WO2002097087A1 - Methode d'expression de gene etranger dans le rein - Google Patents

Methode d'expression de gene etranger dans le rein Download PDF

Info

Publication number
WO2002097087A1
WO2002097087A1 PCT/JP2002/005067 JP0205067W WO02097087A1 WO 2002097087 A1 WO2002097087 A1 WO 2002097087A1 JP 0205067 W JP0205067 W JP 0205067W WO 02097087 A1 WO02097087 A1 WO 02097087A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
kidney
gene
epo
injection
pcaggs
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/005067
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroki Maruyama
Jun-Ichi Miyazaki
Original Assignee
Japan Science And Technology Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Corporation filed Critical Japan Science And Technology Corporation
Priority to US10/478,537 priority Critical patent/US7381709B2/en
Publication of WO2002097087A1 publication Critical patent/WO2002097087A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys

Definitions

  • the invention of this application relates to a method for expressing a foreign gene in the kidney. More specifically, the invention of this application relates to a new gene expression method that enables the introduction of a foreign gene for in vivo or ex vivo gene therapy for kidney disease and the like and the long-term expression thereof.
  • a viral vector such as an adenovirus vector or a herpes virus vector
  • a viral vector such as an adenovirus vector or a herpes virus vector
  • a method has been proposed to improve the transfection efficiency by using a synthetic macromolecule such as a complex with kachi-nik ribosome (riboplex) or a complex with katiconic polymer (polyplex) as a non-viral vector.
  • this gene transfer expression method by intramuscular injection of a plasmid vector is expected to become the mainstream of gene therapy in the future, replacing the recombinant virus vector and the like, and its application range is being studied in various ways.
  • a plasmid vector into which a DNA fragment encoding an antigenic protein has been incorporated, an antigen is expressed in muscle cells, and this antigen-specific immune response is stimulated to obtain immunoprotection in the host. Methods have been developed to cause this.
  • This method is called “DNA vaccine” and is attracting attention as a next-generation vaccine because of its cost and safety advantages compared to conventional inactivated or attenuated virus vaccines.
  • a recombinant plasmid vector In addition to its use as a DNA vaccine for acquiring immune defense ability, direct introduction of a recombinant plasmid vector has also been shown to be effective in regulating systemic functions by bioactive substances and the like. For example, by injecting a recombinant plasmid vector encoding a cytokinin (I-2, IL-4, TGFl) into the muscle of a mouse, the cytokinin expressed in muscle cells is systemically circulated. And has been reported to act systemically (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10876-10880, 1996).
  • One of the inventors of the present application used an elect-portion as a means for efficiently introducing a recombinant plasmid vector into cells.
  • the present inventors have invented such a method and have already filed a patent application (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-004715).
  • gene transfer using a recombinant plasmid vector has been conventionally used as a means for directly introducing a vector into a tissue cell such as a muscle cell, and a foreign gene is introduced into an organ in a living body. It was not used as a vector for DNA.
  • An object of the present invention is to provide a new method that enables a long-term expression of a transgene by using a recombinant plasmid vector as a gene transfer vector into the kidney.
  • peritubular capillary (PTC) of the stomach plays an important role in renal function and maintenance of hemodynamics. It is known to play [The kidney Vol. 1, 6th edn. (Ed. Brenner, BM) 277-318, WB Saunders, Philadelphia, USA, 2000]. Progressive tubulointerstitial fibrosis associated with PTC and tubule loss is common in all progressive renal diseases ( ⁇ Am. Soc. Nephrol. 7, 2495-2508, 1996). Rather than glomerular injury, the severity of chronic ureteral stromal changes is more strongly associated with reduced renal function and its long-term prognosis (Lancet.
  • Disclosure of the invention discloses an invention for solving the above-mentioned problem, in which a plasmid vector recombined with a foreign gene is introduced into the stomach by transrenal vein administration, and the foreign gene is mainly used in fibroblasts of stromal stromal cells.
  • a gene expression method characterized by expression is provided.
  • the foreign gene is a gene for treating a renal disease.
  • Another preferred embodiment is to perform transvenous administration via a percutaneous intravenous catheter.
  • Still another embodiment of the method of the present invention is to introduce a recombinant plasmid into a kidney or kidney cells extracted from a human body in a transplantable state.
  • FIG. 1a is a photomicrograph of a kidney section of a PAS-stained rat immediately after injection of ink. Magnification is 350 times.
  • Figures 1b and c are micrographs of serial sections of rat kidney one day after pCAGGS-lacZ injection stained immunohistologically with X-gal and anti-RECA-1 antibodies, respectively. The magnification is 260 times.
  • FIG. 2 is a photograph of double immunostaining of a rat slice from a rat one day after injection with pCAGGS-lacZ. Sections were stained with anti-E.
  • FIG. 3 is a photograph of an immunoelectron microscopic analysis of a thin section of a rat kidney one day after injection of pCAGGS-lacZ.
  • DAB products are distributed throughout the cytoplasm of fibroblasts (a, b, c). Fibroblasts have long cytoplasmic processes and adhere to the cytoplasm of endothelial cells.
  • C is the capillary endoplasmic reticulum
  • E is endothelial cells
  • F is fibroblasts
  • PT is proximal tubule. Magnifications are 3,200 for a, 3,000 for b, and 4,000 for c.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of injection parameters on ⁇ level. Serum ⁇ was measured one week before (mouth) and one week ( ⁇ ) after plasmid DNA injection.
  • a and b are the effects of injection time (a) or volume (b) on serum Epo levels using 800 g of pCAGGS-Epo or pCAGGS.
  • n 4 / group.
  • c is the effect of varying DNA injection on serum Epo levels.
  • n 5 / group.
  • FIG. 5 shows the results of PCR analysis of pCAGGS-Epo DNA in major organs one day after pCAGGS-Epo injection.
  • Figure 6 shows the results of RT-PCR analysis of Epo mRNA in major organs.
  • FIG. 8 is a photomicrograph showing the results of a histological test for potential kidney damage due to gene transfer. Kidney sections were stained with PAS.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of functional analysis of the injected kidney.
  • ⁇ indicates a unilateral extirpated rat from which pCAGGS injection was performed, and a seal mark indicates a unilateral extirpated rat from which no pCAGGS injection was performed.
  • ⁇ are uninjected non-operative rats.
  • n 6Z group. At each time point comparison with normal rats, * is P ⁇ 0.05 and ** is ⁇ ⁇ 0.01.
  • Figure 10 shows the results of investigating the role of the CAG promoter in gene expression targeting stomach.
  • Serum Epo levels were examined one week before (mouth) and one week (country) after naked DNA injection.
  • n 6Z group. Differences in Epo levels before and after injection between groups were * for ⁇ ⁇ 0.05 and **** for ⁇ , ⁇ .0001.
  • the comparison with the pCAGGS group was ⁇ for P ⁇ 0.0001, and the comparison with the pCI group (comparison at each time point) was #### for P ⁇ 0.0001, and for the pCI-Epo group. Comparison (comparison at each time point) is $$ ⁇ $ for P ⁇ 0.0001.
  • a foreign gene used for recombination of a plasmid vector is, for example, a gene (DNA) encoding various site force-ins or hormones affecting renal function. And polynucleotides such as RNA). Further, depending on the use of the method of the present invention, a gene for treating renal disease can also be used. Further, in the method of the present invention, a gene for treating a disease other than a renal disease (for example, ⁇ -galactosidase ⁇ gene for Fabry disease, 8 Epo gene for thalassemia) can be used.
  • the transgene in the method of the present invention, can be expressed in the kidney for a long period of time by introducing a small amount of plasmid vector, for example, about 2 / g. It can be used as a (biofactory) to treat various diseases by supplying secretory proteins.
  • a gene polynucleotide
  • a genomic gene can be used as it is, or mRNA transcribed from the gene or cDNA synthesized from the mRNA can be used.
  • a promoter / enhancer sequence or the like that controls gene expression in the kidney should be linked to the polynucleotide.
  • the plasmid vector is not particularly limited, and a plasmid DNA generally used for animal cell expression can be appropriately used. Insertion of a foreign gene polynucleotide into plasmid DNA can also be performed by a known method.
  • the recombinant plasmid vector thus constructed is administered retrograde into the kidney via the vein.
  • the kidney of interest is a human or non-human mammal kidney. When targeting human kidney, it is expected to be effective as gene therapy. In the case of non-human animals, the effect of the introduced therapeutic gene can be confirmed at the individual animal level by targeting, for example, a renal disease model animal. Alternatively, a new animal model for renal disease can be created by expressing a gene responsible for renal disease in an individual.
  • Introduction of the recombinant plasmid into the kidney can be performed by mixing the recombinant plasmid with an injection solution and injecting the plasmid solution into a temporarily clamped renal vein.
  • a percutaneous venous catheter may be inserted into the femoral vein, jugular vein, subclavian vein, elbow vein, or the like, and the plasmid solution may be injected through this catheter.
  • the concentration of the plasmid in the injection solution and the dose of the injection solution vary depending on the target animal species. In the case of a human, the plasmid may be administered at about lg to 20 mg.
  • the exogenous gene carried in the vector is expressed for at least 6 months, so that the renal function is improved or the effect of the gene for treating renal disease is maintained for a long time Is done.
  • the method of the present invention can also be performed on a stomach tissue removed from a human body in a state where it can be transplanted. In this case, the kidney is removed together with the vein, and the plasmid solution is administered into the kidney via the vein.
  • the transgene is expressed in the kidney, and the renal function can be improved over a long period of time, and the therapeutic effect of sick diseases can be measured.
  • CAG site megalovirus enhancer noni
  • Epo erythropoietin
  • Wistar rats Eight-week-old male Wistar rats were purchased from Charles-River Japan Inc. (Tokyo, Japan) and used for gene transfer.
  • Plasmid DNA was diluted with Ringer's solution. Rats were anesthetized with getyl ether, plasmid DNA solution was injected immediately after incision of the midline abdominal section, and the left renal vein and renal artery were clamped. The plasmid DNA solution was injected intravenously using a 24-gauge catheter (SURFLO I.V .; Terumo, Tokyo, Japan), and blood flow was resumed immediately after the injection. No incubation was performed. Pressure was applied for 5 seconds to stop the injection site.
  • SURFLO I.V . Terumo, Tokyo, Japan
  • pCAGGS-Epo rats receiving 100 g of pCAGGS-Epo were sacrificed under general anesthesia, and both kidneys, brain, heart, lungs, liver, spleen, muscle, skin pain, testes and blood were isolated. Released. From tissue samples according to Laird et al. (Nucleic Acids Res. 19: 4293, 1991). The DNA was isolated, and the immediate-early enhancer region of the cytomegalovirus (CMV) contained in pCAGGS-Epo was amplified by PCR using the following specific primers.
  • CMV cytomegalovirus
  • CMV-1 forward primer 5'-GGGTCATTAGTTCATAGCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • CMV-2 reverse primer 5'-GGCATATGATACACTTGAT-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • the PCR procedure consists of [95 ° C 1 minute: 60 ° C 2 minutes: 74 ° C 2 minutes] X 1 cycle and [94 ° C 1 minute:
  • the PCR product was run on a 4 ⁇ agarose gel and analyzed for a 215 bp CMV enhancer DNA.
  • Epo reverse primer 5'-GCCCAGAGGAATCAGTAGCA-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Epo forward primer 5'-TCTGACTGACCGCGTTACTC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • G3PDH reverse primer 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • G3PDH forward primer 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • the Epo forward primer was designed to hybridize to a sequence immediately downstream of the transcription initiation site of the CAG promoter. That is, since an intron exists between the CAG promoter in pCAGGS-Epo and Epo cDNA, a primer set for Epo RNA detection was designed to include this intron, and plasmid DNA Alternatively, it can be distinguished from PCR products from genomic DNA. The primer set for G3PDH mRNA detection was also designed to include intron. RT-PCR products were analyzed by 4% agarose gel electrophoresis. The expected product length is 170 bp for Epo mRNA and 452 bp for G3PDH mRNA.
  • pCAGGS-lacZ expresses 8 galactosidase (from Escherichia coli) (Gene. 108, 193-199, 1991). Kidneys injected with 100 / g pCAGGS-lacZ were analyzed histochemically. One day after the injection, the bilateral stomachs were collected for X-gal staining, embedded in Tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetechnical Co. Ltd., Tokyo), and frozen in a mixture of dry ice and acetone. Serial sections (5 wm thick) were cut with a cryostat and attached on a glass slide coated with 3-aminopropyltriethoxysilane.
  • the sections were fixed in 1.5% dartaraldehyde at room temperature for 10 minutes, washed three times with cold phosphate-buffered saline (5 minutes), 1 mg / ml X-gaU 2 mM MgCI 2 , The cells were incubated at 37 ° C for 3 hours in an X-gal staining solution containing 5 mM K 4 Fe (CN) 6 , 5 mM K 3 Fe (CN) 6 , and 0.5% Nonidet P-40 (pH 7.4). The sections were stained with X-gal according to the method described in the literature (Nature Biothechnol. 16, 867-870, 1998) and nuclear stained with nuclear fast red.
  • Envion + mouse (Dako.Tokyo) containing mouse anti-rat endothelial cell monoclonal antibody RECA-1 (Cosmobio, Tokyo, Japan) (Lab. Invest. 66, 459-466, 1992) to identify renal vascular endothelium Serial sections were immunostained using Hematoxylin and nuclear stained with hematoxylin.
  • kidneys injected with 100 g of pCAGGS-lacZ were analyzed. One day after the injection, the kidney was sectioned at a thickness of 5 and fixed with acetone for 4 minutes at 4 ° C. This section was incubated with a perforated anti-E. Coli 8 galactosidase antibody (1: 200 dilution, Biogenesis, Poole, UK) and a mouse anti-rat endothelial cell monoclonal antibody RECA-1 (1: 100 dilution, Cosmobio) for 30 minutes at room temperature.
  • a perforated anti-E. Coli 8 galactosidase antibody (1: 200 dilution, Biogenesis, Poole, UK
  • RECA-1 mouse anti-rat endothelial cell monoclonal antibody
  • fluorescein isothiosinate FH "C) -labeled porcine anti-porcine IgG (1:20 dilution, DAKO) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)
  • FH "C fluorescein isothiosinate
  • DAKO porcine anti-porcine IgG
  • TRITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • kidneys injected with 100 g of pCAGGS-lacZ were analyzed.
  • the rats were anesthetized with getyl ether and perfused through the aorta with 50 ml of PBS and then with 50 ml of periodate-lysine-paraformaldehyde.
  • Kidneys are fixed with periodate-lysine-paraformaldehyde fixative at 4 ° C for 4 hours, treated with 1% sucrose in PBS for 1 hour, embedded with Tissue-Tek OCT compound, and frozen in hexane at -80 ° C.
  • the slices were sectioned to a thickness of 4 Atm with a cryostat, and incubated with a heron anti-E. Coli P galactosidase antibody (1: 800 dilution, Biogenesis) for 30 minutes at room temperature. After washing with PBS, each section was incubated for 1 hour with goat anti-Peacock lg EnVision + Perfect oxidase-Peacock antibody (1:10 dilution, DAKO). Then, each section was washed with PBS, and incubated in Tris buffer (pH 7.6) containing 0.01% H 2 0 2 0.02% diaminobenzidine (DAB) with 3 minutes.
  • Tris buffer pH 7.6 containing 0.01% H 2 0 2 0.02% diaminobenzidine (DAB) with 3 minutes.
  • kidneys were collected, fixed with 10% buffered formaldehyde, embedded in paraffin, and subjected to ordinary light microscopic observation. Next, 5 / im sections were stained with periodate-Schiff (PAS) to detect tissue damage by the gene transfer method.
  • PAS periodate-Schiff
  • Serum creatine level an endogenous marker of wisdom function, was measured using a normal rat and a unilateral nephrectomy rat without DNA injection as controls.
  • Numerical data are shown as mean soil mean standard deviation. All data were analyzed using the Macintosh StatView statistical program (SAS, Cary, NC). Statistical significance was assessed by unpaired t-test. PO.05 was considered statistically significant.
  • Kidney sections were analyzed by double immunofluorescence staining to define the site of expression of the transgene.
  • the expression of pCAGGS-lacZ was detected as broad green fluorescence at the site where several PTCs crossed by immunostaining with ⁇ sagi polyclonal anti-E. coli) 3 galactosidase antibody and FITC-labeled porcine anti- ⁇ sagi IgG.
  • Figure 2a PTC endothelial cells were detected as fine red fluorescence by staining with RECA-1 and TFMTC-labeled goat anti-mouse IgG ( Figure 2b). This double immunostaining showed yellow fluorescence surrounding the yellowish-green area, suggesting that the transgene is expressed in or near a limited area of PTC ( Figure 1). 2 c).
  • the transgene-expressing cells were further examined by immunoelectron microscopy (FIG. 3) and identified based on the morphology of renal stromal cells (Anat. Embryol. 193: 303-318, 1996).
  • FOG. 3 immunoelectron microscopy
  • DAB products were uniformly detected in the cytoplasm of fibroblasts near PTC (Fig. 3a, b, c).
  • Fibroblasts extended long cytoplasmic processes and adhered tightly to the cytoplasm and tubules of PTC endothelial cells (Fig. 3a, b, c). No DAB product was observed in endothelial cells, macrophages, dendritic cells and outer membrane cells.
  • the physiological effect of the transgene (Epo) was examined by serum Epo measurement and erythrocyte analysis after injection of the plasmid vector pCAGGS-Epo.
  • the maximum injection volume that the rat kidney could accommodate was determined.
  • Retrograde infusion into the forked vein introduces plasmid DNA anatomically into the kidney, but there are no technical features to guarantee its kidney-specific expression. Therefore, it is necessary to confirm whether the plasmid DNA is specifically introduced only into the injected kidney and whether it is specifically expressed there.
  • Epo DNA was detected by PCR only in the left kidney injected with pCAGGS-Epo, but not in any other tissues.
  • Epo mRNA derived from the transgene was detected only in the injected left kidney (FIG. 6a), but was not detected in other tissues at all.
  • no Epo mRNA was detected in kidneys injected with control pCAGGS (data not shown).
  • Control G3PDH mRNA was detected in all injected kidneys.
  • Epo transgene DNA was detected by PCR (data not shown), and Epo mRNA was detected by RT-PCR 24 weeks after injection.
  • the time course of Epo expression was examined by varying the DNA injection volume.
  • the injection volume was 1.0 ml, and the injection time was 5 seconds.
  • Rats were divided into 4 groups (3 animals each): pCAGGS-Epo 100 g group, pCAGGS-Epo 30 ⁇ g group, pCAGGS-Epo 2 / ig group, and pCAGGS lOO g group.
  • the serum creatine level in the pCAGGS-Epo ⁇ 00 g group rat was significantly higher than in the pCAGGS group rat (0.6 ⁇ 0.1 mg / dl vs 0.5 ⁇ 0.1 mg / dl ( However, serum creatine levels were within the normal range in both groups.
  • pCAGGS-Epo was digested with the restriction enzyme EcoRI to obtain a 726 bp rat Epo cDNA fragment, which was inserted into the EcoRI site of the pCI expression vector (Promega, Madison, Wis.) Carrying the CMV immediate-early gene promoter / enhancer.
  • the plasmid was inserted to construct a plasmid pC Epo, and a plasmid was prepared as described in the literature (Hum. Gene Ther. 11: 429-437, 2000). An empty pCI plasmid was used as a control.
  • Rats were divided into 4 groups (6 each): pCAGGS-Epo100 / xg group, pCAGGS100 ⁇ g group, pCI-Epo100 ⁇ -g group, pCI100tg group.
  • Serum Epo levels were measured one week before and one week after each plasmid injection. Further, Epo mRNA in the kidney injected with pCI-Epo was confirmed by RT-PCR (data not shown). However, as shown in FIG. 10, serum Epo levels when pCI-Epo was introduced were extremely low. In contrast, when pCAGGS-Epo was introduced, high serum Epo levels were obtained.
  • CAG promoter is one of the important factors for renal targeting gene transfer by retrograde renal vein injection.
  • Stromal fibroblasts are a key site in the development of wisdom disorders.
  • a common pathway in many progressive renal diseases is the fibrosis process, which involves fibroblast proliferation and extracellular matrix secretion by these cells (Kidney Int. 39: 550-556, 1991).
  • Effective in vivo gene transfer into fibroblasts is crucial both in terms of developing methods for treating fibrosis and elucidating the basic biological mechanisms of fibrosis (Nephrol. Dial. Transplant 14: 1615-1617, 1999).
  • peritubular fibroblasts are a major site of endogenous Epo production ( ⁇ Histochem. Cytochem. 41: 335-341, 1993; Kidney Int. 51: 479-482, 1997; Kidney Int.
  • the present invention supports the safety of the method of the invention.
  • One of the key parameters for efficient transgene expression was injection volume and injection rate.
  • the optimal injection volume (1.0 ml) for transgene expression was equal to kidney volume. Since the rapid injection directly exposes the DNA molecules to the PTC endothelium before the DNA mixes with the blood, a rapid injection of an appropriate volume of DNA solution will allow the injection of plasmid DNA from DNA digestion by serum and cellular nucleases. Can be protected. Furthermore, it was confirmed that the selection of the CAG promoter was effective for transgene expression, and that the CMV promoter was not suitable for performing gene transfer targeting the kidney by the method of the present invention.
  • the serum Epo level after renal vein injection of 100 g of pCAGGS-Epo was the level when 400 g of pCAGGC-Epo was introduced into muscle by electoporation (Hum. Gene Ther. 11: 429-437). , 2000; Gene Ther. 8: 461-468, 2001).
  • Serum Epo levels at 24 weeks after renal vein injection of pCAGGS-Epo are about 1/2 of the highest Epo levels, which are the same as those at 5 weeks after gene transfer into muscle (Gene The 8: 461-468, 2001).
  • the lifespan of fibroblasts is not known, but is rather long. Localization of gene transfer into fibroblasts is an important factor in long-term gene expression. This indicates that the method of the present invention is an important problem in the renal gene transfer method using a non-viral vector. (Low efficiency and short-term expression). Furthermore, the method of the present invention can be easily applied to humans. Practical use of catheterization also allows non-invasive transfer of therapeutic genes to the stomach. The method of the present invention is also useful for ex vivo gene transfer during kidney transplantation. Transplant success depends primarily on the suppression of acute rejection (Transplantation. 55, 752-757, 1993; N. Engl. J Med. 342, 605-612, 2000). Specific gene transfer near the PTC is also useful for long-term transfer of therapeutic proteins that suppress either immune cell function or mediators of the inflammatory process.
  • the invention of the present application provides a method for safely and efficiently introducing a foreign gene into the kidney and expressing the transgene for a long period of time. You. This will greatly advance the potential of gene therapy for intelligent diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

明細害 g臓における外来遠伝子発現方法
技術分野 この出願の発明は、 腎臓における外来遺伝子の発現方法に関するものである。 さ らに詳しくは、 この出願の発明は、 腎疾患に対する in vivoまたは ex vivo遺伝子治 療等のための外来遺伝子の導入とその長期間の発現を可能とする新しい遺伝子発現 方法に関するものである。
背景技術 腎臓への遺伝子導入は、 遺伝子性腎疾患、 糸球体腎炎や糖尿病性腎症、 急性およ び慢性腎不全、 移植腎等の腎疾患過程の理解を深め、 あるいはそれらの腎疾患治療 法を革命的に変えるための最も重要なツールの 1つとなる可能性を秘めている。 これまでにも、 腎臓への遺伝子導入 ·発現のための種々の方法が報告されている が、 発現タンパクの量や発現の持続時間が治療用途には十分ではなかった （Gene Ther. 4, 426-431 , 1997; J. Clin. Invest. 101 , 1320-1325, 1998; Kidney Int. 57, 1973- 1980， 2000; Hum. Gene Ther. 8, 1243-1251 , 1997; Gene Ther. 7, 279-285, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 129-34, 1992; J. Clin. Invest. 92, 2597-2601 , 1993; Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 525-532， 1995) 。 また、 外来遺伝子 （治療用遺伝子） を導入するためのベクターとしては、 導入効 率の点から主にウィルスベクター （アデノウイルスベクター、 ヘルぺスウィルスべ クタ一等） が使用されている。 しかしながら、 これらのウィルスベクターの使用は、 安全性の確保や抗原性の排除等の点に課題を残している。 また、 非ウィルスベクターとして、 カチ才ニック · リボソームとの複合体 （リボ プレックス） 、 カチォニック ·ポリマーとの複合体 （ポリプレックス） 等の合成高 分子を用いて導入効率を向上させる方法も提案されている。 ただし、 これらの合成 高分子をベクターとする場合には、 そのアジュバン卜作用による免疫系の障害等の 問題が存在する。 一方、 組換えプラスミドベクタ一を哺乳動物の骨格筋、 皮虜または心筋内に直接 注入し、 プラスミドベクターに組み込まれた遺伝子がコードする蛋白質やポリぺプ チドを細胞内で発現させる方法が提案されている。 この方法は、 Wolff 等によって報 告されたプラスミド DNA (naked DNA) の興味深い特性に基づいている。 すなわち、 Wolff 等は、 種々の酵素 （β—ガラク卜シターゼ、 ルシフェラーゼなど） をコードす る遺伝子によって組換えたプラスミドベクターを哺乳動物の筋肉内に直接注射する と、 組換えプラスミド DNAは複製されたり宿主のゲノムに組み込まれたりせずに、 ェピゾーム （染色体外要素） として長期にわたり （数ケ月間） 筋肉細胞内に存在し、 インサート遺伝子にコードされた酵素を発現し続けることを報告している （Science, 247:1465-1468, 1990) 。 以来、 このプラスミドベクターの筋肉内注射による遺伝子 導入発現法は、 組換えウィルスベクター等に代わって、 今後の遺伝子治療の主流と なるものと期待され、 その応用範囲が様々に検討されている。 例えば、 抗原性蛋白 質をコードする DNA断片を組み込んだプラスミドベクターを筋注することによって 筋肉細胞内に抗原を発現させ、 この抗原特異的な免疫応答を刺激して宿主に免疫防 御能を獲得させる方法が開発されている。 この手法は 「DNA ワクチン」 と名付けら れ、 従来の不活化または弱毒化ウィルスワクチンに比較して費用や安全性の面で優 れているため、 次世代のワクチンとして注目されている。 また、 免疫防御能獲得の ための DNA ワクチンとしての使用のほか、 組換えプラスミドベクターの直接導入法 は、 生理活性物質等による全身機能の調節にも有効であることが示されている。 例 えばサイ卜力イン （Iし 2、 IL-4、 TGF l ) をコードする組換えプラスミドベクターを マウスの筋肉内に注射することによって、 筋肉細胞内で発現されたサイ卜力インが 体循環に入り、 全身性に作用することが報告されている （Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10876-10880, 1996 ) 。 なお、 この出願の発明者の一人は、 組換えプラスミドべ クタ一の細胞内への効率的な導入手段として、 エレクト口ポーレーシヨンを利用し た方法を発明し、 既に特許出願している （特開平 2000-004715号公報） 。 前記のとおり、 組換えプラスミドベクター （naked DNA) を用いた遺伝子導入は, 従来、 筋細胞等の組織細胞に直接ベクターを導入する手段として用いられており、 生体内の臓器に外来遺伝子を導入するためのベクターとしては利用されていなかつ た。 この発明は、 腎臓への遺伝子導入ベクターとして組換えプラスミドベクターを利 用し、 導入遺伝子の長期間の発現を可能とする新しい方法を提供することを課題と している。 また、 各皮質レベルで静脈と連結する間質血管網 （network of interstitial vessel) を含む賢臓の尿細管周囲毛細血管 （peritubular capillary: PTC) は、 腎機能および血 行動態維持の重要な役割を果たすことが知られている [The kidney Vol. 1 , 6th edn. (ed. Brenner, B. M. ) 277-318, W. B. Saunders, Philadelphia, USA, 2000】。 PTCおよ び尿細管の損失によって併発する進行性尿細管間質性線維化は、 全進行性腎疾患に 共通しているが （丄 Am. Soc. Nephrol. 7, 2495-2508, 1996) 、 糸球体損傷よりもむ しろ慢性尿管間質変化の重症度の方が、 腎機能の低下とその長期予後に強く関連し ている (Lancet. 2, 363-366， 1968; Hum. Pathol. 1 , 631 -641 , 1970; Nephrol. Dial. Transplant. 5. θβ9-θ93, 1990; Kidney Blood Press. Res. 19, 191 -195, 1996' d. Am. Soc. Nephrol. 9， 231 -242, 1998; J. Am. Soc. Nephrol. 1 1 , 47-56, 2000) 。 さらに、 PTCの内皮は、 急性および慢性腎移植拒絶の主な標的の 1つであることも知られて いる (17. J. Am. Soc. Nephrol. 10， 2208-2214, 1999; Lab. Invest. 80, 815-830, 2000; J. Am. Soc. Nephrol. 12， 574-582, 2001 ) 。 従って、 この出願の発明は、 PTCの内皮近傍の線維芽細胞において外来遺伝子を 長期間に渡って発現させることをさらに具体的な課題としている。
発明の開示 この出願は、 前記の課題を解決するための発明として、 外来遺伝子によって組み 換えたプラスミドベクターを経腎静脈的投与により賢臓に導入し、 外来遺伝子を主 として肾臓間質の線維芽細胞で発現させることを特徴とする遺伝子発現方法を提供 する。 この発明の方法においては、 外来遺伝子が腎疾患治療用遺伝子であることを好ま しい態様としている。 また、 経皮的静脈カテーテルを介して経賢静脈的投与を行う ことを別の好ましい態様としてもいる。 さらにこの発明方法においては、 移植可能な状態で人体より摘出した腎臓または 腎細胞に組換えプラスミドを導入することをさらに別の態様としている。
図面の簡単な説明 図 1 a は墨汁注射直後の PAS 染色ラット腎臓切片の顕微鏡写真である。 倍率は 350倍。 図 1 bおよび cは、 それぞれ X-galおよび抗 RECA-1抗体で免疫組織学的に 染色した pCAGGS-lacZ注射 1 日後のラッ卜腎臓の連続切片の顕微鏡写真である。 倍 率は 260倍。 図 2は、 pCAGGS-lacZ注射 1 日後のラッ卜賢臓切片の二重免疫染色の写真である。 切片は、 抗 E. coli iS -ガラクトシダーゼ抗体 （a、 緑色蛍光） 、 抗ラッ卜内皮細胞抗体 (b、 赤色蛍光） 、 または両方の抗体 （c、 黄色蛍光） で染色した。 図 3は、 pCAGGS-lacZ注射 1 日後のラッ卜腎臓の微薄切片の免疫電子顕微鏡分析 の写真である。 DAB産物は線維芽細胞の細胞質全体に分布している （a, b, c) 。 線 維芽細胞は長い細胞質突起を有し、 内皮細胞の細胞質に接着している。 Cは毛細血管 小胞体、 Eは内皮細胞、 Fは線維芽細胞、 PTは近位尿細管。 倍率は aが 3,200倍、 b が 3,000倍、 cが 4,000倍である。
差替え用紙 （規則 26) 図 4は、 Ερο レベルに対する注射パラメータの効果を示したグラフである。 血清 Εροを、 プラスミド DNA注射の 1週間前 （口） および 1週間後 （騸） に測定した。 aおよび bは、 800 gの pCAGGS-Epoまたは pCAGGSを用いた血清 Epo レベル に対する注射時間 (a)または容量 (b)の効果である。 n=4/群。 cは、 血清 Epo レベル に対する DNA注射量変化の効果である。 n=5/群。 コントロールラッ卜との各時点 での比較は、 *が Ρ<0·05、 **が Ρ<0·01、 ***か' Ρく 0.001、 および ****が Ρく 0.0001、 各 群内での注射前と注射後との相違は、 #が Ρ<0.05、 ##が Ρ<0.01、 ###が Ρ<0.001、 および #####が Ρ<0·0001である。 図 5は、 pCAGGS-Epo注射 1 日後の主要臓器における pCAGGS-Epo DNAの PCR 分析の結果である。 Bは脳、 Hは心臓、 Luは肺、 ϋは肝臓、 Spは脾臓、 LKは左腎 臓、 RKは右腎臓、 Muは筋肉、 Skは皮虜、 Tは精巣、 BIは血液。 図 6は、 主要な臓器における Epo mRNAについての RT-PCR分析の結果である。
B：脳、 H：心臓、 Lu：肺、 ϋ：肝臓、 Sp：脾臓、 LK：左側の賢臓、 RK：右側の腎 臓、 Mu：筋肉、 Sk：皮廣、 T：精巣である。 図 7は、 100 gのプラスミド DNA注射後の血清 Epoレベル （a) 、 網状赤血球数 (b) およびへマトク ット ） の絰畤的変化を示すグラフである。 pCAGGS-Epo とコントロールラッ卜との各時点での比較であり、 *が P<0.05、 **が P<0.01、 ***が P<0.001、 および ****が Pく 0.0001、 n=3/群である。 図 8は、 遺伝子導入による潜在的な腎臓損傷についての組織学的試験の結果を示 す顕微鏡写真である。 腎臓切片を PAS で染色した。 aは未注射ラッ卜の腎臓切片、 bおよび cは pCAGGS-Epo 注射から 1 日後 (b)および 7日後 (c)のラッ卜の腎臓切片 である。 倍率は 140倍。 図 9は、 注射した腎臓の機能分析の結果を示すグラフである。 〇印は pCAGGS注 射を行った腎片側摘出ラッ卜、 口印は pCAGGS注射を行わなかった腎片側摘出ラッ 卜、 圔印は未注射の非手術ラッ卜。 n=6Z群。 正常ラッ卜との各時点での比較は、 * が P<0.05および **が Ρ<0·01。 図 10 は、 賢臓を標的とした遺伝子発現における CAG プロモーターの役割を調べ た結果である。 naked DNA注射の 1週間前 （口） および 1週間後 （國） に血清 Epo レベルを調べた。 n=6Z群。 各群間の注入前および注入後の Epo レベルの相違は、 * が Ρ<0·05、 ****が Ρ,Ο.0001 である。 pCAGGS 群との比較 （各時点での比較） は ††††が Pく 0.0001、 pCI群との比較 (各時点での比較) は ####が P<0.0001、 pCI-Epo 群との比較 （各時点での比較） は $$$$が P<0.0001。
発明を実施するための最良の形態 この発明の方法において、 プラスミドベクターを組換えるために使用する外来遺 伝子は、 例えば腎臓機能に影響を及ぼす各種サイ卜力インやホルモンをコードする 遺伝子 （DNAや RNA等のポリヌクレオチド） である。 また、 この発明方法の用途に 応じては、 腎疾患の治療用遺伝子を用いることもできる。 さらにこの発明の方法で は、 腎疾患以外の疾患の治療用遺伝子 （例えば、 フアブリ病に対する α - galactosidase Α遺伝子、 ）8サラセミアに対する Epo遺伝子） を用いることができる。 すなわちこの発明方法では、 例えば 2 / g程度の少量のプラスミドベクターを導入す ることによつても導入遺伝子を長期間に渡って腎臓で発現させることが可能である ため、 腎臓を遺伝子発現の工場 （biofactory) として使用して、 分泌性タンパク質の 供給による各種疾患の治療も可能となる。 このような遺伝子 （ポリヌクレオチド） は、 ゲノム遺伝子をそのまま用いること もでき、 あるいは遺伝子から転写された mRNAや、 mRNAから合成された cDNAを 用いることもできる。 また、 mRNA や cDNA を用いる場合には、 腎臓での遺伝子発 現を制御するプロモータ一/ェンハンサー配列等をポリヌクレオチドに連結するよ うにする。 プラスミドベクターは特に制限はなく、 動物細胞発現用に通常用いられているプ ラスミド DNAを適宜に使用することができる。 プラスミド DNAへの外来遺伝子ポ リヌクレオチドの挿入も、 公知の方法によって行うことができる。 このようにして構築した組換えプラスミドベクターは、 肾静脈を介して逆行性に 腎臓内に投与される。 対象とする腎臓は、 ヒ卜または非ヒ卜哺乳動物の腎臓である。 ヒ卜腎臓を対象とする場合は、 遺伝子治療としての効果が期待される。 また非ヒ卜 動物の場合は、 例えば腎疾患モデル動物を対象とすることによって、 導入した治療 用遺伝子の効果を動物個体レベルで確認することができる。 あるいは、 腎疾患の原 因遺伝子を個体内で発現させることによって、 新しい腎疾患動物モデルを作出する こともできる。 腎臓への組換えプラスミドの導入は、 注射液に組換えプラスミドを混合し、 一時 的にクランプした腎静脈にプラスミド溶液を注射することによって行うことができ る。 あるいはまた、 大腿静脈、 頸静脈、 鎖骨下静脈、 肘静脈等に経皮的静脈カテー テルを刺入し、 このカテーテルを介してプラスミド溶液を注入するようにしてもよ い。 注射液中のプラスミドの濃度や注射液の投与量は、 対象とする動物種によって 異なるが、 ヒ卜の場合には、 プラスミド l g〜20mg程度を投与すればよい。 以上の方法によって組換えプラスミドベクターを投与された腎臓は、 ベクターに 保持された外来遺伝子が少なくとも 6ヶ月間発現するため、 腎機能の改善や、 ある いは遺伝子による腎疾患治療効果が長期間維持される。 この発明の方法はまた、 移植可能な状態として人体より摘出した賢臓組織を対象 として行うこともできる。 この場合も、 腎臓はその静脈とともに摘出し、 この静脈 を介してプラスミド溶液を腎臓内に投与する。 そして組換えプラスミドベクターを 注入した腎臓を人体内に移植することによって、 導入遺伝子が腎臓内で発現し、 長 期間に渡っての腎機能改善や賢疾患の治療効果が計られる。 実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明する が、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
1 . 方法
1 .1 プラスミド DNA
文献 （Hum. Gene Ther. 1 1 , 429-437, 2000 ) に記載された Qiagen EndoFree plasmid Giga kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) を用い,こ方 によって、 CAG (サイ卜メガロウィルスェンハンサーノニヮトリ）3—ァクチンハイプリッド） プロ モーターを有する pCAGGS発現ベクター （Gene. 108, 193-199, 1991 ) の Xhol部位 にエリスロポエチン （Epo ) の cDNA を挿入し、 組換えプラスミ ドベクター pCAGGS-Epo を構築した。 コントロールとしては、 Epo cDNA を挿入しない空の pCAGGSプラスミドを使用した。
1 .2 ラッ卜
8週齢の雄 Wistarラッ卜を、 Charles-River Japan Inc. (Tokyo, Japan)から購入し、 遺伝子導入に使用した。
1 .3 プラスミド DNAの注入
プラスミド DNAをリンゲル溶液で希釈した。 ラッ卜をジェチルエーテルで麻酔し、 腹部正中断面の切開の直後にプラスミド DNA溶液を注射し、 左側の腎静脈および腎 動脈をクランプした。 24 ゲージのカテーテル （SURFLO I.V.; Terumo, Tokyo, Japan) を用いて、 静脈にプラスミド DNA 溶液を注射し、 注射直後に血流を再開さ せた。 インキュベーションは行わなかった。 5秒間圧迫し、 注射部位を止血した。
1 .4 全組織の DNA抽出と PCR
注射 1 日後と 24週後に、 100 gの pCAGGS-Epoを投与したラッ卜を全身麻酔 下で屠殺し、 両腎臓、 脳、 心臓、 肺、 肝臓、 脾臓、 筋肉、 皮痛、 精巣および血液を 単離した。 Laird等 （Nucleic Acids Res. 19: 4293, 1991 ) に従って組織サンプルから DNAを単離し、 以下の特異的プライマーを用いて、 pCAGGS-Epoに含まれるサイ卜 メガロウィルス （CMV) の immediate-earlyェンハンサー領域を PCR増幅した。
CMV-1フォワードプライマー： 5'-GGGTCATTAGTTCATAGCC-3' (配列番号 1 )
CMV-2リバースプライマー: 5'-GGCATATGATACACTTGAT-3' (配列番号 2 )
PCRの手続は、 [95°C 1分： 60°C2分： 74°C2分] X 1サイクルと、 [94°C 1分：
60°C 1 分： 72°C 1 分] X 29サイクルとした。 PCR産物は 4<¼ァガロースゲルに泳動 し、 215bpの CMVェンハンサー DNAを解析した。
1 .5 全組織の RNA抽出と RT-PCR
注射 1 日後に、 100 x gの pCAGGS-Epoまたは pCAGGSを投与したラッ卜を全身 麻酔下で屠殺し、 両賢臓、 脳、 心臓、 肺、 肝臓、 脾臓、 筋肉、 皮廣および精巣を単 離した。 Isogen ( Nippon Gene, Tokyo, Japan) を用いて組織サンプルから全 RNA を単離し、 以下の特異的プライマーを用いた RT-PCRによって Epo mRNAと、 コン 卜ロールとしてのグリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ （G3PDH) mRNA の発現を検出した。
Epoリバースプライマー： 5'-GCCCAGAGGAATCAGTAGCA-3' (配列番号 3 )
Epoフォワードプライマー： 5'-TCTGACTGACCGCGTTACTC-3' (配列番号 4 )
G3PDHリバースプライマー ： 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (配列番号 5 )
G3PDHフォワードプライマー ： 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (配列番号 6 ) なお、 Epo フォワードプライマーは、 CAG プロモーターの転写開始部位のすぐ下 流の配列にハイブリダィズするようにを設計した。 すなわち、 pCAGGS-Epo 中の CAGプロモーターと Epo cDNAとの間にはィン卜ロンが存在するため、 このィン卜 ロンを含むように Epo RNA検出用のプライマーセッ卜を設計して、 プラスミド DNA またはゲノム DNAからの PCR産物と区別できるようにした。 G3PDH mRNA検出用 のプライマーセットも、 イン卜ロンを含むように設計した。 4%ァガロースゲル電気 泳動によって RT-PCR産物を分析した。 予想産物の長さは、 Epo mRNAでは 170bp、 G3PDH mRNAでは 452bpである。
1 .6 血液分析
文献 ( Hum. Gene Theに 1 1 , 429-437, 2000; Gene丁 heに 8， 461 -468, 2001 ) の言 Sffi に従って、 Epo レベル、 へマトクリツ卜、 網状赤血球および血清中クレアチニンを 測定した。
1 .7 X-galおよび免疫組織化学的染色
pCAGGS-lacZは、 Escherichia coliの) 8ガラク卜シダ一ゼを発現する （Gene. 108, 193-199， 1991 ) 。 100 / gの pCAGGS-lacZを注射した腎臓を組織化学的に解析した。 注射 1 日後に X-gal 染色用に両側の賢臓を採取し、 Tissue-Tek O.C.T.化合物 (Sakura Finetechnical Co.Ltd., Tokyo) に包埋し、 ドライアイスおよびアセトンの 混合物中で凍結した。 クリオスタツ卜で連続切片 （厚さ 5 w m) に切断し、 3-ァミノ プロピル卜リエ卜キシシランでコートしたガラススライド上に貼り付けた。 切片を 1 .5%ダルタルアルデヒド中、 室温で 10 分間固定し、 冷リン酸緩衝化生理食塩水で 3回洗浄し （5分ノ洗浄） 、 1 mg/ml X-gaU 2 mM MgCI2、 5 mM K4Fe(CN)6、 5 mM K3Fe(CN)6、 0.5% Nonidet P-40 (pH 7.4) を含む X-gal染色溶液中、 37°Cで 3時間 インキュベートした。 文献 （Nature Biothechnol. 16, 867-870, 1998) 記載の方法に 従って切片を X-galで染色し、 nuclear fast redで核染色を行った。
腎臓の血管内皮を同定するために、 マウス抗ラッ卜内皮細胞モノクローナル抗体 RECA-1 ( Cosmobio, Tokyo, Japan ) ( Lab. Invest. 66, 459-466, 1992 ) を含む Envion+mouse ( Dako.Tokyo, Japan) を用いて連続切片を免疫染色し、 へマ卜キシ リンで核染色した。
1 .8 二重免疫蛍光染色
PTCにおける導入遺伝子の発現部位を特定するため、 100 gの pCAGGS-lacZを 注射した腎臓を分析した。 注射 1 日後の腎臓を 5 厚で切片化し、 4°Cで 5分間、 ァ セトンで固定した。 この切片を、 ゥサギ抗 E. coli )8ガラクトシダーゼ抗体 （1 :200希 釈、 Biogenesis, Poole, UK) およびマウス抗ラッ卜内皮細胞モノクローナル抗体 RECA-1 (1 :100希釈、 Cosmobio) と共に 30分間室温でインキュベーションし、 次 いで、 フルォレセインイソチオシァネー卜 （FH"C) を標識したブタ抗ゥサギ IgG (1 :20希釈、 DAKO) またはテ卜ラメチルローダミンイソチ才シァネー卜 （TRITC) を標識したャギ抗マウス IgG ( 1 :20希釈、 Southern Biotechnology Associates, Aし， USA) と共に室温で 30分間インキュベートした。 各切片は、 BX50 システム顕微鏡 (Olympus Promerketing, Tokyo, Japan) を使用して分析した。 全ての顕微鏡像は、 PM-30 フォトマイクログラフィーシステム （Olympus Promerketing ) を使用し、 FITCおよび TRITC用にセッティングしたビルターを用いて撮影した。 画像処理には Adobe Photoshop (Adobe Systems, CA) を使用した。 導入遺伝子部位は緑色蛍光で、 PTCは赤色蛍光で検出した。
1 .9 免疫電子顕微鏡
PTC の導入遺伝子発現部位をさらに微細構造レベルで確認するため、 100 g の pCAGGS-lacZ を注射した肾臓を分析した。 注射 1 日後、 ラッ卜をジェチルエーテル で全身麻酔し、 大動脈を介して、 50mlの PBSを、 次いで 50mlの periodate-lysine- paraformaldehyde を灌流した。 腎臓は periodate-lysine-paraformaldehyde固定剤で 4°C4時間固定し、 PBS中 1 %ショ糖で 1時間処理し、 Tissue-Tek O.C.T.化合物で包 埋し、 そしてへキサン中- 80°Cで凍結させた。 クリオスタツ卜で 4 At m 厚に切片化し、 ゥサギ抗 E. coli Pガラクトシダーゼ抗体 （1 :800 希釈、 Biogenesis) と共に室温で 30 分間インキュベートした。 PBS で洗浄後、 各切片をャギ抗ゥサギ lg EnVision+ ペル才キシダーゼゥサギ抗体 （1 :10希釈、 DAKO) と共に 1 時間インキュベーショ ンした。 次いで、 各切片を PBSで洗浄し、 0.01 % H202を含む Trisバッファー （pH 7.6) 中で 0.02% diaminobenzidine (DAB) と共に 3分間インキュベートした。 PBS で洗浄後、 2.5% glutaraldehyde で室温 3分間固定した。 各切片を PBS で洗浄後、 0.1 M リン酸バッファ一 （pH 7.2) 中で 1 % Os04で 3分間さらに固定し、 蒸留水で 洗浄し、 エタノールで段階的に脱水し、 Epon の同等物である Epok 812 (Oken, Tokyo, Japan) に水平包埋した。 Epok 812で重合した後、 光学顕微鏡で分析し、 選 択領域をウルトラミクロ I ^一厶を用いて 100nm厚に切片化した後、 H-600電子顕微 鏡 （Hitachi, Ibaragi, Japan) を用いて DAB染色部位を分析した。
1 .10 腎臓の組織学的分析
プラスミド DNAの注射後 1 日後、 7日後および 24週間後の腎臓を回収し、 1 0 % 緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、 パラフィンに包埋処理し、 通常の光学顕微鏡観 察を行った。 次いで、 遺伝子導入法による組織損傷を検出するため、 過ヨウ素酸一 Schiff ( PAS) で 5 /i mの切片を染色した。 1 .1 1 腎臓機能
組換えヒ卜 Ερο 治療の一つの副作用は、 尿毒症ラッ卜における腎機能の低下であ る （Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 142-146, 1988) 。 この尿毒症ラッ卜における賢 機能傷害は、 エレクト口ポーレーシヨン法による筋への Epo遺伝子導入によって増 強される （Gene Ther. 8:461 -468, 2001 ) 。 その理由として、 Epo遺伝子導入によつ て引き起こされる多血症が遺伝子導入腎臓の機能に対して好ましくない作用を及ぼ すことが考えられる。 そこで、 1 .0mlの 100 g pCAGGSの腎静脈内注入 （これ自体 は導入遺伝子発現によって腎機能に影響を及ぼさない） の直後から腎臓が正常に機 能するか否かを調べた。 なお、 一方の非注入賢臓が注入腎臓の機能障害を補償する ことを防ぐため、 左腎臓にプラスミドを注入し、 右腎臓は摘出した。 正常ラッ卜と、 DNA 非注入の片側腎摘出ラッ卜をコントロールとし、 賢機能の内因性マーカーであ る血清クレアチンレベルを測定した。
1 .12 統計的分析
数値データは平均値土平均標準偏差として示した。 Macintosh 用の StatView統計 プログラム （SAS， Cary, NC ) を用いて全データを分析した。 統計的有意性を unpaired t検定で評価した。 PO.05を統計的有意性とみなした。
2. 結果
2.1 墨汁の移送部位
プラスミド DNA溶液が逆行性腎静脈注射によって PTC に到達することができる かどうかを調べるために、 最初に墨汁を注射した。 静脈から間質領域への墨汁の移 行が検出され、 出血することなく PTCが拡張した （図 1 a) 。 糸球体または尿細管組 織のいずれにも墨汁の移行は認められなかった。
2.2 pCAGGS-lacZ遺伝子発現の局在化
導入遺伝子の発現部位を明らかにするために、 腎臓に 100 t gの pCAGGS-lacZま たは pCAGGSを移送した。 pCAGGS-lacZを注射した腎臓間質のみが X-gal染色さ れ （図 1 b) 、 pCAGGSを注射した賢臓は染色されなかった （データ示さず） 。 5匹 のラッ卜に pCAGGS-lacZを導入し、 全ての注入腎臓に X-gal染色が再現されること を確認した。 PTCおよび糸球体毛細血管の内皮は RECA-1抗体と反応した （図 1 c) 0 2つの連続切片を比較すると、 一方は X-galで染色され、 他方は RECA-1で染色され、 導入遺伝子の発現が PTCを含む間質に限局することを示した。
導入遺伝子の発現部位を明確化するため、 二重免疫蛍光染色によって腎臓切片を 分析した。 pCAGGS-lacZの発現は、 ゥサギポリクロ一ナル抗 E. coli )3ガラクトシダ ーゼ抗体と、 FITC 標識ブタ抗ゥサギ IgG による免疫染色によって、 幾つかの PTC が交叉する部位に、 広い緑色蛍光として検出された （図 2 a) 。 PTC 内皮細胞は、 RECA-1 と、 TFMTC標識ャギ抗マウス IgG とによる染色によって、 細い赤色蛍光と して検出された （図 2 b) 。 この二重免疫染色は、 黄色がかった緑色領域を取り囲む ような黄色蛍光を示したが、 このことは、 導入遺伝子が PTC の限られた領域内また はその近傍で発現することを示唆する （図 2 c) 。
導入遺伝子発現細胞は、 さらに免疫電子顕微鏡で調べ （図 3 ) 、 腎間質細胞の形 態学 （Anat. Embryol. 193:303-318, 1996) に基づいて特定した。 その結果、 DAB産 物は一様に、 PTC 近傍の線維芽細胞の細胞質に検出された （図 3 a，b,c) 。 線維芽細 胞は、 長い細胞質突起を伸長し、 PTC 内皮細胞の細胞質および尿細管にしっかりと 接着していた （図 3 a,b，c) 。 内皮細胞、 マクロファージ、 樹状細胞および外膜細胞 には DAB産物は全く観察されなかった。
以上の結果は、 導入遺伝子の発現部位が、 PTC 近傍の線維芽細胞であることを示 している。
2.3 遺伝子導入効率に対する注射パラメータの影響
プラスミドベクター pCAGGS-Epo注入後の血清 Epo測定および赤血球分析によつ て、 導入遺伝子 （Epo) の生理学的効果を調べた。
始めに、 ラッ卜腎臓が適応できる最大注射容積を測定した。 8週齢の雄 Wis r ラ ッ卜の平均腎容量は 1 .0 ±0.02ml (n=10) であった。 遺伝子導入効率に対する注射時 間 （5〜60秒） および容積 （0.5〜2.0ml) を変化させ、 800 gのプラスミド DNA注 射の 1週間前および 1週間後の血清 Epo レベルを測定して効果を評価した。 プラス ミド DNA溶液を 5秒以内 （図 4 a) で 1 .0mlの容積 （図 4 b) で注射した場合、 最大 Epo発現が得られた。 注射中、 腎臓は少し膨張した。 次に、 5秒間の注射時間および 1 .0mlの容積で DNAの注射量を変化させたときの効果を評価した。 Epo レベルと、 注射した 100 w g までの DNA 量との間に容量依存的相関が認められた。 実質的な Epo遺伝子発現レベルはわずか の DNAで認められた （図 4 c) 。
2.4 主要臓器における Epo導入遺伝子と mRNAの PCR分析
臂静脈への逆行性注入は、 プラスミド DNAを解剖学的に腎臓へ導入させるが、 そ の腎臓特異的発現を保障する技術的特徴は何ら存在しない。 そこで、 プラスミ ド DNAが注入肾臓にのみ特異的に導入され、 そこで特異的に発現するか否かを確認す ることが必要である。 図 5に示したように、 注射 1 日後、 PCR によって pCAGGS- Epoを注射した左腎臓のみで Epo DNAが検出されたが、 他の如何なる組織でもそれ は検出されなかった。 また、 RT-PCR によっても、 導入遺伝子に由来する Epo mRNAが注射した左腎臓でのみ検出されたが （図 6 a) 、 他の組織では全く検出され なかった。 さらに、 コントロール pCAGGSを注射した腎臓では Epo mRNAは検出 されなかった （データ示さず） 。 全ての注射腎臓でコントロールの G3PDH mRNA が検出された。 同様に、 PCR によって Epo導入遺伝子 DNAが検出され （データ示 さず） 、 注射 24週後でも Epo mRNAが RT-PCRによって検出された。
以上の結果から、 腎静脈を介して逆行性に注射した導入遺伝子の発現は、 注射 1 日後には注射した側の腎臓にのみ特異的となり、 それは 24週間以上維持されること が確認された。
2.5 pCAGGS-Epo注射後の時間経過
DNA注射量を変化させて、 Epo 発現の時間経過を調べた。 注射液の量は 1 .0ml、 注射時間は 5秒間に統一した。 ラッ卜は 4群 （各 3匹） に分けた： pCAGGS-Epo 100 g群、 pCAGGS-Epo 30 ^ g群、 pCAGGS-Epo 2 /i g群、 pCAGGS l OO g群。
100 gの pCAGGS-Epoの注射後、 血清 Epoレベルは 5週後に 208.3±71 .8mU/ml でピークに達し、 24週後までに 1 16.2±38.7mU/mlに徐々に減少した （図 7 a) 。 24 週後まで、 2 g群および 群でも同様のパターンが観察された。 導入遺伝子に 由来する Epo分泌により網状赤血球増加症を発症した （図 7 b) 。 へマ卜クリツトレ ベルは、 試験の最後の時点である少なくとも 24 週後で、 2 ii g 群ラッ卜ですら pCAGGS 注射コントロールよりも有意に高かった （図 7 c) 。 pCAGGS-Epo 導入は 生物活性 Epo を継続的に産生するので、 網状赤血球およびへマトクリツ卜レベルを 投与量依存的に有意に上昇させた。
2.6 腎臓損傷の組織学的試験
腎臓損傷の可能性を評価するために、 プラスミド DNAを含む 1 .0mlのリンゲル液 を注射したラッ卜由来の胬臓切片を分析し、 注射していない正常なラッ卜と比較し た （図 8 a) 。 正常ラッ卜からの腎臓切片 （図 8 a) と比較して、 1 日後 （図 8 b) ま たは 7日後 （図 8 c) では、 遺伝子導入した腎臓切片において PTCの内皮細胞を特定 することはやや困難であつたが、 pCAGGS-Epo注射の 1 日後 （図 8 b) または 7 日 後 （図 8 c) で得た皮質、 髄質、 または乳頭切片では明かな病理学的変化は認められ なかった。 同様に、 pCAGGS-Epo注射後の 24週目でへマ卜クリツ卜を 90%まで増 加させたラッ卜においても明らかな病理学的変化は認められなかった。
2.7 注射後の膂機能
1 .0mlの 100 g pCAGGSを静脈注射直後では、 腎臓は正常に機能することができ、 導入遺伝子発現による賢機能に影響を及ぼさない。 未注射の腎臓は、 機能的問題を 代償し、 データの解釈を狂わせる可能性があるので、 注射した腎臓の機能を試験す るために、 未注射の腎臓を取り出す必要があった。 したがって、 左側の賢臓に注射 し、 右側の腎臓を摘出した。 正常で手術していないラッ卜および DNA注射せずに片 側を腎摘出したラッ卜をコントロールとして使用した。 腎機能の内因性マーカーで ある血清中クレアチニンレベルを測定した。 成長するにつれて血清中クレアチニン 濃度が増加し、 この増加は片側賢摘出によって有意に上昇した。 血清中クレアチニ ンレベルは、 DNA 注射に関係なく任意の時点で片側肾摘出群の間で有意差はなかつ た （図 9 ) 。 全てのラッ卜が手術および注射に耐え、 正常であった。
以上の結果から、 逆行性の腎静脈注射を介した遺伝子導入後の腎臓が正常に機能 することが確認された。 2.8 pCAGGS-Epo導入 24週間後のラット腎機能 pCAGGS-Epo導入 24週間後にへマトクリッ卜を 90<½まで増加させたラッ卜の腎 機能を調べた。 注射 1 週間前の時点では、 pCAGGS-Epo 100 /i g 群ラッ 卜と pCAGGS 群ラッ卜との間で、 血清クレアチンレベルには差は見られなかった （0.5土 0.0mg/dl対 0.6 ±0.1 mg/dl) が、 注射 24週後では、 pCAGGS-Epo ^ 00 g群ラッ卜 の血清クレアチンレベルは pCAGGS群ラッ卜よりも有意に高かった （0.6± 0.1 mg/dl 対 0.5 ± 0.1 mg/dl (p<0.05) 。 しかしながら、 血清クレアチンレベルは、 両群とも正 常範囲内であった。
2.9 肾臓標的化遺伝子発現における CAGプロモーターの役割
腎臓標的化遺伝子導入実験においては、 CMV プロモーターノエンハンサー領域を 含む発現プラスミ ドベクターが一般的に使用されている （Science 261 :209-21 1 , 1993; Hum. Gene Ther. 8:1243-1251 , 1997; Gene Ther. 4:426-431 , 1997; J. Clin. Invest. 101 :1320-1325, 1998; Gene The 7:279-285， 2000) 。 従って、 遺伝子導入 方法の違いによる効果と、 プロモーターの効果とを区別することが重要である。 そ こで、 CMV 系コンストラクト （pCI-Epo) を用いて逆行性腎静脈注射法を実施した。 すなわち、 pCAGGS-Epoを制限酵素 EcoRIで切断し、 726bpのラット Epo cDNA断 片を得、 CMV immediate-early遺伝子プロモーター/ェンハンサーを保有する pCI発 現ベクター （Promega, Madison, WI) の EcoRI サイ卜に挿入し、 プラスミド pC Epoを構築し、 文献 （Hum. Gene Ther. 1 1 :429-437, 2000) に記載のとおりにプラス ミドを調製した。 また、 空の pCI プラスミドをコントロールとした。 ラッ卜は 4群 (各 6匹） に分けた： pCAGGS-Epo 100 /x g群、 pCAGGS 100 ^ g群、 pCI-Epo 100 μ- g群、 pCI 100 t g群。 血清 Epo レベルを、 各プラスミド注射の 1週間前と 1週間 後に測定した。 また、 RT-PCR によって、 pCI-Epo を注射した腎臓における Epo mRNA を確認した （データ示さず） 。 図 1 0に示したように、 しかしながら、 pCI- Epo を導入した場合の血清 Epo レベルは極めて低かった。 これに対し、 pCAGGS- Epoを導入した場合には、 高い血清 Epoレベルが得られた。
以上の結果から、 CAG プロモーターは、 逆行性の腎静脈注射法によって腎臓標的 化遺伝子導入にとって重要な要素の一つであることが確認された。 3. 考察
以上の結果から、 組換えプラスミドベクターの逆行性賢静脈注射により、 PTC 近 傍の間質線維芽細胞における外来遺伝子の長期的な発現が可能であることが確認さ れた。 すなわち、 電子顕微鏡検査によって導入遺伝子の発現部位が PTC 近傍の線維芽細 胞であることが確認された。 また、 図 3 b に示したように、 線維芽細胞は PTC 内皮 細胞に接着していた。 ラッ卜腎臓の間質組織構造は、 既に報告されている （Cell Tissue Res. 264:269-281 , 1991 ; Anat. Embryyol. 193:303-318, 1996) 。 線維芽細胞 のこのような特徴が、 二重免疫染色の結果 （黄色がかった緑色領域が黄色領域の外 側に位置する） を説明すると思われる。 間質線維芽細胞は、 賢障害の発症において鍵となる部位である。 多くの進行性腎 疾患の共通経路は線維症過程であリ、 これは肾線維芽細胞の増殖とこれらの細胞に よる細胞外マトリックスの分泌を含んでいる （Kidney Int. 39:550-556, 1991 ) 。 線維 芽細胞への有効な in vivo遺伝子導入は、 線維症治療方法の開発という観点からも、 線維症の基礎的な生物学的メカニズムの解明という観点からも極めて重要である (Nephrol. Dial. Transplant. 14:1615-1617, 1999) 。 興味深いことに、 尿細管周囲の 線維芽細胞は内因性の Epo 産生の主要部位である （丄 Histochem. Cytochem. 41 :335-341 , 1993; Kidney Int. 51 :479-482, 1997; Kidney Int. 44:1 149-1162, 1993) 。 今回の研究は、 逆行性 g静脈注射法が、 内因性の Epo産生部位に外因性の Epo遺伝 子を導入させることができることを初めて示した。 この発明の方法では、 遺伝子導入用の特異的ベクターや特別なデバイスを用いず に逆行性腎静脈注射を行った。 リポプレックスまたはポリプレックス調製と比較し てプラスミド DNA溶液の調製は簡単である。 遺伝子導入に起因する肾毒性は、 ブラ スミド DNA を注射した筲臓の組織学的試験または機能試験のいずれによっても生じ なかった。 この発明の方法では、 DNA 注射前にもインキュベーションも、 腎臓のフ ラッシングも必要がない。 注射中の血流の遮断によって発症する虚血は 2分間未満 である。 同様に、 機械的ストレスを受けやすい内皮への効率的な遺伝子発現は、 こ の発明方法の安全性を支持するものである。 効率的な導入遺伝子発現の重要なパラメータ一は、 注射量および注射速度であつ た。 導入遺伝子発現の最適注射量 （1 .0ml) は、 腎臓容量と等しかった。 DNAが血液 と混合する前に、 迅速な注射により PTC 内皮に DNA分子が直接暴露されるので、 DNA溶液の適切な容量の迅速な注射は、 血清および細胞ヌクレアーゼによる DNA分 解から注入プラスミド DNAを保護することができる。 さらに、 導入遺伝子発現にとって CAG プロモーターを選択することが有効であり、 CMV プロモーターはこの発明方法によって腎臓を標的とする遺伝子導入を行うため にはふさわしくないことも確認された。
Epo 遺伝子の導入は、 投与量依存的に赤血球造血を生じさせた。 100 g の pCAGGS-Epoを腎静脈注射した後の血清 Epoレベルは、 エレクト口ポーレーシヨン 法によって 400 g の pCAGGC-Epo を筋中に導入した場合のレベル （Hum. Gene Ther. 1 1 :429-437, 2000 ； Gene Ther. 8:461 -468, 2001 ) と同等かまたはそれ以上で あった。 pCAGGS-Epoを腎静脈注射した後の 24週後の血清 Epo レベルは、 最高値 の Epo レベルの約 1/2であり、 これは筋肉へ遺伝子導入した場合の 5週後のレベル と同一である （Gene Theに 8:461 -468, 2001 ) 。 従って、 賢静脈注射による遺伝子導 入効率と、 遺伝子発現の持続性は、 in vivo エレク卜口ポーレーシヨン法による筋注 射よりも優れていることが確認された。 また、 この発明の方法は、 以前の報告 （Gene Ther. 4, 426-431 , 1997; J. Clin. Invest. 101 , 1320-1325, 1998; Kidney Int. 57, 1973-1980, 2000; Hum. Gene Ther. 8, 1243-1251 , 1997; Gene Ther. 7， 279-285, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 129-34, 1992; J. Clin. Invest. 92, 2597-2601 , 1993; Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 525-532, 1995) と比較して、 長期の遺伝子発現を可能とする。 線維 芽細胞の寿命は知られていないが、 かなり長期である。 線維芽細胞への遺伝子導入 の局在化は長期の遺伝子発現において重要な要因である。 このことは、 この発明方 法が、 非ウィルスベクターによる腎臓遺伝子導入法における重要な問題 （卜ランス フエクシヨン効率の低さおよび短期発現） を克服するものであることを示している < さらにまた、 この発明方法は、 容易にヒ卜に適用することができる。 カテーテル 法を実用すれば、 非侵襲的に治療遺伝子を賢臓に移送することもできる。 この発明 方法はまた、 腎移植の際の ex vivoでの遺伝子導入に有用である。 移植の成功は、 主 に急性拒絶の抑制に依存する (Transplantation. 55， 752-757, 1993; N. Engl. J Med. 342, 605-612, 2000) 。 PTC近傍への特異的遺伝子導入は、 免疫細胞機能または炎症 過程のメディエーターのいずれかを抑制する治療タンパク質の長期導入にも有用で ある。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 安全かつ効率的に外来遺 伝子を腎臓に導入し、 長期間に渡って導入遺伝子を発現させることのできる方法が 提供される。 これによつて、 賢疾患の遺伝子治療の可能性が大きく前進する。

Claims

請求の範囲
1 . 外来遺伝子によって組み換えたプラスミドベクターを経肾静脈的投与により腎臓 に導入し、 外来遺伝子を主として腎臓間質の線維芽細胞で発現させることを特徴と する遺伝子発現方法。
2. 外来遺伝子が腎疾患治療用遺伝子である請求項 1の方法。
3. 絰皮的静脈カテーテルを介して経腎静脈的投与を行う請求項 1の方法。
4. 移植可能な状態で人体より摘出した肾臓または腎細胞に組換えプラスミドを導入 する請求項 1または 2の方法。
PCT/JP2002/005067 2001-05-25 2002-05-24 Methode d'expression de gene etranger dans le rein WO2002097087A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/478,537 US7381709B2 (en) 2001-05-25 2002-05-24 Method of expressing foreign gene in kidney

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001157810 2001-05-25
JP2001-157810 2001-05-25
JP2002-032230 2002-02-08
JP2002032230A JP3939160B2 (ja) 2001-05-25 2002-02-08 腎臓における外来遺伝子発現方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002097087A1 true WO2002097087A1 (fr) 2002-12-05

Family

ID=26615745

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/005067 WO2002097087A1 (fr) 2001-05-25 2002-05-24 Methode d'expression de gene etranger dans le rein

Country Status (3)

Country Link
US (1) US7381709B2 (ja)
JP (1) JP3939160B2 (ja)
WO (1) WO2002097087A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1294888B1 (en) * 2000-06-30 2007-04-25 ZymoGenetics, Inc. Interferon-like protein zcyto21
EP1364578A4 (en) * 2001-02-27 2004-09-15 Japan Government MODEL ANIMAL WITH SCHIZOPHRENIA-LIKE MENTAL ILLNESS, METHOD FOR OBTAINING THE SAME, AND USE
GB0110029D0 (en) * 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
US20060026699A1 (en) * 2004-06-04 2006-02-02 Largaespada David A Methods and compositions for identification of genomic sequences
US20060080745A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Cornell Research Foundation, Inc. Gene reactivation by somatic hypermutation
JP4748639B2 (ja) * 2004-11-01 2011-08-17 宮崎県 肝臓疾患治療剤
US7759542B2 (en) * 2007-08-01 2010-07-20 National Yang-Ming University Glycine N-methyltransferase (GNMT) animal model and use thereof
WO2009105244A1 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Recombiant non-human mammalian model for hepatitis infection and immunopathogenesis

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050617A1 (en) * 1999-02-26 2000-08-31 Mirus Corporation Intravascular delivery of non-viral nucleic acid

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050617A1 (en) * 1999-02-26 2000-08-31 Mirus Corporation Intravascular delivery of non-viral nucleic acid

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAI MAKOTO ET AL.: "In vivo transfection of genes for renin and angiotensinogen into the glomerular cells induced phenotypic change of the mesangial cells and glomerular sclerosis", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 206, no. 2, 1995, pages 525 - 532, XP002955050 *
BOLETTA ALESSANDRA ET AL.: "Nonviral gene delivery to the rat kidney with polyethylenimine", HUMAN GENE THERAPY, vol. 8, no. 10, 1997, pages 1243 - 1251, XP002955049 *
ISAKA YOSHITAKA ET AL.: "Glomerulosclerosis induced by in vivo transfection of transforming growth factor-beta or platelet-derived growth factor gene in to the rat kidney", J. CLIN. INVEST., vol. 92, 1993, pages 2597 - 2601, XP002955051 *
LAI LI-WEN ET AL.: "Correction of renal tubular acidosis in carbonic anhydrase I I-deficient mice with gene therapy", J. CLIN. INVEST., vol. 101, no. 7, 1998, pages 1320 - 1325, XP002955048 *
MARUYAMA HIROKI ET AL.: "Kidney-targeted naked DNA transfer by retrogade renal vein injection in rats", HUMAN GENE THERAPY, vol. 13, no. 3, 10 February 2002 (2002-02-10), pages 455 - 468, XP002955053 *
TOMITA NARUYA ET AL.: "Direct in vivo gene introduction into rat kidney", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 186, no. 1, 1992, pages 129 - 134, XP000579745 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003040803A (ja) 2003-02-13
JP3939160B2 (ja) 2007-07-04
US7381709B2 (en) 2008-06-03
US20050070014A1 (en) 2005-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Maruyama et al. Kidney-targeted naked DNA transfer by retrograde renal vein injection in rats
US11654162B2 (en) Cell-based therapy for the pulmonary system
US9827270B2 (en) Cell-based therapy for the pulmonary system
Zhang et al. Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates
Vittitow et al. Gene transfer of dominant-negative RhoA increases outflow facility in perfused human anterior segment cultures
US20050095227A1 (en) Treating heart failure
JPH11503123A (ja) 腎臓内への遺伝子の転移
Huang et al. Cardiomyocyte-enriched protein CIP protects against pathophysiological stresses and regulates cardiac homeostasis
Abdullah et al. Targeted deletion of T‐cell S1P receptor 1 ameliorates cardiac fibrosis in streptozotocin‐induced diabetic mice
JP3939160B2 (ja) 腎臓における外来遺伝子発現方法
JP2002512985A (ja) ポリヌクレオチドを脈管系を介して細胞へ送達する方法
JPH09509821A (ja) メサンギウム細胞を介した遺伝子産物の送達
Vasquez et al. Replication-Deficient Adenovirus Vector Transfer ofgfpReporter Gene into Supraoptic Nucleus and Subfornical Organ Neurons
Ji et al. Molecular mechanism of HSF1-upregulated ALDH2 by PKC in ameliorating pressure overload-induced heart failure in mice
Smythe et al. Adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor gene therapy in skeletal muscle before transplantation promotes revascularization of regenerating muscle
CN115381949A (zh) 靶向抑制色素上皮衍生因子在促进肝脏再生及改善肝损伤中的应用
Kameda et al. Kidney-targeted naked DNA transfer by retrograde injection into the renal vein in mice
US8263756B2 (en) Method of gene transfer via vascular system or ureter
JP6698031B2 (ja) ガン及び様々な病態生理学的状態を処置するための方法において使用するためのＡｐｏＯ
Pun-Garcia The role of the beta3-adrenergic receptor in animal models of cardiac injury
Ji et al. Research Article Molecular Mechanism of HSF1-Upregulated ALDH2 by PKC in Ameliorating Pressure Overload-Induced Heart Failure in Mice
US8496928B2 (en) Method for preventing and treating cardiovascular diseases with BRCA1
CN116732100A (zh) Slc25a47在肝病治疗中的应用
CN117797261A (zh) Akr1c3抑制剂在制备治疗或预防代谢相关脂肪性肝病药物中的用途
Forough et al. Enhanced Myocardial Vascularity and Contractility by Novel FGF-1 Transgene in a Porcine Model of Chronic Coronary Occlusion

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10478537

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase