WO2003105883A1 - Behandlung von schweren infektionen und septischem schock - Google Patents

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WO2003105883A1
WO2003105883A1 PCT/EP2003/005694 EP0305694W WO03105883A1 WO 2003105883 A1 WO2003105883 A1 WO 2003105883A1 EP 0305694 W EP0305694 W EP 0305694W WO 03105883 A1 WO03105883 A1 WO 03105883A1
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rtd
bacteria
therapy
gram
lps
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PCT/EP2003/005694
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Christoph Ladel
Ben Newton
Harald Labischinski
Nina Brunner
Christoph Gerdes
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Bayer Healthcare Ag
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Definitions

  • the invention relates to the use of Rhesus-Theta-Defensin 1 (RTD-1) for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of patients with severe infections (bacteria) including septic shock.
  • RTD-1 Rhesus-Theta-Defensin 1
  • Sepsis is a severe, life-threatening clinical picture resulting from an infection with bacteria on a systemic level (bacteremia) and other clinical findings according to the internationally valid definition (Madot, I. and
  • Sepsis is characterized by fever, hypotension and so-called shock symptoms (e.g. shock lung, shock kidney, gastrointestinal bleeding; generally referred to as multi-organ failure).
  • shock symptoms e.g. shock lung, shock kidney, gastrointestinal bleeding; generally referred to as multi-organ failure.
  • shock symptoms e.g. shock lung, shock kidney, gastrointestinal bleeding; generally referred to as multi-organ failure.
  • These different symptoms are the clinical signs of pathophysiological processes caused by the germs themselves or their products, eg endotoxins, hemolysins or pyrogens.
  • Pathological conditions such as severe nervous disorders can also be Burns, trauma or acute lung changes with subsequent or simultaneous colonization with bacteria, fungi or niren occur. In these cases, too, symptoms of shock are found, with only partial direct diagnosis of the bacteria or other pathogens being possible.
  • the patient's own factors of the immune system are both protective and harmful, depending on concentration, place of action and the like.
  • the trigger for these events is by definition the presence of bacteria and / or the presence of bacterial products such as LPS / LTA and others. This leads to the release of e.g. Tumor ⁇ ecrosis factor- ⁇ , interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-8 (IL-8), as well as factors that influence coagulation (e.g.
  • PAF platelet activating factor
  • factors that intervene in a regulatory manner on the resulting inflammatory process such as prostaglandins, leukotrienes, interleukin-10.
  • PAF platelet activating factor
  • factors that intervene in a regulatory manner on the resulting inflammatory process such as prostaglandins, leukotrienes, interleukin-10.
  • Another approach is to influence the clinical picture with immunomodulatory treatments in order to prevent or at least alleviate an excessive response of the organism to bacteria or bacterial products and thus to avoid organ failure (Zanotti, S. et al. (2002), Expert Opin. Investig. Drugs 11, 1061-1075).
  • Soluble immune system mediators which are administered as therapy, are of particular interest. These mediators include the so-called defensins, molecules with anti-bacterial, anti-fungal or even anti-viral properties (Kagan, B.L. et al. (1994), Toxicology 87, 131-149;
  • RTD-1 A defensin from immune cells of the rhesus monkey (Rhesus-Theta-Defensin 1; RTD-1) was isolated and its properties, its broad antibacterial activity, also against non-growing bacteria, and its antifungal activity have been described in detail (Tang et al. (1999) , Science 286, 498-502; Tran et al. (2002), J. Biol.
  • RTD-1 is characterized by some characteristic and determining properties against other defensins or cationic peptides. On the one hand, RTD-1 is a small circular peptide and, in contrast to other defensins, is therefore stable against degradation and degradation. RTD-1 shows no dependence on the effect of salts in the
  • RTD-1 a further effect of the RTD-1 is surprisingly found in states of bacteremia with subsequent sepsis and septic shock, as well as such disease states after exposure to bacterial products such as LPS.
  • RTD-1 intervenes in the disease process by 1. showing anti-microbial activity against various pathogens, 2. neutralizing effect on bacterial products such as LPS or LTA (effect on products of gram-positive and gram-negative bacteria) , which also allows prophylactic therapy, 3. has an immunomodulatory effect in the sense of mediator modulation, and 4. has a regulated anticoagulant effect.
  • the combined effect on various disease-relevant parameters results in a clearly improved therapeutic success with simplified therapy.
  • therapy with RTD-1 closes the current standard therapies (e.g. antibiotics, circulatory stabilizers
  • RTD-1 Treatment with RTD-1 leads to increased survival of mice with severe bacteremia after application of living bacteria, both after infection with gram-positive and gram-negative bacteria. Surprisingly, there is no dependency on the minimum inhibitory concentration of RTD-1 on the bacterium used.
  • mice with symptoms of septic shock after administration of LPS or SEB also shows a significantly increased survival under therapy with
  • RTD first Cytokine analyzes in the serum or plasma of the animals show a regulation of the release of soluble mediators.
  • a decrease in pro-inflammatory cytokines such as TNF-, IL-6, MIF
  • regulatory factors such as IFN- ⁇ , IL-10
  • Comparable results are found in whole human blood, and the values for pro-inflammatory cytokines and chemokines are lowered.
  • RTD-1 Under the influence of RTD-1, there is a dose-dependent increase in the clotting time of human plasma and human whole blood. RTD-1 therefore shows an influence on the coagulation parameters in human blood without additionally influencing the coagulation by bacterial products such as LPS or LTA.
