WO2003070290A1 - Biomateriau composite contenant de la phospholine - Google Patents

Biomateriau composite contenant de la phospholine Download PDF

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composite biomaterial
bone
composite
cells
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Toshimasa Uemura
Tetsuya Tateishi
Takashi Saito
Daisuke Iejima
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Definitions

  • the present invention relates to a composite biomaterial containing phosphophorin and collagen, and an artificial aggregate obtained by culturing bone marrow-derived cells on the composite biomaterial.
  • the artificial bone be bioabsorbable and be easily formed in order to properly fill the complex bone defect.
  • Collagen type I has a flexible structure and originally has the property of being the core of bone formation, so it has a promising potential as a bone repair material with a three-dimensional structure. I have.
  • a porous hard material hydroxyapatite II
  • STCP hydroxyapatite II
  • An object of the present invention is to provide a biodegradable, easy-to-form artificial bone having high bone formation ability (osteoinductive ability) at low cost.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve such problems, and as a result, have found that a composite material having a sponge-like structure in which a phosphoprotein called phosphophorin is cross-linked to collagen type I has excellent bone-forming ability. This led to the completion of the present invention.
  • the present invention provides the following (1) to (8).
  • a composite biomaterial containing phosphophorin and collagen (1) A composite biomaterial containing phosphophorin and collagen.
  • the composite biomaterial according to the present invention is a composite biomaterial containing phosphophorin and collagen as essential components.
  • the phosphoro-fluorin be cross-linked to collagen fibers, and it is preferable that the composite biomaterial has a sponge-like microporous structure.
  • This structure provides properties suitable for a cell culture scaffold described below.
  • the “sponge-like structure” means a flexible microporous structure (a structure in which there are innumerable pores (voids) of several meters to several tens).
  • Phosphorofluorin contained in the composite biomaterial is contained in mammalian teeth Is known to be a phosphoprotein.
  • collagen type I As collagen used in the present invention. This is because collagen type I occupies most of the organic matter of bones and teeth and has high biocompatibility.
  • the mixing ratio (mass ratio) of phosphophorin and collagen is preferably 1:10 to 1:50, and preferably 1:20 to 1:40. Is more preferred. Further, it is preferable that the phosphorophorin be blended in an amount of 2 to 10% by mass (hereinafter, simply referred to as "% by mass") with respect to the total amount (total mass) of the composite biomaterial of the present invention. More preferably, the content is 5 to 5%. If the amount of phosphophorin is too small, the ability to form bone becomes insufficient, while if the amount of phosphophorin is too large, the cost of the composite biomaterial increases.
  • the porosity is preferably 40 to 90%, and more preferably 60 to 90%. If the ratio exceeds this range, the penetration of cells after application to the living body becomes insufficient, resulting in poor osteoinductivity and a decrease in the strength of the composite biomaterial itself.
  • the composite biomaterial of the present invention may further comprise hydroxyapatite, j8 TCP, o; TCP, polydalicholate and the like, in addition to essential components such as phosphoforin and collagen, as long as the object and effects of the present invention are not impaired. It may contain a porous hard material such as polylactic acid.
  • Phosphoroorin used in the composite biomaterial of the present invention may be a commercially available one (eg, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Can be. Extract the teeth of mammals (eg, pests) to remove soft tissue, pulp, enamel, and cementum. The remaining dentin is pulverized, decalcified using an appropriate buffer containing proteolytic enzymes (eg, 0.5MEDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4), dialyzed, and lyophilized. Next, the obtained freeze-dried product is dissolved in a buffer (for example, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 (containing protease)), and calcium chloride is added.
  • a buffer for example, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 (containing protease)
  • the resulting precipitate is dissolved in a buffer (for example, 0.5 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4 (containing protease)), dialyzed, and lyophilized again. Finally, the lyophilized product is dissolved in a urea solution (eg, 4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0), and then separated by ion exchange chromatography (eg, DEAE-Sepharose).
  • a buffer for example, 0.5 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4 (containing protease)
  • lyophilized product is dissolved in a urea solution (eg, 4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0), and then separated by ion exchange chromatography (eg, DEAE-Sepharose).
  • a urea solution eg, 4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0
  • ion exchange chromatography e
  • the collagen (collagen type I) used in the present invention is not particularly limited, and even if a commercially available collagen is used, it can be obtained from a suitable material containing collagen (for example, connective tissue of an animal such as human skin) by a known method. It may be used after extraction and purification.
  • collagen fibers are dissolved in an aqueous solution of a carbonate such as potassium carbonate or sodium carbonate and incubated at room temperature.
  • concentration of the aqueous carbonate solution is preferably from 0.1M to 0.2M, more preferably from 0.4M to 0.5M.
  • a cross-linking agent for example, divinyl sulfone, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiamide, and the like are added, and a cross-linked chain is previously introduced on the collagen fiber.
  • the amount of the crosslinking agent to be added is preferably about 5% by mass in the case of divinyl sulfone.
  • the amount of phosphophorin to be added is preferably 110 to LZ50, more preferably 1Z20 to 1/40 (weight ratio) based on collagen. This is washed with distilled water and then with a solution of bicarbonate (eg, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, etc.) to remove excess crosslinker. Finally, stop the crosslinking reaction by adding sodium bicarbonate and mercaptoethanol, wash well with distilled water and freeze-dry.
  • the lyophilization conditions eg, temperature, freezing time, lyophilization in water, etc.
  • the obtained freeze-dried product can be molded as necessary, and can be used as, for example, an artificial aggregate described later.
  • the composite biomaterial obtained by the present invention has elasticity like a sponge when absorbing water, and has excellent biocompatibility, osteoinductive ability or osteoconductive ability. That is, when implanted in a bone tissue, it is quickly bonded to the bone tissue, and the interface between the donor-side hard tissue and the composite material obtained by the present invention can be completely integrated. Therefore, the composite biomaterial of the present invention itself can be used as an artificial aggregate for repairing / regenerating a bone defect.
  • the shape and shape of the artificial aggregate are not particularly limited, and may be any shape and shape such as a sponge, a mesh, a non-woven fabric, a disk, a film, a rod, a particle, and a paste. Can be used. These forms and shapes may be appropriately selected according to the purpose of the artificial aggregate.
  • the composite biomaterial of the present invention can be used as an artificial bone material capable of more effectively regenerating bone by inoculating bone marrow-derived cells into this and performing tissue culture in a biologically similar environment or in vivo. Can be.
  • the cells used in the artificial aggregate are undifferentiated cells having differentiation / proliferation ability. Examples thereof include mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, skeletal muscle stem cells, neural stem cells, and liver stem cells. it can. In particular, bone marrow-derived embryonic stem cells (ES cells) and mesenchymal stem cells are preferred.
  • the cells may be established cell cultures, or cells isolated from a living body of a patient may be used.
  • the cells into which the growth factor gene has been introduced may be cultured by a usual method by seeding the cells on a scaffold made of a suitable biocompatible material.
  • the cells can be seeded simply by seeding them on a biocompatible material serving as a scaffold, or by mixing them with a liquid such as a buffer solution, physiological saline, an injection solvent, or a collagen solution. . If the material does not allow the cells to enter the pores smoothly, the cells may be seeded under reduced pressure.
  • seeding density is desirably adjusted appropriately according to the cells and the scaffold used in order to maintain the cell morphology and perform tissue regeneration more efficiently.
  • the seeding density is preferably 100,000 cells / m 1 or more.
  • a known medium such as a MEM medium, an ⁇ -MEM medium, and a DMEM medium can be appropriately selected and used according to the cells.
  • the medium may be supplemented with an antibiotic or antibacterial agent such as FBS (manufactured by Sigma) or Ant ibiotic-Antimycotic (manufactured by GIBCO BRL), a growth factor, a transcription factor, or the like. it is, 3 ⁇ ; 1 0% CO 2 , 3 0 ⁇ 4 0 ° C, it is preferable to perform, especially in conditions at 5% C 0 2, 3 7 .
  • the cultivation period is not particularly limited, but is preferably at least 3 days or more.
  • the artificial aggregate thus produced can be applied to a patient by implanting or injecting it into a bone defect.
  • the composite biomaterial of the present invention can also be used as a carrier for other physiologically active substances and drugs.
  • an anticancer agent is added to the composite material obtained by the present invention.
  • the impregnated one it is possible to prevent the recurrence of cancer and to induce the living hard tissue.
  • the composite biomaterial obtained according to the present invention may be used as a bone-replacement type bone reconstruction material having osteoinduction and osteoconductivity, tissue engineering containing amino acids, carbohydrates, and cytokins. It can be used as a bioactive base material used for biomedical applications, and as a biocompatible base material for sustained release of drugs. Specific examples include artificial bones, artificial joints, bonding materials between tendons and bones, dental materials. Implant materials, percutaneous terminals for catheters, drug sustained-release substrates, bone marrow induction chambers, tissue reconstruction chambers, and base materials. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a photograph showing a tissue image of HE-stained one or two weeks after implantation of a collagen-phosphorin sheet or collagen sheet in Example 2.
  • A indicates collagen (l week)
  • B indicates collagen-phosphophosphorin (1 week)
  • C indicates collagen (2 weeks)
  • D indicates collagen-phosphophorin (2 weeks).
  • FIG. 2 is a photograph showing a tissue image of HE-stained 6, 8 weeks after transplantation of a collagen monophosphorin sheet or a collagen sheet in Example 2.
  • A indicates collagen (6weeks)
  • B indicates collagen-phosphorin (6 weeks)
  • C indicates collagen (8 weeks)
  • D indicates collagen-phosphorin (8 weeks).
  • Example 1 Production of phosphorofluorin / collagen composite biomaterial
  • the permanent teeth are extracted from the jaw bone of the stomach, and the soft tissue, pulp, enamel, and cement are removed.
  • the remaining dentin is pulverized under liquid nitrogen into fine particles of 200 mesh or less.
  • Dentin powder was added with 0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, H 7.4 [Proteolytic enzyme: lOOmM 6-amino exanoic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5mM benzamidine-HCl, lmM phenylmethyl ylsulfonyl fluoride] 4. Demineralize at C.
  • the EDTA demineralized solution is dialyzed against deionized distilled water at 4 ° C. using a dialysis membrane (SPECTRUM® CO 3500, 132725), and freeze-dried (Tokyo Rika Kikai: EYELA FREEZ DRYER 90500042). ) Dissolve the EDTA extract in 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 (containing protease) and add CaCl 2 to a final concentration of 1M.
  • the precipitate is collected by centrifugation (HIMAC CENTRIFUGE345043, manufactured by Hitachi, Ltd.), dissolved again in 0.5 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.4 (containing protease), and dialyzed against deionized distilled water And freeze-dried. Freeze drying The dried product is dissolved in 4M Urea, 0. OlM Tris-HCl, pH 8.0, and eluted by DEAE-Sepharose (manufactured by Sigma Chem. Co.) Column Chromatography with a linear gradient of 0-1M NaCl.
  • Reconstituted collagen type I fibers can be obtained by adding 0.1 M NaCl followed by 0.6 N NaOH and 0.1 M Hepes (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and incubating at 37 ° C.
  • the collagen fibers obtained in (2) are incubated overnight at room temperature with 0.5 M sodium carbonate. Further, divinyl sulfone (Sigma Chem. Co.) and incubate for 2 hours. After washing the collagen fibers well with 0.5M sodium carbonate, add phosphorophorin and incubate overnight to crosslink. Wash it with distilled water and then with 0.5M sodium bicarbonate to remove excess phosphophorin and divinyl sulfone.
  • the femur of an 8-week-old Fischer rat was excised, and cells in the bone marrow were extracted from the femur according to a conventional method.
  • the extracted cells were cultured for 10 days under the following conditions. During the culture period, the medium was replaced every two days to remove floating blood cells and to purify osteoblasts adhering to the bottom.
  • Rats that had reached the number of days after which the transplantation samples had been removed were anesthetized with 7% chloral hydrochloride (0.4 ml of chloral hydrochloride per 100 g rat weight was intraperitoneally injected).
  • the chest of the anesthetized rat was opened, a fixative (4% paraformaldehyde Z0.25% daltaraldehyde) was injected from the heart, and the rat was fixed by the perfusion fixation method (perfusion time: 15 min).
  • the femur was removed from the rat.
  • the excised femur was degreased, decalcified, alcohol-dehydrated, and transparent, and embedded in paraffin so that the sample surface could be seen.
  • the embedded sample was sliced to a thickness with a microtome, attached to a slide glass, and extended on a paraffin extender.
  • the stretched paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin and observed under a microscope. The histological images are shown in Figs.
  • a novel composite biomaterial excellent in biocompatibility and osteoinductivity can be provided.

Description

ンを含む複合生体材料
技 術 分 野
本発明は、 フォスフオフォリンとコラーゲンを含む複合生体材料および 該複合生体材料上に骨髄由来細胞を培養して得られる人工骨材に関する。
明 背 景 技 術 田 近年、 整形外科の領域における骨欠損部の修復は、 人工材料を用いた人 ェ骨の移植が行われることが多い。 こうした人工骨には生体骨類似の機械 的特性に加えて、 生体適合性や骨誘導性一すなわち、 生体適用後徐々に吸 収され、 骨再生サイクルに取り込まれて自身の骨に置換していく性質一が 求められる。
人工骨材料としては、 セラミックス系材料、 有機材料等の種々の材料が 考案されているが、骨再生を積極的に誘導する材料としては、 B M P (Bone Morphogenic Protein)とコラーゲンとの複合材料が有力で、 他の材料には その能力は小さい。 しかし、 B M Pは強い骨形成能を有しているが、 水に 溶解しにくく、 コラーゲンを担体として用いる試みがなされてはいるもの の、 最適担体が未だ見つかっていない。 また、 ラット、 マウスレベルでは B M Pによる骨形成能は高いが、ヒ卜では有効な骨形成を得るのに 0. 4 m g/m l (担体体積） 程度の多量の B M Pが必要と考えられており、 現状で は高額医療に治療が限定されると予想される。 したがって、 B M Pに代わ る、 安全かつ安価な、 骨形成能を有する生体吸収性の骨修復材料の開発が 望まれている。 ' 発明者らは、 これまで、 歯に含まれるリン酸タンパク質である、 フォス フオフオリンゃフォスビチンが単独で骨形成能を有することを見出してい る (Sai to, et al. , Bone 21 (4) 305-311 (1997) )が、 これらが実際に骨形 成や人工骨開発に応用されたとの報告はない。
一方、 人工骨材は生体吸収性であると同時に、 複雑な形状の骨欠損部を 適切に埋めるため、 成形容易であることが望まれる。 これに対し、 コラ一 ゲンタイプ Iは柔軟な構造を持ち、 元来骨形成の核になる性質を有してい るため、 3次元構造を持つ骨修復材料としての有望な可能性を有している。 また、 多孔質の硬材料（ハイドロキシァパタイトゃ |S T C P、 ポリ乳酸等） と複合化することにより、 高品質の移植材料ゃスキヤホールドとして使用 できる可能性も有している。 問題は、 このコラーゲンスポンジに骨形成能 を付加することであり、 B M P以外の安価な活性成分を利用した方法の開 発が望まれている。 - 発 明 の 開 示
本発明は、 骨形成能 （骨誘導能） が高く、 Biodegradable で、 かつ成形 容易な人工骨材を安価に提供することを目的とする。
かかる課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、 フォスフ オフォリンと呼ばれるリン酸蛋白質をコラーゲンタイプ Iに架橋したスポ ンジ状構造を有する複合材料が、 優れた骨形成能を有することを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下の （1 ) 〜 （8 ) を提供するものである。
( 1 ) フォスフオフォリンとコラーゲンを含む複合生体材料。
( 2 ) 前記コラーゲンがコラーゲンタイプ Iである、 上記 （1 ) 記載の 複合生体材料。 (3) 前記フォスフオフオリンがコラーゲンに架橋されていることを特 徴とする、 上記 （1) または （2) 記載の複合生体材料。
(4) 前記複合生体材料がスポンジ状構造を有することを特徴とする、 上記 （1) 〜 （3) のいずれか 1に記載の複合生体材料。
(5) さらにハイドロキシアパタイト、 β TCP、 aTCP、 ポリダリ コール酸およびポリ乳酸から選ばれる少なくとも 1以上を含む、上記（1) 〜 （4) のいずれか 1に記載の複合生体材料。
(6) さらに骨髄由来細胞を含む、 上記 （1) 〜 （5) のいずれか 1に 記載の複合生体材料。
(7) 上記 （1) 〜 （6) のいずれか 1に記載の複合生体材料からなる 人工骨材。
(8) コラーゲン線維とフォスフオフオリンを、 ジビニルスルフォンま たは 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル） カルポジアミドを 用いて架橋後、凍結乾燥することを特徴とする、複合生体材料の製造方法。 以下、 本発明の内容について詳述する。
1. 複合生体材料
本発明にかかる複合生体材料は、 フォスフオフォリンとコラーゲンを必 須の構成成分とする複合生体材料である。 該複合生体材料において、 フォ スフオフオリンはコラーゲン繊維に架橋されていることが好ましレ^また、 該複合生体材料は、スポンジ状の微小多孔質構造を有することが好ましい。 この構造は、 後述する細胞培養の足場に適した特性を与える。 なお、 「スポ ンジ状構造」 とは、 柔軟性を有する微小多孔質構造 （数 m〜数 10 程度 の無数の孔 （空隙） が存在する構造） を意味するものとする。
前記複合生体材料に含まれるフォスフオフオリンは、 哺乳類の歯に含ま れるリン酸タンパク質であることが知られている。
また、 本発明で用いられるコラーゲンとしては、 コラーゲンタイプ Iを 用いることが好ましい。 該コラーゲンタイプ Iは、 骨、 歯の有機質の大部 分を占めており、 生体親和性が高いからである。
本発明の複合生体材料において、 フォスフオフォリンとコラーゲンの配 合比 （質量比） は、 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0であることが好ましく、 1 : 2 0 〜1 ： 4 0であることがより好ましい。 また、 本発明の複合生体材料総量 (合計質量） に対し、 フォスフオフオリンは 2〜1 0質量％ (以下、 単に 「質量％」 を％と記載する。） 配合されることが好ましく、 2 . 5〜5 %配 合されることがより好ましい。 フォスフオフォリンの量が少なすぎると骨 形成能が不十分となり、 一方、 フォスフオフォリンの量が多すぎると複合 生体材料のコス卜が高くなるからである。
本発明の複合生体材料において、 空隙率は好ましくは 4 0〜9 0 %、 よ り好ましくは 6 0〜9 0 %である。 この範囲を超えると、 生体適用後の細 胞の侵入が不十分となり骨誘導性が悪くなるとともに、 複合生体材料自体 の強度が低下するからである。
本発明の複合生体材料は、 必須の成分であるフォスフオフオリンおよび コラーゲンに加えて、 本発明の目的 ·効果を損なわない範囲で、 さらにハ イドロキシアパタイト、 j8 T C P、 o; T C P、 ポリダリコール酸およびポ リ乳酸等の多孔質の硬材料を含んでいてもよい。
2 . 複合生体材料の製造方法
(1) フォスフオフォリンの調製
本発明の複合生体材料に用いられるフォスフオフオリンは、 市販のもの (和光純薬社製等） を用いてもよいが、 例えば以下のようにして得ること ができる。 哺乳類 （例えば、 ゥシ等） の歯を抜歯し、 軟組織、 歯髄、 ェナ メル質、 セメント質を除去する。 残った象牙質を細かく粉砕し、 これを、 蛋白質分解酵素を含む適当な緩衝液 （例えば、 0.5MEDTA, 0.05MTris-HCl, pH 7.4) を用いて脱灰し、 透析した後に凍結乾燥する。 次に、 得られた凍 結乾燥物を緩衝液 （例えば 20mMTris-HCl， pH 7.4 〔蛋白質分解酵素含有〕） に溶解し、 塩化カルシウムを添加する。 生じた沈殿物を緩衝液 （例えば、 0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 〔蛋白質分解酵素含有〕） に溶解し、 透析後、再び凍結乾燥する。最後に、前記凍結乾燥物を尿素溶液（例えば、 4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0) に溶解後、 イオン交換クロマトグラフ ィ一 （例えば、 DEAE- Sepharose等） 等により分離する。 目的とするフォス フオフオリンは、 リン酸分析およびァミノ酸分析により同定することがで さる。
(2)コラーゲンタイプ Iの精製
本発明で用いられるコラーゲン （コラーゲンタイプ I ) は、 特に限定さ れず、 市販のものを用いても、 コラーゲンを含む適当な材料 （例えば、 ゥ シ皮膚等の動物の結合組織） から公知の方法に従い、 抽出，精製して用い てもよい。
(3) フォスフオフオリンとコラーゲンからなる複合生体材料の調製
まず、 コラーゲン線維を炭酸カリウム、 炭酸ナトリウム等の炭酸塩水溶 液に溶かして室温でインキュベートする。 該炭酸塩水溶液の濃度は、 好ま しくは 0. 1M〜0. 2M、 より好ましくは 0. 4M〜0. 5Mである。 これに、 架橋剤、 例えば、 ジビニルスルフォン、 1—ェチルー 3— (3— ジメチルァミノプロピル） カルポジアミド等を加え、 予めコラーゲン繊維 上に架橋鎖を導入する。 添加する該架橋剤の量は、 ジビニルスルフォンで あれば 5質量％程度が好ましい。 次に、 フォスフオフオリンを添加してインキュベートし、 コラーゲンと 架橋させる。 添加するフォスフオフォリンの量は、 コラーゲンに対して 1 1 0〜： L Z 5 0が好ましく、 1 Z 2 0〜1 / 4 0がより好ましい （質量 比）。 これを、 蒸留水、 続いて重炭酸塩 （例えば、 重炭酸ナトリウム、 重炭 酸カリウム等） 溶液で洗浄し、 余剰のフォスフオフオリンゃ架橋剤を除去 する。 最後に、 重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加して架橋 反応を止め、 蒸留水でよく洗浄してから凍結乾燥する。 該凍結乾燥の条件 (例えば、 温度、 凍結時間、 水中での凍結乾燥等） は、 所望の複合生体材 料の構造、 すなわち比表面積、 空隙率、 孔 （空隙） の大きさ等に応じて、 適宜調整することができる。 また、 得られた凍結乾燥物は、 必要に応じて 成形し、 例えば後述する人工骨材等として利用することができる。
3 . 人工骨材
(1) 複合生体材料からなる人工骨材
本発明により得られる複合生体材料は、 水を吸うとスポンジのような弾 性を有し、 優れた生体親和性、 骨誘導能ないしは骨伝導能を有する。 すな わち、 骨組織に埋入した場合は速やかに骨組織と結合し、 ドナー側の硬組 織と本発明により得られる複合材料との界面は完全に一体化しうる。 した がって、 本発明の複合生体材料は、 それ自体、 骨欠損部の修復 ·再生させ るための人工骨材として利用することができる。
前記人工骨材の形態および形状は、 特に限定されず、 スポンジ、 メッシ ュ、 不繊布状成形物、 ディスク状、 フィルム状、 棒状、 粒子状、 およびべ 一スト状等、 任意の形態および形状を用いることができる。 こうした形態 や形状は、 人工骨材の目的に応じて適宜選択すればよい。
(2) 骨髄由来細胞を含む人工骨材 本発明の複合生体材料は、 これに骨髄由来細胞を播種して、 生体類似環 境下あるいは生体内で組織培養を行うことにより、 より効果的に骨再生が 可能な人工骨材として利用することができる。
前記人工骨材で用いられる細胞は、 分化 ·増殖能力を有する未分化の細 胞であり、 例えば、 間葉系幹細胞、 造血幹細胞、 骨格筋幹細胞、 神経幹細 胞および肝臓幹細胞等を挙げることができる。 特に、 骨髄由来の胚幹細胞 ( E S細胞） および間葉系幹細胞が好ましい。 また、 細胞は、 樹立された. 培養細胞株のほか、 患者の生体から単離された細胞を用いてもよい。
前記増殖因子遺伝子を導入した細胞の培養は、 適当な生体適合性材料か らなる足場に、 該細胞を播種して、 通常の方法により行えばよい。 細胞の 播種は、 足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよく、 あるい は、 緩衝液、 生理食塩水、 注射用溶媒、 あるいはコラーゲン溶液等の液体 とともに混合して播種してもよい。 また、 材料によって、 細胞が孔の中に スムーズに入らない場合は、 引圧条件下で播種してもよい。
播種する細胞の数 （播種密度） は細胞の形態を維持して組織再生をより 効率よく行わせるため、 用いる細胞や足場材料に応じて適宜調整すること が望ましい。 例えば、 骨芽細胞であれば、 播種密度は 1 0 0万個/ m 1以 上であることが望ましい。
細胞培養に用いられる培地としては、 M E M培地、 α -M E M培地、 D M E M培地等、公知の培地を細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。 また、該培地には、 F B S (Sigma社製)、 Ant ibiot ic-Ant imycot ic (GIBC0 BRL 社製） 等の抗生物質や抗菌剤、 増殖因子、 転写因子等を添加しても良 レ^ 培養は、 3〜； 1 0 % C O 2、 3 0〜4 0 °C、 特に 5 % C 02、 3 7での 条件下で行うことが望ましい。 培養期間は、 特に限定されないが、 少なく とも 3日以上行うことが望ましい。 このようにして作製された人工骨材は、 骨欠損部に埋入あるいは注入す ることで、 患者体内に適用することができる。
4 . その他
本発明の複合生体材料は他の生理活性物質、 薬剤等のスキヤホールドと して利用することもできる、 例えば、 骨肉腫などの切除骨の再建に、 本発 明により得られる複合材料に抗癌剤を含浸させたものを用いることで、 癌 再発の防止とともに生体硬組織の誘導を行うことができる。
したがって、 本発明によって得られる複合生体材料の用途としては、 骨 誘導および骨伝導能を有する生体骨置換型骨再建材としての利用法、 アミ ノ酸、糖質、サイト力インを含有する組織工学に用いられる生体活性基材、 および生体融和型薬剤徐放性基材としての利用法を挙げることができ、 具 体的には、人工骨、人工関節、腱と骨との接合材、歯科用インプラント材、 カテーテル用経皮端子、 薬剤徐放性基材、 骨髄誘導チャンバ一、 組織再建 用チャンバ一'基材等を挙げることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、実施例 2におけるコラーゲン一フォスフオフオリンシートまたは コラーゲンシ一ト移植 1、 2週間後の HE染色した組織像を示す写真である。 図中、 Aはコラーゲン （l week)、 Bはコラーゲン一フォスフオフ才リン （1 week) , Cはコラーゲン （2 weeks)、 Dはコラーゲン一フォスフオフオリン (2 weeks) を示す。 図 2は、実施例 2におけるコラーゲン一フォスフオフオリンシートまたは コラーゲンシート移植 6、 8週間後の HE染色した組織像を示す写真である。 図中、 Aはコラーゲン （6weeks)、 Bはコラーゲン一フォスフオフオリン （6 weeks), Cはコラーゲン （8 weeks), Dはコラーゲン一フォスフオフオリン (8 weeks) を示す。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2002— 41409号の 明細書に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、 本発明は これに限定されるものではない。
実施例 1 ： フォスフオフオリン /コラーゲン複合生体材料の製造
(1) フォスフオフォリンの精製
まず、 ゥシ顎骨から永久歯を抜歯し、 軟組織、 歯髄、 エナメル質、 セメ ント質を除去する。 残った象牙質を液体窒素下にて 200メッシュ以下の細 粒子に粉砕する。 象牙質粉を 0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, H 7.4 [蛋白 質分解酵素 ： lOOmM 6-amino exanoic acid (和光純薬社製） ， 5mM benzamidine-HCl, lmM phenylmet ylsulfonyl fluoride含有] で 4。Cにて 脱灰する。
つぎに、 EDTA脱灰液を、 4°Cにて脱イオン蒸留水に対し、透析膜（SPECTRUM 丽 CO 3500, 132725)を用いて透析して、 凍結乾燥（東京理科機械製： EYELA FREEZ DRYER 90500042) する。 EDTA抽出物は 20mM Tris-HCl, pH 7.4 (蛋 白質分解酵素 含有） に溶解し、 最終濃度が 1Mになるように CaCl2を添加 する。 沈殿物を遠心分離 （日立ェ機製： HIMAC CENTRIFUGE345043) により 回収し、 再び 0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 (蛋白質分解酵素を含 有） に溶解し、 脱イオン蒸留水に対して透析して、 凍結乾燥する。 凍結乾 燥物を 4M Urea， 0. OlM Tris-HCl, pH 8. 0に溶解して DEAE- Sepharose (Sigma Chem. Co. 製） Column Chromatographyにて、 0- 1M NaCl直線勾配により溶 出させる。
最後に、 リン酸分析およびアミノ酸分析によりフォスフオフオリンを同 定する。
(2)コラーゲンタイプ Iの精製
ゥシ皮膚を細切し、 4tにて蒸留水、 20% NaCl， 0. 05M Tri s-HCl, pH 7. 4 にて洗浄する。 次に、 1M NaCl, 0. 05M Tris-HCl, pH 7. 4 にて overnight で抽出し、 遠心分離により上清を回収し、 0. 5M 酢酸、 1M NaCl を加え overnightで撹拌する。
遠心分離により残渣を回収し、 0. 5M 酢酸に溶かして、 さらに遠心分離を 行う。 上清を 5M NaOH, 4. 4M NaClで中和し、 overnightで撹拌し、 遠心分 離する。この残渣に 4. 4M NaCl， 0. 05M Tris-HCl, pH 7. 4を添加し overnight で撹拌し、 遠心分離する。
残渣に 2. 4M NaCl, 0. 05M Tris-HCl, pH 7. 4を添加し overnightで撹拌 し、 遠心分離する。 残渣に 1. 7M NaCl, 0. 05M Tri s-HCl, pH 7. 4を添加し overnightで撹拌し、遠心分離する。得られた上清を 0. 1M酢酸に対して透 祈し、 凍結乾燥する。
凍結乾燥したコラーゲンと 50mM酢酸を用いて、 0. 3%コラーゲン酢酸溶 液を作成する。 0. 15M NaCl に続き、 0. 6N NaOH, 0. 1M Hepes (和光純薬社 製） を添加して 3 7 °Cにてインキュベートすることにより、 再構成コラー ゲンタイプ I線維が得られる。
(3) フォスフオフォリンのコラ一ゲンへの架橋結合
(2)で得られたコラーゲン線維を 0. 5M 炭酸ナトリウムで室温にて overnightでィンキュベートする。さらにジビニルスルフォン（Sigma Chem. Co. 製）を添加し、 2時間インキュベートする。 0.5M炭酸ナトリウムでコ ラーゲン線維をよく洗浄後、 フォスフオフオリンを添加し、 overnight で インキュベートして架橋させる。 これを蒸留水で洗い、 さらに 0.5M重炭 酸ナトリゥムでよく洗浄して、 過剰なフォスフオフォリンとジビニルスル フォンを除去する。
次いで、 0.5M 重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加し、 overnight でインキュベートして架橋反応を止める。 得られた複合体は蒸 留水で洗い、 さらに 0.5M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4および蒸留水で 洗浄する。これを凍結乾燥し、コラーゲン一フォスフオフオリン複合体（ス ポンジ状シート） を作製した。 また、 フォスフォォリンを加えないコラ一 ゲン線維のみを、 蒸留水でよく洗った後、 凍結乾燥し、 フォスフオフオリ ンを含まないコラーゲン複合体 （スポンジ状シート） を作製した。 実施例 2 ： ラット大腿骨への移植実験
1. 細胞培養
8週齢の Fischer系ラットの大腿骨を摘出し、 この大腿骨より、 骨髄中 の細胞を常法に従い抽出した。.抽出した細胞は、 以下の条件で、 1 0日間 培養した。 なお、 培養期間中は、 2日おきに培地交換を行ない、 浮遊する 血球系細胞を除去し、 底面に接着する骨芽細胞を精製していった。
培養条件） 温度： 3 7°C、 C02濃度： 5 %
培地： Q!MEM (10%FBS+1%グルタミン +抗生物質） 上記のようにして 1 0 日間培養した骨芽細胞を継代し （細胞数 ： 106cel Is/ml), 以下の条件で、 コラーゲン一フォスフオフオリンシート (10ΙΜΦ、 5枚） またはコラーゲンシート （10πιηιφ、 5枚） とともに、 2 週間の共存培養を行なった。 培養条件） 温度： 3 7°C、 （302濃度： 5%、
培地： 《MEM(10%FBS+1%グルタミン +抗生物質） +10mM β -Glycerophosphate + 50 n g/ml Vitamin C phosphate+10-8 M Dexamet asone こうして得られた、 培養細胞を含むシートを、 移植用サンプルとした。 2. 移植実験
8週齢の Fischer系ラット （n = 5)の大腿部に、 ドリルで穿孔した（直 径 2匪）。 この穿孔部に、調製した移植用サンプルを挿入可能な程度の大き さに切断して、 移植した。 なお、 各ラットの右脚にコラーゲンシートを、 左脚にコラーゲン—フォスフオフオリンシートを移植した。 移植後、 1、 2、 4、 6、 8週目に、 移植した大腿骨を摘出した。
3. 移植部位の観察
移植用サンプルの摘出日数に達したラッ卜を、 7 %包水クロラールで麻 酔した（ラット体重 100gあたり、 0.4mlの包水クロラールを腹腔に静注）。 麻酔したラットの胸部を開き、 心臓より固定液 （4%パラホルムアルデヒ ド Z0.25%ダルタールアルデヒド） を注入し、 還流固定法によりラットを 固定した （還流時間： 1 5min)。 還流固定終了後、 ラットより大腿骨を摘 出した。 摘出した大腿骨に対し、 脱脂、 脱灰、 アルコール脱水、 透徹を施 し、 サンプル面が見えるように、 パラフィンで包埋した。 包埋したサンプ ルは、 ミクロト一ムで厚さ に薄切してスライドグラスに貼付し、パラ フィン伸展器上で伸展した。伸展したパラフィン切片は、へマトキシリン ェォジン染色で染色し、 顕微鏡下で観察した。 組織像を図 1および図 2に 示す。
4. 結果 （図 1および図 2)
コラーゲン—フォスフオフオリンシートを移植した大腿骨では、 1週目 より、 コラーゲンシートに比べて骨化が進行し、 2週目以降もコラーゲン シートに比較して骨化が進行していた。 コラーゲンシートのみの場合でも 骨化は若干起こるが、 コラーゲン—フォスフオフオリンシートの方が骨化 が進行していることが確認された。 また、 炎症等の所見は特に認められな かった。 以上のとおり、 本発明のコラーゲン一フォスフオフオリンシートは生体 親和性が高く、 コラーゲンシ一卜に比較して優れた骨形成能を有すること が確認された。 また、 移植後の炎症反応も認められず、 本発明の複合生体 材料は安全性の面でも優れていることが確認された。
' 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考 として本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 生体適合性、 骨誘導性に優れた新規複合生体材料を提 供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. フォスフオフォリンとコラーゲンを含む複合生体材料。
2. 前記コラーゲンがコラーゲンタイプ Iである、 請求の範囲第 1項に 記載の複合生体材料。
3. 前記フォスフオフオリンがコラーゲンに架橋されていることを特徴 とする、 請求の範囲第 1項または第 2項に記載の複合生体材料。
4. 前記複合生体材料がスポンジ状構造を有することを特徴とする、 請 求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の複合生体材料。
5. さらにハイドロキシアパタイト、 j8 TCP、 QJ T C P、 ポリグリコ —ル酸およびポリ乳酸から選ばれる少なくとも 1以上を含む、 請求 の範囲第 1項〜第 4項のいずれか 1項に記載の複合生体材料。
6. さらに骨髄由来細胞を含む、 請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれか 1項に記載の複合生体材料。
7. 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1項に記載の複合生体材料か らなる人工骨材。
8. コラーゲン線維とフォスフオフオリンを、 ジビニルスルフォンまた は 1 _ェチル _ 3 _ ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジアミ ドを用いて架橋後、 凍結乾燥することを特徴とする、 複合生体材料 の製造方法。
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