WO2002086157A2 - Utilisation de la semaphorine-3a pour le diagnostic et le traitement du cancer, notamment de la prostate - Google Patents

Utilisation de la semaphorine-3a pour le diagnostic et le traitement du cancer, notamment de la prostate Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates, in general, to the diagnosis, evaluation and treatment of cancers, and more particularly of prostate cancer.
  • the subject of the present invention is a method for evaluating the invasiveness of tumor cells and a method for treating said tumor cells.
  • the present invention also describes kits and compositions for carrying out said methods.
  • prostate cancer is, after bronchopulmonary cancer, the most common cancer in men, and more particularly in men over 50 (1, 2, 3) [numbers in bold , in parentheses, refer to the annexed bibliographic reference list].
  • angiogenesis is the process which leads to the formation of blood vessels which supply the tumor and allow its development.
  • Angiogenesis consists of the proliferation and migration of healthy endothelial cells from the blood and lymphatic vessels located near the tumor, under the effect of growth factors secreted by cancer cells. These growth factors are for example VEGF; they act through receptors expressed on the surface of endothelial cells such as NEGFR-1 (flt-1) or VEGFR-2 (flk-1).
  • the invasion of the surrounding healthy tissue leads to the extension of the tumor by two concomitant mechanisms: (i) the enzymatic degradation of the basal lamina and (ii) the migration of cells to the surrounding tissues.
  • the invasion can lead to the formation of distant metastases, when the tumor cells reach the bloodstream.
  • proliferation is meant the rapid multiplication of cells, said multiplication taking place by division of the cells at the time of mitosis.
  • migration is meant the ability of malignant tumor cells to move.
  • One of the approaches to find genes involved in these different processes has been to determine and compare the expression levels of many genes in healthy cells as well as tumor cells in order to highlight differences in expression at the level said healthy cells and tumor cells.
  • the genes thus identified can be used to develop more targeted diagnostic or therapeutic methods depending on the stage of development of the pathology.
  • the inventors have identified, on the one hand, semaphorin-3A as a potential tumor suppressor gene and, on the other hand, the semaphorin-3A receptor, neuropilin-1, as a therapeutic target for treat advanced epithelial tumors.
  • Neuropilin is a membrane receptor initially described in cells of the nervous system and then identified in endothelial and epithelial cells. Two forms of neuropilin have been described, neuropilin-1 and neuropilin-2, having different properties. These two forms have semaphorins-3E and -3F as ligands. as well as VEGF 165 while only neuropilin-1 is capable of fixing semaphorin-3A with a high affinity (4).
  • the semaphorin family includes around 20 members divided into 8 classes. Some are soluble proteins secreted while others are transmembrane proteins. Class 3 is the best characterized and includes six members (Sema3A-F).
  • neuropilin-1 is associated with membrane proteins of the plexin family (5, 6).
  • This heterodimeric receptor has the semaphorin-3A ligand, which causes repulsion of. • cone of growth in development. Numerous experiments have shown axon development in the opposite direction to semaphorin-3A gradients, thus participating in the architectural development of the nervous system (7, 8).
  • neuropilin-1 In endothelial cells of blood vessels, neuropilin-1 is associated with receptors of the VEGFR family.
  • the heterodimeric receptor formed by neuropilin-1 and VEGFR2 (flk-1) has NEGF 165 as its ligand, and its binding to said ligand leads to an increase in cell proliferation and migration, two mechanisms involved in the process of 1 ' angiogenesis, especially during tumor development (9, 10, 11).
  • neuropilin-1 has also been identified in tumor cells of epithelial origin. Some studies have shown that NEGF 165 stimulates the migration of neuropilin-1 expressing tumor epithelial cells. Without wishing to be bound by any theory, it has been proposed that, in these cells, neuropilin-1 acts as the sole receptor for VEGF 165 (12).
  • Two methods have, for example, been proposed to prevent the binding of VEGF 165 to neuropilin-1.
  • Two soluble forms of neuropilin-1 have been described. These are the forms called SU and S12 which correspond to splicing variants of neuropilin-1 (13).
  • the isoform s 12 ⁇ RP can be fixed on VEGF 165 .
  • Overexpression of s 12 NRP in AT2 cells (rat prostate carcinoma) injected into animals decreases the development of the tumor (14).
  • the use of molecules competing with VEGF 165 has been proposed, and in particular, the use of semaphorin-3A.
  • VEGF 155 and .semaphorin-3A by mutually competing to bind neuropilin-1, act on cell migration and retraction (12).
  • WO 99/29729 describes the use of a neuropilin-1 antagonist, and more particularly of a member of the semaphorin / collapsin family, which has VEGF 165 antagonist activity to inhibit metastases in a patient having cells malignant tumors.
  • WO 99/29729 shows that members of the semaphorin / collapsin family are not only inhibitors of neuronal addressing, but that they are also inhibitors of the mobility of endothelial and tumor cells which express Neuropilin-1.
  • the proposed mechanism is that semaphorin-3A competes with VEGF l ⁇ s at the level of neuropilin-1 and thus blocks the pathway promoting angiogenesis. It is this anti-angiogenic action which is believed to be responsible for inhibiting tumor development.
  • VEGF pathway Such a mode of action of semaphorin-3A will be called hereinafter "VEGF pathway".
  • semaphorin-3A has so far been described only for its antagonistic activity of NEGF ⁇ e5 .
  • the growth of a tumor requires that its vascularity is sufficient for it to be supplied with the oxygen and nutrients essential for its rapid development and division.
  • Such vascularization is' ensured by angiogenesis which is, • itself, increased by the action of NEGF 165 linked to neuropilin-1.
  • Blocking this action by means of a VEGF 165 antagonist, such as semaphorin-3A which, by binding to neuropilin-1, prevents VEGF 165 from doing so, inhibits angiogenesis and therefore decreases proliferation and migration of tumor cells.
  • the present invention therefore lies in another field • • than that of the prior art, in the sense that it concerns epithelial cells, and not endothelial cells, and that it is based on the demonstration of a direct action of semaphorin-3A on the invasiveness of tumor cells, action completely independent of VEGF 165 and unknown to date.
  • the present invention relates to a direct action on the invasion of tumor cells, and not to an anti-angiogenic activity.
  • semaphorin-3A interacts with neuropilin distinct from VEGF 1S5 and causes a distinct biological response.
  • the present invention relates to a method for in vi tro evaluation of the aggressiveness of tumor cells of a tumor sample to be tested which consists in measuring the level of expression of all or part of the gene coding for semaphorin-3A in healthy epithelial cells and in epithelial tumor cells of said sample and to declare said tumor cells to be with a high invasiveness if an under-expression of said gene is observed there.
  • expression is meant any mechanism leading, through the transcription of DNA into different RNAs and the translation of mRNA into proteins, to the decoding of the genetic information contained in hereditary material. More particularly, the level of expression of a gene can take place at the level of RNA or at the level of peptides / proteins.
  • the gene can consist either of the whole of the nucleotide sequence coding for semaphorin-3A, or only part of it, provided that the sequence retains the capacity to code for said gene (functional counterpart).
  • part of the sequence is meant a region of said nucleotide sequence devoid of one or more terminal nucleotides. It can also be a region of the nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted or substituted by other nucleotides.
  • the present invention therefore envisages quantifying all the products resulting from the expression of the gene coding for semaphorin-3A, for example RNA, but also mRNA or even peptides / proteins.
  • the method according to the invention comprises the following steps: i) in vi tro quantification of the expression product of all or part of the gene coding for semaphorin-3A within, on the one hand, said tumor cells and, on the other hand, said healthy cells, ii) comparison of the results obtained in step i), and iii) declaration of the tumor as being highly invasive if an under-expression of a factor of at least 30, and preferably at least 10, is observed.
  • expression product any product, in any form whatsoever, resulting from the expression mechanism, as described above.
  • Quantifying in vitro the expression product of all or part of the gene 'encoding semaphorin-3A may be accomplished by any technique known to those skilled in the art, such as an mRNA expression assay coding for semaphorin-3A by RT-PCR or an assay for semaphorin-3A by specific antibodies. Due to the large variations between individuals, the reference values are preferably obtained by assay in cells of healthy prostate tissue, originating from the same patient.
  • the present invention applies to all types of cancer, it more particularly targets prostate cells.
  • the present invention also relates to a method for in vitro evaluation of the effectiveness of an anti-tumor treatment which consists in measuring, on a sample of epithelial tumor cells, the level of expression of all or part of the gene coding for semaphorin-3A at predetermined time intervals and to declare said treatment as effective if there is observed, during the various predetermined time intervals, an increase in the expression of all or part of the gene coding for semaphorin-3A.
  • an anti-tumor treatment which consists in measuring, on a sample of epithelial tumor cells, the level of expression of all or part of the gene coding for semaphorin-3A at predetermined time intervals and to declare said treatment as effective if there is observed, during the various predetermined time intervals, an increase in the expression of all or part of the gene coding for semaphorin-3A.
  • said expression product consists of RNA and / or cDNA.
  • the present invention also relates to a kit for the implementation of the method which is the subject of the invention which comprises: a) the primers which hybridize specifically with the RNA and / or cDNA derived from all or part of the coding gene for semaphorin-3A, and b) the buffers and enzymes necessary for the amplification, labeling and hybridization reactions.
  • primers should be understood to mean any DNA oligonucleotide sequence which hybridizes specifically to a complementary sequence of single-stranded DNA, when initiating replication.
  • the primers used in the present invention are described below.
  • primers are commonly carried out, from known sequences, by implementing computer programs well known to those skilled in the art, such as the Oligo 4 program (National Biosciences, Inc., Madison , MN).
  • said expression product consists of proteins.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the process which is the subject of the invention, which comprises: a) the antibodies specifically complexing with proteins originating from all or part of the gene coding for semaphorin-3A, b) the buffers and enzymes necessary for the amplification, labeling and hybridization reactions.
  • the present invention contemplates the use of semaphorin-3A for the treatment of prostate cancer and, more in particular, a method of inhibiting the invasiveness of epithelial tumor cells which consists in increasing the level of semaphorin-3A present within, and / or near, said epithelial tumor cells.
  • the novelty of such a treatment resides, on the one hand, in the fact that it targets only the invasiveness of epithelial tumor cells and, on the other hand, in the fact that semaphorin-3A acts directly on said epithelial tumor cells, that is to say independently of the "VEGF pathway".
  • a first embodiment of the treatment method consists in increasing the expression of all or part of the endogenous gene coding for semaphorin-3A in epithelial tumor cells and / or in proximity to said cells.
  • a second embodiment of the treatment method according to the invention consists in introducing, into said epithelial tumor cells and / or near said cells, all or part of a nucleotide sequence coding for semaphorin-3A.
  • exoduce should not be taken literally, but contemplates any method which results in the presence of semaphorin-3A in or near epithelial tumor cells. It can be both a topical and a systemic introduction, orally for example.
  • exogenous gene is meant any gene, or part of a gene, natural or synthesized, coding for semaphorin-3A which is not initially present in each epithelial cell.
  • such an exogenous gene may be in the form of a purified polynucleotide encoding the semaphorin-3A, or a recombinant vector comprising a polynucleotide coding for semaphorin-3A.
  • purified polynucleotide should be understood to mean any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, that is to say any DNA or RNA modified or unmodified, double or single strand, which has been isolated or separated from its natural environment, and which is free of residues with which it is naturally associated with approximately 60%, preferably approximately 75%, and better still approximately
  • vector any viral or non-viral expression system known to those skilled in the art.
  • nucleic acids or any other biological material
  • a recombinant vector can be a cloning, expression or insertion vector such as an AdV (adenovirus) or AAV (adeno-asociated-virus) type vector.
  • AdV adenovirus
  • AAV adeno-asociated-virus
  • a third embodiment of the treatment method according to the invention consists in introducing, into said epithelial tumor cells and / or near said cells, a polypeptide comprising all or part of semaphorin-3A as it is or partially mutated.
  • a fourth embodiment of the treatment method according to the invention is based on cell therapy, that is to say the use of any method using cells in order to treat the failure of a tissue or an organ. . More particularly, in the present case, it will involve introducing into the breast or close to the organ to be treated cells capable of secreting semaphorin-3A.
  • the present invention therefore envisages introducing, near the epithelial tumor cells, cells capable of secreting semaphorin-3A.
  • such cells can consist of cells of the epithelial or fibroblast type capable of secreting semaphorin-3A, naturally or after modification of said cells, and can be obtained by any genetic engineering technique known to those skilled in the art. art, such as the integration of a vector containing a gene coding for semaphorin-3A in the genome of said cells.
  • a fifth embodiment of the treatment method according to the invention consists in introducing, into said epithelial tumor cells and / or near said epithelial tumor cells, any substance similar to semaphorin-3A.
  • semaphorin-3A-like substance is meant any substance, natural or synthetic, which has the same properties as semaphorin-3A or, at least, its ability to act directly on epithelial tumor cells regardless of VEGF 1S5 . To do this, it must also have the same faculty of binding to neuropilin-1.
  • the present invention describes a method of identifying any substance similar to semaphorin-3A which consists in carrying out, on epithelial tumor cells, an invasion test in the absence of
  • VEGF 165 or in the presence of VEGF 1S5 but with concomitant presence of a substance blocking the action of said VEGF 1S5 , and to retain as analogues the substances which inhibit said invasion.
  • a pharmaceutical composition intended for the treatment of cancers, in particular of the prostate, and, more particularly, to the inhibition of the invasiveness of epithelial tumor cells.
  • the present invention contemplates a pharmaceutical composition for inhibiting the invasiveness of epithelial tumor cells which comprises all or part of semaphorin-3A or of the gene coding for said semaphorin-3A.
  • Another embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for inhibiting the invasiveness of tumor cells, epithelial cells. includes at least one semaphorin-3A-like substance.
  • Tumor samples were obtained from patients undergoing surgery at St-Louis hospital in Paris, La Cavale Blanche hospital in Brest and CHU Nancy (France). Thirty-two patients had a tumor located clinically in the prostate, of which seventeen were limited to the prostate and fifteen had an extra-capsular extension. Twelve patients presented with hormone-refractory carcinomas. Seven tissue samples of healthy prostate and RNA from a set of 47 prostate tissues healthy humans (marketed by Clontech, Palo-Alto, CA) were used to determine the reference amount of mRNA encoding semaphprine-3A in healthy prostate tissue.
  • the malignant areas of the tumor samples were carefully selected by microdissection so as to obtain a homogeneous cell population and thus avoid any "dilution" of the genetic modifications specific to the tumors with the nucleic acids of normal and reactive cells present in the same sample.
  • a sample is considered suitable for molecular studies if the proportion of tumor cells is greater than 90% of the epithelial cells.
  • Histological diagnosis, clinical classification based on the TMM system and Gleason scores were determined in each case during manipulation after surgery. Twelve were hormone-refractory tumors whereas, after a pathological examination, 17 of the 32 tumors were strictly localized (pT2) and 15 presented capsular overflow (pT3).
  • the Gleason scores for carcinomas were 4-6 (7 cases), 7 (24 cases) and 8-10 (13 cases).
  • Healthy prostate tissue was obtained by radical prostatectomy, histologically verified and selected according to their normality and the type of epithelial cellular component.
  • RNAs underwent reverse transcription in a final volume of 20 ⁇ l containing an RT IX buffer (500 mM of each dNTP, 3 mM of MgCl 2 , 75 mM of KC1, 50 mM of Tris-HCl at pH 8.3), 10 units of Rnasin ® ribonuclease inhibitor (Promega, Madison, WI), 10 mM dithiothreitol, 50 units of Superscript II Rnase H " reverse transcriptase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1.5 mM random hexamers (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and 1 ⁇ g of total RNA
  • the samples were incubated at 20 ° C for 10 minutes and at 42 ° C for 30 minutes, and reverse transcriptase was inactivated by heating at 99 ° C for 5 minutes and cooling at 5 ° C for 5 minutes.
  • transcripts of the RPLPO gene also known as 36B4 encoding human ribosomal acid phosphoprotein (PO) were quantified as an endogenous RNA control, and each sample was normalized based on its RPLPPO content.
  • a prostate tumor (T30) which contained the smallest quantifiable certainty level of mRNA encoding semaphorin-3A in the trials was used as a calibrator.
  • Nsema3A The final results, named Nsema3A and expressed as the N-fold difference between the relative expression of semaphorin-3A compared to the RPLPO gene and the calibrator, were determined as follows:
  • Nsema3A 2 constructive( ⁇ ct (sample) - ⁇ Ct (calibrator))
  • ⁇ Ct values of the sample and of the calibrator were determined by subtraction: from the average value per sample (each sample was tested twice) Ct of the gene coding for semaphorin-3A from the average value Ct of the RPLPO gene.
  • the ratio has been normalized so that the average ratio of the 7 healthy prostate samples is 1.
  • the primers were chosen with the assistance of the computer programs Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN) and Primer express (Perckin-Elmer Applied Biosystems, Foster city, CA). BLASTN searches were performed against dbEST and nr (the non-redundant set of GenBank, EMBL and DDBJ sequence databases) to confirm the total gene specificity of the nucleotide sequences chosen as primers. To avoid amplification of contaminating genomic DNA, a first primer was placed at the junction of two exons and a second in a third exon.
  • nucleotide sequences of the primers are as follows:
  • PCR reactions were performed using a Prism ABI 7000 sequence detection system (Perkin-Elmer Applied Biosystems). PCR was performed using the SYBR ® Green PCR Core reagent kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems). The conditions during the thermal cycles include an initial denaturation step at 95 ° C for 10 minutes and 45 cycles including 15 seconds at 95 ° C followed by 1 minute at 65 ° C. The experiments were performed in duplicate for each data point.
  • sequences of the primers used for the amplification are as follows:
  • sequences of the primers used to remove the stop codon are as follows:
  • Cos-7 cells (ECACC) are seeded at the rate of 20,000 cells / cm 2 in RPMI 10% FCS, 24 hours before transfection in a 75 cm 3 flask (T75).
  • the cells are transfected either with the vector pcDNA4 / Myc-HIS or with this vector containing the semaphorin-3A cDNA.
  • the following mixture is added for a T75 flask: 15 ⁇ g of DNA in 1.5 ml of RPMI without serum containing 45 ⁇ l of FuGENE 6 (Roche).
  • the cells are incubated for 72 hours at 37 ° C. in a CO 2 oven. The supernatant is collected and then centrifuged 2 times to remove cell debris.
  • the pellet containing the Sema3Amyc-antibody-beads complex is taken up in 20 ⁇ l of Laemmli Sample Buffer buffer (Biorad) and loaded onto 7% SDS-PAGE gel.
  • Cos-7 cells transfected with empty pcDNA4 / yc-HIS or containing semaphorin-3A are lysed in the. 1 buffer containing 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoxycholic acid, 0.05% SDS, 2mM EDTA.
  • FIG. 1 The results are grouped in FIG. 1, in which: column 1: immunoprecipitation and Western-blot with anti-myc antibody on 1 ml of medium of Cos-7 cells transfected with empty pcDNA4.1, column 2: immunoprecipitation and Western-blot with anti-myc antibody on 1 ml of Cos-7 cell medium transfected with pcDNA4.1 containing the semaphorin-3A cDNA, and column 3: Western blot performed on 50 ⁇ g of total extract of Cos-7 cells.
  • PC3 cells are deposited at the rate of 40,000 cells per well in invasion chambers (BioCoat Matrigel Invasion Chamber, Becton Dickinson, Bedford, MA) in conditioned medium (pcDNA4 / Myc-HIS empty or containing semaphorin-3A) .
  • the conditioned medium is also deposited in the lower compartment of the chamber.
  • anti-VEGF 165 antibodies AF-293-NA, R&D System
  • this antibody is added at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml in the conditioned medium.
  • the cells are incubated for 48 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator, then the non-invasive cells are eliminated from the upper compartment of the invasion chamber.
  • Invasive cells were digested matrigel crossed the pores of 8 microns of the membrane and adhere to the underside 'of the membrane. In order to quantify the invasive cells, these are stained with a solution containing 0.5% crystal violet in 25% methanol. The membrane is then cut and mounted between blade and lamella. The cells are then quantified by observation under a microscope.
  • column 1 conditioned medium originating from cells
  • the relative expression levels of semaphorin-3A were quantified in 44 malignant tumors, 7 corresponding to tissues of healthy prostate, and the RNAs of a set of 47 tissues of healthy human prostate (Clontech).
  • the expression levels are determined in the form of relationships between the semaphorin-3A and the reference RPLPO gene in order to correct the variations in the quantity of RNA.
  • under-expression is considered significant if the level of expression is lower than the mean value of the expression of semaphorin-3A in normal samples minus 3 times the standard deviation. Twenty-four of 32 samples of clinically localized tumors and 6 of 12 samples of hormone-refractory tumors show an under-expression of semaphorin-3A.
  • the semaphorin-3A cDNA was cloned in phase with the myc and histidine epitopes of the vector pcDNA4 / Myc-HIS.
  • the protein produced therefore contains the myc and his epitopes.
  • a cell culture medium containing the soluble form of semaphorin-3A was prepared by transfecting Cos-7 cells. Seventy-two hours after transfection, the medium is harvested and used for invasion experiments. The presence of semaphorin-3A was detected, by immunoprecipitation and Western-blotting, in the supernatant and the cell extracts of the transfected Cos-7 cells (FIG. 1, columns 2 and 3). As a control, it was shown that the supernatant of Cos-7 cells transfected with the pcDNA4 / Myc-HIS vector does not contain semaphorin-3A ( Figure 1, column 1).
  • the invasion experiments were carried out with. prostate cancer cells PC3 and have shown that these cells overexpress neuropilin and express .. very small quantities of semaphorin-3A which is one of its ligands. We sought to determine whether the restoration of an expression of semaphorin-3A could play a role in the inhibition of the tumor properties of PC3 cells.
  • the invasion experiments were carried out in chambers containing matrigel deposited on a membrane which has pores of 8 ⁇ m. The cells were deposited in the upper compartment of the chamber in culture medium, the lower compartment also containing medium. Invasive cells digest the matrigel and migrate through the pores in the lower compartment.
  • the experiments 1 was performed in the presence of conditioned medium prepared on the one hand, from the supernatant of Cos-7 cells transfected with the vector pcDNA4 / Myc-HIS (control medium) and, secondly, from the supernatant of Cos-7 cells transfected with the pcDNA4 ' / Myc-HIS vector containing the semaphorin-3A cDNA. Two experiences were performed in triplicate for each condition. The invasive cells were quantified under the membrane under microscopy and, for each invasion chamber, two different fields were quantified.
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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'évaluation <i>in vit ro</i> de l'agressivité de cellules tumorales par mesure du niveau d'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A dans des cellules épithéliales saines et dans des cellules tumorales épithéliales. Elle concerne également un procédé d'inhibition du povoir invasif desdites cellules tumorales épithéliales qui consiste à augmenter le taux de sémaphorine-3A présent au sein, et/ou à proximité, desdites cellules tumorales épithéliales.

Description

Utilisation de la sémaphorine-3A pour le diagnostic et le traitement du cancer, notamment de la prostate.
La présente invention concerne, d'une manière générale, le diagnostic, l'évaluation et le traitement de cancers, et plus particulièrement du cancer de la prostate. De manière spécifique, la présente invention a pour objet un procédé d'évaluation du pouvoir invasif des cellules tumorales et un procédé de traitement desdites cellules tumorales. La présente invention décrit également des kits et compositions pour la mise en oeuvre desdits procédés.
Actuellement, le cancer de la prostate est, après le cancer broncho-pulmonaire, le cancer le plus répandu chez l'homme, et plus particulièrement chez l'homme de plus de 50 ans (1, 2, 3) [les chiffres en gras, entre parenthèses, renvoient à la liste de références bibliographiques annexée] .
Du fait de l'importance et de l'accroissement du nombre d'homme atteints par ce cancer, l'étude de son développement
- et la recherche de traitements efficaces et peu coûteux sont devenues, ces derniers temps, des priorités du monde médical.
De manière générale, trois processus majeurs participent - au développement des tumeurs épithéliales malignes, à savoir la prolifération, l'invasion et 1 ' angiogenèse . Dans une première étape, il se produit l'augmentation de la masse tumorale due à la prolifération des cellules cancéreuses et à la diminution des processus apoptotiques physiologiques .
De façon concomitante, 1 ' angiogenèse est le processus qui conduit à la formation de vaisseaux sanguins venant vasculariser la tumeur et permettre son développement . L ' angiogenèse consiste en la prolifération et la migration de cellules endothéliales saines des vaisseaux sanguins et lymphatiques situés à proximité de la tumeur, sous l'effet de facteurs de croissance sécrétés par les cellules cancéreuses. Ces facteurs de croissance sont par exemple les VEGF ; ils agissent par l'intermédiaire de récepteurs exprimés à la surface des cellules endothéliales tels que NEGFR- 1 (flt-1) ou VEGFR-2 (flk-1) .
Dans une seconde étape, l'invasion des tissus sains environnants conduit à l'extension de la tumeur par deux mécanismes concomitants : (i) la dégradation enzymatique de la lame basale et (ii) la migration des cellules vers les tissus environnants. Au final, l'invasion peut conduire à la formation de métastases distantes, lorsque les cellules tumorales atteignent la circulation sanguine.
Par • "prolifération", il • faut comprendre la multiplication rapide des cellules, ladite multiplication ayant lieu par division des cellules au moment de la mitose.
Par "migration", il faut comprendre la capacité qu'ont les cellules tumorales malignes à se déplacer.
L'une des approches pour trouver des gènes impliqués dans ces différents processus a consisté à déterminer et comparer les niveaux d'expression de nombreux gènes chez des cellules saines ainsi que des cellules tumorales de manière à mettre en évidence des différences d'expression au niveau desdites cellules saines et cellules tumorales.
Les gènes ainsi identifiés peuvent servir à développer des procédés diagnostiques ou thérapeutiques plus ciblés en fonction du stade de développement de la pathologie. Par cette approche, les inventeurs ont identifié, d'une part, la sémaphorine-3A comme un potentiel gène suppresseur de tumeur et, d'autre part, le récepteur de la sémaphorine-3A, la neuropiline-1, comme une cible thérapeutique pour traiter les tumeurs épithéliales à un stade avancé.
La neuropiline est un récepteur membranaire initialement décrit dans les cellules du système nerveux puis identifié dans les cellules endothéliales et épithéliales. Deux formes de neuropiline ont été décrites, la neuropiline-1 et la neuropiline-2 , possédant des propriétés différentes. Ces deux formes ont pour ligands les sémaphorines-3E et -3F ainsi que le VEGF165 tandis que seule la neuropiline-1 est capable de fixer la sémaphorine-3A avec une forte affinité (4) . La famille des sémaphorines comprend une vingtaine -de membres répartis dans 8 classes. Certains sont des protéines solubles sécrétées alors que d'autres sont des protéines transmembranaires . La classe 3 est la mieux caractérisée et comprend six membres (Sema3A-F) .
Dans les neurones, la neuropiline-1 est associée à des protéines membranaires de la famille des plexines (5, 6) . Ce récepteur héterodimerique a pour ligand la sémaphorine-3A, qui entraîne la ' répulsion du . cône • de croissance en développement . De nombreuses expériences ont montré un développement des axones dans le sens opposé de gradients de sémaphorine-3A participant ainsi au développement architectural du système nerveux (7, 8) .
Dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, la neuropiline-1 est associée aux récepteurs de la famille VEGFR. Le récepteur héterodimerique formé par la neuropiline-1 et le VEGFR2 (flk-1) a pour ligand le NEGF165 ,.et sa fixation audit ligand entraîne une augmentation de la prolifération et de la migration cellulaires, deux mécanismes participant au processus de 1 ' angiogenèse, notamment au cours du développement tumoral (9, 10, 11) .
Enfin, la neuropiline-1 a également été identifiée dans des cellules tumorales d'origine épithéliale. Certains travaux ont montré que le NEGF165 stimulait la migration de cellules épithéliales tumorales exprimant la neuropiline-1. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, il a été proposé que, dans ces cellules, la neuropiline-1 agisse comme récepteur unique du VEGF165 (12) .
Sur la base de ces données, plusieurs procédés ont été proposés visant à réduire le développement des tumeurs par une inhibition de l'action du VEGF165 sur la neuropiline-1.
Deux méthodes ont, par exemple, été proposées pour empêcher la fixation du VEGF165 sur la neuropiline-1. Tout d'abord, l'utilisation de formes solubles de la neuropiline-1 capables de fixer le NEGF165 dans le milieu extracellulaire. Deux formes solubles de la neuropiline-1 ont été décrites. Il s'agit des formes nommées SU et S12 qui correspondent à des variants d'epissage de la neuropiline-1 (13) . L' isoforme s12ΝRP peut se fixer sur le VEGF165. La surexpression de s12NRP dans des cellules AT2 (carcinome prostatique de rat) injectées chez l'animal diminuent le développement de la tumeur (14) . Par ailleurs, l'utilisation de molécules entrant en compétition' avec le VEGF165. a été proposée, et en particulier, l'utilisation de la sémaphorine-3A.
Plusieurs études ont montré que, dans les cellules endothéliales, la sémaphorine-3A était capable d'entrer en compétition avec le VEGF165 pour se fixer sur la neuropiline-1. Cela entraîne une réduction de l'effet du VEGF165 sur la prolifération des cellules (15, 16).
Il a également été récemment décrit que le VEGF155 et la .sémaphorine-3A, en entrant mutuellement en compétition pour se fixer à la neuropiline-1 , agissent sur la migration et la rétraction cellulaire (12) .
WO 99/29729 décrit l'utilisation d'un antagoniste de la neuropiline- 1, et plus particulièrement d'un membre de la famille sémaphorine/collapsine, qui a une activité antagoniste au VEGF165 pour inhiber les métastases chez un patient ayant des cellules tumorales malignes.
Plus particulièrement, WO 99/29729 met en évidence que des membres de la famille sémaphorine/collapsine ne -sont pas seulement des inhibiteurs de l'adressage neuronal, mais qu'ils sont également des inhibiteurs de la mobilité des cellules endothéliales et tumorales qui expriment la neuropiline- 1. Le mécanisme proposé est que la sémaphorine-3A entre en compétition avec le VEGFlβs au niveau de la neuropiline-1 et bloque ainsi la voie favorisant 1 ' angiogenèse . C'est cette action anti-angiogénique qui serait responsable de l'inhibition du développement de la tumeur.
Un tel mode d'action de la sémaphorine-3A sera appelé par la suite "voie VEGF" . En d'autres termes, la sémaphorine-3A n'avait été décrite, jusqu'à ce jour, que pour son activité antagoniste du NEGFιe5. En effet, la croissance d'une tumeur nécessite que sa vascularisation soit suffisante pour que l'oxygène et les nutriments indispensables à son développement et à sa division rapides lui soient apportés. Une telle vascularisation est 'assurée par 1 ' angiogenèse qui est, • elle-même, augmentée par l'action du NEGF165 lié à la neuropiline-1. Le blocage de cette action, au moyen d'un antagoniste du VEGF165, comme la sémaphorine-3A qui, en se liant à la neuropiline-1, empêche que le VEGF165 le fasse, inhibe 1 ' angiogenèse et de ce fait, diminue la prolifération et la migration des cellules tumorales.
La présente invention se situe donc dans un autre •• domaine que celui de l'art antérieur, en ce sens qu'elle concerne les cellules épithéliales, et non les cellules endothéliales, et qu'elle repose sur la mise en évidence d'une action directe de la sémaphorine-3A sur l'invasivité des cellules tumorales, action totalement indépendante du VEGF165 et inconnue à ce jour. Ainsi, la présente invention concerne une action directe sur l'invasion des cellules tumorales, et non une activité anti-angiogénique . Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que la sémaphorine-3A interagit avec la neuropiline de manière distincte du VEGF1S5 et entraîne une réponse biologique distincte.
Plus particulièrement, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé d'évaluation in vi tro de l'agressivité de cellules tumorales d'un échantillon de tumeur à tester qui consiste à mesurer le niveau d'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A dans des cellules épithéliales saines et dans des cellules tumorales épithéliales dudit échantillon et à déclarer lesdites cellules tumorales comme étant à fort pouvoir invasif si une sous-exprèssion dudit gène y est observée. Par "expression", on entend tout mécanisme conduisant, à travers la transcription de l'ADN en différents ARN et la traduction de l'ARNm en protéines, au décodage de l'information génétique contenue dans le matériel héréditaire. Plus particulièrement, le niveau d'expression d'un gène peut s'effectuer au niveau des ARN ou au niveau des peptides/protéines .
Une "sous-expression" aboutira à une quantité de produits d'expression inférieure à celle obtenue suite à une expression normale et-, au contraire, une "sur-expression" aboutira à une quantité supérieure.
Par "tout ou partie" il faut comprendre que le gène peut consister soit en l'ensemble de la -séquence nuclëotidique codant pour la sémaphorine-3A, soit en une partie seulement de celle-ci, à condition que la séquence conserve la capacité à coder pour ledit gène (homologue fonctionnel). Par "partie de la séquence", il faut comprendre une région de ladite séquence nuclëotidique dépourvue d'un ou plusieurs nucleotides terminaux. Il peut également s'agir d'une région de la séquence nuclëotidique dans laquelle un ou plusieurs nucleotides ont été délétés ou substitués par d'autres nucleotides.
La présente invention envisage donc de quantifier tous les produits résultant de l'expression du gène codant pour la sémaphorine-3A, par exemple les ARN, mais aussi les ARNm ou encore les peptides/protéines.
Par "fort pouvoir invasif", il faut comprendre une forte probabilité d'une extension extracapsulaire et de formation de métastases. En pratique, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : i) quantification in vi tro du produit d'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A au sein, d'une part, desdites cellules tumorales et, d'autre part, desdites cellules saines, ii) comparaison des résultats obtenus à l'étape i) , et iii) déclaration de la tumeur comme étant à fort pouvoir invasif si une sous-expression d'un facteur d'au moins 30, et de préférence d'au moins 10, est observée.
Par "produit d'expression", il faut comprendre tout produit, sous quelque forme que ce soit, résultant du mécanisme d'expression, tel que décrit plus haut.
La quantification in vi tro du produit d'expression de tout ou partie du gène' codant pour la sémaphorine-3A peut être effectuée par toute technique connue de l'homme de l'art, comme par exemple un dosage d'expression d'ARNm codant pour la sémaphorine-3A par RT-PCR ou encore un dosage de la sémaphorine-3A par des anticorps spécifiques. Du fait des variations importantes entre individus, les valeurs de référence sont, de préférence, obtenues par dosage dans des cellules de tissu prostatique sain, issues du même patient .
Bien que la présente invention s'applique à tous les types de cancer, elle vise plus particulièrement les cellules prostatiques .
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne également un procédé d'évaluation in vi tro de l'efficacité d'un traitement anti-tumoral qui consiste à mesurer, sur un prélèvement de cellules tumorales épithéliales, le niveau d'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A à des intervalles de temps prédéterminés et à déclarer ledit traitement comme efficace si l'on observe, au cours des différents intervalles de temps prédéterminés, une augmentation de l'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A. Ainsi, il est possible de suivre l'évolution d'un traitement donné chez un patient et, le cas échéant, modifier celui-ci si les résultats obtenus ne sont pas satisfaisants.
Dans une première variante d'exécution de l'invention, ledit produit d'expression consiste en des ARN et/ou ADNc.
Dans ce cas, la présente invention concerne également un kit .pour la mise en oeuvre du procédé objet de l'invention qui comprend : a) les amorces s'hybridant spécifiquement avec les ARN et/ou ADNc issus de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A, et b) les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification, de marquage et d'hybridation.
Par "amorces", il faut comprendre toute séquence oligonucléotidique d'ADN s'hybridant spécifiquement à une séquence complémentaire d'ADN simple-brin, lors de l'initiation d'une réplication. Les amorces utilisées dans la présente invention sont décrites plus loin.
En. pratique, la détermination d'amorces s'effectue couramment, à partir de séquences connues, par mise en oeuvre de programmes informatiques bien connus de l'homme de l'art, tel que le programme Oligo 4 (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN) .
Dans une seconde variante d'exécution de l'invention, ledit produit d'expression consiste en des protéines.
Dans ce cas, la présente invention concerne également un kit pour la mise en oeuvre du procédé objet de l'invention qui comprend : a) les anticorps se complexant spécifiquement avec les protéines issues de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A, b) les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification, de marquage et d'hybridation.
Selon un troisième aspect, la présente invention envisage l'utilisation de la sémaphorine-3A pour le traitement du cancer de la prostate et, plus particulièrement, un procédé d'inhibition du pouvoir invasif de cellules tumorales épithéliales qui consiste à augmenter le taux de sémaphorine-3A présent au sein, et/ou à proximité, desdites 'cellules tumorales épithéliales. Comme décrit plus haut, la nouveauté d'un tel traitement réside, d'une part, dans le fait qu'il cible uniquement 1 ' invasivité des cellules tumorales épithéliales et, d'autre part, dans le fait que la sémaphorine-3A agit directement sur lesdites cellules tumorales épithéliales, c'est-à-dire indépendamment de la "voie VEGF" .
Un premier mode de mise en oeuvre du procédé de traitement consiste à augmenter l'expression de tout ou partie du gène endogène codant pour la sémaphorine-3A dans les cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules.
Par "gène endogène", il faut comprendre le ou les gène (s) codant pour la sémaphorine-3A présent (s) initialement dans chaque cellule épithéliale.
Un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de traitement selon l'invention consiste à introduire, au sein desdites cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules, tout ou partie d'une séquence nuclëotidique codant pour la sémaphorine-3A.
L'expression "introduire" ne doit pas être prise au sens littéral, mais envisage toute méthode ayant pour résultat la présence de sémaphorine-3A dans ou à proximité des cellules tumorales épithéliales. Il peut aussi bien s'agir d'une introduction topique que systémique, par voie orale par exemple. Par "gène exogène", il faut comprendre tout gène, ou partie de gène, naturel ou synthétisé, codant- pour la sémaphorine-3A qui n'est pas présent initialement dans chaque cellule épithéliale.
Par exemple, un tel gène exogène peut se présenter sous la forme d'un polynucléotide purifié codant pour la sémaphorine-3A, ou encore d'un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide codant pour la sémaphorine-3A.
Par "polynucléotide purifié", il faut comprendre tout polyribonucléotide ou polydéoxyribonucléotide, c'est-à-dire tout ADN ou ARN modifié ou non, double ou simple brin, qui a été isolé ou séparé de son environnement naturel, et qui est débarrassé des résidus auxquels il est naturellement associé à environ 60%, de préférence environ 75%, et mieux environ
90%. Par "vecteur", il faut comprendre tout système d'expression viral ou non viral connu de l'homme de l'art.
L'expression "recombinant" fait référence aux résultats de méthodes et manipulations dans lesquelles des acides nucléiques, ou tout autre matériel biologique, sont clivés, synthétisés, combinés ou autrement manipulés in vi tro enzymatiquement , chimiquement ou encore biologiquement pour obtenir les produits désirés dans les cellules ou tout autre système biologique.
Un vecteur recombinant peut être un vecteur de clonage, d'expression ou d'insertion comme un vecteur de type AdV (adénovirus) ou encore AAV (adeno-asociated-virus) .
Un troisième mode de mise en oeuvre du procédé de traitement selon l'invention consiste à introduire, au sein desdites cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules, un polypeptide comprenant tout ou partie de la sémaphorine-3A en l'état ou partiellement mutée.
Un quatrième mode de mise en oeuvre du procédé de traitement selon 1 ' invention repose sur la thérapie cellulaire, c'est-à-dire le recours à toute méthode utilisant des cellules afin de traiter la défaillance d'un tissu ou d'un organe. Plus particulièrement, dans le cas présent, il s'agira d'introduire au sein ou à proximité de l'organe à traiter des cellules capables de sécréter de la sêmaphorine-3A. La présente invention envisage donc d'introduire, à proximité des cellules tumorales épithéliales, des cellules capables de sécréter de la sémaphorine-3A.
En pratique, de telles cellules peuvent consister en des cellules de types épithéliale ou fibroblaste capables de sécréter la sémaphorine-3A, de façon naturelle ou après modification desdites cellules, et peuvent être obtenues par toute technique d'ingénierie génétique connue de l'homme de l'art, comme l'intégration d'un vecteur contenant un gène codant pour la sémaphorine-3A dans le génome desdites cellules .
Un cinquième mode de mise en oeuvre du procédé de traitement selon l'invention consiste à introduire, au sein desdites cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules tumorales épithéliales, toute substance analogue à la sémaphorine-3A.
Par "substance analogue à la sémaphorine-3A" , il faut comprendre toute substance, naturelle ou de synthèse, qui présente les mêmes propriétés que la sémaphorine-3A ou, tout au moins, sa capacité à agir directement sur les cellules tumorales épithéliales indépendamment du VEGF1S5. Pour ce faire, elle doit également présenter la même faculté de liaison à la neuropiline-1.
Dans une forme particulière d'exécution de la présente invention, il est également envisagé un procédé de criblage de substances analogues à la sëmaphorine-3A.
Pour ce faire, la présente invention décrit un procédé d'identification de toute substance analogue à la sémaphorine-3A qui consiste à effectuer, sur des cellules tumorales épithéliales, un test d'invasion en l'absence de
VEGF165, ou en présence de VEGF1S5 mais avec concomitamment présence d'une substance bloquant l'action dudit VEGF1S5, et à retenir comme analogues les substances qui inhibent ladite invasion. Selon un autre aspect encore de la présente invention, il est envisagé une composition pharmaceutique destinée au traitement des cancers, notamment de la prostate, et, plus particulièrement, à l'inhibition de l'invasivité des cellules tumorales épithéliales.
Plus particulièrement, la présente invention envisage une composition pharmaceutique pour l'inhibition de l'invasivité des cellules tumorales épithéliales qui comprend tout ou partie de la sémaphorine-3A ou du gène codant pour ladite sémaphorine-3A.
Une autre forme de réalisation de la présente invention consiste en une composition pharmaceutique pour l'inhibition de 1 ' invasivité des cellules tumorales, épithéliales qui. comprend au moins une substance analogue à la sémaphorine-3A.
L'invention sera mieux comprise à la lumière des résultats des expériences suivantes qui se divisent en deux parties, à savoir une première partie touchant l'expression du gène codant pour la sémaphorine-3A et une seconde partie concernant l'action anti-invasivité de la sémaphorine-3A.
MATERIEL ET METHODE
I. Mesure d'expression du gène codant pour la sêmaphorine-3A
1. 1. Patients et échantillons Quarante-quatre tumeurs primaires de la prostate ont été analysées .
Les échantillons de tumeur ont été obtenus auprès de patients subissant une opération chirurgicale 'à l'hôpital St-Louis à Paris, l'hôpital La Cavale Blanche à Brest et le CHU de Nancy (France) . Trente-deux patients avaient une tumeur localisée cliniquement à la prostate, dont dix-sept étaient limitées à la prostate et quinze avaient une extension extra-capsulaire . Douze patients présentaient des carcinomes hormono-réfractaires . Sept échantillons tissulaires de prostate saine ainsi que des ARN issus d'un ensemble de 47 tissus prostatiques humains sains (commercialisés par Clontech, Palo-Alto, CA) ont été utilisés pour déterminer la quantité de référence d'ARNm codant pour la sémaphprine-3A dans un tissu prostatique sain.
1.2. Tissus sélectionnés
Les échantillons de tumeur maligne ainsi que de tumeur bénigne, qui ont été localisées cliniquement , ont été obtenus par prostatectomie radicale, alors que les tumeurs hormono- réfractaires ont été obtenues par résection transurethrale.
Une partie des tissus sélectionnés a été immédiatement placée dans l'azote liquide pour en extraire les acides nucléiques, alors que les sections adjacentes ont été colorées avec H/E (Hematoxyline et Eosine) et ont été examinées histologiquement .
Les zones malignes des échantillons de tumeurs ont été soigneusement sélectionnées par microdissection de manière à obtenir une population cellulaire homogène et ainsi éviter toute "dilution" des modifications génétiques spécifiques aux tumeurs avec les acides nucléiques de cellules normales et réactives présentes dans le même échantillon.
Pour ces raisons, un échantillon est considéré comme convenable pour des études moléculaires si la proportion de cellules tumorales est supérieure à 90% des cellules épithéliales. Le diagnostic histologique, le classement clinique basé sur le système TMM et les scores de Gleason ont été déterminés dans chaque cas au cours d'une manipulation après une opération chirurgicale. Douze étaient des tumeurs hormono-réfractaires alors qu'après un examen pathologique, 17 des 32 tumeurs étaient strictement localisées (pT2) et 15 présentaient un dépassement capsulaire (pT3) . Les scores de Gleason des carcinomes étaient 4-6 (7 cas) , 7 (24 cas) et 8-10 (13 cas) .
Les tissus prostatiques sains ont été obtenus par prostatectomie radicale, vérifiés histologiquement et sélectionnés en fonction de leur normalité et du type de composant cellulaire epithelial.
1. 3 . Extraction des acides nucléiques
a) Extraction des ARN
Les ARN totaux ont été extraits à partir d'échantillons de tissu en utilisant de l'acide-phénol de guanidium. La qualité des échantillons d'ARN a été contrôlée par electrophorese sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium. Les bandes d'ARN 18S et 28S ont été visualisées sous lumière ultra-violette afin de vérifier l'évaluation de 1 ' extraction.
b) Synthèse des ADNc
Les ARN ont subi une transcription inverse dans un volume final de 20 μl contenant un tampon RT IX (500 mM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl2, 75 mM de KC1, 50 mM de Tris-HCl à pH 8,3), 10 unités d'inhibiteur de la ribonucléase Rnasin® (Promega, Madison, WI) , 10 mM de dithiothreitol, 50 unités de transcriptase reverse Superscript II Rnase H" (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , 1,5 mM d'hexamères aléatoires (Pharmacia, Uppsala, Suède) et 1 μg d'ARN totaux. Les échantillons ont été incubés à 20°C pendant 10 minutes et à 42°C pendant 30 minutes, et la transcriptase reverse a été inactivée par chauffage à 99°C pendant 5 minutes et refroidissement à 5°C pendant 5 minutes .
1. 4 . RT-PCR quanti tative en temps réel Les valeurs quantitatives ont été obtenues à partir du nombre de cycles seuil (Ct) auquel l'augmentation du signal associée à une croissance exponentielle du produit PCR commence à être détectée (en utilisant un programme d'analyse Biosystems PE) , selon le manuel du fabricant. La quantité précise d'ARN totaux ajoutée à chaque réaction (basée sur la densité optique) et sa qualité (c'est- à-dire l'absence de dégradation extensive) sont toutes deux difficiles à maîtriser. Par conséquent, les transcrits du gène RPLPO (aussi connu comme 36B4) codant pour la phosphoprotéine acide ribosomale humaine (PO) ont été quantifiés comme contrôle d'ARN endogène, et chaque échantillon a été normalisé sur la base de son contenu en RPLPPO. Une tumeur de la prostate (T30) qui contenait le plus petit taux quantifiable avec certitude d'ARNm codant pour la sémaphorine-3A dans les essais a été utilisée comme calibreur.
- Les résultats finaux, nommés Nsema3A et exprimés en différence de N-fois entre l'expression relative de la sémaphorine-3A par rapport au gène RPLPO et au calibreur, ont été déterminés comme suit :
Nsema3A = 2 „ (Δct (échantillon) - ΔCt (calibreur) )
où les valeurs ΔCt de l'échantillon et du calibreur ont été déterminées par soustraction :de la valeur moyenne par échantillon (chaque échantillon a été testé deux fois) Ct du gène codant pour la sémaphorine-3A de la valeur moyenne Ct du gène RPLPO. Le rapport a été normalisé de telle sorte que le rapport moyen des 7 échantillons de prostate saine corresponde à une valeur de 1.
1. 5. Amorces et produi ts pour la PCR
Les amorces ont été choisies avec l'assistance des programmes informatiques Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN) et Primer express (Perckin-Elmer Applied Biosystems, Foster city, CA) . Des recherches BLASTN ont été effectuées contre dbEST et nr (le jeu non-redondant de GenBank, bases de données de séquences EMBL et DDBJ) pour confirmer la spécificité totale de gène des séquences nucléotidiques choisies comme amorces. Pour éviter l'amplification d'ADN génomique contaminant, une première amorce a été placée à la jonction de deux exons et une seconde dans un troisième exon.
Il a été vérifié que, après une réaction PCR, ces amorces donnaient une bande unique sur gel d'agarose ; les produits de PCR ont de plus été purifiés et séquences pour confirmer la spécificité des amorces.
Les séquence nucléotidiques des amorces sont les suivantes :
Sêmaphorine-3A
Upper primer 5 ' -CCTATGAACAATCGCCCAATAGTG-3 ' Lower primer 5 ' -CTTTAAGAACGGTCCCAACATCTGT-3 '
RPLPO
Upper primer 5' -GGCGACCTGGAAGTCCAACT-3 '
Lower primer 5' -CCATCAGCACCACAGCCTTC-3 '
1. 6. amplification PCR
Toutes les réactions PCR ont été effectuées en utilisant un système de détection de séquence Prism ABI 7000 (Perkin-Elmer Applied Biosystems) . La PCR a été effectuée en utilisant le kit de réactifs SYBR® Green PCR Core (Perkin- Elmer Applied Biosystems) . Les conditions au cours des cycles thermiques comprennent une étape initiale de dênaturation à 95 °C pendant 10 minutes et 45 cycles comprenant 15 secondes à 95 °C suivi de 1 minute à 65 °C. Les expériences ont été effectuées en double pour chaque point de données.
II. Essais d'invasivité
II. 1 . Clonage de la sêmaphorine-3A . L'ADNc de la sémaphorine-3A, d'une taille de 2,3 kb, a été obtenu par RT-PCR à partir de la lignée prostatique CaHPVlO. Cet ADNc a tout d'abord été clone entre les sites de restriction EcoRI et XBal du vecteur d'expression pcDNA3.l/Zeo (+) (Invitrogen). Il a ensuite été modifié par PCR, afin de supprimer le codon de terminaison de la traduction, et a finalement été clone, en phase avec les épitopes myc et histidine, entre les sites de restriction EcoRI et XBal du vecteur pcDNA4/Myc-His (Invitrogen) . L'intégrité de l'ADNc, clone dans le vecteur pcDNA4/ yc-His, a été vérifiée par séquençage direct. Sa séquence est identique à celle publiée par Kolodkin et al. (n° accession L26081) .
Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification sont les suivantes :
Amorce 5' : 5' CGG AAT TCT GCA GCA TGG GCT GGT TAA CT 3' Amorce 3' : 5' GCT CTA GAT CAG ACA CTC CTG GGT GCC CT 3'
Les séquences des amorces utilisées pour supprimer le codon stop sont les suivantes :
Amorce 5' : 5' GGA ACA TGG GTT CAT ACA AAC TCT TCT TA 3'
Amorce 3' : 5 ' GC TCT AGA GAC ACT CCT GGG TGC C 3'
11. 2 . Préparation de milieu condi tionné .
Les cellules Cos-7 (ECACC) sont ensemencées à raison de 20 000 cellules/cm2 dans du RPMI 10% FCS, 24 heures avant la transfection dans un flacon de 75 cm3 (T75) . Les cellules sont transfectées soit par le vecteur pcDNA4/Myc-HIS soit par ce vecteur contenant l'ADNc de la sémaphorine-3A. Le mélange suivant est ajouté pour un flacon T75 : 15 μg d'ADN dans 1,5 ml de RPMI sans sérum contenant 45 μl de FuGENE 6 (Roche) . Les cellules sont incubées 72 heures à 37°C dans une étuve à C02. Le surnageant est récolté puis centrifugé 2 fois pour éliminer les débris cellulaires.
11. 3 . Contrôle de la présence de sémaphorine-3A dans le milieu condi tionné par immunoprêcipi tation et Western-blot . Un ml de milieu conditionné, récolté 72 heures après la transfection des cellules, est incubé avec 2 μg d'anticorps monoclonal anti-myc (Santa Cruz mouse monoclonal anti-c-Myc sc-40) à 4°C, pendant 16 heures sur agitateur rotatif. Le complexe formé par l'anticorps est précipité par 20 μl de billes de sépharose G (Amersham Pharmacia Biotech) diluées au demi dans du PBS. Le mélange est incubé 30 minutes à 4°C sur agitateur rotatif. Après centrifugation, le culot contenant le complexe Sema3Amyc-anticorps-billes est repris dans 20 μl de tampon Laemmli Sample Buffer (Biorad) et chargé sur gel SDS-PAGE 7%. En parallèle, les cellules Cos-7 transfectées par pcDNA4/ yc-HIS vide ou contenant la sémaphorine-3A sont lysées dans le.1 Èampon contenant 50 mM de Tris pH 8, ..200 mM de NaCl, 1% NP40, 0,5% d'acide déoxycholique, 0,05% SDS, 2mM d ' EDTA.
Par "vide", il faut comprendre "ne comprenant pas de sémaphorine-3A" .
Cinquante -microgrammes de protéines venant de l'extrait total sont chargées sur gel SDS-PAGE 7%. Après migration, les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose . La membrane est incubée 1 heure à température ambiante dans du PBS contenant 5% de lait écrémé (Biorad) pour bloquer les sites non spécifiques . La membrane est ensuite incubée
1 heure à température ambiante avec l'anticorps primaire anti myc (mouse monoclonal anti c-Myc sc-40, Santa Cruz) dilué à
2 ng/ml dans du PBS contenant 5% de lait écrémé. La membrane est rincée 4 fois, à chaque fois pendant 10 minutes, dans du
PBS contenant 0,1% tween 20 avant d'être incubée 1 heure à température ambiante avec l'anticorps secondaire (Rabbit anti mouse HRP, Dako) . Le rinçage est identique à celui décrit précédemment puis la membrane est incubée 5 minutes dans le réactif ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech) . La détection de la fluorescence est effectuée grâce à un détecteur Storm.
Les résultats sont regroupés dans la figure 1, dans laquelle : colonne 1 : immunoprécipitation et Western-blot avec anticorps anti-myc sur 1 ml de milieu de cellules Cos-7 transfectées avec pcDNA4.1 vide, colonne 2 : immunoprécipitation et Western-blot avec anticorps anti-myc sur 1 ml de milieu de cellules Cos-7 transfectées avec pcDNA4.1 contenant l'ADNc de la sémaphorine-3A, et colonne 3 : Western blot réalisé sur 50 μg d'extrait total de cellules Cos-7.
II . 4 . Essais d ' invasion .
Les cellules PC3 sont déposées à raison de 40 000 cellules par puits dans des chambres d'invasion (BioCoat Matrigel Invasion Chamber, Becton Dickinson, Bedford, MA) dans du milieu conditionné (pcDNA4/Myc-HIS vide ou contenant la sémaphorine-3A) . Le milieu conditionné est également déposé dans le compartiment inférieur de la chambre. Pour les essais réalisés en présence d'anticorps anti-VEGF165 (AF-293- NA, R&D System) , cet anticorps est ajouté à la concentration de 0,5 μg/ml dans le milieu conditionné. Les cellules sont incubées 48 heures à 37°C dans un incubateur à C02 puis les cellules non invasives sont éliminées du compartiment supérieur de la chambre d'invasion. Les cellules invasives ont digéré le matrigel, traversé, les pores de 8 μm de la membrane et adhèrent sur la face inférieure' de la membrane. Afin de quantifier les cellules invasives, celles-ci sont colorées avec une solution contenant 0,5% de crystal violet dans 25% de mêthanol . La membrane est alors découpée et montée entre lame et lamelle. Les cellules sont ensuite quantifiées par observation sous microscope.
Les résultats sont regroupés dans la figure 2, dans laquelle : colonne 1 : milieu conditionné provenant de cellules
Cos-7 transfectées par pcDNA4.1 vide et en absence de VEGF165, colonne 2 : milieu conditionné provenant de cellules
Cos-7 transfectées par pcDNA4 contenant l'ADNc de la sémaphorine-3A et en absence de VEGF165, colonne 3 : milieu conditionné provenant de cellules Cos-7 transfecté par pcDAN4.1 vide et en présence de l'anticorps anti-VEGF1S5, colonne 4 : milieu conditionné provenant de cellules Cos-7, transfectées par pcDNA4 contenant l'ADNc de la sémaphorine-3A en présence de l'anticorps anti-VEGFιε5, et
RESULTATS
I. Mesure d'expression du gène codant pour la sémaphorine-3
Les niveaux d'expression relative de la sémaphorine-3A ont été quantifiés dans 44 tumeurs malignes, 7 correspondant à des tissus de prostate saine, et les ARN d'un ensemble de 47 tissus de prostate humaine saine (Clontech) . Les niveaux d'expression sont déterminés sous la forme de rapports entre la sémaphorine-3A et le gène RPLPO de référence afin de corriger les variations dans la quantité d'ARN. Pour un échantillon individuel, une sous-expression est considérée comme significative si le niveau d'expression est inférieur à la valeur moyenne de l'expression de sémaphorine- 3A dans les échantillons normaux moins 3 fois la déviation standard. Vingt-quatre des 32 échantillons de tumeurs cliniquement localisées et 6 des 12 échantillons de tumeurs hormono-réfractaires montrent une sous-expression de la sémaphorine-3A.
Dans l'ensemble, les résultats montrent une diminution significative de l'expression de la sémaphorine-3A dans les échantillons de tumeurs prostatiques par rapport aux échantillons de prostate saine (p<0,001). La sémaphorine-3A apparaît ainsi sous-exprimée d'un facteur 10 environ dans les échantillons tumoraux par rapport au tissu normal. II. Essais d'invasivité
L'ADNc de la sémaphorine-3A a été clone en phase avec les épitopes myc et histidine du vecteur pcDNA4/Myc-HIS . La protéine produite contient donc les épitopes myc et his . Il a été préparé un milieu de culture cellulaire contenant la forme , soluble de la sémaphorine-3A en transfectant des cellules Cos-7. Soixante-douze heures après transfection, le milieu est récolté et utilisé pour les expériences d'invasion. La présence de sémaphorine-3A a été détectée, par immunoprécipitation- et Western-blotting, dans le surnageant et les extraits cellulaires des cellules Cos-7 transfectées (Figure 1, colonnes 2 et 3) . En contrôle, il a été montré que le surnageant des cellules Cos-7 transfectées par le vecteur pcDNA4 /Myc-HIS ne contient pas de sémaphorine-3A (Figure 1, colonne 1) .
Les expériences d'invasion ont été réalisées avec des. cellules prostatiques tumorales PC3 et ont montré que ces cellules surexpriment la neuropiline et expriment de.. très faibles quantités de sémaphorine-3A qui est un de ses ligands. On a cherché à déterminer si la restauration d'une expression de la sémaphorine-3A pouvait jouer un rôle dans l'inhibition des propriétés tumorales des cellules PC3. A cette fin, les expériences d'invasion ont été réalisées dans des chambres contenant du matrigel déposé sur une membrane qui possède des pores de 8 μm. Les cellules ont été déposées dans le compartiment supérieur de la chambre dans du milieu de culture, le compartiment inférieur contenant également du milieu. Des cellules invasives digèrent le matrigel et migrent à travers les pores dans le compartiment inférieur.
Les expériences ont1 été réalisées en présence de milieu conditionné préparé, d'une part, à partir de surnageant de cellules Cos-7 transfectées par le vecteur pcDNA4/Myc-HIS (milieu contrôle) et, d'autre part, à partir du surnageant de cellules Cos-7 transfectées avec le vecteur pcDNA4'/Myc-HIS contenant l'ADNc de la sémaphorine-3A. Deux expériences indépendantes ont été réalisées en triple pour chaque condition. Les cellules invasives ont été quantifiées sous la membrane en microscopie et, pour chaque chambre d'invasion, deux champs différents ont été quantifiés. Les résultats sont présentés sous forme de pourcentages par rapport au nombre de cellules invasives dans le milieu vide ou de contrôle : on constate que la présence de sémaphorine-3A dans le milieu inhibe la capacité invasive des cellules PC3 de 60 à 70% (Figure 2, colonnes 1 et 2) . Les inventeurs ont montré que les cellules PC3 sécrètent de faibles quantités de VEGF165. Afin de confirmer le rôle de la sémaphorine-3A indépendamment de la voie VEGF165, des expériences d'invasion en présence d'un anticorps bloquant l'action du VEGF165 sécrété par les cellules PC3 ont été réalisées. L'anticorps ajouté à la concentration de 0,5 μg/ml dans le milieu conditionné ne modifie pas l'invasion des cellules PC3 que ce soit en l'absence (Figure 2, colonne 3) ou en présence de la sémaphorine-3A dans le milieu conditionné (Figure 2, colonne 4) .Le rôle inhibiteur de la sémaphorine-3A sur la capacité invasive des cellules PC3 est donc ainsi montré. Il a également été démontré que le VEGFlëS sécrété par les cellules PC3 n'a pas d'effet sur l'invasivité des cellules, puisque le blocage du VEGF165 par un anticorps spécifique ne modifie pas l'invasivité des cellules. En conséquence, la sémaphorine-3A a bien un rôle direct et agoniste qui inhibe fortement le pouvoir invasif des cellules tumorales épithéliales.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'évaluation in vi tro de l'agressivité de cellules tumorales d'un échantillon de tumeur à tester, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer le niveau d'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A dans des cellules épithéliales saines et dans dès cellules tumorales épithéliales dudit échantillon et à déclarer lesdites cellules tumorales comme étant à fort pouvoir invasif si une sous-expression dudit gène y est observée.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : i) quantification in vi tro du produit d'expression de tout ou partie du gêne codant pour la sémaphorine-3A au sein, d'une part, desdites cellules tumorales et, d'autre part, desdites cellules saines, ii) comparaison des résultats obtenus à l'étape i) , et iϋ) déclaration de la tumeur comme étant à fort pouvoir invasif si une sous-expression d'un facteur d'au moins 3 est observée.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite tumeur est déclarée à fort pouvoir invasif si une sous-expression d'un facteur d'au moins 10 est observée .
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites cellules tumorales consistent en des cellules prostatiques.
5. Procédé d'évaluation in vi tro de l'efficacité d'un traitement anti -tumoral, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer, sur un prélèvement de cellules tumorales épithéliales, le niveau d'expression de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A à des intervalles de temps prédéterminés et à déclarer ledit traitement comme efficace si l'on observe, au cours des différents intervalles de temps prédéterminés, une augmentation de l'expression de tout ou partie du gêne codant pour la sémaphorine-3A.
6 -, Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ledit produit d'expression consiste en des ARN et/ou ADNc.
7. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend : a) les amorces s'hybridant spécifiquement avec les ARN et/ou ADNc issus de tout oμ partie du gène codant pour la sémaphorine-3A, et b) les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification, de marquage et d'hybridation.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ledit produit d'expression consiste en des protéines.
9. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend : a) les anticorps se complexant spécifiquement avec les protéines issues de tout ou partie du gène codant pour la sémaphorine-3A, b) les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification, de marquage et d'hybridation.
10. Procédé d'inhibition du pouvoir invasif de cellules tumorales épithéliales, caractérisé en ce qu'il consiste à augmenter le taux de sémaphorine-3A présent au sein, et/ou à proximité, desdites cellules tumorales épithéliales .
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste à augmenter l'expression de tout ou partie du gène endogène codant pour la sémaphorine-3A dans les cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules .
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire, au sein desdites cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules, tout ou partie d'une séquence nuclëotidique codant pour la sémaphorine-3A.
13. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire, au sein desdites cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules, un polypeptide comprenant tout ou partie de la sémaphorine- 3A en l'état ou partiellement mutée.
14. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire, à proximité des cellules tumorales épithéliales, des cellules capables de sécréter de la sémaphorine-3A.
15. Procédé d'inhibition du pouvoir invasif de cellules tumorales épithéliales, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire, au sein desdites cellules tumorales épithéliales et/ou à proximité desdites cellules tumorales épithéliales, toute substance analogue à la sémaphorine-3A.
16. Procédé d'identification de toute substance analogue à la sémaphorine-3A, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer, sur des cellules tumorales épithéliales, un test d'invasion en l'absence de VEGF165, ou en présence de VEGF165 mais avec concomitamment présence d'une substance bloquant l'action dudit VEGF1S5, et à retenir comme analogues les substances qui inhibent ladite invasion.
17. Composition pharmaceutique pour l'inhibition de l'invasivité des cellules tumorales épithéliales, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la sémaphorine-3A ou du gène codant pour ladite sémaphorine- 3A.
18. Composition pharmaceutique pour l'inhibition de l'invasivité des cellules tumorales épithéliales, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une substance analogue à la sémaphorine-3A.
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