WO2002057441A1 - Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g et adn de cette proteine - Google Patents

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WO2002057441A1
WO2002057441A1 PCT/JP2002/000270 JP0200270W WO02057441A1 WO 2002057441 A1 WO2002057441 A1 WO 2002057441A1 JP 0200270 W JP0200270 W JP 0200270W WO 02057441 A1 WO02057441 A1 WO 02057441A1
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WO
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protein
receptor protein
salt
present
coupled receptor
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PCT/JP2002/000270
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Inventor
Masanori Miwa
Takashi Ito
Yasushi Shintani
Nobuyuki Miyajima
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from human kidney or a salt thereof and a DNA encoding the same.
  • G protein conjugated guanine nucleic acid binding protein
  • G protein-coupled receptor One protein is present on the surface of each functional cell in living cells and organs and regulates the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters, and physiologically active substances. It plays a physiologically important role as a target for.
  • the receptor transmits a signal into the cell via binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • physiologically active substances are present at various sites in the body, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins.
  • hormones, neurotransmitters, and other physiologically active substances in the living body There are many unknown hormones, neurotransmitters, and other physiologically active substances in the living body. —Many protein structures have not been reported yet. Furthermore, it is often unknown whether subtypes exist in known receptor proteins.
  • Clarifying the relationship between a substance that regulates complex functions in the living body and its specific receptor protein is a very important means for the development of drugs including agonists and antagonists for receptor proteins.
  • drugs including agonists and antagonists for receptor proteins.
  • the functions of receptor protein genes expressed in vivo were elucidated and the It was necessary to express in an expression system.
  • the G protein-coupled receptor Yuichi is a new It is useful for searching for a suitable ligand (physiologically active substance), and for searching for an agonist or an agonist for the receptor.
  • a physiological ligand is not found, by analyzing the physiological action of the receptor from the inactivation experiment (knockout animal) of the receptor, it is possible to analyze the agonist or angina for the receptor. It is also possible to make a second strike.
  • These ligands, agonists or antagonists to the receptor can be expected to be used as preventive / therapeutic agents or diagnostic agents for diseases associated with G protein-coupled receptor dysfunction.
  • a decrease or increase in the function of the receptor in a living organism based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor often causes some disease.
  • the nucleotide sequence of the receptor is essential information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene, and the receptor gene is used for the prevention / treatment of a disease associated with the dysfunction of the receptor. It can also be applied to drugs and diagnostics. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a novel G protein-coupled receptor protein useful as described above. That is, a novel G protein-coupled receptor protein or its partial peptide or a salt thereof, a polynucleotide encoding the G protein-coupled receptor protein or its partial peptide (DNA, RNA and derivatives thereof) A polynucleotide (DNA, RNA and derivatives thereof), a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant carrying the recombinant vector, the G protein-coupled receptor protein or A method for producing a salt thereof; an antibody against the G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof; a compound that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein; Gand determination method, ligand and G protein With role-type receptor Yuichi protein A method for screening a compound that changes the binding property (angonist and agonist) or a salt thereof, a screening kit, a ligand obtainable by using the screening method
  • the present inventors have succeeded in isolating cDNA encoding a novel G-protein-coupled receptor protein derived from human kidney and analyzing the entire nucleotide sequence thereof. Then, when this base sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot shown in FIG. 1, and the protein encoded by these cDNAs was transmembrane-transmitted seven times. It was confirmed that the protein was a G protein-coupled receptor protein. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • the G protein-coupled receptor protein described in (1) above which can be obtained by using the G protein-coupled receptor protein described in (1) or the partial peptide described in (3) or a salt thereof.
  • a ligand for that salt
  • a ligand comprising the G protein-coupled receptor protein of the above (1) or the partial peptide of the above (3) or a salt thereof, and a G protein-coupled receptor of the above (1)
  • a ligand obtainable by using the screening method described in (17) or the screening kit described in (18) and the G tamper described in (1).
  • a medicament comprising the compound of (19) or a salt thereof, (21) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide of (4) under conditions of high stringency,
  • (22) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (4) or a part thereof,
  • a medicament comprising the compound of (28) or a salt thereof, (31) a medicament comprising the compound of (29) or a salt thereof, (32) It is a prophylactic and therapeutic agent for central, endocrine, metabolic, cancer, cardiovascular, respiratory, digestive, immune, inflammatory or infectious diseases (13) ), (15), (20), (30) or the medicament according to (31),
  • the protein is: (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 10) Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, and 2 or more (preferably 1 to 30 or more) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1. Preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids; 3 one or more amino acids (preferably one or more) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. About 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and still more preferably several (1 to 5) amino acids in which the amino acid sequence is substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the ligand is, for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxotocin, PACAP (eg, ⁇ ACAP 27, P ACAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomejuulin, somatos-tin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (basoactive intestinal polypeptide), somatostatin, Dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcito-ningene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, chemokine superfamily (eg IL-18, GROa, GRO / 3, GRO Ryo, N
  • the compound that is brought into contact with the protein-coupled receptor overnight protein and the compound that activates the G-protein-coupled receptor protein or its salt described in (1) above and the test compound described in (8) above The cell stimulating activity through the G protein-coupled receptor protein when the transformant was contacted with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant was measured and compared.
  • the compound that activates the G protein-coupled receptor protein described in (1) above is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, Purine, vasopleucine, oxytocin, PACAP (e.g., PACAP 27, PACAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (baso Active intestinal polypeptide), somatostin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin derivative), leukotriene, pancreatastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, chemoca Emissions superfamily one (e.g., IL one 8, GROa, GRO] 3, GRO
  • MDC DC—CC chemokine subfamily such as CK1 / PARC, SLC; C chemokine subfamily such as lymphotactin; CX3 C chemokine subfamily such as iractalkine), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin , TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA) or sphingosine 1-phosphate, the screening method according to the above (43) or (44),
  • a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand obtainable by the screening method of (38) to (45) and the G protein-coupled receptor protein or salt thereof of (1) above A medicament characterized by:
  • a pharmaceutical comprising a compound or a salt thereof,
  • FIG. 1 is a hydrophobicity plot of TGR30. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a receptor containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Yuichi protein.
  • the receptor protein of the present invention includes, for example, humans and other mammals (eg, , Guinea pigs, rats, mice, egrets, bushes, sheep, horses, monkeys, etc.) (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney), 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langer 8 cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils , Basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts,
  • mammals eg, Guinea pig
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Proteins having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are preferred.
  • substantially the same activity examples include a ligand binding activity and a signal transduction activity. Substantially the same indicates that their activities are the same in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 20 times). 2 times), but the degree of activity and protein Quantitative factors such as the molecular weight of the quality may be different.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and the signal information transduction action can be performed according to a known method.
  • the measurement can be performed according to a ligand determination method described later ⁇ screening method. .
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30; more preferably 1 to 10) Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, and 2 or more (preferably about 1 to 30) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. More preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids; 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acid sequences in which amino acids are substituted with other amino acids, or Proteins containing amino acid sequences Used by all.
  • the amino acid sequence of the receptor protein is N-terminal (amino terminal) at the left end and C-terminal (carboxyl terminal) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the receptor protein of the present invention including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminal lipoxyl group (-COOH), carboxylate (-CO O-), amide (_CONH 2 ) or ester (-COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl or n - C ⁇ 6 alkyl group such as butyl, for example, Shikurobe pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, - C 6, such as naphthyl - 1 2 ⁇ Li Ichiru group, e.g., benzyl, such as full Eniru C alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl ⁇ - Nafuchiru C! C 7 such as _ 2 alkyl group - other 4 Ararukiru groups, such as pin bar opening Iruokishimechiru group commonly used as an oral ester.
  • n - C ⁇ 6 alkyl group such as butyl, for example, Shikurobe pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cyclo
  • the receptor protein of the present invention has a lipoxyl group (or lipoxylate) other than the C-terminus
  • the carboxyl group is amidated or esterified.
  • Such proteins are also included in the receptor protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned terminal ester and the like are used.
  • the receptor protein of the present invention is a protein as described above, with Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. 6 Ashiru groups such as any C 2 _ 6 Arukanoiru group of Asechiru) Protected, N-terminally cleaved in vivo, and daryumin oxidized by daryumil group, substituted on the side chain of amino acid in the molecule (eg, —OH, —SH, amino group, I Midazo Ichiru group, India Ichiru group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., ho mill group, including C ⁇ _ 6 Ashiru group such as C 2 _ 6 Al force Noiru group such Asechiru ) Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. 6 Ashiru
  • the receptor protein of the present invention for example, a receptor protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as a partial peptide) may be any of the above-mentioned partial peptides of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein molecules of the present invention those that are exposed outside the cell membrane and have substantially the same activity are used.
  • substantially the same activity indicates, for example, ligand binding activity.
  • the measurement of the ligand binding activity can be performed in the same manner as described above.
  • the extracellular region (Hydrophilic) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. ) Site) is a peptide that contains the part that was analyzed.
  • a peptide partially containing a hydrophobic site can also be used.
  • a peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention may be at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the amino acid sequences constituting the receptor protein of the present invention.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, and particularly preferably Represents an amino acid sequence having about 90% or more, most preferably about 95% or more homology.
  • the partial peptide of the present invention has the following features: 1) deletion of one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence; (2) One or more (preferably about 1 to 20, preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the above amino acid sequence. Or 3 one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and more preferably about 1 to 5) amino acids in the above amino acid sequence are g It may be replaced.
  • the C-terminus may be any of a hydroxyl group (—CO OH), a carpoxylate (one COO—), an amide (_CONH 2 ), or an ester (one COOR) (R Is as defined above).
  • a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus those in which the carbonyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected by a protecting group, and is formed by cleavage of the N-terminal side in vivo.
  • G 1 n is pyroglutamine-oxidized, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or those in which a sugar chain is bound, such as a so-called glycopeptide. It is.
  • Examples of the salt of the receptor protein or its partial peptide of the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) You.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid,
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can also be produced from the above-mentioned human or other mammalian cells or tissues by a known method for purifying a receptor protein, and encodes the receptor protein of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA. Alternatively, the protein can be produced by the protein synthesis method described later or according to the method.
  • the human or other mammalian tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid, etc., and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion Purification and isolation can be achieved by a combination of mouth chromatography such as exchange chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,, 4, dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4'dimethoxyphenyl) — F moc aminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an a-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the amino acid sequence of a target protein or peptide according to various known condensation methods. .
  • the protein or peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired protein or partial peptide or its amide. get.
  • the ability to use various activating reagents that can be used for protein synthesis particularly, carbodiimides are preferable.
  • the carpimides include DCC, N, N'-diisopropyl carpimide, N-ethyl N '-(3-dimethylaminoprolyl) carpimide, and the like. Activation by these requires a racemization inhibitor additive (eg HO B t, HO OB t)
  • the protected amino acid can be added directly to the resin, or can be added to the resin after the protected amino acid has been activated in advance as the corresponding acid anhydride or HOB t ester or H ⁇ OB t ester.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, Yuichi Sharipentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 _Z, Br—Z , 7-damantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • Lepoxyl groups can be, for example, alkyl esterified (e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, linear, branched, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification) , Phenacyl esterification, ben It can be protected by ziroxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, or the like.
  • alkyl esterified e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopent
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for the esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group and the like are used.
  • the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B z and 2 two Torobenjiru, B r- Z, the protecting groups imidazo Ichiru histidines such evening over tert-butyl is used
  • Tos 4-methoxy-1,2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and HOBt.
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia Also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° (: to 40 ° C.).
  • Dimethyl sulf It is effective to add a force-thione scavenger such as FID, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • a force-thione scavenger such as FID, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4—
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the terminal end of the amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired chain. After lengthening the protein chain, a protein was prepared in which only the protecting group of the amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed, and a protein in which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus was removed. In a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. This crude protein is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing a high-potency carboxyl group of a carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein can be obtained in the same manner as the protein amide. You can get your body.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and the product is protected If it has, the target peptide can be produced by removing the protecting group.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following 1 to 1.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • it is obtained as a salt it is converted to a free form by a known method. be able to.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention. Anything may be used.
  • the polynucleotide is RNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of a double strand, it may be a double-stranded DNA, a double-stranded RNA or a hybrid of DNA: RNA. If single stranded, it may be the sense strand (ie, the coding strand) or the antisense strand (ie, the non-coding strand).
  • mRNA of the receptor protein of the present invention can be quantified.
  • genomic DNA It may be any of the genomic DNA library, the above-mentioned cell- and tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell-tissue-derived cDNA library, and the synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be carried out directly by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention includes, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples of the DNA which hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions include, for example, about 70% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably DNA having a base sequence having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Old Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be done. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringent conditions.
  • the high stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 70 ° C.
  • the conditions at 65 ° C are shown. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • a receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 As a DNA encoding one protein, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • a G protein-coupled receptor has been cloned or determined from an antisense polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting the replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene. It can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence information of DNA encoding a protein.
  • a polynucleotide (nucleic acid) can hybridize with the RNA of the G protein-coupled receptor protein gene and inhibit the synthesis or function of the RNA, or can inhibit the synthesis or function of the G protein-coupled receptor protein. It can regulate and control the expression of the G protein-coupled receptor protein protein through interaction with protein-related RNA.
