WO2003082917A1

WO2003082917A1 - Nouveau polypeptide et acide nucleique le codant

Info

Publication number: WO2003082917A1
Application number: PCT/JP2003/000522
Authority: WO
Inventors: Yoshihide Hayashizaki; Harukazu Suzuki; Mutsumi Kanamori; Matthias Harbers
Original assignee: The Institute Of Physical And Chemical Research; Kabushiki Kaisha Dnaform
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2003-10-09
Also published as: JP2003289870A; US20070042363A1

Description

明細書

新規ポリべプチド及びそれをコードする核酸

技術分野

本発明は、腫瘍壊死因子レセプタ一関連因子 2 (TRAF2)と結合する新規なポリぺプチド及びそれをコードする核酸に関する。

背景技術

腫瘍壊死因子レセプター関連因子 (TRAFs)は、 TNFレセプターファミリーを介したシグナル伝達経路上のアダプタータンパク質であることがわかっている。 TR AF遺伝子ファミリ一は、 TRAF1ないし TRAF6の 6種類の遺伝子から成り、各タンパク質のカルボキシ末端の保存された TRAF ドメインにより特徴付けられる（1 - 5) _c TRAFファミリーの中で、 TRAF2は、 TNF-媒介シグナル伝達経路に包含される。 TN Fレセプター 1 (TNFR1)が TNFにより刺激されると、 TNFR1が、 TRADD (TNFR -関連死ドメインタンパク質（TNFR-associated death doma i n protei n)のァミノ末端を介して間接的に了1^^2を集める（6, 7)。活性化された TRAF2は、 NF - κ Β及び AP-1 の活性化を媒介する RI P (8, 9)及び ASK1 (10)を包含する数種類のタンパク質を集め、その結果、細胞性又は免疫性の機能を有する多くの遺伝子が誘導される（11， 12)。 TRAF2の相互作用に加え、 TRADDはまた、 death ドメインを有するアダプタ一分子である FADDと相互作用する（13)。 FADDは、細胞死プロテアーゼカスケ一ドの開始プロテアーゼであるキャスパーゼ (caspase) - 8を集めて活性化し、アポトーシスを引き起こす（14)。従って、 TRAF2は、 TNF -媒介細胞生存において鍵となる分子であり、ここでは種々のタンパク質が TRAF2との相互作用によってシグナル伝達経路を制御している。

従って、 TRAF2と結合する新規なタンパク質を見出し、特徴付けることは、 TN F -媒介シグナル伝達経路に関与する生理学的及び病理学的過程の理解にとって重要である。また、このようなタンパク質は、 TNF-媒介シグナル伝達経路が関与する疾病の診断および治療の対象としての用途を有する可能性がある。

従って、本発明の目的は、 TRAF2と結合する新規なタンパク質及びそれをコードする核酸を提供することである。本願発明者らは、銳意研究の結果、マウス c D N Aライブラリーから、哺乳動物 2—ハイブリツドアッセィ（mamma l ί an two-hybr i d assay)により、 TRAF2と結合する新規なタンパク質をコードする c D N Aを見出し、かつ、これによリコードされるタンパク質が TRAF2と結合することを実験的に確認して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 6 2番目のアミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、 1〜 4 0個のァミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたァミノ酸配列を有する領域を含み、 TRAF2との結合能を有するポリペプチドを提供する。また、本発明は、配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 6 2番目のアミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、 1〜4 0個のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有する領域を含み、 TR AF2との結合能を有するポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸が導入された細胞であって、上記本発明のポリペプチドを発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の核酸とハイブリダィズする核酸であって、上記本発明の核酸の検出に用いることができる核酸を提供する。さらに本発明は、該検出用核酸をプローブ又はブライマ一として用いて上記本発明の核酸を測定する方法を提供する。

本発明により、 TRAF2と結合する新規なポリぺプチド及びそれをコードする核酸が初めて提供された。本発明のポリペプチドは、 TRAF2と結合するので、 TRAF 2が介在するシグナル伝達の研究において重要である。また、本発明のポリぺプチドは、 NF-zc Bシグナルを活性化させ、それが TNFを介した伝達であることが示唆されることから、その機能を阻害することにより、 NF- ί Βシグナルを減弱させることが可能である。よって、 NF- ΛΓ Β シグナルが関与する疾患として炎症、リウマチなどの治療薬開発のためのターゲットとして有用である。また、 NF - c B シグナルは破骨細胞の活性化にも関与しているので、骨そしょう症治療薬開発のためのターゲッ卜としても有用である。

図面の簡単な説明

図 1の Aは、哺乳動物 2—ハイブリッド法の結果を示し、 Bは、ヒト及びマウス T2BPのァミノ酸配列を比較して示す図である。

図 2の Aは、 TRAF2及びその欠失変異体を模式的に示すもの並びにそれらと野生型 T2BPとの相互作用を示し、 Bは、 T2BP及びその欠失変異体を模式的に示すもの並びにそれらと野生型 TRAF2との相互作用を示す。

