WO2003060588A1 - Procede et dispositif de visualisation microscopique a sondes locales d'un objet tridimensionnel - Google Patents

Procede et dispositif de visualisation microscopique a sondes locales d'un objet tridimensionnel Download PDF

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Arnaud Dubois
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/18—Arrangements with more than one light path, e.g. for comparing two specimens
    • G02B21/20—Binocular arrangements
    • G02B21/22—Stereoscopic arrangements

Definitions

  • the present invention relates to a method and a device for microscopically viewing a three-dimensional object.
  • the object of the present invention is the production of three-dimensional images therefore allowing a visualization of the interior of a sample with a definition also greater than that permitted by conventional optical microscopy.
  • Such a three-dimensional display offering nanometric resolution could receive numerous applications.
  • this visualization consists of the representation of a section, limited in depth, of the sample.
  • the accumulation of information contained in several slices makes it possible to obtain global three-dimensional visualizations, for example in perspective.
  • the probes can be animated with limited movements within a structure.
  • the display methods and device objects of the present invention make it possible to produce detailed images of the interstitial volume.
  • This method also allows the exploration of the structure of physiological elements such as cells such as neurons, to describe the contact between two solid grains and to follow their evolution, to follow the dynamic diffusion of elements in a soft matter or even perform temperature measurements on complex structures such as electronic power components.
  • the study of their positions and the possible evolution of these positions allows to better know the environment in which they are fixed and the possible external parameters to which they are subjected.
  • it can be applied to the visualization of a colloidal gel of which it will be possible to acquire a precise knowledge of the behavior, for example when it is subjected to a homogeneous deformation.
  • the invention relates to a method of microscopic visualization of a three-dimensional object in which the sample is visualized through an interferometer. According to the invention, local probes of nanometric dimensions are introduced into the sample.
  • these local probes or particles can be animated by a movement whose analysis over time allows the production of characteristic images of the object.
  • This movement can be the Brownian movement or it can be generated by acting on the probes, for example by magnetic or electric effect.
  • the probes are of nanometric dimensions, that is to say generally less than 200 nanometers. They must diffuse the light. Thus, metal probes returning a large proportion of the light they receive in the opposite direction give good results.
  • the local probes are balls
  • the local probes are metallic
  • the interferometer is a Michelson interferometer
  • the interferometer is a Linnik interferometer
  • the interferometer is a Mirau interferometer
  • the interferometer includes a broad spectrum source.
  • a broad spectrum source is called a source having a coherence length of the order of one micrometer.
  • the source delivers brief light pulses
  • the invention also relates to a device for microscopically viewing a three-dimensional object comprising:
  • the device comprises means for introducing local probes into the sample.
  • the light source is advantageously a pulse source which makes it possible to freeze the possible movement of the probes.
  • FIG. 1 is a representation of the device of the invention
  • FIG. 2 is a representation of the distribution of the energy received allowing the location of a probe in depth
  • FIG. 3 is a schematic representation for specifying the lateral location of the probes.
  • the sample has been represented in perspective and designated under the reference la with respect to the references x, y, z then seen from the side the reference 1 with respect to the plane xz.
  • the interferometer 2 is a Michelson interferometer composed of a semi-transparent plate 3, a reference mirror 4, a light source 5 and a two-dimensional sensor 6 defining two arms: the measurement arm 7 and the reference arm 8.
  • the local probes 9 or beads are introduced into the sample. These are particles of nanometric dimensions whose average dimension is less than 200 nm, preferably between 20 and 200 min.
  • the voxel being the unit of volume of the solved object, good results are obtained when the probes are sufficient in number for them to be distributed in the observed volume, but also sufficiently low so that in general, a probe at more is present in a voxel.
  • the probes are in a medium such as a liquid, a gas or a gel. This medium must be transparent at the observation wavelengths.
  • These probes 9 are preferably metal balls, advantageously made of gold or silver.
  • the light source 5 is advantageously a wide pulse source.
  • the source coherence width or length determines, among other things, the depth resolution.
  • a pulse source makes it possible to freeze the possible movement of the probes 9.
  • the device thus makes it possible to acquire, at a given instant, the position of each of the probes inside the sample.
  • the image received by the two-dimensional sensor 6, preferably a CCD (Charge Coupled Device) or CMOS camera provides for each probe an image whose positioning in the xy plane of the sensor 6 is shown in FIGS. 3, 3B and 3C.
  • detectors having 1000 x 1000 pixels are common.
  • FIG. 3 represents the images of each of the probes with respect to the contour 10 of the sample
  • FIG. 3B is an enlarged representation of one of these images whose central position is obtained by processing and then positioned in the xy plane such as shown in Figure 3C.
  • the definition obtained in the xy plane depends on the definition of the sensor 6 and on the digital processing carried out by the processing unit 11 to obtain the central position of each of the probes.
  • the depth positioning is obtained by the interferometric techniques and represented in FIG. 2.
  • the depth measurement field is determined by the coherence length of the light 5 which is advantageously small. This depth of field is itself divisible by analysis of the phase, each of the probes 9 producing an image of different color depending on its position inside the field. Furthermore, it is possible to vary the relative positions of the sample and of the reference mirror, thus modifying the position of the field, in depth, inside the sample. It is thus thus possible to obtain at all times the three-dimensional visualization of the probes inside the sample.
  • the cumulation of this information varying due to the Brownian movement to which the probes are subjected, makes it possible to obtain by the processing unit, the three-dimensional outline of the sample.
  • the depth of field is conventionally of the order of 1 micron and a localization of the probes in space is obtained by phase analysis with a resolution of the order of ten nanometers in each of the directions. .
  • the sampling of the diffraction spots allows the location of their centers, characteristic of the positions of the probes with improved precision.
  • the interferometric techniques used allow the visualization of probes of a few tens of nanometers in diameter which have the equivalent of a reflection coefficient of about 10 "5 for the visible wavelengths.
  • interferometer can be used while the description given above uses a Michelson interferometer, it is also possible to use a Linnik interferometer or a Mirau interferometer.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel dans lequel l'échantillon (1) est visualisé au travers d'un interféromètre (2). Des sondes locales (9) de dimensions nanométriques sont introduites dans l'échantillon (1). L'invention concerne également un dispositif de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel comportant un interféromètre (2), une source à spectre large (5), un capteur matriciel (6), des moyens de formation de l'image d'une mince tranche de l'objet sur le capteur au travers de l'interféromètre (2), une unité de traitement de l'image produite par le capteur matriciel (6). Le dispositif comporte des moyens d'introduction de sondes locales (9) dans l'échantillon.

Description

Procédé et dispositif de visualisation microscopique à sondes locales d'un objet tridimensionnel
La présente invention concerne un procédé et un dispositif de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel.
Les techniques de microscopie en champ proche (STM - Scanning Tunneling Microscopy - Microscopie à effet tunnel ; AFM - Atomic Force Microscopy - Microscopie à force atomique ; SNOM - Scanning Nearfield Optical Microscopy - Microscopie optique en champ proche) dont le principe consiste à balayer une pointe à la surface de l'échantillon, permettent d'obtenir des images avec une résolution supérieure à celle de la microscopie optique classique.
Ces techniques se sont développées rapidement au cours des dernières années mais ne sont applicables qu'à l'étude de surfaces. Le but de la présente invention est la réalisation d'images tridimensionnelles permettant donc une visualisation de l'intérieur d'un échantillon avec une définition également supérieure à celle permise par la microscopie optique classique.
Une telle visualisation tridimensionnelle offrant une résolution nanométrique pourra recevoir de nombreuses applications.
De manière générale, elle permet le suivi de sondes locales incluses dans des structures.
Dans certains cas, cette visualisation consiste en la représentation d'une tranche, limitée en profondeur, de l'échantillon. Dans d'autres cas, le cumul des informations contenues dans plusieurs tranches permet d'obtenir des visualisations tridimensionnelles globales, par exemple en perspective.
Différentes applications de cette visualisation de sondes locales sont possibles.
Les sondes peuvent être animées de mouvements limités au sein d'une structure.
L'analyse des positions des sondes, de leur répartition statistique, permet d'acquérir des connaissances sur la structure, par exemple sur des parois limitant les mouvements des sondes.
Ainsi, les procédé et dispositif de visualisation objets de la présente invention permettent de réaliser des images détaillées du volume interstitiel. Cette méthode permet encore l'exploration de la structure d'éléments physiologiques tels que des cellules comme les neurones, de décrire le contact entre deux grains solides et de suivre leur évolution, de suivre la diffusion dynamique d'éléments dans une matière molle ou encore de réaliser des mesures de température de structures complexes comme les composants électroniques de puissance.
Lorsque les sondes sont fixées, l'étude de leurs positions et de l'évolution éventuelle de ces positions pennet de mieux connaître le milieu dans lequel elles sont fixées et les éventuels paramètres extérieurs auxquels elles sont soumises. En particulier, elle pourra être appliquée à la visualisation d'un gel colloïdal dont il sera possible d'acquérir une connaissance précise du comportement, par exemple lorsqu'il est soumis à une déformation homogène.
On pourra de cette manière étudier la structure de suspension de silice floculée. En effet, par floculation puis concentration, il est possible de réaliser des agrégats de silice très réguliers et peu denses, composés de sphères de 50 mn de diamètre environ.
A cet effet, l'invention concerne un procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel dans lequel l'échantillon est visualisé au travers d'un interféromètre. Selon l'invention, des sondes locales de dimensions nanométriques sont introduites dans l'échantillon.
Les sondes sont en grand nombre, on en trouve généralement de 100 à plusieurs milliers dans le champ observé.
On a vu que ces sondes locales ou particules peuvent être animées d'un mouvement dont l'analyse au cours du temps permet la réalisation d'images caractéristiques de l'objet. Ce mouvement peut être le mouvement brownien ou il peut être généré en agissant sur les sondes, par exemple par effet magnétique ou électrique.
Les sondes sont de dimensions nanométriques, c'est-à-dire généralement inférieures à 200 nanomètres. Elles doivent diffuser la lumière. Ainsi, des sondes métalliques renvoyant une proportion importante de la lumière qu'elles reçoivent dans la direction opposée donnent de bons résultats.
Dans différents modes de réalisation préférés présentant chacun leurs avantages spécifiques et susceptibles d'être combinés ensemble : - les sondes locales sont des billes,
- les sondes locales sont métalliques, - l'interféromètre est un interféromètre de Michelson,
- l'interféromètre est un interféromètre de Linnik,
- l'interféromètre est un interféromètre de Mirau,
- l'interféromètre comporte une source à spectre large, On appelle ici - source à spectre large - une source ayant une longueur de cohérence de l'ordre d'un micromètre.
- la source délivre des impulsions lumineuses brèves,
- des moyens optiques foπnent l'image d'une mince tranche de l'objet sur un détecteur matriciel au travers de l'interféromètre. L'épaisseur de la tranche visualisée est de l'ordre de grandeur de la longueur de cohérence de la source.
L'invention concerne également un dispositif de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel comportant :
- un interféromètre, - une source à spectre large,
- un capteur matriciel,
- des moyens de formation de l'image d'une mince tranche de l'objet sur le capteur au travers de l'interféromètre,
- une unité de traitement de l'image produite par le capteur matriciel. Selon l'invention, le dispositif comporte des moyens d'introduction de sondes locales dans l'échantillon.
La source lumineuse est avantageusement une source impulsionnelle qui permet de figer le mouvement éventuel des sondes.
Un mode de réalisation particulier de l'invention sera décrit en détail en référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 est une représentation du dispositif de l'invention ;
- la figure 2 est une représentation de la répartition de l'énergie reçue permettant la localisation d'une sonde en profondeur ;
- la figure 3 est une représentation schématique permettant de préciser la localisation latérale des sondes.
Sur la figure 1, l'échantillon a été représenté en perspective et désigné sous la référence la par rapport aux repères x, y, z puis vu de côté la référence 1 par rapport au plan xz.
L'interféromètre 2 est un interféromètre de Michelson composé d'une lame semi-transparente 3, d'un miroir de référence 4, d'une source lumineuse 5 et d'un capteur bidimensionnel 6 définissant deux bras : le bras de mesure 7 et le bras de référence 8.
Selon l'invention, les sondes locales 9 ou billes sont introduites dans l'échantillon. Il s'agit de particules de dimensions nanométriques dont la dimension moyenne est inférieure à 200 nm, de préférence comprise entre 20 et 200 mn.
Ces sondes sont nombreuses, généralement de plusieurs milliers et au moins d'une centaine dans le champ observé.
Le voxel étant l'unité de volume de l'objet résolu, on obtient de bons résultats lorsque les sondes sont en nombre suffisant pour qu'elles soient réparties dans le volume observé, mais aussi suffisamment faible pour qu'en général, une sonde au plus soit présente dans un voxel.
Les sondes sont dans un milieu tel qu'un liquide, un gaz ou un gel. Ce milieu doit être transparent aux longueurs d'onde d'observation. Ces sondes 9 sont de préférence des billes métalliques, avantageusement en or ou en argent.
Elles sont animées d'un mouvement brownien tout en étant contenues à l'intérieur d'un volume 10.
La source de lumière 5 est avantageusement une source large impulsionnelle. La largeur ou la longueur de cohérence de la source détermine, entre autres, la résolution en profondeur. Une source impulsionnelle permet de figer le mouvement éventuel des sondes 9.
Le dispositif permet ainsi d'acquérir, à un instant donné, la position de chacune des sondes à l'intérieur de l'échantillon. En effet, l'image reçue par le capteur bidimensionnel 6, de préférence une caméra CCD (Charge Coupled Device) ou CMOS, fournit pour chaque sonde une image dont le positionnement dans le plan xy du capteur 6 est représenté sur les figures 3, 3B et 3C. A ce jour, des détecteurs ayant 1000 x 1000 pixels sont courants. La figure 3 représente les images de chacune des sondes par rapport au contour 10 de l'échantillon, la figure 3B est une représentation agrandie de l'une de ces images dont la position centrale est obtenue par traitement et ensuite positionnée dans le plan xy tel que représenté sur la figure 3C.
La définition obtenue dans le plan xy dépend de la définition du capteur 6 et du traitement numérique effectué par l'unité de traitement 11 pour obtenir la position centrale de chacune des sondes. Le positionnement en profondeur est obtenu par les techniques interférométnques et représenté sur la figure 2. Le champ de mesure en profondeur est déterminé par la longueur de cohérence de la lumière 5 qui est avantageusement faible. Cette profondeur de champ est elle-même divisible par analyse de la phase, chacune des sondes 9 produisant une image de couleur différente selon sa position à l'intérieur du champ. Par ailleurs, il est possible de faire varier les positions relatives de l'échantillon et du miroir de référence, modifiant ainsi la position du champ, en profondeur, à l'intérieur de l'échantillon. II est donc ainsi possible d'obtenir à chaque instant la visualisation tridimensionnelle des sondes à l'intérieur de l'échantillon. Le cumul de ces informations variant en raison du mouvement brownien auquel sont soumises les sondes, permet d'obtenir par l'unité de traitement, le contour 10 tridimensionnel de l'échantillon. La profondeur de champ est classiquement de l'ordre de 1 micron et l'on obtient, par analyse de la phase, une localisation des sondes dans l'espace avec une résolution de l'ordre d'une dizaine de nanomètres dans chacune des directions. De manière analogue, l'échantillonnage des taches de diffraction permet le repérage de leurs centres, caractéristiques des positions des sondes avec une précision améliorée. Les techniques interférométnques mises en jeu permettent la visualisation de sondes de quelques dizaines de nanomètres de diamètre qui présentent l'équivalent d'un coefficient de réflexion d'environ 10"5 pour les longueurs d'onde visibles.
Différents types d' interféromètre pourront être utilisés alors que la description faite plus haut met en œuvre un interféromètre de Michelson, il est également possible d'utiliser un interféromètre de Linnik ou un interféromètre de Mirau.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel dans lequel l'échantillon (1) est visualisé au travers d'un interféromètre (2), caractérisé en ce que des sondes locales (9) de dimensions nanométriques sont introduites dans l'échantillon (1).
2. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes locales (9) sont des billes.
3. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les sondes locales (9) sont métalliques.
4. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'interféromètre (2) est un interféromètre de Michelson.
5. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'interféromètre (2) est un interféromètre de Linnik.
6. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'interféromètre (2) est un interféromètre de Mirau.
7. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'interféromètre (2) comporte une source à spectre large (5).
8. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon la revendication 7, caractérisé en ce que la source (5) délivre des impulsions lumineuses brèves.
9. Procédé de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que des moyens optiques forment l'image d'une mince tranche de l'objet sur un détecteur matriciel (6) au travers de l'interféromètre (2).
10. Dispositif de visualisation microscopique d'un objet tridimensionnel comportant :
- un interféromètre (2),
- une source à spectre large (5), - un capteur matriciel (6), - des moyens de formation de l'image d'une mince tranche de l'objet sur le capteur (6) au travers de l'interféromètre (2),
- une unité de traitement de l'image produite par le capteur matriciel (6), caractérisé en ce qu'il comporte des moyens d'introduction de sondes locales (9) dans l'échantillon.
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