  • a polynucleotide complementary to the selected sequence of the G protein-coupled receptor protein-associated RNA and a polynucleotide capable of specifically hybridizing to the G protein-coupled receptor protein-associated RNA are It is useful for regulating and controlling the expression of G protein-coupled receptor protein gene in vivo and in vitro, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like. Also, 5 'end hairpin loop, 5' end 6_ base pair.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region that is, the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize with the target can be said to be “antisense”.
  • Antisense 'polynucleotides are polydeoxynucleotides containing 2-doxy-D-reports, Polynucleotides containing D-reports, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available proteins, nucleic acids and synthetic sequences) A specific nucleic acid polymer or other polymer containing a special bond, provided that the polymer contains nucleotides with a configuration that allows base pairing and attachment of bases as found in DNA and RNA Do).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can further comprise unmodified polynucleotides (or non-modified polynucleotides).
  • Modified oligonucleotides or those with known modifications, eg, those with labels known in the art, capped, methylated, and one or more natural nucleotides Substituted with an amino acid, modified with an intramolecular nucleotide, for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or sulfur Those having a containing bond (for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), for example, a protein (nuclease, nuclease inhibitor) -, Toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (for example, monosaccharides), etc., or those having side chain groups, or inter-potency compounds (for example, acridine, psoralen, etc.).
  • an intramolecular nucleotide for
  • nucleic acid Containing, chelating compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizable metals, etc.), those containing alkylating agents, those with modified bonds (eg, Anoma type 1 nucleic acid).
  • chelating compounds eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizable metals, etc.
  • alkylating agents those with modified bonds (eg, Anoma type 1 nucleic acid).
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., one or more of the hydroxyl groups may be replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may have been converted to a functional group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or Or modified nucleic acids (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase nucleic acid uptake (eg, , Phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached to the 3 'end or 5' end of the nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. No. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, such as dalicol such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the nucleic acid inhibitory activity is determined by the transformant of the present invention, It can be examined using an external gene expression system or an in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • Genomic DNA, genomic DNA library Any of the above-described cell-tissue-derived cDNA, the above-described cell-tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by RT-PCR using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) SEQ ID NO: 2
  • a protein having a DNA that hybridizes under high stringent conditions with a DNA represented by the following, and having substantially the same activity as the protein peptide of the present invention eg, ligand binding activity, signal signal transduction action, etc.
  • a DNA having a partial base sequence of a DNA encoding DNA is used.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the DNA represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof hereinafter referred to as the receptor of the present invention
  • a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the nucleotide sequence of DNA encoding the peptide of the present invention may be used.
  • DNA amplified by PCR or integrated into an appropriate vector is used as a DNA fragment or a synthetic DNA encoding a part or all of the receptor protein of the present invention.
  • Sorting can be performed by hybridizing with the one.
  • the hybridization-screening method can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be replaced using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM _K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0DA-LA PCR method, gapped.
  • the method can be carried out according to a known method such as the duplex method and the Kimkel method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned receptor protein may be used as it is depending on the purpose, or may be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the receptor protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA (for example, cDNA) containing DNA encoding the receptor protein of the present invention; Is ligated downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast Derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, as well as ⁇ A1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Neo and the like are used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110,
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • CMV promoter, SR promoter and the like are preferably used.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, the lac promoter, the recA promoter, the ⁇ ⁇ promoter, the lpp promoter, etc.
  • SP02-flops opening motor such as p en p promoter
  • the host is a yeast, PH05-flops opening motor, PGK promoter, GAP promoter, etc.
  • ADH promoter are preferred.
  • polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV400 ri) may be used.
  • SV400 ri an SV40 replication origin
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ampr) And neomycin-resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo 1 ; G418-resistant).
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium, and if necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention.
  • the host is a bacterium of the genus Bacillus, the PhoA • signal sequence, OmpA • signal sequence, etc.
  • the host is yeast, MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., if the host is an animal cell, insulin signal sequence, interferon signal sequence, etc.
  • An antibody molecule, a signal sequence, etc. can be used, respectively.
  • 'A transformant can be produced using the thus-constructed vector containing DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, Insects and animal cells are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12 ⁇ DH1 [Procedures. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 (Journal of 'Molecular ⁇ Biology (Journal of Molecular Biology), 120, 517 (1978)], HB101 [Journal 'ob molecular' biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39 , 440 (1954)], DH5a CInoue, H., Nojima, H.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry], 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Shizosaccharomyces 'Bomb (Sdiizosacclmromyces pombe) NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia' Pastoris (Pichia pastoris) is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of Spodoptera (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and H derived from an egg of Trichoplusia ni ighFive TM cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like.
  • Sf cells include, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL, et al., In Viv o), 13, 213-217 (1977)).
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient chinini—Chinese hamster cell CHO (hereinafter CHO (dh fr ⁇ ) cell) Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeoma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeoma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 can be used to transform a microorganism belonging to the genus Escherichia, for example, Processings of the National Academy of Sciences. Vol., 2110 (1972) and Gene, 17, 17 (1982).
  • Transformation of Bacillus spp. can be carried out, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Volume 168, 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as the medium used in the above, and contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for growing the transformant.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like.
  • the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experiments in Molecuum) lar Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • an agent such as 3; 6-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours. If necessary, aeration and stirring may be added.
  • Burkholder's minimum medium Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Cultures] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or an SD medium containing 0.5% casamino acid (Bitter). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984). Proc. Natl. Acad. Sc. USA, Proc.'S The National Academy of Obs. )].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Culture is usually carried out at about 20 ⁇ ⁇ 35 at about 24 ⁇ 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium used is Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). )), To which an additive such as 10% serum which has been immobilized is appropriately added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium may be a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium (Journal of the American Medical Association, 199, 519) (1 967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)], etc. Is used.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced in the transformant, in the cell membrane, or outside the cell.
  • the receptor protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and Z or freezing. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the receptor protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • Protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as Triton X- 1 0 0 TM.
  • Purification of the receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylic acid. Methods that mainly use differences in molecular weight, such as mid-gel electrophoresis, Methods that use differences in charge, such as ion-exchange chromatography, Methods that use specific affinities, such as affinity chromatography, and reversed-phase Methods utilizing the difference in hydrophobicity, such as high performance liquid chromatography, and methods utilizing the difference in isoelectric points, such as isoelectric focusing, are used.
  • the receptor protein thus obtained when it is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained in a salt, a known method Alternatively, it can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the receptor protein of the present invention or a salt thereof produced in this manner can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof. It may be.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be a known antibody or antiserum using the receptor protein of the present invention as an antigen. It can be manufactured according to the manufacturing method described above.
  • the receptor protein of the present invention or the like is administered to a mammal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier or a diluent. On administration Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance antibody production. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • monoclonal antibody-producing cells When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization By fusing antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting a labeled receptor protein and the like described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Mills [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0 and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG100 to PEG600) is used. ) Is added at a concentration of about 10 to 80%, and the cells are efficiently incubated by incubating at about 20 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C for about 1 to 10 minutes. Fusion can be performed.
  • the hybridoma can be hybridized to a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen such as a receptor protein is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • an antigen such as a receptor protein
  • the domema culture supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cells used for cell fusion are mice, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A is added.
  • a method for detecting a monoclonal antibody bound to a phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase on which an anti-immune glopurin antibody or protein A is adsorbed, and adding a receptor protein or the like labeled with a radioactive substance or an enzyme, A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase is exemplified.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually from 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as ordinary polyclonal antibodies.Immunoglobulin separation and purification methods (e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers) (E.g., DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or active antibody such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate to obtain antibody Specific purification method].
  • immunoglobulin separation and purification methods e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers
  • DEAE adsorption / desorption method
  • ultracentrifugation method ultracentrifugation method
  • gel filtration method antigen-binding solid phase or active antibody such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate to obtain antibody Specific purification method.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (antigen such as the protein of the present invention) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against a protein or the like and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier-protein and the mixing ratio between carrier and hapten are determined by the efficiency of antibodies to hapten immunized by cross-linking with carrier.
  • any substance may be cross-linked at any ratio.
  • serum serum albumin, thyroglobulin, keyhole 'limpet' hemocyanin, etc. in a weight ratio of 1 to hapten 1 A method of coupling at a rate of about 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde dicarbodiimide a maleimide active ester
  • an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the receptor protein of the present invention or its salt, its partial peptide or its salt, and the DNA encoding the receptor protein or its partial peptide are: (1) the G protein-coupled receptor of the present invention; Determination of ligand (agonist) for protein, (2) preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptor protein of the present invention. (3) gene diagnostic agent,
  • the ligand for the G protein-coupled receptor specific to humans and other mammals can be obtained.
  • Compounds that change the binding property eg, agonist, anginaist
  • the agonist or anginaist can be used as an agent for preventing or treating various diseases.
  • the receptor protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention, etc.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof hereinafter referred to as the present invention.
  • the use of the antibody of the present invention (which may be abbreviated as the DNA of the present invention) and the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) will be specifically described below.
  • the receptor protein of the present invention or its salt or the partial peptide or its salt of the present invention is useful as a reagent for searching for or determining a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or its salt. It is.
  • the present invention is characterized in that a test compound is brought into contact with a receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof.
  • a test compound is brought into contact with a receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxitosine, ⁇ ACAP (e.g., PACAP 27, PACAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos evening, GHRH, CRF, AC TH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal and 'Related Polypeptide), somatos evening Tin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene-related peptide), leukotriene, pancreatastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, chemokine superf Millie (eg, IL-8, GRO
  • enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine monophosphate, etc. for example, humans or other mammals (eg, , Mouse, rat, bush, red pepper, sheep, monkey, etc.), cell culture supernatant, etc.
  • the tissue extract, cell culture supernatant, etc. may be added to the receptor protein of the present invention overnight, fractionated while measuring cell stimulating activity, etc., to finally obtain a single ligand. it can.
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and Using the Yuichi coupled Atsushi system By there, it binds to the receptor protein example cell stimulating activity (of the present invention, Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P product, inositol Compounds that have the activity of promoting or suppressing phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc. (for example, peptides, proteins, non-peptides) Compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or their salts.
  • the receptor protein example cell stimulating activity (of the present invention, Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular
  • a receptor compound of the present invention or a partial peptide thereof is contacted with a test compound, for example, binding of a test compound to the receptor protein or the partial peptide It is characterized by measuring the amount and cell stimulating activity.
  • the present invention provides
  • the protein or the salt of the labeled test compound or the salt thereof is obtained. Measuring the amount of binding to a peptide or a salt thereof; a method for determining a ligand for a receptor protein or a salt thereof according to the present invention;
  • the labeled test compound was contacted with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention, which was expressed in the cell membrane.
  • a method for determining a ligand for a receptor protein according to the present invention which comprises measuring the amount of a test compound bound to the receptor protein or a salt thereof,
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AMP generation, fine Measurement of intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • a test compound When a test compound is brought into contact with a receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the receptor protein of the present invention, cell stimulating activity through the receptor protein (for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c_fos activation
  • the present invention provides a method for determining a ligand for a receptor protein or a salt thereof of the present invention, which comprises measuring an activity of promoting or suppressing pH reduction or the like.
  • any receptor protein used in the method for determining a ligand may be used as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention. Good night's sleep.
  • the above-described expression method is used, and it is preferable to carry out the expression by expressing the DNA encoding the receptor protein in mammalian cells or insect cells.
  • CDNA is usually used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment should be a nucleopolyhedropathy belonging to a baculovirus using an insect as a host.
  • Nuclear polyhedrosis virus (NPV) polyhedrin promoter SV40-derived promoter overnight, retrovirus promoter, metamouth thionine promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SR promoter
  • Inspection of the amount and quality of the expressed receptor can be performed by a known method.
  • the method is performed according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Cem.), 267, 19555-19559, 1992]. Can be.
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof includes a receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof purified according to a known method. Or a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof.
  • the cells When cells containing the receptor protein of the present invention are used in the ligand determination method of the present invention, the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell expressing the receptor protein of the present invention.
  • a host cell Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like are used. .
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a known method.
  • the cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Warlinda blender ⁇ polytron (Kinema tica), crushing with ultrasonic waves, or pressing a thin nozzle with a French press. And crushing by jetting from the air.
  • a fractionation method by centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short time (typically, about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000-3000 rpm), usually 30 min-2 Centrifuge for an hour, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of receptor protein in the cells containing the receptor protein and the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. Is preferred.
  • the receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction activity and the like.
  • test compound [3 H], [125 I], [14 C], [35 S], etc. labeled with angiotensin, bombesin, Kanapinoido, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Peptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxitosine, PACAP (e.g., PACAP 27, PA CAP 38), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatosulin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vaso Active Intestinal and Related Polypeptide), Somato Tostin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitonin Gene-Related Peptide), Leukotriene, Pancreas Retin, Prostaglandin , Trompoxane, adenosine, 7Drainerin
  • a cell or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein of the present invention is suitable for the determination method.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as a tris-monohydrochloride buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein.
  • various proteins such as detergents such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin and dexcholate, serum albumin, and gelatin are buffered. Can also be added.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and peptide suptin can be added for the purpose of suppressing receptor degradation and ligand degradation by proteases.
  • a certain amount 5,000 to 500,000 c pm
  • [3 H] [125 I]
  • [14 C] the test compound labeled with a [35 S] Coexist.