図 3は、本発明の実施例で行った、 T2BPが TRAF2と結合することを示す免疫共沈降の結果を示す図である。

図 4は、本発明の実施例で行った、各種組織中の T2BPの発現を示す、ノーザンブロット分析の結果を示す図である。

図 5は、本発明の実施例で行った、 T2BPをトランスフヱク卜した 2 9 3細胞中での NF- 及び AP-1の活性化を示す、 Τ2ΒΡ量と相対ルシフェラ一ゼ活性の関係を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

下記実施例に詳述する方法により、マウス生後 3日目の胸腺由来の c D N Αライブラリーから、哺乳動物 2—ハイブリッドアツセィの手法を用いて、 TRAF2と結合する新規なポリべプチドをコ一ドする c D N Aを見出した。その塩基配列を、推定アミノ酸配列と共に配列番号 4に示す。配列番号 3には、配列番号 4に示されるアミノ酸配列のみを取り出して示す。このポリペプチドを、「T2BPJ (TRAF 2- b i nd i ng prote i n)と命名した。また、 BLASTによる相同性検索により、ヒ卜の機能未知遺伝子の中からマウス T2BP cDNAと相同性の高い c D N Aを見出した。このヒト由来 c D N Aの塩基配列を、推定アミノ酸配列と共に配列番号 2に示す。配列番号 1には、配列番号 2に示されるアミノ酸配列のみを取り出して示す。配列番号 1記載のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、マウス T2BPと高い相同性（約 7 8 %) を有し、また、フォークヘッド関連（forkhead- assoc i ated (FHA) )ドメインのような特徴的なモチーフを有することから、ヒト T2BPであることは明らかである。このように、本発明のポリペプチド（T2BP)の好ましい実施例は、配列番号 1又は 3で示されるァミノ酸配列を有する。

下記実施例において、具体的に示されるように、 T2BPの第 1番目から第 1 62 番目までの領域（以下、例えば第 1番目のアミノ酸残基を便宜的に aaj のように、また、例えば第 1番目から第 1 62番目のアミノ酸残基から成る領域を Γ 1-1 62aa」のように記載することがある）のみから成る欠失変異体が、 TRAF2 との結合能を示したことから、この領域を含んでいれば TRAF2との結合能を有する。また、一般に生理活性を有するポリペプチドのうち、少数のアミノ酸配列が置換し、欠失し又は挿入された場合でも、該生理活性が維持されることがあることは周知である。実際、ヒトとマウスの T2BPでは、 1-1 62aaの領域で 33個のアミノ酸残基が相違している（相同性約 80%) 。従って、本発明のポリべプチドは、配列表の配列番号 1又は 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62 番目のアミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、 1〜40個のァミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたァミノ酸配列を有する領域を含み、 TRAF2との結合能を有するポリペプチドと定義される。置換、欠失、挿入されるアミノ酸数は、上記した 33個以下であることが好ましい。

配列番号 1のァミノ酸配列の 1- 1 62aaにおいて、配列番号 3のァミノ酸配列の 1-1 62aaと相違しているアミノ酸残基は、 2、 3、 20、 26、 28、 32、 35、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 7 1、 74、 77、 95、 97、 1 00、 1 01、 1 1 4、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 47、 1 56、 1 57及び 1 58aaである。従って、これらのアミノ酸残基は重要ではなく、置換又は欠失していてもよく、また、これらのァミノ酸残基に隣接する位置に 1〜 3個のァミノ酸残基が挿入されていてもよい。また、 1aaのメチォニンは、転写開始コドンであるのでほとんど全てのタンパク質は、翻訳直後の 1aaはメチォニンであるが、多くの生理活性タンパク質では、 1 aaはメチォニン以外のアミノ酸であることから、 1aaのメチォニンがなくても TRA F2との結合能は維持されると考えられる。

同様に、配列番号 3のアミノ酸配列の 1-1 62aaにおいて、配列番号 1の 1-1 62aaのアミノ酸配列と相違しているアミノ酸残基は、 2、 3、 20、 27、 3 1、 34、 36、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 71、 74、 7 7、 95、 97、 1 00、 1 01、 1 1 4、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 47、 1 56、 1 57及び 1 58 aaである。従って、これらのアミノ酸残基は重要ではなく、置換又は欠失していてもよく、また、これらのァミノ酸残基に隣接する位置に 1 ~ 3個のァミノ酸残基が挿入されていてもよい。さらに、配列番号 1では、配列番号 3の 25aaと 26aaの間にアミノ酸残基が挿入されていることから、配列番号 3の 25aaと 26aaの間に 1〜3個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。また、 1aaのメチォニンは、転写開始コドンであるのでほとんど全てのタンパク質は、翻訳直後の 1aaはメチォニンであるが、多くの生理活性タンパク質では、 1aaはメチォニン以外のアミノ酸であることから、 1aaのメチォニンがなくても TRAF2との結合能は維持されると考えられる。

上記の通り、 1-1 62aa断片が TRAF2との結合能を有することは実験的に確認されているが、 1-184aa (全長) を有する方が TRAF2との結合能がより高いことからょリ好ましい。配列番号 1のアミノ酸配列において、配列番号 3のアミノ酸配列と相違しているアミノ酸残基は、 2、 3、 20、 26、 28、 32、 35、 3 7、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 71、 74、 77、 95、 97、 1 00、 1 01、 1 1 4、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 47、 1 56、 1 57、 1 58、 1 63、 1 65、 1 68、 1 69、 1 70、 1 71、 1 72、 1 73、 1 77及び 1 84aaである。従って、これらのアミノ酸残基は重要ではなく、置換又は欠失していてもよく、また、これらのァミノ酸残基に隣接する位置に 1〜 3個のァミノ酸残基が挿入されていてもよい。また、上記の通り、 1aaのメチォニンは、転写開始コドンであるのでほとんど全てのタンパク質は、翻訳直後の 1aaはメチォニンであるが、多くの生理活性タンパク質では、 1aaはメチォニン以外のアミノ酸であることから、 1aaのメチォニンがなくても TRAF2との結合能は維持されると考えられる。同様に、配列番号 3のァミノ酸配列において、配列番号 1のァミノ酸配列と相違しているアミノ酸残基は、 2、 3、 20、 27、 31、 34、 36、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 71、 74、 77、 95、 97、 1 00、 1 01、 1 1 4、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 47、 1 56、 1 57、 1 58、 1 63、 1 65、 1 68、 1 69、 1 70、 1 71、 1 72、 1 73、 1 77及び 1 84aaである。従って、これらのアミノ酸残基は重要ではなく、置換又は欠失していてもよく、また、これらのアミノ酸残基に隣接する位置に 1〜 3個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。さらに、上記の通り、配列番号 1 では、配列番号 3の 25aaと 26aaの間にァミノ酸残基が揷入されていることから、配列番号 3の 25aaと 26aaの間に 1〜 3個のアミノ酸残基が挿入されていてもよしゝ。また、上記の通り、 1aaのメチォニンは、転写開始コドンであるのでほとんど全てのタンパク質は、翻訳直後の 1aaはメチォニンであるが、多くの生理活性タンパク質では、 1aaはメチォニン以外のアミノ酸であることから、 1aaのメチォニンがなくても TRAF2との結合能は維持されると考えられる。

本発明のポリべプチドを相同性に基づいて規定すると、配列表の配列番号 1又は 3に示されるァミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のァミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列と 70%以上の相同性を有する領域を含み、 TRAF2との結合能を有するポリべプチドである。配列番号 1と 3の 1-1 62aaの相同性は、約 80%であるので、 1-1 62aaの相同性は 80%以上であることが好ましい。また、上記の通り、配列番号 1又は 3に示されるアミノ酸配列の全長を有することがより好ましいが、この場合の両者の相同性は約 78%であるので、全長の相同性は 78%以上であることが好ましい。.なお、ここで言う、相同性は、図 1の Bに示されるように、両者のポリペプチドのアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように整列させ、一致しているァミノ酸残基の数を全体のァミノ酸残基の数で除することにより計算できる。なお、このような相同性の計算は、 BLASTのような市販のソフ卜を用いて容易に行うことができる。長さが異なる配列同士を比較する場合には、短い方のアミノ酸残基数で除する。

本発明のポリべプチドは、下記実施例に詳述する方法によっても生産できるし、本発明によりそれをコードする c DN Aの塩基配列が明らかになつたので、 RT-P CR等の常法によりポリべプチドをコードする核酸を調製し、それを常法により細胞中で発現させることにより容易に生産することができる。本発明は、また、上記本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。ここで言う「核酸」には、 D N Aも R N Aも包含される。これらの核酸は、上記本発明のポリべプチドを遺伝子工学的に産生する際の鏡型として利用することができる。核酸の好ましい実施例の具体的な塩基配列は、上記の通り配列番号 2及び 4に示されている。また、上記の通り、置換、欠失、挿入を含むポリペプチドであって、 TRAF2との結合能を有するものをコードする核酸も本発明の核酸であるこのような核酸は、配列番号 2又は 4で示される塩基配列を有する核酸又は該核酸とストリンジェント条件下（すなわち、 5 X Denhardt's reagent, 6 x SSG, 0. 5 % SDS又は 0. 1 % SDSといった一般的なハイブリダィゼ一シヨン溶液を用いて 5 0 〜6 5 °Cで、好ましくは 5 0 °Cと 6 0 °Cの 2段階、又は、 5 0 °C、 5 5 °C、 6 0 °C、 6 5 °Cの 4段階で反応を行なう）でハイブリダイズするものであることが好ましい。

本発明は、上記本発明の核酸をみ、宿主細胞中で該核酸を発現することができる発現ベクターをも提供する。このような発現ベクターは、上記本発明の核酸を市販の発現べクタ一のクローニング部位に挿入することにより容易に調製することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。また、本発明は、このような本発明の発現ベクターにより上記本発明の核酸が導入された細胞であって、上記本発明のポリペプチドを発現する細胞をも提供する。このような細胞は、上記本発明の発現べクターを常法によリ宿主細胞にトランスフエクトすることによリ容易に調製でき、下記実施例にも具体的に記載されている。