  • the present invention therefore relates to the use of theta-defensin from the rhesus monkey for the production of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of bacteria and / or sepsis.
  • the disease triggers can be gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, bacterial products, viruses or yeasts.
  • the invention further relates to the use of RTD-1 for the production of a medicament for binding bacterial products such as LPS and / or LTA.
  • the invention further relates to the use of RTD-1 for the manufacture of a medicament for the treatment of disease states which are characterized by changes in blood coagulation.
  • Table 1 Minimum inhibitory concentrations of RTD-1, vancomycin and ampicillin on various bacterial species determined by the NCCLS method. The table shows the concentration of the respective compounds which showed a clear inhibition of the growth of the bacteria.
  • Bacterial suspensions are administered intraperitoneally (i.p.) in CFW-1 mice.
  • the mice are obtained from Harlan. After 30 min. the animals are then treated intravenously (IV) with RTD-1 in various doses. The survival of the animals with and without therapy results in the success of the therapy.
  • mice survival of mice after ip infection with S. aureus in the bacteremia model and therapy with 0.1, 1 and 10 mg / kg RTD-1 IV.
  • the mice are infected with 1.68 x 10 7 colonies of S. aureus ATCC Smith ip and treated iv after 30 min with the indicated doses.
  • mice survival of mice after ip infection with S. pneumoniae in the bacteremia model and therapy with 0.1, 1 and 10 mg / kg RTD-1 i. ..
  • the mice are infected with 3 ⁇ 10 3 colonies of S. pneumoniae L3TV ip and treated iv after 30 min with the indicated doses.
  • mice survival of mice after ip infection with E. coli in the bacteremia model and therapy with 0.1, 1 and 10 mg / kg RTD-1 IV.
  • the mice are infected with 1.68 x 10 7 colonies of E. coli Neumann ip and treated iv after 30 min with the indicated doses.
  • LPS is injected ip into mice and at different times before and after the LPS administration, RTD-1 is administered iv in various doses to simulate septic shock.
  • the survival of the animals is the measure of the therapeutic success in the model for septic shock.
  • a relevant affinity of the RTD-1 for binding bacterial products can be calculated from the inhibition.
  • Table 6 LPS and LTA binding by RTD-1 and Polymyxin B after 4 hours of incubation. The concentration at which the fluorescence of dansyl polymyxin is reduced by 50% is indicated.
  • the membrane permeability of bacteria under the influence of RTD-1 is investigated using a fluorescence method (Silvestro et al. (2000), Antimicrob. Agents Chemotherap. 44, 602-607). This allows an evaluation of the potential of the RTD-1 with regard to damage to the cell membrane of bacteria and thus on the release of bacterial products.
  • Table 7 Membrane potential change under the influence of RTD-1 and polymyxin B after 10 minutes exposure to S. aureus bacteria. It shows the concentration that leads to a 50% change in the fluorescence signal.
  • Table 7 Membrane potential change under the influence of RTD-1 and polymyxin B.
  • RTD-1 becomes a membrane fraction from E. coli (as an example for gram-negative bacteria) or from Bacillus megaterium (as an example for gram-positive bacteria) and the necessary substrates and the inhibitory activity is determined (Chandrakala, B. et al. (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45, 768-775). This approach determines the incorporation of radioactive precursors into high-molecular peptidoglycan via binding to wheat germ agglutinin.
  • An influence of RTD-1 on the cell wall synthesis in bacteria provides essential information on an effect on the bacterium (e.g. lysis) and in particular in connection with the release of bacterial products, which is an essential prerequisite for assessing the therapeutic potential of RTD-1 in severe Infections including septic shock.
  • Table 8 Inhibition of cell wall synthesis by RTD-1, ampicillin (Sigma), a lactam antibiotic, chloramphenicol (Sigma), a protein biosynthesis inhibitor and vancomycin (Sigma), a glycopeptide antibiotic.
  • ampicillin Sigma
  • a lactam antibiotic a lactam antibiotic
  • chloramphenicol Sigma
  • a protein biosynthesis inhibitor a protein biosynthesis inhibitor
  • vancomycin Sigma
  • glycopeptide antibiotic The inhibition of binding to wheat germ agglutinin from radioactive precursors in high-molecular peptidoglycan is shown. Only substances that influence cell wall biosynthesis, but not protein biosynthesis inhibitors, show inhibition in this approach.
  • This parameter is used to determine faults in the exogenous system of
  • Blood coagulation used.
  • the thromboplastin time is determined in the citrate plasma after adding calcium and tissue factor.
  • blood is taken from healthy people of both sexes in collecting vessels with citrate (Monovetten, Sarstedt, Nümbrecht, Germany) and the plasma is obtained after centrifugation. Samples of this plasma are incubated with various concentrations of the test compounds for 10 minutes at 37 ° C. Thereafter, thromplastin (Recombiplastin, OrthoDiagnostic Systems, Neckargemünd, Germany) is added to start the exogenous path of blood clotting. In a device for determining coagulation (coagulometer, Amelung, KC 4A micro), this approach is mixed and the coagulation time is determined.
  • This parameter is used to determine disorders in the endogenous blood coagulation system.
  • the thromboplastin time is determined in the citrate
  • Plasma after adding an activator and phospholipid Plasma after adding an activator and phospholipid.
  • blood is taken from healthy people of both sexes in collecting vessels with citrate (Monovetten, Sarstedt, Nürnbrecht, Germany) and the plasma is obtained after centrifugation. Samples of this plasma are incubated with various concentrations of the test compounds for 10 minutes at 37 ° C. Then the activator
  • Kaolin and phospholipid (aPTT reagent, Diagnostica Stago, Asnieres, France) added.
  • the coagulation is started by adding 0.025 M calcium chloride to this mixture.
  • a device for determining coagulation coagulometer, Amelung, KC 4A micro
  • this approach is mixed and the coagulation time is determined.
  • Table 10 Influencing of the coagulation parameters aPTT, PT, and the clotting time of whole human blood under the influence of RTD-1. Measured clotting time is shown in seconds after adding RTD-1.
  • Table 10 Influencing of the coagulation parameters aPTT, PT, and the clotting time of whole human blood under the influence of RTD-1.
  • Plasma samples are obtained by bleeding the animals at various times after LPS or SEB administration in mice. Plasma samples are taken from these blood samples and subjected to a cytokine analysis. The amount of cytokine in the
  • Plasma is determined quantitatively using the CBA methods (CBA system, BectonDickinson, Heidelberg, Germany).
  • Table 11 Cytokine modulation after therapy with RTD-1 in the mouse model of septic shock after administration of LPS. The maximum percentage change compared to the untreated LPS control is given. negative Values indicate a decrease, positive values indicate an increase in the amount of cytokine in the plasma.
  • Table 11 Cytokine modulation after therapy with RTD-1 in the mouse model of septic shock after administration of LPS.
  • Table 12 Cytokine modulation after therapy with RTD-1 in the mouse model of septic shock after administration of SEB. The maximum percentage change compared to the untreated SEB control is given. negative
  • Values indicate a decrease, positive values indicate an increase in the amount of cytokine in the plasma.
  • Blood is drawn from healthy donors and infected with bacteria in vitro. Both gram-positive pathogens (S. aureus) and gram-negative pathogens (E. coli) are used. After the pathogens have been added, samples of the infected and infected and treated blood are taken at defined times and the plasma is obtained by centrifugation. The amount of cytokine in the plasma is determined quantitatively using the CBA methods (CBA system, BectonDickinson, Heidelberg, Germany). In addition, the analysis for MIF is carried out by ELISA technology (human MIF ELISA system, R&D Systems Inc., Minneapolis, USA).
  • Table 13 Cytokine modulation after therapy with RTD-1 in the infection model with whole human blood after administration of S. aureus. The maximum percentage change in pro-inflammatory mediators compared to the untreated infection control is given. Negative values indicate a decrease, positive values indicate an increase in the amount of cytokine in the blood culture.
  • Table 13 Cytokine modulation after therapy with RTD-1 in the infection model with whole human blood after administration of S. aureus.
  • Table 14 Cytokine modulation after therapy with RTD-1 in the infection model with whole human blood after administration of E. coli The maximum percentage change compared to the untreated infection control is given. Negative values indicate a decrease, positive values indicate an increase in the amount of cytokine in the blood culture.
  • RTD-1 can be converted in a known manner into the customary formulations, such as tablets, dragées, pills, granules, aerosols, syrups, emulsions, suspensions and solutions, using inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients or solvents.
  • the therapeutically active compound should in each case be present in a concentration of 0.5 to 90% by weight of the total mixture, i.e. in amounts sufficient to achieve the dosage range indicated.
  • the formulations are prepared, for example, by stretching the active ingredients with solvents and / or carriers, if appropriate using emulsifiers and / or dispersants, it being possible, for example if organic solvents to be used as diluents, to use organic solvents as auxiliary solvents.
  • the application is carried out in the usual way, preferably intravenously, transdermally, orally or parenterally, in particular orally or intravenously. However, it can also be done by inhalation via the mouth or nose, for example with the aid of a spray, or topically via the skin.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Rhesus-Theta-Defensin 1 (RTD-1) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Patienten mit schweren Infektionen (Bakteriämien) inklusive septischem Schock.

Description

Behandlung von schweren Infektionen und septischem Schock
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Rhesus-Theta-Defensin 1 (RTD-1) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Patienten mit schweren Infektionen (Bakteriamien) inklusive septischem Schock.
Die Sepsis ist ein schweres, lebensbedrohendes Krankheitsbild resultierend aus einer Infektion mit Bakterien auf systemischer Ebene (Bakteriämie) und weiteren klinischen Befunden gemäß der international gültigen Definition (Madot, I. and
Sprung, C.L. (2001), Int. Care Med. 27, S.3-S.9), die unter anderem auch die systemische Entzündungsreaktion des Körpers mit nachfolgendem Organversagen umfasst. Durchbricht nach einer lokalen Infektion der Erreger die körpereigenen Barrieren (z.B. Epithelien, Endothelien, Blut-Hirn-Schranke), so kann sich aus der daraus resultierenden Bakteriämie eine Sepsis entwickeln. Die Keime gelangen fortlaufend aus dem Sepsisherd (z.B. Abszess, Lunge, Magen-Darm-Trakt), der auch unerkannt bleiben kann, in die Blutbahn und damit in den gesamten Organismus. Die ins Blut und andere immunologische Organe gelangten Keime werden durch Ab- wehrfunktionen des Immunsystems zwar an ihrer Nermehrung gehindert, jedoch meistens nicht vollständig zerstört. Außerdem kommt es durch den Angriff auf die
Keime durch das Immunsystem und auch durch Therapien mit bestimmten Antibiotika zur Freisetzung von bakteriellen Produkten wie Lipopolysaccharid (LPS), Lipoteichonsäure (LTA) und ähnliche (Νau, R. und Eiffert, H. (2002), Clin. Microbiol. Rev. 15, 95-110).
Eine Sepsis ist gekennzeichnet durch Fieber, Hypotonie und eine sogenannte Schocksymptomatik (z.B. Schocklunge, Schockniere, gastrointestinale Blutungen; im Allgemeinen als Multi-Organ-Nersagen bezeichnet). Diese unterschiedlichen Symptome sind die klinischen Zeichen pathophysiologischer Vorgänge, die durch die Keime selbst oder ihre Produkte z.B. Endotoxine, Hämolysine oder Pyrogene bewirkt werden. Als weitere Ursachen können auch pathologische Zustände wie starke Ner- brennungen, Trauma oder akute Lungenveränderungen mit nachfolgender oder gleichzeitiger Besiedelung mit Bakterien, Pilzen oder Niren auftreten. Auch in diesen Fällen wird eine Schocksymptomatik festgestellt, wobei nur teilweise eine direkte Diagnose der Bakterien oder anderer Pathogene möglich ist.
Die Freisetzung von bakteriellen Produkten oder die Bakterien selbst führen zu einer Reaktion des Organismus durch das Immunsystem. Die patienteneigenen Faktoren des Immunsystems sind dabei sowohl protektiv als auch schädlich, abhängig von Konzentration, Wirkort und ähnlichem. Körpereigene Faktoren, die als Reaktion des Körpers auf externe Reize ausgeschüttet werden, interagieren in einer komplexen Art und Weise in den Geweben und führen dadurch unter Umständen zum Krankheitsbild der Sepsis. Der Auslöser dieser Ereignisse ist definitionsgemäß die Anwesenheit von Bakterien und/oder die Anwesenheit von bakteriellen Produkten wie LPS/LTA und andere. Dies führt zur Freisetzung von z.B. Tumor Νekrose Faktor-α, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-8 (IL-8), sowie Faktoren die die Gerinnung beeinflussen (z.B. Platelet Activating Factor, PAF) und Faktoren die regulatorisch auf das entstehende Entzündungsgeschehen eingreifen (wie z.B. Prostaglandine, Leukotriene, Interleukin-10). Durch eine Überreaktion des Körpers, und insbesondere des Immunsystems, entwickelt sich dabei aus der ursprünglich schützenden und infektabwehrenden Antwort das klinische Bild einer Bakteriämie und nachfolgend eine Sepsis (Cohen, J. (2002), Νature 420, 885-891). Zytokin- analysen in septischen Patienten zeigen dabei eine signifikante Korrelation mit .Erhöhung von insbesondere IL-6, IL-8 sowie TΝF-α und einer erhöhten Mortalität (Rodriguez-Gaspar, M. et al. (2001), Cytokine 15, 232-236).
Prinzipiell können zwar nahezu alle Mikroorganismen eine Bakteriämie und damit nachfolgend eine Sepsis auslösen, jedoch hängt die prozentuale Verteilung der Keime vom Alter des Patienten, der Grunderkrankung, dem primären Infektionsherd und ähnlichem ab (Knaus, W.A. et al. (1985), Grit. Gare. Med. 13, 818-829). Leit- keime sind sowohl gram-positive wie auch gram-negative Bakterien, sowie Pilze bzw. Hefen (Llewelyn, M und Cohen, J. (2001), Int. Care Med. 27, S.10-S.32). Therapieverfahren und Wirkstoffe, die die Freisetzung von derartigen Keimprodukten verhindern oder die derartige Produkte binden und neutralisieren oder die körpereigenen Funktionen und Faktoren beeinflussen oder zum Absterben der Keime führen, sind zur Behandlung von Symptomen der oben genannten Erkrankungen geeignet.
Substanzen und Verfahren, die zu einer Erniedrigung der Keimanzahl führen (z.B. Antibiotika) wie auch Substanzen mit kreislaufbeeinflussender Wirkung können therapeutisch genutzt werden (Forth, Henschler, Rummel; Allgemeine und spezielle
Pharmakologie und Toxikologie; Urban & Fischer Verlag (2001), München). Die Standardtherapie bei den oben beschriebenen Erkrankung sind Antibiotika zusammen mit kreislaufstabilisierenden und gerinnungsbeeinflussenden Substanzen oder Lösungen.
Ein weiterer Ansatz ist die Beeinflussung des Krankheitsbildes durch immun- modulatorische Behandlungen, um eine überschiessende Reaktion des Organismus auf Bakterien oder Bakterienprodukte zu verhindern oder zumindest abzumildern und damit ein Organversagen zu vermeiden (Zanotti, S. et al. (2002), Expert Opin. Investig. Drugs 11, 1061-1075).
Dabei sind auch lösliche Mediatoren des Immunsystems, die als Therapie zugeführt werden, von besonderem Interesse. Zu diesen Mediatoren gehören unter anderem auch die sogenannten Defensine, Moleküle mit anti-bakteriellen, anti-fungalen oder auch anti-viralen Eigenschaften (Kagan, B.L. et al. (1994), Toxicology 87, 131-149;
Hancock R.E.W, und Scott M.G. (2000), PNAS 16, 8856-8861). Zusätzlich besitzen diese Moleküle, die kleine Peptide sind, modulatorische Eigenschaften auf das rmmunsystem (Hancock R.E.W, und Scott M.G. (2000), PNAS 16, 8856-8861). Sie bewirken oder verhindern z.B. die Ausschüttung weiterer Mediatoren. Selbst bei optimaler Behandlung nach dem derzeitigen Therapiestandard liegt die Mortalität bei Sepsis und Septischen Schock bei bis zu 50 % der Patienten (Cohen, J. (2002), Nature 420, 885-891). Daher sind zusätzliche therapeutische Behandlungen dringend erforderlich. In verschiedenen Ansätzen die verfolgt werden in der Be- handlung von Patienten mit schweren Bakteriamien, Sepsis und/oder Septischem
Schock zeigt sich jedoch auch bei neueren Therapien, dass eine Eingriff in das Krankheitsgeschehen an einem Punkt nicht, oder nur teilweise zum Erfolg führt. Eine Kombination von verschiedenen therapeutischen Ansätzen erweist sich als am erfolgversprechendsten in der Behandlung erkrankter Patienten (Anel, R.L. und Kumar, A. (2001) Expert. Opin. Investig. Drugs 10, 1471-1485).
Ein Defensin aus Immunzellen des Rhesusaffen (Rhesus-Theta-Defensin 1; RTD-1) wurde isoliert und seine Eigenschaften, seine breite antibakterielle Wirkung, auch gegen nicht wachsende Bakterien, sowie seine antifungische Wirkung im Detail beschrieben (Tang et al. (1999), Science 286, 498-502; Tran et al. (2002), J. Biol.
Chem. 277, 3079-3084) und auch zum Patent angemeldet (WO-00/68265). RTD-1 zeichnet sich durch einige charakteristische und bestimmende Eigenschaften gegen andere Defensine oder kationische Peptide aus. Zum einen ist RTD-1 ein kleines zirkuläres Peptid, und dadurch im Gegensatz zu anderen Defensinen stabil gegen Ab- bau und Degradation. RTD-1 zeigt keine Abhängigkeit der Wirkung von Salzen im
Medium, und dadurch keinen Wirkverlust bei Anwesenheit physiologischer Konzentrationen von verschiedenen Salzen wie z.B. NaCl, KC1 etc. (Mühle et-al. (2001), Biochemistry 40, 5777-5785; Tang et al. (1999), Science 286, 498-502) und auch keinen Wirkverlust in Anwesenheit von humanem Serum (WO00/68265). Zu- sätzlich wurde kein hämolytische Wirkung festgestellt.
In der hier dargestellten Erfindung wird überraschend eine weitergehende Wirkung des RTD-1 in Zuständen der Bakteriämie mit nachfolgender Sepsis und septischem Schock, sowie derartige Krankheitszustände nach Exposition von bakteriellen Pro- dukten wie zum Beispiel LPS gefunden. Dabei ist eine Wirkung auf 4 verschiedene pathologische Zustände, die relevant sind für das Krankheitsbild von schweren Bakteriamien, Sepsis und septischem Schock, gefunden worden. RTD-1 greift in das Krankheitsgeschehen ein, indem es 1. anti-mikrobielle Wirkung gegen verschiedene Erreger zeigt, 2. eine neutralisierende Wirkung auf bakterielle Produkte wie LPS oder LTA (Wirkung auf Produkte von gram-positiven wie auch gram-negativen Bakterien) zeigt, was auch eine prophylaktische Therapie erlaubt, 3. immunmodula- torische Wirkung im Sinne einer Mediatorenmodulation bewirkt und 4. eine regulierte gerinnungshemmende Wirkung aufweist. Durch die kombinierte Wirkung auf verschiedene krankheitsrelevante Parameter wird ein eindeutig verbesserter Therapieerfolg bei vereinfachter Therapie erzielt. Außerdem schließt eine Therapie mit RTD-1 die derzeitigen Standardtherapien (z.B. Antibiotika, kreislaufstabilisierende
Substanzen) nicht aus, und erlaubt eine Kombinationstherapie.
Die Therapie mit RTD-1 führt zu erhöhtem Überleben von Mäusen mit schwerer Bakteriämie nach Applikation lebender Bakterien, und zwar sowohl nach Infektion mit gram-positiven wie auch gram-negativen Bakterien. Dabei ist überraschenderweise keine Abhängigkeit mit der minimalen Hemmkonzentration von RTD-1 auf das verwendete Bakterium festzustellen.
Auch die Therapie von Mäusen mit Symptomen des septischen Schocks nach Gabe von LPS oder SEB zeigt ein deutlich gesteigertes Überleben unter Therapie mit
RTD-1. Zytokinanalysen im Serum oder Plasma der Tiere zeigen eine Regulation der Freisetzung von löslichen Mediatoren. Dabei ist eine Erniedrigung von pro-in- flammatorischen Zytokinen (wie z.B. TNF- , IL-6, MIF) und eine Erhöhung regulatorischer Faktoren (wie z.B. IFN-γ, IL-10) darstellbar. Vergleichbare Er- gebnisse werden in humanem Gesamtblut festgestellt, es kommt zu einer Erniedrigung der Werte für pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen.
Unter Einfluss von RTD-1 zeigt sich eine dosis-abhängige Zunahme der Gerinnungszeit von humanem Plasma und humanem Gesamtblut. RTD-1 zeigt also einen Einfluss auf die Gerinnungsparameter im humanen Blut ohne zusätzliche Beeinflussung der Gerinnung durch bakterielle Produkte wie z.B. LPS oder LTA. Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von Theta-Defensin aus dem Rhesusaffen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prophylaxe von Bakteriamien und/oder Sepsis.
Dabei können die Krankheitsauslöser gram-positive Bakterien, gram-negative Bakterien, bakterielle Produkte, Viren oder Hefepilze sein.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von RTD-1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bindung bakterieller Produkte wie LPS und/oder LTA.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von RTD-1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheitszuständen, die durch Veränderungen in der Blutgerinnung gekennzeichnet sind.
Des weiteren können die genannten Anwendungen in Kombination mit Standard- Antibiotika oder Standard- Antimykotika erfolgen.
Beispiele
Beispiel 1
Test auf anti-bakterielle Wirkung in-vitro
Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration werden Bakterien verschiedener Stämme abgestuften Konzentrationen von RTD-1 ausgesetzt, wobei eine 1:2 Verdünnungsreihe verwendet wird. Die Bestimmung erfolgt nach den Grundsätzen der NCCLS (siehe Dokumentation: Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria, NCCLS document M7-A5, Vol. 20 No. 2).
Tabelle 1: Minimale Hemmkonzentrationen von RTD-1, Vancomycin und Ampicillin auf verschiedene Bakterienspezies bestimmt nach NCCLS Methode. In der Tabelle sind die Konzentration der jeweiligen Verbindungen angegeben, die eine eindeutige Hemmung des Wachstums der Bakterien zeigten.
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Tabelle 1: Minimale Hemmkonzentrationen von RTD-1, Vancomycin und Ampicillin auf verschiedene Bakterienspezies Beispiel 2
In vivo Untersuchungen in krankheitsrelevanten Tiermodellen
Bakteriensuspensionen werden in CFW-1 Mäuse intraperitoneal (i.p.) appliziert. Die Mäuse werden von Harlan bezogen. Nach 30 min. werden die Tiere dann intravenös (i.v.) mit RTD-1 in verschiedenen Dosen therapiert. Das Überleben der Tiere mit und ohne Therapie ergibt den Therapieerfolg.
Tabelle 2: Überleben von Mäusen nach i.p. Infektion mit S. aureus im Bakteriämie- Modell und Therapie mit 0.1, 1 und 10 mg/kg RTD-1 i.V.. Die Mäuse werden mit 1.68 x 107 Kolonien S. aureus ATCC Smith i.p. infiziert und nach 30 min mit den angegebenen Dosen i.v. therapiert. In der Tabelle sind die % Überlebenden aus n= 6 Mäusen an Tag 5 nach Infektion angegeben.
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Tabelle 2: Überleben von S. aureus infizierten Mäusen mit und ohne RTD-1 Therapie
Tabelle 3: Überleben von Mäusen nach i.p. Infektion mit S. pneumoniae im Bakteriämie-Modell und Therapie mit 0.1, 1 und 10 mg/kg RTD-1 i. .. Die Mäuse werden mit 3 x 103 Kolonien S. pneumoniae L3TV i.p. infiziert und nach 30 min mit den angegebenen Dosen i.v. therapiert. In der Tabelle sind die % Überlebenden aus n= 6 Mäusen an Tag 5 nach Infektion angegeben.
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Tabelle 3: Überleben von S. pneumoniae infizierten Mäusen mit und ohne RTD-1 Therapie
Tabelle 4: Überleben von Mäusen nach i.p. Infektion mit E.coli im Bakteriämie- Modell und Therapie mit 0.1, 1 und 10 mg/kg RTD-1 i.V.. Die Mäuse werden mit 1.68 x 107 Kolonien E.coli Neumann i.p. infiziert und nach 30 min mit den angegebenen Dosen i.v. therapiert. In der Tabelle sind die % Überlebenden aus n= 6 Mäusen an Tag 5 nach Infektion angegeben.
Figure imgf000010_0002
Tabelle 4: Überleben von E.coli infizierten Mäusen mit und ohne RTD-1 Therapie
Beispiel 3
Außerdem wird LPS in Mäuse i.p. injiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der LPS-Gabe wird RTD-1 in verschiedener Dosierung i.v. appliziert, um einen septischen Schock zu simulieren. Das Überleben der Tiere ist das Maß für den Therapieerfolg im Modell für den septischen Schock. Tabelle 5: Überleben von Mäusen nach i.p. Applikation von 20 mg/kg LPS von S.typhimurium (Sigma) und Therapie mit 0.1, 1 und 10 mg/kg RTD-1 i.v. zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach LPS-Gabe. In der Tabelle sind die % Überlebenden aus n= 5 Mäusen an Tag 5 nach LPS-Gabe angegeben.
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Tabelle 5: Überleben von LPS-behandelten Mäusen mit und ohne RTD-1 Therapie
Beispiel 4
Untersuchungen zur Bindung bakterieller Produkte
Die Bindung von RTD-1 an Lipopolysaccharid (LPS) und Lipoteichonsäure (LTA) wird in einem Bindungsansatz in-vitro untersucht. Dabei wird Dansyl-Polymyxin B verwendet (Moore et al. (1986), Antimicrob. Agents Chemotherap. 29, 496-500), das nach Bindung an LPS oder LTA fluoresziert. In Kommpetition mit RTD-1 ergibt sich eine Abnahme der Fluoreszenz und daraus resultierend eine Bestimmung der relativen Inhibition der Bindung von Dansyl-Polymyxin B.
Aus der Inhibition lässt sich wiederum eine relevante Affinität des RTD-1 bezüglich einer Bindung bakterieller Produkte berechnen.
Tabelle 6: LPS und LTA Bindung durch RTD-1 und Polymyxin B nach 4 Stunden Inkubation. Angegeben ist die Konzentration, bei der die Fluoreszenz von Dansyl- Polymyxin um 50 % verringert wird.
Figure imgf000012_0001
Tabelle 6: LPS und LTA Bindung durch RTD-1 und Polymyxin B.
