WO2002076492A1 - Nouveaux agents pour soigner les troubles moteur - Google Patents

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WO2002076492A1
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peptide
selenoprotein
disease
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Masaki Hirashima
Takumi Sasaki
Takeshi Naruse
Hiroaki Maeda
Chikateru Nozaki
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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Definitions

  • the present invention relates to a new use of plasma proteins belonging to the field of prescription pharmaceuticals. More specifically, neurodegeneration caused by cell death or cell degeneration of cells constituting the nervous system, such as aging, traumatic, cerebrovascular disorders, immunological disorders, ataxia, epilepsy, and motor neuron diseases. About pharmaceuticals. More specifically, a therapeutic agent for neurodegenerative diseases containing selenoprotein p, which is a kind of plasma protein, preferably a C-terminal peptide of the selenoprotein P or the peptide group as a main active ingredient, particularly movement disorders It relates to an improving agent.
  • selenoprotein p which is a kind of plasma protein, preferably a C-terminal peptide of the selenoprotein P or the peptide group as a main active ingredient, particularly movement disorders It relates to an improving agent.
  • Neurological diseases in which cell death or cell degeneration of cells that make up the nervous system are recognized. Cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, multiple cerebral infarction dementia, Binswanger's leukoencephalopathy , Cerebrovascular disorders such as chronic subdural hematoma, autoimmune diseases such as multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, collagen disease, spinocerebellar degeneration, Scheidrager syndrome, amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer's Neurodegenerative diseases such as sickness, Pick's disease, Huntington's chorea, Parkinson's disease, progressive supranuclear palsy, epilepsy, prion disease, and traumatic spinal cord caused by aging-related dementia, gait disorders, and traffic accidents Damage and brain damage are also known. In most of these diseases, the main symptom is decreased motor function (dyskinesia).
  • Movement disorders include muscular disorders, nerve disorders, bone and joint disorders, etc.Of these, nervous central disorders causing movement disorders are classified and categorized according to site, cerebral (frontal lobe), cerebellum Gender, vestibular tract) and myelopathy.
  • cerebral dyskinesia cerebral cortex, especially frontal lobe disorder, is considered, and cerebrovascular disorder is often a problem in lesions, cerebral atrophy, trauma, tumors, Pick's disease, and chronic subdural hematoma. It also shows ataxic gait as well as a decline in mental function.
  • Cerebellar dysmotility is an important symptom associated with cerebellar disorders, i.e., cerebellar tumors, vascular disorders, degenerative diseases, cerebellar atrophy, malformations, etc.
  • Obstacles of 'Kin Jin walking showing large walking, generally holding posture and posture Difficult to balance.
  • hemispheric cerebellar disorders show abnormalities in the muscular tonus of the extremities, decreased muscle tone, eccentric walking toward the affected side, impaired coordination, false indications (finger-to-finger, finger-to-nose tests), and movement measurements
  • it is accompanied by intentional tremor and cerebellar language (intermittent and explosive).
  • Vestibular (maze) ataxia results from vestibular dysfunction and is often caused by the presence or sequelae of otological or inner ear disorders. Examples include Meniere's disease, sudden deafness, damage to the balance nerve due to addiction to drugs such as streptomycin and kanamycin, trauma, syphilis, acoustic trauma, otosclerosis, and otitis media (and their sequelae).
  • Spinal dyskinesia which is also called retrograde ataxia, is a disorder of deep sensation caused by spinal cord injury, that is, ataxia caused by impaired position, joint, and grip. It is characteristically seen in Friedreich's ataxia, subacute spinal cord association degeneration, spinal cord phlegm, and others.
  • the neurodegenerative diseases presenting with these movement disorders are closely related to neuronal cell death and cell degeneration.
  • spinocerebellar degeneration Machado's Joseph's disease, Friedreich's ataxia, etc.
  • polyglutamine disease found in myotonic dystrophy, etc. ⁇ hen 'I students are recognized.
  • Exercise-two euron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis, a typical example, include free radical generation, neuronal cell death due to excessive accumulation of glutamate, increased intracellular calcium ion concentration, and NO generation. It is considered the etiology.
  • Parkinson's disease degeneration of dendritic dopaminergic neurons is considered to be the main lesion.
  • Autoimmune diseases can cause movement disorders.
  • the immune system originally exists as a biological defense mechanism against the invasion of harmful foreign substances from the outside world. However, sometimes the function of the immune system can be harmful to the living body. When this condition occurs, it is called an autoimmune disease.
  • an autoimmune disease As a disease exhibiting dyskinesia due to this autoimmune reaction, myasthenia gravis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and the like are known.
  • the exemplified multiple sclerosis is a kind of demyelinating disease in which large and small demyelinating lesions are scattered in the white matter of the central nervous system, and the lesions are characterized by a variety of new and old lesions.
  • the lesions are most commonly found in white matter around the lateral ventricles, optic nerve, brainstem, and spinal cord. Histologically, it is a disease in which the oligodendrocytes that form the myelin are damaged, and a large number of cells that have undergone apoptosis in the lesion are observed.
  • the demyelinating lesion has inflammatory cell infiltration early, but in the chronic phase it is replaced by glial fibrils and hardens.
  • Clinical symptoms are various combinations of symptoms such as optic neuritis, diplopia, oculomotor disorders such as nystagmus, spastic paralysis, painful tonic convulsive seizures, Lermit's syndrome, ataxia, speech disorders, and bladder rectal disorders. It is characterized in that it appears together and shows remission.
  • the ischemic state of the brain caused by various factors such as cerebral infarction and intracerebral hemorrhage generally causes oxygen and hypoxia in cells and tissues in the ischemic region, resulting in oxygen deficiency.
  • ATP production is disrupted through disruption of ATP production, eventually leading to degeneration, necrosis, or atrophy.
  • a decrease in the supply of oxygen and glucose due to ischemia triggers the generation of free radicals, an excessive accumulation of glutamate, an increase in intracellular calcium ion concentration, an increase in NO production, and the like.
  • Causing death This disorder is dependent on ischemia time, with longer ischemia times during reperfusion Disability also tends to worsen. As a result, motor function is also impaired due to nerve cell death and cell degeneration.
  • neurodegenerative diseases presenting with movement disorders are considered to have a common etiology, such as neuronal death and cytodegeneration, although the types of the diseases are different. Therefore, a substance having an effect of suppressing or improving this nerve cell death or degeneration is considered to be a therapeutic drug for the above-mentioned neurodegenerative diseases, particularly, movement disorders. At present, various drugs are being tried to improve these symptoms.
  • Examples include superoxide dismutase ⁇ catalase, glutathione peroxidase, and other substances that prevent and control oxidative disorders in many living organisms, trimetazidine hydrochloride, a therapeutic agent for ischemic heart disease that is actually used for treatment, and Ozadarel sodium, a mouthboxane synthase inhibitor, ifenprodil tartrate, a cerebral circulatory metabolism improver, and nizophenone fumarate, an ischemic encephalopathy improver, are also available. It cannot be suppressed.
  • Parkinsonism such as hand tremors
  • autonomic nervous symptoms such as orthostatic hypotension
  • autonomic nervous modulating agents are used for autonomic nervous modulating agents. Therefore, in order to improve the dyskinesia caused by nerve cell death and cell degeneration, as described above, substances that suppress cell death and cell degeneration caused under adverse conditions for nerve cells, in particular, increase intracellular antioxidant capacity There is a long-awaited need for a substance to be used.
  • selenoprotein P which is a protein derived from blood components
  • C-terminal peptide of selenoprotein P Cell death inhibitory activity was found, and a patent application was filed based on this finding (PCT / JP99 / 063222).
  • the inventors of the present application have conducted intensive studies to provide a new agent for improving a neurodegenerative disease, in particular, an agent for improving a movement disorder.
  • the present invention relates to a dyskinetic agent comprising selenoproteins P and Z or a C-terminal peptide of the protein or the peptide group as a main component.
  • the C-terminal peptide of the protein or the peptide group comprises a deletion, substitution or addition of one or several amino acids at the C-terminal 103 amino acid sequence of selenoprotein P.
  • the C-terminal peptide or the peptide group of the protein is represented by the following formula:
  • amino acid sequence represented by the following, the amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, the partial sequence of any of the amino acid sequences, or the amino acid sequence of any one of the amino acid sequences Or a peptide group having an amino acid sequence contained in a part thereof.
  • FIG. 1 is a graph showing the improvement effect of selenoprotein P on bilateral carotid artery blockade-induced dyskinesia in gerbils.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of selenoprotein P on dyskinesia in mouse AE.
  • FIG. 3 is a micrograph of cultured human neurons observed when selenoprotein P was added (SeP (+)) and when selenoprotein P was not added (SeP (-)). When selenoprotein P was added, projections were observed in cultured human neurons.
  • selenium-containing protein was identified as a selenium-containing protein, and in 1982 it was revealed that selenium was incorporated in the form of selenocysteine. Furthermore, in 1991, cloning of the cDNA of selenoprotein P revealed the full-length amino acid sequence, which indicated that the protein could contain up to 10 selenocysteines. (Hill KE and Ourk RF, Biomed. Environ. Sci., 10, p. 198-208 (1997)). Although the function of selenoprotein P was almost unknown, recently, it was found that phospholipid hydroperoxide and peroxynitrite act in vitro and act as survival promoting factors for neurons in in vitro systems.
  • the present invention relates to a new drug effect based on the above-mentioned findings of selenoprotein P, and the essential feature of the agent for improving neuropathy of the present invention is selenoprotein P. More specifically, selenocysteine, which contains selenium in selenoprotein P, is characterized by this amino acid, and is thought to be the central amino acid in improving neuropathy, especially movement disorders.
  • the inventors of the present application have disclosed in a previous patent application that a cell death fragment of selenoprotein P, which is a protein derived from blood components, has a cell death inhibitory activity which has not been reported previously. It is clear that the contained selenocysteine is also involved in this activity. Therefore, proteins and / or peptides containing selenocysteine and having cell death inhibitory activity can be candidates for the dyskinetic ameliorating agent.
  • selenium related to the present invention is one of the trace essential elements, and if it is deficient, severe deficiency accompanied by cardiomyopathy is known.
  • selenium is essential for maintaining and proliferating at the cell level.
  • the range of effective and dangerous doses that is, the concentration range of the safety zone is narrow, and selenium conjugates with an appropriate amount or more are generally used. Is toxic to cells and induces cell death. For example, selenium sudden and sexually toxic symptoms include facial pallor, neurological symptoms, neuropathy, dermatitis, and gastrointestinal disorders.
  • the insects are quite toxic.
  • the C-terminal fragment of selenoprotein or tin selenoprotein P which is a preferred embodiment of the present invention, has a strong poison despite its structure containing 9 to 10 selenocysteines. From the above, it is considered important that selenoprotein P exhibiting a medicinal effect according to the present invention contains selenocysteine and has reduced cathodotoxicity.
  • the peptide or the peptide group of the present invention not only overcomes the selenium compound's proposition of reducing toxicity, but also makes it possible to bring about an unexpected improving effect on dyskinesia.
  • selenoprotein P used here. Any molecule having a good activity is included. That is, various molecular forms such as complete molecular selenoprotein P can be targeted. Among them, a preferred embodiment is a peptide at the C-terminal side of selenoprotein P or the peptide group, and among them, 103 at the C-terminal side (from 260 to 362: 260Lys Arg Cyslie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro
  • the term "the peptide group” refers to a peptide derived from the amino acid sequence of selenoprotein P and containing at least one selenocystin, and one or several amino acids in the amino acid sequence. Means an aggregate of peptides having different microstructures due to the presence or absence of sugar chains, differences in charge, diversity of fragmentation, etc., including amino acid sequences that have been deleted, substituted or added. That is, the selenoprotein P and peptides of the present invention are derived from the amino acid sequence of selenoprotein P and have no particular restriction on the molecular form as long as they have cytotoxicity-inhibiting activity.
  • Such a peptide of the present invention can be prepared according to a conventional method using a peptide synthesizer, and a peptide compound of the present invention can be used as a lead substance to design a synthetic compound. .
  • the method for producing selenoprotein P or a peptide or peptide group derived from the protein used in the present invention is not particularly limited.For example, a method for separating human blood from human blood, or a method using genetic recombination technology Can be manufactured You.
  • the protein or peptide or peptide group as an active ingredient can be combined with a suitable known excipient to obtain the dyskinetic agent of the present invention by a known method.
  • the effective dose of the dyskinesia-improving agent of the present invention varies depending on the age, symptoms and severity of the administration subject, and ultimately varies according to the intention of the physician. Although the efficacy does not depend on the method of administration, it is optimal to administer it subcutaneously, intradermally, intraperitoneally, single intravenously (bolus) or intravenously. In the case of peptides having a small molecular weight, oral administration and transdermal administration are also possible.
  • the subject to which the agent for improving a neurological disorder of the present invention is administered is not particularly limited as long as it is a disease that exhibits neurological symptoms due to nerve cell death or cell degeneration thereof, particularly a disease in which motor function is reduced.
  • a drug containing the selenoprotein P of the present invention or a peptide or peptide group derived therefrom as a main component is used as an agent for improving a neurological disorder such as a movement disorder, the drug may be administered alone.
  • co-administration with other therapeutic agents can also be expected as an effective means for increasing the effect.
  • an effect can be expected in either prophylactic or therapeutic administration.
  • the present invention provides an agent for improving a neuropathy suitable for a neurodegenerative disease caused by various etiologies, in particular, a disease having reduced motor function.
  • the heparin-sepharose-bound fraction in plasma was precipitated with 2 M ammonium sulfate, and the precipitate was dissolved with 5 times or more of 2 OmM Tris (pH 8.0) with respect to the precipitated fraction.
  • Selenoprotein P present in this solution was bound to the anti-SeP antibody column and washed with PBS. Thereafter, selenoprotein P was eluted with 20 mM citrate buffer containing 4 M urea, and bound to a cation exchanger (Macroprep High S: BioRad) equilibrated with 20 mM citrate buffer. This was subjected to salt concentration gradient elution with sodium chloride, and a fraction showing cell death inhibitory activity was collected.
  • an Atsey medium (50% PBS / SA / 0.03% HSA (manufactured by SI GMA)) or SA / 0.05% defatty acid BSA (WAKO) / 4 M Long-chain polyvalent fatty acid (such as arachidonic acid, linoleic acid or linolenic acid) is washed twice to obtain 3 ⁇ 10 4
  • the obtained cell suspension was dispensed into a 96-well 11 plate, with 200 1 only for the sample addition and 100 1 for the serial dilution.
  • a peptide purified from the fragment in a reduced state (Lys Arg Cyslie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu lie Phe Glu Lys (SEQ ID NO: 4) was also confirmed to have cytotoxicity-suppressing activity, while selenocysteine-free peptide derived from selenoprotein P (Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser) (SEQ ID NO: 5) was found to have no activity, indicating that selenocystine is important for -selenoprotein P activity.
  • Klotho mouse is an aging model mouse created by Dr. Yoichi Nabeshima of Kyoto University graduate School of Medicine in 1997.It has an average lifespan of 60 days and its growth is delayed from around 20 days after birth. Nearly all cases die within 0 days.
  • the tail is completely hanging
  • the selenoprotein P administration group was found to have an effect of suppressing the onset of the disease and reducing the severity. Furthermore, comparing the incidence rate on day 10, 4 out of 13 selenoprotein P groups showed severe onset in the selenoprotein P administration group, although 12 out of 13 animals in the Saline group were affected. Not. This indicates that selenoprotein P has an inhibitory effect on the onset of immunological disorders and a reduction effect on motor disorders.
  • Neurosci. Res. 35: 585-602 is a neural progenitor cell derived from human teratocarcinoma, and can be converted to hNT neurons that show the properties of central nervous system nerves by retinoic acid. (Trojanowski, JQ et al., 1993 Exp. Neurol. 122: 283-294). The effect of selenoprotein P on the projection formation of the hNT cells was examined.
  • Both NT2 and hNT cells can be cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C, and hNT cells were obtained by the following procedure. First, 10% FCS / D—MEM / F—1
  • NT 2 cells that can be subcultured in 2 media are plated with 2.5 x 10 5 cells ml, and D—MEM / F-1 containing 10 M all trans retinoic acid after 24 B
  • the medium was changed to 2 and induction was started. After that, the medium was changed every three days, and the cells were cultured for 6 weeks to differentiate NT2 cells into hNT cells. After collecting all the differentiated cells, the cells were subcultured three times in 10% FCS / D-MEM / F-12 medium. After 48 hours, plating was performed so that 3-4 ⁇ 10 6 cells Zm 1 were obtained.
  • the medium was replaced with 5% FCS / D-MEMZF-12 plus mitotic inhibitor (10 ⁇ M Fluorodeoxyuridine, Uridine, 1 ⁇ cytosine arabinoside), and culturing was performed for 10 days while changing the medium every 3 days.
  • mitotic inhibitor 10 ⁇ M Fluorodeoxyuridine, Uridine, 1 ⁇ cytosine arabinoside
  • the released hNT neurons were recovered by light tapping.
  • the recovered cells were suspended in a medium containing an equal volume of NT2 culture supernatant (10% FCS / D-MEM / F-12) and fresh 10% FCS / D-MEM / F-12, and then coated with Larainin. After plating on the plate, the cells were maintained.
  • the hNT cells thus obtained were used for experiments.
  • the obtained hNT cells were collected by trypsinization, washed with a basal medium mixed with RPMI 1640, D-MEM, F-12 at a ratio of 1: 2: 2, suspended in the same medium, and placed in a 96-well plate. Culture at 3000 cells / we11 killed completely on days 5-7. On the other hand, when selenoprotein P was added to 100 ng Zml, cell death was completely suppressed, and it was possible to maintain the cell death for 2 weeks or more. In addition, when the cell morphology was observed on the fourth day of culture, as shown in FIG. 3, the formation of projections was observed when selenoprotein P was added. This indicates that selenoprotein P has an effect on the formation of dendrites and axons of nerve cells.

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Description

明 細 書 技術分野
本願発明は医療用医薬品の分野に属する血漿蛋白質の新たな用途に関する。 さ らに詳細には、 老化や外傷性、 脳血管障害、 免疫異常性疾患、 運動失調症、 てん かん、 運動ニューロン疾患など神経系を構成する細胞の細胞死や細胞変性に起因 する神経変性に対する医薬品に関する。 より詳しくは、 血漿蛋白質の一種である セレノプロテイン pを、 好適には当該セレノプロテイン Pの C末端側ぺプチドも しくは当該ペプチド群を主たる有効成分として含有する神経変性疾患治療剤とり わけ運動障害改善剤に関する。
背景技術
神経系を構成する細胞 （神経細胞ゃグリア細胞など） の細胞死や細胞変性が認 められる神経性疾患として、 脳梗塞、 脳出血、 くも膜下出血、 多発性脳梗塞性痴 呆、 ビンスワンガー型白質脳症、 慢性硬膜下血腫などの脳血管障害性疾患、 多発 性硬化症、 ギランバレー症候群、 膠原病などの自己免疫性疾患、 脊髄小脳変性症、 シャイドレーガー症候群、 筋萎縮性側索硬化症、 アルツハイマー症、 ピック病、 ハンチントン舞踏病、 パーキンソン病、 進行性核上麻痺、 てんかん、 プリオン病 などの神経変性疾患、 さらには老化に付随する痴呆症、 歩行障害や、 交通事故な どによる外傷性の脊髄損傷、 脳障害なども知られている。 これらのほとんどの疾 患では、 主症状として運動機能の低下 （運動障害） が認められている。
運動障害には、 筋の障害、 神経の障害、 骨や関節の障害などがあるが、 そのう ち、 運動障害をきたす神経中枢性障害について、 部位別に分類列挙すると、 大脳 (前頭葉)性、 小脳性、 前庭谜路)性及 髄性の運動障害症がある。
大脳性運動障害症では大脳皮質、 殊に前頭葉性の障害が考えられ、 脳血管障害 ¾病変、 脳萎縮、 外傷、 腫瘍、 ピック病をはじめ慢性硬膜下血腫などでしばしば 問題となる。 また、 失調性歩行のほか精神機能の低下を示す。
小脳性運動障害症は、 小脳障害すなわち小脳腫瘍、 血管性障害、 変性性疾患、 小脳萎縮、 奇形などに伴う重要な症状で、 小脳虫部の損傷では主として体幹性失 調をきたし、 起立歩行の障害 '蹣跚歩行、 大歩行を示し、 一般に姿勢、 体位保持 が困難で平衡パランス障害をきたす。 それに反し、 小脳半球性障害では四肢筋ト 一ヌスの異常、 筋緊張の低下を示し、 患側方向への偏位歩行、 協調運動不能、 誤 示 (指一指、 指一鼻試験） 、 運動測定障害、 ホームズ'スチュアート現象のほか、 企図振戦や小脳性言語 (断続性 ·爆発性)を伴う。
前庭 (迷路)性失調症では、 前庭機能障害に由来し、 原因としてその多くは耳科 的、 内耳性障害性疾患の存在あるいは後遺症としてみられる。 例えば、 メニエー ル病、 突発性難聴、 ストレプトマイシンやカナマイシンなどの薬物中毒による平 衡神経の障害、 外傷、 梅毒、 音響外傷、 耳硬化症、 内耳炎 (及びその続発症)が挙 げられる。
脊髄性運動障害症は、 別名後索性運動失調症と呼称するごとく、 脊髄後索障害 により深部感覚の障害すなわち、 位置覚、 関節覚、 握覚の障害により失調をきた すものである。 フリードライヒ運動失調症、 亜急性脊髄連合変性症、脊髄癆など で特徴的にみられる。
これらの運動障害を呈する神経変性疾患は神経細胞死や細胞変性と病態が深く 関係している。 例えば、 ハンチントン病、 脊髄小脳変性症 （マシャド 'ジヨセフ 病、 フリードライヒ失調症など） 、 筋緊張性ジストロフィーなどに見られるポリ グルタミン病ゃァルツハイマ 病などでは、 異常蛋白の細胞内蓄積による神経細 胞死ゃ変' I生が認められている。 運動二ユーロン疾患でも、 その代表例である筋萎 縮性側索硬化症において、 フリ一ラジカルの発生、 グルタミン酸の過剰蓄積によ る神経細胞死、 細胞内カルシウムイオン濃度の上昇、 NO発生などが、 病因と考 えられている。 さらに、 パーキンソン病では黒質緻密層ドーパミン性神経細胞の 変性が主病変と考えられている。
人は老化が進むにしたがって進行的な身体機能の低下が観られる。 これら変ィ匕 の基礎を成す形態の老化として βは萎縮 (重量の減少)する。 例えば、 老化が進 行すると脳萎縮がみられ、 顕著な場合には、 歩行障害や痴呆症になる。 組織病理 学的には、 神経細胞の変性あるいは脱落、 老人斑、 アルツハイマー原線維変ィ匕な どがみられる。 これらの神経系の細胞死や変性はフリ一ラジカノレなどの酸化スト レスやダリケーシヨンによって生じているといわれている。 また、 剖検脳の生化 学的知見として神経伝達物質の減少、 ことにコリン作動系ニューロンの障害が報 告されているが、 なお病因は不明である。
さらに、 健常人でも、 交通事故などによって脊髄や脳を損傷して、 歩行障害に なることがある。 事故などで強力な外力が加わり、 脊椎の脱臼骨折がみられると 脊髄に圧迫や挫創が起こり、 脊髄が損傷される。 原因にはその他放射創、 切創、 刺創がある。 骨傷の明白でない場合もあり、 頸椎の過伸展損傷でよくみられる。 病態は、 脊髄実質に出血、 浮腫を基盤とした脊髄の挫滅と圧迫病変である。 臨床 症状として不全あるいは完全横断麻痺が出現する。
自己免疫疾患によつて運動障害が生じる場合がある。 免疫系は本来外界からの 有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。 しかし時 にはこの免疫系の働きが、 結果的に生体に有害であることがある。 これをもとに ある病態が生じた時には、 自己免疫疾患と呼ぶ。 この自己免疫反応が原因で、 運 動障害を呈する疾患として、 重症筋無力症、 多発性硬化症、 慢性関節リウマチな どが知られている。
例示される多発性硬化症は、 脱髄疾患の一種で、 中枢神経系の白質に大小さま ざまの脱髄巣が散在し、 その病巣もまた新旧様々なものが存在することを特徴と する。 病巣は側脳室周囲、 視神経、 脳幹、 脊髄などの白質に好発する。 組織学的 には髄鞘を形成するオリゴデンドロサイトが傷害される疾患であり、 病巣にアポ トーシスを起こした細胞が多数認められる。 脱髄巣は早期には炎症性細胞浸潤が あるが、 慢性期になるとグリア線維で置き換えられて硬化する。 臨床症状は視神 経炎、 複視、 眼振などの眼球運動障害、 痙性麻痺、 有痛性強直性痙攣発作、 レル ミット症候群、 失調症、 言語障害、 膀胱直腸障害などの症状がいろいろな組み合 わせで出現し、 しかも寛解を示すことに特徴がある。
脳血管障害性疾患においては、 脳梗塞や脳内出血など様々な要因によって生じ た脳の虚血状態が、 一般的に虚血領域の細胞や組織に酸素欠乏と栄養障害をもた らし、 酸素欠乏は A T P産生の途絶を介して、 まず機能が障害され、 ついには変 性、 壊死、 あるいは萎縮をきたす。 具体的には、 虚血に伴う酸素とグルコースの 供給低下が引き金となり、 フリ一ラジカルの発生、 グルタミン酸の過剰蓄積、 細 胞内カルシウムイオン濃度の上昇、 NO産生の増大などが見られ、神経細胞死を 引き起こしている。 この障害は虚血時間に依存し、 虚血時間が長いほど再灌流時 の障害も悪化する傾向にある。 これらのこと力ゝら、 神経細胞死や細胞変性により 運動機能にも障害を呈することになる。
発明の開示
(発明が解決しようとする技術的課題）
以上述べてきたように、 疾患の種類こそ異なるものの、 運動障害を呈する神経 変性疾患には、 共通する病因として神経細胞死や細胞変性が考えられている。 従 つて、 この神経細胞死や変性を抑制あるいは改善するような効果を持つ物質は、 前述のような神経変性疾患、 とりわけ運動障害の治療薬になると考えられる。 現 在、 これらの症状を改善するために、 種々の薬剤が試みられている。 例えば、 ス 一パーォキシドジスムターゼゃカタラーゼ、 グルタチオンペルォキシダーゼほか 多数の生体の酸化障害に対する予防、 制御物質のほか、 実際に治療に用いられて いる虚血性心疾患治療剤である塩酸トリメタジジン、 ト口ンボキサン合成酵素阻 害剤であるォザダレルナトリゥム、 脳循環代謝改善剤である酒石酸ィフェンプロ ジル、 虚血性脳障害改善剤であるフマル酸ニゾフエノンなどもあるが、 これらに より障害が完全に抑制できるわけではない。
このように神経細胞死や神経変性を伴う運動障害について、 症状を改善する有 効な治療薬はほとんど知られておらず、 そのため対処療法が主体となっている。 例えば、 手の震えなどのパーキンソニズムにはパーキンソン病治療薬、 起立性低 血圧などの自律神経症状には自律神経調整薬が使われている。 従って、 神経細胞 死や細胞変性によって生じる運動障害を改善するためには、 前述のように、 神経 細胞にとって悪条件下で生じる細胞死や細胞変性を抑制する物質、 中でも細胞内 抗酸化能を上昇させる物質が切望されている。
なお、 上記の記述 （背景技術及 ϋ ^明が解決しょうとする技術的課題） は、 「虚血によりなぜ細胞は死ぬのカゝ j 田川邦夫著、 共立出版； 「脳卒中ハンドブッ ク」 佐野圭司、 アイ ·ピー ·シー； 「今日の診療」 C D- R OM版、 医学書院；
「医学大辞典」 C D- R OM版、 南山堂； 「最新医学大辞典」 C D- R OM第 2版、 医歯薬出版、 「アポトーシスと疾患」 水野美邦編、 医薬ジャーナル社の記述を参 考にした。
(その解決方法） 上述の状況の下、 本願発明者らは先に、 血液成分由来の蛋白質であるセレノブ 口ティン Pに、 そしてより好適な態様として当該セレノプロテイン Pの C末端側 ぺプチドに、 従来報告されていなかった細胞死抑制活性が認められることを見出 し、 この知見を基に特許出願した（P C T/ J P 9 9 / 0 6 3 2 2 )。 さらに、 本願 発明者らは、 新たな神経変性疾患改善剤、 とりわけ運動障害改善剤を供するべく 鋭意研究した結果、 驚くべきことに従来試みられることのなかつた前記セレノプ 口ティン Pまたはその C末端側ぺプチドもしくは当該べプチド群が、 モデル動物 での実際の生体内投与によって、 運動障害改善剤として人間その他の動物に充分 に適応できる事実を見出し、 この知見に基づいて本願発明を完成するに至った。 すなわち、 本願発明は、 セレノプロテイン Pおよび Zまたは当該蛋白質の C末 端側べプチドもしくは当該ぺプチド群を主要構成成分とする運動障害改善剤に関 する。
本願発明の好ましい態様において、 前記蛋白質の C末端側ぺプチドもしくは当 該ペプチド群は、 セレノプロテイン Pの C末端側 1 0 3アミノ酸配列、 1もしく は数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、 前記いず れかのァミノ酸配列の部分配列または前記ァミノ酸配列をその一部に含有するァ ミノ酸配列を有するぺプチドまたは当該べプチド群である。
本願発明のさらに好ましい態様において、 前記蛋白質の C末端側ぺプチドもし くは当該ペプチド群は、 次式、
K i ) Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu
Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) および/または
( I I ) ： Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2 )
(式中、 Xaaはセレノシスティンを表す）
で表されるァミノ酸配列、 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加 された当該ァミノ酸配列、 前記いずれかのァミノ酸配列の部分配列または前記い ずれかのアミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するぺプチドまた は当該ペプチド群である。 図面の簡単な説明
図 1はスナネズミの両頸動脈遮断誘導運動障害に対するセレノプロテイン Pの 改善効果を示す図である。
図 2はマウス E A Eにおける運動障害に対するセレノプロテイン Pの改善効果 を示す図である。
図 3はセレノプロテイン Pを添加した場合 ( S e P (+) ) と添加しない場合 ( S e P (—）） に観察される培養ヒト神経細胞の顕微鏡写真である。 セレノプロ ティン Pを添加した場合には培養ヒト神経細胞に突起形成が認められる。
発明を実施するための最良の形態
セレノプロテイン Pは 1 9 7 7年にグルタチオンぺロキシダーゼ
(glutathione - peroxidase)とは異なるセレン含有蛋白質として確認され、 1 9 8 2年にセレンがセレノシスティン（selenocysteine)の形態で取り込まれているこ とが明らかにされた。 さらに、 1 9 9 1年にセレノプロテイン Pの c D NAのク ローニングにより全長のアミノ酸配列が明らかにされ、 その結果、 当該蛋白質は 最大 1 0個のセレノシスティンを含む可能性等が示された（Hill K. E.及 O¾urk R. F. , Biomed. Environ. Sci.， 10， p. 198—208 (1997) )。 セレノプロテイン P の機能はほとんど不明であつたが、 最近、 in vitroの系で phospholipid hydroperoxideや peroxynitriteの遠元活性、 神経細胞の survival promoting factorとしての作用が見出された。
具体的な事例として、 老化のモデルマウスであるクロトーマウスにおいて、 顕 著な運動性の回復が認められ、 さらに、 多発性硬化症のモデルである実験的ァレ ル ー性脳脊髄炎 ^experimental allergic encephalomyelitis： E AE) でも 発症抑制効果と症状低減効果が認められ、 運動障害症の改善作用があることが判 明した。 また、 脳血管障害性疾患のモデルである、 スナネズミの両頸動脈遮断実 験において、 虚血'再灌流後の神経症状、 とりわけ運動障害改善に有効であるこ とも示された。 さらに、 セレノプロテイン Pに培養神経細胞に突起を形成させる 作用があることが分かり、 細胞ダメージから機能回復させる作用もあることが示 された。 これらのこと力 、 神経系においては、 虚血 ·再灌流障害だけでなく、 病因には依存せずに、 神経障害、 とりわけ運動障害症状を改善する作用をセレノ プロテイン Pが有していることが示された。
本願発明は、 セレノプロテイン Pの前記知見に基づく新たな薬効に関するもの であり、 本願発明の神経障害改善剤の本態はセレノプロテイン Pである。 さらに 詳細には、 セレノプロティン Pの中のセレンを含むセレノシスティンに特徴があ り、 このアミノ酸が神経障害とりわけ運動障害の改善作用の中心アミノ酸である と思われる。 本願発明者らは、 先の特許出願において、 血液成分由来の蛋白質で あるセレノプロテイン Pの C末端側ぺプチド断片に従来報告されていなかつた細 胞死抑制活性が認められることを開示した。 この活性にも、 含有されるセレノシ スティンが関与していることが明らかである。 従って、 セレノシスティンを含み 細胞死抑制活性を持つ蛋白質及び/またはぺプチド群は、 運動障害改善剤の候補 となりうる。
そもそも、 本願発明に関係するセレンは、 微量必須元素の一つであり、 それが 欠乏した場合には心筋症などを伴う重篤な欠乏症が知られている。 また、 無血清 培養の培地に亜セレン酸ナトリゥムの添加が必須であることから、 セレンが細胞 レベルでの生存維持 ·増殖に必須であることが示されている。 し力 し、 セレン化 合物が毒物指定されていることから理解されるように、 有効量と危険量の幅、 つ まり安全域の濃度幅が狭く、 適量以上のセレンィ匕合物は一般的には細胞にとって 毒性を示し、 逆に細胞死を誘導する。 例えば、 セレンの急、性中毒症状として、 顔 面蒼白、 神経症状、 神経障害、 皮膚炎、 胃腸障害などが知られている。 また、 細 胞培養にセレノシスティンの 2量体であるセレノシスチンを添加すると、 聘虫で はかなり強い毒性を示す。 これに対して、 本願発明の好適な態様であるセレノプ 口ティン P、 セレノプロテイン Pの C末端側断片は、 その構造中に 9〜1 0個の セレノシスティンを含むにも拘わらず、 強い毒' 1"生は観察されなかった。 このこと から、 本発明の薬効作用を示すセレノプロテイン Pの特徴として'、 セレノシステ インを含み、 なおカつ毒性が減弱していることが重要と思われる。 本願発明のぺ プチドまたは当該べプチド群は、 毒性の低減というセレン化合物に対する命題を 克服するのみならず、 予期し得ない運動障害改善作用をもたらすことを可能とす るものである。
ここで用いられるセレノプロテイン Pに特段の制約はなく、 所望の運動障害改 善活性を有するものであれば如何なる分子形態のものをも包含する。 すなわち、 完全分子型セレノプロテイン Pをはじめ種々の分子形態のものが対象となり得る。 この中で、 好適な態様はセレノプロテイン Pの C末端側ぺプチドもしくは当該べ プチド群であり、 中でも C末端側 1 0 3個（ 2 6 0位から 3 6 2位まで： 260Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro
Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu lie Phe Glu Lys Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie Thr Glu Ser Cys Gin Xaa Arg Leu Pro Pro Ala Ala Xaa Gin lie Ser Gin Gin Leu lie Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser Xaa Arg Xaa Lys Asn Gin Ala Lys Lys Xaa Glu Xaa Pro Ser Asn362 (式中、 Xaaはセレノシ スティンを表す） （配列番号 3 ) のアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列または、 前記いずれかのァミノ酸配列の部分配列または前記ァミノ酸配列を含有するアミ ノ酸配列を有するぺプチドまたは当該べプチド群は、 とりわけ好適な態様として 推奨され得る。
なお、 本願明細書で用いる 「当該ペプチド群」 とはセレノプロテイン Pのアミ ノ酸配列に由来し、 少なくとも 1個のセレノシスティンを含むペプチドで、 当該 ァミノ酸配列のうち 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加された アミノ酸配列を含み、 糖鎖の有無、 荷電の相違、 断片化の多様性等に起因する微 細構造の異なるペプチドの集合体を意味する。 すなわち、 本願発明のセレノプロ ティン P及びペプチド群は、 セレノプロテイン Pのアミノ酸配列に由来し、 細胞 障害抑制活性を有するものであればその分子形態に特段の制約はなく、 これらに は完全分子型のセレノプロテイン Pをはじめこれに起因する C末端側ぺプチド等 が含まれる。 このような本願発明のペプチドは、 ペプチド合成機を用いて常法に 従って調製することもできるし、 また、 本願発明のペプチドをリード物質として、 ィ匕学合成物をデザィンすることも可能である。
本願発明に使用されるセレノプロテイン Pまたは当該蛋白質に由来するべプチ ドもしくはぺプチド群を製造する方法は特に限定されるものではないが、 例えば ヒト血液より分離する方法、 または遺伝子組換え技術により製造することができ る。 本願発明に使用される運動障害改善剤の主要構成成分となるセレノプロティ ン Pまたは当該蛋白質に由来するぺプチドもしくはぺプチド群は、 一般的な酵素 類よりも熱、 変性剤、 幅広い; H、 血中のプロテアーゼに対して安定であるため、 これを精製同定するに際しては、 一つの態様として、 血漿を出発原料とし種々の クロマトグラフィ一工程、 例えば、 へパリンクロマトグラフィ一、 陽ィオン交換 クロマトグラフィー、 陰イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィ 一、 ゲノレ濾過クロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 ハイドロキシァパ タイトクロマトグラフィー、 抗体カラムの様な各種ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一等、 適用可能な種々の担体を用いた分画方法の他、 硫酸アンモニゥム沈殿 分画、 分子量膜分画、 等電点分画、 電気泳動分画等、 種々の分画法が利用可能で ある。 これらの分画法を組み合わせることにより、 所望のセレノプロテイン Pま たはぺプチドもしくはぺプチド群を分画することが可能である。 その望ましい組 み合わせの一例を調製例 1に示す。
本願発明では、 有効成分としての当該蛋白質またはぺプチドもしくはぺプチド 群と公知の適当な賦形剤を組み合わせ、 公知の方法で本願発明の運動障害改善剤 とすることができる。 本願発明の運動障害改善剤の有効投与量は、 投与対象者の 年齢、 症状及び重症度などにより変動し、 最終的には医師の意図により変動する。 薬効は投与方法には依存しないが、 皮下、 皮内、 腹腔への投与、 血管内への単回 (ボーラス）投与あるいは点滴投与などが最適である。 また、 分子量の小さなぺプ チド群の場合は、 経口投与や経皮投与なども可能である。
本願発明の神経障害改善剤の投与対象は、 神経細胞死あるいはその細胞変性に 起因し、 神経症状を呈する疾患、 とりわけ運動機能の低下している疾患であれば 特に限定されることはない。 例えば、 脳梗塞、 脳出血、 くも膜下出血、 多発性脳 梗塞性痴呆、 ビンスワンガー型白質脳症、 慢性硬膜下血腫などの脳血管障害性疾 患、 虚血性麵障害、 臓器移植等再灌流障害、 血管性障害、 神経障害、 動脈硬化 及び心筋梗塞等、 神経変性疾患では、 多発性硬化症、 ギランバレー症候群、 膠原 病などの自己免疫性疾患、 脊髄小脳変性症、 シャイドレーガー症候群、 マチヤ ド-ジヨセフ病、 筋緊張性ジストロフィー、 フリードライヒ失調症、 筋萎縮性側 索硬化症、 アルツハイマー症、 ピック病、 ハンチントン舞踏病、 パーキンソン病、 進行性核上麻痺、 てんかんなどの神経変性疾患、 さらには老化に付随する痴呆症、 歩行障害や、 交通事故などによる外傷性の脊髄損傷、 脳障害などがその対象とし て考慮され得る。 中でも、 運動失調症、 てんかん、 運動ニューロン疾患、 老ィ匕や 外傷性の疾患、 脳血管障害性疾患、 免疫異常性疾患に分類されるものが最適対象 と考えられる。 運動障害のような神経障害改善剤として本願発明のセレノプロテ イン Pまたはこれに由来するべプチドもしくはぺプチド群を主要構成成分として 含有する薬剤を使用する場合、 本薬剤を単独で投与することもできるし、 他の治 療薬剤との併用投与も効果を増大させるための有効な手段として期待できる。 ま た、 予防的または治療的投与のいずれにおいても効果が期待できる。
本願発明により、 種々の病因に起因する神経変性疾患、 とりわけ運動機能の低 下している疾患に対する好適な神経障害改善剤が提供される。
以下、 調製例及び実施例に沿って本願発明をさらに詳細に説明するが、 これら は本願発明の範囲を何ら限定するものではない。 なお、 以下に示す調製例及ぴ実 施例では、 特に断りのない限り、 和光純薬、 宝酒造、 東洋紡、 及 mfew England BioLabs社、 フアルマシャ社、 バイオラド社、 シグマ社、 ギプコ B R L社製の試 薬を使用した。
調製例 1
(セレノプロテイン P断片に対する抗体結合担体 (抗 S e P抗体カラム）を用いた セレノプロテイン P断片の精製）
血漿中のへパリンセファロース結合画分を 2 M硫酸アンモニゥムにより沈殿さ せ、 その沈殿画分に対して 5倍以上の 2 O mM T r i s ( p H 8 . 0 )により沈殿 を溶解させた。 この溶液に存在するセレノプロテイン Pを抗 S e P抗体カラムに 結合させ、 P B Sで洗浄した。 その後 4 M尿素を含有する 2 0 mMクェン酸バッ ファーによりセレノプロテイン Pを溶出し、 2 O mMク ン酸バッファーで平衡 化した陽イオン交換体 (Macroprep High S: BioRad)に結合させた。 これを塩化ナ トリウムによる塩濃度勾配溶出を行ない、 細胞死抑制活性を示す画分を回収した。 この時、 全長のセレノプロテイン Pを得ることが可能であるが、 蛋白あたりの細 胞死抑制活性は明らかに弱い値を示した。 本方法では、 短時間の精製が可能であ るため、 蛋白あたりの細胞死抑制活性の強 V、セレノプロテイン P断片を得ること ができた。 ここで得られた断片もまた、 糖鎖の有無、 分子間結合の有無、 内部切 断の有無などにより種々のサイズの分子種を含む混合画分であり、 非還元電気泳 動で 10〜30 kD aのサイズを示すセレノプロテイン P断片群であった。 実施例 1
(細胞障害抑制活性）
細胞障害抑制活性のアツセィ系に使用する D a m i細胞 (Greenberg S.M.ら、 Blood vol.72, p.1968- 1977 (1988)に記載）を用いて、 アツセィ培地（50%PB S/SA/0.03%HSA(S I GMA社製)）または S A/0.05%脱脂肪酸 B S A(WAKO社)/ 4 Mの長鎖多価脂肪酸（ァラキドン酸、 リノール酸または リノレン酸等）により 2回洗浄しで 3 X 104細胞/ mlになるように懸濁後、 得 られた細胞懸濁液をサンプル添加ゥエルのみ 200 1、 段階希釈のためのゥェ ルには 100 1ずつを 96 w e 1 1プレートに分注した。 サンプル添加ウエノレ にアツセィ試料として調製例 1で得られたセレノプロテイン P断片及び、 セレノ シスチン、 セレノメチォニン、 エブセレン、 亜セレン酸ナトリゥムについて同一 濃度の溶液を調製し、 それらを 2 1添加し撹拌後、 100/x 1細胞懸濁液が入 つたゥエルに対して段階希釈した。 そして、 37°Cの CO2インキュベーターで 4〜 5日間培養し細胞の生死を判定した。
その結果、 調製例 1で精製したセレノプロテイン P断片以外に、 その断片より 還元状態で精製したペプチド （Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu lie Phe Glu Lys (配列番号 4) にも細胞障害抑制活性のあることを確認した。 一方、 セレノプロテイン P由来のセレノシスティンを含まないペプチド （Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser) (配列番号 5) には活性がないことが分かり、 -セレノプロテイン P活 性にとってセレノシスティンが重要であることが示された。
実施例 2
(脳虚血再灌流障害モデルにおけるセレノプロテイン P断片の虚血■再灌流障害 抑制効果）
セレノプロテイン Pの脳虚血再灌流障害による運動障害に及ぼす影響を麻痺の 度合いで確認するために、 1 2週齢のスナネズミを用いて評価した。 塩酸ケタミ ン（l O O m g Z k g )の腹腔内注射にて全身麻酔をかけ、 正中切開にて頸静脈を 露出させ、 本願発明のセレノプロテイン P断片を 1 m g /匹の量で静脈内投与し た。 3 0分虚血、 4 5分間虚血を行なった後、 血流を再灌流させ、 6時間後及び 2 4時間後の麻痺の度合！/、により評価した。
6時間後及び 2 4時間後の麻痺の状態を表 1に示すスコァで判定し評価した。
IE 0
前足に軽い麻痺があり、 足を曲げた状態で動きが鈍い · 1
足の麻痺が多少悪化し、 片側に回り続ける 2
麻痺が悪化し、 片側に倒れる 3
更に麻痺が悪ィ匕し、 動けない状態になる 4
5Εύ 5
図 1に示すように、 3 0分虚血モデルにおける 6時間後の麻痺の状態及ぴ 2 4 時間後の麻痺の状態を評価すると、 セレノプロテイン Ρ断片投与群の方が明らか に症状が良好である結果が得られた。 また、 4 5分虚血モデルでは 6時間後の麻 瘅の度合いは大差ないが、 2 4時間後の麻痺の度合いに大きな差が観られた。 実施例 3
(ク口トー（Klotho)マウスへのセレノプロテイン Ρの投与による運動失調の改善 効果）
老ィ匕に付随する運動機能低下の改善を目的として、 クロトーマウス (Nature,
390: 45-51, 1997) を用いて本願発明のセレノプロテイン P断片の効果を確認した。 クロトーマウスは、 1 9 9 7年に京都大学大学院医^ f究科の鍋島陽一先生らが 作出した老化モデルマゥスで、 平均寿命は 6 0日、 生後 2 0日頃から発育が遅延 し、 生後 1 0 0日以内にほぼ全例が死亡する。 Klotho遺伝子変異のため、 動脈硬 化症、 肺気腫、 皮； #萎縮、 性腺萎縮 （卵子や精子が減数分裂しない） 、 神経変性 (小脳 Purkinje細胞の脱落、 運動失調症） 、 脳下垂体の機能異常 （成長ホルモ ンの生産低下、 成長障害） 、 骨粗鬆症 （軟部組織や軟骨の異所性石灰化） など、 老ィ匕に関連した異常が認められるマウスである。 Nature, 390 :45 - 51， 1997に記載 され、 クロトーマウスは京都大学大学院医学研究科の鍋島腸一先生の許可を得て 日本クレアより入手した。 1群 4匹の 4週齢のクロトーマウスに対して 8週齢まで、 生理食塩水に溶解し た調製例 1で得られたセレノプロテイン P断片（1. 5mgZral)及び生理责塩 水を毎週 300 /Z 1ずつ腹腔に投与し、 その状態変化を観察した。 その結果、 生 理食塩水投与群、 セレノプロテイン P断片投与群ともに、 4週齢からの体重の増 加は観察されず、 根本原因を解決する事は無かった。 しカゝし、 その行動を比較す るとセレノプロテイン P断片投与群が手のひらに乗せた際、 自発的に逃げるため に飛び降りることが可能であるのに対し、 生食投与群は自発的な逃避行動をとる ことが出来なかった。 これはセレノプロテイン P断片による運動能低下の改善効 果を示すものと考えられた。
実施例 4
(マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎 (EAE) )
セレノプロテイン Pの免疫異常性疾患による運動障害に及ぼす影響を麻痺の度 合 ヽで確認するために、 マウス EAEでのセレノプロテイン P投与実験をを行つ た。 動物として、 S J L//jOr I I Cr j、 メス、 14週令（日本チャールズ リバ一）を用い、 免疫原として myelin proteolipid protein (PLP) synthetic peptide 139-151 (アミノ酸配列： His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe) (酉己列番号 6) を 25mgZマウスで、 フロイント完全アジュバ ント H37Ra (400mg/マウス） と百日咳菌毒素 （List Biological Laboratory社製； 200 n gZマウス） とともに尾根部 2箇所に皮内投与した。
1群 13匹で、 セレノプロテイン Pを発症前日 （8日目） から 13曰目まで毎 日、 0.5 m g /headで腹腔内投与した。 対象として同様に Salineを腹腔投与し た。 発症後、 その麻痺の程度を表 2に示すスコアで毎日判定し、 評価した。 表 2
正常 0
尾が不完全に垂れ下がつた状態 0.5
尾が完全に垂れ下がつた状態
後肢の軽度の麻痺 2
後肢の中度から重度の麻痺）または前肢の軽度の麻痺 · · 3
後肢の完全麻痺及び/または前肢の中度から重度の麻痺' 4
四肢の麻痺または瀕死 5
死亡 6 その結果、 図 2に示すように、 セレノプロテイン P投与群に、 発症の抑制と重 症度の軽減効果が認められた。 さらに、 10日目の発症率を比較すると、 Saline 投与群は 1 3匹中 1 2匹が発症しているにもかかわらず、 セレノプロテイン P投 与群では 1 3匹中 4匹し力発症していない。 このことから、 セレノプロテイン P には免疫異常性疾患における発症の抑制効果と運動障害の軽減効果があることが 示された。
実施例 5
(培養ヒト神経細胞の突起形成に対するセレノプロテイン Pの効果）
NT 2 (N t e r a 2/Ό 1) (Pleasure, S. J.及び Lee, V.M. 1993 J.
Neurosci. Res. 35： 585-602) はヒト奇形癌由来の神経前駆細胞であり、 レチノ ィン酸により中枢神経系の神経の性状を示す h NT神経細胞へと分ィ匕させること が可能である（Trojanowski, J.Q.ら、 1993 Exp. Neurol. 122： 283-294)。 この h NT細胞の突起形成に対するセレノプロテイン Pの効果を検討した。
NT 2、 hNT細胞ともに 37°C、 C O 2インキュベーターで培養可能であり、 hNT細胞は以下の操作により得た。 まず、 10%FCS/D— MEM/F— 1
2培地で継代培養可能である NT 2細胞を 2. 5 X 105細胞 m 1でプレーテ ィングしておき、 24 Bき間後に 10 M all trans retinoic acid を含む D— M EM/F-1 2に培地を交換して誘導を開始した。 その後 3日毎に同培地を交換 し、 6週間培養することにより NT2細胞を hNT細胞へ分化させた。 分化した 細胞を全て回収後、 10%FCS/D— MEM/F— 1 2培地により 3倍に拡張 継代培養した。 更に 48時間後に 3— 4X 1 06細胞 Zm 1になるようにプレー ティングした。 48時間培養後に 5%FCS/D— MEMZF— 12プラス mitotic inhibitor ( 10 μ M Fluorodeoxyuridine, Uridine, 1 μΜ cytosine arabinoside)に培地を交換、 3日毎に同培地を交換しながら 10日間培養した。 その後、 短時間のトリプシン処理後、 軽いタッピングで遊離してくる hNT神経 細胞を回収した。 回収した細胞は NT 2培養上清 （10%FCS/D— MEM/ F- 1 2) と新しい 10%FCS/D— MEM/F— 1 2を等量混合した培地に 懸濁後、 Laraininコートプレートにプレーティング後、 細胞を維持した。 このよ うにして得られた h NT細胞を実験に用いた。 得られた h N T細胞はトリプシン処理により細胞回収後、 R PM I 1640、 D-MEM, F— 12を 1 ： 2： 2で混合した基礎培地により洗浄後、 同培地懸 濁後 96穴プレートに 3000細胞/ we 1 1で培養を行うと、 5〜7日目に完 全に死滅した。 それに対して、 セレノプロテイン Pを l OOngZml添加する と完全に細胞死が抑制され、 その状態で、 2週間以上維持可能であった。 また、 培養 4日目に細胞形態を観察すると、 図 3に示すように、 セレノプロテイン P添 加では、 突起形成が認められた。 このことより、 セレノプロテイン Pに神経細胞 の樹状突起や軸索などの突起形成に効果があることが示された。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . セレノプロテイン Pおよび/または当該蛋白質の C末端側ぺプチドもしくは 当該べプチド群を主要構成成分とする運動障害改善剤。
2 . 前記蛋白質の C末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、 セレノプロティ ン Pの C末端側 2 6 0位アミノ酸から 3 6 2位アミノ酸までのアミノ酸配列、 1 もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加された当該アミノ酸配列、 前 記いずれかのァミノ酸配列の部分配列または前記ァミノ酸配列をその一部に含有 するアミノ酸配列を有する細胞障害抑制活性を示すぺプチドまたは当該ぺプチド 群である、 請求項 1記載の運動障害改善剤。
3 . 前記蛋白質の C末端側ペプチドもしくは当該ペプチド群が、 次式：
κ ΐ ) Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) および/または
( I I ) ： Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2 )
(式中、 Xaaはセレノシスティンを表す）
で表されるァミノ酸配列、 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加 された当該ァミノ酸配列、 前記いずれかのァミノ酸配列の部分配列または前記い ずれかのァミノ酸配列をその一部に含有するアミノ酸配列を有するぺプチドまた は当該べプチド群である請求項 1または請求項 2記載の運動障害改善剤。
4 . 運動障害が、 神経変性疾患に付随して生じる症候である、 請求項 1から請求 項 3のいずれかに記載の運動障害改善剤。
5 . .運動障害が、 老化、 外傷性神経障害疾患、 脳血管障害性疾患または免疫異常 性疾患に付随して生じる症候である、 請求項 1カゝら請求項 3のいずれかに記載の
6 . セレノプロテイン Pおよび/または当該蛋白質のペプチドもしくは当該ぺプ チド群を主要構成成分とする神経変性疾患治療剤。
7. 神経変性疾患が、 運動失調症、 てんかん、 運動ニューロン疾患、 老化、 外傷 性神経障害、 脳血管障害、 免疫異常性疾患より選択される、 請求項 6に記載の神 経変性疾患治療剤。
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