. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass PtLOX1 auf Basis der vergleichenden Substratumsetzung (8) ARA bzw EPA bevorzugt umsetzt. Nimmt man die Ergebnisse der Positionsspezifität und der Enantiomeren-Analyse hinzu, spricht dies für EPA als bevorzugtes Substrat. im Vergleich zu ARA ist das Verhältnis zwischen Haupt- und Nebenprodukt zwar deutlich zuungunsten des Hauptproduktes verschoben, welches dafür in nahezu enantiomerer Reinheit vorliegt. Damit wurde im Vergleich zu pflanzlichen LOXen eine außergewöhnliche Substratspezifität gefunden. Auch andere pflanzliche 13-LOXen die chloroplastidär lokalisiert sind, waren in der Lage Arachidonsäure umzusetzen (z.B. LOX2:Hv:1, [88]). Dabei wurde für gewöhnlich 15-HPETE in S-Konfiguration gebildet, sowie eine Reihe racemischer Produkte, aber nicht 12- und 8-HETE S-Konfiguration.
Ketokonjudienfensäuren wurden durch PtLOX under den Bedingungen der Analyse nicht gebildet. KODE werden hauptsächlich bei geringem Sauerstoffpartialdruck gebildet, aber von einigen pflanzlichen LOX, z. B. LOX-2 aus Sojabohne und LOX-1 aus Erbse, ist bekannt, dass sie diese auch bei normalem Sauerstoffpartialdruck in ungewöhnlich hohen Mengen von bis zu 50 % bezogen auf HODE bilden [7, 52]. Auch die Umsetzung von komplexen Lipiden ist von LOXen aus anderen Pflanzen bekannt. So ist z. B. die Lipidkörper-LOX aus Gurken-Keimlingen in der Lage Triarylglyceride umzusetzen [24]. Wahrscheinlich sind diese LOXs bei der Mobilisierung von Speicherfetten bei der Keimung beteiligt [29]. PtLOX verfügt zwar über Ölvakuolen [1], aber da die Fortpflanzung durch vegetative Zellteilung geschieht ist eine Einbeziehung von LOXen bei der Mobilisierung von Speicherlipiden wie bei manchen höheren Pflanzen auszuschließen. Auch die Umsetzung von Phosphatidylcholin kann durch LOXs stattfinden. LOX-1 aus Sojabohne setzt dieses Substrat zuerst zu Monohydroperoxy-Linoleoyl-Phosphatidylcholin und dann weiter zum Dihydroperoxid um [17]. In Arabidopsis wurde zudem ein neues Oxolipin identifiziert [79.]. Es handelt sich dabei um ein sn1-O-(12-Oxophytodienyl)-sn2-O-(hexadekatrienoyl)-monogalactosyl-diglycerid. Man könnte daher aufgrund dieser Befunde und früherer Hypothesen [31] annehmen, dass LOXen Monogalactosyldiglyceride, die Hauptbestandteile der Chloroplastenmembran, als Substrate akzeptieren und eine Hydroperoxidgruppe in die Fettsäure die sich in der sn1-Position befindet, einbauen. In Pflanzen gibt es Hinweise, dass bei Existenz eines solchen Weges letztendlich Jasmonsäure gebildet wird. Obwohl dies bei PtLOX1 aufgrund der geringen Menge an veresterter α-Linolensäure unwahrscheinlich ist, sollte eine weiter Untersuchung auch komplexe Lipide der veresterten Fettsäuren wie EPA und AA in Form von Phosphatidylcholin und Monogalactosyldiglyceride berücksichtigen.
