WO2002061438A1 - Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique. - Google Patents

Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique. Download PDF

Info

Publication number
WO2002061438A1
WO2002061438A1 PCT/FR2002/000309 FR0200309W WO02061438A1 WO 2002061438 A1 WO2002061438 A1 WO 2002061438A1 FR 0200309 W FR0200309 W FR 0200309W WO 02061438 A1 WO02061438 A1 WO 02061438A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substances
analyzed
reagents
film
protocol
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/000309
Other languages
English (en)
Inventor
Yves Fouillet
Raymond Charles
Nicolas Sarrut
Patricia Claustre
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Priority to EP02700414A priority Critical patent/EP1356303B1/fr
Priority to DE60201257T priority patent/DE60201257T2/de
Priority to AT02700414T priority patent/ATE276519T1/de
Priority to US10/466,106 priority patent/US7404930B2/en
Priority to JP2002561953A priority patent/JP4307074B2/ja
Publication of WO2002061438A1 publication Critical patent/WO2002061438A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00009—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with a sample supporting tape, e.g. with absorbent zones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
    • G01N2035/1037—Using surface tension, e.g. pins or wires
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/110833—Utilizing a moving indicator strip or tape
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/11—Automated chemical analysis
    • Y10T436/113332—Automated chemical analysis with conveyance of sample along a test line in a container or rack
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the invention relates to a method and a system for carrying out a biological, chemical or biochemical protocol in continuous flow. It makes it possible to carry out a complete analysis protocol on a large number of samples.
  • the system can be used for the synthesis of fine chemicals, i.e. those manufactured in small volumes and / or with very high quality, where series of steps involving treatment of reagents and / or injection of reagents are required.
  • the system can also be used for drug testing, for example when a drug is linked to a target protein, or for biological analyzes such as the detection of a protein-protein interaction or the detection of a protein component in a complex biological sample.
  • a first family is made up of systems where liquids are deposited in wells.
  • a second family consists of micro-systems where the fluids are transported in microchannels.
  • ⁇ TAS terms for "Total Analysis System” or ⁇ FIA for "Flow Injection Analysis”.
  • the biological sample is placed in a reservoir made in a plate and having the shape of a well which is brought successively to the temperatures desired to carry out the heat treatments necessary for the biological reactions.
  • Commercial devices such as those produced by the company M.J. Research or by the company Perkin Elmer generally use a thermostatization system by Peltier effect. This method is simple to implement and the components are standardized in the case of titration plates comprising 384 wells distributed in a matrix of 16 rows and 24 columns.
  • the channels can be obtained by etching in silicon, glass or polymeric substrates.
  • the reaction liquids circulate through temperature-controlled areas.
  • US Patent No. 5,736,106 discloses a device for carrying out a heat treatment protocol on a substance.
  • the device comprises a heat conducting plate having cavities serving as reaction chambers and containing a substance to be analyzed.
  • the reaction chambers are closed with a transparent sheet.
  • a conveyor belt mechanism makes it possible to bring the cavity plate to successive fixed positions in order to bring the contents of the cavities to determined temperatures.
  • the invention makes it possible to combine the advantages presented by state-of-the-art techniques while minimizing the disadvantages. It makes it possible to work in continuous flow of analysis on the same machine in order to increase the profitability of laboratories. It makes it possible to carry out all the steps of a biological protocol on the same machine by integrating the injection of reagents or samples, the mixing of reagents, the detection of analytes, optical or thermal treatments or by implementing functions such as temperature cycling, reagent mixtures and possibly detection. It does not require the development of complex liquid pumping systems in microchannels.
  • the invention uses an analysis support which moves continuously or at a small step. • Unlike the US Patent 'No. 5,736,106, cited above, the steps of the protocol can be simultaneously on a large number of samples, which allows for continuous biological protocols.
  • a first object of the invention consists of a system making it possible to carry out a continuous biological, chemical or biochemical protocol on substances to be analyzed, the system comprising:
  • a mobile analysis support comprising means for receiving the substances to be analyzed and reagents, the reception means being arranged so as to constitute a matrix of rows and columns,
  • the mobile analysis support is provided with means making it possible to avoid evaporation of the substances to be analyzed and of the reagents, - the means making it possible to avoid
  • the means allowing the implementation of the protocol steps can also include means for injecting a reagent or a sample, means for optical treatment (for example an ultraviolet treatment) of a reagent or a sample, means for application of a magnetic field, suction means for removing all or part of a reaction volume, detection means, for example for detecting a parameter of a constituent of a sample or of any detectable marker, and means for heat treatment of a sample.
  • means for injecting a reagent or a sample can also include means for injecting a reagent or a sample, means for optical treatment (for example an ultraviolet treatment) of a reagent or a sample, means for application of a magnetic field, suction means for removing all or part of a reaction volume, detection means, for example for detecting a parameter of a constituent of a sample or of any detectable marker, and means for heat treatment of a sample.
  • the energy supply means can be heating means making it possible to bring the reception means to a determined temperature.
  • These heating means may include at least one thermal rod brought to said determined temperature.
  • the thermal rod can be brought to said temperature determined by the circulation of a heat transfer fluid and / or by Joule effect and / or by Peltier effect and / or by light radiation.
  • the system may further comprise means for bringing the mobile analysis support closer to the thermal rod.
  • the means making it possible to supply the substances to be analyzed and the reagents, and the means making it possible to implement the protocol are arranged so as to successively obtain:
  • the detection means can be means providing an analysis of the substances directly on the mobile analysis support or means providing an analysis of the substances after their transfer from the mobile analysis support.
  • the mobile analysis support is constituted by a plate, the receiving means being constituted by studs arranged on one face of the plate and allowing the attachment of the substances to be analyzed.
  • the mobile analysis support is a film.
  • the reception means can result from capillary forces between a surface of the film and the substances to be analyzed.
  • the film can be movable between an unwinding roller and a winding roller. If the film is a uniform film, the surface of the film may be a hydrophilic surface.
  • the film may be a structured film, the structuring of the film making it possible to determine the location of the reception means.
  • the surface of the film can be hydrophobic and support hydrophilic pads constituting said receiving means.
  • the film may have an anisotropic thermal conductivity, the thermal conductivity depending on the thickness of the film being greater than the thermal conductivity in the plane of the film.
  • a second subject of the invention consists of a process for producing, in continuous flow, a biological, chemical or biochemical protocol on substances to be analyzed, the process being characterized in that it comprises:
  • a mobile analysis support comprising means for receiving the substances to be analyzed and reagents, the reception means being arranged so as to constitute a matrix of rows and columns, the mobile analysis support being provided with means making it possible to avoid evaporation of the substances to be analyzed and of the reagents chosen from: • a liquid medium immiscible with the substances to be analyzed, the reagents and the reaction products between the substance to be analyzed and the reagents,
  • a film of liquid immiscible with the substances to be analyzed and the reagents covering the receiving means and capable of being crossed by the substances to be analyzed and the reagents,
  • the substances to be analyzed and the reagents are supplied successively to the means for receiving the support during its travel.
  • the method may further comprise an analysis, by means of detection, of the substances having undergone the protocol.
  • the energy supply step can be a thermal energy supply step. According to a particular mode of implementation, the process takes place so as to obtain successively:
  • the analysis of the substances having undergone the protocol can be carried out directly on the mobile analysis support or after their transfer from the mobile analysis support.
  • FIG. 1 is a top view of a system enabling a biological, chemical or biochemical protocol according to the invention to be carried out in continuous flow,
  • FIG. 2 shows, in perspective, a mobile analysis support according to the invention during operation of the system
  • - Figure 3 shows, in longitudinal section and partially, the system according to the invention where three thermal rods are visible making it possible to carry out steps of a biological, chemical or biochemical protocol
  • FIG. 4 illustrates a PCR cycle carried out on a mobile analysis support, in accordance with the invention.
  • the system can also be advantageously used for any application involving a protocol comprising steps in series.
  • the means allowing the implementation of a protocol can include, for example, means for injecting a reagent or a sample, means for optical treatment (for example ultraviolet treatment) of a reagent or a sample, detection means for example for detecting a parameter of a constituent of a sample or of any detectable marker and means for heat treatment of a sample.
  • any synthesis requiring the serial injection of reagents can in particular be advantageously implemented according to the method and thanks to the system of the invention.
  • the applications of the invention include the synthesis of chemicals, in particular fine chemicals, that is to say those manufactured in small volumes and / or with very high quality.
  • a microfluidic substrate or a device according to the invention, implementing more than one protocol can be designed, for example for the synthesis of fine chemicals in combination with online screening (for example drug screening ).
  • one or more reagents are disposed on the surface of the support as required, in the form of a liquid droplet.
  • Other reagents can be added by injection elements positioned along the device, these injection elements injecting the required amount of reagents.
  • the characteristics of the device comprising inter alia the material of the analysis support, are chosen so as to be compatible with the characteristics of the reactions envisaged, for example the reaction temperatures and the solvents (for example: water, organic solvents) used. work in synthesis.
  • the system according to the invention can be used for drug screening in which a protein or a cell composition is supplied to the support in the form of a droplet, a test compound is injected by an element injection positioned along the system and, optionally, a detection or analysis step is carried out on the sample, preferably by detection means located on the system.
  • the system can be used for a detection protocol in which a sample is supplied to the analysis support in the form of droplets and an element for carrying out a detection step is positioned in the system.
  • laser nephelometry can be used to detect antigen-antibody complexes for high throughput screening to determine the water solubility of a drug. We can refer to this subject in the CD article.
  • the means allowing the implementation of the protocol are means for carrying out ultra-violet treatments.
  • ultraviolet light is known to induce crosslinking between complementary strands of DNA and between DNA and proteins.
  • a sample is supplied to the analysis medium in the form of a droplet and an ultraviolet treatment element placed in the system is used to treat the sample, as for a gene modification targeted on the triple helix (see article of FX BARRE et al., published in Proc. Natl. Acad. Sci.
  • means of implementing a protocol comprise an area in which a magnetic field is exerted, as for the separation of constituents of a sample by association with magnetic beads (by example purification by calibration for sequencing applications using paramagnetic particles, G.
  • the means for implementing a protocol include extraction means capable of extracting a determined volume of sample or of a fraction of sample.
  • the means for implementing a protocol include thermal elements for bringing a sample to a determined temperature, for example example for carrying out a PCR reaction as will be described later.
  • Figure 1 shows a first mobile analysis support 11 arranged in the system according to the invention.
  • the support 11 is a film supporting a drop matrix 12 constituting the various reaction media where the chemical reactions will be carried out when reagents are added.
  • the analysis support is linked to a mechanism for setting in motion, in the direction of the arrow, in order to allow the scrolling of each column of drops opposite the various elements necessary for carrying out the protocol.
  • Some protocols such as PCR require temperature cycling, typically around twenty cycles at 94 ° C (denaturation) - 55 ° C (hybridization) 72 ° C (elongation) with stop times of a few tens of seconds.
  • temperature control elements such as those referenced 14 and 15 in Figures 1, also called thermal rods and operating for example by Peltier effect or by circulation of a heat transfer fluid.
  • the heat transfer fluid can circulate through a circular channel passing through the thermal rods, or through a system of fins making it possible to optimize the heat exchanges between the heat transfer fluid and the rod.
  • Each of the thermal bars is connected to a thermostated bath with a pumping system to circulate the heat transfer fluid. It is possible to integrate temperature measurement elements into the bars to control the temperature of the thermostatically controlled bath. It is also possible to integrate additional heating elements into the thermostatically controlled bars.
  • the heating element is for example an electrical resistance working as a hot source and the heat transfer fluid as a cold source. Heating can also be obtained by light radiation.
  • a system for pressing the analysis support on the heating rod This is obtained for example, by a suction system at the level of the heating rod or by a flange system, the analysis support being sandwiched between the flange and the heating rod.
  • the carpet or film is, before use, placed in an enclosure filled with a liquid immiscible with the products which will be introduced therein.
  • These different products can be brought in by small capillaries arranged so as to successively introduce the products to be injected when the analysis support is running.
  • the capillaries are, for example, fibers of fused silica commonly used in microfluidic devices.
  • the control of the formation of a drop at the outlet of the fiber is for example ensured by a pressure generator or by a syringe pump.
  • the mobile analysis support is a film 30 or a conveyor belt.
  • the substances to be analyzed and the reaction products correspond to drops deposited on the moving film 30.
  • injection capillaries 36 and temperature control elements 34 and 35 housed in a plate 31.
  • the attachment of the drops is ensured by the capillary forces existing between the drops and the film 30.
  • a system for translating the film allows the drops to be transported along the various elements allowing the protocol to unfold.
  • the film 30 is set in motion by a winding system in a manner analogous to a video cassette, the film flowing from a unwinding roller 37 to a winding roller 38.
  • the film 30 drop-down is covered with an oil film 32 or a liquid immiscible with the substances to be analyzed and the reagents, in order to avoid their evaporation.
  • the liquid immiscible with the substances to be analyzed and the reagents can be oil (mineral, silicone) or an organic solvent immiscible with water such as octane.
  • the exemplary embodiment illustrated in FIG. 2 can of course include several series of heating zones to ensure the desired cycles, for example a PCR cycle.
  • the film can be either uniform or structured. In the case of a uniform film, it is advantageous for this film to be slightly hydrophilic so that the deposited drop does not roll to ensure the attachment of the drop to the film. It is possible to use a film made of organic material (a plastic or a polyimide such as Kapton ® ) or a metallic wire (for example aluminum or gold).
  • a structured film is to be able to act on a self-positioning of the drops. This is for example achieved by a hydrophobic film having hydrophilic pads. The drops are then positioned by capillarity on the hydrophilic pads. It is also possible to obtain the same result by structuring the film with cuvettes.
  • the consumable part of the system is then reduced to a film which has the advantage of being simpler and less costly to produce than well or channel structures.
  • FIG. 3 highlights elements of temperature control.
  • a frame 51 supports a plate 52 on which a mobile analysis support 50 travels.
  • Reaction volumes 53 in the form of drops, are regularly arranged on the analysis support 50.
  • FIG. 3 shows three control elements of temperature 54, 55 and 56. These elements are thermal rods housed in an insulating material 57, their upper face flush with the insulating material. Other heating means can be used, for example those based on the Joule effect, the Peltier effect, the effect of light radiation.
  • the thermal rods 54, 55 and 56 have a hole for the passage of a heat transfer fluid, such as the hole 58.
  • the thermal bar 55 shows an electrical resistance 61 making it possible to increase the temperature of this bar.
  • the thermal bar 56 shows an element 62 for measuring the temperature of the upper face of this bar.
  • FIG. 4 schematically represents a mobile analysis support 70 subjected to a PCR protocol of 20 cycles. Each cycle includes the submission of a substance to the three successive temperatures 94 ° C, 55 ° C and 72 ° C supplied by twenty groups of thermal bars 74, 75 and 76.
  • the invention makes it possible to carry out this protocol for a large number of samples (for example 384) combined with a large number of different reagents
  • the invention makes it possible to obtain these 100 x 384 analyzes in a shorter time than machines using traditional well plates while having a simpler embodiment than "lab on a chip" systems. Indeed, with standard machines working with 384-well plates, the implementation time of the protocol is 100 x (ti + t 2 ). This time, which is incompressible, is generally too long. It should also be noted that it is necessary to design robots for handling the 100 well plates and a management and distribution system for 100 x 384 samples and 3 x 100 x 384 reagent distributions.
  • this finding poses a problem because the need to increase the length of the channels is contrary to the miniaturization of the micro-fluidic chip and calls into question the use of microtechnologies for the production of the component.
  • the control of displacements on 384 parallel tracks with 100 different reactions poses a big design problem and, in particular, it is necessary to perfectly master the problems of the mechanics of fluids in small channels.
  • the invention allows to keep the advantage of the continuous flow of reactions concerning the speed of execution of the 100 x 384 reactions without having the disadvantage of controlling the movement of liquids in micro-channels.
  • the invention makes it possible to carry out biological reactions in continuous flow, by moving the mobile support on which the reaction volumes are immobilized.
  • the displacement of the reaction volumes is therefore directly controlled by the displacement of the mobile support, which is much simpler to produce than a pumping system in microchannels.
  • the speed of movement of the analysis support, and consequently of the samples analyzed is independent of the volumes of the samples or of the volumes injected.
  • the mobile analysis support is a film of
  • Kapton 200 HN available from Dupont, 50 ⁇ m thick.
  • the immiscible liquid used is light type mineral oil available from Sigma.
  • a PCR solution of 100 ⁇ l can comprise the following constituents:
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP 2 mM
  • primers - 2 times 4 ⁇ l of primers ("primers"), - 10 ⁇ l of BSA 20 mg / ml,
  • the drops with a volume of 0.5 ⁇ l, 1 ⁇ l and 2 ⁇ l, then undergo about thirty thermal cycles at successive temperatures of 94, 55 and 72 ° C in accordance with the invention.
  • the results are analyzed by electrophoresis on agarose gel. The results obtained are compared with the results provided by a control resulting from a PCR amplification of a volume of 2 ⁇ l of the same preparation but amplified on a device of the standard well plate type.
  • a variant of the previous protocol consists in depositing a first drop of 0.5 ⁇ l containing DNA and then a second drop deposit of
  • 0.5 ⁇ l containing the primers (or primers).
  • the operations can also be parallelized by making a column of N drops containing different DNAs. N lines of drop of 0.5 ⁇ l are thus formed, then, sequentially, drops of 0.5 ⁇ l of reagents containing the primers are deposited. For each column the primers are different. It is thus possible to carry out continuous amplifications by PCR on N different DNAs and for a multitude of different primers. The various tests carried out on the invention made it possible to bring the following conclusions.
  • the thermal cycles are applied to the drops with sufficient precision for a PCR protocol.
  • the presence of the oil and the film does not disturb the heat exchanges between the reactants and the various thermal bars.
  • the system consisting of the film of Kapton ® and mineral oil with the described configuration is biocompatible for PCR.
  • a gas bubble may appear after a few thermal cycles. However, this does not affect the result. It is therefore not necessary to perform degassing operations for the various liquids before performing the PCR cycles.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

L'invention concerne la réalisation, en flux continu, d'un protocole biologique, chimique ou biochimique sur des substances à analyser, le protocole comportant la mise en oeuvre de plusieurs étapes. Il est procédé à:- la mise en défilement d'un support d'analyse mobile (11) comprenant des moyens de réception (12) des substances à analyser et de réactifs,- la mise en oeuvre des étapes du protocole sur les substances à analyser pendant le défilement du support d'analyse mobile (11).

Description

PROCEDE ET SYSTEME PERMETTANT DE REALISER EN FLUX CONTINU UN PROTOCOLE BIOLOGIQUE, CHIMIQUE OU
BIOCHIMIQUE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention concerne un procédé et un système permettant de réaliser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique. Elle permet de réaliser un protocole complet d'analyse sur un grand nombre d'échantillons.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
Pour des études biologiques, il est nécessaire de réaliser des réactions chimiques, biochimiques ou biologiques suivant un protocole bien déterminé. Ces réactions font très souvent intervenir des étapes de mélanges, des étapes de traitement thermique, des étapes d'incubation, des étapes de détections . Par exemple, le système peut être utilisé pour la synthèse de produits chimiques fins, c'est-à- dire ceux fabriqués en petits volumes et/ou avec une très haute qualité, où des séries d'étapes impliquant un traitement de réactifs et/ou l'injection de réactifs sont requises. Le système peut aussi être utilisé pour le dépistage de drogues, par exemple lorsqu'une drogue est liée à une protéine cible, ou pour les analyses biologiques comme la détection d'une interaction protéine-protéine ou la détection d'un composant protéine dans un échantillon biologique complexe. A titre d'exemple de réaction chimique ou biologique, dans le domaine de la génétique, on utilise très largement le procédé de réaction de polymérisation en chaîne ou PCR (de l'anglais "Polymérisation Chain Reaction") . Une étape de PCR nécessite le mélange d'un échantillon d'ADN avec des réactifs nécessaires à l'amplification. Il faut ensuite faire cycler en température les volumes de réactions entre des températures pouvant être comprises entre 50 °C et 9 °C. Pour rentabiliser les installations des laboratoires, il est nécessaire de concevoir des machines optimisant les points suivants :
- minimiser les volumes d'échantillons et de réactifs pour minimiser le coût de mise en œuvre des réactions,
- mettre en série plusieurs réactions dans un même système, l'idéal étant de réaliser tout un protocole biologique sur une même machine,
- mettre en parallèle un grand nombre d'analyses, ce qui permet d'accroître la capacité des laboratoires (en nombre d'analyses réalisées par jour et par machine) .
Il existe actuellement deux grandes familles de machines permettant de réaliser un protocole complet d'analyse chimique ou biologique d'un grand nombre d'échantillons. Une première famille est constituée par les systèmes où les liquides sont déposés dans des puits. Une deuxième famille est constituée par des micro-systèmes où les fluides sont véhiculés dans des microcanaux. On utilise aussi les termes μTAS pour "Total Analysis System" ou μFIA pour "Flow Injection Analysis".
Concernant la première famille de machine, l'échantillon biologique est placé dans un réservoir réalisé dans une plaque et ayant la forme d'un puits qui est porté successivement aux températures désirées pour effectuer les traitements thermiques nécessaires aux réactions biologiques. Les appareils commerciaux tels que ceux produits par la société M.J. Research ou par la société Perkin Elmer utilisent généralement ' un système de thermostatisation par effet Peltier. Cette méthode est simple à mettre en œuvre et les composants sont standardisés dans le cas de plaques de titration comportant 384 puits répartis selon une matrice de 16 lignes et 24 colonnes.
Chaque opération du protocole biologique
(remplissage, PCR, ajout d'un réactif.) se fait en général sur des machines différentes. Suivant le nombre d'analyses à réaliser, la gestion des échantillons, des réactifs et des plaques peut devenir très compliquée. Ce genre de machine ne permet pas de travailler en flux continu de réactions, les machines ne permettant généralement de ne traiter qu'une seule plaque à la fois . Concernant la deuxième famille de machines, qui est plus récente que la première famille, des microcanaux permettent de véhiculer les liquides nécessaires aux réactions. Les avantages de cette deuxième famille sont nombreux. On peut citer : - la miniaturisation des volumes des réactifs et des échantillons, - l'intégration de plusieurs réactions sur le même composant, ce qui permet à l'ensemble d'un protocole biologique d'être effectué sur une même biopuce et ce qui minimise ou facilite l'automatisation des opérations de manipulation,
- la réalisation de protocoles en parallèle sur plusieurs canaux.
Les canaux peuvent être obtenus par gravure dans des substrats en silicium, en verre ou un matériau polymère. Les liquides en réaction circulent en traversant des zones à température contrôlée. On peut se référer à ce sujet à l'article "Continuous Flow PCR on a Chip" de M.U. KOPP et al., Proceedings of the μTAS '98 Workshop, Banff, Canada, 13-16 octobre 1998, Ed. Kluwer Académie Publishers, pages 7 à 10.
Il existe aussi des systèmes où plusieurs échantillons circulent en même temps sur les mêmes canaux. On parle alors de flux continu de réactions. On peut se référer à ce sujet à l'article "Synthesis and Analysis of Chemical Components in Nanoscale" de
E. LITBORN et al., Proceedings of the μTAS '2000 symposium, pages 447 à 454, et à la demande internationale O-A-00/21 666.
Malheureusement, la mise au point de ces composants reste difficile, principalement en raison du problème du contrôle du transport des liquides dans les canaux. La mise en mouvement des liquides nécessite des méthodes de pompage intégré comme 1 ' électro-osmose ou des systèmes de distribution par pression ou par débits imposés qui restent difficiles à mettre au point et sont souvent d'un prix de fabrication très élevé. La fonction de pompage, pour véhiculer les liquides dans des canaux où sont effectuées les réactions du protocole, est cependant un point clef et incontournable de tous les composants dits "lab on a chip" .
Le brevet américain N° 5 736 106 divulgue un dispositif permettant de réaliser un protocole de traitement thermique sur une substance. Le dispositif comprend une plaque conductrice de la chaleur possédant des cavités servant de chambres de réaction et contenant une substance à analyser. Les chambres de réaction sont obturées par une feuille transparente. Un mécanisme de tapis roulants permet d'amener la plaque à cavités à des positions fixes successives pour porter le contenu des cavités à des températures déterminées .
EXPOSÉ DE L'INVENTION
L'invention permet de cumuler les avantages présentés par les techniques de l'état de l'art tout en minimisant les inconvénients. Elle permet de travailler en flux continu d'analyse sur une même machine afin d'augmenter la rentabilité des laboratoires. Elle permet de réaliser toutes les étapes d'un protocole biologique sur une même machine en intégrant l'injection de réactifs ou d'échantillons, le mélange de réactifs, la détection d'analytes, des traitements optiques ou thermiques ou en mettant en œuvre des fonctions telles que le cyclage en température, les mélanges de réactifs et éventuellement la détection. Elle ne nécessite pas la mise au point de systèmes complexes de pompage de liquide dans des microcanaux. L'invention met en œuvre un support d'analyse qui se déplace de manière continue ou à un petit pas. Contrairement au brevet américain • ' N° 5 736 106, cité plus haut, les étapes du protocole peuvent se faire simultanément sur un grand nombre d'échantillons, ce qui permet de réaliser en continu les protocoles biologiques.
Un premier objet de l'invention consiste en un système permettant de réaliser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique sur des substances à analyser, le système comprenant :
- un support d'analyse mobile comprenant des moyens de réception des substances à analyser et de réactifs, les moyens de réception étant disposés de façon à constituer une matrice de lignes et de colonnes,
- des moyens permettant la mise en œuvre du protocole, disposés de façon que les moyens de réception du support défilent devant eux lors de la mise en œuvre du protocole, caractérisé en ce que :
