WO2002074902A2 - Coculture de neurones avec des cellules cibles en chambre bicompartimentee - Google Patents

Abstract

L'invention décrit une chambre de culture comportant deux compartiments séparés par un support biologique et permettant la mise en culture de part et d'autre de la cloison de cellules nerveuses et de cellules cibles, ainsi que des procédés de préparation d'une telle chambre. L'invention décrit également des méthodes pour obtenir des tissus biologiques reconstitués, en particulier des tissus biologiques reconstitués comprenant au moins deux types cellulaires, l'un d'entre eux étant des cellules nerveuses, et permettant de mesurer des paramètres tels que la toxicité, l'effet thérapeutique ou l'effet cosmétique de composés tests. L'invention décrit en outre des outils et kits pour la mise en oeuvre de ces méthodes.

Description

COCULTURE DE NEURONES AVEC DES CELLULES CIBLES EN CHAMBRE BICOMPARTIMENTEE

La présente invention se rapporte aux domaines techniques de la biologie, de la biotechnologie, de la biochimie, de la toxicologie, de la pharmacologie et de la cosmétologie. Ses applications concernent notamment les domaines de la santé humaine et animale. Plus particulièrement, l'invention décrit de nouvelles méthodes qui permettent de déterminer la toxicité ou au contraire l'effet thérapeutique ou cosmétique de composés tests, ainsi que des outils et kits pour la mise en œuvre de ces méthodes. L'invention décrit ainsi une chambre de culture comportant deux compartiments séparés par une cloison perméable imprégnée d'une matrice biologique et permettant la mise en culture de part et d'autre de la cloison de cellules nerveuses et de cellules cibles, ainsi que des procédés de préparation d'une telle chambre. L'invention décrit également des méthodes de reconstitution de tissus biologiques à partir des cellules qui les composent, en particulier de tissus biologiques reconstitués comprenant au moins deux types cellulaires, l'un d'entre eux étant des cellules nerveuses. L'invention est particulièrement utile dans l'industrie pharmaceutique ou cosmétique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules à court, moyen ou long terme, qui pourront entrer en développement pharmaceutique et/ou dans des compositions pharmaceutiques ou cosmétiques.

Les cultures cellulaires, pour qu'elles soient de bons outils susceptibles de remplacer ou diminuer l'expérimentation animale, se doivent de reproduire le plus fidèlement possible l'organisation observée in vivo, en particulier l'organisation tridimensionnelle. Jusqu'à ce jour, les cocultures de cellules nerveuses avec des cellules cibles comme les cellules musculaires striées, les cellules épithéliales, les kératinocytes ou les entérocytes se faisaient soit directement en contact sur le même support de culture, soit par l'intermédiaire d'inserts de culture séparant les deux populations cellulaires et empêchant tout contact physique entre les cellules. Or, in vivo, les corps cellulaires des neurones se trouvent toujours séparés des cellules cibles telles que les kératinocytes, autres cellules épithéliales, cellules musculaires etc., et/ou cellules autres que les cellules du système nerveux, par une matrice complexe à travers laquelle elles projettent leurs dendrites.

Dans les cocultures classiques, par exemple les cocultures d'expiants de moelle épinière et de muscles striés (Askanas et al., 1975), les corps cellulaires des neurones qui se développent, sont directement en contact avec les autres types cellulaires, et baignent dans le même milieu ce qui peut perturber la physiologie des cellules.

Dans une coculture en insert où des neurones sensitifs sont placés dans le fond d'un puit de culture tandis que des kératinocytes sont cultivés dans des inserts, les cellules communiquent entre elles par l'intermédiaire de molécules chimiques qui circulent dans le milieu sans qu'il y ait de contact entre les prolongements neuronaux et les cellules cibles.

La présente invention propose pour la première fois des méthodes et outils pour la préparation de tissus reconstitués complexes, c'est-à-dire comprenant au moins deux types cellulaires, proche des conditions physiologiques, notamment des conditions physiologiques d'interaction entre lesdits types cellulaires. L'invention décrit notamment des tissus biologiques reconstitués comprenant une population de cellules nerveuses et une population de cellules cibles, lesdites populations étant séparées par un filtre ou une membrane empêchant le contact des corps cellulaires mais permettant le passage des prolongements nerveux. Cette invention a pour but de développer un modèle permettant de mettre en culture des cellules nerveuses et des cellules cibles séparées par un support biologique formant une barrière physique.

Tissu reconstitué La présente invention propose pour la première fois un tissu biologique reconstitué comprenant des cellules nerveuses et des cellules cibles séparées par support biologique formant une barrière physique, ledit support comprenant une membrane d'origine biologique ou une membrane biocompatible traitée par une matrice biologique.

Le support séparant les deux populations cellulaires forme une barrière physique qui empêche tout contact physique entre les corps cellulaires d'une population et les corps cellulaires de l'autre population, mais permet le passage des prolongements nerveux. Ce support biologique comprend ou avantageusement est constitué soit d'une membrane d'origine biologique, soit d'une membrane biocompatible traitée par une matrice biologique.

En général, la membrane d'origine biologique est une matrice biologique, un explant ou une partie d'un explant de tissu humain ou animal ou un tissu reconstruit.

Un explant ou une partie de cet explant correspond généralement à une biopsie ou un morceau de tissu prélevé stérilement à partir d'un homme ou d'un animal. Ce tissu peut être la peau ou tout autre épithélium. Lorsque c'est une partie du tissu qui est utilisé, cela peut correspondre par exemple à du derme désépidermisé. Ainsi, l'expiant peut être un épithélium (épiderme ou tout autre tissu débarrassée de la couche dermique et/ou toute couche sous- jacente) ou une muqueuse comprenant un épithélium avec les couches sous- jacentes (peau, muqueuse buccale, muqueuse vaginale, muqueuse utérine, muqueuse intestinale et toute autre muqueuse).

Le tissu reconstruit ou reconstitué correspond généralement à un épithélium reconstruit, une muqueuse reconstitué ou tout autre structure tissulaire. Généralement, ce tissu est obtenu par culture cellulaire ou par greffage. Ce tissu reconstruit peut être de toute origine commerciale (épithéliums reconstruits et épidermes reconstruits (SkinEthic®) de la société SkinEthic, Modèle Episkin® de l'Oréal, modèle EpiDerm™ de la société MatTek, Mimederm®, Mimetop® de Coletica) et peut être posé directement dans la chambre selon l'invention. La matrice biologique peut être définie comme une composition comprenant un ou plusieurs facteurs, généralement d'origine biologique, permettant ou favorisant une adhésion, croissance, organisation et/ou différenciation des cellules. Elle peut se présenter sous forme de suspension, pâte, gel, etc.

Un composant préféré de la matrice biologique est le collagene, notamment le collagene polymérisé.

Tout type de collagene pouvant assurer une bonne adhésion et un bon développement des cellules nerveuses et des cellules cibles, tout en assurant une barrière physique entre les 2 types cellulaires, est susceptible d'être utilisé selon la présente invention. Le collagene peut être préparé à différentes concentrations selon le type de cellules cibles en culture. Il s'agit préférentiellement de collagene de type I, d'origine naturelle, synthétique ou semi-synthétique. Le collagene (ou les autres constituants de la matrice biologique) peut être d'une espèce différente de celle des cellules cultivées. A titre d'exemple, du collagene de type I de tendon de queue de rat peut être déposé sur la membrane.

Avantageusement, la matrice biologique comprend en outre différentes molécules de la matrice extra-cellulaire et/ou une lame basale reconstituée et/ou des cellules exerçant un rôle trophique sur les cellules cibles ou l'organe cible et/ou les neurones et/ou des cellules exerçant un rôle trophique sur les prolongements nerveux.

Ainsi, outre le collagene, la matrice biologique peut contenir différents facteurs et molécules de la matrice extra cellulaire. Ces facteurs peuvent être, par exemple, du collagene de type IV, de la laminine, de la fibronectine et/ou de la ténacine et/ou tout autre type de molécules permettant une bonne adhésion et survie des cellules cibles ou de l'organe cible et des neurones au sein de la matrice cellulaire. Ces facteurs peuvent se présenter sous forme de lame basale reconstituée extraite d'une tumeur, comme par exemple la tumeur EHS (Kleiman et Col, 1986). La lame basale reconstituée comprend ainsi toute substance issue de la tumeur EHS et/ou tout produit issu de cette tumeur et commercialisé tels que le Matrigel^® (Becton Dickinson, France). Selon une variante particulière, la matrice biologique comprend un mélange de collagene, notamment de type I, et une lame basale reconstituée extraite de la tumeur EHS de souris. La matrice biologique peut également contenir des cellules exerçant un rôle trophique sur les cellules cibles ou l'organe cible et/ou les neurones. Les cellules permettant ainsi d'augmenter la survie ou la prolifération des cellules cibles ou des neurones, peuvent être rajoutées dans la matrice biologique, par exemple dans le collagene. Il s'agit, par exemple, des cellules fibroblastiques ou des astrocytes. De même, des oligodendrocytes ou des cellules de Schwann, peuvent être incorporées dans la matrice biologique, par exemple dans le collagene. Ces cellules favorisent en effet la pousse des axones en formant autour d'eux une gaine de myéline.

La membrane d'origine biologique peut comprendre un explant ou une partie d'un explant de tissu humain ou animal ou un tissu reconstruit sur lequel a été posé, plus particulièrement du côté de la chambre où se trouve la population neuronal, une matrice biologique telle que décrite ci-dessus.

Le support biologique peut éventuellement être maintenu par une colle biologique. Ainsi, le tissu biologique selon l'invention comprend avantageusement en outre une colle biologique. La colle peut permettre d'améliorer l'étanchéité du support biologique et notamment de maintenir séparés les 2 compartiments présents dans la chambre pour la culture du tissu biologique.

La colle biologique utilisée peut être d'origine biologique ou chimique, elle doit être compatible avec le maintien de l'intégrité cellulaire et tissulaire. Elle est de préférence à base de cyanoacrylate.

La membrane biocompatible, filtre ou toile à bluter, pouvant séparer les deux populations cellulaires peut être en nylon, en soie, en fibres, en métal, en polymère, en polycarbonate ou en tout autre matériel poreux compatible avec la culture de cellules. Les mailles du filtre peuvent avoir différentes tailles selon le tissu que l'on cherche à reconstituer.

Cette membrane ou filtre biocompatible, éventuellement d'origine synthétique ou naturelle, etc, correspond à tout support solide, rigide ou semi-rigide, plan ou non, éventuellement biodégradable, assurant une séparation physique des populations cellulaires.

Comme indiqué, et selon une alternative de l'invention, la membrane biocompatible est traitée par une matrice biologique, telle que décrite ci- dessus.

Le traitement de la membrane biocompatible comprend essentiellement le dépôt de la matrice biologique à la surface de la membrane, de manière à imprégner celle-ci sur les deux faces, et à occuper l'espace des pores de la membrane. La matrice biologique peut-être déposée en une ou plusieurs fois, en une ou plusieurs couches. Elle forme généralement un film à la surface de la membrane dont l'épaisseur peut-être adaptée par l'homme du métier, mais est généralement inférieure à 1 mm de chaque côté. Typiquement, dans les chambres de culture de l'invention, on dépose par exemple de 10 à 100 μl de matrice biologique.

La support biologique empêche tout contact physique entre les corps des cellules mais permet le passage des prolongements nerveux.

L'invention propose donc des tissus et cellules cibles innervés par les prolongements nerveux des cellules nerveuses.

Cellules cibles

Les cellules cibles des neurones sont les cellules susceptibles d'être innervées. Ces cellules doivent pouvoir être isolées et purifiées et doivent pouvoir se développer ou survivre en culture dans un milieu approprié. Les cellules cibles peuvent être des cellules humaines ou animales, progénitrices ou différenciées. Elles peuvent être isolées à partir de prélèvements sains issus d'êtres humains ou de tout autre animal. Elles peuvent provenir également de prélèvements pathologiques.

La population de cellules cibles peut comprendre des cellules de plusieurs types différents, pour reconstituer des structures complexes telles que des organes. L'organe lui-même peut être une cible directe. On entend alors par organe, toute structure tissulaire organisée pouvant être innervée. II peut s'agir par exemple de kératinocytes et de mélanocytes si l'objectif est de reconstituer des épidermes pigmentés ou de cellules musculaires et de cellules fibroblastiques s'il s'agit de favoriser la formation de myotubes, ou d'expiants de tissus.

Ces cellules peuvent être issues de tissu normaux ou pathologiques, de tissus adultes, d'embryons ou encore de cellules souches (on appelle cellule souche toute cellule pluripotente d'origine embryonnaire ou adulte animale ou humaine ayant une potentialité de se différencier en une cellule adulte). Il peut s'agir par exemple de cellules provenant de l'épiderme, comme les kératinocytes ou les mélanocytes et les cellules de Langerhans ; de cellules provenant de prélèvements de derme, comme les fibroblastes et par exemple les cellules fibroblastiques 3T3, de prélèvements d'hypoderme, comme les adipocytes ou de prélèvement de muscles striés, comme les cellules satellites ou de muscles lisses, comme les cellules musculaires lisses de l'intestin, ou encore de cellules musculaires cardiaques. Il peut également s'agir de cellules nerveuses provenant d'une structure différente des neurones se développant dans le deuxième compartiment.

Les cellules cibles peuvent être ensemencées soit sous forme dissociée, soit sous forme d'expiants (on appelle explant toute tranche d'une structure tissulaire organisée ainsi découpée et mise en culture), soit sous forme d'organes reconstitués ou d'agrégats. Les cellules cibles sont cultivées dans le premier compartiment de la chambre de culture dans un milieu de culture et dans des conditions appropriés, par exemple dans une atmosphère d'air contenant 2 à 10 % de C0₂ à 37 °C. Les cellules cibles peuvent également être mises en culture après les neurones.

Le compartiment des cellules cibles peut ensuite rester accessible. Les cellules peuvent ainsi être mises en interface air-liquide en retirant le milieu de culture du compartiment. Les cellules cibles sont en contact avec le milieu à travers la matrice et peuvent, dans le cas des kératinocytes, se différencier et former une couche kératinisée (stratum corneum).

Les cellules sont donc maintenues en culture le temps de leur différenciation, prolifération, organisation et/ou adhésion, pour qu'elles puissent être innervées. A la fin de cette période les cellules nerveuses sont ensemencées du coté opposé aux cellules cibles, dans un milieu adapté.

Cellules nerveuses

Les cellules nerveuses sont les cellules capables d'innerver les cellules cibles. Elles peuvent avoir comme origine, des tissus embryonnaires ou adultes de mammifères, par exemple humain ou de rongeurs et, dans un mode préféré de réalisation de l'invention, de rat ou de souris ou encore de poulet ou de tout autre espèce animale utilisée couramment pour la culture de neurones. Elles peuvent également avoir comme origine, le tissu nerveux humain adulte ou embryonnaire, des cellules souches ou encore des lignées de cellules provenant de tumeurs (exemple : neuroblastomes) ou de lignées transfectées.

Les neurones mis en culture sont des cellules du système nerveux central ou du système nerveux périphérique (somatique ou végétatif) qui innervent des cellules cibles ou des organes cibles. Les neurones peuvent provenir du cortex entier ou d'une partie définie du cortex, comme le cortex frontal, ou de structures sous corticales, comme le thalamus ou l'hippocampe par exemple, du cortex cérébelleux, de la moelle épinière, au sein de laquelle les motoneurones peuvent être isolés, des ganglions rachidiens dorsaux, où les neurones sensitifs du système nerveux somatique peuvent également être isolés, du système sympathique, à partir des ganglions des cervicales supérieurs, des cellules nerveuses de la rétine (bâtonnet ou cône) ou de toutes autres structures nerveuses. Les neurones peuvent ainsi être des motoneurones, des neurones sensitifs, des neurones dopaminergiques, cholinergiques, gabaergiques, sérotoninergiques, etc.

Les neurones peuvent être cultivés dans les chambres de culture, soit après une dissociation enzymatique et/ou mécanique, soit après une dissociation et une purification (par traitement avec des anti-mitotiques ou par tri avec des billes magnétiques ou encore par gradient), soit sous forme d'expiant. Dans le premier cas les neurones ne se présentent plus sous la forme d'une structure organisée, mais ils sont présents avec d'autres types cellulaires. Dans le cas des explants, les neurones gardent une architecture tissulaire. C'est le cas par exemple des explants de ganglions rachidiens dorsaux, des explants de moelles épinières ou des coupes d'hippocampe.

Les cellules nerveuses sont déposées dans le deuxième compartiment après retournement de la chambre de culture, si les cellules cibles ont été ensemencées en premier, ou dans le premier compartiment, si les cellules cibles sont ensemencées dans un deuxième temps. Le milieu de culture mis dans le compartiment des neurones est adapté à chaque type cellulaire, il peut contenir du sérum ou être chimiquement défini. Les neurones dans la chambre de culture avec les cellules cibles sont préférentiellement cultivés à 37 °C dans une atmosphère saturé d'humidité contenant 2 à 10 % de C0₂. Les neurones se développent alors et émettent des prolongements en direction des cellules cibles, à travers la matrice extra cellulaire.

Milieux de culture

Les milieux de culture adaptés à la mise en œuvre de la présente invention sont choisis selon le type de cellules mises en culture et le type de tissu à reconstituer. Le milieu et les conditions de culture doivent favoriser la croissance cellulaire, la synthèse de matrice et/ou la viabilité des cellules. Il peut s'agir par exemple de sérum, d'extrait pituitaire, d'extrait hypothalamique, placentaire ou embryonnaire ou encore de protéines ou de facteurs sécrétés par des cellules nourricières. D'une manière préférée, le milieu utilisé ne contient pas de composants indéfinis et les composants sont d'origine humaine. L'utilisation de milieux de culture chimiquement définis, c'est-à-dire ne contenant aucun extrait d'organe ou de tissu animal, peut être préférée. Bien que l'addition de composants indéfinis ne soit pas préférée, elle peut cependant avoir lieu au cours de l'une des étapes de reconstitution du tissu. Des équivalents fonctionnels synthétiques connus de l'homme du métier peuvent ainsi être ajoutés pour enrichir certains milieux définis chimiquement. L'homme du métier sera ainsi capable de choisir, sans effort excessifs les équivalents humains, recombinants ou synthétiques des composants animaux connus, pour enrichir les milieux de culture de l'invention.

De nombreuses sources nutritives sont disponibles dans le commerce. Il est notamment possible d'utiliser le Dulbecco's Modified Eagle's médium (DMEM), le Minimal Essential Médium (MEM) et Le M199 qui requièrent souvent une supplémentation en phospholipides précurseurs et en acides aminés non essentiels, le RPMI 1640 ou l'iscove's Modified Dolbecco's Médium (EDMEM). Des mélanges riches en vitamines et qui fournissent un apport en acides aminés, en acides nucléiques, en cofacteurs enzymatiques, en précurseurs de phospholipides et en sels inorganiques comme Ham's F- 12, Ham's F-10, NCTC 109 et NCTC 135 sont également disponibles. Le milieu de culture préférentiellement utilisé dans le cadre de l'invention pour les cocultures épidermes/neurones comprend un mélange de DMEM/HAM 12. Pour les coculture de cellules musculaires avec explants de moelle épinière le milieu est composé d'un mélange de MEM et de M199. Les demandes de brevet WO 00/29553, WO 95/31473 ou encore le brevet US 5,712,163 décrivent des milieux de culture pouvant être utilisés dans le cadre de la présente invention. D'autres milieux sont divulgués dans Ham and McKeehan, Methods in Enzymology, 58 :44-93 (1979) ou encore dans Bottenstein et al., Methods in Enzymology, 58 :94-109 (1979). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture est enrichi à l'aide des composants suivants : insuline, transferrine, triiodothyronine (T3), éthanolamine et/ou o-phosphoryl-ethanolamine, facteurs de croissance naturels, recombinants ou synthétiques. Les concentrations de ces composants ou l'emploi d'équivalents peuvent être déterminés par l'homme du métier.

Chambres de culture

Pour la mise en œuvre de l'invention et la production de tissus reconstitués, la présente demande décrit également des chambres de culture particulières. Les chambres de culture selon l'invention sont composées de deux compartiments séparés par un support biologique telle que défini ci-avant. Ainsi, le support biologique peut être une membrane biocompatible traitée avec une matrice biologique, par exemple du collagene et éventuellement avec des molécules de la matrice extra cellulaire. Selon une autre alternative, le support biologique peut comprendre ou être constitué d'une membrane d'origine biologique telle que définie ci-dessus. Les cellules nerveuses peuvent, de manière surprenante, se développer dans une telle chambre et émettre des prolongements qui traversent le support biologique pour contacter les cellules cibles de l'autre côté. Dans ces conditions, les cellules communiquent in vitro ou ex vivo par l'intermédiaire de neurotransmetteurs ou de molécules chimiques, via les prolongements neuronaux, comme si elles se trouvaient en situation physiologique in vivo. Dans les cultures en chambre de l'invention, il est possible de doser indépendamment, à tout moment, et donc de façon particulièrement avantageuse, la libération de molécules dans chacun des 2 compartiments. Ces dosages permettent d'étudier, par exemple, la libération de neurotransmetteurs par les prolongements des axones dans le compartiment des cellules cibles. Ces cellules cibles vont alors libérer des cytokines ou des facteurs de croissance capables d'agir sur les neurones. La présente invention décrit ainsi, pour la première fois, des chambres de culture composées de deux compartiments, qui peuvent être des sections circulaires, arrondies, carrées, rectangulaires, etc. en matière plastique et notamment en polystyrène, en polyméthacrylate ou en toute autre matière compatible avec la culture cellulaire (verre, polymère, métal, etc.), séparés entre eux par un support biologique, ledit support comprenant une membrane biocompatible imprégnée d'une matrice biologique ou une membrane d'origine biologique.

La taille des chambres (hauteur et diamètre intérieur et extérieur) peut être déterminée par l'utilisation ultérieure de la culture. Elle peut en particulier s'adapter à tout instrument d'observation ou d'analyse (microscope, analyseur à haut débit). Les chambres peuvent être inégales en hauteur et en diamètre. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la hauteur de chaque compartiment est inférieure à 20 mm, de préférence inférieure ou égale à 15 mm. Le diamètre ou la largeur intérieur de ces compartiments peut être compris entre 5 et 20mm, et préférentiellement de 6 à 12 mm, tandis que leur diamètre ou la largeur extérieur peut être compris entre 8 à 22 et préférentiellement de 9 à 16 mm.

Des ouvertures sont avantageusement prévues dans les parois de chaque compartiment, destinées à permettre une circulation du milieu lorsque la chambre repose sur le fond d'un récipient.

Ainsi, dans un mode particulier, des encoches sont taillées aux extrémités de chaque compartiment, selon un mode particulièrement avantageux de l'invention. Ces encoches peuvent par exemple avoir une hauteur et une largeur de 0,3 à 1 ,5 mm, de préférence de 0,4mm. Il peut également s'agir d'ouvertures de forme et dimensions quelconques pratiquées dans les compartiments. Le nombre et/ou la forme des ouvertures peut-être différent d'un compartiment à l'autre, pour faciliter leur identification. A une extrémité de la chambre ainsi formée, il est possible, par exemple, de pratiquer deux ou trois encoches, tandis qu'aucune encoche n'est pratiquée à l'autre extrémité de la chambre. Ces encoches ou ouvertures ont notamment pour but de favoriser le passage du milieu de culture. Le nombre d'encoches ou ouvertures en haut et/ou en bas des chambres est en outre différent afin de pouvoir distinguer et identifier facilement les deux compartiments ainsi formés. Il est également possible de colorer différemment chaque compartiment afin de pouvoir les identifier facilement.

Selon une première alternative, la chambre de culture peut-être monobloc avec deux compartiments distincts séparés par une membrane physique ou biocompatible.

Ainsi, selon cette alternative, lorsque le support comprend une membrane biocompatible imprégnée d'une matrice biologique, la hauteur de chaque compartiment est encore plus préférentiellement inférieure ou égale à 10 mm et idéalement de 4 mm chacun. Le diamètre ou la largeur intérieur est de préférence de 8 à 12 ou de 8 à 10 mm et le diamètre ou la largeur extérieur de 14 à 16 mm.

Selon une autre alternative, la chambre de culture, dite alors « chambre gigogne », comprend 2 compartiments formés à partir de 2 tubes à sections de largeurs ou diamètres différents, ces tubes ayant coulissé l'un dans l'autre, le tube intérieur étant de hauteur égale ou de préférence inférieure au tube extérieur, idéalement la hauteur du tube intérieur est de 6mm et la hauteur du tube extérieur est de 13mm. Les tubes qui vont former les 2 compartiments peuvent être de sections circulaires, arrondies, carrées, rectangulaires, etc. Dans ce cas, préalablement à l'étape où les tubes coulissent l'un dans l'autre, est posé sur l'extrémité du tube intérieur un matériel biologique qui forme, après avoir fait coulisser les deux tubes, le support biologique. Le matériel biologique est donc une matrice biologique, un explant ou un partie d'un explant de tissu humain ou animal ou un tissu reconstruit. Lorsque l'on utilise un explant ou une partie d'un explant de tissu humain ou animal ou un tissu reconstruit, celui-ci peut être mis en œuvre dès sa préparation.

Les chambres de culture peuvent être fabriquées par toute technique connue. Dans le cas de la première alternative, l'assemblage des deux compartiments peut être réalisé au moyen d'une colle, un adhésif ou par tout système (chauffage, ultrasons, etc.) permettant cet assemblage. Il est possible, selon un mode préféré de l'invention, de coller la membrane biocompatible (par exemple le filtre de nylon) entre les deux compartiments en plongeant une extrémité d'une section de compartiment dans du chloroforme puis en y déposant la membrane et en plongeant ensuite la deuxième section.

Ces chambres de culture sont stérilisées avant toute utilisation. Une solution de paraformaldehyde à 4 % dans un tampon physiologique (Phosphate Buffer Saline) peut être utilisée à cet effet. Tout autre type de stérilisation ne faisant pas intervenir la chaleur peut également être utilisé (rayon gamma, oxyde d'éthylène, etc.). Les chambres sont par exemple plongées dans cette solution de paraformaldehyde à 4 % pendant 4 heures, puis rincées plusieurs fois dans de l'eau distillée.

L'invention propose un procédé avantageux de préparation d'une chambre de culture, telle que décrite ci-dessus, selon la deuxième variante, comprenant les étapes suivantes : a) stériliser la chambre de culture ou les structures la composant, b) un matériel d'origine biologique est posé, éventuellement en présence d'une colle biologique, sur une des extrémités du tube à section de largeur ou diamètre la plus petite, c) ledit matériel posé est ensuite coincé en faisant coulisser le tube à section de diamètre ou de largeur plus grande sur le tube à section de largeur ou diamètre la plus petite, formant ainsi le support séparant les

2 compartiments. L'invention propose également un procédé avantageux de préparation d'une chambre de culture, lorsque le support biologique comprend une membrane biocompatible, comprenant les étapes suivantes : a) stériliser la chambre de culture, b) mélanger, à 0°C, une solution de collagene de type I dans de l'acide acétique avec une solution physiologique concentrée et avec une solution de soude dans des proportions permettant d'obtenir une matrice de collagene ayant un pH et une concentration osmotique physiologique, c) éventuellement, mélanger à 0°C la solution obtenue à l'étape b), avant qu'elle ne gélifie, avec de l'extrait de tumeur EHS de souris dans des proportions de 1/2 à 1/5, d) couler la solution obtenue en b) ou c) dans la chambre de culture stérilisée sur la membrane biocompatible, et, gélifier le mélange à 37°C pendant 1 heure, e) éventuellement, couler une deuxième couche du mélange obtenu en b) ou c) sur la première couche de collagene gélifié obtenu en d) lorsque cette dernière est polymérisée. f) Eventuellement, couler une deuxième couche du mélange obtenu en b) ou c) dans le compartiment opposé à la première couche de collagene gélifié.

La quantité de solution obtenue en b) ou en c) dépend de la taille de la chambre. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le collagene de type I en solution dans de l'acide acétique à 0,1%, à la concentration désirée, est mélangé à 0°C, dans du milieu de culture DMEM concentré 10 fois sans bicarbonate et dans une solution de soude à 0,1 N contenant du bicarbonate concentré 10 fois (35 g par litre) dans les proportions 8/1/1. Lors de l'étape d) du procédé ci-dessus décrit, on coule entre 10 et 200 μl de la solution obtenue en b) contenant 1/5 d'extrait de tumeur EHS de souris pour des chambres de culture d'une surface de 0,6 à 1 ,2 cm².

Selon une alternative de l'invention, une caractéristique de la chambre de culture concerne le filtre séparant les deux compartiments de la chambre qui doit être imprégné d'une matrice biologique telle que décrite précédemment.

Procédés de préparation de tissus reconstitués

La présente invention décrit ainsi pour la première fois un procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer le premier type cellulaire du tissu à reconstituer dans le premier compartiment de la chambre de culture, b) après un délai nécessaire pour permettre l'adhésion de cellules à la membrane et, le cas échéant, la formation d'un amas cellulaire suffisant, ensemencer le deuxième type cellulaire dans le deuxième compartiment de cette chambre, et c) maintenir les cellules en culture pendant un délai suffisant pour permettre l'organisation cellulaire caractéristique du tissu et l'innervation des cellules cibles par les cellules nerveuses, de préférence de 5 à 30 jours.

Afin d'améliorer l'adhésion des cellules nerveuses, du collagene de différents types avec ou sans lame basale reconstituée extraite de la tumeur EHS (Kleiman et col., 1986), avec ou sans constituant de la matrice extra cellulaire peut être avantageusement déposé sur la membrane d'origine biologique, telle que matrice biologique ou explant de tissus, dans le compartiment destiné à accueillir les cellules nerveuses. Préférentiellement, du collagene de type I issu de tendon de queue de rat contenant 1/5 de lame basale reconstituée extraite de la tumeur EHS à raison de 40 μl par chambre est utilisé.

Selon un mode préféré de mise en œuvre de l'invention, les cellules en culture sont placées dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10% de C0₂ en atmosphère saturée en eau.

Selon un autre mode préféré de mise en œuvre de l'invention, le premier type cellulaire ensemencé correspond à la population de cellules cibles. Selon un autre mode préféré de mise en œuvre de l'invention, les deux types cellulaires sont ensemencés à une densité cellulaire fonction du type cellulaire et adaptée à la surface des compartiments, de préférence comprise entre 50000 et 500000 cellules par cm².

Dans le modèle épiderme-neurones sensitifs, la dépolarisation des neurones sensitifs peut être augmentée, par exemple par l'adjonction de KCI au milieu de culture, de préférence après le dixième jour de maintien des cellules en culture et d'une manière encore plus préférée après le douzième jour.

Dans le modèle nerf-muscle, l'activité électrique des neurones et la fréquence des contractions des fibres musculaires peut-être stimulée par l'adjonction de KCI ou de toute autre molécule modifiant l'activité électrique, au milieu de culture de préférence après le cinquième jour de maintien des cellules en culture et d'une manière préférée après trois semaines de culture.

Les cellules mises en culture peuvent être des kératinocytes de mammifères et le tissu à reconstituer, à l'aide de ces cellules, un epiderme innervé. Dans ce cas, la densité cellulaire des kératinocytes est de 200000 à 600000 cellules par cm² et celle des neurones est de 50000 à 300000 cellules par cm². De préférence, le nombre de kératinocytes, dans une chambre de culture dont la surface est de 0,6 cm² est d'environ 250 000 cellules et celle des cellules nerveuses est d'environ 100 000 cellules.

La présente invention décrit ainsi pour la première fois un procédé de préparation d'un epiderme reconstitué dans une chambre de culture selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer une population de cellules comprenant des kératinocytes à la densité cellulaire adaptée à la surface de la chambre de culture, dans le premier compartiment de celle-ci, b) placer les cellules dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10% de C0₂ en atmosphère saturée en eau, pendant 24 heures environ, c) retourner la chambre et ensemencer les neurones sensitifs à la densité cellulaire adaptée à la surface de cette chambre, dans le deuxième compartiment de celle-ci, d) placer la chambre dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10% de C0₂ en atmosphère saturée en eau, e) au deuxième jour de culture des kératinocytes environ, retourner la chambre une deuxième fois et éliminer le milieu de culture côté kératinocytes, et f) maintenir les cellules en culture pendant 13 à 17 jours environ, en interface air-liquide, dans une étuve à 37°C environ, contenant 2 à 10% de C0₂ en atmosphère saturée en eau.

Les cellules du tissu à reconstituer selon ce procédé peuvent encore être par exemple des cellules satellites musculaires de mammifère et le tissu à reconstituer à l'aide de ces cellules, un tissu musculaire. Dans ce cas, le nombre de cellules satellites musculaires est compris entre 30000 et 150000 cellules par cm² de préférence environ 500 000 cellules pour une surface de 1 ,2 cm², tandis que un à cinq explants, de préférence 3 explants, de moelle épinière d'embryon sont requis pour une surface de 1 ,2 cm².

L'invention propose ainsi un autre procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer les cellules du tissu à reconstituer et leur milieu de culture à la densité cellulaire adaptée à la surface de la chambre de culture, dans le premier compartiment de celle-ci, b) placer les cellules dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10 % de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, jusqu'à confluence et fusion des cellules en myotubes, s'il s'agit de cellules satellites musculaires, c) retourner la chambre et ensemencer les neurones à la densité cellulaire adaptée à la surface de cette chambre dans le deuxième compartiment de celle-ci, d) placer la chambre dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10% de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, pendant 24 heures environ, e) immerger de milieu de culture le compartiment correspondant aux neurones, f) maintenir les cellules en culture , dans une étuve à 37°C environ, contenant 2 à 10 % de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, pendant environ 3 semaines en renouvelant le milieu environ tous les 3 jours.

La présente invention permet ainsi l'obtention de tissus reconstitués différent selon le type de cellules mises en culture dans les chambres de l'invention.

Le type de cellules utilisé et leur concentration, densité et état physiologique (au repos, stimulé, etc.), peuvent être choisis par l'utilisateur des méthodes de l'invention, en fonction des applications envisagées. Les deux types cellulaires sont généralement ensemencés à une densité cellulaires fonction du type cellulaire et adapté à la surface des compartiments, de préférence comprise entre 50000 et 500000 cellules par cm².

Applications des cocultures cellules cibles-cellules nerveuses dans les chambres

Les chambres de culture selon l'invention, permettent de cultiver des cellules cibles et des neurones dans 2 compartiments physiquement séparés par un support biologique. Cette organisation se rapproche de la situation physiologique par rapport aux cultures classiques en monocouche ou en explant, car seuls les prolongements des cellules nerveuses (axones ou dendrites) sont en contact avec les cellules cibles. Ces cocultures en chambre constituent donc un modèle de choix pour étudier les échanges entre les neurones et les cellules cibles, sans avoir recours à l'expérimentation animale mais en restant proche de la situation in vivo.

Ces chambres permettent de doser séparément dans le compartiment neuronal et dans le compartiment des cellules cibles, par des techniques ELISA (ou d'autres techniques), la libération de neuropeptides par exemple le CGRP et/ou la substance P et/ou de molécules telles que des cytokines et/ou des neurotransmetteurs et/ou des facteurs de croissance et/ou toutes autres molécules libérées dans le surnageant par les différents types cellulaires.

Ainsi, il est possible de doser par des techniques ELISA, appliquées par exemple à des épidermes innervés, la libération de CGRP, de substance P, de cytokines ou de facteurs de croissance dans le surnageant de culture côté compartiment neurones ou côté compartiment epiderme.

Il est également possible de marquer en immunofluorescence ou en immunocytochimie les différentes cellules avec des marqueurs spécifiques (anticorps, sondes moléculaires, etc.) des neurones et/ou de leurs prolongements et/ou de sécrétions et/ou des kératinocytes, etc.

La matrice de collagene peut elle-même être marquée en immunofluorescence ou en immunocytochimie notamment avec des anticorps marquant le collagene ou d'autres constituants du support biologique.

Les contacts cellulaires entre les neurones et les cellules cibles peuvent quant à eux être avantageusement étudiés en microscopie confocale ou électronique.

Il a été montré que, dans les chambres de culture selon l'invention, les kératinocytes forment un epiderme reconstitué avec plusieurs couches de cellules dont les dernières couches forment un stratum corneum.

Ces chambres de culture permettent également, de manière avantageuse, de récupérer un type cellulaire en évitant toute contamination par les autres types cellulaires, si l'on désire réaliser une analyse en biologie moléculaire.

De plus, de par sa configuration en trois dimensions, ces modèles de cocultures en présence de neurones permettent d'étudier la formation et l'organisation des contacts cellulaires, synapses, plaques motrices, en présence de différentes molécules. Ces études peuvent être réalisées également avec des cellules provenant de tissus pathogènes.

Dans un mode particulier de mise en œuvre des méthodes d'étude des tissus reconstitués de l'invention, ces derniers peuvent être traités par un ou plusieurs composé-test de façon à caractériser les réactions cellulaires à l'égard de ce ou ces composé-test ainsi qu'à l'égard du ou des autres types cellulaires.

Le composé-test peut être de nature très variée. Ainsi, il peut s'agir d'un composé isolé ou d'un mélange de substances. Le composé peut être de nature chimique ou biologique. Il peut s'agir notamment d'un peptide, polypeptide, acide nucléique, lipide, glucide, d'une molécule chimique, d'extraits végétaux, de banques combinatoires, etc. Le composé test peut également être un traitement appliqué aux tissus (radiations, UV, etc.). Pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, le composé test peut être appliqué à différentes concentrations, choisies par l'utilisateur.

La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué tel que défini ci-avant, pour l'évaluation des propriétés biologiques et/ou toxiques d'un composé test, notamment de composés à visée thérapeutique, cosmétiques, etc. Il peut s'agir également de tester des véhicules, crèmes, systèmes de libération de produits, etc.

Avantageusement, plusieurs composés tests sont évalués en parallèle, sur plusieurs tissus reconstitués (ou chambre de culture), disposés dans des supports (plaques multipuits, boîtes, etc.). Ce procédé d'étude des tissus reconstitués peut également permettre l'analyse des transcrits des différents types cellulaires ainsi que l'analyse de l'activité électrique, l'étude des canaux ioniques impliqués dans les échanges et/ou celle des récepteurs, par des techniques électrophysiologiques ou par des techniques de patch-clamp.

Kits

La présente demande a également pour objet des kits (ou trousses) pour la mise en œuvre des procédés de préparation et d'études des tissus reconstitués tels que décrits ci-avant. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils contiennent plusieurs chambres de culture selon l'invention et une ou plusieurs boîtes (boîte de Pétri par exemple), tubes, etc., ou plaques dont les puits ont une dimension suffisante pour accueillir les chambres de culture. Comme indiqué ci-avant, dans les kits de l'invention, les deux compartiments des chambres de culture peuvent être de couleur et/ou de forme différente, permettant leur reconnaissance. La faisabilité, la réalisation et d'autres avantages de l'invention sont illustrés plus en détails dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Légende des figures :

Figure 1 : Dessin d'une chambre de culture, selon la première alternative. Figure 2 : Dessin d'une chambre de culture, selon la deuxième alternative, dite « chambre gigogne » Figure 3 : Culture de kératinocytes dans un compartiment de la chambre.

Figure 4 : Marquage par immunofluorescence des prolongements neuritiques ; Microscopie à fluorescence.

Exemples

Exemple 1 : culture de neurones sensitifs en présence d'un epiderme reconstitué à partir de kératinocytes.

A - Culture de kératinocytes humains selon le protocole de Green

Préparation des cellules 3T3

Afin d'obtenir un nombre élevé de cellules proliférantes lors d'une première phase de culture, la méthode appliquée utilise un tapis nourricier de cellules fibroblastiques 3T3 sur lequel sont ensemencés les kératinocytes en primoculture. Les 3T3 sont issues d'une lignée de fibroblastes embryonnaires de teratome de souris. Elles vont synthétiser des protéines qui agissent comme des facteurs de croissance pour les kératinocytes.

Les cellules 3T3 sont cultivées dans du milieu DMEM complété avec 1% de L- Glutamine 200 mM et 10 % de sérum de veau fœtal dans une étuve à 37 °C contenant 5 % de C0₂ saturé en humidité. Les cellules se multiplient dans ce milieu et elles peuvent être repiquées plusieurs fois quand elles sont sub- confluentes. Les cellules 3T3 sont traitées avec de la mitomycine C afin de stopper leurs divisions avant d'être utilisées comme cellules nourricières pour les kératinocytes.

Les cellules 3T3 sub confluentes sont traitées avec de la mitomycine C à 5 μg/ml pendant 2 h à 37 °C. Les cellules sont récupérées par dissociation enzymatique et congelées dans du DMEM 10 % de DMSO et 20 % de Sérum de Veau Fœtal (SVF).

Les cellules sont décongelées et ensemencées à raison de 10⁶ cellules par flacon de 75 cm² dans du DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % de L- Glutamine la veille de la primo-culture de kératinocytes.

Préparation des kératinocytes

Les prélèvements de peau sont grattés au scalpel pour enlever la couche graisseuse puis sont successivement placés dans plusieurs bains d'une solution de 70 % de solution physiologique et de 30 % d'alcool, puis dans un bain de PBS 1 % d'une solution 100 X de pénicilline streptomycine.

Les morceaux de peau de 1 cm², sont déposés dans une solution de dispase Grade II pendant la nuit, à 4°C. A la fin de l'incubation, le derme est séparé de l'épiderme à l'aide de pinces fines. Les morceaux d'épiderme sont placés dans une solution de Trypsine EDTA, pendant 10 min, à 37°C. Les morceaux sont dissociés mécaniquement à l'aide d'une pipette de 5 ml. La réaction enzymatique est arrêtée avec du milieu de culture DMEM contenant 10 % de SVF. Les tissus sont filtrés à travers de la gaz stérile.

Les cellules, récupérées par centrifugation, sont cultivées dans une étuve à 37°C, contenant 5 % de C0₂ saturé en eau à 3 10⁶ cellules par flacon de 75 cm² contenant les cellules fibroblastiques 3T3 mytomicinées dans du milieu de Green. Le milieu de Green est composé de 60 % de DMEM, de 30 % de Ham F 12 et de 10% de SVF. Ce milieu de base est complété par 2 % de L- Glutamine 200 mM et de 0,4 % d'une solution antibiotique composé de pénicilline et de streptomycine, de 5 μg par ml d'insuline, de 10 ng/ml dΕpithelial Growth Factor (EGF) et de 0,5 μg par ml d'hydrocortisone. Le milieu de culture est changé après 2 jours de culture, puis tous les 3 jours. Ces cocultures sont une première fois passées dans une solution de trypsine EDTA, pendant 1 min, à 37 °C afin d'éliminer les fibroblastes, puis une deuxième fois pendant 20 min afin de décoller les kératinocytes. La réaction enzymatique est arrêtée avec du milieu de culture.

B - Préparation des chambres de culture.

Les chambres de culture sont stérilisées dans une solution de 2 % de paraformaldehyde (PFA) pendant 2 heures, puis rincées 5 fois dans de l'eau distillée stérile.

Le collagene de type I extrait de tendon de queue de rat est utilisé pour préparer la matrice. La solution de collagene dans de l'acide acétique 0,1 %, le DMEM sans bicarbonate 10 fois concentré et une solution de NaOH 0,1 N comprenant 35 g par litre de bicarbonate sont mélangés à 0°C dans des proportions 8/1/1. Après ajout de 1/5 d'extrait de tumeur EHS de souris, 50 à 100 μl sont coulés dans les chambres de culture dont le filtre de nylon est humide. L'ensemble est gélifié à 37°C.

Une deuxième couche de collagene contenant 1/5 de lame basale reconstituée est coulée par dessus quand la première couche est polymérisée.

Une autre façon de préparer les chambres de culture consiste à reconstituer un derme équivalent. Une solution de collagene de type I dans de l'acide acétique 0,1 %, le DMEM sans bicarbonate 10 fois concentré et une solution de NaOH 0,1 N comprenant 35 g par litre de bicarbonate sont mélangés à 0°C dans des proportions 8/1/1. Cette solution est mélangée avec 10 % de sérum fœtal de veau. 5 ml de cette solution sont mélangés avec 250 000 cellules fibroblastiques dermiques puis ensemencées dans une boite de pétri de 60 mm de diamètre. Cette boite de pétri est placée dans une étuve contenant 5 % de C02 à 37 °C saturée en humidité. Après gélification du collagene, cette matrice va se rétracter pour former après une semaine, un tissu de 15 mm de diamètre. Cette pastille ou derme équivalent est coincé entre le bord intérieur du gros tube et le bord extérieur du petit tube de la chambre de culture gigogne. Le derme équivalent ainsi tendu forme la barrière biologique entre les deux compartiments.

Une deuxième couche de collagene contenant 1/5 de lame basale reconstituée est coulée par dessus quand la première couche est polymérisée.

C - Cultures des kératinocytes et des neurones en chambres de culture.

Les kératinocytes sont ensemencés à la densité cellulaire de 500 000 cellules par chambre de culture de 12 mm de diamètre intérieur dans du milieu de culture composé de 1/3 de milieu nutritif Ham F12 et de 2/3 de milieu DMEM complété par 5 % de SVF, 2 % de L-glutamine, de 0,4 % d'une solution concentrée de pénicilline et de streptomycine 100 x, de 5 μg par ml de d'insuline, de 10 ng/ml d'EGF, de 0,5 μg par ml d'hydrocortisone, de 1 % d'une solution d'acides aminés non essentiels et de 1 ,5 10^"3 M de chlorure de calcium. Les cellules sont placées pendant 24 h dans une étuve à 37 °C contenant 5 % de C0₂.

Après 1 jour de culture, les chambres sont retournées et les neurones sensitifs fraîchement dissociés sont ensemencés à raison de 200 000 cellules par chambre de 12 mm de diamètre. Les neurones sont issus de ganglions rachidiens dorsaux (DRG) d'embryon de rat Wistar de 15 jours. Les DRG sont prélevés sous loupe binoculaire et placés dans du milieu de Leibovitz L 15. A la fin de la dissection, les DRG sont lavés dans du HBSS, sans Ca⁺⁺ ni Mg⁺⁺, puis incubés pendant 15 min à 37°C dans 5 ml de trypsine EDTA. La réaction enzymatique est arrêtée avec 5 ml de DMEM contenant 10 % de SVF. Les DRG sont dissociés mécaniquement à l'aide d'une pipette de 10 ml et la suspension cellulaire est reprise dans le milieu de culture décrit ci dessus auquel sont ajoutés 10 μg/ml de Nerve Growth Factor. A ce stade, la suspension cellulaire est composée de neurones sensitifs non matures, de cellules de Schwann et de cellules fibroblastiques. Les chambres sont ensuite placées dans une étuve à 37°C contenant 5 % de C0₂.

Au deuxième jour de culture des kératinocytes, les chambres sont retournées une deuxième fois et le milieu de culture côté kératinocytes est éliminé afin de mettre les cellules épidermiques à l'interface air-liquide. Les cellules sont maintenues en culture dans une étuve à 37 °C, contenant 5 % C0₂, pendant 13 à 17 jours, en interface air-liquide, afin que l'épiderme forme plusieurs couches.

D - Analyses des épidermes innervés

Les neurones se développent dans le deuxième compartiment et émettent des prolongements à travers la matrice de collagene pour contacter les kératinocytes. Ces observations ont été faites par microscopie confocale. Les neurones libèrent spontanément, après 13 jours de coculture, des neuropeptides dans le compartiment des cellules nerveuses, mais également dans le compartiment des kératinocytes. Cette libération est augmentée en dépolarisant les neurones avec 40 mM de KCI (tableau 1 ).

Le tableau n°1 donne la quantité de CGRP libérée dans le surnageant de culture du compartiment des cellules cibles et du compartiment des neurones après 7 jours de coculture, quand les neurones ne sont pas matures et après 13 jours de coculture, quand les neurones sont matures.

La quantité de CGRP libérée spontanément pendant 20 min dans les surnageants de culture des 2 compartiments est dans un premier temps dosée par une technique ELISA. Dans un deuxième temps la quantité de CGRP libérée après stimulation de l'activité électrique des neurones par du KCL pendant 20 min est dosée par la même technique.

Exemple 2 : culture d'expiants de moelle épinière en présence de myotubes

A - Culture des cellules satellites humaine à partir de prélèvement de muscles humains

Les cellules satellites musculaires sont obtenues à partir d'une biopsie musculaire d'un donneur.

Primo-culture des cellules satellites La biopsie est débarrassées des gaines, des tendons et de la graisse, qui entourent les groupes de fibres et découpée en petit fragments de 0,5 mm². Ces fragments sont ensuite incubés une nuit, à 37°C, dans une atmosphère saturée en humidité contenant 5 % de C0₂ et dans un milieu contenant 61,25 % de milieu 199, 37,5 % de sérum fœtal de veau et 1 ,25 % d'un mélange d'antibiotique 100 X.

Les fragments sont ensuite déposés dans des boites de culture traitées avec 1 ,5 % de gélatine. Ils sont incubés dans un milieu constitué de 1/3 de milieu 199 et de 2/3 de MEM complété avec 10 % de sérum fœtal de veau, 5 μg/ml d'insuline, 10 ng/ml d'EGF, 10 ng/ml de FGF, 1 % d'une solution 100 X d'antibiotiques. Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37°C, 5 % C0₂, pendant 5 à 10 jours. De ces explants vont sortir des cellules satellites qui vont coloniser la boite de culture. Les cellules sont récupérées par trypsinisation.

A ce stade, elles peuvent être soit subcultivées, dans le même milieu, soit congelées dans une solution de MEM contenant 20 % de sérum de veau fœtal et 10 % de DMSO à -80 °C, selon le protocole usuel.

Subculture des cellules satellites

Les cellules sont ensemencées dans des boites de culture de 100 mm de diamètre prés enduites avec de la gélatine 0,1 % à raison de 4000 cellules par cm² dans un milieu contenant 1/3 de milieu 199 et 2/3 de milieu MEM complété avec 10 % de sérum fœtal de veau, 5 μg/ml d'insuline, 10 ng/ml d'EGF, 10 ng/ml de FGF, 1 % d'une solution 100 X d'antibiotiques. Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37°C, 5 % C0₂.

B - Préparation des chambres de culture. Les chambres de culture sont stérilisées dans 2 % de para-formaldéhyde (PFA) pendant 2 heures, puis rincées 5 fois dans de l'eau distillé stérile.

Le collagene de type I extrait de tendon de queue de rat est utilisé pour préparer la matrice. La solution de collagene dans de l'acide acétique 0,1 %, le DMEM sans bicarbonate 10 fois concentré et une solution de NaOH 0,1 N comprenant 35 g par litre de bicarbonate sont mélangés à 0°C dans les proportions 8/1/1. Après ajout de 1/5 d'extrait de tumeur EHS de souris, 50 μl sont coulés dans les chambres de culture dont le filtre de nylon est humide. L'ensemble est gélifié à 37°C.

C - Ensemencement des cellules satellites dans les chambres

Les cellules satellites sont ensemencées à raison de 100 000 cellules par chambre dans le premier compartiment d'une chambre de 12 mm de diamètre intérieur et dans un milieu de culture classique, connu de l'homme du métier, contenant 1/3 de M199, 2/3 de MEM et 10% de sérum de veau fœtal, 5μg/ml d'insuline, 10 ng/ml d'EGF, 10ng/ml de FGF basique et 1% de solution d'antibiotiques. La chambre est ensuite mise dans une étuve à 37°C et à 5 % de C02. Les cellules sont maintenues en culture jusqu'à confluence et fusion.

Elles vont alors former des myotubes (structure polynucléées). A ce stade les chambres de culture sont retournées (les cellules musculaires se trouvent dans le compartiment du bas) et le milieu de culture est remplacé par 1/3 de

M199, 2/3 de MEM et 10% de sérum de veau fœtal complémenté avec 10μg/ml d'insuline et 1% de solution d'antibiotiques.

D - Ensemencement des explants de moelle épinière

Les moelles épinières d'embryon de rats wistar de 13 jours ont été obtenues à partir de rats femelle wistar. Les moelles épinières avec les ganglions rachidiens sont disséquées et découpées transversalement en 10 explants par moelle épinière. Les tranches de moelle épinière avec des ganglions rachidiens dorsaux ont été déposées sur le collagene du compartiment de culture opposé aux cellules musculaires à raison de 3 explants par chambre. Les chambres de culture sont déposées dans une étuve à 37 °C et contenant 5 % de C02. Ce milieu est renouvelé tous les 3 jours.

E - Analyses des coculture nerf-muscle en chambre de culture

Les contractions des fibres musculaires prouvent que les prolongements des neurones traversent la matrice de collagene et innervent les cellules musculaires.

Les premières contractions des fibres musculaires sont observées après 5 à 6 jours de coculture et après trois semaines, toutes les fibres musculaires innervées par les neurones moteurs issus des explants se contractent. A ce stade, les fibres musculaires sont striées et possèdent des jonctions neuromusculaires différenciées Les cellules musculaires innervées peuvent survivre et se contracter jusqu'à 15 mois.

Claims

REVENDICATIONS

1. Tissu biologique reconstitué, comprenant une population de cellules nerveuses et une population de cellules cibles, lesdites populations étant séparées par un support biologique formant une barrière physique, ledit support comprenant une membrane biocompatible traitée par une matrice biologique ou une membrane d'origine biologique.

2. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 1 , dans lequel la barrière physique empêche tout contact physique entre les corps cellulaires d'une population et les corps cellulaires de l'autre population, mais permet le passage des prolongements nerveux.

3. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les cellules cibles sont innervées par les prolongements nerveux des cellules nerveuses.

4. Tissu biologique reconstitué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la membrane synthétique est composée de tout matériau biocompatible, solide, rigide ou semi-rigide, plan ou non, éventuellement biodégradable, assurant une séparation physique des populations cellulaires.

5. Tissu biologique reconstitué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la membrane biocompatible est en nylon, en soie, en fibres, en métal, en polymère, en polycarbonate ou en tout autre matériel poreux compatible avec la culture de cellules.

6. Tissu biologique reconstitué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice biologique contient du collagene.

7. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 6, caractérisé en ce que le collagene est un collagene de type I ou tout autre type de collagene sur lequel des cellules cibles ou un organe cible et des neurones se développent.

8. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que la matrice biologique comprend en outre différentes molécules de la matrice extra-cellulaire et/ou une lame basale reconstituée et/ou des cellules exerçant un rôle trophique sur les cellules cibles ou l'organe cible et/ou les neurones et/ou des cellules exerçant un rôle trophique sur les prolongements nerveux.

9. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 8, caractérisé en ce que les molécules de la matrice extra-cellulaire sont de la laminine et/ou de la fibronectine et/ou de la ténacine et/ou tout autre type de molécules permettant une bonne adhésion et/ou survie des cellules cibles ou de l'organe cible et des neurones au sein du tissu.

10. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 8, caractérisé en ce que la lame basale reconstituée comprend toute substance issue de la tumeur EHS et/ou tout produit issu de cette tumeur.

11. Tissu biologique reconstitué selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que les cellules exerçant un rôle trophique sur les cellules cibles ou l'organe cible et/ou les neurones sont des cellules fibroblastiques et/ou des cellules astrocytaires.

12. Tissu biologique reconstitué selon l'une des revendications 8 à 11 , caractérisé en ce que les cellules exerçant un rôle trophique sur les prolongements nerveux sont des cellules de Schwann et/ou des oligodendrocytes.

13. Tissu biologique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la membrane d'origine biologique est une matrice biologique, un explant ou un partie d'un explant de tissu humain ou animal ou un tissu reconstruit.

14. Tissu biologique selon l'une des revendications 1 à 3 et 13, caractérisé en ce que la membrane d'origine biologique constitue le support biologique.

15. Tissu biologique selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la membrane d'origine biologique est un épithélium ou une muqueuse.

16. Tissu biologique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une colle biologique maintenant le support biologique.

17. Tissu biologique reconstitué selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules cibles sont des cellules que les neurones peuvent innerver.

18. Tissu biologique reconstitué selon la revendication 17, caractérisé en ce que les cellules cibles sont des cellules humaines ou animales, progénitrices ou différenciées, des mélanocytes, des cellules musculaires lisses ou striées, des adipocytes, des cellules nerveuses.

19. Tissu biologique reconstitué selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules cibles sont présentes sous forme d'organe cible.

20. Tissu biologique reconstitué selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les neurones sont des cellules du système nerveux central ou du système nerveux périphérique ou du système nerveux sympathique.

21. Chambre pour la culture d'un tissu biologique reconstitué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comporte 2 compartiments séparés entre eux par un support biologique, ledit support comprenant une membrane biocompatible imprégnée d'une matrice biologique ou une membrane d'origine biologique.

22. Chambre de culture selon la revendication 21 , caractérisée en ce que le diamètre ou la largeur intérieur des compartiments est de 5 à 20 mm, et préférentiellement de 6 à 12 mm, leur diamètre ou largeur extérieur de 8 à 22 mm et préférentiellement de 9 à 16 mm, et leur hauteur est inférieure à 20 mm, de préférence inférieure ou égale à 15 mm.

23. Chambre de culture selon la revendication 22, caractérisée en ce que la hauteur des compartiments est inférieure ou égale à 10 mm et idéalement de 4 mm chacun, lorsque le support comprend une membrane biocompatible imprégnée d'une matrice biologique.

24. Chambre de culture selon la revendication 21 ou 22, caractérisée en ce que les 2 compartiments sont formés à partir de 2 tubes à sections de largeurs ou diamètres différents, ces tubes ayant coulissé l'un dans l'autre, le tube intérieur étant de hauteur égale ou de préférence inférieure au tube extérieur, idéalement la hauteur du tube intérieur est de 6mm et la hauteur du tube extérieur est de 13mm.

25. Chambre de culture selon la revendication 21 à 24, caractérisée en ce que les compartiments sont en polystyrène, en polyméthacrylate ou en toute autre matière compatible avec la culture cellulaire, notamment en plastique ou verre.

26. Procédé de préparation d'une chambre de culture selon l'une des revendications 21 à 25, comprenant les étapes suivantes : d) stériliser la chambre de culture ou les structures la composant, e) un matériel d'origine biologique est posé, éventuellement en présence d'une colle biologique, sur une des extrémités du tube à section de largeur ou diamètre la plus petite, f) le matériel posé est ensuite coincé en faisant coulisser le tube à section de diamètre ou de largeur plus grande sur le tube à section de largeur ou diamètre la plus petite, formant ainsi le support séparant les 2 compartiments.

27. Procédé de préparation d'une chambre de culture selon la revendication 21 ou 22, lorsque le support biologique comprend une membrane biocompatible, comprenant les étapes suivantes : a) stériliser la chambre de culture, b) mélanger, à 0°C, une solution de collagene de type I dans de l'acide acétique avec une solution physiologique concentrée et avec une solution de soude dans des proportions permettant d'obtenir une matrice de collagene ayant un pH et une concentration osmotique physiologique, c) éventuellement, mélanger à 0°C la solution obtenue à l'étape b), avant qu'elle ne gélifie, avec de l'extrait de tumeur EHS de souris dans des proportions de 1/2 à 1/5, d) éventuellement, mélanger à 0°C la solution obtenue à l'étape b), avant qu'elle ne gélifie, avec de l'extrait de tumeur EHS de souris dans des proportions de 1/2 à 1/5couler la solution obtenue en b) ou c) dans la chambre de culture stérilisée sur la membrane biocompatible, et, gélifier le mélange à 37°C pendant 1 heure, e) éventuellement, couler une deuxième couche du mélange obtenu en b) ou c) sur la première couche de collagene gélifié obtenu en d) lorsque cette dernière est polymérisée. f) éventuellement, couler une deuxième couche du mélange obtenu en b) ou c) dans le compartiment opposé à la première couche de collagene gélifié.

28. Procédé de préparation d'une chambre de culture selon l'une quelconque des revendications 21 à 22, comprenant les étapes suivantes : a) stériliser la chambre de culture, b) préparer la matrice par polymérisation du collagene à la concentration désirée, dans une solution contenant 8/10 de collagene dans de l'acide acétique 0,1%, 1/10 de milieu DMEM 10 fois concentré et 1/10 de

NaOH 0,1N, c) éventuellement, additionner le collagene obtenu à l'étape b) avec 1/2 à 1/5 de lame basale reconstituée, d) couler entre 10 et 200 μl de la solution obtenue en c) sur la membrane biocompatible de la chambre de culture stérilisée de 0,6 à 1 ,2 cm², et, éventuellement e) couler une deuxième couche de la solution obtenue en c) sur la première couche obtenue en d) lorsque cette dernière est polymérisée. f) couler une deuxième couche de la solution obtenue en b) ou c) dans le compartiment opposé à la première couche.

29. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture définie selon l'une des revendications 21 à 25, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer le premier type cellulaire du tissu à reconstituer dans le premier compartiment de la chambre de culture, b) après un délai nécessaire pour permettre l'adhésion de cellules à la membrane et, le cas échéant, l'organisation cellulaire caractéristique du tissu, ensemencer le deuxième type cellulaire dans le deuxième compartiment de cette chambre, et c) maintenir les cellules en culture pendant un délai suffisant pour permettre l'organisation cellulaire caractéristique du tissu et l'innervation de cellules cibles par les cellules nerveuses, de préférence de 5 à 30 jours.

30. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué selon la revendication 29, dans lequel le premier type cellulaire ensemencé correspond à la population de cellules cibles.

31. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture selon la revendication 29, dans lequel les deux types cellulaires sont ensemencés à une densité cellulaire fonction du type cellulaire et adaptée à la surface des compartiments, de préférence comprise entre 50000 et 500000 cellules par cm².

32. Procédé de préparation d'un epiderme reconstitué dans une chambre de culture définie selon l'une des revendications 21 à 25, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer une population de cellules comprenant des kératinocytes à la densité cellulaire adaptée à la surface de la chambre de culture, dans le premier compartiment de celle-ci, b) placer les cellules dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10% de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, pendant 24 heures environ, c) retourner la chambre et ensemencer les neurones sensitifs à la densité cellulaire adaptée à la surface de cette chambre, dans le deuxième compartiment de celle-ci, d) placer la chambre dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10% de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, e) au deuxième jour de culture des kératinocytes environ, retourner la chambre une deuxième fois et éliminer le milieu de culture côté kératinocytes, et f) maintenir les cellules en culture pendant 13 à 17 jours environ, à l'interface air-liquide, dans une étuve à 37°C environ, 2 à 10% de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau.

33. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture, selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les kératinocytes sont ensemencés à une densité de 200000 à 600000 cellules par cm² et en ce que les neurones sont ensemencés à une densité comprise entre 50000 et 300000 cellules par cm².

34. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture selon l'une des revendications 21 à 25, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer les cellules du tissu à reconstituer et leur milieu de culture à la densité cellulaire adaptée à la surface de la chambre de culture dans le premier compartiment de celle-ci, b) placer les cellules dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10 % de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, jusqu'à confluence et fusion des cellules, c) retourner la chambre et ensemencer les neurones à la densité cellulaire adaptée à la surface de cette chambre, dans le deuxième compartiment de celle-ci, d) placer la chambre dans une étuve à 37°C environ contenant 2 à 10 % de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, pendant 24 heures environ, e) immerger de milieu de culture le compartiment correspondant aux neurones, f) maintenir les cellules en culture, dans une étuve à 37°C environ, contenant 2 à 10 % de C0₂ dans une atmosphère saturée en eau, pendant environ 3 semaines en renouvelant le milieu environ tous les 3 jours.

35. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture, selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les cellules du tissu à reconstituer sont des cellules satellites musculaires de mammifères et en ce que le tissu à reconstituer est un tissu musculaire.

36 Procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture, selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la densité cellulaire des cellules satellites musculaires est de 30000 à 150000 par cm² et en ce que celle des neurones sensitifs correspond à 1 à 5 explants de moelle épinière.

37. Procédé de préparation d'un tissu reconstitué selon l'une des revendications 26 à 36, caractérisé en ce que l'activité électrique des neurones est stimulée par l'adjonction de KCI au milieu de culture ou de toute autre molécule modifiant l'activité électrique, après le cinquième jour de maintien des cellules en culture et d'une manière préférée après trois semaines de culture dans le cas d'un modèle nerf-muscle ou après le dixième jour ou de manière préférée après le douzième jour dans le cas d'un modèle épiderme-neurones sensitifs.

38. Procédé d'étude de l'effet d'un composé test sur un tissu reconstitué selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par la mise en contact des cellules cibles du tissu avec le composé test et le dosage, par des techniques ELISA, de la libération de neuropeptides, par exemple le CGRP et/ou la substance P et/ou de neurotransmetteurs et/ou de cytokines et/ou de facteurs de croissance, dans le surnageant de culture de l'un ou l'autre des compartiments de la chambre de culture.

39. Procédé d'étude de l'effet d'un composé test sur un tissu reconstitué selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par la mise en contact des cellules cibles du tissu avec le composé test et le marquage des neurones en immunofluorescence ou en immunocytochimie avec des anticorps marquant les neurones et/ou les prolongements neuritiques et/ou des sécrétions.

40. Procédé d'étude des tissus reconstitués selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le marquage en immunofluorescence ou en immunocytochimie des cellules à l'aide d'anticorps spécifiques desdites cellules.

41. Procédé d'étude des tissus reconstitués selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le marquage en immunofluorescence ou en immunocytochimie de la matrice de collagene avec des anticorps spécifiques du collagene ou des autres constituants de la matrice biologique.

42. Procédé d'étude des tissus reconstitués selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par l'analyse des contacts cellulaires entre les neurones et les cellules cibles en microscopie confocale ou électronique.

43. Procédé d'étude des tissus reconstitués selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le traitement desdits tissus par un ou plusieurs composés test de façon à caractériser les réactions cellulaires à l'égard de ce ou ces composés test ainsi qu'à l'égard du ou des autres types cellulaires.

44. Procédé d'étude des tissus reconstitués selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le traitement desdits tissus par un ou plusieurs composés test de façon à permettre l'analyse des transcrits des différents types cellulaires.

45. Procédé d'étude des tissus reconstitués selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé par le traitement desdits tissus par un ou plusieurs composés test de façon à permettre l'analyse de l'activité électrique, l'étude des canaux ioniques impliqués dans les échanges et/ou celle des récepteurs, par des techniques électrophysiologiques ou par des techniques de patch-clamp.

46. Kit, caractérisé en ce qu'il contient plusieurs chambres de culture selon l'une des revendications 21 à 25 et une ou plusieurs boîtes, tubes ou plaques dont les puits ont une dimension suffisante pour accueillir les chambres de culture.