  • reaction tube containing a large excess of unlabeled test compound to determine the amount of non-specific binding (NSB).
  • the reaction is carried out at about 0 ° C. to 50 ° C., preferably about 4 ° C. to 37 ° C., for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or a counter.
  • a test compound having a count (B-NSB) exceeding 0 cpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) is used as a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or its salt. ) Can be selected.
  • cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-1: activation of fos, decrease in pH, etc.
  • Activity or inhibitory activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the receptor protein are cultured on a multiwell plate or the like.
  • the assay Before performing ligand determination, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or supernatant. Collect the liquid and quantify the product produced according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to the presence of a degrading enzyme contained in cells, the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. Good. In addition, activities such as inhibition of CAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • activities such as inhibition of CAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • the kit for determining a ligand that binds to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes the receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide or a salt thereof of the present invention, a cell containing the receptor protein of the present invention, or It contains a membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 2 days at 37 ° (5% CO 2 , 95% air).
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • the ligand capable of binding to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes, for example, substances specifically present in the hypothalamus, cerebral cortex, colon cancer, lung cancer, heart, placenta, lung, and the like. Specifically, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxoxysin, PACAP (eg, PACAP 27, PACAP 38), secretin , Glucagon, Calcitonin, Adrenomedullin, Somatosintin, GHRH, CRF, A CTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive 'Intestinal and Related Polypeptide), Somatosintin, Dopamine , Motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitoninji Nri Retiddo peptide), leukot
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein is determined according to the action of the ligand. It can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention when there is a patient who cannot expect the physiological action of the ligand due to a decrease in the receptor protein of the present invention in the living body (deficiency of the receptor protein), (1) the receptor protein of the present invention To supplement the amount of the receptor protein, or (2) administering to the patient the DNA encoding the receptor protein of the present invention and expressing it; After inserting and expressing DNA encoding the receptor protein of the present invention, the cells may be transplanted into the patient, for example, to increase the amount of receptor protein in the patient's body, The effect of the ligand can be sufficiently exerted. That is, the DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic agent for preventing and / or treating diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is a G receptor protein conjugated receptor receptor protein.
  • P2Y1 P2Y purinoceptor 1
  • P2Y purinoceptor 1 LEON C., VIAL C., CAZENAVE J.P., and GACHET C. GENE 171: 295-297 (1996): AYYANATHAN K., TANIA W. , HARBAN SJIT S., RAGHBIR AS, BARNARD EA, and KUNAPULI SP BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 218: 783-788 (1996): JANS SENS R., COMMUNI D., PIROTTON S., S AMSON M. PARMENTIER M., and BOEYNAEMS JM BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMU N. 221: 588-593 (1996))
  • P2Y1 P2Y purinoceptor 1
  • GENE 171 295-297 (1996): AYYANATHAN K.,
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention or the receptor protein may be a central disease (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorder, etc.), an endocrine disease (eg, hypertension, gonad dysfunction, thyroid dysfunction, pituitary gland) Functional disorders), metabolic disorders (e.g., diabetes, lipid metabolism disorders, hyperlipidemia, etc.), cancers (e.g., non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, gastric cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer) , Colon cancer, rectal cancer, etc., cardiovascular diseases (eg, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), respiratory diseases (eg, airway obstructive diseases, infectious lung diseases, etc.), gastrointestinal diseases ( For example, gastric ulcer, duodenal ulcer, gastritis, reflux esophagitis, etc., immune system diseases (eg, autoimmune diseases), inflammatory diseases (eg, allergies, asthma, rheumatic diseases) ), If e infections (
  • the receptor protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
  • the DNA of the present invention when used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or in a retrovirus vector. After insertion into a suitable vector, such as an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, etc., it can be carried out in a conventional manner.
  • a suitable vector such as an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, etc.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting ingestion, using a gene gun or a catheter such as Hydrate gel gel.
  • the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein may be a sugar-coated tablet, capsule, elixir It can be used orally as a preparation, microcapsule or the like, or parenterally in the form of an injection such as a sterile solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • a known carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, and binder which are physiologically acceptable for the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the protein. It can be manufactured by mixing with a generally accepted unit dosage form required for the practice of the formulation. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • an aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene Dali call
  • a nonionic surfactant eg, polysorbate 8 0 TM, HC_ ⁇ one 5 0
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agents examples include buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. May be blended.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc. May be blended.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, puppies, higgs, bush, puppies, cats, dogs
  • the dosage of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (as 60 kg), one day is used.
  • L is about 0.1 to about; L 00 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • injection it is usually used, for example, for cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, the target organ, the condition, the administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in a cancer patient (as 6 O kg), one dose is generally used. About 0.1 to per day; L0 Omg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • an injection it is usually, for example, a cancer patient (as 6 O kg)
  • a cancer patient as 6 O kg
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce the receptor of the present invention in humans or other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • Abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding a protein or a partial peptide thereof can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA.
  • the DNA or mRNA is useful as a diagnostic agent for a gene such as increase or overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the well-known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)), etc. Can be implemented.
  • the DNA of the present invention can be used for screening for a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention.
  • the present invention provides, for example, the receptor of the present invention contained in (i) blood of a non-human mammal, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a transformant.
  • a method for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention by measuring the mRNA amount of one protein or its partial peptide is provided.
  • the measurement of the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide is specifically performed as follows.
  • non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, bushus, horses, cats, dogs, monkeys, etc., more specifically, demented rats, obese mice, arteriosclerosis ⁇ Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.)
  • blood or a specific organ eg, brain, lung, colon, etc.
  • tissue or cells isolated from the organ is obtained.
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the obtained cells can be obtained, for example, by extracting mRNA from cells or the like by a usual method, for example, For example, it can be quantified by using a method such as TaQMan PCR, and can also be analyzed by performing a Northern plot by a known means.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above method, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof contained in the transformant is similarly determined. Quantification and analysis.
  • the test compound is administered at the same time as the physical stress, and after a certain period of time after the administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), It can be performed by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cells,
  • the test compound is mixed in a medium and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days). A day later), the amount can be determined by quantifying and analyzing the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention or a salt thereof is a compound having an action of changing the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention.
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, IntracAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c_fos , A compound that enhances the activity of promoting or suppressing a decrease in pH, etc.
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, IntracAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c_fos , A compound that enhances the activity of promoting or suppressing a decrease in
  • Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
  • the compound that reduces the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-described pharmaceuticals containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (as 6 O kg), About 0.1-100 mg per day, preferably about 1.0-5 Omg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • an injection it is usually used, for example, in a cancer patient (as 6 O kg).
  • the dose can be administered in terms of 60 kg
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo, for example, central function, as described above. Therefore, the compound of the present invention that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide can be used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. .
  • the compound when used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like as needed, orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally or in the form of injections such as suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannidol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • Agent for example, alcohol (eg, It may be used in combination with ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene dalicol), nonionic surfactant (eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50).
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic and therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, egrets
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • the daily dose is generally one day.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • it is usually used, for example, in a cancer patient (as 6 O kg).
  • it can be administered in an amount equivalent to 6 O kg
  • the receptor protein and the like of the present invention have a binding property to a ligand, the ligand concentration in a living body can be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the subject is brought into contact with the receptor protein or the like of the present invention. Thus, the concentration of the ligand in the subject can be measured. Specifically, for example, it can be used according to the method described in the following (1) or (2) or a method analogous thereto.
  • a method for screening a compound eg, an agonist, an angelist, etc. that alters the binding between a G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand.
  • the ligand and the present invention can be used.
  • Compounds that change the binding to receptor proteins and the like eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.
  • salts thereof can be efficiently screened.
  • the compounds (I) G protein-coupled receptions evening through an cell ⁇ intense activity (e.g., Arakidon acid release, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM Activities that promote P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c_fos, reduction of pH, etc. Suppressing activity, etc.) a compound having a (so-called antagonists to the receptor protein of the present Agonisuto against receptors one protein of the invention), a compound having no (mouth) cell stimulating activity (so-called, the present invention),
  • an cell ⁇ intense activity e.g., Arakidon acid release, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM Activities that promote P production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of
  • (C) a compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
  • the compound (a) is preferably screened by the above-described ligand determination method).
  • the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand; Salts, ligands and reagents A method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and a receptor protein or its partial peptide or a salt thereof of the present invention, which is characterized by comparing with the case of contact with a test compound. provide.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein and the like, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared. .
  • the present invention provides
  • the labeled ligand and the test compound are combined with the DNA of the present invention.
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention eg, a ligand for the receptor protein of the present invention and the like
  • cells containing the receptor protein of the present invention and the like e.g., a ligand for the receptor protein of the present invention and the like
  • a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention and a test compound e.g., cell stimulating activity through contact with cells (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation when exposed to cells) , Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-1s activation, pH reduction, etc. promoting or suppressing activities) and comparing them.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between a ligand and the receptor protein of the present invention, and the like, and
  • a cell in which a compound that activates the receptor protein of the present invention eg, a ligand for the receptor protein of the present invention
  • a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention and a test compound are cultured on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention when the compound is brought into contact with the receptor protein or the like of the present invention.
  • cell stimulating activity mediated by the receptor e.g., Arakidon acid release, Asechiruko phosphorus release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P product, cells C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c_fos, decrease in pH Assaying the activity or inhibiting activity
  • the receptor e.g., Arakidon acid release, Asechiruko phosphorus release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P product, cells C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c_fos, decrease in pH Assaying the activity or inhibiting activity
  • a cell, tissue or a cell thereof containing a G protein-coupled receptor protein such as a rat
  • a candidate compound is obtained using the plasma membrane fraction (primary screening), and then it is confirmed whether or not the candidate compound actually inhibits the binding of a human G protein-coupled receptor protein to a ligand. Testing (secondary screening) was required. If the cell, tissue, or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also present, so it has been difficult to actually directly screen an agonist or an antagonist for the target receptor protein.
  • the human-derived receptor protein of the present invention This eliminates the need for primary screening, and allows efficient screening of compounds that inhibit the binding of ligand to G protein-coupled receptor protein. Furthermore, it is possible to easily evaluate whether the screened compound is an agonist or an engonist.
  • the receptor protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention.
  • a cell membrane fraction of a mammalian organ containing In particular, since human-derived organs are extremely difficult to obtain, human-derived receptor proteins and the like that are expressed in large amounts using recombinants are suitable for screening.
  • the above-mentioned method is used for producing the receptor protein of the present invention and the like, but it is preferable to express the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells.
  • CDNA is used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment should be expressed in a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using an insect as a host.
  • NPV nuc lear polyhedros is virus
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter metallotionin promoter
  • human heat shock promoter cytomegalovirus promoter
  • SR a SR a
  • Detection of the amount and quality of the expressed receptor can be performed by a known method. For example, the method is performed according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biologics Chemistry (J. Biol. Cem.), 267, 19555-19559, 1992]. be able to.
  • the receptor protein or the like of the present invention may be a receptor protein or the like purified according to a known method, or may be a receptor protein or the like. May be used, or a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
  • the cells may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like. The immobilization method can be performed according to a known method.
  • Cells containing the receptor protein of the present invention and the like include host cells that express the receptor protein and the like.
  • Examples of the host cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, and animal cells. Are preferred.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a known method.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Waring Plender ⁇ polytron (manufactured by Kinetica), crushing with ultrasonic waves, or applying pressure with a French press or other means. And crushing by jetting from a thin nozzle.
  • a fractionation method by centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 rpm) for a short period of time (usually about 1-10 minutes), and the supernatant is further processed at a higher speed (150-300-3000 rpm). (Centrifugation at 300 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of receptions evening one protein of a cell or membrane fraction containing the receptor protein or the like is preferably from 1 0 3 to 1 0 8 molecules per cell, is 1 0 5-1 0 7 minutes terminal Is preferred.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction activity For example.
  • labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a cell or a cell membrane containing the receptor protein of the present invention prepares a receptor protein sample by suspending the fraction in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding of the ligand to the receptor protein, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by proteases.
  • protease inhibitors such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and pepstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by proteases.
  • the mixture is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a color counter.
  • the count (B Q — NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B Q ) when there is no antagonist is 100%
  • the specific binding amount (B—NSB) A test compound having a concentration of 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • cell stimulating activity via receptor protein eg, arachidonic acid release
  • Acetylcholine Release e.g., Acetylcholine Release
  • intracellular Ca 2+ release e.g., Acetylcholine Release
  • intracellular cAMP generation e.g., Acetylcholine Release
  • intracellular cGMP generation e.g., inositol phosphate production
  • cell membrane potential fluctuation e.g, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH Activity that promotes or suppresses reduction, etc.
  • cells containing the receptor protein of the present invention and the like are cultured on a multi-well plate or the like. Before conducting screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. Then, the produced product is quantified according to each method.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • an activity such as inhibition of cAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basal production has been increased by forskolin or the like.
  • Cells expressing an appropriate receptor protein are required.
  • Cells expressing the receptor protein of the present invention and the like are preferably cell lines having the natural receptor protein of the present invention and the like, and cell lines expressing the above-mentioned recombinant receptor protein and the like.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. It may be a known compound.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property of the ligand to the receptor protein of the present invention or the like includes cells containing the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention, or the present invention. And those containing the membrane fraction of cells containing the receptor protein and the like.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured for 2 days in 37, 5% CO 2 , 95% air.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention.