- le support d'analyse mobile est pourvu de moyens permettant d'éviter 1 ' évaporâtion des substances à analyser et des réactifs, - les moyens permettant d'éviter
1 ' évaporation des substances à analyser et des réactifs sont choisis parmi :
• un milieu liquide non miscible avec les substances à analyser, les réactifs et les produits de réaction entre substances à analyser et réactifs, • un film de liquide non miscible avec les substances à analyser et les réactifs, recouvrant les moyens de réception et apte à être traversé par les substances à analyser et les réactifs, - les moyens permettant la mise en œuvre du protocole comprennent des moyens successifs d'apport d'énergies différentes.
Il peut comprendre en outre des moyens permettant d'apporter successivement les substances à analyser et les réactifs jusqu'aux moyens de réception du support d'analyse mobile. Il peut aussi comprendre en outre des moyens de détection appliqués aux substances ayant subi le protocole pour fournir une analyse de ces substances. Les moyens permettant la mise en œuvre des étapes du protocole peuvent aussi comprendre des moyens pour injecter un réactif ou un échantillon, des moyens de traitement optique (par exemple un traitement ultraviolet) d'un réactif ou d'un échantillon, des moyens d'application d'un champ magnétique, des moyens d'aspiration pour enlever tout ou partie d'un volume de réaction, des moyens de détection, par exemple pour détecter un paramètre d'un constituant d'un échantillon ou de tout marqueur détectable, et des moyens de traitement thermique d'un échantillon.
Les moyens d'apport d'énergie peuvent être des moyens de chauffage permettant de porter les moyens de réception à une température déterminée. Ces moyens de chauffage peuvent comprendre au moins un barreau thermique porté à ladite température déterminée. Le barreau thermique peut être porté à ladite température déterminée par la circulation d'un fluide caloporteur et/ou par effet Joule et/ou par effet Peltier et/ou par un rayonnement lumineux. Le système peut comprendre en outre des moyens pour rapprocher le support d'analyse mobile du barreau thermique .
Selon un exemple de réalisation, les moyens permettant d'apporter les substances à analyser et les réactifs, et les moyens permettant la mise en œuvre du protocole sont agencés de façon à obtenir successivement :
- l'apport d'un premier composé chimique dans un volume de réaction jusqu'au moyen de réception,
- le déplacement du support d'analyse mobile vers un premier élément d'injection, - l'apport d'un deuxième composé chimique dans le volume de réaction par le premier élément d' injection,
- et optionnelle ent , le déplacement du support d'analyse mobile vers un deuxième élément d'injection pour apporter un troisième composé chimique au volume de réaction.
Les moyens de détection peuvent être des moyens fournissant une analyse des substances directement sur le support d'analyse mobile ou des moyens fournissant une analyse des substances après leur transfert du support d'analyse mobile.
Selon une variante de réalisation, le support d'analyse mobile est constitué par une plaque, les moyens de réception étant constitués par des plots disposés sur une face de la plaque et permettant l'accrochage des substances à analyser. Selon une autre variante de réalisation, le support d'analyse mobile est un film. Les moyens de réception peuvent résulter de forces de capillarité entre une surface du film et les substances à analyser. Le film peut être mobile entre un rouleau dérouleur et un rouleau enrouleur. Si le film est un film uniforme, la surface du film peut être une surface hydrophile. Le film peut être un film structuré, la structuration du film permettant de déterminer l'emplacement des moyens de réception. Par exemple, la surface du film peut être hydrophobe et supporter des plots hydrophiles constituant lesdits moyens de réception. Le film peut posséder une conductivité thermique anisotrope, la conductivité thermique selon l'épaisseur du film étant supérieure à la conductivité thermique dans le plan du film.
Un deuxième objet de l'invention consiste en un procédé de réalisation, en flux continu, d'un protocole biologique, chimique ou biochimique sur des substances à analyser, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en défilement d'un support d'analyse mobile comprenant des moyens de réception des substances à analyser et de réactifs, les moyens de réception étant disposés de façon à constituer une matrice de lignes et de colonnes, le support d'analyse mobile étant pourvu de moyens permettant d'éviter 1 ' évaporation des substances à analyser et des réactifs choisi parmi : • un milieu liquide non miscible avec les substances à analyser, les réactifs et les produits de réaction entre substance à analyser et réactifs,
• un film de liquide non miscible avec les substances à analyser et les réactifs, recouvrant les moyens de réception et apte à être traversé par les substances à analyser et les réactifs,
- la mise en œuvre du protocole sur les substances à analyser pendant le défilement du support d'analyse mobile grâce à des moyens successifs d'apport d'énergies différentes.
Avantageusement, les substances à analyser et les réactifs sont apportés successivement jusqu'aux moyens de réception du support pendant son défilement. Le procédé peut comprendre en outre une analyse, par des moyens de détection, des substances ayant subi le protocole.
L'étape d'apport d'énergie peut être une étape d'apport d'énergie thermique. Selon un mode de mise en œuvre particulier, le procédé se déroule de façon à obtenir successivement :
- l'apport d'un premier composé chimique dans un volume de réaction jusqu'au moyen de réception, - le déplacement du support d'analyse vers un premier élément d'injection,
- l'apport d'un deuxième composé chimique dans le volume de réaction par le premier élément d' inj ection, - et optionnellement , le déplacement du support d'analyse mobile vers un deuxième élément d'injection pour apporter un troisième composé chimique au volume de réaction.
L'analyse des substances ayant subi le protocole peut être effectuée directement sur le support d'analyse mobile ou après leur transfert du support d'analyse mobile.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels :
- la figure 1 est une vue de dessus d'un système permettant de réaliser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique selon 1 ' invention,
- la figure 2 montre, en perspective, un support d'analyse mobile selon l'invention lors du fonctionnement du système ; - la figure 3 montre, en coupe longitudinale et partiellement, le système selon l'invention où sont visibles trois barreaux thermiques permettant de réaliser des étapes d'un protocole biologique, chimique ou biochimique ; - la figure 4 illustre un cycle PCR réalisé sur un support d'analyse mobile, conformément à 1 ' invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION Comme indiqué ci-dessus, le système peut aussi être avantageusement utilisé pour toute application impliquant un protocole comprenant des étapes en série. Les moyens permettant la mise en œuvre d'un protocole peuvent comprendre par exemple des moyens d'injection d'un réactif ou d'un échantillon, des moyens de traitement optique (par exemple un traitement ultra-violet) d'un réactif ou d'un échantillon, des moyens de détection par exemple pour détecter un paramètre d'un constituant d'un échantillon ou de tout marqueur détectable et des moyens de traitement thermique d'un échantillon.
Toute synthèse requérant l'injection en série de réactifs peut en particulier être avantageusement mis en œuvre selon le procédé et grâce au système de l'invention. A titre d'exemples, les applications de l'invention comprennent la synthèse de produits chimiques, en particulier de produits chimiques fins, c'est-à-dire ceux fabriqués en petits volumes et/ou avec une très haute qualité. En outre, un substrat microfluidique ou un dispositif selon l'invention, mettant en œuvre plus d'un protocole, peut être conçu, par exemple pour la synthèse de produits chimiques fins en combinaison avec un dépistage en ligne (par exemple le dépistage de drogues) .
Dans une application de l'invention, un ou plusieurs réactifs sont disposés sur la surface du support comme il est requis, sous forme d'une gouttelette liquide. D'autres réactifs peuvent être ajoutés par des éléments d'injection positionnés le long du dispositif, ces éléments d'injection injectant la quantité requise de réactifs. Les caractéristiques du dispositif, comportant entre autres le matériau du support d'analyse, sont choisies de façon à être compatibles avec les caractéristiques des réactions envisagées, par exemple les températures des réactions et les solvants (par exemple : eau, solvants organiques) mis en œuvre dans la synthèse. Dans un autre mode de réalisation, le système selon l'invention peut être utilisé pour un dépistage de drogue dans lequel une protéine ou une composition de cellule est fournie au support sous forme d'une gouttelette, un composé de test est injecté par un élément d'injection positionné le long du système et, optionnellement , une étape de détection ou d'analyse est menée sur l'échantillon, de préférence par des moyens de détection situés sur le système. Dans un autre mode de réalisation, le système peut être utilisé pour un protocole de détection dans lequel un échantillon est fourni au support d'analyse sous forme de gouttelettes et un élément pour mener une étape de détection est positionné dans le système. Par exemple, la néphélométrie par laser peut être utilisée pour détecter des complexes antigène-anticorps pour le dépistage à débit élevé pour déterminer la solubilité dans l'eau d'une drogue. On peut se reporter à ce sujet à l'article de CD. BEVAN et al., paru dans Anal. Chem. , 15 avril 2000, 72(8), pages 1781 à 1787. Dans d'autres applications, les moyens permettant la mise en œuvre du protocole sont des moyens pour réaliser des traitements ultra-violets. Par exemple, la lumière ultra-violette est connue pour induire une réticulation entre des brins complémentaires d'ADN et entre ADN et protéines . Un échantillon est fourni au support d'analyse sous forme de gouttelette et un élément de traitement aux ultra-violets disposé dans le système est utilisé pour traiter l'échantillon, comme pour une modification de gène ciblée sur la triple hélice (voir l'article de F.X. BARRE et al., paru dans Proc . Natl . Acad. Sci. USA, 28 mars 2000, 97(7), pages 3084 à 3088), pour la réticulation de protéines à l'ADN de noyaux de cellules humaines (voir l'article de S. LEJNINE, paru dans Nucleic Acids Res . 15 septembre 1999, 27(18), pages 3676 à 3684), pour 1 ' inactivation d'éléments pathogènes (voir l'article de M. GHALI et al., paru dans J. Neurovirol, octobre 1998, 4(5), pages 521 à 530). Dans d'autres applications de l'invention, des moyens de mise en œuvre d'un protocole comprennent une zone dans laquelle s'exerce un champ magnétique, comme pour la séparation de constituants d'un échantillon par association avec des perles magnétiques (par exemple la purification par calibrage pour des applications de séquençage utilisant des particules paramagnétiques, G. FRY et al., Biotechniques, juillet 1992, 13(1), pages 124 à 131). Dans d'autres applications de l'invention, les moyens de mise en œuvre d'un protocole comprennent des moyens d'extraction aptes à extraire un volume déterminé d'échantillon ou d'une fraction d'échantillon. Dans d'autres applications, les moyens de mise en œuvre d'un protocole comprennent des éléments thermiques pour porter un échantillon à une température déterminée, par exemple pour réaliser une réaction PCR comme cela va être décrit par la suite.
La figure 1 montre un premier support d'analyse mobile 11 disposé dans le système selon l'invention. Le support 11 est un film supportant une matrice de gouttes 12 constituant les différents milieux réactionnels où vont se réaliser les réactions chimiques lorsque des réactifs sont ajoutés. Le support d'analyse est lié à un mécanisme de mise en mouvement, dans la direction de la flèche, afin de permettre le défilement de chaque colonne de gouttes en regard des différents éléments nécessaires à la réalisation du protocole .
Certains protocoles comme la PCR demandent un cyclage en température, typiquement une vingtaine de cycles à 94°C (dénaturation) - 55°C (hybridation) 72°C (élongation) avec des temps de palier de quelques dizaines de secondes. Ces variations de température sont imposées par des éléments de contrôle de la température tels ceux référencés 14 et 15 sur la figures 1, encore appelés barreaux thermiques et fonctionnant par exemple par effet Peltier ou par circulation d'un fluide caloporteur.
Le fluide caloporteur peut circuler à travers un canal circulaire traversant les barreaux thermiques, ou à travers un système d'ailettes permettant d'optimiser les échanges de chaleur entre le fluide caloporteur et le barreau. Chacun des barreaux thermiques est relié à un bain thermostaté avec un système de pompage pour faire circuler le fluide caloporteur. Il est possible d'intégrer des éléments de mesure de la température dans les barreaux pour asservir la température du bain thermostaté. Il est aussi possible d'intégrer des éléments chauffant complémentaires dans les barreaux thermostatés . L'élément chauffant est par exemple une résistance électrique travaillant comme une source chaude et le fluide caloporteur comme une source froide. Le chauffage peut être aussi obtenu par rayonnement lumineux.
Pour augmenter les échanges thermiques, il peut être avantageux d'ajouter un système pour presser le support d'analyse sur le barreau chauffant. Ceci est obtenu par exemple, par un système d'aspiration au niveau du barreau chauffant ou par un système de bride, le support d'analyse étant pris en sandwich entre la bride et le barreau chauffant.
Pour éviter 1 ' évaporation des substances à analyser et des réactifs, il est particulièrement avantageux que le tapis ou film soit, avant utilisation, disposé dans une enceinte remplie d'un liquide non miscible avec les produits qui y seront introduits. Ces différents produits peuvent être amenés par de petits capillaires disposés de manière à introduire successivement les produits à injecter lorsque le support d'analyse est en défilement. Les capillaires sont par exemple des fibres en silice fondue couramment utilisées dans les dispositifs micro- fluidiques . Le contrôle de la formation d'une goutte en sortie de fibre est par exemple assuré par un générateur de pression ou par un pousse-seringue. Dans le mode de réalisation représenté à la figure 2, le support d'analyse mobile est un film 30 ou un tapis roulant. Les substances à analyser et les produits de réaction correspondent à des gouttes déposées sur le film 30 en défilement. Sur la figure 2, on reconnaît des capillaires d'injections 36 et des éléments de contrôle de la température 34 et 35 logés dans une platine 31.
L'accrochage des gouttes est assuré par les forces de capillarité existant entre les gouttes et le film 30. Un système de mise en translation du film permet de véhiculer les gouttes le long des différents éléments permettant le déroulement du protocole
(dépôts, chauffages, détection). Dans l'exemple représenté à la figure 2, le film 30 est mis en mouvement par un système de bobinage de manière analogue à une cassette de magnétoscope, le film circulant d'un rouleau dérouleur 37 à un rouleau enrouleur 38. Le film 30 se déroulant est recouvert d'un film d'huile 32 ou d'un liquide non miscible avec les substances à analyser et les réactifs, afin d'éviter leur évaporation. Le liquide non miscible avec les substances à analyser et les réactifs peut être de l'huile (minérale, silicone) ou un solvant organique non miscible à l'eau tel que l'octane.
L'exemple de réalisation illustré par la figure 2 peut bien sûr comporter plusieurs séries de zones chauffantes pour assurer les cycles désirés, par exemple un cycle PCR. Le film peut être soit uniforme, soit structuré. Dans le cas d'un film uniforme, il est avantageux que ce film soit légèrement hydrophile afin que la goutte déposée ne roule pas pour assurer l'accrochage de la goutte sur le film. Il est possible d'utiliser un film en matériau organique (un plastique ou un polyimide tel que le Kapton®) ou un fil métallique (par exemple en aluminium ou en or) .
L'intérêt d'un film structuré est de pouvoir agir sur un auto-positionnement des gouttes. Ceci est par exemple réalisé par un film hydrophobe possédant des plots hydrophiles. Les gouttes se positionnent alors par capillarité sur les plots hydrophiles. Il est aussi possible d'obtenir le même résultat en structurant le film avec des cuvettes .
Pour optimiser les échanges thermiques et minimiser les flux thermiques entre les éléments de contrôle de la température, il est possible d'utiliser des films ayant une conductivité thermique anisotrope, c'est-à-dire isolant thermique dans le plan du film et conducteur thermique suivant son épaisseur.
La partie consommable du système se réduit alors à un film qui a l'avantage d'être plus simple et moins coûteux à réaliser que des structures à puits ou à canaux.
D'autre part, la visibilité des gouttes permet le contrôle en temps réel et la mesure des volumes réactionnels après chaque injection, ce qui peut être avantageux pour la mise au point d'un suivi de production en temps réel. La figure 3 met en évidence des éléments de contrôle de la température. Un bâti 51 supporte une platine 52 sur laquelle défile un support d'analyse mobile 50. Des volumes de réaction 53, sous la forme de gouttes, sont disposés régulièrement sur le support d'analyse 50. La figure 3 montre trois éléments de contrôle de la température 54, 55 et 56. Ces éléments sont des barreaux thermiques logés dans un matériau isolant 57, leur face supérieure affleurant du matériau isolant. D'autres moyens de chauffage peuvent être utilisés, par exemple ceux basés sur l'effet Joule, l'effet Peltier, l'effet d'un rayonnement lumineux. Les barreaux thermiques 54, 55 et 56 possèdent un trou de passage d'un fluide caloporteur, tel le trou 58. Leur face supérieure présente une cavité d'aspiration, telle la cavité 59 sur le barreau thermique 54, reliée à un dispositif d'aspiration afin de plaquer le support d'analyse 50 sur les barreaux thermiques. Le barreau thermique 55 montre une résistance électrique 61 permettant d'accroître la température de ce barreau. Le barreau thermique 56 montre un élément 62 de mesure de la température de la face supérieure de ce barreau.
La figure 4 représente, de manière schématique, un support d'analyse mobile 70 soumis à un protocole PCR de 20 cycles. Chaque cycle comprend la soumission d'une substance aux trois températures successives 94°C, 55°C et 72°C fournies par vingt groupes de barreaux thermiques 74, 75 et 76.
L'intérêt de l'invention par rapport aux techniques de l'état de l'art peut être démontré à partir d'un protocole pour l'analyse d'une série d'échantillons comportant les étapes suivantes :
- mélange d'un premier réactif à un échantillon, - cyclage thermique d'une durée tx ,
- ajout d'un deuxième réactif,
- cyclage thermique d'une durée t2,
- ajout d'un troisième réactif,
- détection d'une substance, d'une couleur ou d'une autre grandeur physico-chimique.
L'invention permet de réaliser ce protocole pour un grand nombre d'échantillons (par exemple 384) combiné avec un grand nombre de réactifs différents
(par exemple 100) . L'invention permet d'obtenir ces 100 x 384 analyses en un temps plus court que les machines utilisant des plaques à puits traditionnelles tout en ayant un mode de réalisation plus simple que les systèmes "lab on a chip". En effet, avec les machines standard travaillant avec des plaques à 384 puits, le temps de mise en œuvre du protocole est de 100 x (ti + t2) . Ce temps, qui est incompressible, est en général trop long. On peut noter aussi qu'il est nécessaire de concevoir des robots de manipulation des 100 plaques à puits et un système de gestion et de distribution de 100 x 384 échantillons et de 3 x 100 x 384 distributions de réactifs.
Avec une machine utilisant des puces à micro-canaux travaillant en flux continu de réactions, il est possible de dimensionner le système pour minimiser le temps nécessaire pour les 100 x 384 réactions grâce au principe du flux continu. Par exemple, il suffit de réaliser une puce à 384 canaux et de faire circuler les uns à la suite des autres, dans chacun des 384 canaux, les 100 réactions sur les différentes zones où sont effectuées les étapes du protocole. chaque réaction étant séparée l'une de l'autre par des bouchons séparateurs miscibles ou non miscibles (voir le document WO-00/21 666) . Le temps nécessaire pour les 100 x 384 réactions est donné par le temps de passage entre deux réactions successives. Ainsi, une très grande vitesse des liquides permettra de faire circuler toutes les réactions en un minimum de temps .
La vitesse de déplacement des liquides V se dimensionne par la relation V = L/t où L est la longueur des zones où sont effectués les protocoles biologiques et t est le temps des protocoles biologiques. Il est donc possible, en prenant des grandes longueurs, d'augmenter la vitesse de déplacement des réactions et donc de minimiser le temps nécessaire pour obtenir les 100 x 384 réactions. Ce constat pose cependant un problème car la nécessité d'augmenter la longueur des canaux est contraire à la miniaturisation de la puce micro-fluidique et remet en cause l'utilisation des microtechnologies pour la réalisation du composant. D'autre part, le contrôle des déplacements sur 384 voies en parallèles avec 100 réactions différentes pose un gros problème de conception et, en particulier, il faut maîtriser parfaitement les problématiques de la mécanique des fluides dans des petits canaux. L'invention permet de garder l'avantage du flux continu de réactions concernant la rapidité d'exécution des 100 x 384 réactions sans avoir l'inconvénient du contrôle du déplacement des liquides dans des micro-canaux. En effet, l'invention permet de réaliser des réactions biologiques en flux continu, en déplaçant le support mobile sur lequel sont immobilisés les volumes de réaction. Le déplacement des volumes de réaction est donc directement contrôlé par le déplacement du support mobile, bien plus simple à réaliser qu'un système de pompage dans des microcanaux. Il faut noter aussi, comme autre avantage par rapport aux dispositifs à microcanaux, que la vitesse de déplacement du support d'analyse, et par conséquent des échantillons analysés, est indépendante des volumes des échantillons ou des volumes injectés.
On va donner maintenant un exemple d'utilisation du principe de l'invention pour réaliser un protocole de PCR. Le support d'analyse mobile est un film de
Kapton 200 HN disponible chez Dupont, d'épaisseur 50 μm. Le liquide non miscible utilisé est l'huile minérale de type light disponible chez Sigma.
A titre d'exemple d'échantillons, une solution de PCR de 100 μl peut comprendre les constituants suivants :
- 10 μl de tampon 10X (Gibco) ,
4 μl de magnésium Mg2+ (Gibco) 50 mM,
- 10 μl de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 2 mM,
- 2 fois 4 μl d'amorces ("primers"), - 10 μl de BSA 20 mg/ml ,
- 58 μl d'eau colorée pour bien visualiser les gouttes,
1 μl de matrice (ADN) , - 2 μl de taq polymérase (Gibco) .
Des gouttes de cette solution sont déposées sur le tapis ou film, sous huile.
Les gouttes, d'un volume de 0,5 μl, 1 μl et 2 μl, subissent alors une trentaine de cycles thermiques à des températures successives de 94, 55 et 72 °C conformément à l'invention. Après récupération des gouttes, les résultats sont analysés par electrophorese sur gel d'agarose. Les résultats obtenus sont comparés aux résultats fournis par un témoin résultant d'une amplification par PCR d'un volume de 2 μl de la même préparation mais amplifié sur appareil du type plaque à puits standard.
Une variante du protocole précédent consiste à déposer une première goutte de 0,5 μl contenant de l'ADN puis un deuxième dépôt de goutte de
0,5 μl contenant les amorces (ou primers) . Les opérations peuvent aussi être parallélisées en réalisant une colonne de N gouttes contenant des ADN différents. On forme ainsi N lignes de gouttes de 0 , 5 μl puis, séquentiellement, on dépose des gouttes de 0,5 μl de réactifs contenant les primers. Pour chaque colonne les primers sont différents. Il est ainsi possible de réaliser en flux continu des amplifications par PCR sur N ADN différents et pour une multitude de primers différents. Les différents essais effectués sur l'invention ont permis d'apporter les conclusions suivantes .
La forme des gouttes est reproductible. Chaque goutte, une fois accrochée au film par les forces de capillarité, reste fixée au film avec une très bonne stabilité tout au long du procédé de réalisation du protocole biologique.
Le mélange entre les deux volumes de 0,5 μl est très rapide et il n'est pas nécessaire d'ajouter une fonction supplémentaire pour forcer le mélange, contrairement à l'enseignement du document O-A-95/34 374. Il a été en effet observé qu'avec de petits volumes (de l'ordre du μl) , le mélange s'effectue en quelques secondes .
Les cycles thermiques sont appliqués sur les gouttes avec une précision suffisante pour un protocole de PCR. La présence de l'huile et du film ne perturbe pas les échanges thermiques entre les réactifs et les différents barreaux thermiques.
Le système constitué par le film de Kapton® et l'huile minérale avec la configuration décrite est biocompatible pour une PCR.
Une bulle de gaz peut apparaître après quelques cycles thermiques. Cependant, ceci ne remet pas en cause le résultat. Il n'est donc pas nécessaire d'effectuer des opérations de dégazage des différents liquides avant d'effectuer les cycles de PCR.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système permettant de réaliser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique sur des substances à analyser, le système comprenant :
- un support d'analyse mobile (11, 30, 50) comprenant des moyens de réception des substances à analyser et de réactifs, les moyens de réception étant disposés de façon à constituer une matrice de lignes et de colonnes,
- des moyens permettant la mise en œuvre du protocole, disposés de façon que les moyens de réception du support défilent devant eux lors de la mise en œuvre du protocole, caractérisé en ce que :
- le support d'analyse mobile est pourvu de moyens permettant d'éviter 1 ' évaporation des substances à analyser et des réactifs, - les moyens permettant d'éviter
1 ' évaporation des substances à analyser et des réactifs sont choisis parmi :
• un milieu liquide non miscible avec les substances à analyser, les réactifs et les produits de réaction entre substances à analyser et réactifs,
• un film de liquide non miscible avec les substances à analyser et les réactifs, recouvrant les moyens de réception et apte à être traversé par les substances à analyser et les réactifs, - les moyens permettant la mise en œuvre du protocole comprennent des moyens successifs d'apport d'énergies différentes.
2. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (36) permettant d'apporter successivement les substances à analyser et les réactifs jusqu'aux moyens de réception du support d'analyse mobile.
3. Système selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens de détection appliqués aux substances ayant subi le protocole pour fournir une analyse de ces substances.
4. Système selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les moyens d'apport d'énergie sont des moyens de chauffage (14, 15, 34, 35, 54, 55, 56) permettant de porter les moyens de réception à une température déterminée.
5. Système selon la revendication 4, caractérisé en ce que lesdits moyens de chauffage comprennent au moins un barreau thermique (54, 55, 56) porté à ladite température déterminée.
6. Système selon la revendication 5, caractérisé en ce que le barreau thermique est porté à ladite température déterminée par la circulation d'un fluide caloporteur et/ou par effet Joule et/ou par effet Peltier et/ou par un rayonnement lumineux.
7. Système selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (59) pour rapprocher le support d'analyse mobile du barreau thermique .
8. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens permettant d'apporter les substances à analyser et les réactifs, et les moyens permettant la mise en œuvre du protocole sont agencés de façon à obtenir successivement :
- l'apport d'un premier composé chimique dans un volume de réaction jusqu'au moyen de réception,
- le déplacement du support d'analyse mobile vers un premier élément d'injection,
- l'apport d'un deuxième composé chimique dans le volume de réaction par le premier élément d'injection,
- et optionnellement , le déplacement du support d'analyse mobile vers un deuxième élément d'injection pour apporter un troisième composé chimique au volume de réaction.
9. Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que les moyens de détection sont des moyens fournissant une analyse des substances directement sur le support d'analyse mobile.
10. Système selon la revendication 3, caractérisé en ce que les moyens de détection sont des moyens fournissant une analyse des substances après leur transfert du support d'analyse mobile.
11. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support d'analyse mobile est constitué par une plaque, les moyens de réception étant constitués par des plots disposés sur une face de la plaque et permettant l'accrochage des substances à analyser .
12. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support d'analyse mobile est un film (30) .
13. Système selon la revendication 12, caractérisé en ce que les moyens de réception résultent de forces de capillarité entre une surface du film et les substances à analyser.
14. Système selon la revendication 12, caractérisé en ce que le film (30) est mobile entre un rouleau dérouleur (37) et un rouleau enrouleur (38) .
15. Système selon la revendication 12, caractérisé en ce que le film (30) étant un film uniforme, ladite surface du film est une surface hydrophile .
16. Système selon la revendication 12, caractérisé en ce que le film est un film structuré, la structuration du film permettant de déterminer l'emplacement des moyens de réception.
17. Système selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite surface du film est hydrophobe et supporte des plots hydrophiles constituant lesdits moyens de réception.
18. Système selon la revendication 12, caractérisé en ce que le film possède une conductivité thermique anisotrope, la conductivité thermique selon l'épaisseur du film étant supérieure à la conductivité thermique dans le plan du film.
19. Procédé de réalisation, en flux continu, d'un protocole biologique, chimique ou biochimique sur des substances à analyser, le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en défilement d'un support d'analyse mobile (11, 30, 50) comprenant des moyens de réception des substances à analyser et de réactifs, les moyens de réception étant disposés de façon à constituer une matrice de lignes et de colonnes, le support d'analyse mobile étant pourvu de moyens permettant d'éviter 1 ' évaporation des substances à analyser et des réactifs choisi parmi :
• un milieu liquide non miscible avec les substances à analyser, les réactifs et les produits de réaction entre substance à analyser et réactifs, • un film de liquide non miscible avec les substances à analyser et les réactifs, recouvrant les moyens de réception et apte à être traversé par les substances à analyser et les réactifs, - la mise en œuvre du protocole sur les substances à analyser pendant le défilement du support d'analyse mobile grâce à des moyens successifs d'apport d'énergies différentes.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que les substances à analyser et les réactifs sont apportés successivement jusqu'aux moyens de réception du support pendant son défilement .
21. Procédé selon l'une des revendications
19 ou 20, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une analyse, par des moyens de détection, des substances ayant subi le protocole.
22. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'étape d'apport d'énergie est une étape d'apport d'énergie thermique.
23. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il se déroule de façon à obtenir successivement :
- l'apport d'un premier composé chimique dans un volume de réaction jusqu'au moyen de réception,
- le déplacement du support d'analyse mobile vers un premier élément d'injection, - l'apport d'un deuxième composé chimique dans le volume de réaction par le premier élément d' injection,
- et optionnellement, le déplacement du support d'analyse mobile vers un deuxième élément d'injection pour apporter un troisième composé chimique au volume de réaction.
24. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que ladite analyse des substances ayant subi le protocole est effectuée directement sur le support d'analyse mobile.
25. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que ladite analyse des substances ayant subi le protocole est effectuée après leur transfert du support d'analyse mobile.
PCT/FR2002/000309 2001-01-29 2002-01-25 Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique. WO2002061438A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02700414A EP1356303B1 (fr) 2001-01-29 2002-01-25 Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique.
DE60201257T DE60201257T2 (de) 2001-01-29 2002-01-25 Verfahren und vorrichtung zur kontinuerlichen durchführung einer biologischen, chemischen oder biochemischen reaktion
AT02700414T ATE276519T1 (de) 2001-01-29 2002-01-25 Verfahren und vorrichtung zur kontinuerlichen durchführung einer biologischen, chemischen oder biochemischen reaktion
US10/466,106 US7404930B2 (en) 2001-01-29 2002-01-25 Method and system for performing in continuous flow a biological, chemical or biochemical protocol
JP2002561953A JP4307074B2 (ja) 2001-01-29 2002-01-25 生物学的、化学的または生化学的プロトコルを連続フローで実行するための方法及びシステム

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0101159A FR2820058B1 (fr) 2001-01-29 2001-01-29 Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique
FR01/01159 2001-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002061438A1 true WO2002061438A1 (fr) 2002-08-08

Family

ID=8859342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2002/000309 WO2002061438A1 (fr) 2001-01-29 2002-01-25 Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7404930B2 (fr)
EP (1) EP1356303B1 (fr)
JP (1) JP4307074B2 (fr)
AT (1) ATE276519T1 (fr)
DE (1) DE60201257T2 (fr)
FR (1) FR2820058B1 (fr)
WO (1) WO2002061438A1 (fr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020001544A1 (en) * 1997-08-28 2002-01-03 Robert Hess System and method for high throughput processing of droplets
US8414774B2 (en) 2001-04-25 2013-04-09 Agilent Technologies, Inc. Systems and methods for high-throughput screening of fluidic samples
US7588725B2 (en) 2001-04-25 2009-09-15 Biotrove, Inc. High throughput autosampler
US6812030B2 (en) 2001-04-25 2004-11-02 Biotrove, Inc. System and method for high throughput sample preparation and analysis using column chromatography
AU2003235969A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Arkray, Inc. Method for adjusting temperature of analyzing tool and analyzing device having function of adjusting temperature
IL162842A0 (en) * 2004-07-04 2005-11-20 Blue I Technologies Ltd Indictor strip and a device for automatic testing of liquids
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
DE102005031648B4 (de) * 2005-07-06 2010-06-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Kryokonservierung biologischer Proben
DE102005038252A1 (de) * 2005-08-12 2007-02-15 Mann, Wolfgang, Dr. Substrat zum Durchführen von chemischen und biologischen Reaktionen und Vorrichtung zum Durchführen von entsprechenden Reaktionen mit einem solchen Substrat
US7556776B2 (en) * 2005-09-08 2009-07-07 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic manipulation of fluids and reactions
DE102006057300A1 (de) * 2006-12-05 2008-06-19 Siemens Ag Anordnung zur Aufbereitung einer Mehrzahl von Proben für eine Analyse
US8677808B2 (en) 2007-11-02 2014-03-25 Agilent Technologies, Inc. Sample injection system
DE102007057651A1 (de) 2007-11-28 2009-06-18 Nickl, Julius, Dr. Thermisches Schwingen zum zyklischen Temperieren von biologischen medizinischen und chemischen Proben
FR2930457B1 (fr) * 2008-04-24 2010-06-25 Commissariat Energie Atomique Procede de fabrication de microcanaux reconfigurables
WO2009134395A2 (fr) 2008-04-28 2009-11-05 President And Fellows Of Harvard College Dispositif microfluidique pour un stockage et un agencement bien défini de gouttelettes
DE102009032428B4 (de) * 2009-07-09 2015-07-02 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung, Substrat und Verfahren für eine Präparation einer Zellprobe
US12065698B2 (en) * 2009-10-02 2024-08-20 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Sample processing apparatus and method
DE102016215269B4 (de) * 2016-08-16 2020-12-03 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Vereinzelung biologischer Zellen

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3368872A (en) * 1964-08-31 1968-02-13 Scientific Industries Automatic chemical analyzer
US3566677A (en) * 1969-06-26 1971-03-02 Atomic Energy Commission Method and apparatus for monitoring content of flowing streams
US4349510A (en) * 1979-07-24 1982-09-14 Seppo Kolehmainen Method and apparatus for measurement of samples by luminescence
US4883642A (en) * 1984-06-05 1989-11-28 Universite Paris-Nord Means to automatically hold, process, store and analyze biological samples
WO1995034374A2 (fr) * 1994-06-16 1995-12-21 Behringwerke Aktiengesellschaft Procede et dispositif pour melanger des liquides
US5508200A (en) * 1992-10-19 1996-04-16 Tiffany; Thomas Method and apparatus for conducting multiple chemical assays
WO1999011373A2 (fr) * 1997-08-28 1999-03-11 Hunter Ian W Procedes et appareil permettant de realiser des operations microchimiques sur des gouttelettes
WO1999034920A1 (fr) * 1998-01-12 1999-07-15 Massachusetts Institute Of Technology Procede pour effectuer des dosages microscopiques
WO2001051207A1 (fr) * 2000-01-10 2001-07-19 Genospectra, Inc. Support de sondes lineaire

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE8813773U1 (de) 1988-11-03 1989-01-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften eV, 37073 Göttingen Gerät zum wahlweisen Einstellen der Temperatur einer Probe auf verschiedene Werte
JPH08196299A (ja) 1995-01-26 1996-08-06 Tosoh Corp サーマルサイクリング反応装置及びこれに用いる反応容器
JP3813655B2 (ja) 1996-02-22 2006-08-23 大日本印刷株式会社 Ｐｃｒ装置
US5985214A (en) * 1997-05-16 1999-11-16 Aurora Biosciences Corporation Systems and methods for rapidly identifying useful chemicals in liquid samples
US6159368A (en) * 1998-10-29 2000-12-12 The Perkin-Elmer Corporation Multi-well microfiltration apparatus
CA2464467A1 (fr) * 2001-10-26 2003-05-01 Sequenom, Inc. Procede et appareil de distribution parallele de volumes precis de particules solides

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3368872A (en) * 1964-08-31 1968-02-13 Scientific Industries Automatic chemical analyzer
US3566677A (en) * 1969-06-26 1971-03-02 Atomic Energy Commission Method and apparatus for monitoring content of flowing streams
US4349510A (en) * 1979-07-24 1982-09-14 Seppo Kolehmainen Method and apparatus for measurement of samples by luminescence
US4883642A (en) * 1984-06-05 1989-11-28 Universite Paris-Nord Means to automatically hold, process, store and analyze biological samples
US5508200A (en) * 1992-10-19 1996-04-16 Tiffany; Thomas Method and apparatus for conducting multiple chemical assays
WO1995034374A2 (fr) * 1994-06-16 1995-12-21 Behringwerke Aktiengesellschaft Procede et dispositif pour melanger des liquides
WO1999011373A2 (fr) * 1997-08-28 1999-03-11 Hunter Ian W Procedes et appareil permettant de realiser des operations microchimiques sur des gouttelettes
WO1999034920A1 (fr) * 1998-01-12 1999-07-15 Massachusetts Institute Of Technology Procede pour effectuer des dosages microscopiques
WO2001051207A1 (fr) * 2000-01-10 2001-07-19 Genospectra, Inc. Support de sondes lineaire

Also Published As

Publication number Publication date
JP4307074B2 (ja) 2009-08-05
DE60201257T2 (de) 2005-09-29
US7404930B2 (en) 2008-07-29
FR2820058A1 (fr) 2002-08-02
US20040053418A1 (en) 2004-03-18
DE60201257D1 (de) 2004-10-21
EP1356303B1 (fr) 2004-09-15
FR2820058B1 (fr) 2004-01-30
ATE276519T1 (de) 2004-10-15
EP1356303A1 (fr) 2003-10-29
JP2004526138A (ja) 2004-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1356303B1 (fr) Procede et systeme permettant de realiser en flux continu un protocole biologique, chimique ou biochimique.
EP1376846B1 (fr) Dispositif de déplacement de petits volumes de liquide le long d'un micro-catenaire par des forces électrostatiques
US10739366B2 (en) System and method for screening a library of samples
JP4142280B2 (ja) 流体の分析及び流体の制御された搬送のための装置
CA2416756C (fr) Dispositif pour l'amplification en chaine thermo-dependante de sequences d'acides nucleiques cibles
JP5791621B2 (ja) 液滴生成技術
US9404882B2 (en) Method of producing a multi-microchannel, flow-through element and device using same
DE60018733T2 (de) Vorrichtung und verfahren zur probenanalyse
US7919306B2 (en) Biological sample reaction chip, biological sample reaction apparatus, and biological sample reaction method
CN102083533A (zh) 微流控芯片装置及其使用
US20020187564A1 (en) Microfluidic library analysis
JP2017514151A (ja) 試薬をカプセル化およびパーティション化するための流体デバイス、システム、および方法、ならびにそれらの応用
FR2843048A1 (fr) Dispositif d'injection et de melange de micro-gouttes liquides.
JP2009543054A (ja) 分析装置、抽出及び検出システム及びｐｃｒ反応方法
JP6190950B2 (ja) 液滴保存方法
JP2004093558A (ja) 分析用チップ、分析用チップユニット及び分析装置ならびに分析用チップの作製方法
JP4442035B2 (ja) マイクロチャンネル型チップ
Yasui et al. Inkjet injection of DNA droplets for microchannel array electrophoresis
Kulkarni et al. A review on recent advancements in chamber-based microfluidic PCR devices
FR2861610A1 (fr) Dispositif de travail comprenant une zone localisee de capture d'une goutte d'un liquide d'interet
EP1677914B1 (fr) Procede de repartition de gouttes d un liquide d interet sur une surface
Kim et al. Deterministic bead-in-droplet ejection utilizing an integrated plug-in bead dispenser for single bead–based applications
FR2799139A1 (fr) Dispositif d'analyse biochimique comprenant un substrat microfluidique notamment pour l'amplification ou l'analyse d'acides nucleiques.
FR2796863A1 (fr) Procede et dispositif permettant de realiser en flux continu un protocole de traitement thermique sur une substance
Poonia et al. Raman and Surface-Enhanced Raman Scattering Detection in Flowing Solutions for Complex Mixture Analysis

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002700414

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002561953

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10466106

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002700414

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2002700414

Country of ref document: EP