WO2003018742A2 - Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora - Google Patents

Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora Download PDF

Info

Publication number
WO2003018742A2
WO2003018742A2 PCT/RU2002/000405 RU0200405W WO03018742A2 WO 2003018742 A2 WO2003018742 A2 WO 2003018742A2 RU 0200405 W RU0200405 W RU 0200405W WO 03018742 A2 WO03018742 A2 WO 03018742A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
aηά
recombinant
asparaginase
investigation
Prior art date
Application number
PCT/RU2002/000405
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Other versions
WO2003018742A3 (en
Inventor
Mikhail Anatolevich Eldarov
Aleksandr Aleksandrovich Zhgun
Yury Viktorovich Gervaziev
Svetlana Serebedzhanovna Aleksandrova
Vladimir Georgievich Bogush
Konstantin Vasilevich Sidoruk
Elena Vasilevna Sveshnikova
Anna Arkadevna Borisova
Natalya Mikhailovna Omelnyuk
Aleksandr Ivanovich Archakov
Konstantin Georgievich Skryabin
Nikolai Nikolaevich Sokolov
Original Assignee
Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchno-Issledovatelsky Institut Biomeditsinskoy Khimii Im. Orekhovicha Rossiiskoy Akademii Meditsinskikh Nauk
Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Tsentr 'bioinzheneriya' Rossiiskoy Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from RU2001123442/13A external-priority patent/RU2221868C2/en
Priority claimed from RU2002108505/13A external-priority patent/RU2224797C2/en
Application filed by Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchno-Issledovatelsky Institut Biomeditsinskoy Khimii Im. Orekhovicha Rossiiskoy Akademii Meditsinskikh Nauk, Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Tsentr 'bioinzheneriya' Rossiiskoy Akademii Nauk filed Critical Gosudarstvennoe Uchrezhdenie Nauchno-Issledovatelsky Institut Biomeditsinskoy Khimii Im. Orekhovicha Rossiiskoy Akademii Meditsinskikh Nauk
Priority to AU2002332371A priority Critical patent/AU2002332371A1/en
Publication of WO2003018742A2 publication Critical patent/WO2003018742A2/en
Publication of WO2003018742A3 publication Critical patent/WO2003018742A3/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • Le ⁇ a ⁇ s ⁇ vennye ⁇ my ba ⁇ e ⁇ ialny ⁇ L-as ⁇ a ⁇ aginaz on ⁇ yazhenie desya ⁇ ile ⁇ y shi ⁇ is ⁇ lzuyu ⁇ sya in ⁇ n ⁇ l ⁇ giches ⁇ y ⁇ a ⁇ i ⁇ e for treating ⁇ s ⁇ y ⁇ lim ⁇ blas ⁇ ny ⁇ ley ⁇ z ⁇ v, and lim ⁇ - ⁇ e ⁇ i ⁇ ul ⁇ sa ⁇ m chel ⁇ ve ⁇ a ( ⁇ g ⁇ zyu ⁇ D.S,] ⁇ . [1985].
  • a solvable invention is the production of microscopic activity with high specific activity and lowered glutalin relevance. The problem was solved by
  • Example 1 Identification of the Strain ⁇ mm ⁇ g ⁇ . industrial L-asparaginase with high asparticase and low glutaminase activity
  • P ⁇ ayme ⁇ y is ⁇ lz ⁇ vali in PTS ⁇ with ⁇ b ⁇ azts ⁇ m gen ⁇ mn ⁇ y D ⁇ isolated from sh ⁇ amma ⁇ g ⁇ g ⁇ g ⁇ s ⁇ g ⁇ g ⁇ ⁇ a 204.
  • the volume of the reaction mixture was 50 ⁇ l of a single PCB buffer for--polimerase ( ⁇ vit iser sait »» »)»)), the percentage of the concentration was 0.5 m, the percentage was 0.5 ⁇ After amplification in 5 ⁇ l of the sample by the elec- tric elec- trophoresis in 1% agar gel, the homogeneous homogenous reaction of the particle size 300 was identified.
  • the volume of the reactive mixture was. 50 ⁇ l of a single PCB buffer for a mixture of ⁇ ⁇ and ⁇ polymer, a concentration of ⁇ - 0.4 m ⁇ , a concentration of ⁇ - - - 1 ⁇ m, a percentage of D ⁇ - 20 ng / PCRs were operated under the following conditions - heating - 2 min, 94 °, then 25 cycles of amplification - 94 °, 40 "; 50 °, 40"; 68 °, 5 '.
  • the samples obtained on the basis of the sample and the ⁇ method of electrolysis in 1% agar gel were used to identify fragments of sizes 1200 and 5000 bp, respectively. Samples were isolated from the gel (Example 2) and partitioned by nucleotide sequencing by automatically sequencing for a total of 207 seconds. The installed complete investigation has been carried out in the liver before issue 8 ⁇ , GO ⁇ 07.
  • Is ⁇ lz ⁇ vannye ⁇ ayme ⁇ y ⁇ g ⁇ anichivayu ⁇ ⁇ agmen ⁇ gene ⁇ S ⁇ - ⁇ . ⁇ 8, v ⁇ lyuchayuschy initsia ⁇ ny ⁇ d ⁇ n ⁇ anslyatsii ⁇ , ⁇ as ⁇ l ⁇ zhenny in ⁇ l ⁇ zhenii 48 ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ i 8 ⁇ , GO ⁇ 07 and ⁇ e ⁇ mina ⁇ ny ⁇ d ⁇ n ⁇ , ⁇ as ⁇ l ⁇ zhenny in ⁇ l ⁇ zhenii 1093 ⁇ y ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ i same.
  • a specific full-sized amplification product includes a complete transducer investigation of the SCC gene.
  • the following amplification conditions were used: initial denaturation - 94 °, 60 ", then 30 cycles of amplification - 94 °, 40"; 50 °, 40 "; 72 °, 90".
  • the reaction mixture was separated by 1% agar gel and the reaction product was detected - a single reaction element of 1100 p.p.
  • the substance was isolated from the gel and removed in vectrum ⁇ - ⁇ (" ⁇ beau ⁇ ", ⁇ ), as described in Example 2. From the obtained individual tips 11 plants isolated the standard method and analyzed it by means of hydrolysis of the organic process and separation of the products of the business unit in 1%.
  • EXAMPLE 4 Expression of the ⁇ - ⁇ 8 gene in the cells of the Russian Academy of Sciences through the control panel.
  • the plasmid was disassembled together with W + W, removed from the agar gel with a fragment of 2560 ⁇ .n. Two fragments of the league were removed, they took away the risks of strain ⁇ 9, stable at the same time, ampicillin and canamycin.
  • plasmid D was isolated, hydrolyzed by its natural product and detected the presence of hydrolysis products of size 3 T.p.n. and 2.5 ⁇ . ⁇ .n.
  • the physical and genetic pathway of the obtained such plasmid species is shown in Fig. 1.
  • a sulphate-ammonia fraction (22.5 ml) was applied to a ring with a safe ⁇ -25 (5 x 45 cm);
  • the speed of application of the buffer when applying and gel filtration is 400 ml / hour.
  • L-paraphaginase is eluted from the S-phase in the range of ⁇ C ⁇ concentration of 0.45 to 0.5 ⁇ . They received about 225 000 100 activity of the enzyme in 100-120 ml of buffer with an output of .75.6% (Table 3).
  • the combined active fractions suppressed the ultrafiltration by pressure on the system “Millipore” (US) with the use of an ultrafiltration membrane for 30 000 days.
  • composition of a recombinant L-aspartase ⁇ g. with ⁇ in the aforementioned above makes up about 95%, and a small.
  • the mass of the subunit of the fragment was about 36 kDa, which follows from the analysis of the preparation by the gel method of the elec- troelectomy in DDS-PG (Fig. 2).
  • the ⁇ C ⁇ - ⁇ 8 gene cures a polypeptide with an amino acid test indicated in the liver of the investigations on July 8 8., which is a result of an accident.
  • Protein samples were dissolved in 30% acetyl, containing 0.1% acid and applied to the membranes of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (USA).
  • the sequencing was performed on the site of the United Kingdom (Germany, model 816), equipped with analysis of the environment (United States, United States)
  • ⁇ - ⁇ has a wide range of ⁇ in the range of ⁇ from 7.5 to 9.0; the mass of the subunit is about 36 kDa.
  • a temperature of optimum (55 ° C) and a high specific activity of the SSC-3 see table 3.
  • the recombinant b-paraphase of ⁇ .cie ⁇ 1969 ⁇ has a very low content of glutamine, compared with the corresponding ⁇ ⁇ ⁇ ............ Skuzh ⁇ ket ierik, the hydropathy of parasitic paralysis is responsible for the many toxic effects of the drug and the pharmaceutical use.
  • the negligible glutaminase activity of the USA can cause the low toxicity of medical preparations of this medicine and their improved pharmaceuticals. 17

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

The invention relates to the secretion of the Okazaki fragment which codes L-asparaginase of the Erwinia caratovora bacterium. Said invention makes it possible to produce a homogenous polypeptide preparation corresponding to the recombinant Erwinia caratovora L- asparaginase secreted by using a bacterial strain-producer.

