WO2003055862A1 - Method for the chromatographic isolation of ectoine - Google Patents

Method for the chromatographic isolation of ectoine Download PDF

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WO2003055862A1
WO2003055862A1 PCT/EP2002/012512 EP0212512W WO03055862A1 WO 2003055862 A1 WO2003055862 A1 WO 2003055862A1 EP 0212512 W EP0212512 W EP 0212512W WO 03055862 A1 WO03055862 A1 WO 03055862A1
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column
ectoin
ectoine
hydroxyectoin
usually
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PCT/EP2002/012512
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Inventor
Klaus FÜLBERTH
Harald Müssig
Bernd Wesp
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/06—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member

Definitions

  • the present invention relates to a chromatographic process for separating ectoin from a mixture containing ectoin and hydroxyectoin.
  • ectoin When ectoin is obtained as a natural product from cells by biotechnical processes, as described, for example, in EP-A-0 677 044, DE-A-19925615, EP-A-0 999 277, DE-A-4427617 or T. Sauer et al. GIT FACHZ. Lab. 10/95, the desired product, ectoin, is usually obtained together with by-products, especially hydroxyectoin. It is therefore necessary to separate ectoin not only from contamination by cell material, but also from other cell substances that are also obtained from these cells. Unwanted cell material is usually first removed by filtration. For the separation of the ectoin / hydroxyectoin mixture there are HPLC methods, but also extraction methods.
  • This object is achieved by a process for the chromatographic separation of ectoin from a mixture containing ectoin and hydroxyectoin, characterized in that the separation is carried out using an ion exchange column which has a ratio of diameter to height of 1: 8 to 1:20.
  • the mixture to be purified, containing ectoin and hydroxyectoin, is usually filtered before the process according to the invention is carried out in order to rule out the presence of possible cell components which occur in biotechnical processes.
  • Any column which has the dimensions mentioned above is suitable as a chromatography column.
  • the material from which this column is made is not critical. Metal, plastic or glass is usually used as the material.
  • the chromatographic column is packed with an ion exchange material. It is usually a cation exchange resin. A strong acid cation exchange resin is particularly preferred.
  • the resin preferably has a small and uniform particle size. The average particle size is 450 to 700 ⁇ m, more preferably 500 to 650 ⁇ m.
  • Examples of the ion exchange resin include DOWEX MARATHON C,
  • DOWEX HCR S DOWEX 50 WX 8-100, AMBERLITE IR 122, FRACTOGEL EMD SE,
  • the process according to the invention is preferably carried out without pressure, in contrast to conventional HPLC columns in which pressure is used.
  • pressure in contrast to conventional HPLC columns in which pressure is used.
  • the slim column used with the pressure-free This way of working clogging is avoided and at the same time an excellent separation of ectoin is obtained.
  • the ion exchange resin is usually in a loosely washed-in state.
  • the ion exchange column used has a ratio of diameter to height of 1: 8 to 1:20, preferably 1: 9 to 1:15, more preferably 1: 9 to 1:12, most preferably 1:10.
  • the column usually has a diameter of 20 to 60 cm and a height of 160 to 500 cm. Columns in which the diameter is 25 to 40 cm and the height is 200 to 450 cm are particularly preferred.
  • the column particularly preferably has a diameter of 30 cm and a height of 300 cm.
  • the term “height” means the filling height of the column. The column itself can of course be much higher than the fill level.
  • the column is packed with the ion exchange resin.
  • the ion exchange resin is usually slurried in an aqueous solution and this slurry is filled into the column.
  • the aqueous solution is usually a weak salt solution.
  • This salt solution preferably contains sodium, potassium or magnesium ions as cations.
  • a sodium chloride solution, potassium chloride solution or magnesium chloride solution is preferred, and a sodium chloride solution is particularly preferred.
  • This solution is preferably 0.1 to 2 M, more preferably 0.5 to 1.5 M, most preferably 1 M.