本発明は、また、上記本発明の核酸とハイブリダィズする核酸であって、上記本発明の核酸の検出に用いることができる核酸（以下、便宜的に「検出用核酸」と言うことがある）をも提供する。このような核酸は、 P C Rや NASBA等の核酸増幅法のプライマ一であってもよいし、標識を付したプローブであってもよい。プライマーの場合、ハイブリダィズしないと錶型核酸の増幅が起きないので、増幅が起きるか否かによリ該プライマーとハイプリダイズする本発明の核酸が被検試料中に含まれているか否かを調べることができる。また、プローブの場合、ハィブリダイズしないとプロ一ブの標識が検出されないので、プロ一ブの標識を検出することによリ被検試料中に本発明の核酸が存在するか否かを検出することができる。これらの検出用核酸は、検出の特異性を高めるために、塩基数が 1 5以上であることが好ましく、プライマーの場合には塩基数が 2 0〜 5 0がよリ好ましく、プローブの場合には塩基数が 2 0〜全長が好ましい。なお、このような検出用核酸は、リアルタイム検出 P C Rのプライマーに用いることや、プローブの標識を定量すること等により、本発明の核酸の定量に利用することもできる。

P C Rのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。すなわち、例えば、錶型となる被検核酸（例えば、本発明のポリペプチドの遺伝子の c D N A)と本発明の検出用核酸（プライマー）の一対とを、緩衝液中で、 Taqポリメラーゼ及び dNTPの存在下で、変性、アニーリング、伸長の各工程を反応液の温度を変化させることにより行う。 .通常、変性工程は、 9 0〜9 5 °C、ァニーリング工程は、錶型とプライマーの Tm又はその近傍（好ましくは ± 4 °C以内）、伸長工程は Taqポリメラーゼの至適温度である 7 2 °Cで行われる。各工程は 3 0秒〜 2分程度で適宜選択される。この熱サイクルを例えば 2 5〜4 0回程度繰り返すことにより、一対のプライマーで挟まれた錶型核酸の領域が増幅される。なお、核酸増幅法は P C Rに限定されるものではなく、この分野において周知の他の核酸増幅法も用いることができる。このように、上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を錶型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをェチジゥムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイ口ン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダィズする標識プローブとハイブリダィズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クェンチヤ一蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出 P C Rを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出 P C R用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、 m R N Aでも、 m R N Aから逆転写した c D N Aであってもよい。被検核酸として m R N Aを増幅する場合には、上記一対のプライマ一を用いた NASBA法 (3SR法、 TMA法）を採用することもできる _c NASBA法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。

プローブとしては、上記検出用核酸に蛍光標識、放射標識、ビォチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。核酸の標識方法自体は周知である。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダィズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、検出用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダィズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。なお、核酸プローブを用いた被検核酸の測定方法もこの分野において周知であり、緩衝液中、核酸プローブを被検核酸と Tm又はその近傍 (好ましくは土 4 °C以内）で接触させることによリハイブリダィズさせ、洗浄後、ハイブリダィズした標識プローブ又は固相プローブに結合された錶型核酸を測定することによリ行うことができる。このような方法には、下記実施例に記載されるノーザンブロットゃインサイチューハイブリダィゼーシヨン、さらにはサザンブロット法等の周知の方法が包含される。

下記実施例で具体的に示されるように、本発明のポリペプチドは、 NF- シグナルを活性化させ、それが TNFを介した伝達であることが示唆されることから、その機能を阻害することにより、 NF - κ Βシグナルを減弱させることが可能である。よって、 NF- cBシグナルが関与する疾患として炎症、リウマチなどの治療薬開発のためのターゲットとして有用である。また、 NF- Bシグナルは破骨細胞の活性化にも関与しているので、骨そしょう症治療薬開発のためのターゲットとしても有用である。さらに、本発明の検出用核酸は、 T2BP遺伝子の発現量の測定に用いることができるので、炎症、リウマチ、骨そしょう症などの病態のモ二ターに使用することが可能である。また、炎症、リウマチ、骨そしょう症などの治療薬が、 T2BP遺伝子の発現を抑制するものである場合やアンチセンス RN Aであるような場合には、これらの治療薬の薬効の評価に用いることもできる。実施例

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実験はすべてマウス T2BPを用いておこなつた。

材料及び方法

細胞培養

10%熱不活化ゥシ胎児血清 (FBS)、 200 U/mlベニシリン及ぴ 200〃 g/mlストレプトマイシンを添加した最少必須培地中で、ヒト胎児腎臓セルライン 293 (Gr aham, F丄， Smi ley, 丄， Russel l, W. C. , Nairn, R.： J Gen Vi rol , 36, 59-74 (1 977)。理化学研究所細胞バンクから入手）を培養した。 293T 細胞（DuBridge RB, Tang P, Hsia HC, Leong P , Mi l ler JH, Calos MP： Mol Cel l Biol 7， 379-87 (1987)) 及び GH0-K1細胞（Kao, F. T. , Puck, T. T.： Proc Nat Acad Sci U S A, 60, 1275-1281 (1968)。理化学研究所細胞バンクから入手）は、それぞれ 10% FBS及び抗生物質を添加した、ダルベッコ修飾イーグル培地及び F- 12栄養混合培地（HanT s F-12)中でそれぞれ維持した。

哺乳動物 2—ハイプリッドアッセィ

公知の方法（15)に従い行った。すなわち、先ず、次のようにして 2段階 P C R によリアッセィ用サンプルを調製した。 T2BP及び TRAF2の c DN A (それぞれマウス生後 3日目の胸腺由来の c DN Aライブラリー、成マウスの精巣由来の c DN Aライブラリ一中に含まれる）を錶型として各々のタンパク質コード領域を含む領域を、タグを付けた遺伝子特異的プライマー（正鎖プライマー T2BP, gaag gagccgccaccatgtccacctttgaagac ；正鎖プライマ一 TRAF2, gaaggagccgccaccatgg ctgcagccagtgt. 公知のタンパク領域予測ソフトを用いて設計）及びベクター配列に対するプライマー（逆鎖プライマー P8 ; agcggataacaatttcacacaggaaa) を用いた P CRにより増幅した（第 1段）。また、 SV40 poly- Aシグナルの DN A断片及び Gal 4 DNA -結合ドメイン又はへルぺスウィルス V16転写活性化ドメインが後に続くヒトサイ卜メガロウィルス（GMV)極初期プロモーターを増幅した（用いた正逆のプライマーの塩基配列および錶型は、それぞれ次のとおり； SV40 p 01 y-Aシグナノレの D N A断片， gtttcctgtgtgaaattgttatccgctgcagacatgataagata cattg(IE) agcaagttcagcctggttaagatccttatcgattttaccac (逆) 、 pG5luc(Prome ga社製)； Gal 4断片、 ccaatatgaccgccatgttggc (正）、 catggtggcggctccttccggc gatacagtcaactg (逆）、 pBIND(Promega社製) ； VP16断片、 ccaatatgaccgccatg ttggc (正）、 catggtggcggctccttcaagtcgacggatccctggc (逆）、 pACT (Pr omega 社製））。第 2段の PC Rでは、第 1の PC R産物と、 SV40 poly-Aシグナル断片と、 Gal4又は VP16断片とを連結し、 P C R産物が Gal4又は VP16 ドメインとの融合タンパク質として発現されるように設計した。なお、第 2段の PCRで用いたプライマーの塩基配列は、 gGGatgttggcattgattattgac (正）及び agcaagttc agcctggttaag (逆）であった。得られた P C R産物 (0.13 を、 20 ngのレポ —タープラスミド卩6511^とともに2.2 X 10⁴個の GH0 - K1細胞にトランスフエクション試薬[/2000(1^ 1"(^6 社製）を用いて卜ランスフエクトした。 20時間インキュベートした後、 Steady-Glo (商品名）ルシフェラ一ゼアツセィシステム (Promega社製）によリルシフェラーゼレポーター活性を測定した。

免疫共沈降分析

T2BP及び TRAF2 c D N Aのタンパク質コード領域を含む領域を、遺伝子特異的プライマー（T2BPの正鎖用プライマーの塩基配列； gacgcgtGgaccatgtGGacGt ttgaagacg_s TRAF2の正鎖用プライマーの塩基配列； gaGgGgtGgaccatggGtgGagGGa gtgt。逆鎖用プライマーはべクタ一部位に対して作成し、塩基配列は GGggttaag cggccgcagcggataacaatttcacacaggaaac) を用いた P C Rにより増幅した後に制限酵素 Sailおよび Notlで消化した断片を、発現ベクター pGMV- HA及び pCMV-Myc ( いずれも Glontech社製）にそれぞれサブクローニングした。トランスフエクシヨン試薬 LF2000 (商品名）を用い、 HA-T2BP又は Myc- T2BPを発現するための発現用べクタ一 2.5 gで 293T細胞（1 X 10⁶個）をトランスフエクトした。なお、 HA又は Mycは抗体が認識するタグ配列の名前を意味する。 24時間ィンキュベ —卜した後、細胞を回収し、 10 ni of Tris-HCI (pH 7.8), 1% NP40 (商品名）， 0.15 NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF and 10 μ g/ml ロイぺプチン (PEPTIDE I NSTITUTE Inc.製）から成る TNE緩衝液で溶解した。 10,000 x gで 1 5分間遠心後、上清を単離し、 5 / gの抗 HAタグ抗体（Santa Cruz社製）で免疫沈降させた。共沈殿した Myc-TRAF2の検出は、ウェスタンプロット分析により行った。 La e國 uliサンプル緩衝液中の試料を 5分間煮沸し、 12.5% SDS - PAGEにかけ、タンパク質を Hybond-EGL膜（Amersham社製）に転写した。ウェスタンプロットは、抗 Mycタグ抗体と 1時間、次いで HRP-結合抗マウス I g G (Amersham社製）と 1 時間インキュベートし、次いで洗浄を行う、通常の方法により行った。シグナルの検出は、 EGLシステム（Amersham社製）及び X-線フィルム（Kodak社製）を用いて行った。また、培養上清を、上記した一次抗体及び二次抗体を用いた直接的なゥエスタンブロッ卜に付すことによリ、 HA- T2BP及び Myc-TRAF2の発現を確認した。

ノーザン分析

T2BP及び TRAF2 cDNAを、ノーザンブロッ卜分析のプローブとして用いた。 Ra ndom Primer Label ing Kit Ver. 2 (宝酒造社製）を用いて、プローブを [³²P]で標識した。マウス MTNブロット膜およびマウスセルライン MTNブロッ卜膜（いずれも Glontech社製）を購入した。 ExpressHyb (商品名）ハイブリダィゼーション溶液 (Clontech社製）を用い、 68°Cで 30分間ハイプリダイゼーションを行つた。ハイブリダィゼーシヨンシグナルは、 X—線フィルムにより検出した。シグナル伝達経路分析

T2BPの発現ベクターを、 100 ngのレポーターベクター pNF iB - Luc又は pAP1-L UG (Glontech社製）とともに、卜ランスフ:]:クシヨン試薬 LF2000を用いて、 9 6穴アツセィプレート中の 5 X 10⁴個の 293細胞にトランスフエク卜した。 24 時間ィンキュベート後、細胞を 5 ng/mlの TNFで 6時間処理し（+)又は処理しなかった (-)。レポ一ター遺伝子のルシフエラーゼ活性は上記の通リに測定した。結果

FHA ドメィンを有する新規な TRAF2結合タンパク質 T2BPの同定本願発明者らは、哺乳動物 2ハイブリッド法に基づく、 P C R—媒介サンプル調製及び高効率アツセィシステムを開発したことを報告している 05)。このシステムを用い、マウス全長 c D N Aが豊富に含まれるライブラリーから得た約 600 0個の c D N Aをマトリックス的に分析した。 T2BP (TRAF2結合タンパク質）と命名された新規な TRAF2相互作用タンパク質が、 VP16転写活性化ドメィンに融合された TRAF2をプレイ（prey)として用いた時に同定された（図 1の A ) 。マウス T2BPの c D N A配列（配列番号 4 ) は、 5個の A+Tリッチモチーフ ATTTAを 3 ' 非翻訳領域中に含む。これは、サイ卜力インや癌原遺伝子のような多くの短命 m R N A中に見出されるものであり、従って、潜在的な不安定化要素である（16， 17)。図 1の Bに示されるように、 T2BPは、 1 8 4個のアミノ酸残基から成り、等電点 (P I )が 4. 79で分子量が 21560と計算される。 Pf amモチーフデータベース検索 (http： //pfam. wust I · edu/ i ndex. htm I )によりモチーフ解析を行つたところ、リン酸化べプチド結合モチーフ（18, 19)として知られるフォークへッド関連 (fork head-assoc i ated (FHA) ) ドメインが T2BP の中央領域に位置することがわかった。さらに、 BLASTにより相同性検索を行ったところ、マウス T2BPのヒトォ一ソログが同定された（図 1の B、配列番号 1、 2 ) 。マウス及びヒト T2BPは、アミノ酸配列全体に亘リ高度に保存されていた。

なお、図 1の Aは、哺乳動物 2—ハイブリッドアツセィの結果を示す。プレィ- TRAF2及び Z又はバイト（ba i t) -T2BPを、レポーターベクター pG5 l ucと共に G H0-K1細胞にトランスフエク卜してレポ一タ一遺伝子であるルシフヱラーゼの活性を測定した。プレイ一 TRAF2又はバイト一 T2BP トランスフエクシヨンについての平均値を基礎にして相対値を計算した。

図 1の Bは、マウス及びヒト T2BP (それぞれ mT2BP及び hT2BPと記載）のアミノ酸配列を示す。両者において同一のアミノ酸残基は、背景に影をつけて示した。

FHA領域は枠で囲んで示す。マウス及びヒト T2BPのァミノ酸配列は、 c D N A から推定したものである。

T2BPは、 TRAF2の TRAF ドメインと相互作用する

TRAF2は、図 2の Aに示すように、数種類の周知のモチーフ（1-4)を有するァダブタータンパク質である。どのモチーフが T2BPとの相互作用に関わるのかを調べるため、本願発明者らは、哺乳動物 2—ハイブリッド法を用いて野生型 TRA F2及びその欠失変異体との相互作用を調べた。その結果、最小の相互作用領域は、 TRAF ドメインとして知られる、カルポキシ末端側の半分を包含することがわかった。 TRAF ドメインは、 TRAF-N及び TRAF- Gサブドメインに分けられる（20) ₍ T2BPは、 TRAF2 [1- 357]及び TRAF2 [348-501 ]のいずれとも相互作用しなかったので、 T2BPとの相互作用には両方のサブドメインが必要と考えられる。-また、ィンビトロで GST-プルダウンアツセィを用いて同じ結果が得られている。次いで. TRAF2との相互作用に関与する T2BP中の領域を調べた（図 2の B ) 。調べた欠失変異体のうち、 Τ2ΒΡ Π - 1 6 2 ]以外の変異体は、 TRAF2との結合能を喪失していた。

なお、図 2の Aは、 TRAF2及びその欠失変異体を模式的に示すもの並びにそれらと野生型 T2BPとの相互作用を示す。図 2の Bは、 T2BP及びその欠失変異体を模式的に示すもの並びにそれらと野生型 TRAF2との相互作用を示す。

T2BPと TRAF2との相互作用の免疫共沈降解析

T2BPと TRAF2との相互作用は、免疫共沈降法により i n v i voで確認された（図 3 ) 。本願発明者らは、 HA-タグを付けた T2BP及び Myc-タグを付けた TRAF2 を産生する発現べクターを構築した。これらの発現べクターを 293T細胞にトランスフヱク卜し、細胞抽出物を、抗 HAタグ抗体を用いて免疫沈降に付した。抗 Mycタグ抗体を用いたウェスタンプロット（図 3の上段）により、 Myc-TRAF2が HA-T2BPと特異的に免疫共沈降されたことが示された。

なお、図 3の中段は、細胞抽出物をウェスタンプロットに付し、 HA - T2BPの発現を確認したもの、下段は同様に Myc-TRAF2の発現を確認したものである。また, 図 3において、 I P及び I Bはそれぞれ免疫沈降及び免疫ブロッ卜を示す。

T2BPの発現プロフィール

TRAF2と T2BPがこれらの間で相互作用を行うためには、これらが同じ組織で共に発現していることが必要であるので、ノーザンブロット分析により T2BP及び TRAF2の発現プロフィールを調べた。 T2BP GDNAをプローブとして用いた場合、 2. 3 kbのシグナルが検出された。これは得られた c D N Aのサイズである 2. 0 k bに対応する、合理的なサイズであった。 T2BPは、成体の主な組織において普遍的に発現されていた（図 4 ) 。主なシグナルに加え、 T2BPについて 3. 0 kbと 4. 0 kbに弱い 2つのシグナルが観察された。 TRAF2 GDNAをプローブとして用いた結果からわかるように、 TRAF2遺伝子は、成体の主な全ての組織中で同様に発現されており、これは先の報告 (21 )と一致している。次に、どのようなマウス培養細胞株において T2BPが良く発現しているかを調べた。調べた培養細胞株は、 PU 5-1. 8 (PU5-R) , RAW264. 7, K-BALB (K - 234) , M— MSV - BALB/3T3, L-M, P19, Hepa1-6, R1. 1 , L1210, P388D1 , P815及び NB41A3であった。これらのうち、 T2BPは、 RA W264. 7, L1210, P388D1といった免疫系細胞由来の培養細胞で高発現していることが明らかとなった。

T2BPをトランスフエク卜した 2 9 3細胞中での NF- Λ: Β及び AP-1の活性化

NF- ΛΓ Β及び ΑΡ- 1の TNF-誘導活性化は、 2 9 3細胞を包含する数種類のセルラインにおいて良く確立されており、そこでは、 TRAF2がシグナル伝達において鍵となる役割を果たす (1 1 , 22)。これらの経路に対する Τ2ΒΡの効果を調べるために、ルシフヱラーゼ活性により NF - Λ: Βの活性化を検出することを可能にするレポ一ターベクターと共に、 2 9 3細胞中で Τ2ΒΡを過剰発現させた（図 5の左）。レポーターベクターのみをトランスフエクトした 2 9 3細胞を TNF処理すると、 Ν F - Λ: Βの活性化が明瞭に観察された。 Τ2ΒΡの過剰発現により、 TNF処理なしで Ν F- Λ: Βが濃度依存的に活性化された。 Τ2ΒΡ -トランスフエクト 2 9 3細胞を TNF 処理した場合には、 TNF処理していない Τ2ΒΡ-トランスフエク卜 2 9 3細胞と同等か僅かに低い NF - Λ: Βの活性化が見られた。 ΑΡ-1の活性化に対する Τ2ΒΡの効果を評価するために同様な実験を行った（図 5の右）。 TNF処理したコントロール 2 9 3細胞中で、 AP- 1の活性化が観察された。 TNFで処理していない 2 9 3細胞中で Τ2ΒΡを過剰発現させると、 ΑΡ- 1が濃度依存的に活性化された。 Τ2ΒΡ-卜ランスフエクト細胞を TNF処理した場合、 TNF処理していない Τ2ΒΡ-卜ランスフェクト細胞よりも ΑΡ-1の活性化が少なかった。このように、これらの結果は、 Τ 2ΒΡの過剰発現により、 NF- c B及び ΑΡ-1の両方が、 TNF処理なしで活性化されることを示している。

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Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のアミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、 1 ~40個のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有する領域を含み、 TR AF2との結合能を有するポリべプチド。

2. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のアミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、 1〜33個のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたァミノ酸配列を有する領域を含む請求項 1記載のポリべプチド。

3. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のアミノ酸配列中、第 1、 2、 3、 20、 26、 28、 32、 35、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 7 1、 74、 77、 95、 97、 1 00、 1 0

1、 1 1 4、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 4

7、 1 56、 1 57及び 1 58番目のアミノ酸のうち少なくとも 1個が置換し若しくは欠失し、又はこれらのアミノ酸の少なくとも 1個に隣接する位置に各 1〜

3個のァミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有する領域を含む請求項 2記載のポリペプチド。

4. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のァミノ酸配列を有する領域を含む請求項 2記載のポリぺプチド。

5. 配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列又は該ァミノ酸配列中、第 1、

2、 3、 20、 26、 28、 32、 35、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 71、 74、 77、 95、 97、 1 00、 1 01、 1 1 4、 1 1 7、 1 2 6、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 47, 1 56、 1 57、 1 5

8、 1 63、 1 65、 1 68、 1 69、 1 70、 1 7 1、 1 72、 1 73、 1 7 7及び 1 84番目のアミノ酸のうち少なくとも 1個が置換し、欠失し、又はこれらのァミノ酸の少なくとも 1個に隣接する位置に 1〜 3個のァミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有し、 TRAF2 との結合能を有する請求項 2記載のポリペプチド。

6. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する請求項 5記載のポリペプチド。

7. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のアミノ酸配列を有する領域又は該アミノ酸配列において、 1〜40個のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有する領域を含み、 TR AF2との結合能を有するポリべプチド。

8. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のアミノ酸配列を有するぺプチド又は該アミノ酸配列において、 1〜33個のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは挿入されたァミノ酸配列を有する領域を含む請求項 7記載のポリべプチド。

9. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のァミノ酸配列中、第 1、 2、 3、 20、 27、 31、 34、 36、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 71、 74、 77、 95、 97、 100、 1 0 1、 1 14、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 145、 1 4 7、 1 56、 1 57及び 1 58番目のアミノ酸のうち少なくとも 1個が置換し、欠失し、又はこれらのアミノ酸の少なくとも 1個に隣接する位置並びに第 25番目と第 26番目の間の位置の少なくともいずれかに各 1 ~ 3個のァミノ酸が揷入されたアミノ酸配列を有する領域を含む請求項 8記載のポリべプチド。

1 0. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 62番目のァミノ酸配列を有する領域を含む請求項 8記載のポリぺプチド。

1 1. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列中、第 1、 2、 3、 20、 27、 31、 34、 36、 37、 38、 41、 44、 55、 57、 68、 7 1、 74、 77、 95、 97、 1 00、 1 01、 1 14、 1 1 7、 1 26、 1 27、 1 34、 1 36、 1 43、 1 45、 1 47、 1 56、 1 57、 1 58、 1 63、 1 65、 1 68、 1 69、 1 70、 1 71、 1 72、 1 73、 1 77及び 1 84番目のアミノ酸のうち少なくとも 1個が置換し、欠失し、又はこれらのアミノ酸の少なくとも 1個に隣接する位置並びに第 25番目と第 26番目の間の位置の少なくともいずれかに 1 ~ 3個のァミノ酸が挿入されたァミノ酸配列を有する請求項 8記載のポリべプチド。

1 2. 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列を有する請求項 1 1記載のポリペプチド。

1 3. 配列表の配列番号 1又は 3に示されるアミノ酸配列の第 1番目〜第 1 6 2番目のァミノ酸配列を有する領域又は該ァミノ酸配列と 70 %以上の相同性を有する領域を含み、 TRAF2との結合能を有するポリべプチド。

1 4. 前記相同性が 80%以上である請求項 1 3記載のポリべプチド。

1 5. 配列表の配列番号 1又は 3に示されるアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、 TRAF2との結合能を有するポリペプチド。

1 6. 前記相同性が 78。以上である請求項 1 5記載のポリべプチド。

1 7. 請求項 1ないし 1 6のいずれか 1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。

1 8. 配列表の配列番号 2又は 4で示される塩基配列を有する核酸又は該核酸の相補配列とストリンジヱント条件下でハイブリダィズする請求項 1 7記載の核酸。

1 9. 請求項 1 7又は 1 8記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる発現ベクター。

20. 請求項 1 7又は 1 8記載の核酸が導入された細胞であって、請求項 1ないし 1 6のいずれか 1項に記載のポリべプチドを発現する細胞。

2 1. 請求項 1 7又は 1 8記載の核酸とハイブリダィズする核酸であって、請求項 1 7又は 1 8記載の核酸の検出に用いることができる核酸。

22. 配列表の配列番号 2又は 4記載の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズする請求項 2 1記載の核酸。

23. プライマ一又はプローブである請求項 21又は 22記載の核酸。

24. 塩基数が 1 5以上である請求項 2 1ないし 23のいずれか 1項に記載の核酸。

25. 請求項 23記載のプローブと、請求項 1 8記載の核酸とを接触させることによリハイブリダィズさせ、ハイブリダィズした核酸を測定することを含む、請求項 1 8記載の核酸の測定方法。

2 6 . 請求項 2 3記載のプライマーの一対をプライマーとして用い、請求項 1 8記載の核酸を錶型として核酸増幅法を行い、増幅産物を測定することを含む、請求項 1 8記載の核酸の測定方法。