Description

ΡΕΚΟΜБИΗΑΗΤΗΑЯ Ъ-ΑСΙΙΑΡΑГтϊΑЗΑ ΕΚШΝΙΑ сαгοϊονοгα ΗΑΗΤΗΑ BATTLE B-ΑСΙΙΑΡΑГтϊΑЗΑ ΕΚШΝΙΑ сαгοϊονοгα
Οбласτь τеχниκиArea of technology
Изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи биοχимии, медицины и биοτеχнοлοгии, в часτнοсτи, κ генеτичесκοй инженеρии, и πρедсτавляеτ сοбοй φρагменτ ДΗΚ, κοдиρующий ποлную аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь Ь-асπаρагиназы (Ь- асπаρагинамидοгидροлазы, ΕС 3.5.1.1.) баκτеρии ΕгχνΜα сαШονοгα, и ποлученный πуτем эκсπρессии эτοгο φρагменτа ДΗΚ в баκτеρиальнοм шτамме ρеκοмбинанτный белοκ, сοοτвеτсτвующий Ь-асπаρагиназе Εгχмгтα сαгοϊονοгα, οбладающий высοκοй удельнοй аκτивнοсτью и ποниженным сροдсτвοм κ глуτалину. Изοбρеτение мοжеτ быτь исποльзοванο для ποлучения леκаρсτвенныχ πρеπаρаτοв.Izοbρeτenie οτnοsiτsya K οblasτi biοχimii, medicine and biοτeχnοlοgii in chasτnοsτi, K geneτichesκοy inzheneρii and πρedsτavlyaeτ sοbοy φρagmenτ DΗΚ, κοdiρuyuschy ποlnuyu aminοκislοτnuyu ποsledοvaτelnοsτ L-asπaρaginazy (b- asπaρaginamidοgidροlazy, ΕS 3.5.1.1.) Baκτeρii ΕgχνΜα sαShονοgα and ποluchenny πuτem eκsπρessii eτοgο Fragment D in the bacterial strain is a recombinant protein corresponding to the b-aspaginase Ε hgmgtα with a high specific activity that is important The invention may be used for the manufacture of a medicament.
Пρедшесτвующий уροвень τеχниκиPREVIOUS LEVEL OF TECHNOLOGY
Леκаρсτвенные φορмы баκτеρиальныχ Ь-асπаρагиназ на προτяжение десяτилеτий шиροκο исποльзуюτся в οнκοлοгичесκοй πρаκτиκе для лечения οсτρыχ лимφοбласτныχ лейκοзοв, лимφο- и ρеτиκулοсаρκοм челοвеκа (ΨгϊзюηД.С, ]χ. [1985]. Αзρага°,тазе. Μешοάз Εηζугηοϊ. 113, 608-618); (Сοκοлοв, Η.Щ Занин, Α.Α. и Αлеκсандροва, С.С. [2000]. Баκτеρиальные Ь-асπаρагиназы и глуτамин (асπаρагин)азы: неκοτορые свοйсτва, сτροение и προτивοοπуχοлевая аκτивнοсτь. Βοπρ. мед. Χимии 46 (6), 531-548). Β ποследнее вρемя ποявились сοοбщения οб исποльзοвании Ь-асπаρагиназы для лечения οсτροй миелοмοнοциτаρнοй лейκемии (Τгеϋак.Ν.Μ., ΚиρсЬеηкο,Τ.Ν., ΡοИюνД.Ζ., аηά ΖиЬгуΙз'ка,Τ.Β. [1997]. ΤЬе еШсасу οϊ χχвχщ ρгο1οη§еά-асποη Ь-азρага§ϊηазе ϊη а Ιχеатιеηϊ: ρгο§гат юг асШе ΙутρЬοЫазгϊс Ιеикетϊа ϊη аάиπз. Ιлк. δρгаνа. 81-83.), χροничесκοй лимφοциτаρнοй лейκемии
Figure imgf000003_0001
Κаζο,Ο.Μ., νегЬοезΙ,СΚ.., Τг., Уаη Εз,Τ., Κа&е νкζ.ϋ., Νиссϊ,ΜΧ., νϊаи,Α.Τ., аηά ϋаνϊзДΡ. [1984]. Саηсег тегаρу
Figure imgf000003_0002
сЬеππсаΗу тοάϊиеά еηζутез. I. Αηшитοг ρгορегϋез οι* ροϊуетуϊеηе ёгусοϊ-азρагаёϊηазе сοη]и§а1;ез. Саηсег ΒюсЬет. ΒϊορЬуз. 7, 175-186), меланοсаρκοмы (Τау1οг,С.Ψ., ϋοггД.Τ., ΡаηΙаД, ΗегзЬ,Ε.Μ., аηά δаΙтοηДΕ. [2001]. Α ρЬазе I аηά ρЬагтасοάуηаιшс еνаϊиаϋοη οι- ροϊуетуϊеηе §1усο1- сοη"и§а1;еά Ь-азρага§тазе ϊη ρа еηϊз
Figure imgf000003_0003
аάνаηсеά зοϊϊά ттοгз. Саηсег СЬетοтег. ΡЬагтасοΙ. 47, 83-88), лимφοм, связанныχ сο СПИДοм (Ανгатϊз,ν.Ι.,
Figure imgf000003_0004
ΑνгаππзД.Α., СοЬеη.ЬД., аηά ΙηάегΗеά,С. [2001. 8уηег£Ϊзгϊс аηϊшгаϊ егϊесϊ: οГ- ΡΕΟ- азρага§тазе (ΟΝСΑ8ΡΑΚ),
Figure imgf000003_0005
ΚΤ ".ηЬϊЫюгз а§аϊηзΙ Ηϊν-1 ϊηГесΙеά Τ-сеΙΙз: а тοάеϊ οι* Ηϊν-1-тάисеά Τ-сеΙΙ гутρЬοта. Ιη νϊνο 15, 1-9); (ΟШ,Ρ.8., Ьеνϊηе,Α.Μ., Κгаϋο,Μ., Κаπск,Μ.υ., Ьοигеϊгο,С, ϋеуюη,!,., Μеуег,Ρ., аηά ΚазЬееά,8. [1987]. ΑГО8-ге1аϊеά таΗ§ηаηϊ ΙутρЬοта: гезиϊϊз οГ ρгοзρесϊϊνе ϊгеаϊтеηϊ ϊгϊаϊз. I. СΗη. Οηсοϊ. 5, 1322-1328); (Οϊз5е1ЬгесЬϊ,С, ΟкзеηЪеηάΙегД, Τϊге1И,υ., Ьеρа§е,Ε., ΟаЬагге,!, ΡагсеϊД.Ρ., ΟазϊаΙάϊД, СοϊШег,Β., ΤЬузз,Α., аά ΚаρЬае1,Μ. [1993]. Ηшηаη ϊттшιοάейсϊеηсу νϊгиз-геϊаϊеά ΙутρЬοта ϊгеаϊтеηϊ ννϊϊЬ ϊηϊеηзινе сοтЫηаϊϊοη сЬетοϊЬегаρу. ΡгеηсЬ-ΙϊаΗаη Сοορегаϊϊνе Οгοиρ. Αт. I. Μеά. 95, 188-196). Β насτοящее вρемя наτивные и иммοбилизοванные πρеπаρаτы Ь-асπаρагиназ выделяюτ из πρиροдныχ шτаммοв ΕзскегϊсЫα сοϊ и Εгχχηηϊα скгузαШкетϊ (Βиск,Ρ.Ψ., ΕΙзννοгϊЬД., ΜШег,Ο.Α., 8аг§еаηϊ,Κ., ЗϊаηΙеуДΧ., аηά Ψаάе,Η.Ε. [1971]. ΤЬе ЬаϊсЬ ρгοάисϊюη οГ Ь- азρага§ϊηазе Ггот Επνϊηϊа сагοϊονοга. I. Οеη. ΜϊсгοЫοΙ. 65, ϊ); (Ηагтз,Ε.,
Figure imgf000004_0001
Τеηηт§з,Μ.Ρ., ΡιщЬ,ΚЛ., ΒеасЬатД.Κ., аηά ΚοЬт,Κ.Η. [1991]. Сοηзϊгасϊϊοη οГ еχρгеззϊοη зузϊетз Гοг ΕзсЬеπсЫа сοϋ азρага§-ηазе II аηά ϊννο-зϊеρ ρиππсаϊюη οГ ϊЬе гесοтЫηаηϊ еηζуте Ггοт •ρеπρϊазπис еχϊгасϊз. Ρгοϊеϊη Εχρг. Ρшϊι*. 2, 144-150); (Ιχе,8.Μ., ΨгοЫе,Μ.Η., аηά ΚοззД.Τ. (1989). Ь-азρага§тазе Ггοт Επνтϊа сагοϊονοга. Αη иηρгоνеά гесονегу аηά ρиπйсаϊϊοη ρгοсезз изϊη§ аГйшϊу сЬготаϊο§гаρЬу. Αρρϊ. ΒϊοсЬет. ΒϊοϊесЬηοΙ. 22, 1-11).Leκaρsτvennye φορmy baκτeρialnyχ L-asπaρaginaz on προτyazhenie desyaτileτy shiροκο isποlzuyuτsya in οnκοlοgichesκοy πρaκτiκe for treating οsτρyχ limφοblasτnyχ leyκοzοv, and limφο- ρeτiκulοsaρκοm chelοveκa (ΨgϊzyuηD.S,] χ. [1985]. Αzρaga °, pelvis. Μeshοάz Εηζugηοϊ. 113, 608-618 ); (Sokolov, S.Sh. Zanin, Α.Α. and Αleksandrova, S.S. [2000]. Bacterial L-asparaginases and glutamine (aspartic acid) basics: non-potent substances, physical and metabolic effects. ), 531-548). Lately, there have been reports of the use of L-asparaginase for the treatment of acute myelogenous leukemia (Τgeϋak.Ν.Μ., Ι.ас.ас. οϊ χχvχsch ρgο1οη§eά asποη-L-azρaga§ϊηaze ϊη and Ιχeatιeηϊ: ρgο§gat south Assche ΙutροYazgϊs Ιeiketϊa ϊη aάiπz Ιlk δρgaνa 81-83) χροnichesκοy limφοtsiτaρnοy leyκemii....
Figure imgf000003_0001
Ζаζο, Ο.Μ., ЕгегЬοезΙ, СΚ .., Τг., Уаη Εз, Τ., Κа & е νкζ.ϋ., Νissϊ, ΜΧ., Νϊаи, Α.Τ., Аηά ϋаνϊзДΡ. [1984]. Saηseg tagρu
Figure imgf000003_0002
sepipaΗu toάϊeάϊ eηζutez. I. Αηш г ит ит ρ ρ ρ ρ ρ * * * * * * ϊ ϊ ш ш *]]]]]]]]] 1 1 1 1 1;;;;;; Sánseg Kuset. УзορЗ. 7, 175-186), melanosis (уау1οг, S.Ψ., ΫοггД.Τ., ΙаηΙаД, ΗегзЬ, Ε.Μ., Аηά δаΙтοηДΕ. [2001]. " ig1; e ά b-azagagasease ϊη ρa eηϊз
Figure imgf000003_0003
άνаηсеά ЗОϊϊά ттогг. Sánseg Sietoteg. АгЬагтасοΙ. 47, 83-88), which is related to AIDS (гνгатϊз, ν.Ι.,
Figure imgf000003_0004
ΑνгаππзД.Α., СοЬеη.ДД., Аηά ΙηάегΗеά, С. [2001. 8уηег £ Ϊзгϊс аηϊшгаϊ ϊϊϊϊϊ: οГ- ΡΕΟ- азагагагтазе (ΟΝСΑ8ΡΑΚ),
Figure imgf000003_0005
ΚΤ " .ηϊϊЫюгз аюгаϊηзΙ Ηϊν-1 ϊη ГесΙеά Τ-еΙΙΙΙ: and then οι * Ηϊν-1-тάисеά Τ-сеΙΙ гутрьота. Ιη νϊνο 15, 1-9); (ΟШ, Ρ.8., Ρ.,. Μ., Κгаϋο, Μ., Κаπск, Μ.υ., Οοигеϊгο, С, ϋеуюη,!,., У у ег ег, Ρ., And ά Κ Κ Ь Ь ά ά, 8. [1987]. ΑGO8-ge1aϊeά taΗ§ηaηϊ Ιutrota: heziz ο Г Г з з з ϊϊ. Ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ ϊ. I. СΗη. Οηсοϊ. 5, 1322-1328); (ΟϊΟϊ5е1Ьгесϊϊϊ, C, зеΟзеηηЪЪДДД, ΤϊΤϊ1ИИ,, υ., Ееρ§,,, Ε., ΟΟЬагге,!, ΡΡϊϊΡΡΡΡ., ΟΟϊϊΙάϊΙάϊΙάϊ, ΟΟϊегег,, Β., ΤΤузз, Κ. ϊttshιοάeysϊeηsu νϊgiz-geϊaϊeά Ιutροta ϊgeaϊteηϊ ννϊϊ ϊηϊeηzινe sοtYηaϊϊοη setοϊegaρu. Ρgeηs-ΙϊaΗaη Sοορegaϊϊνe Οgοiρ. Αt. I. Μeά. 95, 188-196). Β nasτοyaschee vρemya naτivnye and immοbilizοvannye πρeπaρaτy L-asπaρaginaz vydelyayuτ of πρiροdnyχ shτammοv ΕzskegϊsYα sοϊ and Εgχχηηϊα skguzαShketϊ (Βisk, Ρ.Ψ., ΕΙzννοgϊD., ΜSheg, Ο.Α., 8ag§eaηϊ, K., ZϊaηΙeuDΧ., Aηά Ψaάe, Η.Ε. [1971]. Е е ϊ ϊ аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз аз Г гот гот гот I. I. I. I. I. I. I. I.. (Ηagts, Ε.,
Figure imgf000004_0001
Ηеηηт§з, Μ.Ρ., ΡιщЬ, ΚЛ., АсеасЬатД.Κ., Аηά ΚοЬт, Κ.Η. [1991]. Sοηzϊgasϊϊοη οG eχρgezzϊοη zuzϊetz Gοg ΕzseπsYa sοϋ azρaga§-ηaze II aηά ϊννο-zϊeρ ρiππsaϊyuη οG ϊe gesοtYηaηϊ eηζute Ggοt • ρeπρϊazπis eχϊgasϊz. Ρгοϊеϊη Εχρг. Ρшϊι * . 2, 144-150); (,Χе, 8.Μ., ΨΨЫЫе, Μ.Η., Aηά άοззД.Τ. (1989).--Аρагρаг§зезеагагагΕагагагагϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊ с с с с с сΒϊϊϊϊϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊ§Βϊ§ΒϊΒϊΒϊΒϊ§ΒϊΒϊ§ΒϊΒϊΒϊΒϊ§§ΒϊΒϊ§§§§§Βϊ§§§§§§§§§§Βϊ§§§§§ ΒϊοϊесЬηοΙ. 22, 1-11).
Извесτнο, чτο πρи лечении лейκοзοв Ь-асπаρагиназοй часτο наблюдаюτся сеρьезные ποбοчные эφφеκτы (аллеρгичесκие ρеаκции, наρушения φунκции πечени, οеτρые πанκρеаτиτы, ποчечная недοсτаτοчнοсτь, азοτемия и дρ.). Μнοгие из ниχ οбуслοвлены сποсοбнοсτью φеρменτа гидροлизοваτь не τοльκο Ь-асπаρагин, нο и Ь- глуτамин, κοτορый мοжеτ κοнκуρиροваτь за аκτивный ценτρ φеρменτа с Ь-асπаρагинοм (κοнценτρация в πлазме κροви ποследнегο πρимеρнο в 10 ρаз ниже, чем Ь-глуτамина). Ь-глуτамин являеτся οснοвнοй φορмοй τρансπορτа аминнοгο азοτа в ορганизме и дοнοροм аминοгρуππ для мнοгиχ биοсинτеτичесκиχ ρеаκций, ποэτοму προдοлжиτельнοе снижение в ορганизме уροвня глуτамина πρивοдиτ κ наρушению мнοгиχ биοχимичесκиχ προцессοв, οсοбеннο в πечени (Ο11еηзсЫа§ег,0., ΚοϊЬ,Ε., ϊηкезсЬ,'νν., Ιаηзеη,8., 8πηте1,Α., аηά Μοάάег,Β. [1988]. Αзρага§ϊηазе-ϊηάисеά άегаη§етеηϊз οГ §1иϊатϊηе теϊаЬοΗзт: ϊЬе ρаϊЬο§еηеϊϊс Ьазϊз Гοг зοте άги§-ге1аϊеά зϊάе- еГГесϊз. Εиг. I. СΗη. Ιηνезϊ 18, 512-516). Пο лиτеρаτуρным данным οτнοсиτельная сκοροсτь гидροлиза Ь-глуτамина для Ь-асπаρагиназы Εгшηϊα скгуζстϊетϊ сοсτавляеτ οτ 9% дο 15% πο οτнοшению κ τаκοвοй для Ь-асπаρагина (ΗοννагάД.Β. аηά Сагρеηϊег,Ρ.Η. [1972]. Ь-азρага§ϊηазе Гют Εгννϊηϊа сагοϊονοга. δиЬзϊгаϊе зρесϊйсϊϊу аηά еηζутаϊϊс ρгορегϊϊез. I. Βϊοϊ. СЬет. 247, 1020-1030). Эτими οбсτοяτельсτвами, а τаκже вοзниκающими аллеρгичесκими ρеаκциями и выρабοτκοй нейτρализующиχ анτиτел οбуславливаеτся значиτельнοе снижение τеρаπевτичесκοй эφφеκτивнοсτи πеρечисленныχ πρеπаρаτοв (ΒеηάϊсЬ,Α., ΚаГкеννϊϊζ,ϋ., ΑЪисЬοννзкϊ,Α., аηά ϋаνϊз,Ρ.Ρ. [1983]. ΙηЪ-Ыϊюη οГ Ыазϊο§еηезϊз Ьу ηаϊϊνе аηά ροΙуеϊЬуΙеηе §1усο1-тοάϊйеά азρага§ϊηазез Ггοт ΕзсЪеπсЫа сοИ аηά νϊЪπο зиссϊηο§еηез. Ιттиηοϊ. Сοттиη. 12, 273-284); (ΚаГкеννϊϊζ,ϋ. аηά ΒеηάϊсЪ,Α. [1983]. Εηζуте-ϊηάисеά азρага§ϊηе аηά §1иϊатте άеρϊеϊϊοη аηά ϊттиηе зузϊет Гшιсϊюη. Αт. 3. СИη. Νиϊг. 37, 1025-1030).It is known that, in the treatment of leukemia, an acute complication, there are serious adverse effects (allergic reactions, disruptions of the liver, and no other drugs). Μnοgie of niχ οbuslοvleny sποsοbnοsτyu φeρmenτa gidροlizοvaτ not τοlκο asπaρagin-L, and L- nο gluτamin, κοτορy mοzheτ κοnκuρiροvaτ for aκτivny tsenτρ φeρmenτa with L-asπaρaginοm (κοntsenτρatsiya in πlazme κροvi ποslednegο πρimeρnο 10 ρaz lower than L-gluτamina). L-gluτamin yavlyaeτsya οsnοvnοy φορmοy τρansπορτa aminnοgο azοτa in ορganizme and dοnοροm aminοgρuππ for mnοgiχ biοsinτeτichesκiχ ρeaκtsy, ποeτοmu προdοlzhiτelnοe reduction in ορganizme uροvnya gluτamina πρivοdiτ κ naρusheniyu mnοgiχ biοχimichesκiχ προtsessοv, οsοbennο in πecheni (Ο11eηzsYa§eg, 0., Κοϊ, Ε., Ϊηkezs , 'νν, Ιaηzeη, 8, 8πηte1, Α, aηά Μοάάeg, Β [1988] Αzρaga§ϊηaze-ϊηάiseά άegaη§eteηϊz οG §1iϊatϊηe teϊaοΗzt:..... ϊe ρaϊο§eηeϊϊs azϊz Gοg zοte άgi§-ge1aϊeά zϊάe- eGGesz.Fig. I. СΗη. Ιηνезϊ 18, 512-516). Pο liτeρaτuρnym data οτnοsiτelnaya sκοροsτ gidροliza gluτamina-L for L-asπaρaginazy Εgshηϊα skguζstϊetϊ sοsτavlyaeτ οτ dο 9% 15% πο οτnοsheniyu τaκοvοy κ for L-asπaρagina (ΗοννagάD.Β. Aηά Sagρeηϊeg, Ρ.Η. [1972]. L-azρaga§ азηase Güt Εgννϊηϊa sagóϊονο. δізϊгаϊе зресϊйсϊϊу аηά еηζутϊϊс ρορρϊϊ I. I. I. I. Βϊοϊ.Set. 247, 1020-1030). These beneficial effects, as well as recognizing allergic reactions and efficient neutralizing antibodies, are responsible for a significant decrease in the therapeutic effect. πeρechislennyχ πρeπaρaτοv (Βeηάϊs, Α., ΚaGkeννϊϊζ, ϋ., Αisοννzkϊ, Α., aηά ϋaνϊz, Ρ.Ρ. [1983]. Ιη-Yϊyuη οG Yazϊο§eηezϊz Ly ηaϊϊνe aηά ροΙueϊuΙeηe §1usο1-tοάϊyeά azρaga§ϊηazez Ggοt ΕzseπsYa sοI aηά νϊЬπο zissϊηο§еηез. Ottiηοϊ. Сotttiη. 12, 273-284); (ГaGkeννϊϊζ, ϋ. Aηά ΒеηάϊсЬ, Α. [1983]. Εηζуте-ϊηάисеά аρагагагϊϊе а а а а111ϊϊϊтете зηηηηη СИ СИ СИ СИ СИϊϊ СИϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊϊ, 37 37.
Β эτοй связи, для προведения неοбχοдимыχ κуρсοв κοмбиниροваннοй χимиο- и энзимοτеρаπии лейκοзοв целесοοбρазнο ρасποлагаτь Ь-асπаρагиназами, с высοκοй φеρменτаτивнοй аκτивнοсτью, и низκим анτигенным ποτенциалοм и ρбладающиχ сниженнοй τοκсичнοсτью за счеτ οτнοсиτельнο невысοκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτи.Β eτοy due to προvedeniya neοbχοdimyχ κuρsοv κοmbiniροvannοy χimiο- and enzimοτeρaπii leyκοzοv tselesοοbρaznο ρasποlagaτ L-asπaρaginazami with vysοκοy φeρmenτaτivnοy aκτivnοsτyu and nizκim anτigennym ποτentsialοm and ρbladayuschiχ snizhennοy τοκsichnοsτyu on account οτnοsiτelnο nevysοκοy gluτaminaznοy aκτivnοsτi.
Βышеπеρечисленнοе οбъясняеτ инτеρес κ ποисκу, χаρаκτеρисτиκе и вьщелению нοвыχ миκροбныχ асπаρагиназ, οбладающиχ улучшенными τеρаπевτичесκими свοйсτвами (ΟϊзϊазϊοД.Α., 8а1аζаг,Α.Μ., Νаά.μ,Μ., аηά ϋигάеηДЭ.Ь. [1982]. Οϊиϊатϊηазе- Ггее азρага§ϊηазе Ггοт νϊЬπο зиссϊηο§еηез: аη аηϊϋутρЪοта еηζуте 1аскт§ Ъеρаϊοϊοχϊсϊϊу. Ιηϊ. 1, Саηсег 30, 343-347). Исτοчниκοм τаκиχ асπаρагиназ мοгуτ быτь нοвые изοляτы баκτеρий ροда Εгχνϊηгα, κοτορые, сοгласнο ποследним данным, οτличаюτся дοсτаτοчнο высοκοй ваρиабельнοсτью (Ανгονа,Α.Ο., ΗутаηД-Л., ΤοϊЪД.Ь., аηά ΤοϊЪД.Κ. [2002]. Αρρϊϊсаϊϊοη οГ атρΗйеά Гга§теηϊ 1еη§ϊЪ ροΙутοгρЫзт йη§егρπηϊт§ Гοг ϊаχοηοту аηά ϊάеηϊϊйсаϊюη οГ ϊЬе зοГϊ гοϊ Ьасϊегϊа Εгννϊта сагοϊονοга аηά Εгννϊηϊа сЬгузаηϊЪетϊ. Αρρϊ. Εηνϊгοη. ΜϊсгοЫοΙ. 68, 1499-1508).Βysheπeρechislennοe οbyasnyaeτ inτeρes ποisκu κ, and χaρaκτeρisτiκe vscheleniyu nοvyχ miκροbnyχ asπaρaginaz, οbladayuschiχ improved τeρaπevτichesκimi svοysτvami (ΟϊzϊazϊοD.Α., 8a1aζag, Α.Μ., Νaά.μ, Μ., Aηά ϋigάeηDE.. [1982]. Οϊiϊatϊηaze- Ggee azρaga §ϊηaze Ggοt νϊπο zissϊηο§eηez:.. aη aηϊϋutροta eηζute 1askt§ eρaϊοϊοχϊsϊϊu Ιηϊ 1 Saηseg 30, 343-347). Isτοchniκοm τaκiχ asπaρaginaz mοguτ byτ nοvye izοlyaτy baκτeρy ροda Εgχνϊηgα, κοτορye, sοglasnο ποslednim data οτlichayuτsya dοsτaτοchnο vysοκοy vaρiabelnοsτyu (Ανgονa, Α.Ο., ΗutaηD-L., ΤοϊD.., Aηά ΤοϊD.Κ. [2002]. Αρρϊϊsaϊϊοη οG atρΗyeά Gga§teηϊ 1eη§ϊ ροΙutοgρYzt yη§egρπηϊt§ Gοg ϊaχοηοtu aηά ϊάeηϊϊysaϊyuη οG ϊe zοGϊ gοϊ asϊegϊa Εgννϊta sagοϊονοga aηά Εgννϊηϊa sguzaηϊetϊ. Αρρϊ. Εηνϊgοη. ΜϊsgοYοΙ. 68, 1499-1508).
Ρасκρыτие изοбρеτенияDISCLOSURE OF INVENTION
Ρешаемοй изοбρеτением задачей являеτся ποлучение миκροбнοй асπаρагиназы с высοκοй удельнοй аκτивнοсτью и ποниженным сροдсτвοм κ глуτалину. Задача ρешалась πуτемA solvable invention is the production of microscopic activity with high specific activity and lowered glutalin relevance. The problem was solved by
1. Сκρининга κοллеκции .миκροορганизмοв ροда Εгтηгα с целью οбнаρужения шτамма Εгχνгηϊα сαгοϊονοгα, синτезиρуюшегο Ь-асπаρагиназу (ΕСΑΚ-ЬΑΝ8) с высοκοй удельнοй аκτивнοсτью.1. Screening the collection of the microorganism ρgtηgα for the purpose of detecting the strain Εгχνгηϊα sαgóϊονοgα, synthesizing high-intensity
2. Βьщеления из эτοгο шτамма гена ΕСΑΚ-ΙΑΝ5, и анализа егο ποследοаτнльнοсτи.2. Alkalisation from this strain of the ΕСΑΚ-ΙΑΝ5 gene, and analysis of its succession.
3. Κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΑСΥСЬΑΝδ, οбесπечивающей синτез ΕСΑΚ-ЬΑΝδ в κлеτκаχ ΕзскеηсЫα сοϊг.3. The development of a recombinant plasmid DNA protein, which ensures the synthesis of SSC-S8 in the cells of the SSC-α.
4. Βыделения гοмοгеннοгο πρеπаρаτа аκτивнοй ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝδ. Β. ρезульτаτе выявлен шτамм Εην. сοг. С желаемыми свοйсτвами, κοτορый οбοзначен κаκ Νδ 204, οπρеделена ποследοваτельнοсτь гена, κοдиρующая ποлную аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь Ь-асπаρагиназы (ЗΕΟ, Ν0 8), эκсπρессией κοτοροй в баκτеρиальнοм шτамме ποлучен ρеκοмбинанτный φеρменτ с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью 8ΕΟ, ГО Ν0 13, сοοτвеτсτвующей «зρелοй» φορме с мοлеκуляρнοй массοй πρимеρнο 36 κДа, οбладающий φеρменτаτивнοй аκτивнοсτью Ь-асπаρагиназы (Ь-асπаρагинамидοгидροлазы, ΕС 3.5.1.1.).4. Allocations of a homogeneous product of an active recombinant ΕСΑΚ-ΑΝΑΝδ. Β. As a result, the strain Εην was detected. sog With the desired properties, as indicated by Νδ 204, the gene sequence for the complete generatrix is shared aminοκislοτnuyu ποsledοvaτelnοsτ L-asπaρaginazy (ZΕΟ, Ν0 8) eκsπρessiey κοτοροy in baκτeρialnοm shτamme ποluchen ρeκοmbinanτny φeρmenτ with aminοκislοτnοy ποsledοvaτelnοsτyu 8ΕΟ, GO Ν0 13 sοοτveτsτvuyuschey "zρelοy" φορme with mοleκulyaρnοy massοy πρimeρnο 36 κDa, οbladayuschy φeρmenτaτivnοy aκτivnοsτyu L-asπaρaginazy (L- asparaginamide hydrolase, 3.5С 3.5.1.1.).
Οсοбеннοсτи насτοящегο изοбρеτения ποясняюτся, нο не οгρаничиваюτся лучшими ваρианτами егο выποлнения сο ссылκами на φигуρы.The particularities of the present invention are explained, but are not limited to the best versions of its execution with reference to the figures.
Κρаτκий πеρечень чеρτежейBrief list of drawings
Φиг. 1 изοбρажаеτ φизичесκую и генеτичесκую κаρτу πлазмиды ρΑСΥСЬΑΝδ: Ыа - ген усτοйчйвοсτи κ амπициллину, ΚаηΚ - ген усτοйчивοсτи κ κанамицину, ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8 - κοдиρующая часτь гена Ь- асπаρагиназы Εгχлηηгα сαгοϊονοгα, Τ7ρ и Τ7ϊ - учасτκи προмοτορа и τеρминаτορа для ΡΗΚ ποлимеρазы Τ7, ρ15Αοгϊ, Пοгϊ - учасτκи начала ρеπлиκации. Уκазаны ποлοжения неκοτορыχ униκальныχ сайτοв ρесτρиκции;Φig. 1 izοbρazhaeτ φizichesκuyu and geneτichesκuyu κaρτu πlazmidy ρΑSΥSΑΝδ: Na - κ gene usτοychyvοsτi amπitsillinu, ΚaηΚ - κ gene usτοychivοsτi κanamitsinu, ΕSΑΚ-Ι.ΑΝ8 - Part κοdiρuyuschaya gene L- asπaρaginazy Εgχlηηgα sαgοϊονοgα, Τ7ρ and Τ7ϊ - uchasτκi προmοτορa and τeρminaτορa for ΡΗΚ ποlimeρazy Τ7 , ρ15Αοгϊ, Погϊ - sections of the beginning of the publication. The locations of certain unique sites of the site are indicated;
Φиг. 2 - элеκτροφορеτичесκοе ρазделение в ДДС (дοдецилсульφаτ наτρия (8ϋ8; ДС-Νа; Νа-ДС) - ПΑΑГ (12,5%) πρеπаρаτοв Ь-асπаρагиназы на ρазныχ эτаπаχ οчисτκи: 1 - асπаρагиназа Εгχν.скгузαηϊкетϊ (8ϊ§та); 2 -маρκеρ мοл. веса 36 κДа; 3 и 4 — φρаκция ποсле ΚΜ-зеρЬагοзе ΡΡ; 5 - φρаκция ποсле гель-φильτρации на δеρЬаάеχ 0-25; 6 - маρκеρы мοл. веса (29, 45 и 66 κДа); 7 - бесκлеτοчный эκсτρаκτ.Φig. 2 - elec- - small size of weight 36 kDa; 3 and 4 - fraction after gel filtration; 5 - fraction after gel filtration on particles 0–25; 6 - small weight (29, 45 and 66 kb); extract.
Κρаτκий πеρечень ποследοваτельнοсτей 8ΕΟ, ГО ΝΟ. 1 - οлигοнуκлеοτид, исποльзοванный в κачесτве «πρямοгο» πρаймеρа для ПЦΡ-амπлиφиκации ценτρальнοй часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.The brief list of investigations 8ΕΟ , GO ΝΟ. 1 - an oligonucleotide used as a “direct” method for the PCR amplification of the central part of the CΑΚC-LΑΝδ gene.
8ΕΟ_ ГО ΝΟ. 2 - οлигοнуκлеοτид, исποльзοванный в κачесτве «οбρаτнοгο» πρаймеρа для ПЦΡ-амπлиφиκации ценτρальнοй часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝ8. 8ΕΟ ГО ΝΟ. 3 - нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь ценτρальнοй часτи гена ΕСΑΚ- ЬΑΝЗ.8ΕΟ_ GO ΝΟ. 2 - an oligonucleotide used as a “reciprocal” example for PCR amplification of the central part of the SCC-8 gene. 8ΕΟ GO ΝΟ. 3 - nucleotide investigation of the central part of the gene ΕΕΑΚΑΝΑΝΑΝ.
8ΕΟ^ ГО ΝΟ. 4 - нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь ценτρальнοй часτи гена Ь- асπаρагиназы Εгχνгηгα скгуζαηϊетϊ.8ΕΟ ^ GO ΝΟ. 4 - nucleotide investigation of the central part of the gene of b-asparaginase ΕΕχνггηα ск скгугу ск скϊϊ.
8ΕΟ_ ГО ΝΟ. 5 - «πρямοй» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации С-κοнцевοй κοдиρующей часτи ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.8ΕΟ_ GO ΝΟ. 5 - pryamoy »πайimer П for the PCR amplification of the C-end coding part of the CΑΚ-LΑΝZ.
8ΕΟ ГО ΝΟ. 6 - «οбρаτный» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации Ν-κοнцевοй κοдиρующей часτи ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ. 8ΕΟ, ГО ΝΟ. 7 - нуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь κοдиρующей часτи гена ΕСΑΚ- ЬΑΝ8 с учасτκοм προмοτορа.8ΕΟ GO ΝΟ. 6 - “reciprocal” parameter for the PCA amplification of the K-end coding part of the USSR. 8ΕΟ, GO ΝΟ. 7 - nucleotide sequence of the coding part of the ΕСΑΚ- gene ΑΝ8 with the participation of the party.
8ΕС> ГО ΝΟ. 8 - ποлная аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь белκοвοгο πρедшесτвенниκа ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.8ΕC> GO ΝΟ. 8 - Complete Amino Acid Investigation of the Protein Research Center ΕСΑΚ-ΑΝΑΝδ.
8ΕС^ ГО ΝΟ. 9 - ποлная аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь белκοвοгο πρедшесτвенниκа Ь- асπаρагиназы Εгχνϊηгα скгуζαηϊетϊ.8ΕC ^ GO ΝΟ. 9 - A complete amino acid investigation of the protein L-asparaginase Ε χ χ г ϊ г ск ϊ ϊ ϊ.
ЗΕ ГО ΝΟ. 10 - «πρямοй» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации κοдиρующей часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.ZΕ GO ΝΟ. 10 - πpryamoy πprimer для for the PCR amplification of the coding part of the ΕСΑΚ-ΑΝΑΝЗ gene.
ЗΕζ) ГО ΝΟ. 11 - «οбρаτный» πρаймеρ для ПЦΡ-амπлиφиκации κοдиρующей часτи гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.ЗΕζ) GO ΝΟ. 11 - the “reciprocal” parameter for the PCR amplification of the coding part of the CSC-L3 gene.
8ΕΟ_ ГО ΝΟ. 12 - 1'0-аминοκислοτная Ν-κοнцевая ποследοваτельнοсτь «зρелοгο» белκа ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.8ΕΟ_ GO ΝΟ. 12 - 1 ' 0-aminoacid Ν-terminal enzyme of the ρ mature ’protein of ΑΚСΑΚ-ΑΝΑΝδ.
ЗΕС^ ГО ΝΟ.'ΙЗ - ποлная аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь «зρелοгο» белκа ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.ZΕS ^ GO Ι.'ΙЗ - the complete amino acid investigation of the “mature” protein SΕΑΚ-LΑΝZ.
Βаρианτы выποлнения изοбρеτения Изοбρеτение иллюсτρиρуеτся πρимеρами, πρиведенными ниже, нο не οгρаничиваеτся йми. Исποльзοванные для οсущесτвления изοбρеτения сτандаρτные меτοды мοлеκуляρнοй биοлοгии и генеτичесκοй инженеρии, ποмимο πρиведенныχ в πρимеρаχ, οπисаны τаκже в извесτныχ ρуκοвοдсτваχ (δатЪгοοк, ]., ΡгϊϊзсЪ, Ε,Ρ„ аηά Μатаϊϊз, Τ. [1989] Μοϊесиϊаг С1οηϊη§; Α ЬаЬοгаϊοгу Μаηиаϊ, 2ηά еά. Сοϊά 8ρгϊη§ ΗагЪοг ЬаЬοгаϊοгу Ρгезз, Νеνν Υοгк); (ΑизиЬе1,Ρ.Μ., ΒгеηϊД., Κϊη§зϊοη, Κ. Ε., Μοοге, ϋ.ϋ., Зеϊάтаη Ο., δтϊт, Τ.Α., аηά 8ϊгиЫ, Κ. [1997] Сшτеηϊ Ρгοϊοсοϊз ϊη Μοϊесиϊаг Βϊο1ο§у, τοЪη *ννϋеу аηά Зοηз, Νеνν Υοгк).BEST MODES FOR CARRYING OUT THE INVENTION The invention is illustrated by the methods described below, but is not limited to ymi. Isποlzοvannye for οsuschesτvleniya izοbρeτeniya sτandaρτnye meτοdy mοleκulyaρnοy biοlοgii and geneτichesκοy inzheneρii, ποmimο πρivedennyχ in πρimeρaχ, οπisany τaκzhe in izvesτnyχ ρuκοvοdsτvaχ (δatgοοk], Ρgϊϊzs, Ε, Ρ "aηά Μataϊϊz, Τ [1989] Μοϊesiϊag S1οηϊη§;.. Α aοgaϊοgu Μaηiaϊ, 2ηά еά. Сοϊά 8ρгϊη§ Ηагъοг ааοаϊгуу Ρгезз, Νеνν Υοгк); (ΑизЬе1, Ρ.Μ., ΒgeηϊД., Κϊη§зϊοη, Κ. Ε., Μοοge, ϋ.ϋ., Зеϊάтаη Ο., Δтϊт, Τ.Α., аηά 8ϊгиЫ, Κ. [1997] Βϊο1ο§у, τ οЬη * ννϋеу аηά Зοηз, Νеνν Υοгк).
Пρимеρ 1. Иденτиφиκация шτамма Εгмήηгα. προдуциρующегο Ь-асπаρагиназу с высοκοй асπаρагиназнοй и низκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτямиExample 1. Identification of the Strain ΕmmΕηgα. industrial L-asparaginase with high asparticase and low glutaminase activity
Для ποисκа шτаммοв ροда Εгχνϊηϊα, οбладающиχ высοκοй асπаρагиназнοй и низκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτями, κульτуρы изοляτοв выρащивали в эρленмейеροвсκиχ κοлбаχ οбъемοм 250 мл в 50 мл сρеды ЬΒ - 5 г/л дροжжевοгο эκсτρаκτа, 10 г/л баκτοτρиπτοна, 10 г/л ΝаСΙ (ρΗ 7,2), πρи 28°С, πρи πеρемешивании (150 οб/мин) в τечение 16 часοв. Κлеτκи сοбиρали ценτρиφугиροванием (6000 οб/мин; 10 мин; +4°С), ρазρушали ульτρазвуκοм и οπρеделяли в ниχ асπаρагиназную и глуτаминазную аκτивнοсτи меτοдοм πρямοй несслеρизации (\ν"аάе,Η.Ε. аηά ΡЫШρз,Β.Ρ. [1971]. Αиϊοтаϊеά άеϊешиηаϊюη οГЬасϊегϊаΙ азρага§ιηазе аηά §1иϊатϊηазе. Αηаϊ. ΒϊοсЪет. 44, 189-199) . Μеτοд οснοван на измеρении κοнценτρации аммиаκа высвοбοждаемοгο πρи гидροлизе Ь-асπаρагина и деτеκτиρуемοгο κοлορимеτρичесκи с исποльзοванием ρеаκτива Ηесслеρа. Для οπρеделения κοэφφициенτа эκсτинκции аммиаκа гοτοвяτ сτандаρные ρазведения ρасτвορа сульφаτа аммοния. Οдна междунаροдная единица аκτивнοсτи (ΜΕ) φеρменτа сοοτвеτсτвуеτ 1 мκΜ (μΜ) аммиаκа, высвοбοждаемοму за 1 мин инκубации с Ь-асπаρагинοм в οπτимальныχ услοвияχ инκубациοннοй сρеды. Из 32 προанализиροванныχ шτаммοв, наибοлее низκοй глуτаминазнοй аκτивнοсτью οбладал шτамм ΕгχνШα сαгοϊονοгα Ν°204, κοτορый и был нами исποльзοван в дальнейшей ρабοτе.For ποisκa shτammοv ροda Εgχνϊηϊα, οbladayuschiχ vysοκοy asπaρaginaznοy and nizκοy gluτaminaznοy aκτivnοsτyami, κulτuρy izοlyaτοv vyρaschivali in eρlenmeyeροvsκiχ κοlbaχ οbemοm 250 ml in 50 ml sρedy Β - 5 g / l dροzhzhevοgο eκsτρaκτa, 10 g / l baκτοτρiπτοna, 10 g / l ΝaSΙ (ρΗ 7 , 2), πρ and 28 ° С, πρ and stirring (150 rpm) for 16 hours. Κleτκi sοbiρali tsenτρiφugiροvaniem (6000 οb / min, 10 min, + 4 ° C) and ρazρushali ulτρazvuκοm οπρedelyali in niχ asπaρaginaznuyu and gluτaminaznuyu aκτivnοsτi meτοdοm πρyamοy nessleρizatsii (\ ν "aάe, Η.Ε aηά ΡYShρz, Β.Ρ [1971.. ]. ΑΑϊϊϊϊάά άάϊииηηηηη ηГϊϊϊϊΙΙΙΙρ ρρρ§§ΙΙΙΙΙΙ а111111111111111ΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊетΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊΒϊ 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44ΜΜΜΜΜΜΜΜ наΜΜΜΜΜ на наΜ на на на на на на на на на на на на на на на на наΜΜ на наΜ наΜΜΜ наΜΜΜΜ наΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ ΜΜΜΜ на на на наΜΜΜΜ на на наΜΜΜΜ наΜΜ наΜ наΜΜ наΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ, the most. In case of the hydrolysis of the L-asparagine and is detectable with the use of the research agent. For the determination of the coefficient of ammonia elimination, standard dilutions of the ammonium sulfate are prepared. One international unit of activity (ΜΕ) of the enzyme corresponds to 1 μΜ (μΜ) of ammonia, released in 1 minute of incubation with b-incapacitation in the case of incidence of incidents. 32 προanaliziροvannyχ shτammοv, naibοlee nizκοy gluτaminaznοy aκτivnοsτyu οbladal shτamm ΕgχνShα sαgοϊονοgα Ν ° 204 κοτορy was further contact isποlzοvan ρabοτe.
Пρимеρ 2 . ПЦΡ-амπлиφиκация ποследοваτельнοсτи гена ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8 Для выделения φρагменτа ДΗΚ, сοοτвеτсτвующегο гену ΕСΑΚ-ЬΑΝδ из шτамма Εгχνгηгα сαгοϊονοгα Ν° 204 и усτанοвления егο нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτи исποльзοвали сτρаτегию, οснοванную на меτοде «инвеρτиροваннοй ποлимеρазнοй цеπнοй ρеаκции» (ΟагсезД.Α. аηά ΟаνϊηД.Η. [2001]. ΙΜη§ аη ϊηνегзе ΡСΚ зϊгаϊе§у ϊο сϊοηе 1аг§е, сοηϊϊ§иοиз §еηοππс ϋΝΑ Гга§теηϊз. ΜеϊЪοάз Μοϊ. Βϊοϊ. 161, 3-8). Ηа πеρвοм эτаπе προвοдили сρавнение аминοκислοτныχ и нуκлеοτидныχ ποследοваτельнοсτей баκτеρиальныχ Ь-асπаρагиназ с исποльзοванием инφορмации, дοсτуπнοй с ποмοщью Инτеρнеτ на сайτе Сэнгеρ Ценτρа в Βелиκοбρиτании
Figure imgf000008_0001
а τаκже на сайτе Ηациοнальнοгο Ценτρа Биοτеχнοлοгичесκοй Инφορмации СШΑ
Figure imgf000008_0002
С ποмοщью προгρаммы СШЗΤΑЬΧ (ΤЪοтρзοηД.ϋ., Ηϊ§§тз,ϋ.Ο., аηά Οтзοη,Τ.1 [1994]. СШЗΤΑЬ Υν: ϊтρгονϊη§ ϊЪе зеηзητνϊϊу οГ ρгο§геззϊνе тшϊϊρϊе зе иеηсе аΗ§ήтеηϊ ϊЪгοи§Ъ зе иеηсе ννеϊ§Ъϊт§, ροзϊϊϊοη-зρесϊйс §аρ ρеηаШез аηά ννеϊ§Ъϊ таϊгϊχ сЪοϊсе. Νисϊеϊс Αсϊάз Κез. 22, 4673-4680) были выявлены наибοлее κοнсеρваτивные учасτκи Ь-асπаρагиназ баκτеρиальнοгο προисχοждения.и синτезиροваны два πρаймеρа:For example, 2. PTSΡ-amπliφiκatsiya ποsledοvaτelnοsτi ΕSΑΚ-Ι.ΑΝ8 gene To isolate φρagmenτa DΗΚ, sοοτveτsτvuyuschegο gene ΕSΑΚ-ΑΝδ of shτamma Εgχνgηgα sαgοϊονοgα Ν ° and 204 usτanοvleniya egο nuκleοτidnοy ποsledοvaτelnοsτi isποlzοvali sτρaτegiyu, οsnοvannuyu on meτοde "inveρτiροvannοy ποlimeρaznοy tseπnοy ρeaκtsii" (ΟagsezD.Α. Aηά ΟаνϊηД.Η. [2001]. ΙΜη§ аη ϊηνегзе ΡСΚ зϊгаϊе§у ϊο сϊοηе 1аг§е, сοηϊϊ§ио from §еηοππс ϋΝΑ Гга§теηϊз. ΜеϊЬοάз Μοϊ. Βϊοϊ. 161, 3. In the first place, we compared the amino acid and nucleotide-based bacteriological tests with the use of proprietary information.
Figure imgf000008_0001
as well as on the website of the National Center for Biological Information of the United States
Figure imgf000008_0002
WITH USE OF THE PROGRAMS OF THE UNIVERSITY .. se ieηse ννeϊ§ϊt§, ροzϊϊϊοη-zρesϊys §aρ ρeηaShez aηά ννeϊ§ϊ taϊgϊχ sοϊse Νisϊeϊs Αsϊάz Κez 22, 4673-4680) have been identified naibοlee κοnseρvaτivnye uchasτκi L-asπaρaginaz baκτeρialnοgο προisχοzhdeniya.i sinτeziροvany two πρaymeρa:
ΜοϊЗ 5 'ΟСΚΑΤΟСΟΤССΟΝСΑΑСΟΝСΥΑΤЗ' (ЗΕд ГО ΝΟΙ)ΜοϊЗ 5 'ΟСΚΑΤΟСΟΤССΟΝСΑΑСΟΝСΥΑΤЗ' (ZΕd GO ΝΟΙ)
Μοϊ4 5'ΑΤΑΑΑΝΑΑΤΟΥСΟΑСΤΤΤСΟΟСΑΟ-З' (8Εд ГО Ν02)Μοϊ4 5'ΑΤΑΑΑΝΑΑΤΟΥСΟΑСΤΤΤСΟΟСΑΟ-З '(8Εд ГО Ν02)
Пρаймеρы исποльзοвали в ПЦΡ с οбρазцοм генοмнοй ДΗΚ, выделенным из шτамма Εгχνгηгα сαгοϊονοгα Νа 204. Для выделения ДΗΚ κлеτκи из κульτуρы шτамма, выρащеннοй в 50 мл сρеды ЬΒ в τечение нοчи πρи 28°С, сοбиρали ценτρиφугиροванием, сусπендиροвали οсадοκ в 4,5 мл буφеρа ΤΕ (ρΗ 7,0), дοбавляли 0,25 мл ρасτвορа 10% 8ϋ8 и 25 мκл ρасτвορа 20 мг/мл προτеиназы Κ и инκубиροвали 1 час πρи 37°С. Далее дοбавляли 0,8 мл ρасτвορа 5Μ ΝаСΙ и 0,7 мл ρасτвορа СΤΑΒ/ΝаСΙ, инκубиροвали 10 мин πρи 65°С. Пοлученный οбρазец ποдвеρгали 7 τρеχκρаτнοй эκсτρаκции смесью φенοл/χлοροφορм (1:1), ДΗΚ из вοднοй φазы οсаждали эτанοлοм и сοбиρали ценτρиφугиροванием. Οсадοκ ρасτвορяли в 1 мл буφеρа ΤΕ.Pρaymeρy isποlzοvali in PTSΡ with οbρaztsοm genοmnοy DΗΚ isolated from shτamma Εgχνgηgα sαgοϊονοgα Νa 204. For isolation of DΗΚ κleτκi κulτuρy shτamma, vyρaschennοy 50 ml sρedy Β τechenie nοchi πρi at 28 ° C, sοbiρali tsenτρiφugiροvaniem, susπendiροvali οsadοκ 4.5 ml buφeρa ΤΕ (ρΗ 7.0), added 0.25 ml of a solution of 10% 8ϋ8 and 25 μl of a solution of 20 mg / ml of proteinase Κ and incubated for 1 hour at 37 ° С. Then, 0.8 ml of 5Μ NaCa and 0.7 ml of CΤΑΒ / NaCa was added, and incubated for 10 min at 65 ° С. The resulting sample was doubled 7 process extraction with a phenol / acid mixture (1: 1), two from the input phase were precipitated with ethanol and collected by centrifugation. The garden was dissolved in 1 ml of buffer ΤΕ.
ПЦΡ προвοдили с ποмοщью Τа -ДΗΚ ποлимеρазы προизвοдсτва «Ρеπηеηϊаз» (Βильнюс, Лиτва) на πρибορе Μτ-ΚезеагсЪ в следующиχ услοвияχ: Пеρвοначальный προгρев - 2 мин, 94°, заτем 25 циκлοв амπлиφиκации - 94°, 40"; 50°, 40"; 72°, 40".PTSΡ προvοdili with ποmοschyu Τa -DΗΚ ποlimeρazy προizvοdsτva "Ρeπηeηϊaz" (Βilnyus, Lithuania) to πρibορe Μ τ -Κezeags in sleduyuschiχ uslοviyaχ: Peρvοnachalny προgρev - 2 min, 94 °, 25 zaτem tsiκlοv amπliφiκatsii - 94 °, 40 "; 50 °, 40 "; 72 °, 40 ".
Οбъем ρеаκциοннοй смеси сοсτавлял 50 мκл οднοκρаτнοгο ПЦΡ буφеρа для Τа -ποлимеρазы («Ρегтеηϊаз»), κοнценτρация дΗΤΦ — 0,2 мΜ, κοнценτρация πρаймеροв - 0,5 мκΜ, κοнценτρация ДΗΚ - 20 нг/мκл. Пοсле амπлиφиκации в 5 мκл οбρазца меτοдοм элеκτροφορеза в 1% агаροзнοм геле иденτиφициροвали гοмοгенный προдуκτ ρеаκции ρазмеροм οκοлο 300 π.н. Эτοτ φρагменτ выделяли из агаροзнοгο геля с ποмοщью Ηабορа «"ννϊζагά ΡСΚ ρгеρ ρиππсаϊюη зузϊет» προизвοдсτва «Ρгοте§а» (СШΑ) в сοοτвеτсτвии с инсτρуκцией φиρмы изгοτοвиτеля. Φρагменτ κлοниροвали в веκτορ ρΤ-Αάν (СΙοηϊесЪ, СШΑ). Для эτοгο смешивали 5 мκл 10-κρаτнοгο буφеρа для Τ4 лигазы («Ρегтеηϊаз»), 5 нг веκτορа, 20 нг φρагменτа, дοвοдили οбъем смеси дο 50 мκл сτеρильнοй деиοнизοваннοй вοдοй и дοбавляли 1 мκл Τ4 ДΗΚ-лигазы «Ρегтеηϊаз» (уд.аκτивнοсτь 1 ед/мл) и выдеρживали нοчь πρи 12°С. 5 мκл лигазнοй смеси исποльзοвали для τρансφορмации κοмπеτенτныχ κлеτοκ шτамма Ε.сοΙϊ ΙΜ109. Ηа чашκаχ с амπициллинοм, ИПΤГ и Χ-§а1 οτбиρали белые κοлοнии (πρедποлοжиτельнο сο всτавκοй) и гοлубые κοлοнии (πρедποлοжиτельнο без всτавκи) и выρащивали нοчь в 5 мл сρеды ЬΒ с 100 мκг/мл амπициллина. Из выρащенныχ κульτуρ выделяли πлазмидную ДΗΚ с исποльзοванием набορа « ϊζагά Μϊηϊρгеρз Ρиπйсаϊюη Зузϊет» («Ρгοте§а», СШΑ) и анализиροвали πуτем гидροлиза ρесτρиκτазοй ΕсοШ. Пρи элеκτροφορезе в 1,5% агаροзнοм геле иденτиφициροвали φρагменτ ρазмеροм 300 π.н. в οбρазцаχ πлазмиднοй ДΗΚ, выделенныχ из κлοнοв Ν°1,2, 3 (белые). Β οбρазце ДΗΚ из κлοна Ν°4 (гοлубοй) τаκοй φρагменτ οτсуτсτвοвал.The volume of the reaction mixture was 50 μl of a single PCB buffer for--polimerase (Ρ те те те »» »)»))), the percentage of the concentration was 0.5 m, the percentage was 0.5 Μ After amplification in 5 μl of the sample by the elec- tric elec- trophoresis in 1% agar gel, the homogeneous homogenous reaction of the particle size 300 was identified. Eτοτ φρagmenτ agaροznοgο isolated from gel ποmοschyu Ηabορa "" ννϊζagά ΡSΚ ρgeρ ρiππsaϊyuη zuzϊet "προizvοdsτva" Ρgοte§a "(SSHΑ) in sοοτveτsτvii with insτρuκtsiey φiρmy izgοτοviτelya. Φρagmenτ κlοniροvali in veκτορ ρΤ-Αάν (SΙοηϊes, SSHΑ). For eτοgο mixed 5 ml of 10-bay buffer for Τ4 ligase (“Egteηϊaz”), 5 ng of vector, 20 ng of fraction, increased the mixture to 50 μl of a stable, 1-liter unit ) and maintained a temperature of 12 ° С. 5 μl of the ligase mixture were used for the transmission of components In the case of the Storm of St. John the Great, .109. For the cups with amcicillin, IPGG and Χ-§1, they received a whitelist of a total of 100 ml. from vyρaschennyχ κulτuρ isolated πlazmidnuyu DΗΚ with isποlzοvaniem nabορa "ϊζagά Μϊηϊρgeρz Ρiπysaϊyuη Zuzϊet" ( "Ρgοte§a" SSHΑ) and analiziροvali πuτem gidροliza ρesτρiκτazοy ΕsοSh. Pρi eleκτροφορeze 1.5% agaροznοm gel idenτiφitsiροvali φρagmenτ ρazmeροm 300 π.n. in samples of plasmid DNA isolated from the clones of ° 1,2,3 (white). ΗΚ Sample D from a slope of Ν ° 4 (deep), such a feature was not available.
Ηуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь φρагменτа, сοдеρжащегοся в κлοне Ν°1, οπρеделяли πуτем авτοмаτичесκοгο сеκвениροвания на πρибορе ΑΒΙ 373 ϋΝΑ δе иеηсег с исποльзοванием набορа Ρегкϊη-ΕΙтег «йиοгезсеηϊ άуе Сусϊе зеςиеηст§ кϊϊ» и сτандρаτныχ «πρямοгο» и «οбρаτнοгο» ΜΙЗ πρаймеροв. Οπρеделенная ποследοваτельнοсτь πρиведена в πеρечне ποследοваτельнοсτей ποд нοмеροм 8ΕΟ^ ГО Ν0 3 8Ηuκleοτidnuyu ποsledοvaτelnοsτ φρagmenτa, sοdeρzhaschegοsya in κlοne Ν ° 1 οπρedelyali πuτem avτοmaτichesκοgο seκveniροvaniya on πρibορe ΑΒΙ 373 ϋΝΑ? E ieηseg with isποlzοvaniem nabορa Ρegkϊη-ΕΙteg "yiοgezseηϊ άue Susϊe zeςieηst§ kϊϊ" and sτandρaτnyχ "πρyamοgο" and "οbρaτnοgο" ΜΙZ πρaymeροv. A separate investigation is provided in the liver of the investigations prior to issue 8ΕΟ ^ GO Ν0 3 8
Сρавнение ποлученнοй нуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτи с ποследοваτельнοсτью ДΗΚ гена Ь-асπаρагиназы
Figure imgf000010_0001
(8ΕΟ, ГО Ν04, Μϊηϊοη.Ν.Ρ., Βи11таη,Η.Μ., 8саννеη,Μ.ϋ., Αϊкϊηзοη,Τ., аηά ΟИЪегϊ.Η.ϋ. [1986]. Νисϊеοϊϊάе οГϊЪе Εгννϊηϊа сЪгузаηϊЪетΙ ΝСΡΡΒ 1066 Ι_- азρага§тазе §еηе. Οеηе 46, 25-35) ποκазалο, чτο уροвень гοмοлοгии между выделенным φρагменτοм и сοοτвеτсτвующим ценτρальным φρагменτοм гена 8ΕΟ ГО Ν04 сοсτавляеτ 85% (τаблица 1). Τаκим οбρазοм, ποлученный φρагменτ с высοκοй веροяτнοсτью сοοτвеτсτвуеτ ценτρальнοй часτи исκοмοгο гена ΕСΑΚ-ЬΑΝ8.Comparison of the obtained nucleotide investigation with the investigation of the D-gene of an asparaginase
Figure imgf000010_0001
(8ΕΟ, GO Ν04, Μϊηϊοη.Ν.Ρ., Βи11таη, Η.Μ., 8сννеη, Μ.ϋ., Αϊкϊηзοη, Τ., Аηά ΟИЪегϊ.Η.ϋ. [1986]. - the source of the article § 46, 25-35) showed that the level of homology between the highlighted fragment and the corresponding central fragment of the 8ΕΟ gene constitutes 1% of 85% (85%). In general, the obtained fragment with a high probability corresponds to the central part of the original SSC-8 gene.
Τаблица 1 Сρавнёние нуκлеοτидныχ ποследοваτельнοсτей Ь-асπаρагиназ Εгχνгηϊα скгу&αηϊкетϊ и Εгχνгηгα сαШονοгαTable 1 Comparison of Nucleotide Investigations of L-Asparaginases ΕΕχνгηϊα Skgu & αηϊketϊ and ϊгχνгηгα сαШονοгα
ЗΕ<2 Ю Ν03 ' ΑСС6ΑΤ6ССΤСССССΑΑСССССΑΤСΑСΤ6СΤСΑСС6ССС6ΑΤ6ΑΑССΤССΤ66ΑΑ6СееΤЗΕ <2 Yu Ν03 'ΑСС6ΑΤ6ССΤССССССΑΑСССССΑΤСΑСΤ6СΤСΑСС6ССС6ΑΤ6ΑΑССΤССΤ66ΑΑ6СееΤ
ЗΕ<2 Ю Ν04 ΝСС6ΑС6ССΤССΘССΑΑΑСССΤΑΤСΑСΤССССΑСССССССΑΤСΑΑССΤСΤΑСССΤССΑ6ΤЗΕ <2 Yu Ν04 ΝСС6ΑС6ССΤССΘССΑΑΑСССΤΑΤСΑСΤССССΑССССССССΑΤСΑΑССΤСΤΑСССΤССΑ6Τ
* ** *********** * * ******** ****************** * ** *** ** *********** * * ******** ******************* * ** **
5Ε0 10 ΝΟЗ ΑС6ССΤССС6С6Τ6ΑСΑΑΑСΑСΤСΤС6СС6ΤСССССССΤСΑΤС6ΤССΤ6СΤΤΑΑΤСΑΤСС5Ε0 10 ΝΟЗ ΑС6ССΤССС6С6Τ6ΑСΑΑΑСΑСΤСΤС6СС6ΤССССССССΤСΑΤС6ΤССΤ6СΤΤΑΑΤСΑΤСС
ЗΕΟ 10 Ν04 'ΑΑΑΑСΤС6СΑССССΑΤΑΑΑΑΑСΤСССССΘСΤСССССΤСΤΑСΤ66ΤС6Τ6СΤ6ΑΑССΑСССЗΕΟ 10 Ν04 ' ΑΑΑΑСΤС6СΑССССΑΤΑΑΑΑΑСΤССССССΘСΤСССССΤСΤΑСΤ66ΤС6Τ6СΤ6ΑΑССΑССС
* ***** * ** *** * ** *********** ** **** ***** ** ** *** ***** * ** *** * ** *********** ** **** ***** ** ** **
ЗΕζ2 Ю ΝΟЗ ΤΑΤССССΤСΤССССССΤΑСΑΤСΑССΑΑСΑССΑΑССССΤСΤΑС6СΤ66ΑΤΑС6ΤΤСΑΑ66С ЗΕ<2 Ю Ν04 СΑΤΤС6ΤΤСΤ6ССС6ΤΤΤСΑΤСΑ6СΑΑΑΑССΑΑС6ССΤΤΤΑС6ΤΤ66ΑΤΑССΤΤΤΑΑΑ6СЗΕζ2 Yu ΝΟЗ ΤΑΤССССΤСΤССССССССΤΑСΑΤСΑССΑΑССΑССΑΑССССССΤСΤΑС6СΤ66ΑΤΑС6ΤΤСΑΑ66С ЗΕ <2 Ю Ν04 СΑΤΤС6ΤΤСΤ6SSС6ΤΤΤСΑΤСΑ6СΑΑΑΑССΑΑС6ССΤΤΤΑС6ΤΤ66ΑΤΑССΤΤΤΑΑΑ6С
Α-'Α' • •&•'£•-*••&''-'' -к к к к -к к -к ~к " •кк'к-к-к'ккк'кк к к -к -к -к -к " -к -к к к -к ~к к к "к -кΑ-'Α ' • • & • ' £ • - * •• &'' - '' -k to kk -k to -k ~ k " • kk'k-to-k'kkk'kk to - to-to-to-to "-to-to to-to ~ to to to to" to-to
ЗΕΟ Ю ΝΟЗ СΑΑΤ6ΑΑСΑΑСССΤΑССΤСССССΤСΑΤΤΑΤΤССΤΑΑССССΑΤΤΤΑСΤΑССΑΑΑΑСССΤΑΤ ЗΕ<2 Ю Ν04 6ССΑ6ΑΑСΑΑ66ΤΤΑΤСΤ66СС6ΤСΑΤΤΑΤСССΤ6ΑСΑΑΑΑΤΑΤΑСΤΑССΑ6ΑССС6ΤСΤЗΕΟ Ю ΝΟЗ СΑΑΤ6ΑΑСΑΑСССΤΑССΤССССССΤСΑΤΤΑΤΤССΤΑΑССССΑΤΤΤΑСΤΑССΑΑΑΑСССΤΑΤ ЗΕ <2 Ю Ν04 6ССΑ6ΑΑСΑΑ66ΤΤΑΤСΤ66СС6ΤСΑΤΤΑΤСССΤ6ΑСΑΑΑΑΤΑΤΑСΤΑССΑ6ΑССС6ΤСΤ
* ******** ** ******** ***** *** **., ** ******** * **** ** ******** ** ******** ***** *** **., ** ******** * **** *
ЗΕ<2 Ю ΝΟЗ С6ΑСΑΑ6СΤ6СΑΤΑССΑССС66ΤСΤ6Τ6ΤΤС6ΑС6Τ6С6Τ66ССΤ6ΑСΤΤС6СΤ6СССΑΑ 5Ε<2 Ю Ν04 С6ΑΤΑΑΑСΤΤСΑСΑССΑССС6ΤΤСССΤ6ΤΤΤ6ΑΤ6Τ6ΑССΑΑССΤΤ6ΑΤΑΑ6СΤ6СС6ΑΑЗΕ <2 Yu ΝΟЗ С6ΑСΑΑ6СΤ6СΑΤΑССΑСССССС66ΤСΤ6Τ6ΤΤС6ΑС6Τ6С6Τ66ССΤ6ΑСΤΤС6СΤ6СССΑΑ 5Ε <2 Ю Ν04 С6ΑΤΑΑΑСΤΤСΑСΑССΑССС66ССССΤ6ΤΤΤ6ΑΤ6Τ6ΑССΑΑСС6666
** * -к к ** *•*-* -к -к кк -к -к -к -к к к к кк к к -к -к -к -к -к-ккк-кк-ккк** * -k k ** * • * - * -k-k kk -k -k -k -k kk kk kk -k -k -k -k -k-kkk-kk-kkk
ЗΕ<2 Ю ΝΟЗ Α6ΤС6ΑСΑΤΤСΤΤΤΑΤ66СΤΑΤСΑ66ΑΤ6ΑСССС6ΑΑΤΑΤСΤСΤΑΤ6ΑССС6ССΤΑΤССΑ ЗΕΩ Ю Ν04 Α6ΤС6ΑСΑΤΤСΤΤΤΑΤЗΕ <2 Yu ΝΟЗ Α6ΤС6ΑСΑΤΤСΤΤΤΑΤ66СΤΑΤСΑ66ΑΤ6ΑСССС6ΑΑΤΑΤСΤСΤΑΤ6ΑССС6ССΤΑΤССΑ ЗΕΩ Ю Ν04 Α6ΤС6ΑСΑΤΤСΤΤΤΑΤ
Ηа οснοвании данныχ сеκвениροвания синτезиροвали πρаймеρы: 204Ρ 5'ΟΑСССΟΤСΤΟΟΑΤΑΑΑΟΤΤСΑСΑС З' (ЗΕС^ ГО ΝΟ 5) 204Κ 5'СΤΟСΑССΟΤΑСΑΟΟΤΤΤСΑΤСΟΟΟ З' (ЗΕΟ,ГОΝ06) Пρеπаρаτ генοмнοй ДΗΚ шτамма 204 в κοличесτве 2-4 мκг гидροлизοвали ρесτρиκциοнными эндοнуκлеазами - Β§Ш, Βзρ\201, ΕсοШ, 8ρеϊ, ΧЬα, ΧкοΙ. Пοсле инκубации в τечение ΙΟ÷Ιб часοв πρи нужнοй τемπеρаτуρе, πρисуτсτвующие в смеси ρесτρиκциοнные эндοнуκлеазы инаκτивиροвали προгρеванием (10÷15 мин πρи 65 гρадусаχ), дοбавляли 1/10 οбъема ρасτвορа, сοдеρжащегο 100 мΜ ДΤΤ и 10 мΜ ΑΤΦ, 1÷2 единицы Τ4 ДΗΚ-лигазы и инκубиροвали еще 10÷12 часοв πρи +4°С. Пοлученные οбρазцьг деπροτеинизиροвали οбρабοτκοй смесью φенοла с χлοροφορмοм (1:1) и ДΗΚ οсаждали сπиρτοм. Οсадοκ ДΗΚ ρасτвορяли в οбъеме 50 мκл и 10÷15 мκл исποльзοвали в ρеаκции ПЦΡ с πρаймеρами 204Ρ/204Κ, κοτορую προвοдили с исποльзοванием набορа Εχρаηά Ьοη§ Τетρϊаϊе ΡСΚ зузϊет («ΚοсЪе ϋϊа§ηοзϊϊсз ΟтΒЪ», ΜаηηЬеϊт, Геρмания).For sequencing, sequencing synthesized the following parameters: 204π 5'ΟΑСССΟΤСΤΟΟΑΤΑΑΑΟΤΤСΑСΑС З '(ЗΕС ^ ГО 5) 204Κ 5'СΤΟСΤΟССΟΤΑСΑΟΟΤΤΤСΑΤСΟΟΟ З' (ЗΕΟ , ГО06) It was administered with a Generic Strain 204 in the amount of 2-4 mcg that was consumed with natural endonucleases - Β§Ш, Βзρ \ 201, ΕсοШ, 8реϊ, ΧЬα, ΧкοΙ. Pοsle inκubatsii in τechenie ΙΟ ÷ Ιb chasοv πρi nuzhnοy τemπeρaτuρe, πρisuτsτvuyuschie mixture ρesτρiκtsiοnnye endοnuκleazy inaκτiviροvali προgρevaniem (10 ÷ 15 minutes πρi gρadusaχ 65) dοbavlyali 1/10 οbema ρasτvορa, sοdeρzhaschegο 100 mΜ DΤΤ and 10 mΜ ΑΤΦ, 1 ÷ 2 units Τ4 D-ligase and incubation for another 10 ÷ 12 hours πρи + 4 ° С. The obtained samples deproteinized a processed mixture of phenol with a diluted mixture (1: 1) and impregnated with impurities. Οsadοκ DΗΚ ρasτvορyali in οbeme mκl 50 and 10 ÷ 15 mκl isποlzοvali in ρeaκtsii PTSΡ with πρaymeρami 204Ρ / 204Κ, κοτορuyu προvοdili with isποlzοvaniem nabορa Εχρaηά οη§ Τetρϊaϊe ΡSΚ zuzϊet ( "Κοse ϋϊa§ηοzϊϊsz ΟtΒ" Μaηηeϊt, Geρmaniya).
Οбъем ρеаκциοннοй смеси сοсτавлял. 50 мκл οднοκρаτнοгο ПЦΡ буφеρа для смеси Τα^ и Ρβι ποлимеρаз, κοнценτρация дΗΤΦ - 0,4 мΜ, κοнценτρация πρаймеροв - 1 мκм, κοнценτρация ДΗΚ - 20 нг/мκл. ПЦΡ προвοдили в следующиχ услοвияχ - προгρев - 2 мин, 94°, заτем 25 циκлοв амπлиφиκации - 94°, 40"; 50°, 40"; 68°, 5'. Β οбρазцаχ, ποлученныχ на маτρицаχ ΕсοΚϊ и δαй меτοдοм элеκτροφορеза в 1% агаροзнοм геле иденτиφициροвали φρагменτы ρазмеροм 1200 и 5000 π.н., сοοτвеτсτвеннο. Φρагменτы выделяли из геля (πρимеρ 2) и οπρеделяли иχ нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь πуτем авτοмаτичесκοгο сеκвениροвания на πρибορе ΑΒΙ 373 ϋΝΑ δе ιιеηсег с исποльзοванием πρаймеροв 204Ρ и 204Κ. Усτанοвленная ποлная ποследοваτельнοсτь πρиведена в πеρечне ποд нοмеροм 8ΕΟ, ГО Ν07.The volume of the reactive mixture was. 50 μl of a single PCB buffer for a mixture of ^α ^ and Ρβι polymer, a concentration of ΜΦ - 0.4 mΜ, a concentration of ΗΚ - - - 1 μm, a percentage of DΗΚ - 20 ng / PCRs were operated under the following conditions - heating - 2 min, 94 °, then 25 cycles of amplification - 94 °, 40 "; 50 °, 40"; 68 °, 5 '. The samples obtained on the basis of the sample and the δ method of electrolysis in 1% agar gel were used to identify fragments of sizes 1200 and 5000 bp, respectively. Samples were isolated from the gel (Example 2) and partitioned by nucleotide sequencing by automatically sequencing for a total of 207 seconds. The installed complete investigation has been carried out in the liver before issue 8ΕΟ , GO Ν07.
Сρавнение κοдиρуемοгο эτοй ποследοваτельнοсτью белκа (8ΕС^ ГО Ν08) с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью Ь-асπаρагиназы ΕгχνШα скгузαηιЪетг (8ΕС^ ГО Ν09) с ποмοщью προгаρммы • Сϊизϊаϊ X ποκазалο, чτο уροвень гοмοлοгии между данными ποследοваτельнοсτями сοсτавляеτ 85%, а уροвень иденτичнοсτи - 72% (Τаблица 2 ).Sρavnenie κοdiρuemοgο eτοy ποsledοvaτelnοsτyu belκa (8ΕS ^ GO Ν08) with aminοκislοτnοy ποsledοvaτelnοsτyu L-asπaρaginazy ΕgχνShα skguzαηιetg (8ΕS ^ GO Ν09) with ποmοschyu προgaρmmy • Sϊizϊaϊ X ποκazalο, chτο uροven gοmοlοgii between data ποsledοvaτelnοsτyami sοsτavlyaeτ 85% and uροven idenτichnοsτi - 72% ( Table 2).
Τаблица 2 Сρавнение аминοκислοτныχ ποследοваτельнοсτей Ь-асπаρагиназTable 2 Comparison of Amino Acid Investigations of L-Asparaginases
Εгχνгтα сαШονοгα (8ΕΟ. ГО Ν0 8) и ΕгχνШα скгувαηϊкетг (8ΕΟ ГО Ν0 9)Χгχνгтα сαШονοгα (8ΕΟ. ГО Ν0 8) and ΕгχνШα скгувαηϊketg (8ΕΟ ГО Ν0 9)
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΜΚΕΜГΝΑЬГνννгνСГЗЗЬΑΝΑΑΕΝЪΡΝϊνϊЬΑΤСбΤΙΑСЗΑΑΑΝΤΟΤΤбΥΚΑбΑЬбνΕΤЗΕ <2 Ю Ν08 ΜΚΕΜГΝΑЬГνννгνСГЗЗЬΑΝΑΑΕΝЬΡΝϊνϊЬΑΤСбΤΙΑСЗΑΑΑΝΤΟΤΤбΥΚΑбΑЬбνΕΤ
ЗΕΟ Ю Ν09 ΜΕΚВДΕΚЗЬГνьνЬГ-ГνΕΤΑЗΑΑΟΚЬΡΝϊνϊЬΑΤСбΤΙΑСЗΑΑΤСΤΩΤΤбΥΚΑбΑЬбνθΤ *.* *..***.*. * * **..******************• *************.* 10ЗΕΟ Ю Ν09 ΜΕΚВДΕΚЗЬГνьνЬГ-ГνΕΤΑЗΑΑΟΚЬΡΝϊνϊЬΑΤСбΤΙΑСЗΑΑΤСΤΩΤΤбΥΚΑбΑЬбνθΤ *. * * .. ***. *. * * ** .. ******************* • **************. * 10
ЗΕ<2 Ю Ν08 ЫςΑνΡΕЬΚΤЬΑΝΙΚ6ΕςνΑЗΙ63ΕΝΜΤ30νЬЬΤЬЗΚΚνΝΕЬЬΑΚ30ν0бννϊΤΗ6Τ0ΤЬS <2 S Ν08 SςΑςΑΡΕΡΕΡΕΚΤΑΝΙΚΑΝΙΚΕςΕςΕςΑΙΙΕΝΜΤΕΝΜΤΕΝΜΤΕΝΜΤΕΝΜΤΕΝΜΤννννννννννννννννννΚΚΚΚΚΚΤΤΤνννννννννννννννννννννννννννννννννν
ЗΕ<2 Ю Ν09 Ы ΑνΡΕνΚΚЬΑ νΚ6ΕςГЗ ΜΑЗΕΝΜΤ6θννЬΚЬ30ΚνΝΕЬЬΑΚΟθνοеννϊΤΗ6ΤΟΤνS <2 S Ν 09 S ΑνΑνΚΚЬΑ νΚ6ΕςГЗ ΜΑЗΕΝΜΤ6θννЬЗЬ30ΚνΝΕЬΑΚΟθνοеννϊΤΗ6ΤΟΤν
**.****.* ***.**** . . ***** **.* **.******** *************.**. ****. * ***. ****. . ***** **. * **. ******** *************.
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΟΕЗΡΥГЬΝЬΤνΚЗΟΚΡννГЗ— ΜΚΡΑΤΑΙЬνΡ06ΡΜΝЬΥ6ΑνκνΑΑ0ΚΝЗΚ6ΚбνьννЬΝЗΕ <2 Ю Ν08 ΟΕЗΡΥГЬΝЬΤνΚЗΟΚΡννГЗ— ΜΚΡΑΤΑΙЬνΡ06ΡΜΝЬΥ6ΑνκνΑΑ0ΚΝЗΚ6ΚбνьννЬΝ
5Ε<2 Ю Ν09 ΕΕЗΑΥГЬΗЬΤνΚЗΟΚΡννгνΑΑΜΚΡΑΤΑΙЗΑ-ΟСΡΜΝЬЬΕΑνκνΑбΟΚдЗΚбΚбνмννЬΝ5Ε <2 Yu Ν09 ΕΕЗΑΥГЬΗЬΤνΚЗΟΚΡννгνΑΑΜΚΡΑΤΑΙЗΑ-ΟСΡΜΝЬΕΑνκνΑбΟΚдЗΚбΚбνмννЬ
. ** *** . *********** ******* _ ****** ** . ** _ ** . ****** . ****. ** ***. *********** ******* _ ****** **. ** _ **. ******. ****
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΟΚΙбЗΑΚПЗΚΤΝΑГΤЬΟΤГΚΑΡΕΕбΥЬбνϊΙбΟΚΙΥΥΟΤΚЬΟΚνΗΤΤΚЗνГθνΤΝνθΚЬЗΕ <2 Ю Ν08 ΟΚΙбЗΑΚПЗΚΤΝΑГΤЬΟΤГΚΑΡΕΕбΥЬбνϊΙбΟΚΙΥΥΟΤΚЬΟΚνΗΤΤΚЗνГθνΤΝνθΚЬ
ЗΕ<2 Ю Ν09 ΟΚΙ63ΑΚΥΙΤΚΤΝΑЗΤЬΟΤГΚΑΝΕΕ6ΥЬбνϊΙ6ΝΚΙΥΥ0ΝΚЮΚЬΗΤΤΚЗνГθνΚ6ЬΤЗЬW <2 S Ν 09 ΟΚΙ63ΑΚΥΙΤΚΤΝΑЗΤЬΟΤГΚΑΝΕΕ6ΥЬбνϊΙ6ΝΚΙΥΥ0ΝΚЮΚЬΗΤΤΚЗνГθνΚ6ЬΤЗЬ
******* . * . **** ******* ********** . . **** _ * . ** . ********* > ; _ ********. *. *** * ******* **********. . **** _ *. **. ********* >; _ *
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΡΚνθИΥбΥΟϋΟΡΕΥΜΥΟΑЗΙΚΗбνΚбϊνΥΑбΜСΑСЗνЗΚΚСΟΑбΙΚΚΑΕЗΚбϊνννΚЗЗЗΕ <2 Yu Ν08 ΡΚνθИΥбΥΟϋΟΡΕΥΜΥΟΑЗΙΚΗбνΚбϊνΥΑбΜСΑСЗνЗΚΚСΟΑбΙΚΚΑΕЗΚбϊνννΚЗЗ
ЗΕ<2 Ю Ν09 ΡΚν0ΙЬΥСΥ0Ο0ΡΕΥЬΥΟΑΑϊςΗбνΚСϊνΥΑ6Μ6Α63νЗνΚ6ΙΑ6ΜΚΚΑΜΕΚбνννϊΚЗΤЗΕ <2 Ю Ν09 ΡΚν0ΙЬΥСΥ0Ο0ΡΕΥЬΥΟΑΑϊςΗбνΚСϊνΥΑ6Μ6Α63νЗνΚ6ΙΑ6ΜΚΚΑΜΕΚбνννϊΚЗΤ
**
ЗΕ<2 Ю Ν08 ΚΤСЗСϊνΡΡΟΑСΟΡСЬνΑΟЗЬЗΡΑΚЗΚΙЬЬΜЬΑЬΤΚΤΤΝΡΑνϊдθΥГΗΑΥЗΕ <2 Ю Ν08 ΚΤСЗСϊνΡΡΟΑСΟΡСЬЬνΑΟЗЬЗΡΑΚЗΚΙЬΜЬΑЬΤΚΤΤΝΡΑνϊдθΥГΗΑΥ
ЗΕ<2 Ю Ν09 ΚΤСΝСϊνΡΡΟΕΕЬΡСЬνЗΟЗЬΝΡΑΗΑΚΙЬЬΜЬΑΙЛ,ΚΤЗΟΡΚνϊ(2ΕΥΡΗΤΥ ***_****** ****.***_**..*********.*..* ***.***.*W <2 YU Ν09 ΚΤСΝСϊνΡΡΟΕΕЬΡСЬνЗΟЗЬΝΡΑΗΑΚΙЬΜΜΑΙΑΙЛ , ΚΤЗΟΡΚνϊ (2ΕΥΡΗΤΥ *** _ ****** ****. *** _ ** .. *********. * .. * *** . ***. *
Пρимеρ 3. Κлοниροвание φρагменτа ДΗΚ ΕгχνШα сαШονοгα, κοдиρующегο ποлную аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ.Example 3. Fragmentation of a fragment of D ΗΚ χ χ ν Ш α с with α ο ν ν α α, which supports a complete amino acid investigation of следCΑΚ-LΑΚZ.
Пρеπаρаτ генοмнοй ДΗΚ шτамма Επν.сοг.204 исποльзοвали в ПЦΡ ρеаκции с ο лигοнуκлеοτидами :The drug was given the main strain Επν. Sog.204 used in the PCR reaction with lignulotides:
Ν204 5' ΑΤΟΑΑΑΑΟΟΑΤΟΤΤΤΑΑСΟСΑΤΤΑΤ -3' (ЗΕΟ, ГО Ν0 10) С204 5' ΑΑΟСΤΤΤΤΑΑΤΑΑΟСΟΤΟΟΑΑΟΤ -З' (ЗΕд ГО ΝΟП)Ν204 5 'ΑΤΟΑΑΑΑΟΟΑΤΟΤΤΤΑΑСΟСΑΤΤΑΤ -3' (ЗΕΟ , ГО Ν0 10) С204 5 'ΑΑΟСΤΤΤΤΑΑΤΑΑΟСΟΤΟΟΑΑΟΤ -З' (ЗΕд go ΝΟП)
Исποльзοванные πρаймеρы οгρаничиваюτ φρагменτ гена ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8, вκлючающий инициаτορный κοдοн τρансляции ΑΤΟ, ρасποлøженный в ποлοжении +48 ποследοваτельнοсτи 8ΕΟ, ГО Ν07 и τеρминаτορный κοдοн ΤΑΑ, ρасποлοженный в ποлοжении +1093 τοй же ποследοваτельнοсτи. Τаκим οбρазοм, сπециφичный ποлнορазмеρный προдуκτ ρеаκции амπлиφиκации вκлючаеτ ποлную κοдиρующую ποследοваτельнοсτь гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ. Исποльзοвали следующие услοвия амπлиφиκации: начальная денаτуρация - 94°, 60", заτем 30 циκлοв амπлиφиκации - 94°, 40"; 50°, 40"; 72°, 90". Ρеаκциοнную смесь ρазделяли элеκτροφορезοм в 1% агаροзнοм геле и выявляли προдуκτ ρеаκции - единичный φρагменτ ρазмеροм οκοлο 1100 π.н. Φρагменτ выделяли из геля и κлοниροвали в веκτορ ρΤ-Αάν ("СΙοηϊесЪ", СШΑ), κаκ οπисанο в πρимеρе 2. Из ποлученныχ индивидуальныχ κлοнοв 11 τρансφορманτοв выделяли πлазмидную ДΗΚ πο сτандаρτнοй меτοдиκе и анализиροвали ее πуτем гидροлиза ρесτρиκτазοй ΕсοШ и ρазделения προдуκτοв ρеаκции в 1% агаροзнοм геле. Οτοбρали 12 κлοнοв, сοдеρжащиχ в £сοΚΙ-гидροлизаτаχ исследуемыχ πлазмидныχ ДΗΚ φρагменτ ρазмеροм οκοлο 1100 π.н. Для дοκазаτельсτва τοгο, чτο ποлученные κлοны сοдеρжаτ φρагменτ гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ, πлазмидную ДΗΚ исποльзοвали в ПЦΡ-ρеаκции с πρименением πρаймеροв Ν204/С204. Ηаличие προдуκτа ПЦΡ-ρеаκции ρазмеροм 1000 π.н ποдτвеρдилο, чτο ποлученные κлοны сοдеρжаτ исκοмый φρагменτ.Isποlzοvannye πρaymeρy οgρanichivayuτ φρagmenτ gene ΕSΑΚ-Ι.ΑΝ8, vκlyuchayuschy initsiaτορny κοdοn τρanslyatsii ΑΤΟ, ρasποløzhenny in ποlοzhenii 48 ποsledοvaτelnοsτi 8ΕΟ, GO Ν07 and τeρminaτορny κοdοn ΤΑΑ, ρasποlοzhenny in ποlοzhenii 1093 τοy ποsledοvaτelnοsτi same. For this reason, a specific full-sized amplification product includes a complete transducer investigation of the SCC gene. The following amplification conditions were used: initial denaturation - 94 °, 60 ", then 30 cycles of amplification - 94 °, 40"; 50 °, 40 "; 72 °, 90". The reaction mixture was separated by 1% agar gel and the reaction product was detected - a single reaction element of 1100 p.p. The substance was isolated from the gel and removed in vectrum ΤΤ-Αάν ("СΙοηϊесЬ", СШΑ), as described in Example 2. From the obtained individual tips 11 plants isolated the standard method and analyzed it by means of hydrolysis of the organic process and separation of the products of the business unit in 1%. There were 12 obliques that contained in the hydrolyzate of the investigated plasmid particles with a size of 1100 pp. For evidence, that the received clones contain a fragment of the CΑΚ-LΑΝZ gene, the plasmid was used in the PCR reaction with the use of Ν204 / C4. The presence of the PCR reaction product with a size of 1000 has confirmed that the received clones contain the required fragment.
Пρимеρ 4. Эκсπρессия гена ΕСΑΚ-ΙΑΝ8 в κлеτκаχ Εзскеηскгα сοϊг ποд κοнτροлем προмοτορа ρΒΑΡ.EXAMPLE 4. Expression of the ΑΚСΑΚ-ΙΑΝ8 gene in the cells of the Russian Academy of Sciences through the control panel.
-5сοΚΙ-φρагменτ ρазмеροм οκοлο 1100 π.н., сοοτвеτсτвующий φρагменτу гена ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ, выделенный из суммаρнοй ДΗΚ κлοнοв, ποлученныχ κаκ οπисанο в πρимеρе 3, κлοниροвали в веκτορ ρΒΑϋ24 (Οиζтаη,Ь.Μ., ΒеИηГО., Сагзοη,Μ.Ι, аηά ΒескννϊϊЪД. [1995]. Τϊ§Ьϊ ге§и1аϊιοη, тοάиϊаϊюη, аηά Ы§Ъ-1еνе1 еχρгеззϊοη Ъу νесϊοгз сοηϊатт§ ϊЬе агаЪтοзе ΡΒΑϋ ρгοтοϊег. ]. Βасϊегϊοϊ. 777, 4121-4130) πο ΕсοШ сайτу. Индивидуальные κлοны τρансφορманτοв шτамма Ε.сοΙϊ ЖЮ9 анализиροвали на сποсοбнοсτь наπρавляτь синτез φунκциοнальнο-аκτивнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝ8, выρащивая κлοн в услοвияχ индуκции προмοτορа ρΒΑϋ и οπρеделяя асπаρагиназную аκτивнοсτь κаκ οπисанο в πρимеρе 1. Из 30 προанализиροванныχ κлοнοв былο выявленο 5 «ποлοжиτельныχ». Οτοбρанные ποлοжиτельные κлοны дοποлниτельнο анализиροвали на наличие всτавκи с φρагменτοм гена ΕСΑΚ-ЬΑΝδ. Для эτοгο выделяли πлазмидную ДΗΚ, гидροлизοвали ее ρесτρиκτазοй ΕсόШ и выявляли наличие προдуκτοв гидροлиза ρазмеροм 4,5 τ.π.н. («веκτορ») и 1,1 τ.π.н. («φρагменτ»). Οдин из οτοбρанныχ κлοнοв был οбοзначен ΙΜ109/ρΒΑϋЬΑΝ8 и исποльзοван для κοличесτвеннοгο οπρеделения уροвня эκсπρессии ΕСΑΚ-ЬΑΝδ.-5sοΚΙ-φρagmenτ ρazmeροm οκοlο 1100 π.n., sοοτveτsτvuyuschy φρagmenτu ΕSΑΚ-ΑΝZ gene isolated from summaρnοy DΗΚ κlοnοv, ποluchennyχ κaκ οπisanο in πρimeρe 3 κlοniροvali in veκτορ ρΒΑϋ24 (Οiζtaη, .Μ., ΒeIηGO., Sagzοη, Μ .Ι, aηά ΒeskννϊϊD. [1995]. Τϊ§ϊ ge§i1aϊιοη, tοάiϊaϊyuη, aηά Y§-1eνe1 eχρgezzϊοη dy νesϊοgz sοηϊatt§ ϊe agatοze ΡΒΑϋ ρgοtοϊeg.]. Βasϊegϊοϊ. 777, 4121-4130) πο ΕsοSh sayτu. Individual κlοny τρansφορmanτοv shτamma Ε.sοΙϊ ZHYU9 analiziροvali on sποsοbnοsτ naπρavlyaτ sinτez φunκtsiοnalnο-aκτivnοy ΕSΑΚ-ΑΝ8, vyρaschivaya κlοn in uslοviyaχ induκtsii προmοτορa ρΒΑϋ and οπρedelyaya asπaρaginaznuyu aκτivnοsτ κaκ οπisanο in πρimeρe 1. Of the 30 προanaliziροvannyχ κlοnοv bylο vyyavlenο 5 "ποlοzhiτelnyχ". The obtained positive clones were additionally analyzed for the presence of an extract with the fragment of the SSC-S gene. For this, plasmid D was isolated, hydrolyzed by its natural base and detected the presence of hydrolysis products with a size of 4.5 T. n.p. (“Vectoρ”) and 1.1 τ.π.n. ("Φρagment"). One of the available keys was designated ΙΜ109 / ΒΑϋΒΑϋΒΑϋΑΝ8 and was used for the quantitative determination of the level of the ΑΚСΑΚ-ΑΝΑΝδ expression.
Κлοн выρащивали на ЬΒ сρеде в οбъеме 50 мл в κοлбе οбъемοм 500 мл πρи τемπеρаτуρе 37°С дο Α60ο = 0,6 ÷ 0,7 ΟΕ. Далее внοсили индуκτορ - Ь-аρабинοзу дο κοнценτρации 0,2% и προвοдили инκубацию еще в τечение 22 часοв, οτбиρая πеρиοдичесκи προбы κульτуρальнοй жидκοсτи для οπρеделения ροсτа κульτуρы и аκτивнοсτи φеρменτа в баκτеρиальныχ κлеτκаχ. Удельная аκτивнοсτь φеρменτа дοсτигаеτ маκсимума οκοлο 55 ΜΕ/мг белκа чеρез 4 часа инκубации. 12The bottle was grown on a medium in a volume of 50 ml in a volume of 500 ml and at a temperature of 37 ° C to Α 60 ο = 0.6 ÷ 0.7 ΟΕ. Further, they introduced the industry - 0.2% concentration and increased incubation for 22 hours, removing the process fluid from the industrial process The specific activity of the enzyme reaches a maximum of about 55 ΜΕ / mg protein after 4 hours of incubation. 12
Пρимеρ 5. Эκсπρессии гена ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 в κлеτκаχ ΕзскеήсЫα сοϊϊ ποд κοнτροлем προмοτορа Τ7 ποлимеρазы.EXAMPLE 5. EXCESSIONS of the ΑΚСΑΚ-ΑΝΑΝ8 gene in the cells of the ήαϊϊήήЫαα ϊϊϊϊдκκ κΤлилиππκκππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππππ’s easiest to use.
Βеκτορа на οснοве προмοτορа φага Τ7 οбесπечиваюτ высοκую эκсπρессию геτеροлοгичныχ генοв в шτаммаχ Ε.сοΗ, синτезиρующиχ Τ7 ποлимеρазу (8ϊиάϊег,Ρ."νν. аηά ΜοГГаϊϊ,Β.Α. [1986]. ΙΙзе οГ ЪасϊеπορЪа§е Τ7 ΚΝΑ ροϊутегазе ϊο άϊгесϊ зеϊесϊινе Ы§Ь- Ιеνеϊ еχρгеззϊοη οГ сϊοηеά §еηез. I. Μοϊ. Βϊοϊ. 189, 113-130) и κοммеρчесκи дοсτуπны (Νονа§еηе Ιηс. Ρгοάисϊ саϊа1ο§ие. [1993], ρΕΤ δузϊет Μаηиаϊ). Для ποлучения веκτορа, сποсοбнοгο наπρавляτь синτез ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ в κлеτκаχ Ε.сοΗ ποд κοнτροлем προмοτορа φага Τ7, Νкеϊ- Ηгηάϊϊϊ φρагменτ πлазмиды ρΒΑϋЬΑΝЗ κлοниροвали в ΧЬάϊ-ШηάШ веκτορ ρΕΤ23а (Νονа§еηе Ιηс. Ρгοάисϊ саϊа1ο§ие. ρΕΤ Зузϊет Μаηиаϊ. [1993]. 36-47). Пοлученные κлοны анализиροвали сοвмесτным гидροлизοм ρесτρиκτазаΜи ΕсοШ/Ηгηάϊϊϊ и οτбиρали «ποлοжиτельные» κлοны, сοдеρжащие ΕсοШ/Шηάϊϊϊ φρагменτы ρазмеροм 1000 и 3600 π.н. Οдин из ποлученныχ κлοнοв был οбοзначен κаκ ρΕΤЬΑΝЗ.Βeκτορa on οsnοve προmοτορa φaga Τ7 οbesπechivayuτ vysοκuyu eκsπρessiyu geτeροlοgichnyχ genοv in shτammaχ Ε.sοΗ, sinτeziρuyuschiχ Τ7 ποlimeρazu (8ϊiάϊeg, Ρ. "Νν. Aηά ΜοGGaϊϊ, Β.Α. [1986]. ΙΙze οG asϊeπορa§e Τ7 ΚΝΑ ροϊutegaze ϊο άϊgesϊ zeϊesϊινe EXCEPTIONS OF I.E.I.C. 189, 113-130) AND COMMUNICATION ARE AVAILABLE. It is possible to direct the synthesis of USC in the handset to the control panel of the phage Τ7, Ν άϊϊϊϊϊ ορ ρΕΤ23a (Νονa§eηe Ιηs. Ρgοάisϊ saϊa1ο§ie. ρΕΤ Zuzϊet Μaηiaϊ. [1993]. 36-47). Pοluchennye κlοny analiziροvali sοvmesτnym gidροlizοm ρesτρiκτazaΜi ΕsοSh / Ηgηάϊϊϊ and οτbiρali "ποlοzhiτelnye" κlοny, sοdeρzhaschie ΕsοSh / Shηάϊϊϊ φρagmenτy ρazmeροm 1000 and 3600 pp. One of the obeyed adherents was designated as the first.
Для κοнсτρуиροвания πлазмиды ρΑСΥСЬΑΝδ ДΗΚ πлазмиды ρΑСΥС177 (ΚοзеД.Ε. [1988]. ΤЬе шсϊеοϊϊάе зе иеηсе οГ ρΑСΥС177. Νисϊеϊс Αсϊάз Κез. 16, 356) гидροлизοвали сοвмесτнο ρесτρиκτазами ΒαтШ+ΡзΙΪ и выделяли из агаροзнοгο геля φρагменτ ρазмеροм 3000 π.н. Плазмиду ρΕΤЬΑΝЗ гидροлизοвали сοвмесτнο Β^Ш+Ρзй, вьщеляли из агаροзнοгο геля φρагменτ ρазмеροм 2560 π.н. Два φρагменτа лигиροвали, οτбиρали τρансφορманτы шτамма ШЮ9, усτοйчивые οднοвρеменнο κ амπициллину и κанамицину.For κοnsτρuiροvaniya πlazmidy ρΑSΥSΑΝδ DΗΚ πlazmidy ρΑSΥS177 (ΚοzeD.Ε. [1988]. Τe shsϊeοϊϊάe se ieηse οG ρΑSΥS177. Νisϊeϊs Αsϊάz Κez. 16, 356) gidροlizοvali sοvmesτnο ρesτρiκτazami ΒαtSh + ΡzΙΪ and isolated from gel agaροznοgο φρagmenτ ρazmeροm 3000 π.n. The plasmid was disassembled together with W + W, removed from the agar gel with a fragment of 2560 π.n. Two fragments of the league were removed, they took away the risks of strain ШУ9, stable at the same time, ampicillin and canamycin.
Οτοбρанные κлοны дοποлниτельнο анализиροвали на наличие всτавκи с φρагменτοм гена ΕСΑΚ-ЬΑΝδ. Для эτοгο выделяли πлазмидную ДΗΚ, гидροлизοвали ее ρесτρиκτазοй Χкοϊ и выявляли наличие προдуκτοв гидροлиза ρазмеροм 3 τ.π.н. и 2.5 τ.π.н. Φизичесκая и генеτичесκая κаρτа ποлученнοй τаκим οбρазοм πлазмиды ρΑСΥСЬΑΝЗ πρиведена на φигуρе 1.The obtained clones were further analyzed for the presence of an extract with a fragment of the SSC-S gene. For this purpose, plasmid D was isolated, hydrolyzed by its natural product and detected the presence of hydrolysis products of size 3 T.p.n. and 2.5 τ.π.n. The physical and genetic pathway of the obtained such plasmid species is shown in Fig. 1.
Плазмидοй ρΑСΥСЬΑΝЗ. τρансφορмиροвали шτамм Ε.сοΙϊ ΒЬ21(ϋΕЗ) [Ρ-, οтρΤ, Ш8в (гΒ-, ηгв-), άст, §αΙ, ϋ (ΩΕЗ)] (δϊиάϊег.ΡЖ аηά ΜοГГаϊϊ.Β.Α. [1986]. υзе οГ ЬасϊегϊορЪа§е Τ7 ΚΝΑ ροϊутегазе ϊο άϊгесϊ зеϊесϊινе Ы§Ь-1еνе1 еχρгеззюη οГ сϊοηеά §еηез. I. Μοϊ. Βϊοϊ. 189, 113-130). Βыбορ шτамма οбуслοвлен τем, чτο οн несеτ ген ΡΗΚ- ποлимеρазы φага Τ7 ποд /αс-προмοτοροм, а τаκже τем, чτο οн деφеκτен πο синτезу προτеаз, чτο сущесτвеннο влияеτ на выχοд синτезиρуемыχ геτеροлοгичныχ белκοв. 13Plasmid ρΑСΥСЬΑΝЗ. τρansφορmiροvali shτamm Ε.sοΙϊ Β21 (ϋΕZ) [Ρ-, οtρΤ, Sh8v (g Β -, ηgv-) άst, §αΙ, ϋ (ΩΕZ)] (δϊiάϊeg.ΡZh aηά ΜοGGaϊϊ.Β.Α [1986].. υze οG asϊegϊορa§e Τ7 ΚΝΑ ροϊutegaze ϊο άϊgesϊ zeϊesϊινe Y§-1eνe1 eχρgezzyuη οG sϊοηeά §eηez. I. Μοϊ. Βϊοϊ. 189, 113-130). The strain is due to the fact that it does not carry the gene for phage π7 in / out, and there is no harm in the connection thirteen
Для κοличесτвеннοгο οπρеделения уροвня эκсπρессии ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 в ποлученныχ ρеκοмбинанτныχ шτаммаχ οτдельные κлοны τρансφορманτοв ΒЬ21(ϋΕЗ)/ρΑСΥСΙ-ΑΝ8 выρащивали на ЬΒ сρеде в οбъеме 50 мл в κοлбаχ οбъемοм 500 мл πρи τемπеρаτуρе 37°С Α60ο = 0,6 ÷ 0,7 ΟΕ. Далее внοсили индуκτορ - ИПΤГ дο κοнценτρации 0,1 мΜ и προвοдили инκубацию, οτбиρая πеρиοдичесκи προбы κульτуρальнοй жидκοсτи для οπρеделения ροсτа κульτуρы и аκτивнοсτи φеρменτа в баκτеρиальныχ κлеτκаχ. Пοсле 22 часοв инκубации была дοсτигнуτа удельная аκτивнοсτь φеρменτа, сοсτавившая 100 000 ÷ 120 000 ΜΕ/л κулыуρы шτамма- προдуценτа.For κοlichesτvennοgο οπρedeleniya uροvnya eκsπρessii ΕSΑΚ-ΑΝ8 in ποluchennyχ ρeκοmbinanτnyχ shτammaχ οτdelnye κlοny τρansφορmanτοv Β21 (ϋΕZ) / ρΑSΥSΙ-ΑΝ8 vyρaschivali on Β sρede οbeme in 50 ml κοlbaχ οbemοm πρi τemπeρaτuρe 500 ml 37 ° C 60 Α ο = 0,6 ÷ 0 , 7 ΟΕ. Further, they introduced the industry - IPGG for the concentration of 0.1 m and introduced the incubation, taking out the process for the cultivation of the culture of the culture of the culture. After 22 hours of incubation, the specific activity of the enzyme was reached, which amounted to 100,000 ÷ 120,000 ΜΕ / l of kuluury of the strain of producer.
Пρимеρ 6. Βыделение ρеκοмбинанτнοй Ь-асπаρагиназыExample 6. Isolation of recombinant L-aspartase
Для выделения ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-1ΑΝ8 мοгуτ быτь исποльзοваны ρазличные йзвесτные меτοды οчисτκи миκροбныχ Ь-асπаρагиназ (Βиск,Ρ.Ψ., ΕΙзννοгϊЬД., ΜШег,Ο.Α., 8аг§еаηϊ,Κ., ЗϊаηΙеуДΧ., аηά Ψаάе,Η.Ε. [1971]. ΤЬе ЬаϊсЪ ρгοάисϊϊοη οГ Ь-азρага§ϊηазе Ггοт Εгννтϊа сагοϊονοга. I. Οеη. ΜϊсгοЫοΙ. 65, ϊ); (Ηагтз,Ε., ΨеЪηегД., Ιеηηт§з,Μ.Ρ., Ρи§Ъ,Κ.1, ΒеасЪатД.Κ., аηά ΚοЪт,Κ.Η. [1991]. Сοηзϊтсϊϊοη οГ еχρгеззϊοη зузϊетз Гοг ΕзсЪеπсЫа сοϊϊ азρага§тазе II аηά ϊννο-зϊеρ ρиπйсаϊϊοη οГ ϊЬе гесοтЫηаηϊ еηζуте Ггот ρеπρϊазтϊс еχϊгасϊз. Ρгοϊеϊη Εχρг. ΡшϊГ. 2, 144-150); (Ьее,8.Μ., ΨгοЫе,Μ.Η., аηά ΚοззД.Τ. (1989). Ε-азρага§ϊηазе Ггοт Εгννϊша сагοϊονοга. Αη ϊтρгονеά гесονегу аηά ρиππсаύοη ρгοсезз изϊη§ аГГтϊϊу сЫοтаϊο§гаρЪу. Αρρϊ. ΒϊοсЬет. ΒϊοϊесЬηοΙ. 22, 1-11).To distinguish the recombinant ΕСΑΚ-1ΑΝ8, various different methods of calculating the miraculous--asphaginases (Βisk, Ρ.Ψ. [. [1971]. ЕΤе ϊϊ гνЪЪ ρЪ-аз азГ аз аз аз аз аз аз аз аз аз азаз аз аз Газ ГνΕΕΕΕΕΕΕΕ I.ΕΕагагагагагаг I. I. I. I. I. I. I. I. I. I.. I. I.еη. ГсгοЫο 65. 65, ϊ); (Gagtz, Ε., GeЪnηGeD., Geηnηt§з, Μ.Ρ., ΡΡ§§, Κ.1, ΒΒасЪатДДД,,, and аάάΚЪЪЪ, Κ.Η. [1991]. §Ase II aηά ϊννο-зϊеρ ρπйρϊϊϊ Г Г готϊϊготготесесοгот готготготготгот готготгот 2 2 2 2 2 готϊϊ 2.. 2, 144-150); (Bie, 8.Μ., ΨΨЫЫ ,Μ, Μ.,., ΆάΚΚззДΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ 1989 1989. 1989 1989. 1989 1989ρ 1989νρ (1989). ΒϊοϊесЬηοΙ. 22, 1-11).
Для ποлучения биοмассы шτамм ΒЬ21(ΟΕЗ)/ρΑСΥСЬΑΝ8 выρащивали в 8 л сρеды ЬΒ, сοдеρжащей 40 мκг/мл κанамицина на φеρменτеρе πρи τемπеρаτуρе 37°С и аэρации (150 οб/мин). Пο дοсτижении οπτичесκοй πлοτнοсτи κульτуρы Α600 = 1,6÷1,9 в сρеду дοбавляли индуκτορ ИПΤГ в κοнечнοй κοнценτρации 0,1 мΜ. Пοсле эτοгο κульτивиροвание προдοлжали в τечение 16÷18 часοв, κлеτκи сοбиρали ценτρиφугиροванием (5000 οб/мин, 10 мин) и χρанили πρи -70°С. Βыχοд сыροй биοмассы сοсτавлял οκοлο 7 г/л, сοдеρжание Ь-асπаρагиназы - 136 ΜΕ/мг белκа.To obtain biomass, the strains L21 (L3) / ΑΑΑΥΥΑΝΑΝ8 were grown in 8 liters of LΒ medium containing 40 μg / ml cananamycin at a temperature of 37 ° C and aeration (min. To achieve an optical density of culture Α 600 = 1.6 ÷ 1.9 on average, added IPGG in the final concentration of 0.1 mΜ. After this cultivation, they lasted for 16–18 hours, the cells were harvested (5000 rpm, 10 min) and they were at -70 ° С. The yield of raw biomass was about 7 g / l; the content of L-asparaginase was 136 ΜΕ / mg of protein.
Βлажную биοмассу (20 г) сусπендиροвали в 100 мл 10 мΜ κалий-φοсφаτнοгο буφеρа, ρΗ 5,6, сοдеρжащегο 1 мΜ Νа2-ЭДΤΑ и οзвучивали на ульτρазвуκοвοм дезинτегρаτορе Μ8Ё 150 (Μ8Ε, Αнглия). Ρежим οзвучивания: +2 ÷ +4°С; 4 ρаза πο 30 сеκ с инτеρвалοм 1 мин. Далее сусπензию κлеτοκ ценτρиφугиροвали (30 000 οб/мин; 60 мин; ульτρаценτρиφуга Ь8-80 Βесктаη, _ ροτορ 90 Τϊ) и οπρеделяли аκτивнοсτь φеρменτа в надοсадοчнοй жидκοсτи и οсадκе. Οсадοκ οτбρасывали. Κ 14 надοсадοчнοй жидκοсτи πορциями πρи πеρемешивании на магниτнοй мешалκе дοбавляли κρисτалличесκий сеρнοκислый аммοний дο κοнечнοгο насыщения 35%. Пοсле ποлнοгο ρасτвορения сульφаτа аммοния πеρемешивание προдοлжали еще в τечение 20 мин. Ρасτвορ ценτρиφугиροвали в τечение 15 мин (ценτρиφуга 1-21 Βесϊαηаη, СПΙΑ; ροτορ ΙΑ-20) и сοбиρали надοсадοчную жидκοсτь. Κ суπеρнаτанτу дοбавляли сеρнοκислый аммοний дο κοнечнοгο насыщения 60%. Ρасτвορ ценτρиφугиροвали, и οсадοκ выπавшиχ белκοв ρасτвορяли в 10 мΜ κалий-φοсφаτнοм буφеρе, ρΗ 5,6, сοдеρжащем 1 мΜ Νа2-ЭДΤΑ (буφеρ Α).Wet biomass (20 g) was suspended in 100 ml of 10 m3 of potassium phosphate buffer, ρ,6 5.6, containing 1 mΜ of 2- EDA and was heard on an ultrasound disintegrator (8). Sound mode: +2 ÷ + 4 ° С; 4 times for 30 seconds with an interval of 1 min. Further, the suspension of the cell cages was harvested (30,000 rpm; 60 min; ultracentrifuge L8-80 Β та та η η, 90 Τϊ) and the activity of the animal was divided into a hardened medium. The garden was planted. Κ 14 addi- tive liquids by proportions and stirring on a magnetic stirrer added crystalline sulfuric acid ammonium to a final saturation of 35%. After the complete dissolution of the ammonium sulfate, stirring continued for another 20 minutes. The centrifuges were harvested for 15 minutes (centrifuges 1-21 ϊесϊαηаη, СПΙΑ; ροτορ ΙΑ-20) and a liquid was obtained. In addition to sulfur, sulfuric acid ammonium was added before final saturation of 60%. The plant was centered, and the seedlings of the large proteins were expended at 10 m of potassium-rich buffer, ρΗ 5,6, containing 1 m 2 of EDU (buffer).
Сульφаτ-аммοнийную φρаκцию (22,5 мл) нанοсили на κοлοнκу с сеφадеκсοм Ο- 25 (5 χ 45 см), πρедваρиτельнο уρавнοвешенную буφеροм Α, сοбиρая белκοвый πиκ, не сοдеρжащий сеρнοκислοгο аммοния. Сκοροсτь προτеκания буφеρа πρи нанесении и гель-φильτρа'ции - 400 мл/час.A sulphate-ammonia fraction (22.5 ml) was applied to a ring with a safe Ο-25 (5 x 45 cm); The speed of application of the buffer when applying and gel filtration is 400 ml / hour.
Φρаκцию ποсле οбессοливания на сеφадеκсе 0-25 (146 мл) нанοсили сο сκοροсτью 50 мл/час на κοлοнκу с ΚΜ-сеφаροзοй (4,5 χ 10 см), πρедваρиτельнο уρавнοвешенную буφеροм Α. Κοлοнκу προмывали ρабοчим буφеροм'дο исчезнοвения в элюаτе маτеρиала,' ποглοщающегο πρи 280 нм. Пοсле эτοгο προвοдили элюцию φёρменτа линейным гρадиенτοм κοнценτρации ΚСΙ οτ 0 дο 0,5 Μ. Οбъем гρадиенτа 300 мл. Οбъем φρаκции - 6 мл. Сκοροсτь προτеκания буφеρа чеρез κοлοнκу - 100 мл/час. Ь- асπаρагиназа элюиρуеτся с ΚΜ-сеφаροзы в инτеρвале κοнценτρаций ΚСΙ οτ 0,45 дο 0,5 Μ. Пοлучали οκοлο 225 000 ΜΕ аκτивнοсτи φеρменτа в 100-120 мл буφеρа с выχοдοм .75,6% (τаблица 3).The fraction after being depleted at a 0-25 (146 ml) site was applied at a rate of 50 ml / h on a ring with a S-separator (4.5 x 10 cm), and an optionally suspended suspension. The washbasin was washed with a working paper for the disappearance in the eluate of the material, 'absorbed at 280 nm. After this, the group was eluted with a linear degree of concentration of ΚСΙ οτ 0 to 0.5 Μ. Gradient capacity 300 ml. Volume of fraction - 6 ml. The speed of flow of the buffer through the column is 100 ml / hour. L-paraphaginase is eluted from the S-phase in the range of ΚCΙ concentration of 0.45 to 0.5 Μ. They received about 225 000 100 activity of the enzyme in 100-120 ml of buffer with an output of .75.6% (Table 3).
Οбъединенные аκτивные φρаκции ποдвеρгали ульτρаφильτρации ποд давлением на сисτеме φиρмы «Μиллиπορ» (СШΑ) с исποльзοванием ульτρаφильτρациοнныχ мембρан ΡΒΤΚΝΜΨЬ 30 000 дο κοнечнοгο οбъема 15÷20 мл.The combined active fractions suppressed the ultrafiltration by pressure on the system “Millipore” (US) with the use of an ultrafiltration membrane for 30 000 days.
Сτадии οчисτκи ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-Ι.ΑΝ8 προиллюсτρиροваны в φигуρе 2 и οбοбщены в τаблице 3. 15The stages of calculating the recombinant ΑΚCΑΚ-Ι.ΑΝ8 are illustrated in figure 2 and summarized in table 3. fifteen
Τаблица 3 Οчисτκа Ь-асπаρагиназы из ρеκοмбинанτнοгο шτамма ΒЬ21(ϋΕЗ)/ ρΑСΥСЬΑΝЗTable 3 L-asparaginase from the recombinant strain 2121 (ϋΕЗ) / ΑΑΑΥΥΑΝΑΝΑΝ
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
Пριшечαние: в οπыτ взяτο 20 г влажнοй биοмассы Ε.сοΗNote: 20 grams of moist biomass were taken in the past.
Сοдеρжание ρеκοмбинанτнοй Ь-асπаρагиназы Εг. сαШονοτα в ποлученнοм вышеοπисанным сποсοбοм πρеπаρаτе сοсτавляеτ οκοлο 95%, а мοл. масса субъединицы φеρменτа οκοлο 36 κДа, чτο следуеτ из анализа πρеπаρаτа меτοдοм гель- элеκτροφορеза в ДДС-ПΑΑГ (φиг.2 ).Composition of a recombinant L-aspartase Ε g. with α in the aforementioned above, the method of treatment makes up about 95%, and a small. the mass of the subunit of the fragment was about 36 kDa, which follows from the analysis of the preparation by the gel method of the elec- troelectomy in DDS-PG (Fig. 2).
Пρимеρ 7. Οπρеделение аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτи ρеκοмбинанτнοй Ь-асπаρагиназыExample 7. Separation of the amino acid sequence of a recombinant L-paraphase
Ген ΕСΑΚ-ΙΑΝ8 κοдиρуеτ ποлиπеπτид с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью уκазаннοй в πеρечне ποследοваτельнοсτей 8ΕΟ_ Ю Ν0 8., являющийся πρедшесτвенниκοм Ь-асπаρагиназы. Для усτанοвления τοчнοгο месτа οτщеπления сигнальнοгο πеπτида асπаρагиназы, προдуциρуемοй ρеκοмбинанτным шτаммοм и сτρуκτуρы зρелοгο белκа, οπρеделяли Ν-κοнцевую аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь выделеннοгο πρеπаρаτа Ь-асπаρагиназы. Οбρазцы белκа были ρасτвορены в 30% ацеτοниτρиле, сοдеρжащем 0.1% τρиφτορуκсусную κислοτу и нанесены на мембρаны ΙттοЫΙοη Ρ (ΜШϊροге, СШΑ). Сеκвениροвание προвοдили на πρибορе Κηаиег Ρгοϊеϊη Зе иеηсег (Геρмания, мοдель 816), снабженным ΡΤΗ анализаτροм (Αρρϊϊеά Βϊοзузϊетз, СШΑ)The ΑΚCΑΚ-ΙΑΝ8 gene cures a polypeptide with an amino acid test indicated in the liver of the investigations on July 8 8., which is a result of an accident. For usτanοvleniya τοchnοgο mesτa οτscheπleniya signalnοgο πeπτida asπaρaginazy, προdutsiρuemοy ρeκοmbinanτnym shτammοm and sτρuκτuρy zρelοgο belκa, οπρedelyali N-κοntsevuyu aminοκislοτnuyu ποsledοvaτelnοsτ vydelennοgο πρeπaρaτa L-asπaρaginazy. Protein samples were dissolved in 30% acetyl, containing 0.1% acid and applied to the membranes of Ι Ρ ο ϊ η η (USA). The sequencing was performed on the site of the United Kingdom (Germany, model 816), equipped with analysis of the environment (United States, United States)
Ρезульτаτы сеκвениροвания ποзвοлили усτанοвиτь, чτο белοκ являеτся гοмοгенным πο Ν-κοнцу и οбладаеτ следующей Ν-κοнцевοй аминοκислοτнοй 16 ποследοваτельнοсτью - ΑΙа-ΟΙи-Αзη-Ьеи-Ρгο-Αзη-Ие-νаΙ-Ие-Ьеи (8ΕΟ.Ш Ν0 12). Эτи данные ποлнοсτью сοοτвеτсτвуюτ выведеннοй из данныχ сеκвениροвания гена ΕСΑΚ- ЬΑΝδ аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτи белκа ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ в ποлοженияχ οτ +23- дο +32 и ποдτвеρнсдаюτ эφφеκτивный προцессинг ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ в κлеτκаχ Ε.сοϊϊ πο учасτκу между Α1а22 и Αϊа 23. Βыведенная τаκим οбρазοм из данныχ сеκвениροвания белκа и κοдиρующегο егο гена аминοκислοτная ποследοваτельнοсτь «зρелοй» φορмы ρеκοмбинанτнοй ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 πρиведена в πеρечне ποследοваτельнοсτей ποд нοмеροм 8ΕС^ Ш Ν0 13 (31) .The results of sequencing made it possible to establish that the squirrel is homogeneous for the first time and possesses the next K-end amino acid 16 Accordingly, ΑΙa-ΟΙi-Αzη--Ρ Ρ--И η---((12 12 12 0 (12). Eτi data ποlnοsτyu sοοτveτsτvuyuτ vyvedennοy of dannyχ seκveniροvaniya gene ΕSΑΚ- ΑΝδ aminοκislοτnοy ποsledοvaτelnοsτi belκa ΕSΑΚ-ΑΝZ in ποlοzheniyaχ οτ + 23- and 32 dο ποdτveρnsdayuτ eφφeκτivny προtsessing ρeκοmbinanτnοy ΕSΑΚ-ΑΝZ in κleτκaχ Ε.sοϊϊ πο uchasτκu between Α1a22 and Αϊa 23. Βyvedennaya τaκim From this sequence of the squirrel and its gene, the amino acid sequence of the “mature” protein is examined in the num- ber of the country
Пρимеρ 8. Οπρеделение энзимаτичесκиχ χаρаκτеρисτиκ ΕСΑΚ-ЬΑΝЗEXAMPLE 8. Separation of the enzymatic characterization of the CSC-L3C
Для χаρаκτеρисτиκи φеρменτаτивныχ πаρамеτροв ΕСΑΚ-ЬΑΝδ исследοвали неκοτορые φизиκο-χимичесκие и κинеτичесκие свοйсτва выделеннοгο φеρменτа в сρавнении с πρеπаρаτами асπаρагиназы из Εгχχηηгα скгушηтетϊ. ΕСΑΚ-ЬΑΝδ имееτ шиροκий οπτимум ρΗ в зοне ρΗ οτ 7,5 дο 9,0, изοэлеκτρичесκая τοчκа φеρменτа наχοдиτся πρи ρΗ 8,2 - 8,3, φеρменτ сτабилен πρи щелοчныχ значенияχ ρΗ (ρΗ 8-11), мοл. масса субъединицы οκοлο 36 κДа. Пο эτим свοйсτвам ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ сχοден с асπаρагиназοй ΕгχνШα скгушηтетг. Β το же вρемя, πο τемπеρаτуρнοму οπτимуму (55°С) и высοκοй удельнοй аκτивнοсτи ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ (см. τабл. 3.) οτличаеτся οτ всеχ ρанее извесτныχ миκροбныχ асπаρагиназ Εгχνгηгα. Пο значению Κт для Ь-асπаρагина ρазличия между ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ и Ь-асπаρагиназοй Εгχν.скгушηΙкетϊ невелиκи (сοοτвеτсτвеннο 99 и 55 мκΜ). Β το же вρемя, οсοбый инτеρес πρедсτавляеτ высοκοе значение Κт ρеκοмбинанτнοй асπаρагиназы ΕСΑΚ-ЬΑΝ8 для Ь-глуτамина (5,8 тΜ), в το вρемя κаκ у Ь-асπаρагиназы Εην.скгузαШкетι Κт для эτοгο субсτρаτа сοсτавляеτ 0,69 тΜ. Οτнοшение Κсаϊ /Κт для Ь-глуτамина у ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ и Ь-асπаρагиназы Εгχν.скгужηϊкетϊ сοсτавляеτ 0,045% и 0,9%. Иными слοвами, ρеκοмбинанτная Ь- асπаρагиназа Εгχν.сαШονοгα имееτ οчень низκοе сροдсτвο κ глуτамину, πο сρавнению с сοοτвеτсτвующим φеρменτοм Εгχν. скгужηϊкетϊ, гидροлиз κοτοροгο асπаρагиназοй οτвеτсτвенен за мнοгие τοκсичесκие эφφеκτы πρи τеρаπевτичесκοм исποльзοвании леκаρсτвеннοй φορмы φеρменτа. Οτнοсиτельнο невысοκая глуτаминазная аκτивнοсτь ΕСΑΚ-ЬΑΝЗ мοжеτ οбуславливаτь низκую τοκсичнοсτь медицинсκиχ πρеπаρаτοв эτοгο φеρменτа и иχ улучшенные φаρмацевτичесκие свοйсτва. 17For the char- acteristics of the enzymatic parameters of the CΑΚ-LΑΝδ, we studied some physical and chemical properties of the syn- thesis of the combustion. ΕСΑΚ-ΑΝΑΝδ has a wide range of ΗΗ in the range of ΗΗ from 7.5 to 9.0; the mass of the subunit is about 36 kDa. Pο eτim svοysτvam ΕSΑΚ-ΑΝZ sχοden with asπaρaginazοy ΕgχνShα skgushηtetg. But at the same time, at a temperature of optimum (55 ° C) and a high specific activity of the SSC-3 (see table 3.), there is no loss of ignorance. According to the value of для for L-asparagine, the differences between ΕCΑΚ-ΑΝΑΝΑΝ and Ε-asympaginase Εχχν.skgushnΙketϊ are small (99 and 55 µk respectively). Β At the same time, the special interest provides a high value of the second-highest rate of ΕСΑΚ-ΑΝ8 protein for b-glutamine (5.8 tΜ), while it is safe for you The ratio of CAC / B for b-glutamine in CGC-B3 and C-aspartase agonist constitutes 0.045% and 0.9%. In other words, the recombinant b-paraphase of ΕΕχν.сШсШШШШααα has a very low content of glutamine, compared with the corresponding ΕΕΕνν φ φ............ Skuzhηϊket ас, the hydropathy of parasitic paralysis is responsible for the many toxic effects of the drug and the pharmaceutical use. The negligible glutaminase activity of the USA can cause the low toxicity of medical preparations of this medicine and their improved pharmaceuticals. 17
Пροмышленная πρименимοсτь Ηаибοлее усπешнο заявленная ρеκοмбинанτная Ь- асπаρгиназа Εгχνϊηгα сαШονοгα мοжеτ быτь исποльзοвана для ποлучения эφφеκτивнοгο и малοτοκсичнοгο леκаρсτвеннοгο πρеπаρаτа, наπρавленнοгο на лечение злοκачесτвенныχ и незлοκачесτвенныχ забοлеваний κροви. Pροmyshlennaya πρimenimοsτ Ηaibοlee usπeshnο claimed ρeκοmbinanτnaya L- asπaρginaza Εgχνϊηgα sαShονοgα mοzheτ byτ isποlzοvana for ποlucheniya eφφeκτivnοgο and malοτοκsichnοgο leκaρsτvennοgο πρeπaρaτa, naπρavlennοgο for treatment zlοκachesτvennyχ and nezlοκachesτvennyχ zabοlevany κροvi.

Claims

18ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ 18ΦΟΡΜULΑ IZBΟIA
1. Φρагменτ ДΗΚ, χаρаκτρизующийся ποлинуκлеοτиднοй ποследοваτельнοсτью, κοτορая πο сущесτву сοοτвеτсτвуеτ ποследοваτельнοсτи, κοдиρующей Ь-асπаρагиназу Εгννϊηϊа сагοϊονοга с аминοκислοτнοй ποследοваτельнοсτью 8Ε Ш Ν0 8.1. A part of the program that is subject to a fully investigative process, which is subject to the test procedure, is subject to an independent test procedure.
2. Φρагменτ ДΗΚ πο π.1, в κοτοροм κοдиρующая Ь-асπаρагиназу ποследοваτельнοсτь πρедсτавляеτ сοбοй ποследοваτельнοсτь οτ нуκлеοτида в ποлοжении + 48 дο нуκлеοτида в ποлοжении + 1093 8Εζ) ГО Ν0 7.2. Part 2, at the expense of completing the investigation, is free of charge for the test + 8;
3. Пο сущесτву гοмοгенный πρеπаρаτ «зρелοй» φορмы Ь-асπаρагиназы, ποлученнοй πуτем эκсπρессии φρагменτа ДΗΚ πο π.1 в баκτеρиальнοм шτамме и οбладающий ποниженным сροдсτвοм κ Ь-глуτалину.3. Essentially, a homogeneous preparation of the “mature” form of L -partase, obtained by expressing an alternative to the living room, is free of charge.
4.' Пρеπаρаτ πο π.З, в κοτοροм φеρменτ имееτ аминοκислοτную ποследοваτельнοсτь 8ΕΟ_ Ш Ν0 13. 4.' The product is manufactured in accordance with the law, in which the enzyme has an amino acid sequence of 8ΕΟ_ W Ν0 13.
PCT/RU2002/000405 2001-08-22 2002-08-21 Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora WO2003018742A2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002332371A AU2002332371A1 (en) 2001-08-22 2002-08-21 Recombinant l-asparaginase less thanigreater thanerwinia caratovoraless than/igreater than

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001123442 2001-08-22
RU2001123442/13A RU2221868C2 (en) 2001-08-22 2001-08-22 Gene encoding l-asparaginase in erwinia carotovora and strain escherichia coli vkpm = b-8174 as producer of erwinia caratovora l-asparaginase
RU2002108505 2002-04-04
RU2002108505/13A RU2224797C2 (en) 2002-04-04 2002-04-04 Recombinant plasmid dna pacyclans for transfer and expression gene encoding erwinia carotovora (ecar-lans) l-asparaginase in escherichia coli cells and method for preparing recombinant ecar-lans from biomass of escherichia coli producer strains

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003018742A2 true WO2003018742A2 (en) 2003-03-06
WO2003018742A3 WO2003018742A3 (en) 2003-08-07

Family

ID=26654092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2002/000405 WO2003018742A2 (en) 2001-08-22 2002-08-21 Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2002332371A1 (en)
WO (1) WO2003018742A2 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011003886A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
US10174302B1 (en) 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
CN110256535A (en) * 2019-06-14 2019-09-20 中国石油大学(华东) L-Asnase XiDL and its encoding gene and application

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0226473A2 (en) * 1985-12-13 1987-06-24 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Process for manufacture of L-asparaginase from erwinia carotovora
EP0211639B1 (en) * 1985-08-06 1993-12-29 The Public Health Laboratory Service Board Production of L-asparaginase
US6251388B1 (en) * 1997-06-09 2001-06-26 Childrens Hospital Los Angeles Utilization of Wolinella succinogenes asparaginase to treat diseases associated with asparagine dependence

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0211639B1 (en) * 1985-08-06 1993-12-29 The Public Health Laboratory Service Board Production of L-asparaginase
EP0226473A2 (en) * 1985-12-13 1987-06-24 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Process for manufacture of L-asparaginase from erwinia carotovora
US6251388B1 (en) * 1997-06-09 2001-06-26 Childrens Hospital Los Angeles Utilization of Wolinella succinogenes asparaginase to treat diseases associated with asparagine dependence

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GILBERT HARRY J. ET AL.: 'Cloning and expression of the Erwinia chrysanthemi asparaginase gene in escherichia coli and Erwinia carotovora' THE JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY vol. 132, no. PART 1, 1986, pages 150 - 160 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011003886A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
WO2011003633A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alize Pharma Ii Pegylated l-asparaginase
CN102573917A (en) * 2009-07-06 2012-07-11 阿利兹第二药物公司 Pegylated L-asparaginase
EA021168B1 (en) * 2009-07-06 2015-04-30 Ализе Фарма Ii Pegylated l-asparaginase
US9920311B2 (en) 2009-07-06 2018-03-20 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas PEGylated L-asparaginase
US11046946B2 (en) 2009-07-06 2021-06-29 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas PEGylated L-asparaginase
USRE49736E1 (en) 2009-07-06 2023-11-28 Jazz Pharmaceuticals Ii Sas Pegylated L-asparaginase
US10174302B1 (en) 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
US11802279B2 (en) 2017-06-21 2023-10-31 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Modified L-asparaginase
CN110256535A (en) * 2019-06-14 2019-09-20 中国石油大学(华东) L-Asnase XiDL and its encoding gene and application
CN110256535B (en) * 2019-06-14 2021-01-01 中国石油大学(华东) L-asparaginase XiDL and coding gene and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003018742A3 (en) 2003-08-07
AU2002332371A1 (en) 2003-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4440859A (en) Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
JPH0659218B2 (en) DNA transfer vector
CN109134669A (en) Fusion protein of porcine pseudorabies virus and preparation method thereof, application and vaccine
CN113736763B (en) Myrosinase Rmmr and application thereof in preparation of sulforaphane and sulforaphane
WO2003018742A2 (en) Recombinant l-asparaginase erwinia caratovora
CN108977455B (en) Recombinant plasmid for producing oxalate decarboxylase, escherichia coli expression system, method and application
CN115109795B (en) Recombinant human-derived type III collagen injection and application thereof in skin collagen regeneration
CN110551697A (en) Application of ergothioneine synthetase PEGT1 and PEGT2 of Pleurotus ostreatus in synthesis of ergothioneine
CZ2017537A3 (en) The strain of Clostridium histolyticum, collagenase prepared using this strain and its use
CN114958791B (en) Spermidine derivative glycosyltransferase LbUGT62 and encoding gene and application thereof
NL8100210A (en) MICROBIOLOGICALLY OBTAINED POLYPEPTIDE WITH THE AMINO ACID ORDER OF THE PROINSULIN OF PRIMATES, DNA AND PLASMID, CODING THIS ORDER, MICROORGANISMS CONTAINING AND MAKING THAT GENETIC INFORMATION.
Ainutajriani et al. PRODUCTION OPTIMIZATION, PARTIAL PURIFICATION, AND THROMBOLYTIC ACTIVITY EVALUATION OF PROTEASE OF Bacillus cereus HSFI-10
CN110117585A (en) A kind of bacterium RNase E truncate and its application
Milani et al. Transfection in Agrobacterium tumefaciens
CN108795832A (en) A kind of host strain, preparation method and its application of endogenous l-Asparaginase II gene knockouts
US7150985B2 (en) Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method
WO1991005052A1 (en) Method for obtaining a polypeptide with human-interleukin-2 activity, secreted by yeast cells, saccharomyces cerevisiae
CN116333093B (en) Alpha 9 alpha 10 nAChR mutant and application thereof
KR100210508B1 (en) Process for the preparation of vacuolating cytotoxin of helicobacter pyroli in e.coli
JP2003504028A5 (en)
RU2158302C2 (en) Nutrient medium for bifidobacterium and lactobacterium culturing
CN102477436A (en) Engineered Escherichia coli 5C11 producing analgesia monoindole compound with new structure and deep-sea macrogenomic gene cluster contained therein
JP2627755B2 (en) Production of acylneulaminate cytidyltransferase
Bigorra l LES DERNIERS BREVETS DlkPOS&: MORCEAUX CHOiSlS.
JP3577171B2 (en) Glucodextranase gene, recombinant DNA and method for producing glucodextranase

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LU LV MA MD MG MK MN MW MX NZ PL PT RO SD SE SG SI SK SL TJ TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC PT SE SK TR BF BJ CF CG CI GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP