VESICULES LIPIDIQUES, PREPARATION ET UTILISATIONS
INTRODUCTION ET ETAT DE L'ART
La présente invention concerne des vésicules lipidiques artificielles, leur préparation et leurs utilisations. Elle concerne en particulier des vésicules artificielles dont la composition est basée sur des caractéristiques de vésicules naturelles, leur conférant des propriétés biologiques et/ou physico-chimiques particulièrement avantageuses. Elle concerne notamment des vésicules dont la paroi possède une composition en lipides particulière, notamment une teneur élevée en phospholipides disaturés. L'invention décrit également les utilisations de ces vésicules lipidiques, notamment en tant que vecteurs de transport de molécules d'intérêt, dans le cadre de la préparation de vaccins, de compositions pharmaceutiques ou de compositions cosmétiques. L'invention concerne en outre les méthodes de préparation de telles vésicules lipidiques ainsi que des compositions les contenant. Elle porte par ailleurs sur des outils et kits pour la préparation des vésicules et compositions évoquées ci-dessus. L'invention peut être utilisée par exemple dans les domaines techniques de la biologie, de la pharmacologie, du diagnostic, de la cosmétologie, de l'imagerie médicale et de l'agroalimentaire. Ses applications concernent notamment les domaines de la santé humaine et animale.
II a été mis en évidence dans différents contextes physiologiques que les cellules pouvaient libérer des vésicules membranaires (appelées exosomes), impliquées dans le transport de molécules, la communication entre cellules, etc. Ainsi, une production et une libération de vésicules ont été observées à partir de différents types cellulaires tels que : - les lymphocytes B, qui libèrent des exosomes porteurs de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II impliqués dans la présentation antigénique (Raposo et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 1161) ;
- les cellules dendritiques, qui produisent des vésicules ayant des caractéristiques structurales et fonctionnelles particulières jouant un rôle dans la médiation de la réponse immune, notamment dans la stimulation des lymphocytes T cytotoxiques (Zitvogel et al., Nature Medicine 4 (1998) 594) ; - les cellules tumorales, qui sécrètent des vésicules particulières porteuses d'antigènes tumoraux et capables de présenter ces antigènes ou de les transmettre aux cellules présentatrices d'antigènes (WO 99/03499) ;
- les cellules de mastocytes, qui accumulent les molécules dans les compartiments vésiculaires intracellulaires, qui peuvent être sécrétés sous l'effet de signaux (WO 00/28001 ).
D'une manière générale, il semble donc que les cellules communiquent entre elles par l'intermédiaire de vésicules membranaires qu'elles libèrent, qui peuvent être porteuses de motifs antigéniques, de molécules du CMH, ou de tout autre signal (cytokine, facteur de croissance, etc.). Ces vésicules présentent des caractéristiques structurales et fonctionnelles spécifiques et particulièrement intéressantes, et représentent donc un produit particulièrement attractif pour des applications diagnostiques, vaccinales, thérapeutiques ou pour véhiculer des molécules d'intérêt.
Différentes approches ont été mises en œuvre pour produire de telles vésicules et pour les purifier. Ces approches utilisent des cellules productrices, éventuellement modifiées génétiquement, ou des fluides biologiques, à partir desquels les vésicules sont purifiées (voir par exemple les demandes WO 99/03499, WO 00/44389, WO 00/28001 ).
La présente demande propose maintenant des vésicules lipidiques artificielles ayant des propriétés structurales et fonctionnelles avantageuses, susceptibles de se substituer aux vésicules naturelles.
La présente invention rapporte notamment l'analyse de la composition lipidique des membranes des vésicules lipidiques produites par différents types
cellulaires. La présente demande rapporte également l'analyse des propriétés structurales de ces vésicules et montre que la phase lipidique de ces vésicules est un élément essentiel de leur structure et de leurs propriétés. L'invention démontre notamment pour la première fois l'existence d'une structure lipidique spécifique des exosomes et de paramètres structuraux propres à ces vésicules, qui diffèrent de la composition membranaire globale des cellules dont ils sont issus. Ces informations permettent désormais de reconstituer in vitro de telles vésicules, ci-après dénommées exoliposomes, indépendamment de toute source biologique et notamment de tout système cellulaire, simplifiant ainsi avantageusement leur production. En raison de leur composition, les vésicules de l'invention présentent des propriétés biologiques et pharmaco-dynamiques avantageuses par rapport aux liposomes de l'art antérieur, telles que une plus grande stabilité, une plus grande rigidité, une demi-vie plasmatique augmentée, etc. En outre, ces vésicules peuvent être produites facilement. Ces vésicules représentent donc des produits particulièrement intéressants pour véhiculer des molécules d'intérêt in vivo.
DESCRIPTION GENERALE DE L'INVENTION
Le problème que la présente invention se propose de résoudre consiste à produire des vésicules lipidiques artificielles ayant des propriétés améliorées in vitro ou in vivo, notamment pour le transfert de molécules d'intérêt vers des cellules ou organismes. La présente invention repose notamment sur l'analyse de la composition de vésicules lipidiques naturelles et sur la mise en évidence de caractéristiques inattendues, permettant la préparation de vésicules artificielles ayant un comportement amélioré.
Un premier aspect particulier de l'invention concerne ainsi une vésicule lipidique artificielle caractérisée en ce qu'elle comprend une paroi (ou membrane) lipidique comprenant du cholestérol et des phospholipides disaturés. De préférence, les phospholipides disaturés représentent 3% au moins des constituants totaux de la paroi lipidique.
La présente demande repose en effet en partie sur la mise en évidence de la présence de phospholipides particuliers, notamment de phospholipides disaturés (phospholipides comprenant deux chaînes d'acides gras saturés occupant des positions distinctes sur l'alcool considéré, généralement le glycérol substitué en positions 1 et 2) dans la structure de la paroi des vésicules, permettant de conférer des propriétés avantageuses à ces produits. Dans un mode plus préféré, les vésicules de l'invention comprennent en outre d'autres lipides ou phospholipides, tels que de la sphingomyéline, de la phosphatidylsérine et du phosphoinositol.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de production d'une vésicule telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en présence, dans un milieu approprié, de cholestérol et de phospholipides, une partie au moins des phospholipides étant disaturés, b) le traitement du mélange obtenu dans l'étape a) pour former des vésicules comprenant une paroi lipidique, et c) la récupération des vésicules obtenues à l'issue de l'étape b).
Un autre aspect de l'invention concerne une vésicule lipidique (ou une composition comprenant des vésicules lipidiques) obtenue par assemblage à partir d'une composition comprenant du cholestérol et des phospholipides, une partie au moins des phospholipides étant disaturés.
L'invention concerne par ailleurs l'utilisation des vésicules telles que décrites ci-avant comme vecteur de transport d'une ou de plusieurs molécules d'intérêt.
D'autres aspects de l'invention concernent par ailleurs un vaccin, une composition pharmaceutique et une composition cosmétique comprenant au
moins une vésicule selon l'invention, ainsi que des kits comprenant de telles vésicules ou destinés à la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Au sens de l'invention, le terme « vésicule lipidique artificielle » désigne une vésicule produite par voie artificielle ou synthétique, c'est-à-dire par exemple par assemblage ou reconstitution in vitro d'une vésicule à partir des constituants. Une vésicule artificielle est donc typiquement produite indépendamment de tout système cellulaire. Il est entendu que certains lipides ou autres constituants utilisés dans la préparation des vésicules peuvent être d'origine naturelle, et provenir de source cellulaire. Une vésicule lipidique artificielle selon l'invention est plus précisément une vésicule comprenant une paroi lipidique entourant ou renfermant une solution (ou phase) aqueuse. Au sens de l'invention, le terme « paroi lipidique » désigne toute paroi ou membrane comprenant un agencement de lipides. La paroi ou membrane lipidique des vésicules de l'invention peut se présenter sous forme d'une monocouche lipidique (i.e., une simple couche moléculaire de lipides) ou d'une bi- couche lipidique (i.e., une double couche moléculaire de lipides). Dans le cas d'une double couche, les pôles hydrophobes des lipides sont en regard les uns des autres. La paroi (ou membrane) des vésicules artificielles de l'invention comprend essentiellement des lipides (e.g., phospholipides, stérols (e.g., cholestérol), glycolipides, (di-)glycérides, etc.), même si d'autres constituants éventuels, tels que des protéines ou des glucides, peuvent être présents. Les vésicules selon l'invention ont un diamètre généralement compris entre 50 et 150 nm, de préférence entre 60 et 100 nm. Ces diamètres ont été obtenus par une méthode d'extrusion (passage à travers une membrane présentant des pores de 100 nm de diamètre, par exemple). Il est entendu que la dimension peut être adaptée par l'homme du métier en fonction des applications envisagées, par exemple en modifiant les conditions de préparation. Bien entendu, les compositions de vésicules peuvent comprendre des vésicules ayant des dimensions variables.
Comme indiqué, la présente demande concerne des vésicules lipidiques artificielles dont la paroi présente une composition lipidique particulière. Cette composition est basée sur l'analyse de vésicules naturelles, et confère aux vésicules artificielles de l'invention des propriétés biologiques et physicochimiques remarquables, notamment en terme de stabilité, bio-compatibilité, etc. Plus particulièrement, les inventeurs ont procédé à l'analyse de la composition lipidique de différentes membranes biologiques, et ont mis en évidence des compositions particulières permettant la reconstitution de vésicules artificielles ayant des propriétés avantageuses.
En particulier, les résultats obtenus montrent que des vésicules physiologiques possèdent une structure lipidique particulière, basée principalement sur :
- un équilibre des proportions molaires des 4 classes principales de phospholipides (PC, PE, PS/PI, SM), et/ou
- une présence d'espèces moléculaires disaturées, notamment de PC et PE, et/ou
- une diminution des diglycérides totaux, conférant des paramètres structuraux de fluidité membranaire remarquables et distincts des cellules.
Sur la base de ces résultats, la présente demande propose à présent des vésicules artificielles, de composition particulière, ayant des propriétés physiologiques avantageuses.
Une première caractéristique particulièrement avantageuse des vésicules de l'invention réside dans le fait que la paroi lipidique comprend des phospholipides di-saturés. Le terme phospholipides di-saturés désigne au sens de l'invention des phospholipides portant deux chaînes d'acides gras saturées. Les inventeurs ont en effet mis en évidence, en analysant la composition d'exosomes naturels, la présence de tels phospholipides et leur enrichissement par rapport aux membranes globales des cellules.
Les phospholipides sont des constituants des membranes biologiques des cellules vivantes. De façon schématique les phospholipides sont des lipides complexes caractérisés par une tête polaire hydrophile (c'est-à-dire une extrémité portant une charge électrique positive ou négative interagissant avec l'eau), et de longues queues apolaires hydrophobes (lesquelles, n'ayant pas de charge électrique, ne se mélangent pas avec l'eau). Ces caractéristiques moléculaires font que les phospholipides, plongés dans une solution aqueuse, s'organisent typiquement sous forme de vésicule. Selon les conditions utilisées, ils peuvent former une bicouche fluide dans laquelle les têtes hydrophiles entrent en contact avec l'eau, tandis que les longues queues hydrophobes se disposent vers l'intérieur, s'isolant du milieu aqueux. Cette bicouche lipidique d'environ 5 nanomètres d'épaisseur sert de barrière presque imperméable au passage de substances solubles dans l'eau.
Une autre caractéristique des vésicules de l'invention réside dans la présence de cholestérol. Le cholestérol est le stéroïde le plus abondant dans les membranes naturelles. Son squelette de base est formé de quatre cycles carbonés auxquels s'attachent des groupements latéraux variés. Il constitue un élément rigidifiant de la membrane.
De manière particulièrement préférée, une vésicule lipidique artificielle selon l'invention est une vésicule comprenant une paroi lipidique (mono- ou bicouche) entourant une solution aqueuse, la paroi lipidique comprenant des phospholipides di-saturés et du cholestérol.
Plus préférentiellement, les phospholipides disaturés représentent 3% au moins des constituants totaux de la paroi lipidique. Comme illustré dans les exemples, les phospholipides disaturés représentent avantageusement plus de 4 % des constituants, encore plus préférentiellement plus de 5 %, de préférence moins de 15 %. Dans un mode particulièrement préféré, les vésicules comprennent de 5 à 7% de phospholipides disaturés.
De manière avantageuse, les vésicules de l'invention comprennent de 5 à 25 % environ de cholestérol, plus préférentiellement de 8 à 20 %, encore plus préférentiellement de 12 à 18 %, par rapport aux constituants totaux.
Les phospholipides sont plus précisément des molécules de glycérides dont le glycérol est estérifié par deux acides gras et la dernière fonction alcool primaire par un acide phosphorique. Cette structure, commune à tous les phospholipides, porte le nom d'acide phosphatidique. L'acide phosphorique des phospholipides est estérifié une deuxième fois dans la plupart des phospholipides par une fonction alcool d'une autre molécule : la choline (phosphatidylcholine (PC) ou lécithine), l'éthanolamine (phosphatidylethanolamine (PE)), la serine (phosphatidylsérine (PS)), l'inositol (phosphatidyl-inositol (PI)), le glycérol (phosphatidyl-glycérol (PG)), etc.
De manière particulièrement préférée, les vésicules de l'invention comprennent au moins un phospholipide di-saturé choisi parmi la phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidylethanolamine (PE), typiquement sous forme de mélange. A cet égard, les proportions respectives de PC et de PE peuvent être ajustées par l'homme du métier. Elles sont généralement comprises entre 1/10 et 10/1 , plus préférentiellement entre 3/10 et 10/3. De manière plus préférée, le rapport PC-disaturées / PE-disaturées varie de 0,5 à 2.
De préférence, les chaînes grasses des phospholipides utilisés dans les vésicules de l'invention ont une longueur, identique ou différente, comprise entre 14 et 22 atomes de carbone, de préférence entre 14 et 20, encore plus préférentiellement entre 16 et 20 atomes de carbone. On peut ainsi mentionner les phospholipides ayant une chaîne grasse comprenant 14, 16, 18, 20 ou 22 atomes de carbone, saturées ou non.
Dans un mode particulier de l'invention, les vésicules comprennent des phospholipides disaturés comportant deux chaînes grasses saturées, identiques
ou différentes, choisies parmi l'acide palmitique (C16 :0) et l'acide stéarique (C18 :0).
L'acide palmitique est un acide gras à chaîne longue, le principal produit de la synthèse des lipides dans nos cellules. On le symbolise souvent par les nombres 16:0 pour indiquer qu'il comporte 16 atomes de carbone et aucune double liaison : c'est acide gras saturé. C'est également un solide blanc, qui fond à 64 °C. Son nom vient de l'huile de palme, mais il est abondant dans toutes les graisses et huiles animales ou végétales. Industriellement on utilise l'acide palmitique pour la fabrication des margarines, des savons durs.
L'acide stéarique est un autre acide gras à chaîne longue, qu'on symbolise par les nombres 18:0 pour indiquer qu'il a 18 atomes de carbone et aucune double-liaison : c'est un acide gras saturé. C'est également un solide blanc, qui fond à 70 °C. Il est abondant dans toutes les graisses animales (surtout chez les ruminants) ou végétales. L'acide stéarique sert industriellement à faire des bougies, des savons.
Un objet particulier de l'invention concerne une vésicule lipidique artificielle dont la paroi lipidique comprend de la phosphatidylcholine (PC) ou de la phosphatidylethanolamine (PE) substituée par deux chaînes grasses saturées, identiques ou différentes, choisies parmi C18 :0 et C16 :0. II est entendu que des phospholipides synthétiques peuvent être mis en œuvre, dans lesquels la position des chaînes grasses est modifiée (par exemple en position 2 et 3) et/ou dans lesquels la longueur des chaînes grasses est modifiée (par exemple 15, 17 19 ou 21 atomes de carbone).
De préférence, la paroi des vésicules comprend en outre d'autres lipides ou phospholipides.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, les vésicules artificielles de l'invention comprennent en outre du phosphatidyl-inositol (PI). Le PI est formé de deux acides gras, liés par des liaisons ester à un glycérol dont la troisième
fonction est estérifiée par un acide phosphorique comme dans les autres phospholipides. L'autre fonction acide estérifié un alcool cyclique à six fonctions alcool secondaires, dont les hydroxyles sont orientés spécifiquement de part et d'autre du plan de la molécule. Le phosphatidyl-inositol est situé à la face interne des membranes plasmiques où il est le précurseur métabolique de deux messagers secondaires : le diacylglycérol (DAG) et l'inositol triphosphate. Les résultats obtenus par les inventeurs montrent que des vésicules biologiques naturelles comportent du PI, et que cette espèce moléculaire contribue aux propriétés des vésicules. De manière plus préférée, le PI est présent dans les membranes des vésicules de l'invention à raison de 1 à 10 % des constituants, plus préférentiellement de 3 à 10 %, encore plus préférentiellement de 4 à 8 %.
Dans un autre mode particulier de mise en œuvre, les vésicules de l'invention comprennent de la phosphatidylsérine (PS), de préférence entre 1 et 15 % du total des constituants, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 %, typiquement entre 3 et 8 %. Les résultats obtenus par les inventeurs montrent que la quantité totale de PS et de PI est préférentiellement comprise entre 10 et 20 % des constituants totaux.
D'autre part, dans un mode de réalisation préféré, les vésicules artificielles de l'invention comprennent en outre des sphingomyélines (SM). Les sphingomyélines sont des phospholipides membranaires, présents dans différentes membranes mais surtout dans le système nerveux (gaines de myéline). Elles sont constituées d'une longue chaîne (sphingosine), d'un acide gras amidifiant la fonction aminé et d'un phosphate esterifiant la fonction alcool primaire et lui même estérifié par un alcool aminé (choline). De manière plus préférée, les SM sont présentes dans les membranes des vésicules de l'invention à raison de 2 à 20 % des constituants, plus préférentiellement de 3 à 18 %, encore plus préférentiellement de 6 à 15 %.
Les vésicules de l'invention peuvent en outre comprendre des di- glycérides, bien que ceux ci soient généralement présents à raison de moins de
10 % des constituants totaux. Les diglycérides sont des agents de fluidité et les résultats obtenus montrent qu'ils sont présents de manière moins importante dans les vésicules que dans les membranes des cellules de type cellules dendritiques ou mastocytes. Plus préférentiellement, les vésicules comprennent moins de 7% de diglycérides, par rapport au total des constituants.
Dans un mode de réalisation particulier, les vésicules artificielles de l'invention comprennent en outre de la lyso-phosphatidylcholine (LPC) et/ou de la lysophosphatidyléthanolamine (LPE). Ces lipides peuvent être présents en quantités variables, de préférence comprise entre 1 et 8 % des constituants totaux, de préférence au moins 3 %
Les vésicules de l'invention peuvent comprendre, outre les phospholipides disaturés, des phospholipides polaires, apolaires, neutres, chargés et/ou insaturés. Il peut s'agir de lipides synthétiques ou naturels. Les lipides utilisés dans le cadre de la présente invention peuvent être obtenus de sources commerciales (Avanti Polar Lipids, Sigma, lnositols.com, Matreya, Alexis, etc.). A titre d'exemples, on peut citer des phospholipides comprenant deux chaînes grasses, identiques ou différentes, comportant de 14 à 22 atomes de carbone et présentant une ou plusieurs double-liaisons, par exemple de 1 à 5. Des exemples de tels phospholipides sont donnés dans les figures 4 et 5 notamment.
Un exemple particulier de réalisation de l'invention est une vésicule lipidique artificielle comprenant une paroi lipidique mono- ou bi-couche comprenant, en % des constituants totaux : . au moins 3 % de PC et/ou de PE di-saturées, de préférence de 5 à 7 % ;
. de 3 à 10 % de PI ; . de 2 à 20 % de SM, et . de 5 à 25 % de cholestérol, plus préférentiellement de 12 à 18 %.
Encore plus préférentiellement, elle comprend en outre :
. de 1 à 15% de PS, de préférence de 3 à 8%, et/ou de 1 à 8 % de lyso-phosphatidylcholine et/ou de lyso- phosphatidyléthanolamine.
Les résultats obtenus montrent que des vésicules lipidiques particulièrement intéressantes sont obtenues lorsque la paroi lipidique comprend des phospholipides disaturés et une proportion similaire des constituants suivants : cholestérol, sphingomyéline, PC et PE. Encore plus préférentiellement, la paroi lipidique comprend des phospholipides disaturés et des proportions similaires des constituants suivants : cholestérol, sphingomyéline, PC, PE et PS/PI.
Le terme « proportions similaires » indique que lesdits constituants sont présents dans des proportions identiques ou pouvant varier les unes par rapport aux autres d'un écart généralement inférieur à 25 %.
Comme indiqué ci-avant, la vésicule peut en outre comprendre d'autres lipides ou phospholipides neutres, polaires, saturés ou insaturés, tels que notamment de la phosphatidylcholine et/ou de la phosphatidylethanolamine insaturées et de la lysophosphatidylcholine (LPC), etc.
D'autre part, les lipides ou phospholipides peuvent être glycosylés (glycolipides) ou non, modifiés chimiquement ou biologiquement, comporter un groupe réactif, etc. A cet égard, la vésicule peut comprendre différents types d'hydrates de carbone, présents dans la membrane sous la forme d'oligosaccharides, courtes chaînes formées par l'association de quelques molécules de sucres simples. Ces chaînes sont liées à des constituants (e.g., protéines ou lipides) de la membrane, formant respectivement des glycoprotéines et des glycolipides. Les glycolipides, tout comme les phospholipides, sont des lipides complexes dotés de têtes hydrophiles et de queues hydrophobes. Un autre objet de l'invention concerne ainsi des vésicules telles que décrites ci-dessus comprenant en outre des glycolipides.
Dans un mode particulier de réalisation, la paroi lipidique est essentiellement dépourvue de protéines, en particulier de récepteurs spécifiques.
Des compositions plus spécifiques de vésicules sont données dans le Tableau ci-après (en % des constituants totaux) :
LYSO-PC 3,75 à 6,21
SPHINGOMYELINE 8,26 à 12, 41
PC-DISATUREES 3,00 à 4,81
PC-MELANGE 12,00 à 19,22
PS 5,17 à 6,89
PI 5,17 à 6,89
PE-DISATUREES 2,61 à 2,85
PE-MELANGE 13,42 à 14,65
CHOLESTEROL 13,01 à 16,61
DIGLYCERIDES 4,76 à 7,05
AUTRES LIPIDES Qsp 100%
Les vésicules préférées de l'invention présentent des propriétés biologiques et/ou physico-chimiques particulièrement avantageuses. Ainsi, la composition lipidique confère aux vésicules une rigidité membranaire importante et crée, notamment par l'intermédiaire des phospholipides, une pression latérale de surface empêchant l'action d'enzymes lipolytiques ou augmentant la résistance à ces enzymes. La membrane des vésicules selon l'invention présente ainsi la particularité d'être plus rigide à 37 °C que la membrane des cellules, augmentant ainsi sa stabilité et donc sa demi-vie in vitro mais également et surtout in vivo.
La rigidité peut être estimée par mesure de la viscosité des parois lipidiques. De préférence, les vésicules de l'invention présentent une viscosité, mesurée par anisotropie de fluorescence à 37 °C, supérieure à environ 0,15, de préférence supérieure à 0,20.
Une autre caractéristique avantageuse des vésicules préférées de l'invention, découlant de leur stabilité élevée, est que ces vésicules pourraient être congelées sans adjuvant ou stabilisant, sans altérer leurs propriétés. Ainsi, les exosomes naturels peuvent par exemple être conservées à - 80 °C sans traitement particulier.
Sans être lié par la théorie, il est estimé que les propriétés particulières des vésicules de l'invention découlent notamment des quantités respectives des constituants majeurs de la paroi lipidique que sont le cholestérol, les PC, les PE, les SM et les PS/PI, de l'enrichissement en phospholipides disaturés, et d'un taux faible en diglycérides.
Etant basée sur une analyse, faite par les inventeurs, de membranes lipidiques naturelles particulières, les vésicules lipidiques de l'invention devraient par ailleurs posséder une meilleure bio-compatibilité et une toxicité bien inférieure à des produits synthétiques de l'art antérieur. En outre, leur composition pourrait permettre un ciblage cellulaire in vivo particulièrement adapté à des applications thérapeutiques ou vaccinales. La présence éventuelle, dans les vésicules lipidiques de l'invention, de lyso-PC confère également une plus grande stabilité à ces vésicules, en réduisant leur caractère fusogène.
Les vésicules de l'invention peuvent comprendre en outre différentes molécules d'intérêt, telles que des protéines, polypeptides, peptides, molécules chimiques, acides nucléiques, etc. Ces molécules peuvent être destinées à améliorer les propriétés physico-chimiques des vésicules, ou à leur conférer des propriétés biologiques particulières (ciblage, activité biologique, marquage, purification, etc.). Ces molécules peuvent être insérées, en tout ou partie, dans la bicouche lipidique, ancrées dans celle-ci, exposées à la surface de la
vésicule, ou présentes dans la phase aqueuse. A cet égard, un autre objet particulier de l'invention concerne une vésicule telle que décrite ci-dessus comprenant en outre une ou plusieurs molécules d'intérêt.
Dans un mode de réalisation particulier, il s'agit de protéines, de nature identique ou différente, qui participent à la rigidité de la membrane notamment par interaction avec des lipides.
Dans un autre mode de réalisation, il s'agit de molécules destinées à être véhiculées par les vésicules, in vitro ou in vivo. De telles molécules d'intérêt portées par ou contenues dans les vésicules de l'invention peuvent être toute protéine, polypeptide, peptide, acide nucléique, lipide, ainsi que toute substance d'intérêt (de nature chimique, biologique ou synthétique). Ces molécules peuvent être de nature recombinante, et être introduites directement dans/sur les vésicules. Ces molécules sont par exemple liées aux vésicules par interaction avec la phosphatidylsérine et/ou la phosphatidylethanolamine, éventuellement fonctionnalisées, présentes dans la membrane. Des types plus particulièrement préférés de molécules d'intérêt sont notamment des molécules du CMH, des antigènes (entiers ou sous forme de peptides), des ligands de récepteurs, des récepteurs (spécifiques) de ligands, des acides nucléiques, des produits pharmacologiques, des marqueurs ou encore des peptides ou protéines permettant une purification des vésicules.
Comme antigène, on peut citer plus particulièrement toute protéine, notamment cytoplasmique, d'origine virale ou tumorale. A titre d'exemples préférés de protéines d'origine virale, on peut citer notamment toute protéine cytoplasmique ou membranaire exprimée par les virus EBV, CMV, VIH, rougeole, hépatite, etc. Il s'agit plus préférentiellement de protéines cytoplasmiques, c'est-à-dire essentiellement invisibles au système immunitaire dans les processus d'infection classique, et donc faiblement immunogènes dans les conditions naturelles, ou également de protéines ou fragments de protéines membranaires. A titre d'exemples préférés de protéines d'origine tumorale, on peut citer notamment les protéines p53 (sauvage ou toute forme mutée présente dans une tumeur), MAGE (notamment MAGE 1 , MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4,
MAGE 5 et MAGE 6), MART (notamment MART 1 ), la Gp100, les protéines ras (p2l sauvage ou mutées), etc. Il est entendu que toute autre protéine d'intérêt peut être exprimée dans ou à la surface des vésicules de l'invention, en suivant l'enseignement de la présente demande. En outre, les molécules antigéniques peuvent être présentes soit à la surface des vésicules (exposées), soit à l'intérieur des vésicules.
Parmi les récepteurs de ligands, on peut citer, de manière générale, tout récepteur de ligand naturel ou issu de manipulations génétiques. En particulier, il peut s'agir de tout récepteur d'hormone, facteur de croissance, lymphokine, facteur trophique, antigène, etc. On peut citer plus particulièrement les récepteurs des interleukines IL1 à IL15, le récepteur de l'hormone de croissance, ou le récepteur de facteurs de stimulation de colonies de granulocytes et/ou macrophages (G-CSF, GM-CSF, CSF, etc). Un exemple particulier de récepteur de ligand est composé d'un anticorps ou d'un fragment ou dérivé d'anticorps, par exemple un simple-chaîne (ScFv), qui permet l'interaction avec un ligand spécifique. Un autre exemple particulièrement avantageux au sens de l'invention est représenté par le récepteur à l'antigène des lymphocytes T (TcR). Des vésicules de l'invention exprimant à leur surface un ou plusieurs TcR définis constituent des outils d'analyse et de diagnostic particulièrement avantageux (cf : WO 00/28001 ).
L'invention concerne également une vésicule telle que définie ci-avant, caractérisée en ce qu'elle comprend, typiquement dans la phase aqueuse, un produit pharmaceutique. Comme produit pharmaceutique, on peut citer toute substance active, de nature chimique, telle que par exemple des produits pharmaceutiques préparés par les techniques de chimie conventionnelles. On peut également citer tout acide nucléique, toute protéine, polypeptide ou peptide ayant une activité biologique, tel que par exemple une toxine, une hormone, une cytokine, un facteur de croissance, une enzyme, un suppresseur de tumeur, etc. L'acide nucléique peut être tout ADN ou ARN codant pour une protéine, polypeptide ou peptide pharmacologique tel que mentionné ci-dessus, ainsi que tout autre acide nucléique présentant une propriété particulière (anti-sens, anti-
gène, promoteur, répresseur, site de liaison d'un facteur transcriptionnel, etc.). Il peut s'agir d'un oligonucléotide, d'une phase codante, d'un chromosome artificiel, etc.
Les vésicules de l'invention portant un récepteur de ligand peuvent être utilisées pour la détection de toute interaction de type récepteur-ligand, en particulier de faible affinité, dans tout échantillon biologique. D'autre part, la présente invention concerne également l'utilisation d'une vésicule telle que décrite ci-avant comme vecteur de transport d'une ou de plusieurs molécules d'intérêt. De telles vésicules peuvent en effet être utilisées pour véhiculer, vers des cellules, la ou les substances d'intérêt, ces dernières pouvant être des principes actifs (protéine, peptide, nucléique acide, substance chimique, etc). Le principe actif peut, en particulier, être choisi parmi une molécule de nature hormonale ou neuroendocrinienne, un glucide, une vitamine, un acide gras essentiel, une protéine et un acide nucléique. Ainsi, les vésicules de l'invention peuvent être utilisées, de manière générale, pour le transport et le transfert de toute molécule dans des cellules ou organismes, in vitro, ex vivo ou in vivo. L'invention concerne donc toute vésicule telle que décrite ci-avant comprenant une molécule hétérologue d'intérêt, utilisable comme vecteur de transfert de ladite molécule dans une cellule.
Dans un mode plus préféré, les vésicules de l'invention sont utilisées pour le transfert orienté de substances d'intérêt vers des populations cellulaires sélectionnées. Ainsi, il est possible de préparer des vésicules de l'invention comportant une substance d'intérêt (une toxine, une hormone, une cytokine, un acide nucléique recombinant, etc.) et exprimant à sa surface un récepteur de ligand ou un ligand de récepteur, et de mettre en contact lesdites vésicules avec des cellules exprimant le ligand ou le récepteur correspondant. Cette approche permet donc un transfert ciblé et efficace. A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne une vésicule comprenant au moins une molécule d'adressage choisie de préférence parmi un anticorps, un antigène, un ligand particulier, un récepteur particulier, un substrat et un enzyme.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans une vésicule telle que définie ci-avant, caractérisée en ce qu'elle exprime un récepteur de ligand et en ce qu'elle comporte une molécule hétérologue d'intérêt. Le terme « hétérologue » indique que la molécule d'intérêt n'est pas présente, sous cette forme, dans les exosomes de l'invention à l'état naturel.
Dans une variante particulière, les vésicules selon l'invention comportent en outre au moins un marqueur et/ou un produit de contraste. Le marqueur peut être de nature différente (enzymatique, fluorescent, radioactif, magnétique, paramagnetique etc.) et présent dans la vésicule ou à sa surface. Un marquage préféré est non-radioactif, comme par exemple un marquage fluorescent. Plus préférentiellement, le marquage utilisé est un fluorochrome ou une enzyme à substrat chromogénique. Le marquage peut être réalisé directement sur les vésicules produites.
Production des vésicules artificielles
Les vésicules de l'invention peuvent être produites artificiellement par différentes méthodes, par exemple des méthodes utilisées pour la production de liposomes. On peut citer notamment les méthodes décrites par Allen et al. (FEBS Lett. 223 (1987) 42), Gabizon et al. (PNAS 85 (1988) 6949) et Lentz et al (Biochemistry 26 (1987) 5389). Une méthode préférée, qui constitue également un objet de l'invention, comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en présence des différents constituants des vésicules, en particulier de cholestérol et de phospholipides dont au moins certains sont disaturés, b) le traitement du mélange obtenu à l'issue de l'étape a) pour former des vésicules comprenant une paroi lipidique, et c) la récupération des vésicules obtenues à l'issue de l'étape b).
Avantageusement, l'étape a) comprend la mise en contact de cholestérol, de phospholipides dont une partie sont disaturés, de phosphatidylsérine et/ou de
phophoinositol et/ou de sphingomyéline. Les constituants sont mis en contact dans les proportions désirées, comme indiqué ci-avant.
L'étape a) de mise en présence des constituants (e.g., du cholestérol et des phospholipides) peut être effectuée dans tout milieu approprié, de préférence tout milieu dans lequel les constituants sont solubles. Généralement, elle est réalisée dans un solvant organique. Dans ce cas, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on procède à une étape supplémentaire d'élimination du solvant, qui est remplacé par tout milieu aqueux adapté à un usage biologique ou pharmaceutique. Cette étape peut être réalisée avant la mise en contact des constituants ou, de préférence, après leur mise en contact.
Dans une variante particulière de réalisation, le procédé de l'invention comprend donc une étape a') intermédiaire d'élimination du milieu de départ par évaporation (ou assèchement), généralement sous vide, du mélange lipidique obtenu à l'issue de l'étape a). Cette étape permet notamment d'éliminer le solvant et/ou de définir un milieu d'hydratation. Ce milieu d'hydratation est important puisqu'il se retrouvera, en partie, au sein des vésicules de l'invention (phase aqueuse). Il est donc de préférence biocompatible et peut contenir des agents ou principes actifs, des constituants structuraux additionnels des vésicules, etc. Le milieu ou tampon d'hydratation est par exemple réalisé à base de sérum physiologique ou d'une solution tamponnée isotonique.
Le mélange des différents constituants dans le milieu choisi (tampon d'hydratation) est typiquement agité, pour favoriser la mise en suspension des constituants et leur réorganisation. Les phospholipides présents dans le tampon d'hydratation s'organisent spontanément en mono- ou bi-couche lipidique, reproduisant par exemple l'organisation d'une membrane biologique naturelle. A ce stade, le mélange obtenu est composé de structures lipidiques hétérogènes.
L'étape b) de traitement du mélange obtenu à l'issue de l'étape a) permet de former des vésicules de taille et/ou de forme plus homogènes, comprenant une
paroi lipidique entourant une solution aqueuse. Selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, le traitement mis en œuvre lors de l'étape b) est un procédé d'ultrasonication. Selon un deuxième mode, plus préféré, il s'agit d'un procédé d'extrusion. L'extrusion est typiquement réalisée à travers une membrane de porosité définie, permettant d'obtenir des vésicules selon l'invention de dimension homogène et pré-déterminée. L'extrusion peut être réalisée dans tout dispositif connu de l'homme du métier, tel que notamment un Extruder™ (Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada).
Les procédés selon l'invention peuvent en outre comprendre une étape d) de purification des vésicules récupérées à l'issue de l'étape c). La purification peut être réalisée par exemple par gel-filtration, ultra-centrifugation, ultrafiltration, filtration sur colonne, chromatographie, etc. Il peut encore s'agir d'une extraction réalisée à l'aide d'un système magnétique.
Les procédés décrits ci-dessus peuvent également comprendre une étape de fonctionnalisation des vésicules, par exemple par fixation ou incorporation d'un marqueur, d'une molécule d'adressage, d'un ligand, d'un lipide modifié, d'une molécule active, d'un médicament, d'un acide nucléique, etc., plus généralement, de toute molécule d'intérêt. Cette étape peut être réalisée de différentes manières et à différents stades du procédé. Ainsi, la fonctionnalisation peut être réalisée sur les vésicules finales, par exemple par électroinsertion directe dans la bicouche lipidique ou dans la phase aqueuse, ou par interaction avec une molécule de surface réactive ou fonctionnalisée. Elle peut également être réalisée sur les vésicules en cours de formation, par exemple (i) à l'aide d'un détergent, lorsque la paroi lipidique a déjà été formée, (ii) par ajout d'une ou de plusieurs molécules d'intérêt dans la solution d'hydratation, conduisant à leur incorporation dans la phase aqueuse ou dans la membrane des vésicules à l'issue du traitement réalisé lors de l'étape b), ou (iii) par ajout de lipides ou constituants fonctionnalisés ou réactifs lors de l'étape a).
Selon un premier mode avantageux de réalisation de l'invention, les vésicules sont modifiées après leur formation, par interaction entre la ou les molécules d'intérêt et un constituant réactif ou fonctionnalisé de la membrane lipidique. Le constituant réactif ou fonctionnalisé peut être une protéine, du cholestérol ou un lipide fonctionnalisé, c'est-à-dire porteur d'un groupe (chimique) réactif permettant la fixation d'une molécule d'intérêt et n'empêchant pas l'introduction de ce constituant dans la membrane des vésicules. Ainsi, les surface négativement chargées des phospholipides, et notamment la fonction aminé de la phosphatidylethanolamine, peuvent être adaptées de manière à comporter un groupe réactif capable de fixer une molécule d'intérêt. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les exoliposomes de l'invention sont fonctionnalisés par conjugaison chimique avec des anticorps selon la méthode décrite par Holmberg et al. (« Highly efficient immunoliposomes prepared with a method which is compatible with various lipid compositions », Biochemical and biophysical research communications, pages 1272-1278, Vol. 165, No.3, 1989). Selon une autre variante, on introduit dans la composition lipidique un lipide ayant une affinité particulière pour une molécule d'intérêt. Ainsi, il est possible d'introduire dans la membrane lipidique de la phosphatidylsérine, qui possède une affinité élevée pour la lactadhérine.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend, dans l'étape a), l'introduction d'un lipide modifié portant un group réactif ayant la capacité d'interagir avec un molécule d'intérêt, la formation des vésicules selon b), puis la mise en contact des vésicules avec la molécule d'intérêt, permettant son interaction avec la vésicule.
Dans un autre mode de réalisation, le lipide modifié est mis en contact avec la molécule d'intérêt préalablement à son introduction dans la vésicule.
Le lipide modifié est préférentiellement une phosphatidylethanolamine dans laquelle la fonction aminé a été activée chimiquement.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend, dans l'étape a), l'introduction de phosphatidylsérine, la formation des
vésicules selon b), puis la mise en contact des vésicules avec une molécule d'intérêt fusionnée à la lactadhérine, permettant son interaction avec la vésicule.
Les procédés décrits ci-dessus peuvent comprendre en outre, l'adjonction, lors de l'étape a) ou à l'issue de cette dernière, d'un principe actif d'intérêt tel que défini ci-dessus présent dans la solution d'hydratation.
Les vésicules ainsi préparées peuvent être mises en suspension et/ou conservées dans différents types de solutions ou milieux. On peut citer notamment des solution isotoniques, tamponnées, stériles et/ou biocompatibles.
L'invention concerne également toute vésicule obtenue par la mise en œuvre d'un procédé tel que décrit ci-dessus. Notamment, elle concerne toute préparation lipidique obtenue par reconstitution in vitro à partir d'un mélange de constituants comprenant du cholestérol, des phospholipides disaturés et, de préférence, des SM, de la PS et/ou du PI.
Compositions/Utilisations
Un autre objet de l'invention concerne toute composition comprenant une ou plusieurs vésicules telles que définies ci-dessus. Les compositions de l'invention peuvent en outre comprendre une pluralité de vésicules telles que définies ci-dessus, portant des molécules différentes. En particulier, une composition selon l'invention peut comprendre des vésicules telles que définies ci-dessus, portant différents médicaments, protéines, gènes, peptides, antigènes, marqueurs, etc.
Les compositions de l'invention comprennent généralement un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, tel qu'une solution tampon, saline, physiologique, etc., permettant de préserver la structure des vésicules. Elles peuvent en outre comprendre tout agent stabilisant, tensio-actif, etc., de préférence compatible avec un usage biologique (in vitro ou in vivo). Ces
compositions peuvent être conditionnées dans tout dispositif approprié, tel que tube, flacon, ampoule, flasque, poche, etc., et stockées à 4 °C. Comme indiqué ci-avant, une propriété particulièrement avantageuse de vésicules préférées de l'invention réside dans leur stabilité, même en l'absence d'agent de stabilisation. Des compositions typiques selon l'invention comprennent de 5 à 500 μg d'exoliposomes, par exemple de 5 à 200 μg.
Un autre objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'une vésicule artificielle telle que décrite ci-avant comme vecteur de transport d'une ou de plusieurs molécules d'intérêt, et notamment de principes actifs, par exemple dans le cadre de la préparation d'un médicament ou d'un vaccin. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des vésicules pour la préparation d'une composition pharmaceutique. Une vésicule selon l'invention peut ainsi être utilisée dans le cadre de la préparation d'une composition destinée à la prévention ou au traitement d'un cancer, d'une allergie, d'une maladie virale, d'une maladie génétique, d'une dermatose, d'une maladie affectant le système nerveux ou le système immunitaire. Une vésicule selon l'invention peut également être utilisée dans le cadre de la préparation d'une composition cosmétique.
Un autre objet de l'invention concerne en outre les vaccins, compositions pharmaceutiques ou cosmétiques comprenant une vésicule selon l'invention.
L'invention est particulièrement adaptée au transfert de molécules vers des cellules du système immunitaire, notamment vers des cellules présentatrices d'antigènes (cellules dendritiques, macrophages, etc.). Une application particulière de l'invention réside donc dans l'utilisation d'une vésicule telle que définie ci-avant pour le transfert d'antigènes ou autres molécules vers des cellules présentatrices, notamment vers de cellules dendritiques. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une vésicule pour stimuler ou inhibe une réponse immune.
L'invention est également relative à des méthodes de transfert, d'administration, de transport ou de libération prolongée de molécules d'intérêt chez un sujet, comprenant l'administration à un sujet d'une vésicule de l'invention comprenant ladite molécule. L'administration peut être réalisée par voie systémique, notamment par injection(s) intraveineuse, intraarterielle, sous- cutanée, intradermique, intrapéritonéale, etc. L'injection ou l'administration peuvent être locales (intra-tumorale, intra-cérébrale, trans-dermique, etc.).
Application en imagerie médicale : Les exoliposomes sont des outils avantageux pour l'imagerie médicale du fait de leur stabilité et de leur biodégradabilité. Comme indiqué précédemment, ils peuvent être facilement administrés aux patients, par exemple par voie intraveineuse. Les marqueurs utilisés varient en fonction des techniques d'imagerie. Ils peuvent être couplés directement aux lipides ou indirectement via une protéine de type albumine humaine.
Les exoliposomes permettent une stabilisation avantageuse des marqueurs jusqu'à leur administration en limitant leur incompatibilité avec les excipients ou les contenants. Ils peuvent également diminuer la toxicité de certains marqueurs et/ou augmenter leur biodisponibilité, et/ou diriger les marqueurs vers un compartiment cible défini si un moyen d'adressage est prévu.
Applications dans l'industrie pharmaceutique :
Les exoliposomes peuvent être utilisés pour répondre à un certain nombre d'exigences galéniques et pharmacologiques et constituer ainsi un nouveau système de libération de principe actif (« Drug delivery System »). Le principe actif (PA) peut être présent à la surface ou dans la phase aqueuse des exoliposomes et se présenter sous forme libre ou liée, par exemple aux lipides ou à des protéines supports. Un moyen d'adressage spécifique peut en outre être mis en œuvre comme expliqué précédemment. Les exoliposomes peuvent ainsi être utilisés comme simples vecteurs "inactifs" et permettre la solubilisation des PA peu solubles dans l'eau, la protection du PA dans le courant sanguin ou dans les tissus ou encore la diminution de la toxicité du PA.
Ils peuvent aussi être utilisés comme vecteurs "actifs" et permettre par exemple la libération contrôlée dans le temps du PA lequel est en fait libéré progressivement lors de la dégradation des exoliposomes. Ils peuvent également permettre une libération contrôlée dans l'espace, le moyen d'adressage mis en oeuvre permettant un ciblage cellulaire ou tissulaire.
Dans ce contexte, un mode d'administration préféré est l'injection. Cette dernière peut être sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou encore intrapéritonéale.
Applications en immunologie clinique :
Du fait de leur composition et de leurs propriétés, les exoliposomes peuvent avoir plusieurs applications majeures en immunologie clinique. Ils peuvent être utilisés comme adjuvant en vaccinologie : la stabilité des exoliposomes fait de ces vésicules des adjuvants avantageux qui peuvent potentiellement être utilisés en vaccinologie humaine et animale. Ils peuvent en outre être utilisés comme vecteurs de principes actifs dans les organes lymphoïdes. En incorporant des drogues spécifiques et un moyen d'adressage propre aux système immunitaire, il devient possible de les cibler vers les organes lymphoïdes (rate et ganglions). Cette propriété est utile pour cibler notamment les drogues anti-rétrovirales dans les réservoirs ganglionnaires du HIV et les produits de chimiothérapie dans les ganglions profonds lymphomateux ou
métastatiques. Dans ces cas, la voie d'administration préférée est également l'injection.
Applications en thérapie génique et cellulaire :
Les exoliposomes peuvent servir de vecteur non viral de transfert de fragments linéaires ou circulaires d'acides nucléiques (ADN, ARN). Ce transfert peut se faire in vitro, in vivo (injection directe au patient de la préparation) ou ex vivo
(recueil des cellules, transfert de la séquence d'intérêt puis réinjection des cellules).
Applications en dermo-cosmétologie :
Un des intérêts majeurs des exoliposomes réside dans leur stabilité et dans leur composition proche de celle de membranes biologiques. Ils sont également facilement administrables par voie cutanée. Dans ce type d'application, le principe actif est préférentiellement couplé aux lipides ou encapsulé dans les exoliposomes.
Les exoliposomes particulièrement stables peuvent protéger le PA et augmenter sa biodisponibilité. Ils permettent également une stabilisation du PA dans la préparation jusqu'à son application. Ils peuvent également séparer plusieurs PA incompatibles entre eux. Ces propriétés sont très utiles pour les vitamines par exemple.
Les exoliposomes sont par eux-même non toxiques. Ils peuvent par ailleurs réduire les irritations de certains PA augmentant ainsi l'efficacité et le confort des préparations.
Les constituants des exoliposomes pouvant être la cible des enzymes de la peau, ils peuvent être modifiés pour retarder ou au contraire accélérer cette dégradation permettant ainsi une libération programmée du PA.
Applications en diagnostic :
Les exoliposomes peuvent servir de support stable à des ligands, récepteurs, substrats, enzymes ou anticorps. Ils peuvent être marqués avec des molécules
radioactives, fluorescentes ou magnétiques ce qui permet de créer des combinaisons originales de propriétés (ligands et fluorescence). Ces exoliposomes fonctionnalisés et marqués peuvent être utilisés pour isoler une molécule, une enzyme ou une population cellulaire, pour doser un substrat, pour mesurer une activité enzymatique, pour marquer in vitro ou in vivo une population cellulaire.
Applications dans l'industrie agro-alimentaire :
Les exoliposomes peuvent encore servir de support stable à diverse enzymes utilisées dans les processus d'affinage et de maturation (protéases, lipases, décarboxylases, etc.) des préparations agro-alimentaires. Cette application permet une meilleure reproductibilité et un meilleur contrôle des processus d'affinage.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lectures des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Contrôle de la qualité des préparations d'exosomes par microscopie électronique.
Photographie d'une préparation d'exosomes extraits de cellules RBL. Les préparations d'exosomes contiennent des vésicules de 50 à 80 nm de diamètres ainsi que des vésicules beaucoup plus petites (environ 30 à 40 nm). Barre = 200 nm
Figure 2 : Composition phospholipidique des exosomes et des cellules mastocytes RBL.
Les figures de gauche représentent le système exosomes/cellules RBL. Les résultats représentent la moyenne de 3 expériences différentes +/- l'écart standard à la moyenne.
Les figures de droite représentent le système exosomes/cellules dendritiques. Les résultats représentent la moyenne de 4 mesures +/- l'écart standard à la moyenne à partir du même lot d'exosomes et de cellules dendritiques.
A. Proportion de phosphore présent dans les 5 phospholipides majoritaires (5PL) au dépôt et au front de migration. La séparation des extraits lipidiques d'exosomes (barres noires) ou de cellules RBL au repos (barres grises) a été réalisée par chromatographie en couche mince (CCM) dans un solvant Skipsky (cf. Matériels et Méthodes). Les distances de migration du dépôt et du front sont reportées sur la photo de la plaque de CCM en dessous de l'histogramme.
B. Proportion des classes de phospholipides majoritaires dans les membranes d'exosomes (barres noires) ou de RBL au repos (barres grises). La séparation des 5 phospholipides majoritaires est illustrée sur la photo de la plaque de CCM après migration des extraits lipidiques totaux dans un solvant Skipsky. La migration des extraits lipidiques dans un système de solvant basique (Chloroforme/Méthanol/Méthylamine ; 65/22/4 ; v/v/v) permet de séparer les phosphatidylserines des phosphatidylinositols et montre une augmentation des deux phospholipides.
Figure 3 : Proportion des sous-classes diacyl et alkylacyl, au sein des phosphatidylcholines et des phosphatidyléthanolamines d'exosomes et de cellules RBL.
Les résultats sont exprimés en pourcentage du total de la classe de phospholipide, PC ou PE.
A. Détermination, par HPLC en phase normale, de la proportion de diacyls (DA) présents dans les phosphatidylcholines (PC) ou phosphatidyléthanolamines (PE) de cellules RBL (barres noires) ou d'exosomes (barres grises).
B. Détermination, par HPLC en phase normale, de la proportion d'alkylacyls (AA) présents dans les PC ou PE de RBL (barres noires) ou d'exosomes (barres grises).
Dans les deux cas, la différence par rapport au 100% correspond à la sous- classe des alkénylacyls (non représentée).
Figure 4 : Analyse des espèces moléculaires de phosphatidylcholines et phosphatidyléthanolamines d'exosomes et de RBL.
A. Analyse par HPLC en phase inverse des espèces moléculaires de la sous-classe des diacyl-phosphatidylcholines (panneau du haut; DA-PC) et des diacyl-phosphatidyléthanolamines (panneau du bas; DA-PE) à partir d'extraits lipidiques de RBL (barres noires) ou d'exosomes isolés à partir des RBL (barres grises). B. Analyse par HPLC en phase inverse des espèces moléculaires de la sous-classe des alkylacyl-phosphatidylcholines (panneau du haut; AA-PC) et des alkylacyl-phosphatidyléthanolamines (panneau du bas; AA-PE) à partir d'extraits lipidiques de RBL (barres noires) ou d'exosomes isolés à partir des RBL (barres grises). Les résultats correspondent à la moyenne de deux expériences et sont exprimés en pourcentage de l'ensemble des pics obtenus sur les chromatogrammes d'HPLC. En gras sont indiquées les espèces moléculaires disaturées.
C. Comparaison des proportions d'espèces moléculaires disaturées, impliquées dans la rigidité membranaire (cf. fig. 6), entre RBL (barres noires) et exosomes (barres grises). A partir des résultats obtenus par HPLC (fig. 4A et 4B), la somme des pourcentages correspondant aux espèces moléculaires disaturées (16:0/16:0 et 16:0/18:0) a été effectuée, en tenant compte de la proportion relative des deux sous-classes (AA et DA; cf. fig. 3A et 3B) au sein des PC ou des PE. Les résultats sont exprimés en pourcentage du total des espèces moléculaires dans chaque classe de phospholipides, PC ou PE.
Figure 5 : Analyse par chromatographie en phase gazeuse des lipides neutres d'exosomes et de RBL.
Mesure de la proportion de cholestérol et de diglycérides totaux (DG totaux), - impliqués également dans la rigidité membranaire - dans les extraits lipidiques de RBL (barres noires) et d'exosomes (barres grises). Les résultats correspondent au rapport molaire dans l'échantillon du cholestérol/Phosphore total (Ptot) ou des DG totaux Ptot. Les histogrammes représentent la moyenne de 3 expériences +/- l'écart standard à la moyenne pour le cholestérol, et de 2 expériences pour les DG.
Figure 6 : Mesure de la viscosité (Ln h) des membranes des exosomes (carrés gris) et des RBL au repos (ronds noirs) en fonction de la température (1/T) par polarisation de fluorescence.
Les résultats représentent une expérience type d'obtention des diagrammes d'Arrhenius.
Figure 7 : Mesure de la viscosité membranaire par polarisation de fluorescence.
Les résultats présentent les valeurs d'anisotropie de fluorescence à 25 °C et 37 °C, pour les cellules au repos (n = 3), activées (n = 2) et les exosomes (n = 3). A partir de l'intensité de la lumière polarisée parallèlement (1
//) et perpendiculairement (l ) à la direction de polarisation du faisceau d'excitation, on calcule l'anisotropie de fluorescence r selon l'équation suivante :
L'anisotropie peut être reliée à la microviscosité, terme inverse de la fluidité, par la relation de Perrin (1926). A une valeur élevée de r est donc associée une valeur élevée de la microviscosité, et inversement (Shinitzky et al., 1978). En l'asbence de mouvement (milieu rigide) l'anisotropie a une valeur maximale de 0,4.
Figure 8 : Marquage in vitro et in vivo des exosomes avec des phospholipides fluorescents.
A. Les exosomes isolés à partir de cellules RBL lAb-li ont été marqués in vitro avec des phospholipides fluorescents BODIPY-phosphatidylcholine (BPY- PC), BODIPY-céramide (BPY-Cer), NBD-phosphatidylcholine (NBD-PC) dans l'éthanol, ou incubés avec de l'éthanol seul (EtOH). Les vésicules ont ensuite été fixées sur des billes de latex seules (« billes seules ») ou immunoisolées avec des billes de latex recouvertes d'anticorps anti-CMH Classe II IAb (« Billes + Ac α CMH II »), d'anticorps anti-CD63 (« Billes + Ac α CD63 ») ou d'anticorps anti-CD81 (« Billes + Ac α CD81 »). La fluorescence émise par les exosomes fixés sur les billes a ensuite été mesurée par cytometrie de flux. Les histogrammes représentent les résultats d'une expérience type, et correspondent aux moyennes de fluorescence normalisées par rapport à un marquage avec un anticorps irrelevant.
B. Des exosomes ont été isolés à partir de cellules RBL IAb-H marquées, avant stimulation, avec les phospholipides fluorescents BODIPY-PC, BODIPY-
Céramides, NBD-PC, ou éthanol seul. Les exosomes marqués in vivo ainsi obtenus ont ensuite été traités de la même manière qu'en A.
Figure 9 : Fixation des exoliposomes sur différents types cellulaires.
Les différents types cellulaires utilisés sont l'hybridome T CD4, BO97.10 (spécifique du peptide Ova-323-339 de I' Ovalbumine et restreint par les molécules de classe II du CMH l-Ab (Guéry et al. 1996)), le lymphome B A20 et les cellules dendritiques immatures de la lignée D1 (Winzler e al. 1997). BO97.10 et A20 sont maintenues en culture en RPMI (Gibco) complet (10% SVF+ glutamine (Seromed) + antibiotiques (Seromed)) et les cellules D1 sont cultivées en IMDM (Sigma) complet (10% SVF + glutamine + antibiotiques + 15% de surnageant de cellules J558 produisant du GM-CSF ( fournies par D. Gray, Edimburg)). Les cellules sont lavées dans un milieu dépourvu de protéine puis préincubées 15 min à 4°C. Elles sont ensuite incubées à 2.106/ml avec différentes quantités de Lipex-Ova-bodipy-PC, dans un milieu dépourvu de protéine pendant 1 h à
4°C. Après lavage, les cellules sont passées au cytomètre de flux (Facscalibur, Beckton Dickinson) et la fluorescence du bodipy-PC analysée en FL1/FL2. La proportion de cellules marquées par le bodipy-PC est indiquée au dessus des figures.
Figure 10 : Activation de lymphocytes T CD8 par les Lipex-Ova présentés par les cellules dendritiques.
Les cellules dendritiques de la lignée D1 (5.104/puit) sont incubées en présence de l'antigène ovalbumine sous forme de Lipex-Ova-bodipy-PC ou de protéine entière soluble en milieu IMDM sans protéine (ni SVF, ni source de GM-CSF), pendant 3h, à 37°C. Le peptide Ova-257-264, restreint par les molécules de classe I Kb est utilisé comme contrôle d'activation de l'hybridome T CD8 par les cellules de la lignée D1. Ensuite, l'hybridome T CD8 B3Z (spécifique du peptide Ova-257-264 dans le contexte H-2b) (5.104/puit) est ajouté en milieu IMDM complet (+SVF + GM-CSF). Après 18h de coculture, les surnageants sont prélevés et mis en présence de la lignée IL-2- dépendante CTLL-2. Après 24h de culture, la prolifération des CTLL-2 est mesurée, pendant 18h, par incorporation de thymidine tritiée, traduisant ainsi l'activation de l'hybridome T B3Z.
Figure 11 : Répartition des phospholipides et des protéines Ova sur les fractions 4-11 Lipex-Ova.
Figure 12 : Libération d'HPTS (sonde fluorescente encapsulée) par les Lipex en fonction de la température. Les résultats présentés sur la figure n'indiquent pas de variation de matériel libéré en fonction de la température.
Sauf mention contraire, les pourcentages mentionnés dans les exemples et dans l'ensemble de la description sont exprimés en moles.
EXEMPLES
Cultures cellulaires
Les cellules utilisées pour la production d'exosomes sont des cellules de mastocytes murins nommées RBL 2H3 (Rat Basophil Leukemia). Elles sont cultivées, à 37 °C sous une atmosphère à 5 % de C02, soit en adhérence dans des flacons de culture de 175 cm2, soit en suspension à une concentration de 2 à 5.105 cellules/mL dans du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal, 4mM final de L-Glutamine et d'un mélange pénicilline/streptomycine (pénicilline. : 140 U/ml ; streptomycine. : 140 μg/mL final).
Préparation des exosomes naturels
Les préparations d'exosomes se font à partir d'1.109 cellules en suspension. Les exosomes sont isolés par un jeu de centrifugations différentielles. Tout d'abord, les cellules sont concentrées et lavées par 3 centrifugations de 300Xg pendant 10' et deux fois 5', puis les cellules sont stimulées par un ionophore calcique, la lonomycine à 1 μM final, à raison de 108 cellules dans 5mL de milieu DMEM pendant 20' à 37 °C. Les cellules activées et les débris cellulaires sont ensuite éliminés par 3 centrifugations de 300Xg pendant 5', puis 2 OOOXg pendant 20' et enfin 10 OOOXg pendant 30'. Les exosomes sont ensuite isolés à partir de ces surnageants par ultracentrifugation à 100 OOOXg pendant 1h10. Le culot de vésicules ainsi obtenu est repris par du PBS et de nouveau ultracentrifugé à 100 OOOXg pendant 1h10. Ce dernier culot est repris par du PBS et soumis aux différentes analyses.
Analyse des exosomes par microscopie électronique (fia. 1)
Le culot d'exosomes est repris et fixé dans un tampon PBS/Paraformaldéhyde 2 % puis déposé sur des grilles de microscopie électronique. Le contraste de densité aux électrons est réalisé avec un mélange d'acétate d'uranyl et de
méthyl cellulose, puis les grilles sont analysées par un microscope électronique de type Philips TEM CM120. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 1.
Extraction lipidique et composition phospholipidique des exosomes (fia. 2)
L'extraction des lipides est réalisée à partir des cellules avant stimulation ou des exosomes dans le PBS, par la méthode de Bligh and Dyer qui consiste en un mélange chloroforme/méthanol/eau ou PBS (1/1/1 ; v/v/v). La phase organique contenant les lipides est reprise, séchée sous un jet d'azote et stockée dans du chloroforme/méthanol (1/1 ; v/v).
Afin de connaître la proportion de chaque classe de phospholipides dans les membranes d'exosomes ou de cellules, les extraits lipidiques ont été analysés par chromatographie sur couche mince de silice. La phase mobile correspond à un mélange de solvants chloroforme/méthanol/acide acétique/eau (75/45/12/6 ; v/v/v/v), dit de Skipsky. Les classes de phospholipides séparées grâce à ce solvant sont les phosphatidyléthanolamines (PE ; Rf=0.79), les phosphatidylsérines/phosphatidylinositols (PS/PI ; Rf=0.59), les phosphatidylcholines (PC ; Rf=0.48), les sphingomyélines (SM ; Rf=0.27), et enfin les lyso-phosphatidylcholines (LPC ; Rf=0.14). Les phospholipides sont révélés par des vapeurs d'iode. Un extrait lipidique d'hépatocytes sert de témoin afin de repérer l'emplacement des phospholipides. Chaque tache de silice est grattée et son contenu en phospholipide est mesuré. Cette quantification est réalisée par dosage du phosphore puisque chaque molécule de phospholipide contient un seul atome de phosphore. Ce dosage consiste tout d'abord en une minéralisation des molécules par de l'acide perchlorique puis le phosphore libéré est dosé par la méthode de Fisk et Subarov qui donne lieu à une réaction colorimétrique lisible par spectrophotométrie à une longueur d'onde λ. de 800nm.
Analyse des sous-classes et des espèces moléculaires de phosphatidylcholine et de phosphatidylethanolamine d'exosomes (fia.3 et 4)
Les extraits lipidiques d'exosomes ou de RBL au repos ont été analysés par HPLC en trois étapes afin de séparer successivement les classes de phospholipides (PC, PE, PS, ...), les sous-classes (alkylacyls, AA ; diacyls, DA), et enfin les espèces moléculaires de chacune des deux sous-classes.
- La séparation des classes de phospholipides est réalisée en phase normale sur une colonne de silice de type NUCLEOSIL (7 μm ; 250X4mm). Les extraits lipidiques à injecter sont repris dans le mélange hexane/isopropanol (3/2 ; v/v). La phase mobile est constituée du mélange acétonitrile/hexane/méthanol/acide phosphorique 85 % (918/30/30/17,5 ; v/v/v/v) passant sur la colonne à un flux de 1 ,5 mL/min. Les phospholipides ainsi séparés sont détectés par UV à une longueur d'onde λ de 206nm. Les classes PC et PE subissent ensuite un traitement in vitro consistant en une hydrolyse par la phospholipase C. Les diglycérides ainsi obtenus sont ensuite dérivés avec du chlorure d'anthroyle afin d'obtenir des composés fluorescents (diglycérides anthroylés ; DGA).
- La séparation des sous-classes (fig. 3) est aussi réalisée en phase normale sur une colonne de silice de type EQUISORB (3 μm ; 100X3mm). Les DGA formés à partir des PC et des PE sont repris dans le mélange cyclohexane/éther (98/2 ; v/v) qui correspond également à la phase mobile passant sur la colonne à un flux de 0,5mL/min. Les sous-classes (AA et DA) anthroyiées ainsi séparées sont détectées par fluorescence à une longueur d'onde λ de 460nm.
- La séparation des espèces moléculaires est réalisée en phase inverse sur une colonne apolaire (octadécyl-silice) de type EQUISORB ODS2 (5μm ; 250X4,6 mm). Les sous-classes anthroyiées sont reprises dans le mélange acétonitrile/éther (1/1 ; v/v). La phase mobile est constituée du mélange acétonitrile/propanol-2 (85/15 ; v/v) passant sur la colonne à un flux de 1 ,5 mL/min. Les différents pics sont détectés par fluorescence à une longueur d'onde λ de 460nm. Pour chaque séparation, l'identification des pics a été réalisée en comparant les chromatogrammes de cellules ou d'exosomes avec les chromatogrammes obtenus après injection d'un standard de plaquettes dont la composition en sous-classes et en espèces moléculaires est bien établie (Thevenon C. et al., J.
of Chromatography B , 1998). Divers standards commerciaux ont également permis d'identifier certains pics.
Analyse des lipides neutres d'exosomes et de RBL (fia. 5)
Les extraits lipidiques totaux d'exosomes ou de RBL, dont le contenu en phosphore était connu, ont été mis à sec en présence de 2 standards internes non naturels en quantité connue : le stigmastérol (3μg) dont la structure est proche de celle du cholestérol et le 1 ,3 dimyristoyl glycérol (diglycéride 14 :0- 14 :0 ; 0,5 μg). L'ensemble a été repris par de l'acétate d'ethyle puis les échantillons ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne capillaire de silice de type Hewlett Packard Ultra 1 (5m X 0,31mm) recouverte par pontage covalent de diméthyl siloxane. La température du four a été programmée à partir de 205 °C jusqu'à 345 °C à raison de 6 °C/min. Le gaz vecteur ici utilisé est l'hydrogène passant sur la colonne à une pression de 0,5 bar. Après intégration, les pics correspondant au cholestérol et aux diglycérides ont été identifiés sur les chromatogrammes et quantifiés grâce aux standards internes.
La composition de vésicules type est fournie dans le Tableau 1.
Mesure de la dynamique lipidique membranaire des exosomes et des RBL (fia. 6) et 7)
La microviscosité (η) des membranes a été mesurée par polarisation de fluorescence en fonction de la température, comme précédemment décrit (Shinitzky M., Barenholz Y., Biochim. Biophys. Acta., 1978) à l'aide d'une sonde fluorescente, le 1 ,6-diphényl 1 ,3,5-hexatriène (DPH) intégrée dans les membranes des exosomes ou des cellules. Les valeurs de η obtenues pour différentes températures permettent de tracer une droite Ln η = f(1/T) (diagramme d'Arrhenius). D'après l'équation précédemment établie (Kauzmann W. et al., J. Am. Chem. Soc, 1940) η= A eΔE/RT soit Ln η=LnA + ΔE/RT (A est
une constante caractéristique du système, R est la constante des gaz parfaits, ΔE est l'énergie d'activation du flux), on peut déduire l'expression de la pente de la droite soit ΔE/R, qui nous permet d'obtenir ΔE, paramètre structural important des membranes lipidiques. Les mesures d'anisotropie de fluorescence permettent de comparer les variations de microviscosité d'une structure à une autre en fonction de la température.
A cet égard, la Figure 7 rapporte les valeurs d'anisotropie de fluorescence à 25 °C et 37 °C, pour les cellules au repos (n = 3), activées (n = 2) et les exosomes (n = 3). L'anisotropie de fluorescence correspond à un rapport d'intensités de fluorescence ; elle est directement reliée à la microviscosité membranaire. On observe ainsi une microviscosité supérieure des exosomes à 25 °C comme à 37 °C, comparativement aux cellules au repos ou activées. Nos résultats démontrent donc une rigidité plus élevée des exosomes. Lorsque le milieu est totalement rigide, l'anisotropie atteint une valeur maximale de 0,4.
Utilisation de lipides fluorescents pour suiyre le devenir des exosomes (fig. 8) :
z Marquage fluorescent des exosomes
Des cellules RBL exprimant de façon stable la molécule de CMH de classe II murine IAb ainsi que la chaîne invariante « li » ont été utilisées pour produire des exosomes comme précédemment décrit. Deux types de marquages fluorescents ont été réalisés en parallèle à partir du même lot de cellules divisé en deux.
Le premier lot de cellules a été stimulé directement comme précédemment décrit et un marquage a été réalisé sur ces vésicules en les incubant avec 3 types de phospholipides fluorescents : le BODIPY-phosphatidylcholine, le BODIPY-céramide, ou le NBD-phosphatidylcholine pendant 30' à 37 °C à l'obscurité. Les 3 phospholipides fluorescents étant stockés dans de l'éthanol, une incubation avec de l'éthanol seul a été réalisée en tant que témoin. Les
exosomes ainsi marqués in vitro ont ensuite été lavés par 2 ultracentrifugations à 100 OOOXg dans du PBS.
Le second lot de cellules a tout d'abord été marqué avec les trois phospholipides fluorescents et l'éthanol séparément pendant 30' à 37 °C. Les cellules ont été lavées et la fluorescence a ensuite été chassée pendant 30' à 37 °C dans du milieu DMEM seul. Les cellules ont ensuite été stimulées afin de libérer les exosomes comme précédemment décrit. Le dernier culot d'exosomes marqués ainsi in vivo a été lavé une fois de plus puis repris par du PBS.
- Analyse des exosomes fluorescents par cytometrie de flux
La taille trop faible des exosomes (60-80nm) ne permet pas une analyse directe par cytometrie de flux. Les exosomes ont d'abord été fixés sur des billes de latex recouvertes d'aldéhyde-sulfate (diam=1 μm) par une incubation de 15' à température ambiante à raison de 10 μg d'exosomes pour 0,5 μL de billes. Puis le mélange a été dilué dans du PBS et de nouveau incubé pendant 1 h sous agitation à température ambiante. De la glycine a ensuite été rajoutée à raison de 100 mM pendant 30' à température ambiante afin de saturer les groupements aldéhydes des billes. Afin de séparer différentes populations d'exosomes, 4 types de billes ont été utilisés : des billes seules pour observer l'ensemble des exosomes, des billes recouvertes d'un anticorps anti-IAb, des billes recouvertes d'un anticorps anti-CD63 et enfin des billes recouvertes d'un anticorps anti-CD81. Afin de normaliser les valeurs de fluorescence, un anticorps inadapté couplé à un fluorochrome émettant dans une longueur d'onde différente des phospholipides fluorescents, a été incubé avec les complexes billes/exosomes.
Les billes recouvertes d'exosomes fluorescents marqués in vivo ou in vitro ont ensuite été analysées par cytometrie de flux.
Les résultats obtenus font apparaître une structure lipidique particulière, basée principalement sur :
- un équilibre des proportions molaires des 4 classes principales de phospholipides (PC, PE, PS/PI, SM)
- une présence d'espèces moléculaires disaturées de PC et PE
- une diminution des diglycérides totaux, - des paramètres structuraux de fluidité membranaire distincts des cellules d'origine.
La présente invention met ainsi en évidence une structure lipidique de type vesiculaire physiologiquement stable, puisque isolée à partir de vésicules biologiques capables d'être véhiculées par l'organisme sans être dégradées.
TABLEAU 1
Capacité des exosomes à fixer différents types cellulaires et à induire la présentation de peptides (fig. 9 et 10) :
L'Ovalbumine est utilisé comme source d'antigène soit sous forme de protéine soluble, soit incorporée dans des exosomes selon l'invention (ou Lipex-Ova), soit sous forme de peptides contenant des épitopes T CD4 ou CD8. Les Lipex- Ova contiennent de plus du bodipy-PC comme traceur fluorescent.
Les Lipex ont tout d'abord été testés pour leur capacité à se fixer à différents types cellulaires tels que des lymphocytes T (BO97.10 (Guery, Ria et al. 1996, "Dendritic cells but not B cells présent antigenic complexes to class ll-restricted T cells after administration of protein in adjuvant." J Exp Med 183(3): 751-7), lymphocytes B (A20) ou cellules dendritiques (lignée immature D1 [(Winzler, Rovere et al. 1997, "Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor- dependent long-term cultures." J Exp Med 185(2): 317-28)]. La Figure 9 représente les résultats obtenus après incubation des cellules avec les Lipex- Ova-bodipy-PC à 4°C en l'absence de protéine dans le milieu. Les différentes cellules fixent les Lipex-Ova de façon dose-dépendante mais seule une très faible proportion des cellules est capable de les fixer. De plus, il ne semble pas y avoir de fixation préférentielle sur un type cellulaire particulier, les cellules dendritiques étant les moins efficaces pour lier les Lipex (sur 4 expériences indépendantes). Les Lipex-Ova ont également été testés pour leur capacité à induire la présentation du peptide Ova-257-264 par les cellules dendritiques à des lymphocytes T CD8 (hybridome B3Z spécifique du peptide Ova-257-264). Les cellules D1 incubées avec les Lipex-Ova sont capables d'induire l'activation de l'hybridome T CD8. Les résultats obtenus dans 2 expériences indépendantes (l'une est représentée Figure 10) suggèrent que la présentation par les cellules D1 est optimale pour une dose d'Ova sous forme de Lipex qui correspond à une dose inefficace lorsque l'Ova se présente sous forme soluble. Ceci semble
indiquer que les Lipex-Ova peuvent être présentés de façon efficace par les cellules dendritiques bien que la liaison (suivie par Facs) soit peu importante.
Fabrication des Lipex-Ova utilisés pour les essais (Fig. 11):
Composition de Lipex :
•Les 100 μmoles de phospholipides (+10μl de Bodipy-PC) sont repris par 2 ml de PBS (sans Ca2+ ni Mg2+) contenant 10mg d'OVA /ml, puis incubés 2h à
55°C.
•L'échantillon subit 3 passages sur l'Extruder sur une membrane de 400nm et avec une pression de 200 psi.
•L'Ova non liée est séparée par la colonne Séphadex 6B (fraction 11 à 20) de manière à récupérer les Lipex-Ova seuls (fractions 6 à 9, cf. tableau 2).
P = Phospholipides Pt = Protéine Ova
Libération d'HPTS (sonde fluorescente encapsulée) par les Lipex en fonction de la température (Fia. 12):
Fabrication:
•Les 25 μmoles de phospholipides sont reprises par 1 ml de PBS (sans Ca2+ ni Mg2+) contenant 35μMoles d'HPTS puis sont incubées 2h à 55°C.
•L'échantillon subit 3 passages sur l'Extruder sur une membrane de 400nm et avec une pression de 200 psi.
•L'HPTS libre est séparée des liposomes par la colonne SéphadexθB (gel filtration). »Les Lipex-HPTS (100μl) sont dilués dans du PBS, placés à la température indiquée pendant 10min (37°C à 40°C), puis centrifugés 5 min à 6500 rpm à
4°C.
•Le surnageant contenant l'HPTS libérée est séparé du culot où se trouvent les
Lipex-HPTS contenant l'HPTS interne. Le culot est repris par du PBS + Triton X à 1%.
•Chaque partie est diluée par du solvant d'injection et l'HPTS est mesurée à ? excitation = 450nm et ? émission = 510nm. La fluorescence est obtenue après passage sur colonne silice-diol par HPLC.
Composition de Lipex