  • the column is then washed. This is preferably done until the conductivity drops to ⁇ 100 ⁇ S. Water, especially demineralized water, is suitable for washing the column.
  • the column is then loaded with the ectoin solution.
  • the ectoin solution usually has a pH of 1.0 to 2.5, preferably 1.5 to 2.0. It is preferred that the flow rate when loading the column with the ectoin solution is 200 to 800 l / h, preferably 400 to 600 l / h, more preferably 500 l / h.
  • the column After loading the column with the crude octoin solution to be separated and purified, which also contains hydroxyectoin in addition to ectoin, the column is washed from below with water, preferably demineralized water.
  • the amount of water is preferably 500-1000 l / h, preferably 700 l / h. This washing step elutes Hydroxyectoin, while Ectoin remains bound and thus the purification is achieved.
  • the product can then be eluted.
  • Weakly basic solutions are suitable as eluents, for example aqueous solutions of sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution or an aqueous ammonical solution.
  • the weakly basic solution is usually 0.01 to 0.5 M, preferably 0.05 to 0.25 M, particularly preferably 0.08 to 0.2 M.
  • Elution with weakly basic solutions preferably sodium hydroxide solution, removes the ectoin and possibly the remaining hydroxyectoin evenly from the gel.
  • the residual amount of hydroxyectoin, if any, is usually ⁇ 4%, more preferably ⁇ 1%.
  • the elution rate depends on the height of the column and the ion exchange resin. Usual speeds are in the range of 500 to 1000 l / h, preferably 600 to 900 l / h, more preferably 700 to 800 l / h.
  • the elution can be carried out in several fractions.
  • the elution is usually monitored by known detection methods. This is preferably done by means of UV detection and / or monitoring of the pH.
  • ectoine is obtained with a UV signal of 210 to 230 nm, preferably 220 nm.
  • the fractions can be divided so that they contain the product which was eluted at different pH values.
  • a first fraction may contain eluted material up to a pH of 7 and a second fraction may contain the eluted material at a pH greater than 7.
  • the column is usually washed. It is common for the column to have a conductivity of ⁇ 100 ⁇ S after washing. Water is suitable for washing, especially demineralized water.
  • the column was loaded with an ectoin solution to be purified, containing ectoin and hydroxyectoin, at 500 l / h from below.
  • the solution had a pH of 1.5 to 2.0.
  • the product was then eluted from below with 0.1 N NaOH at 750 l / h. The following fractions were collected:
  • Ectoin was predominantly in the first fraction and to a lesser extent in the second fraction in a ratio of 4: 1.

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

The invention relates to a method for the chromatographic isolation of ectoine from a mixture containing ectoine and hydroxyectoine. The method is characterised in that the isolation takes place using an ion exchanger column, whose diameter-to-height ratio is between 1: 8 and 1: 20. Said method permits an excellent isolation of ectoine, without the accumulation of undesirable impurities and with significant amounts of hydroxyectoine.

Description

Verfahren zur chomatographischen Trennung von Ectoin Process for the chromatographic separation of ectoin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein chromatographisches Verfahren zur Trennung von Ectoin aus einem Gemisch, enthaltend Ectoin und Hydroxyectoin.The present invention relates to a chromatographic process for separating ectoin from a mixture containing ectoin and hydroxyectoin.
Bei der Gewinnung von Ectoin als Naturstoff aus Zellen durch biotechnische Verfahren, wie sie beispielsweise in der EP-A-0 677 044, DE-A-19925615, EP-A-0 999 277, DE-A-4427617 oder T. Sauer et al. GIT FACHZ. Lab. 10/95 beschrieben werden, fällt das gewünschte Produkt, Ectoin, üblicherweise zusammen mit Nebenprodukten, insbesondere Hydroxyectoin, an. Es ist daher notwendig, Ectoin nicht nur von Verunreinigungen durch Zellmaterial, sondern auch von anderen Zellinhaltsstoffen zu trennen, die ebenfalls aus diesen Zellen gewonnen werden. Ungewünschtes Zellmaterial wird zuerst üblicherweise durch Filtration entfernt. Zur Auftrennung des Ectoin/Hydroxyectoin-Ge- misches bieten sich HPLC-Verfahren, aber auch Extraktionsverfahren an.When ectoin is obtained as a natural product from cells by biotechnical processes, as described, for example, in EP-A-0 677 044, DE-A-19925615, EP-A-0 999 277, DE-A-4427617 or T. Sauer et al. GIT FACHZ. Lab. 10/95, the desired product, ectoin, is usually obtained together with by-products, especially hydroxyectoin. It is therefore necessary to separate ectoin not only from contamination by cell material, but also from other cell substances that are also obtained from these cells. Unwanted cell material is usually first removed by filtration. For the separation of the ectoin / hydroxyectoin mixture there are HPLC methods, but also extraction methods.
Bei der Anwendung von Chromatographiesäulen zur Reinigung im kleinen Maßstab wurden bisher üblicherweise Säulen mit einem relativ großen Durchmesser (ca. 40 cm bis 60 cm) und einer geringen Füllhöhe (ca. 20 cm bis 40 cm) eingesetzt. Darüber hinaus wurde bei derartig kleinen Säulen üblicherweise mit Niederdruck gearbeitet.When using chromatography columns for purification on a small scale, columns with a relatively large diameter (approx. 40 cm to 60 cm) and a low filling height (approx. 20 cm to 40 cm) have usually been used. In addition, such small columns were usually operated with low pressure.
T. Sauer et al. beschreibt in Biotechnology and Bioengineering, Vol. 57, 3, 1998 zwar den Einsatz einer 2,8 x 18 cm großen Kationenaustauschersäule, um Ectoine zu eluie- ren. Wie jedoch dieser Veröffentlichung zu entnehmen ist, erfolgt an dieser Säule keine Trennung von Ectoin und Hydroxyectoin. Dies geschieht in einem nachfolgenden Schritt, wobei die unterschiedlichen Löslichkeitseigenschaften von Ectoin und Hydroxyectoin ausgenutzt werden. Dabei wird das Ectoin/Hydroxyectoin-Gemisch in Methanol gelöst, danach wird Methanol vorsichtig abgedampft und gleichzeitig Hydroxyectoin ausgefällt und abgetrennt.T. Sauer et al. in Biotechnology and Bioengineering, Vol. 57, 3, 1998 describes the use of a 2.8 x 18 cm cation exchange column to elute ectoine. However, as can be seen from this publication, no separation of ectoin and hydroxyectoin. This takes place in a subsequent step, whereby the different solubility properties of ectoin and hydroxyectoin are used. The ectoin / hydroxyectoin mixture is dissolved in methanol, then methanol is carefully evaporated and at the same time hydroxyectoin is precipitated and separated off.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Trennung von Ectoin bereitzustellen, das auch eine gute Wirksamkeit aufweist, wenn das Trennverfahren im großen Maßstab durchgeführt wird. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur chromatographischen Trennung von Ectoin aus einem Gemisch, enthaltend Ectoin und Hydroxyectoin, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung mit einer lonenaustauschersäule durchgeführt wird, die ein Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 8 bis 1 : 20 besitzt.It is therefore the object of the present invention to provide an improved process for the separation of ectoine which also has a good effectiveness when the separation process is carried out on a large scale. This object is achieved by a process for the chromatographic separation of ectoin from a mixture containing ectoin and hydroxyectoin, characterized in that the separation is carried out using an ion exchange column which has a ratio of diameter to height of 1: 8 to 1:20.
Es wurde überraschend gefunden, dass durch den Einsatz von derartig schlanken lo- nenaustauschersäulen eine ausgezeichnete Trennung von Ectoin erfolgt und das Endprodukt keine unerwünschte Verunreinigung mit erheblichen Mengen an Hydroxyectoin enthält. Weiterhin zeigte sich, dass eine derartig Säule insbesondere im großen Maßstab, d.h. größer als Labormaßstab, eine gute Trennung von Ectoin bei gleichzeitigem einfachen Aufbau und geringem analytischen Aufwand gewährleistet.It was surprisingly found that the use of such slim ion exchange columns results in excellent separation of ectoin and that the end product does not contain any undesired contamination with considerable amounts of hydroxyectoin. Furthermore, it was found that such a column, in particular on a large scale, i.e. larger than laboratory scale, a good separation of ectoin with a simple structure and low analytical effort is guaranteed.
Das zu reinigende Gemisch, enthaltend Ectoin und Hydroxyectoin, wird üblicherweise vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gefiltert, um ein Vorhandensein von möglichen Zellbestandteilen, die bei biotechnischen Verfahren anfallen, auszuschließen.The mixture to be purified, containing ectoin and hydroxyectoin, is usually filtered before the process according to the invention is carried out in order to rule out the presence of possible cell components which occur in biotechnical processes.
Als Chromatographie-Säule eignet sich jede Säule, die die vorstehend genannten Ausmaße besitzt. Das Material, aus dem diese Säule hergestellt wird, ist nicht kritisch. Üblicherweise wird als Material Metall, Kunststoff oder Glas eingesetzt.Any column which has the dimensions mentioned above is suitable as a chromatography column. The material from which this column is made is not critical. Metal, plastic or glass is usually used as the material.
Die chromatographische Säule wird mit einem lonenaustauschermaterial gepackt. Dabei handelt es sich üblicherweise um ein Kationenaustauscherharz. Besonders bevorzugt ist ein starkes Säurekationenaustauscherharz. Das Harz hat vorzugsweise eine geringe und gleichmäßige Partikelgröße. Die mittlere Partikelgröße beträgt 450 bis 700 μm, noch bevorzugter 500 bis 650 μm.The chromatographic column is packed with an ion exchange material. It is usually a cation exchange resin. A strong acid cation exchange resin is particularly preferred. The resin preferably has a small and uniform particle size. The average particle size is 450 to 700 μm, more preferably 500 to 650 μm.
Beispiele des lonenaustauscherharzes beinhalten DOWEX MARATHON C,Examples of the ion exchange resin include DOWEX MARATHON C,
DOWEX HCR S, DOWEX 50 WX 8-100, AMBERLITE IR 122, FRACTOGEL EMD SE,DOWEX HCR S, DOWEX 50 WX 8-100, AMBERLITE IR 122, FRACTOGEL EMD SE,
HICAP (M). Bevorzugt ist DOWEX MARATHON C.HICAP (M). DOWEX MARATHON C is preferred.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise drucklos durchgeführt, im Gegensatz zu üblichen HPLC-Säulen, bei denen mit Druck gearbeitet wird. Es zeigte sich in diesem Zusammenhang, dass bei der eingesetzten schlanken Säule durch die drucklo- se Arbeitsweise Verstopfungen vermieden werden und gleichzeitig eine ausgezeichnete Trennung von Ectoin erhalten wird. Bei dieser drucklosen Säule befindet sich das lonenaustauscherharz üblicherweise in einem locker eingeschwemmten Zustand.The process according to the invention is preferably carried out without pressure, in contrast to conventional HPLC columns in which pressure is used. In this context, it was shown that the slim column used with the pressure-free This way of working clogging is avoided and at the same time an excellent separation of ectoin is obtained. In this pressureless column, the ion exchange resin is usually in a loosely washed-in state.
Die eingesetzte lonenaustauschersäule besitzt ein Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 8 bis 1 : 20, vorzugsweise 1 : 9 bis 1 : 15, noch bevorzugter 1 : 9 bis 1 : 12, am meisten bevorzugt 1 : 10.The ion exchange column used has a ratio of diameter to height of 1: 8 to 1:20, preferably 1: 9 to 1:15, more preferably 1: 9 to 1:12, most preferably 1:10.
In der Praxis bedeutet dies, dass die Säule üblicherweise einen Durchmesser von 20 bis 60 cm und eine Höhe von 160 bis 500 cm besitzt. Besonders bevorzugt sind Säulen, bei denen der Durchmesser 25 bis 40 cm und die Höhe 200 bis 450 cm beträgt. Besonders bevorzugt besitzt die Säule einen Durchmesser von 30 cm und eine Höhe von 300 cm. Der Begriff "Höhe" bedeutet in diesem Zusammenhang Füllhöhe der Säule. Die Säule selbst kann selbstverständlich weitaus höher als die Füllhöhe sein.In practice, this means that the column usually has a diameter of 20 to 60 cm and a height of 160 to 500 cm. Columns in which the diameter is 25 to 40 cm and the height is 200 to 450 cm are particularly preferred. The column particularly preferably has a diameter of 30 cm and a height of 300 cm. In this context, the term “height” means the filling height of the column. The column itself can of course be much higher than the fill level.
Im Folgenden wird die Durchführung des eriϊndungsgemäßen Verfahrens näher erläutert.The implementation of the method according to the invention is explained in more detail below.
Die Säule wird mit dem lonenaustauscherharz gepackt. Dazu wird das lonenaustauscherharz üblicherweise in einer wässrigen Lösung angeschlämmt und diese Auf- schlämmung in die Säule gefüllt. Die wässrige Lösung ist üblicherweise eine schwache Salzlösung. Diese Salzlösung enthält vorzugsweise als Kationen Natrium-, Kalium oder Magnesiumionen. Bevorzugt ist eine Natriumchloridlösung, Kaliumchloridlösung oder Magnesiumchloridlösung, besonders bevorzugt ist eine Natriumchloridlösung. Diese Lösung ist vorzugsweise 0,1 bis 2 M, noch bevorzugter 0,5 bis 1 ,5 M am bevorzugtesten 1 M.The column is packed with the ion exchange resin. For this purpose, the ion exchange resin is usually slurried in an aqueous solution and this slurry is filled into the column. The aqueous solution is usually a weak salt solution. This salt solution preferably contains sodium, potassium or magnesium ions as cations. A sodium chloride solution, potassium chloride solution or magnesium chloride solution is preferred, and a sodium chloride solution is particularly preferred. This solution is preferably 0.1 to 2 M, more preferably 0.5 to 1.5 M, most preferably 1 M.
Danach wird die Säule gewaschen. Dies geschieht vorzugsweise so lange, bis die Leitfähigkeit auf < 100 μS absinkt. Zum Waschen der Säule eignet sich Wasser, insbesondere VE-Wasser.The column is then washed. This is preferably done until the conductivity drops to <100 μS. Water, especially demineralized water, is suitable for washing the column.
Danach wird die Säule mit der Ectoinlösung beladen. Die Ectoinlösung besitzt üblicherweise einen pH-Wert von 1 ,0 bis 2,5, vorzugsweise 1 ,5 bis 2,0. Es ist bevorzugt, dass die Durchflussgeschwindigkeit beim Beladen der Säule mit der Ectoinlösung 200 bis 800 l/h beträgt, vorzugsweise 400 bis 600 l/h, noch bevorzugter 500 l/h.The column is then loaded with the ectoin solution. The ectoin solution usually has a pH of 1.0 to 2.5, preferably 1.5 to 2.0. It is preferred that the flow rate when loading the column with the ectoin solution is 200 to 800 l / h, preferably 400 to 600 l / h, more preferably 500 l / h.
Nach dem Beladen der Säule mit der zu trennenden und aufzureinigenden Rohectoinlö- sung, die neben Ectoin auch Hydroxyectoin enthält, wird die Säule von unten mit Wasser, vorzugsweise VE-Wasser gewaschen. Die Menge an Wasser beträgt vorzugsweise 500 - 1000 l/h, vorzugsweise 700 l/h. Durch diesen Waschschritt wird Hydroxyectoin eluiert, während Ectoin gebunden bleibt und damit die Aufreinigung erreicht wird.After loading the column with the crude octoin solution to be separated and purified, which also contains hydroxyectoin in addition to ectoin, the column is washed from below with water, preferably demineralized water. The amount of water is preferably 500-1000 l / h, preferably 700 l / h. This washing step elutes Hydroxyectoin, while Ectoin remains bound and thus the purification is achieved.
Danach kann das Produkt eluiert werden. Als Elutionsmittel eignen sich schwach basische Lösungen, beispielsweise wässrige Lösungen von Natronlauge, Kalilauge oder eine wässrige ammonikalische Lösung. Die schwach basische Lösung ist üblicherweise 0,01 bis 0,5 M, vorzugsweise 0,05 bis 0,25 M, besonders bevorzugt 0,08 bis 0,2 M.The product can then be eluted. Weakly basic solutions are suitable as eluents, for example aqueous solutions of sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution or an aqueous ammonical solution. The weakly basic solution is usually 0.01 to 0.5 M, preferably 0.05 to 0.25 M, particularly preferably 0.08 to 0.2 M.
Durch die Elution mit schwach basischen Lösungen, vorzugsweise Natronlauge, werden Ectoin und gegebenenfalls das noch verbliebene Hydroxyectoin gleichmäßig vom Gel gelöst. Die Restmenge an Hydroxyectoin, falls überhaupt vorhanden, beträgt üblicherweise < 4%, noch bevorzugter < 1%.Elution with weakly basic solutions, preferably sodium hydroxide solution, removes the ectoin and possibly the remaining hydroxyectoin evenly from the gel. The residual amount of hydroxyectoin, if any, is usually <4%, more preferably <1%.
Die Elutionsgeschwindigkeit ist abhängig von der Höhe der Säule und dem lonenaustauscherharz. Übliche Geschwindigkeiten liegen im Bereich von 500 bis 1000 l/h, vorzugsweise 600 bis 900 l/h, noch bevorzugter 700 bis 800 l/h.The elution rate depends on the height of the column and the ion exchange resin. Usual speeds are in the range of 500 to 1000 l / h, preferably 600 to 900 l / h, more preferably 700 to 800 l / h.
Die Elution kann in mehreren Fraktionen erfolgen. Üblicherweise wird die Elution durch bekannte Detektionsverfahren überwacht. Vorzugsweise geschieht dies mittels UV- Detektion und/oder der Überwachung des pH-Werts.The elution can be carried out in several fractions. The elution is usually monitored by known detection methods. This is preferably done by means of UV detection and / or monitoring of the pH.
Es ist insbesondere bevorzugt, dass Ectoin bei einem UV-Signal von 210 bis 230 nm, vorzugsweise 220 nm, gewonnen wird. Weiterhin können die Fraktionen so aufgeteilt werden, dass sie das Produkt, das bei unterschiedlichen pH-Werten eluiert wurde, enthalten. Beispielsweise kann eine erste Fraktion eluiertes Material bis zu einem pH-Wert von 7 enthalten und eine zweite Fraktion das eluierte Material bei einem pH-Wert von größer als 7 enthalten. Nach erfolgter Trennung wird die Säule üblicherweise gewaschen. Dabei ist es üblich, dass die Säule nach dem Waschen eine Leitfähigkeit von < 100 μS besitzt. Zum Waschen eignet sich Wasser, insbesondere VE-Wasser.It is particularly preferred that ectoine is obtained with a UV signal of 210 to 230 nm, preferably 220 nm. Furthermore, the fractions can be divided so that they contain the product which was eluted at different pH values. For example, a first fraction may contain eluted material up to a pH of 7 and a second fraction may contain the eluted material at a pH greater than 7. After separation, the column is usually washed. It is common for the column to have a conductivity of <100 μS after washing. Water is suitable for washing, especially demineralized water.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.The following example illustrates the invention.
Beispiel 1example 1
Eine Säule mit einem Durchmesser von 35 mm und einer Füllhöhe von 300 cm wurde mit einer Aufschlämmung von ca. 250 I DOWEX MARATHON C in 1 N NaCI-Lösung gefüllt. Danach wurde die Säule mit VE-Wasser gewaschen, bis eine Leitfähigkeit vonA column with a diameter of 35 mm and a filling height of 300 cm was filled with a slurry of approx. 250 I DOWEX MARATHON C in 1 N NaCI solution. The column was then washed with deionized water until a conductivity of
< 100 μS erhalten wurde.<100 μS was obtained.
Die Säule wurde mit einer zu reinigenden Ectoinlösung, enthalten Ectoin und Hydroxyectoin, mit 500 l/h von unten beladen.The column was loaded with an ectoin solution to be purified, containing ectoin and hydroxyectoin, at 500 l / h from below.
Anschließend wurde die Säule mit 300 I VE-Wasser/Std. 6 Stunden lang gewaschen. In diesem Schritt kommt es zu der gewünschten Abreicherung von Hydroxyectoin bisThe column was then washed with 300 l of demineralized water / hour. Washed for 6 hours. In this step, the desired depletion of hydroxyectoin occurs
< 4%, bezogen auf das Ectoin. Ectoin bleibt auf der Säule gebunden.<4%, based on the ectoin. Ectoin remains bound on the pillar.
Die Lösung wies einen pH-Wert von 1 ,5 bis 2,0 auf. Danach wurde das Produkt mit 0,1 N NaOH mit 750 l/h von unten eluiert. Die folgenden Fraktionen wurden gesammelt:The solution had a pH of 1.5 to 2.0. The product was then eluted from below with 0.1 N NaOH at 750 l / h. The following fractions were collected:
- Vorlauf bis UV-Signal auf 220 nm ansteigt;- advance until the UV signal rises to 220 nm;
- Fraktion I bis der pH-Wert auf 7 ansteigt bei einem UV-Signal von 220 nm;- Fraction I until the pH rises to 7 with a UV signal of 220 nm;
- Fraktion II bei einem pH-Wert von > 7 bis Ende des UV-Signals von 220 nm.- Fraction II at a pH of> 7 until the end of the UV signal of 220 nm.
Nachdem das Produkt erhalten wurde, wurde die Säule mit VE-Wasser gewaschen, bis eine Leitfähigkeit von < 100 μS erhalten wurde.After the product was obtained, the column was washed with demineralized water until a conductivity of <100 μS was obtained.
Ectoin befand sich überwiegend in der ersten Fraktion und zu einem geringeren Teil in der zweiten Fraktion im Verhältnis von 4:1. Ectoin was predominantly in the first fraction and to a lesser extent in the second fraction in a ratio of 4: 1.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur chromatographischen Trennung von Ectoin aus einem Gemisch, enthaltend Ectoin und Hydroxyectoin, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung mit einer lonenaustauschersäule durchgeführt wird, die ein Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 8 bis 1 : 20 besitzt.1. A method for the chromatographic separation of ectoin from a mixture containing ectoin and hydroxyectoin, characterized in that the separation is carried out with an ion exchange column which has a ratio of diameter to height of 1: 8 to 1:20.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass drucklos gearbeitet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that one works without pressure.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1 : 9 bis 1 : 15 beträgt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the ratio of diameter to height is from 1: 9 to 1:15.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kationenaustauscherharz eingesetzt wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that a cation exchange resin is used.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule einen Durchmesser von 20 bis 60 cm und eine Höhe von 160 bis 500 cm besitzt. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the column has a diameter of 20 to 60 cm and a height of 160 to 500 cm.
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