Beispiel 5
Die Membranpermeabilität von Bakterien unter Einfluss von RTD-1 wird untersucht indem eine Fluoreszenzmethode angewandt wird (Silvestro et al. (2000), Antimicrob. Agents Chemotherap. 44, 602-607). Dies erlaubt eine Bewertung des Potentials des RTD-1 bezüglich Schädigungen der Zellmembran von Bakterien und damit auf die Freisetzung von bakteriellen Produkten.
Tabelle 7: Membranpotentialänderung unter Einfluss von RTD-1 und Polymyxin B nach 10 Minuten Einwirkung auf S. aureus Bakterien. Dargestellt ist Konzentration, die zu einer 50 %igen Änderung des Fluoreszenzsignals fuhrt.
Figure imgf000012_0002
Tabelle 7: Membranpotentialänderung unter Einfluss von RTD-1 und Polymyxin B.
Beispiel 6
Des weiteren wird der Einfluss von RTD-1 auf die Zellwandsynthese von Bakterien untersucht. Dabei wird RTD-1 zu einer Membranfraktion aus E. coli (als Beispiel für gram-negative Bakterien) oder aus Bacillus megaterium (als Beispiel für grampositive Bakterien) und den notwendigen Substraten gegeben und die hemmende Aktivität bestimmt (Chandrakala, B. et al. (2001) Antimicrob. Agents Chemother. 45, 768-775). Dieser Ansatz bestimmt den Einbau radioaktiver Vorstufen in hochmolekulares Peptidoglykan über Bindung an Weizenkeimagglutinin. Ein Einfluss von RTD-1 auf die Zellwandsynthese in Bakterien gibt wesentliche Aufschlüsse auf eine Wirkung auf das Bakterium (z.B. Lyse) und insbesondere im Zusammenhang mit der Freisetzung bakterieller Produkte, was eine wesentliche Voraussetzung für die Beurteilung des therapeutischen Potentials von RTD-1 in schweren Infektionen inklusive septischem Schock ist.
Tabelle 8: Inhibition der Zellwandsynthese durch RTD-1, Ampicillin (Sigma), ein Lactam Antibiotikum, Chloramphenicol (Sigma), ein Proteinbiosynthesehemmer und Vancomycin (Sigma), ein Glycopeptid Antibiotikum. Dargestellt ist die Inhibition der Bindung an Weizenkeimagglutinin von radioaktiven Vorstufen in hochmolekulares Peptidoglykan. Nur Substanzen mit Einfluss auf die Zellwandbiosynthese, aber nicht Proteinbiosynthesehemmer zeigen eine Inhibition in diesem Ansatz.
Figure imgf000013_0001
Tabelle 8: Inhibition der Zellwandsynthese bei gram-negativen und gram-positiven
Bakterien bzw. Bakterienlysaten durch RTD-1, Ampicillin, Vancomycin und Chloramphenicol. Beispiel 7
Untersuchungen zum Einfluss auf Thromboplastinzeit (PT)
Dieser Parameter wird zur Bestimmung von Störungen im exogenen System der
Blutgerinnung eingesetzt. Die Bestimmung der Thromboplastinzeit erfolgt im Zitrat- Plasma nach Zugabe von Calcium und Gewebefaktor. Dafür wird Blut von gesunden Menschen beiderlei Geschlechts in Sammelgefäßen mit Zitrat (Monovetten, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) abgenommen und das Plasma nach Zentrifugation ge- wonnen. Proben dieses Plasmas werden mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindungen für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird Thromplastin (Recombiplastin, OrthoDiagnostic Systems, Neckargemünd, Deutschland) zugegeben um die den exogenen Weg der Blutgerinnung zu starten. In einem Gerät zur Gerinnungsbestimmung (Coagulometer, Amelung, KC 4A micro) wird dieser Ansatz gemixt und Gerinnungszeit bestimmt.
Untersuchungen zum Einfluss auf die partielle Thromboplastinzeit (aPTT)
Dieser Parameter wird zur Bestimmung von Störungen im endogenen System der Blutgerinnung eingesetzt. Die Bestimmung der Thromboplastinzeit erfolgt im Zitrat-
Plasma nach Zugabe eines Aktivators und Phospholipid. Dafür wird Blut von gesunden Menschen beiderlei Geschlechts in Sammelgefäßen mit Zitrat (Monovetten, Sarstedt, Nürnbrecht, Deutschland) abgenommen und das Plasma nach Zentrifugation gewonnen. Proben dieses Plasmas werden mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindungen für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird der Aktivator
Kaolin und Phospholipid (aPTT Reagenz, Diagnostica Stago, Asnieres, Frankreich) zugegeben. Die Gerinnung wird gestartet durch Zugabe von 0,025 M Calciumchlorid zu diesem Gemisch. In einem Gerät zur Gerinnungsbestimmung (Coagulometer, Amelung, KC 4A micro) wird dieser Ansatz gemixt und Gerinnungszeit bestimmt. Tabelle 10: Beeinflussung der Gerinnungsparameter aPTT, PT, sowie die Gerinnungszeit von humanem Gesamtblut unter Einfluss von RTD-1. Dargestellt ist gemessene Gerinnungszeit in Sekunden nach Zugabe von RTD-1.
Figure imgf000015_0001
Tabelle 10: Beeinflussung der Gerinnungsparameter aPTT, PT, sowie die Gerinnungszeit von humanem Gesamtblut unter Einfluss von RTD-1.