  • G protein-coupled receptions evening through an cell-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, Asechirukori emissions release, intracellular C a 2 + release, intracellular C AM P production, intracellular c GM P product, Ino Shitorurin acid production (A so-called agonist against the receptor protein of the present invention) having an activity of promoting or suppressing cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, reduction of pH, etc.
  • G a compound not having the cell stimulating activity
  • G a compound that enhances the binding strength between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, or (2) the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention It is a compound that reduces force.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the agonist against the receptor protein of the present invention has the same activity as the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention, it can be used as a safe and low-toxic drug depending on the ligand activity. Useful.
  • the antagonist of the present invention for the receptor protein or the like can suppress the physiological activity of the ligand for the receptor or the like of the present invention, it can be used as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity. Useful.
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like. is there.
  • the compound that reduces the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention has a ligand for the receptor protein or the like of the present invention. It is useful as a safe and low toxic drug for reducing physiological activity.
  • the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and other mammals (eg, rats, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, dogs, sal, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in a cancer patient (as 6 O kg), one dose is generally used. About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo, such as central function, circulatory function, digestive function, and cardiac function. Therefore, the compounds (agonists, antagonists) that alter the binding property between the receptor protein of the present invention and the ligand and the ligands for the receptor protein of the present invention are dysfunctional of the receptor protein of the present invention. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases related to the disease.
  • the compound or ligand is formulated according to a conventional method. can do.
  • the compound or ligand can be sterilized with tablets or capsules, elixirs, microcapsules, etc., as required, or sugar-coated, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as solutions or suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by this. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives that can be mixed with tablets, capsules, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, traganth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, Swelling agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • Swelling agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharine
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the preparation unit form is a capsule, the above type of material may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice,
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene Dali call
  • a nonionic surfactant eg, polysorbate 8 0 TM, HCO - 5 0
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic / therapeutic agents examples include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc. ), Preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent can be used in combination with an appropriate drug, for example
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • the daily dose is generally one day.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention and the like, it is used for quantification of the receptor protein and the like of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. can do. That is, the present invention provides, for example,
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal of the receptor protein of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor protein of the present invention. Is preferred.
  • the receptor protein and the like of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the receptor protein and the like of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention). You can do it.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of antigen (for example, the amount of receptor protein) in the test solution.
  • any method that detects the amount of the antigen complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used.
  • nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescein, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, a luminol derivative, reluciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing proteins, enzymes, or the like may be used.
  • the carrier include agarose, dextran, and cellulose.
  • Insoluble polysaccharides such as polystyrene, polystyrene, polyacrylamide, synthetic resins such as silicon, and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insoluble monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be based on those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction differs in the binding site of the receptor and the like.
  • Antibodies are preferably used. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation The amount of labeling of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • Anti The raw material is reacted with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the measuring system for the receptor protein or its salt of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method.
  • the measuring system for the receptor protein or its salt of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting a body fluid or a tissue, such as the receptor protein of the present invention, which is present in any subject.
  • preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and receptor protein of the present invention in test cells It can be used for analysis of the behavior of an object.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt, it changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane. It can be used for screening of compounds to be formed. ,
  • Transformants expressing the receptor protein of the present invention or its partial peptide, etc. are sectioned, and then subjected to immunostaining to obtain the protein at the cell surface.
  • the quantitative determination of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the provided cell membrane fraction is specifically performed as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, waterlogging stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • blood or a specific organ eg, brain, lung, colon, etc.
  • tissue or cells isolated from the organ is obtained.
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.) to destroy the organ, tissue or cell.
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, Hess buffer, etc.
  • a cell membrane fraction is obtained by using a surfactant (eg, Triton X-100 TM , Tween-20 TM, etc.), and further using techniques such as centrifugation, filtration, and column fractionation.
  • a surfactant eg, Triton X-100 TM , Tween-20 TM, etc.
  • the cell membrane fraction refers to a cell membrane-rich fraction obtained by disrupting cells and then obtained by a known method.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, crushing with a Warinda blender ⁇ polytron (Kinema tica), crushing by ultrasonic waves, pressing with a French press, etc. Crushing by ejecting cells from a thin nozzle may be mentioned.
  • a fractionation method by centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3OOO rpm) for a short time (usually about 1-10 minutes), and the supernatant is further spun at a high speed (150000-30000). (0 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the receptor protein of the present invention contained in the cell membrane fraction or a partial peptide thereof Can be quantified by, for example, a sandwich immunoassay using the antibody of the present invention, Western blot analysis, or the like.
  • Such a sandwich immunoassay can be performed in the same manner as described above, and western blotting can be performed by known means.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above method, and the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified.
  • a given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered at the same time as the target stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cell membrane
  • test compound When the transformant is cultured according to a conventional method, the test compound is mixed in a medium and cultured for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably 2 days to 3 days). After a day), it can be performed by quantifying the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in a cell membrane.
  • the cell stimulating activity via the G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release
  • the G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the cell membrane By reducing the amount a compound Ru attenuate the cell-stimulating activity.
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
  • the compound that reduces the cell stimulating activity is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention or the like.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be performed according to a conventional method.
  • a conventional method for example, in the same manner as the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention, Solutions, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • the daily dose is generally one day.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in cancer patients (as 6 O kg).
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof in the cell membrane may be, for example, a heart or a central function as described above. It is thought to play some important role in vivo. Therefore, a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. Can be.
  • the compound when used as a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound can be administered orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, optionally coated with sugar, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the compound is generally recognized together with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like. It can be manufactured by mixing in the unit dosage form required for formulation. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propylene glycol, polyethylene Dali call
  • a nonionic surfactant eg, polysorbate one preparative 8 0 TM, HCO - 5 0
  • solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and other mammals (e
  • the dose of the compound or its salt depends on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (assuming 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably It is about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in a cancer patient (as 6 O kg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection.
  • the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the neutralizing activity of the antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof for the receptor protein or the like means that the activity of inactivating the signal transduction function involving the receptor protein. means. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signal transduction associated with the receptor protein, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release) , Intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Activity that promotes or suppresses pH decrease, etc.) Can be inactivated. Therefore, it can be used for prevention and / or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein.
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release
  • transgenic animals expressing the receptor protein of the present invention and the like can be produced.
  • animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, bush, squirrels, cats, cats, dogs, monkeys, etc.) (hereinafter sometimes abbreviated as animals). Mice, egrets and the like are preferred.
  • the DNA When introducing the DNA of the present invention into a target animal, the DNA is generated in animal cells. It is generally advantageous to use it as a gene construct linked downstream of a promoter that can be expressed.
  • a DNA construct of the present invention derived from an animal having a high homology to the DNA is linked to a gene construct linked downstream of various promoters capable of expressing the DNA in animal cells.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the receptor protein of the present invention can be produced by injecting the eggs into a fertilized egg of a heron.
  • a ubiquitous expression promoter such as a virus derived from virus or meta-mouth thionein can be used.
  • a promoter of a gene specifically expressed in the heart is used.
  • the presence of the receptor protein or the like of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA introduction means that all the offspring of the produced animal have the receptor protein or the like of the present invention in all of the germinal and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the gene has the receptor protein of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the animal After confirming that the DNA-introduced animal of the present invention stably retains the gene by mating, the animal can be bred in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all the offspring will have the DNA Breeding to have Since the animal into which the DNA of the present invention has been introduced expresses the receptor protein and the like of the present invention at a high level, it is used as an agonist for screening for the receptor protein and the like of the present invention or for screening of the anna gonist. It is useful as an animal.
  • the DNA-introduced animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • the receptor of the present invention can be obtained. It can analyze proteins and the like.
  • Cells of a tissue having the receptor protein of the present invention or the like are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used, for example, for brain or peripheral tissue.
  • One can study the function of cells from commonly difficult tissues such as In addition, by using the cells, for example, a drug that enhances the function of various tissues can be selected.
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine
  • Pro Proline A sn: Asparagine
  • TC thiazolidine one 4 (R) - Power Rupokisamido group also hereby: substituents frequently used medium, denoted the protecting groups and reagents following symbols.
  • Dicarboxyimide DCC N, N'-dicyclohexynolenophoreimide SEQ ID No. in the Sequence Listing in this specification shows the following sequence.
  • FIG 1 shows the amino acid sequence of the novel human-derived G protein-coupled receptor protein TGR30 of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human-derived G protein-coupled receptor protein TGR30 of the present invention.
  • PCR reaction was performed using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was the above-mentioned cDNA as a 1Z10 amount type I, 50 parts of Advantage-GC2 Polymerase Mix (CL0NTECH), primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 1 (SEQ ID NO: 2). : 4)
  • dN Ding? 3 was added to 200 21 ⁇
  • the buffer attached to the enzyme was added in an amount of 1Z5
  • GC Melt was added in an amount of 1Z5 to give a liquid volume of 201.
  • the PCR reaction is performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by a cycle of 94 ° C for 30 seconds at 60 seconds for 30 seconds, 68V for 4 minutes 35 times.
  • the PCR reaction product was subcloned into a plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen) according to the procedure of a TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into E. coli TOP10, and clones having cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin.
  • a cDNA sequence SEQ ID NO: 2
  • a novel G protein-coupled receptor protein containing this amino acid sequence was named TGR30.
  • the transformant was named Escherichia coli T0P10 / pCR2.1-GR30.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, a polynucleotide encoding the receptor protein or a partial peptide thereof are: (2) Acquisition of antibodies and antisera; (3) Construction of a recombinant receptor protein overnight expression system; (4) Development of a receptor-one-binding assay system using the same expression system and screening of drug candidate compounds 5Structurally similar ligands ⁇ Drug design based on comparison with Receptor ⁇ Professor in gene diagnosis It can be used as a reagent for preparing a PCR primer, (2) a transgenic animal, or (2) a drug such as a gene therapy agent.

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Description

明細書
新規 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質およびその D N A 技術分野
本発明は、 ヒト腎臓由来の新規 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質また はその塩およびそれをコ一ドする D NAに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異 的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ 夕一タンパク質のうち多くは共役している guanine nuc leot ide- binding prote in (以下、 Gタンパク質と略称する） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行 ない、 また、 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G 夕ンパク質共役型レセプタータンパク質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一夕ノ、 Γ\ ク質 （7 TM R) と総称される。
G夕ンパク質共役型レセプタ一夕ンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表 面に存在し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えば、 ホルモン、 神経 伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプ夕ーは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシ グナルにより細胞の賦活ゃ抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ タータンパク質、 特には Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質との関係を明 らかにすることは、 各種生体の臓器や細胞の機能を解明し、 それら機能と密接に 関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達 物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれて レ ^る。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応する レセプタ一タンパク質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内には未 知のホルモンや神経伝達物質、 その他の生理活性物質も多く、 それらのレセプ夕 —タンパク質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに 、 既知のレセプ夕一タンパク質においてもサブタイプが存在するかどうかについ ても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプタータンパク質 との関係を明らかにすることは、 レセプタータンパク質に対するァゴニスト、 ァ ンタゴ二ストを含む医薬品開発に非常に重要な手段である。 しかし従来は、 レセ プタ一タンパク質に対するァゴニスト、 アンタゴニス卜を効率よくスクリーニン グし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプタータンパク質 の遺伝子の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であつ た。
また、 近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D NAの 配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られ た c D NAの断片配列が Expressed Seauence Tag (E S T) としてデータベース に登録され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 そ の機能を推定することは困難である。
従来、 Gタンパク質共役型レセプターとそのリガンドである生理活性物質との 結合を阻害する物質や、 結合して生理活性物質と同様なシグナル伝達を引き起こ す物質は、 これらレセプターの特異的なアン夕ゴニストまたはァゴニストとして 、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従って、 このように生体内 での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品開発の標的ともなりうる Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を新規に見出し、 その遺伝子 （例えば c D NA) をクローニングすることは、 新規 Gタンパク質共役型レセプ夕一夕ン パク質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アンタゴニストを見出す際に、 非常に 重要な手段となる。
しかし、 Gタンパク質共役型レセプ夕一はその全てが見出されているわけでは なく、 現時点でもなお、 未知の Gタンパク質共役型レセプター、 またそのリガン ドが同定されていない、 いわゆるォーファンレセプ夕一が多数存在しており、 新 たな Gタンパク質共役型レセプ夕一の探索および機能解明が切望されている。
Gタンパク質共役型レセプ夕一は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新た なリガンド （生理活性物質） の探索、 また、 該レセプタ一に対するァゴニストま たはアン夕ゴニストの探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見出されな くても、 該レセプ夕一の不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセプ夕一の生 理作用を解析することにより、 該レセプターに対するァゴニストまたはアン夕ゴ 二ストを作製することも可能である。 これら該レセプタ一に対するリガンド、 ァ ゴニストまたはアンタゴニストなどは、 Gタンパク質共役型レセプターの機能不 全に関連する疾患の予防 治療薬や診断薬として活用することが期待できる。 さらにまた、 Gタンパク質共役型レセプタ一の遺伝子変異に基づく、 生体での 該レセプターの機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合 も多い。 この場合には、 該レセプターに対するアンタゴニストやァゴニストの投 与だけでなく、 該レセプター遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への導入 や、 該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子治療に 応用することもできる。 この場合には該レセプタ一の塩基配列は遺伝子上の欠失 や変異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプターの遺伝子は 、 該レセプターの機能不全に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬に応用するこ ともできる。 発明の開示
本発明は、 上記のように有用な新規 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質 を提供するものである。 すなわち、 新規 Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク 質もしくはその部分べプチドまたはその塩、 該 Gタンパク質共役型レセプ夕一夕 ンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） を含有するポリヌクレオチド （D NA、 R NAおよび それらの誘導体） 、 該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 該組換えべ クタ一を保持する形質転換体、 該 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質また はその塩の製造法、 該 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 該 Gタンパク質共役型レセプタータンパ ク質の発現量を変化させる化合物、 該 Gタンパク質共役型レセプターに対するリ ガンドの決定方法、 リガンドと該 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質との 結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩のスグ リーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法もしくはス クリーニングキットを用いて得られうるリガンドと該 Gタンパク質共役型レセプ 夕一タンパク質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩、 およびリガンドと該 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質と の結合性を変化させる化合物 (アン夕ゴニス卜、 ァゴニス卜) もしくは該 Gタン パク質共役型レセプ夕一タンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩を 含有してなる医薬などを提供する。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト腎臓由来の新規な Gタンパク質共 役型レセプタータンパク質をコードする cDNAを単離し、 その全塩基配列を解 析することに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ 、 第 1〜第 7膜貫通領域が図 1に示される疎水性プロット上で確認され、 これら の c D N Aにコードされるタンパク質が 7回膜貫通型の G夕ンパク質共役型レセ プ夕ータンパク質であることを確認した。 本発明者らは、 これらの知見に基づい て、 さらに研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有することを特徴とする Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパ ク質またはその塩、
(2) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する上記 （1) 記載の G 夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩、
(3) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質の部分ぺプ チドまたはその塩、
(4) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードす るポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する上記 （5) 記載の DNA、
(7) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(8) 上記 （7) 記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体、 (9) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載の Gタンパク質 共役型レセプタ一タンパク質またはその塩を生成せしめることを特徴とする上記
(1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩の製造法、
(10) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質もしくは 上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(1 1) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグナ ル伝達を不活性化する中和抗体である上記 （10) 記載の抗体、
(12) 上記 （10) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(13) 上記 （10) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(14) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質もしくは 上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られうる上記 ( 1 ) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリ ガンド、
(15) 上記 （14) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一のリガンドを含有 してなる医薬、
(16) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは 上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする上記 （1 ) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩に対するリガン ドの決定方法、
(17) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質もしくは 上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンド と上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(18) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質もしくは 上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガン ドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(19) 上記 （17) 記載のスクリーニング方法または上記 （18) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 （1) 記載の Gタンパ ク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩、
(20) 上記 （19) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (21) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下 でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(22) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、
(23) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特 徴とする上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の mRNA の定量方法、
(24) 上記 （10) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の定量方法、
(25) 上記 （23) または上記 （24) 記載の定量方法を用いることを特徴 とする上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一の機能が関連する疾患の 診断方法、
(26) 上記 （23) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 （1) 記 載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法、
(27) 上記 （24) 記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜におけ る上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質量を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
(28) 上記 （26) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる上記 （1 ) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物 またはその塩、
(29) 上記 （27) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜に おける上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質量を変化させ る化合物またはその塩、
(30) 上記 （28) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (31) 上記 （29) 記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (32) 中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 循環器系疾患、 呼吸器系疾患 、 消化器系疾患、 免疫系疾患、 炎症性疾患または感染症の予防 ·治療剤である上 記 （13) 、 （15) 、 (20) 、 (30) または （31) 記載の医薬、
(33) 哺乳動物に対して、 上記 （19) 、 （28) または （29) 記載の化 合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 循環器系疾患、 呼吸器系疾患、 消化器系疾患、 免疫系疾患、 炎症 性疾患または感染症の予防 ·治療方法、
(34) 中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 循環器系疾患、 呼吸器系疾患 、 消化器系疾患、 免疫系疾患、 炎症性疾患または感染症の予防 ·治療剤を製造す るための上記 （19) 、 （28) または （29) 記載の化合物またはその塩の使 用等に関する。
さらには、
(35) タンパク質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号 ： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個 程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） の アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程 度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1 〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5 個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを 組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質である上記 （1) 記載の Gタン パク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩、
(36) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは その塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを 接触させることを特徴とす 上記 （16) 記載のリガンドの決定方法、
(37) リガンドが、 例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド 、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP (例、 Ρ ACAP 27、 P ACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシ卜ニン、 ァ ドレノメジユリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 P TH、 V I P (バソアクティブ ·インテスティナル ·ポリペプチド） 、 ソマトス タチン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシト ニンジーンリレーティッドぺプチド) 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカイン スーパーファミリー （例、 I L一 8、 GROa、 GRO/3、 GRO了、 NAP— 2、 ENA - 78、 GCP— 2、 PF4、 I P— 1 0、 M i g、 PBS F/SD F- 1などの CXCケモカインサブファミリー； MCAF/MCP- 1、 MCP — 2、 MCP— 3、 MCP - 4、 e o t ax i n、 R ANTES, M I P - 1 α 、 MI P_ l i3、 HCC— 1、 MI P - 3 «/LARC、 M I P - 3 β/ELC 、 1— 309、 TARC、 MI PF— 1、 M I PF— 2/e o t ax i n— 2、 MDC、 DC-CK 1/PARC, S L Cなどの C Cケモカインサブファミリー ； lymphotactinなどの Cケモカインサブファミリ一； fractalkineなどの CX 3 Cケモカインサブファミリ一等) 、 エンドセリン、 ェンテロガス卜リン、 ヒス夕 ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニ ン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) またはスフインゴシン 1—リン酸である上 記 （36) 記載のリガンドの決定方法、
(38) (i) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質も しくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンド とを接触させた場合と、 （i i) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕 一タンパク質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその 塩と、 リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特 徴とする上記 （1 7) 記載のスクリーニング方法、
(39) (i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセ プタータンパク質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくは その塩に接触させた場合と、 （i i) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくはその塩または上 記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識し たリガンドの上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしく はその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を 測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共 役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法、
(40) (i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセ プタータンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、 （i i) 標識したリガン ドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク 質を含有する細胞に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対す る結合量を測定し、 比較することを特徵とするリガンドと上記 （1) 記載の G夕 ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法、
(41) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセ プ夕ータンパク質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （i i) 標識し たリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプター タンパク質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガン ドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガン ドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(42) ( i) 標識したリガンドを上記 （8) 記載の形質転換体を培養するこ とによって該形質転換体の細胞膜に発現した Gタンパク質共役型レセプ夕一タン パク質に接触させた場合と、 （i O 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 ( 8 ) 記載の形質転換体を培養することによつて該形質転換体の細胞膜に発現し た Gタンパク質共役型レセプタータンパク質に接触させた場合における、 標識し たリガンドの該 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に対する結合量を測定 し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型 レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、
(43) ( i) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質ま たはその塩を活性化する化合物を上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕 —タンパク質を含有する細胞に接触させた場合と、 （i i ) 上記 （1) 記載の G タンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩を活性化する化合物および 試験化合物を上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を含有 する細胞に接触させた場合における、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1 ) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(44) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはそ の塩を活性化する化合物を上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって 該形質転換体の細胞膜に発現した G夕ンパク質共役型レセプタ一夕ンパク質に接 触させた場合と、 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質ま たはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （8) 記載の形質転換体 を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した Gタンパク質共役型レ セプ夕一タンパク質に接触させた場合における、 Gタンパク質共役型レセプター タンパク質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンド と上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(45) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を活性化 する化合物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキ二 ン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP (例、 PACAP 27、 P ACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシ卜ニン、 アドレノメジユリン 、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (バ ソアクティブ ·インテスティナル ·ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミ ン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジ一ンリレー ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジ ン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカインスーパーファミリ 一 （例、 I L一 8、 GROa、 GRO]3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA-78 、 GCP-2, PF4、 I P— 10、 M i g、 P B S F/S D F— 1などの C X Cケモカインサブファミリー； MCAF/MCP— 1、 MCP— 2、 MCP— 3 、 MCP_4、 e o t ax i n、 R ANTES, MI P— 1 α、 MI P— l jS、 HCC— 1、 M I P— 3 /LARC、 MI P— 3 3/ELC、 1—309、 T ARC, MI PF—1、 MI PF— 2/e o t ax i n— 2、 MDC、 DC— C K1/PARC、 SLCなどの CCケモカインサブファミリー； lymphotact inな どの Cケモカインサブファミリー； iractalkineなどの CX3 Cケモカインサブ ファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテ ンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニン、 リゾホスファ チジン酸 （LPA) またはスフインゴシン 1—リン酸である上記 （43) または (44) 記載のスクリーニング方法、
(46) 上記 （38) 〜 （45) 記載のスクリーニング方法で得られうるリガ ンドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(47) 上記 （38) ~ (45) 記載のスクリーニング方法で得られうるリガ ンドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩 との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(48) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質を含有す る細胞を含有することを特徴とする上記 （18) 記載のスクリーニング用キット 、
(49) 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質を含有す る細胞の膜画分を含有することを特徴とする上記 （18) 記載のスクリーニング 用キッ卜、
(50) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を含有することを特 徴とする上記 （18) 記載のスクリーニング用キット、
(51) 上記 （48) ~ (50) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質 またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、 (52) 上記 （48) 〜 （50) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 (1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴 とする医薬、
(53) 上記 （10) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レ セプ夕一タンパク質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接 触させることを特徴とする上記 （1) の Gタンパク質共役型レセプタータンパク 質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
(54) 上記 （10) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 （1) 記 載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは上記 （3) 記載の部分べ プチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 (1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくは上記 （3) 記載 の部分ペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の上記 (1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくは上記 （3) 記載 の部分ペプチドまたはその塩の定量法、 および
(55) 被検液と担体上に不溶化した上記 （10) 記載の抗体および標識化さ れた上記 （10) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化 担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチ ドまたはその塩の定量法等を提供する。
I
図面の簡単な説明
図 1は TGR30の疎水性プロット図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質 （以下、 レセプタータンパ ク質と略記する場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タンパク質である。 本発明のレセプタータンパク質は、 例えば、 ヒトやその他の哺乳動物 （例えば 、 モルモット、 ラッ卜、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど) のあ らゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 ]3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維 芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞 、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球 ) 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝 細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞 など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床 下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄 、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓 、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関 節、 骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク質であ つてもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましく は約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上 、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 公知の方法に 準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法ゃスク リ一ニング方法に従つて測定することができる。
また、 本発明のレセプ夕一タンパク質としては、 ①配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好まし くは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失し たアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好まし くは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のァミノ 酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァ ミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
本明細書におけるレセプ夕一タンパク質のアミノ酸配列は、 ペプチド標記の慣 例に従って、 左端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一タンパク 質をはじめとする、 本発明のレセプタータンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 (- C O O H) 、 カルポキシレー卜 (—C O O-) 、 アミド （_ C O NH 2) ま たはエステル （― C O O R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n —ブチルなどの C ^ 6アルキル基、 例えば、 シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 —ナフチルなどの C 6— 1 2ァリ一ル基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー C アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C ！ _ 2アルキル基などの C 7— 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用 されるピバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプタータンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または力ルポ キシレー卜) を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化さ れているものも本発明のレセプ夕一タンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した 末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセプタータンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルな どの C 2_6アルカノィル基などの 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル夕ミル基がピ口ダル夕ミン酸化したもの 、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 — OH、 — S H、 アミノ基、 ィ ミダゾ一ル基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホ ルミル基、 ァセチルなどの C 2 _ 6アル力ノィル基などの C〗 _ 6ァシル基など) で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合 タンパク質なども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号 1で表 わされるァミノ酸配列を含有するレセプ夕一夕ンパク質などが用いられる。 本発明のレセプタータンパク質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記す る場合がある） としては、 上記した本発明のレセプタータンパク質の部分べプチ ドであれば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプ夕一タンパク 質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 実質的に同質の活性を 有するものなどが用いられる。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 例えばリガンド結合活性を示す。 リガ ンド結合活性の測定は上記と同様に行なうことができる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプ夕一タン パク質の部分べプチドとしては、 図 1に示される疎水性プロット解析において細 胞外領域 （親水性 （Hydrophi l ic) 部位） であると分析された部分を含むぺプチ ドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含むペプチドも同様に用 いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数の ドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸数は、 上記した本発明のレセプタータンパク 質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 よ り好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 % 以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列を示す。
また、 本発明の部分ペプチドは、 ①上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （ 好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸 が欠失し、 ②上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程 度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のァ ミノ酸が付加し、 または③上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で g換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （― C O OH) 、 カル ポキシレート （一 C O O— ) 、 アミド （_ C O NH 2) またはエステル （一 C O O R) の何れであってもよい （Rは前記と同意義を示す） 。 本発明の部分べプチ ドが C末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有している場合 、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分べ プチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエス テルなどが用いられる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明のレセプタータンパク質 と同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子 内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸また は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 (例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロ ピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚 酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられ る。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩は、 上記したヒトやその他の哺乳 動物の細胞または組織から公知のレセプ夕一タンパク質の精製方法によって製造 することもでき、 後に記載する本発明のレセプタータンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また 、 後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。 ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトやその他の 哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 得ら れた抽出液を逆相クロマトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィ一などのク 口マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩または そのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ る。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹 脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジ ルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエ二ルァセ卜アミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹 脂、 4— ( 2， , 4， ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル) フエノキシ樹 脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' ージメトキシフエ二ル— F m o cアミノエチル) フエノキ シ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 a—ァミノ基と側鎖 官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質またはペプチドのァ ミノ酸配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最 後に樹脂からタンパク質またはペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し 、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のタン パク質もしくは部分べプチドまたはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができる力 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' ― ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対応する酸無水物また は HO B tエステルあるいは H〇O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸 の活性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセ卜アミド、 N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジンなどのアミン類、 ジォキサン、 テトラヒドロフラ ンなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用 いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい る範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリ ン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うこと なく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰 り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ ールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕一シャリーペンチ ルォキシカルボニル、 ィソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォ キシカルボニル、 C 1 _ Z、 B r— Z、 7ダマンチルォキシカルボニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフィノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シク口才クチル、 2ーァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステ ル、 4—二卜口べンジルエステル、 4ーメ卜キシベンジルエステル、 4—クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 ターシャリーブトキシカルポニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また 、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル 基、 t一プチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 1 2 - B z し 2—二トロベンジル、 B r— Z、 夕ーシャリーブチルなどが用いられる ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 T o s、 4—メトキシ 一 2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル 、 B um、 B o c、 T r t、 Fm o cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール (例えば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2 , 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 H ON B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N —ヒドロキシフタルイミド、 HO B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 ° (：〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1 , 2一エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノ一ル処理により除去され 、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2一エタンジチオール、 1 , 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力ルポキシ末 端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端のひ ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し 、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製 手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミ ド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸のひ一 力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで さる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のペプチドの合成法 に従つて、 あるいは本発明の夕ンパク質を適当なぺプチダーゼで切断することに よって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法 、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のタンパク質を構成し 得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を 有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができ る。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載され た方法が挙げられる。
(DM. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i, ペプチド シンセシス （Pept ide Synth es is) , Interscience Publ ishers, New York (1966年)
② Scliroederおよび Luebke、 ザ ペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205 、 （1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィ一 ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のレセプ夕一夕ンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記 した本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする塩基配列 （D NAまたは R NA 、 好ましくは D NA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該 ポリヌクレオチドとしては、 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NA 、 mR NA等の R NAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本 鎖の場合は、 二本鎖 D NA、 二本鎖 R NAまたは D NA： R NAのハイプリッド でもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アン チセンス鎖 （すなわち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプ夕一タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 公知 の実験医学増刊 「新 P C Rとその応用」 15 (7)、 1997記載の方法またはそれに準 じた方法、 例えば、 TadMan PCRなどの方法により、 本発明のレセプタ一タンパク 質の mR NAを定量することができる。
本発明のレセプタータンパク質をコードする D NAとしては、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 上記した細胞，組織由来の c D NA、 上記した細胞 '組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのいずれでもよい。 ライブラリ 一に使用するべク夕一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファー ジミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より t o t a l RNAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する） によって増幅 することもできる。
具体的には、 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NAとしては、 例 えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D N Aとハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズする D N Aを有し、 本発明のレセプタータンパク質と実質的に同質の 活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプ夕一 タンパク質をコードする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D NAとハイストリンジェン卜な 条件下でハイブリダィズする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされ る塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 % 以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイプリダイゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , C old Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライプラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条 件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 1 9〜 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜2 O mMで、 温度が約 5 0〜7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °C の場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕 一タンパク質をコードする D N Aとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列 を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NAの塩基配列の一部、 または 該 D NAと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記 の本発明の部分ペプチドをコードする D N Aを包含するだけではなく、 R NAを も包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質遺伝子の複製また は発現を阻害することのできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） を、 ク ローン化した、 あるいは決定された Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を コードする D NAの塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌ クレオチド （核酸） は、 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質遺伝子の R N Aとハイプリダイ,ズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害すること ができるか、 あるいは Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質関連 R N Aとの 相互作用を介して Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質関連 R NA の選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および Gタンパク質共役型レセ プ夕一タンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌ クレ才チドは、 生体内および生体外で G夕ンパク質共役型レセプター夕ンパク質 遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断 に有用である。 また、 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝子の 5 ' 端 ヘアピンループ、 5， 端 6 _ベースペア . リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリべ プチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端 非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好まし い対象領域として選択しうるが、 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質遺伝 子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 、 即ち、 対象物とハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドとの関係は 、 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス 'ポリヌクレオチ ドは、 2—デォキシ一 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオ チド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販のタンパク質、 核酸および合 成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー （ 但し、 該ポリマ一は D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングや塩 基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 そ れらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D NA、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （ または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例 えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化され たもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレ ォチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホ スホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷 を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチ ォエートなど） を持つもの、 例えばタンパク質 (ヌクレアーゼ、 ヌクレアーゼ · インヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や 糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インター 力レート化合物 (例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど) を持つもの、 キレート化 合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有 するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 ひァノマ一型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレ ォチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでな く、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こう した修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリン およびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾され たヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよ く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲン、 脂肪族基などで置換されていてもよ く、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 RNA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。
このような修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al . , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. C rooke et al. ed. , Ant isense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチォン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5， 端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌ クレア一ゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用 の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのダリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それ に限定されるものではない。
、核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の生体内 や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は、 公知の各種の方法で 細胞に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 上記した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 上記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのい ずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細 胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 RT— PCR法によって 増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 （ 1) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または （2) 配列番号： 2で表わされる DNAとハイストリンジェント な条件下でハイブリダィズする DNAを有し、 本発明のタンパク質ペプチドと実 質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有す るタンパク質をコードする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられ る。
配列番号： 2で表わされる DN Aとハイストリンジェントな条件でハイブリダ ィズする D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好まし くは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセ プ夕一タンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクロー二 ングの手段としては、 本発明のペプチドをコードする DN Aの塩基配列の部分塩 基配列を有する合成 DNAプライマ一を用いて PCR法によって増幅するか、 ま たは適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明のレセプタータンパク質の一部 あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DNAを用いて標識したも のとのハイブリダィゼーシヨンによつて選別することができる。 ハイブリダイゼ —シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Molecular Cloning ) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の 方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場 合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の置換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™— super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 MutanTM_K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA— LA PCR法、 gapped duplex法、 Kimkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる 方法に従って行なうことができる。
クロ一ン化されたレセプ夕一タンパク質をコードする DNAは目的によりその まま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用 することができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATG を有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合 成 DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のレセプタータンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のレ セプ夕一タンパク質をコードする DNAを含む DNA (例えば、 cDNA) から 目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現べクタ一中 のプロモータ一の下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pCR4、 p CR 2. 1、 pBR322、 pBR325、 pUC12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラス ミド （例、 pUB 110、 pTP 5、 p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19、 p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイ ルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρ A 1— 11、 pXT 1、 pRc/CMV、 pRc/RS V、 p cDNA I /N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモータ一、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV— TKプロモーターなどが挙げられる これらのうち、 CMVプロモータ一、 S R プロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l acプ ロモ一ター、 r e cAプロモーター、 λΡ^プロモーター、 l ppプロモ一夕一 などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモータ一、 SP02プ 口モーター、 p e n pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH05プ 口モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターな どが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモー夕一、 P 1 0プロモータ一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V400 r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne o1"と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r~) 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マ一カーとして 使用する場合、 チミジンを含まない培地によっても目的遺伝子を選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプタータン パク質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA •シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場 合は、 ひ一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿 主が酵母である場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 一インタ一フ エロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された本発明のレセプタ一タンパク質をコードする DN A を含有するベクターを用いて、'形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア，コリ （Escherichia col i ) K 12 · DH1 〔プロシ一ジングズ.ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー ·ォ ブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160 (1968)) 、 JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ ·リサーチ （Nucl eic Acids Research) ， 9巻， 309 (1981)] 、 J A221 〔ジャーナル ·ォブ' モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Biology) ， 120巻， 517 ( 1978)〕 、 HB 101 〔ジャーナル 'ォブ ·モレキュラー 'バイオロジー， 41巻 ， 459 (1969)〕 、 C 600 〔ジェネティックス （Genetics) , 39巻， 440 (1954) 〕 、 DH5 a CInoue, H. , Noj ima, H. and Okayama, H. , Gene, 96, 23-28 (19 90)〕 ， DH10B 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 87 巻, 4645-4649 (1990)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·ズ チルス （Bacillus subtilis ) M I 114 〔ジーン, 24巻, 255 (1983)〕 、 207 -21 〔ジャーナル ·オフ' -バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1984)〕 などが 用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレピシェ （Saccharomyces cere visiae) AH22、 AH22R -、 NA87— 11A、 DKD - 5D、 20 B- 12、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ （Sdiizosacclmromyces pombe) NCYC 1913、 NCYC 2036, ピキア 'パストリス （Pichia pastoris) などが 用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 ョトウガの幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の H i gh F i ve TM細胞 、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用い られる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 カイコ由来株化細胞 （Bombyx mod N ； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン'ヴィポ (In Viv o) , 13, 213-217 (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 (Nature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7、 Ve r o、 チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子欠損チヤィニ —ズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r~) 細胞と略記） 、 マウス L細胞， マウス A t T— 20、 マウスミエ口一マ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL 細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ.サイェンジィズ.ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) ， 17巻， 1 07 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ ル 'ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 111 (1979) などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ*イン 'ェンザィモロジ一 （Meth ods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ •ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法に従って 行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロジー （Bi o/Technology) ， 6, 47-55 (1988) )などに記載の方法に従って行なうことができ る。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一 （Virology) ， 52巻 ， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードする DN Aを含有する発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Mi l ler) ， ジャーナル'ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン ·モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecu lar Genet ics) , 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例えば 、 3 ;6—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ルダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bost ian, K. L. ら、 プロシージングズ-ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エス エー （Proc. Nat l. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミ ノ酸を含有する S D培地 〔Bi t ter, G. A. ら、 プロシ一ジングズ 'ォブ ·ザ ·ナ ショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 (Proc . Nat l. Acad. Sc i. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の p Hは 約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0 ^〜 3 5でで約 2 4〜 7 2 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , ネイチヤー (Nature) , 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 7 で 約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜2 0 %の胎児牛血清を含む ME M培地 〔サイエンス （Science) , 122巻， 501 (1952) ] , D ME M培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1959)〕 ， R P M I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メディカル ·ァソシェ ーシヨン （The Journal of the American Medical Associat ion) 199卷， 519 (1 967)〕 ， 1 9 9培地 〔プロシ一ジング 'ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ · バイオロジカル ·メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが 好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じ て通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の G夕 ンパク質共役型レセプタータンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のレセプタータンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法により行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際して は、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁 し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞 を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプタータンパク質の粗抽出液を得る 方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク 質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方 法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプ夕一夕 ンパク質の精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなど の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。
このようにして得られるレセプ夕一タンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩 で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または 他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するレセプタータンパク質を、 精製前または精製後に適 当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリ ペプチドを部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例え ば、 卜リプシン、 キモトリブシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテイン キナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のレセプタ一タンパク質またはその塩の活性は 、 標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアツ セィなどにより測定することができる。
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対す る抗体は、 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分べプチドまたはその 塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れ であってもよい。
本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 （以下 、 本発明のレセプタータンパク質等と略記する場合がある） に対する抗体は、 本 発明のレセプタータンパク質等を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製 造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のレセプ夕一タンパク質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が 可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジ ュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程 度行なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モ ルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラット が好ましく用いられる。
モノク口一ナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプタ一タンパク質 等と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することに より行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルス夕 インの方法 〔ネイチヤー （Nature) 、 256巻、 495頁 （1975年） 〕 に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G ) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0などが挙げら れるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好 ましくは、 P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加 され、 約 2 0〜 4 0 °C、 好ましくは約 3 0〜 3 7 °Cで約 1〜 1 0分間ィンキュベ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプタータンパク質等の抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し 、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） または プロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上 清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質等を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培地と しては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い 。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1 ~ 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S FM— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の 抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一ナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のタンパク質等の抗原） とキ ャリア一タンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプタータンパク質 等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造でき る。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キャリア一タンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ' リンペット 'へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドゃカルボジィミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。
本発明のレセプ夕一タンパク質またはその塩、 その部分べプチドまたはその塩 、 および該レセプ夕一夕ンパク質またはその部分べプチドをコードする D N Aは 、 ( 1 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質に対するリガンド （ ァゴニスト） の決定、 （2 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質 の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤.、 （ 3 ) 遺伝子診断剤、
( 4 ) 本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ せる化合物のスクリーニング方法、 (.5 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質または その部分ペプチドの発現量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および /または治療剤、 （6 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質に対 するリガンドの定量法、 （7 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク 質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 (ァゴニスト、 アンタゴニス卜など ) のスクリーニング方法、 （8 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパ ク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、 （9 ) 本発明のレセプ夕一夕 ンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、 （1 0 ) 細胞膜におけ る本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合 物のスクリーニング方法、 （1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク 質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防お よび/または治療剤、 （1 2 ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体による中和、 （1 3 ) 本発明の Gタンパク質 共役型レセプ夕一タンパク質をコードする D NAを有する非ヒトトランスジェニ ック動物の作製などに用いることができる。
特に、 本発明の組換え型 Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の発現系を 用いたレセプター結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトやその他の哺乳動 物に特異的な Gタンパク質共役型レセプターに対するリガンドの結合性を変化さ せる化合物 (例、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすること ができ、 該ァゴ二ストまたはアン夕ゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとし て使用することができる。
本発明のレセプタータンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のレセプ夕一タンパク質等と略記する場合がある） 、 本発明のレセプター夕 ンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと 略記する場合がある） および本発明のレセプタータンパク質等に対する抗体 （以 下、 本発明の抗体と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明 する。
( 1 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質に対するリガンド （ ァゴニスト） の決定
本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩または本発明の部分べプチドも しくはその塩は、 本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対するリガンド (ァゴ二スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその塩または本 発明の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴と する本発明のレセプ夕一タンパク質に対するリガンドの決定方法を提供する。 試験化合物としては、 公知のリガンド (例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシ ン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシ卜シン、 Ρ ACAP (例、 PACAP 27、 PACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 AC TH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ ·インテスティナル ·アンド ' リレイテッド ·ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミ リン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン 、 アデノシン、 アドレナリン、 ケモカインスーパーファミリー (例、 I L— 8、 GROa、 GRO]3、 GROァ、 NAP- 2, ENA— 78、 GCP— 2、 PF 4、 I P— 10、 M i g、 PBS FZSDF— 1などの CXCケモカインサブフ アミリー； MCAF/MCP— 1、 MCP_2、 MCP— 3、 MCP— 4、 e o t ax i n、 RANTES、 MI P— 1 «、 MI P— 1 )3、 HCC— 1、 M I P — 3 a/LARC、 M I P- 3 1— 309、 TARC、 MI PF—
1、 M I P F— 2/e o t a x i n— 2、 MDC、 DC— CK1/PARC、 S LCなどの CCケモカインサブファミリー； lymphotac t inなどの Cケモカインサ ブファミリ一； fractalkineなどの CX3ケモカインサブファミリ一等） 、 ェン ドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パン クレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸など） の他に、 例えば、 ヒトまたはその他の哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細 胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本発 明のレセプ夕一夕ンパク質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプ夕一タンパク質も しくはその部分べプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプター タンパク質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用 いることによって、 本発明のレセプタータンパク質に結合して細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o s活性化、 p Hの低下などを促進する活 性または抑制する活性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法で ある。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプ夕一タンパク質または その部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプ夕一夕 ンパク質または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性な どを測定することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識した試験化合物を、 本発明のレセプタータンパク質もしくはその塩また は本発明の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試 験化合物の該夕ンパク質もしくはその塩、 または該部分べプチドもしくはその塩 に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプタ一タンパク質また はその塩に対するリガンドの.決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一タンパク質を含有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞また は該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプタータン パク質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NA を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一夕 ンパク質に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプ夕一タンパ ク質またはその塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕 一夕ンパク質に対するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞に接触させた 場合における、 レセプタータンパク質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキド ン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細 胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制 する活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一タンパク質また はその塩に対するリガンドの決定方法、 および
⑤試験化合物を、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする DNAを含有す る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプタータンパク質 に接触させた場合における、 レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性 （例え ば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cA MP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内タンパク質のリン酸化、 c_ f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活 性または抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプター夕 ンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一タンパク 質に結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプタータンパク質としては、 上記した本 発明のレセプタータンパク質または本発明の部分ペプチドを含有するものであれ ば何れのものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプ夕一夕 ンパク質が適している。
本発明のレセプ夕一タンパク質を製造するには、 上記の発現方法が用いられる が、 該レセプ夕ータンパク質をコードする DNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発 現することにより行なうことが好ましい。 目的とするタンパク質部分をコードす る DNA断片には、 通常、 cDNAが用いられるが、 必ずしもこれに制約される ものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DNAを用いてもよい。 本発明のレセ プ夕ータンパク質をコードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効 率よく発現させるためには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルス に属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NP V) のポリへ ドリンプロモーター、 S V40由来のプロモ一夕一、 レトロウイルスのプロモー ター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒトヒートショックプロモーター、 サイ トメガロウィルスプロモーター、 SR プロモー夕一などの下流に組み込むのが 好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査は公知の方法で行うことができる 。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミ ストリー (J. Biol. C em. ) ， 267巻， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法 に従って行うことができる。
したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプタータンパ ク質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものとしては、 公知の方 法に従って精製したレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩であってもよいし、 該レセプ夕ータンパク質を含有する細胞またはその細胞膜 画分を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一タンパク質を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞としては、 本発明のレセプ夕一 タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌 、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （Kinema tica社製） による破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧しながら 細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細胞膜の分 画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と して用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500〜3000 r pm) で短時 間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000〜 3000 O r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画 分中には、 発現したレセプ夕一タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質 などの膜成分が多く含まれる。
該レセプ夕ータンパク質を含有する細胞やその膜画分中のレセプ夕一夕ンパク 質の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107 分子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結 合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるば かりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対するリガンドを決定する上記 の①〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプタータンパク質画分と、 標識 した試験化合物が必要である。
レセプ夕一タンパク質画分としては、 天然型のレセプ夕一夕ンパク質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここ で、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示 す。
標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 [14C] , 〔35S〕 な どで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン 、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プ リン、 バソプレツシン、 ォキシ卜シン、 PACAP (例、 PACAP 27、 PA CAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソ アクティブ ·インテスティナル ·アンド ·リレイテッド ·ポリペプチド） 、 ソマ トス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カル シトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアス夕チ ン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 7ドレナリン、 ケモカ インスーパーファミリ一 （例、 I L—8、 GROひ、 GROj3、 GR〇ァ、 NA P— 2、 ENA- 78、 GCP - 2、 PF4、 I P— 10、 M i g、 P B S F/ SDF— 1などの CXCケモカインサブファミリー； MCAFZMCP— 1、 M CP— 2、 MCP— 3、 MCP— 4、 e o t ax i n、 RANTES、 MI P— 1 α、 MI P - 1 ]3、 HCC - 1、 M I P - 3 α/L AR C、 M I P - 3 β/Ε LC、 卜 309、 TARC、 MI PF— 1、 MI PF—2/e o t ax i n_ 2、 MDC、 DC— CK 1/PARC、 S L Cなどの C Cケモカインサブフアミ リー； lymphotactinなどの Cケモカインサブファミリー； fractalkineなどの C X 3ケモカインサブファミリ一等） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス 夕ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラ ニン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸などが好適 である。
具体的には、 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンドの 決定方法を行なうには、 まず本発明のレセプ夕一タンパク質を含有する細胞また は細胞の膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプタ —標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリ ン酸バッファ一、 トリス一塩酸バッファーなどのリガンドとレセプタ一タンパク 質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結 合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n- 80™ (花王—アトラス社 ) 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼ ラチンなどの各種タンパク質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロ テアーゼによるリセプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で P M S F、 ロイぺプ チン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤 を添加することもできる。 0. 01〜1 Om 1の該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （ 5000〜500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るため に大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°C 〜50°C、 望ましくは約 4°C〜37°Cで、 約 20分〜 24時間、 望ましくは約 3 0分〜 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファー で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウ ンターあるいはァーカウンターで計測する。 全結合量 （B) から非特異的結合量 (NSB) を引いたカウント （B— NSB) が 0 c pmを越える試験化合物を本 発明のレセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） とし て選択することができる。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩に対するリガンドを決定する上記 の④〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプ夕一タンパク質を介する細胞刺激 活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電 位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 : f o sの活性化、 pHの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キット を用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 レセプタータンパク質を含 有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあた つては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交 換し、 試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あ るいは上清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細 胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含 有する分解酵素によつて検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加し てアツセィを行なってもよい。 また、 CAMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生 抑制作用として検出することができる。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩に結合するリガンド決定用キット は、 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその塩、 本発明の部分ペプチドもし くはその塩、 本発明のレセプタータンパク質を含有する細胞、 または本発明のレ セプタ一タンパク質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。
1. リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清ァ ルブミン (シグマ社製) を加えたもの。
孔径 0. 45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質標品
本発明のレセプタータンパク質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37° ( 、 5 % C02、 95% a i rで 2日間培養 したもの。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 ま たは適当な方法で標識化したもの 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20でにて保存し、 用時に測定用緩衝夜 にて 1 Μに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチルホル ムアミド、 DMS〇、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタ一タンパク質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 lm 1で 2回洗浄した後、 490 21の測定用緩衝 液を各穴に加える。
②標識試験化合物を 5 a 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験化合物を 5 β 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0. 2N NaOH— 1% SDSで溶解し、 4mlの液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンター (ベックマンコ一ル夕一社製) を用いて放 射活性を測定する。
本発明のレセプタータンパク質またはその塩に結合することができるリガンド としては、 例えば、 視床下部、 大脳皮質、 結腸癌、 肺癌、 心臓、 胎盤、 肺などに 特異的に存在する物質などが挙げられ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべ シン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン 、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシ卜シン、 PACAP (例、 PACAP 27、 PACAP 38) 、 セクレチン、 グルカゴン 、 カルシトニン、 ァドレノメジユリン、 ソマ卜ス夕チン、 GHRH、 CRF、 A CTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ 'インテスティナル ·アンド · リレイテッド ·ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 ァ ミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド ) 、 ロイコトリエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサ ン、 アデノシン、 7ドレナリン、 ケモカインスーパーファミリー (例、 I L- 8 、 GROa、 GROi3、 GRO了、 NAP- 2, ENA_78、 GCP_2、 P F4、 I P— 10、 M i g、 PBS F/SDF— 1などの CXCケモカインサブ ファミリー； MCAF/MCP— 1、 MCP— 2、 MCP - 3、 MCP - 4、 e o t ax i n、 RANTES、 MI P - 1 α、 ΜΙ Ρ— 1 3、 HCC - 1、 MI Ρ- 3 α/LARCs MI P— 3 /3/ELC、 1— 309、 TARC、 MI PF — 1、 M I P F- 2/e o t a x i n- 2, MDC、 DC— CK1/PARC、 SLCなどの CCケモカインサブファミリー； lymphotacUnなどの Cケモカイン サブファミリー； fractalkineなどの CX3ケモカインサブファミリ一等） 、 ェ ンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 ンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 (LPA) 、 スフインゴシン 1—リン酸などが用いられる。
(2) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の機能不全に関連す る疾患の予防および Zまたは治療剤
上記 （1) の方法において、 本発明のレセプタータンパク質に対するリガンド が明らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプター夕 ンパク質または②該レセプ夕一タンパク質をコードする DNAを、 本発明のレセ プ夕ータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤などの 医薬として使用することができる。
例えば、 生体内において本発明のレセプ夕一夕ンパク質が減少しているために リガンドの生理作用が期待できない （該レセプタータンパク質の欠乏症） 患者が いる場合に、 ①本発明のレセプタータンパク質を該患者に投与し該レセプタ一夕 ンパク質の量を補充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプタータンパク質をコードす る DNAを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる 細胞に本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする DN Aを挿入し発現させた後 に、 該細胞を該患者に移植することなどによって、 患者の体内におけるレセプ夕 一タンパク質の量を増加させたりして、 リガンドの作用を充分に発揮させること ができる。 すなわち、 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする DNAは、 安 全で低毒性な本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび/または治療剤として有用である。
本発明のレセプ夕一夕ンパク質は、 G夕ンパク質共役型レセプ夕一夕ンパク質 である P 2 Y 1 ( P 2 Yプリノセプター 1 ) (LEON C. , VIAL C. , CAZENAVE J. P .， and GACHET C. GENE 171 : 295-297 (1996) ： AYYANATHAN K. , TANIA W. , HARBAN SJIT S. , RAGHBIR A. S. , BARNARD E. A. , and KUNAPULI S. P. BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. 218 : 783-788 (1996) ： JANS SENS R.， COMMUNI D. , PIROTTON S. , S AMSON M. , PARMENTIER M. , and BOEYNAEMS J. M. BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMU N. 221 : 588-593 (1996) ) にアミノ酸配列レベルで、 3 6 %程度の相同性が認めら れる新規 7回膜貫通型レセプ夕一タンパク質である。
本発明のレセプタータンパク質または該レセプタ一タンパク質をコードする D NAは中枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病、 痴呆、 摂食障害など）、 内分泌疾患 (例えば、 高血圧症、 性腺機能異常、 甲状腺機能異常、 下垂体機能異常など)、 代 謝疾患 (例えば、 糖尿病、 脂質代謝異常、 高脂血症など)、 癌 （例えば、 非小細胞 肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌な ど） 、 循環器系疾患 （例えば、 狭心症、 心筋梗塞など） 、 呼吸器系疾患 （例えば 、 気道閉塞性疾患、 感染性肺疾患など） 、 消化器系疾患 （例えば、 胃潰瘍、 十二 指腸潰瘍、 胃炎、 逆流性食道炎など） 、 免疫系疾患 （例えば、 自己免疫性疾患な ど） 、 炎症性疾患 （例えば、 アレルギー、 喘息、 リュウマチなど） 、 感染症 （例 えば、 免疫機能不全、 肺炎、 インフルエンザなど） などの予防および Zまたは治 療に有用である。
本発明のレセプタータンパク質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常 套手段に従って製剤化することができる。
一方、 本発明のレセプタータンパク質をコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明 の D NAを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 ァ デノウィルスァソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入し た後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D N Aは、 そのままで 、 あるいは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲル力テ一テ ルのようなカテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明のレセプ夕一タンパク質または②該レセプタ一タンパク質を コードする D NAは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル 剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬 学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口 的に使用できる。 例えば、 ①本発明のレセプ夕一タンパク質または②該レセプ夕 —タンパク質をコードする D NAを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤 実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるように するものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C〇一 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよレ^
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一ルなど ) 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