Abkürzungsverzeichnis
APS Ammoniumperoxodisulfat
ATP Adenosin-5'-triphosphat
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-indoxylphosphat
BLAST Basic Local Alignment Search Tool - Suche der nächsten Homologen einer Sequenz durch Vergleich mit Sequenzen in verschiedenen Datenbanken
bp Basenpaar
BSA Bovine Serum Albumin – Rinderserumalbumin
BSTFA N, O-Bis(trimethylsilyl)uifluoroacetamide
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
C-Terminus Carboxy-Terminus
DNA Desoxyribonukieinsäure
dNTP Desoxynukleotid-5'-triphosphate
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EDAC N-Dimethylamino-propyl-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid
g (Formelzeichen) Erdbeschleunigung
g (Einheit) Gramm
GC/MS Gaschromatograph/Massenspektrometer
17-H(P)DHE (17S,4Z,7Z,10Z,13Z,15E,19Z-17-Hydro(pero)xy-4,7,10,13,15,19-docosahexaensäure
14-H(P)DPE (14S,7Z,10Z,12E,16Z,19Z)-14-Hydro(pero)xy-7,10,12,16,19-docosapentaensäure
10-H(P)DPE (10S,7Z,11E,13Z,1GZ,19Z)-10-Hydro(pero)xy-7,11,13,16,19-docosapentaensäure
12-H(P)EPE (12S,5Z,8Z,10E,14Z,17Z)-12-Hydro(pero)xy-5,8,10,14,17-eicosapentaensäure
8-H(P)EPE (8S,5Z,9E,11E,14Z,17Z)-8-Hydro(pero)xy-5,9,11,i4,17-eicosapentaensäure
5-H(P)ETE (5S,6E,8Z,11Z,14Z)-S-Hydro(pero)xy-6,8,11,i4-eicosatetraensäure
8-H(P)ETE (8S,5Z,9E,11Z,14Z)-8-Hydro(pero)xy-5,9,11,14-eicosatetraensäure
9-H(P)ETE (9S,5Z,7E,11Z,14Z)-9-Hydro(pero)xy-5,7,11,14-eicosatetraensäure
11-H(P)ETE (11S,5Z,8Z,12E,14Z)-11-Hydro(pero)xy-5,8,12,14-eicosatetraensäure
12-H(P)ETE (12S,5Z,8Z,10E,14Z)-12-Hydro(pero)xy-5,8,10,14-eicosatetraensäure
15-H(P)ETE (15S,5Z,8Z,11Z,13E)-15-Hydro(pero)xy-5,8,11,13-eicosatetraensäure
HPLC High Performance Liquid Chromatography – Hochleistungs-Flüssigchromatographie
9-H(P)ODE (9S,10E,12Z)-9-Hydro(pero)xy-10,12-octadecadiensäure
13-H(P)ODE (13S,9Z,11E)-13-Hydro(pero)xy-9,11-octadecadiensäure
9-α H(P)OTE (9S,10E,12Z,15Z)-9-Hydro(pero)xy-10,12,15-octadecatriensäure
12-α H(P)OTE (12S,9Z,13E,15Z)-12-Hydro(pero)xy-9,13,15-octadecatriensäure
13-α H(P)OTE (13S,9Z,11E,15Z)-13-Hydro(pero)xy-9,11,15-octadecatriensäure
16-α H(P)OTE (16S,9Z,12Z,14E)-16-Hydro(pero)xy-9,12,14-onadecatriensäure
6-γ H(P)OTE (6S,7E,9Z,12Z)-6-Hydro(pero}xy-7,9,12-octadecatriensäure
9-γ H(P)OTE (9S,6Z,10E,12Z)-9-Hydro(pero)xy-6,10,12-octadecatriensäure
10-γ H(P)OTE (10S,6Z,8E,12Z)-10-Hydro(pero)xy-6,8,12-octadecatriensäure
13-γ H(P)OTE (13S,6Z,9Z,11E)-13-Hydro(pero)xy-6,9,11-octadecatriensäure
IEP isoelektrischer Punkt
IPTG Isopropyl-ß-thiogalaktopyranosid
kDa Kilodalton
MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure
mRNA messenger Ribonukleinsäure
NBT Natriumnitrotetrazoliumblau
N-Terminus Amino-Terminus
OD optische Dichte bezogen auf 1 cm Küvettenbreite
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS Phosphat gepufferte Saline
P/C/I Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol
PCR Polymerase-Ketten-Reaktion
pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
RACE Rapid Amplification of cDNA Ends – Methode zur Sequenzverlängerung
RNA Ribonukleinsäure
SDS Natriumdodecylsulfat
SSC Natrium-Natriumchlorid
TAE Tris-Acetat-EDTA
TCA Trichloressigsäure
TE Tris-EDTA
TEAA Triethylamonium-Acetat
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylendiamin
TENS Tris-EDTA-NaCl-SDS
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TMS Trimethylsilyl-
ORF Open Reading Frame – offener Leserahmen
U unit; Einheit der Enzymaktivität [μmol/min]
UV ultraviolett
var. Varietät
v "volume", Volumen
w "weight", Gewicht
X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β3-Galaktosid
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Lipoxygenase aus Phaeodactylum tricornutum mit einem pH-Optimum von 8,2 und einer Regiospezifität für die Hydroperoxybildung von Linolsäure am C-Atom 13 (13-LOX).
Lipoxygenase mit der in 2 dargestellten Polypeptidsequenz.
Nukleinsäuresequenz codierend für eine Lipoxygenase nach Anspruch 2. -