Beispiel 8
In vivo Zytokin Untersuchungen in krankheitsrelevanten Tiermodellen
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach LPS oder SEB Gabe in Mäusen werden Blutproben durch Entbluten der Tiere gewonnen. Aus diesen Blutproben werden Plasma- proben gezogen und einer Zytokinanalyse unterworfen. Die Zytokinmenge im
Plasma wird quantitativ mittels der CBA Methoden bestimmt (CBA system, BectonDickinson, Heidelberg, Deutschland).
Tabelle 11: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Mausmodell des septischen Schocks nach Verabreichung von LPS. Angegeben ist die maximale prozentuale Änderung im Vergleich zur unbehandelten LPS-Kontrolle. Negative Werte geben ein Verringerung, positive Werte ein Steigerung der Zytokinmenge im Plasma an.
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Tabelle 11: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Mausmodell des septischen Schocks nach Verabreichung von LPS.
Tabelle 12: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Mausmodell des septischen Schocks nach Verabreichung von SEB. Angegeben ist die maximale prozentuale Änderung im Vergleich zur unbehandelten SEB-Kontrolle. Negative
Werte geben ein Verringerung, positive Werte ein Steigerung der Zytokinmenge im Plasma an.
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Tabelle 12: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Mausmodell des septischen Schocks nach Verabreichung von SEB. Beispiel 9
Ex vivo Zytokin Untersuchungen im infizierten Humanblut
Von gesunden Spendern wird Blut abgenommen und in vitro mit Bakterien infiziert. Dabei werden sowohl gram-positive Erreger (S. aureus), wie auch gram-negative Erreger (E. coli) verwendet. Nach Zugabe der Erreger werden zu definierten Zeitpunkten Proben des infizierten und des infizierten und behandelten Blutes genommen und durch Zentrifugation das Plasma gewonnen. Die Zytokinmenge im Plasma wird quantitativ mittels der CBA Methoden bestimmt (CBA system, BectonDickinson, Heidelberg, Deutschland). Zusätzlich erfolgt die Analyse auf MIF durch ELISA Technik (human MIF ELISA System, R&D Systems Inc., Minneapolis, USA).
Tabelle 13: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Infektionsmodell mit humanem Gesamtblut nach Verabreichung von S. aureus. Angegeben ist die maximale prozentuale Änderung von pro-inflammatorischen Mediatoren im Vergleich zur unbehandelten Infektionskontrolle. Negative Werte geben ein Verringerung, positive Werte ein Steigerung der Zytokinmenge in der Blutkultur an.
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Tabelle 13: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Infektionsmodell mit humanem Gesamtblut nach Verabreichung von S. aureus. Tabelle 14: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Infektionsmodell mit humanem Gesamtblut nach Verabreichung von E. coli Angegeben ist die maximale prozentuale Änderung im Vergleich zur unbehandelten Infektionskontrolle. Negative Werte geben ein Verringerung, positive Werte ein Steigerung der Zytokinmenge in der Blutkultur an.
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Tabelle 14: Zytokinmodulation nach Therapie mit RTD-1 im Infektionsmodell mit humanem Gesamtblut nach Verabreichung von E. coli
Formulierungen
RTD-1 kann in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspen- sionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von 0,5 bis 90 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein, d.h. in Mengen, die ausreichend sind, um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Strecken der Wirkstoffe mit Lösungsmitteln und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z.B. im Fall der Benutzung von Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als Hilfs- lösungsmittel verwendet werden können. Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise intravenös, transdermal, oral oder parenteral, insbesondere oral oder intravenös. Sie kann aber auch durch Inhalation über Mund oder Nase, beispielsweise mit Hilfe eines Sprays erfolgen, oder topisch über die Haut.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwa 0,001 bis 10 mg/kg, bei oraler Anwendung vorzugsweise etwa 0,005 bis 3 mg/kg Körpergewicht zum Erzielen wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikationsweges, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchen die Verabrei- chung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Literaturliste:
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Moore et al. (1986), Antimicrob. Agents Chemotherap. 29, 496-500 Mühle et al. (2001), Biochemistry 40, 5777-5785 Silvestro et al. (2000), Antimicrob. Agents Chemotherap. 44, 602-607 Tang et al. (1999), Science 286, 498-502 Tran et al. (2002), J. Biol. Chem. 277, 3079-3084
Abkürzungsliste:
ATCC American Type Culture Collection
LPS Lipopolysaccharid
LTA Lipoteichonsäure
MHK Minimale Hernmkonzentration
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
RTD Rhesus Theta Defensin

Claims

Patentansprüche
1. Nerwendung von RTD-1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Bakteriamien.
2. Nerwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Krankheitsauslöser gram-positive Bakterien, gram-negative Bakterien, bakterielle Produkte oder Hefepilze sind.
3. Nerwendung von RTD-1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bindung bakterieller Produkte wie LPS und/oder LTA.
4. Nerwendung von RTD-1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und oder der Prophylaxe des septischen Schocks.
5. Nerwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Krankheitsauslöser gram-positive
Bakterien, gram-negative Bakterien, bakterielle Produkte oder Hefepilze sind.
6. Nerwendung gemäß Anspruch 1 in Kombination mit Standard- Antibiotika.
7. Nerwendung gemäß Anspruch 1 in Kombination mit Standard- Antimykotika.
8. Nerwendung gemäß Anspruch 4 in Kombination mit Standard- Antibiotika.
9. Nerwendung gemäß Anspruch 4 in Kombination mit Standard- Antimykotika.
10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels enthaltend RTD-1 sowie pharmazeutische Hilfsmittel.
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