本発明のレセプタ一タンパク質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜； L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することが できる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 O kgとして） に おいては、 一日につき約 0. 1〜； L 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1 回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例え ば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O kgとして） においては、 一日に つき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒ卜またはその他の 哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ 、 サルなど） における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを コードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができる ので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用 である。
本発明の D NAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや P C R— S S C P法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 8 74〜879頁 （1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー •ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー （Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America) ， 第 86巻， 2766〜277 0頁 （1989年） ) などにより実施することができる。
( 4 ) 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化 させる化合物のスクリーニング方法
本発明の D NAは、 プロ一ブとして用いることにより、 本発明のレセプ夕一夕 ンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニング に用いることができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器 、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （i i ) 形質転換体等に含まれ る本発明のレセプタ一タンパク質またはその部分べプチドの m R N A量を測定す ることによる、 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量 を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチドの m R N A量の測定は 具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット 、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗 痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肺、 大腸など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチ ドの mR NAは、 例えば、 通常の方法により細胞等から mR N Aを抽出し、 例え ば、 TaQMan PCRなどの手法を用いることにより定量することができ、 公知の手段 によりノザンプロットを行うことにより解析することもできる。
( i i ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体を上記の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプ 夕一タンパク質またはその部分ペプチドの mR NAを同様にして定量、 解析する ことができる。
本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる 化合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒ卜哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （ 3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞に含まれる本発明のレセプタ一タンパク質 またはその部分ペプチドの mR NA量を定量、 解析することにより行なうことが でさ、
( i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ 、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプタータンパク質ま たはその部分ペプチドの mR NA量を定量、 解析することにより行なうことがで さる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明 のレセプタ一タンパク質またはその部分べプチドの発現量を変化させる作用を有 する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプタータンパク質またはそ の部分べプチドの発現量を増加させることにより、 Gタンパク質共役型レセプタ 一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細 胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c _ f o sの活性化 、 pHの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物 、 （口） 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を減少 させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であっても、 公知の 化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等の生 理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプタータンパク質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとするこ とができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば、 癌患者 （6 O kgと して） においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は 、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なる が、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O k gとして） においては 、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる
(5) 本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチドの発現量を変化 させる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤 本発明のレセプタ一タンパク質は上記のとおり、 例えば、 中枢機能など生体内 で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 本発明のレセ プ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発 明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療 剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニドール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 80TM、 HCO-50 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌症患者 （6 O kgとして） においては 、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる
(6) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質に対するリガンドの 定量法
本発明のレセプタータンパク質等は、 リガンドに対して結合性を有しているの で、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプタータンパク質等と接触させること によって被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば 、 以下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いる ことができる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
( 7 ) 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合 性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング方 法
本発明のレセプ夕一タンパク質等を用いるか、 または組換え型レセプタ一タン パク質等の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプター結合アツセィ系を用い ることによって、 リガンドと本発明のレセプ夕一夕ンパク質等との結合性を変化 させる化合物 （例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合 物、 発酵生産物など） またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる このような化合物には、 （ィ） Gタンパク質共役型レセプ夕一を介して細胞剌 激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離 、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c _ f o sの活性化、 p Hの低下など を促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明の レセプタ一タンパク質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない 化合物 （いわゆる、 本発明のレセプタータンパク質に対するアンタゴニスト） 、
(ハ） リガンドと本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力 を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の Gタンパク質共役型レセ プタータンパク質との結合力を減少させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ ィ） の化合物は、 上記したリガンド決定方法によってスクリーニングすることが 好ましい） 。
すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i ) 本発明のレセ プ夕ータンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試 験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発 明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i ) の場合における、 例えば、 該レセプ夕ータンパク質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性な どを測定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明のレセプタ一タンパク質等に接触させた場合と 、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質等に接触 させた場合における、 標識したリガンドの該レセプ夕一夕ンパク質等に対する結 合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一タンパ ク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本 発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させ た場合における、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタータンパク質等と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現したレセプ夕一タンパク質等に接触させた場合と、 標識 したリガンドおよび試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養す ることによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させ た場合における、 標識したリガンドの該レセプタータンパク質等に対する結合量 を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプタ一タンパク質 等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④本発明のレセプ夕一タンパク質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレ セプ夕—夕ンパク質等に対するリガンドなど） を本発明のレセプタ一夕ンパク質 等を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明のレセプタータンパク質等を活性 化する化合物および試験化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細 胞に接触させた場合における、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成 、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タン パク質のリン酸化、 c一： 0 sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または 抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレ セプタ一タンパク質等との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、 および
⑤本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレ セプ夕一タンパク質等に対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク 質等に接触させた場合と、 本発明のレセプタータンパク質等を活性化する化合物 および試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養することによつ て細胞膜上に発現した本発明のレセプタータンパク質等に接触させた場合におけ る、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコ リン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c _ f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定 し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明のレセプ夕一タンパク質等が得られる以前は、 Gタンパク質共役型レセ プ夕ーァゴニス卜またはアン夕ゴニストをスクリーニングする場合、 まずラット などの Gタンパク質共役型レセプタータンパク質を含む細胞、 組織またはその細 胞膜画分を用いて候補化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化 合物が実際にヒトの Gタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結 合を阻害するか否かを確認する試験 (二次スクリーニング) が必要であった。 細 胞、 組織または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプ夕一タンパク質も混在 するために、 目的とするレセプタータンパク質に対するァゴニストまたはアン夕 ゴニストを実際に直接的にスクリーニングすることは困難であった。
しかしながら、 例えば、 本発明のヒト由来レセプタータンパク質を用いること によって、 一次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと Gタンパク質共役 型レセプ夕一タンパク質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングす ることができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアン夕ゴ ニストかを簡便に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプタータンパク質等 としては、 上記した本発明のレセプタータンパク質等を含有するものであれば何 れのものであってもよいが、 本発明のレセプタータンパク質等を含有する哺乳動 物の臓器の細胞膜画分が好適である。 し力 ^し、 特にヒト由来の臓器は入手が極め て困難なことから、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用い て大量発現させたヒト由来のレセプタータンパク質等などが適している。
本発明のレセプタ一タンパク質等を製造するには、 上記の方法が用いられるが 、 本発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ま しい。 目的とするタンパク質部分をコードする D N A断片には c D NAが用いら れるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 本発明のレセプ夕一タンパク質をコードする D NA断片を 宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を 昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuc lear poly hedros is virus； N P V) のポリヘドリンプロモー夕一、 S V 4 0由来のプロモ —ター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタロチォネィンプロモーター、 ヒト ヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモータ一、 S R aプロ モーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプ夕一の量と質の検 查は公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャー ナル ·ォブ'バイオロジカル ·ケミストリ一 （J. Biol. C em. )， 267巻， 19555 〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプタ一タン パク質等を含有するものとしては、 公知の方法に従って精製したレセプ夕一夕ン パク質等であってもよいし、 該レセプ夕ータンパク質等を含有する細胞を用いて もよく、 また該レセプ夕ータンパク質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を含 有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定 化してもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプタ一タンパク質等を含有する細胞としては、 該レセプ夕一夕ン パク質等を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehj em型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリングプレンダーゃポリトロン （Kinema t ica社製） のよる破碎、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら 細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などが挙げられる。 細胞膜の分 画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と して用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0〜3 0 0 0 r p m) で短時 間 （通常、 約 1〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0〜 3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分 中には、 発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質 などの膜成分が多く含まれる。
該レセプタータンパク質等を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一タンパク質 の量は、 1細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7分 子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合 活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか りでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物を スクリーニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプ夕 —タンパク質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプタータンパク質画分としては、 天然型のレセプ夕一夕ンパク質画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプタータンパク質画分などが望ま しい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作 用などを示す。
標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 など で標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化さ せる化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプ夕一夕ンパク質 等を含有する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに 懸濁することによりレセプ夕一タンパク質標品を調製する。 バッファ一には、 p H4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリスー塩酸バッファ —などのリガンドとレセプター夕ンパク質との結合を阻害しないバッファ一であ ればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 T we e n— 80 TM (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなど の界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによる レセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること もできる。 0. 01〜1 Om 1の該レセプ夕ー溶液に、 一定量 （5000〜50 O O O O c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10_4〜10— 1Q Mの 試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標 識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ま しくは約 から 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分から 3 時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した 後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまた はァ—カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント （BQ) から 非特異的結合量 （NSB) を引いたカウント （BQ— NSB) を 100%とした 時、 特異的結合量 （B—NSB) が、 例えば、 50%以下になる試験化合物を拮 抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性を変化させる化合物ス クリーニングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕一 タンパク質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシ トールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o s の活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方 法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を含有する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新 鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物 などを添加して一定時間ィンキュベ一トした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回 収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標 とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素に よって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行な つてもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フォルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検 出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプタ一タン パク質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプ夕一タンパク質等を発現し た細胞としては、 天然型の本発明のレセプタータンパク質等を有する細胞株、 上 記の組換え型レセプタータンパク質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用い られ、 これら化合物は新規な化合物であっても、 公知の化合物であってもよい。 リガンドと本発明のレセプ夕一タンパク質等との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプタータンパク質等、 本 発明のレセプタータンパク質等を含有する細胞、 または本発明のレセプタータン パク質等を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 1 . スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Sal t Solut ion (ギブコ社製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清ァ ルブミン (シグマ社製) を加えたもの。
孔径 0. 45 imのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G夕ンパク質共役型レセプ夕ー標品
本発明のレセプ夕一タンパク質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37 、 5 % C02、 95% a i rで 2日間培養 したもの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1%ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む PBSで ImM となるように溶解し、 — 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタ一タンパク質発現 CHO細胞を、 測定用緩衝液 lm 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝 液を各穴に加える。
② 10_3〜10— 1QMの試験化合物溶液を 5 i 1加えた後、 標識リガンドを 5 a 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合 物の代わりに 10一3 Mのリガンドを 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0. 2N NaOH— 1% SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ 一ター A (和光純薬製） と混合する。 ，
④液体シンチレーションカウンター (ベックマンコール夕一社製) を用いて放 射活性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B - NSB) Z (B0-NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値 N S B： Non-specif ic Binding (非特異的結合量)
B Q ：最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプタータンパク質等との結合性 を変化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） Gタンパク質共役 型レセプ夕一を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する 化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一タンパク質に対するァゴニスト） 、 （口 ) 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆる、 本発明のレセプタータンパク質 に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本発明の Gタンパク質共役型レセ プタータンパク質との結合力を増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発 明の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質との結合力を減少させる化合物で ある。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明のレセプ夕一タンパク質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプ夕一 タンパク質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので 、 該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプタータンパク質等に対するアン夕ゴニストは、 本発明のレセプ 夕一夕ンパク質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるの で、 該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を増 強する化合物は、 本発明のレセプタ一タンパク質等に対するリガンドが有する生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質との結合力を減 少させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等に対するリガンドが有する 生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプ夕一タンパク質を含有 する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤 、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ卜やその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 O kgとし て） においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(8) 本発明の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質とリガンドとの結合 性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予 防および/または治療斉 (I
本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、 例えば中枢機能、 循環機能、 消化機能、 心機能など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる 。 従って、 本発明のレセプ夕一タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化 合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） や本発明のレセプタ一タンパク質に対する リガンドは、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび/または治療剤として用いることができる。
該化合物やリガンドを本発明のレセプタータンパク質の機能不全に関連する疾 患の予防および/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化 することができる。
例えば、 該化合物やリガンドは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤 、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくは それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤 の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の 担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に 認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造する ことができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が 得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 卜ラガン卜、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである i易合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール) 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ卜血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 さらに、 上記予防'治療剤は適当な薬剤と組み合わせて例えば本発明のレセプ 夕一タンパク質が高発現している臓器や組織を特異的なターゲットとした DDS 製剤として使用することもできる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(9) 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩 の定量
本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を特異的に認識することが できるので、 被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量、 特にサンドィ ツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、
( i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプタータンパク質等とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化レセプ夕一タンパク質等の割合を測定す ることを特徴とする被検液中の本発明のレセプタータンパク質等の定量法、
( i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプ夕一タンパク質等の定量 法を提供する。
上記 （i i ) においては、 一方の抗体が本発明のレセプタータンパク質等の N 端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプ夕一タンパク質等の C端部 に反応する抗体であることが好ましい。
本発明のレセプタータンパク質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明 のモノクロ一ナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプター夕ンパ ク質等の測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 こ れらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b ' 、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のレセプター夕 ンパク質等に対する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 レセプ夕一タンパク質量） に対応した抗体、 抗原 もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを 既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれ ば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノ メトリック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で 、 後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵 素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダ ーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アル力リフォスファターゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リ ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力 ミン、 フルォレツセンイソチォシァネートなどが用いられる。 発光物質としては 、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 リレシフェリン、 ルシゲニンなどが用 いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン—アビジン系 を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 夕ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロー スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成 樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の本発明のレセプ夕一タンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次 反応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行 なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができ る。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるレセプ夕一夕ンパク質等の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプ夕一夕ン パク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次 反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が 、 レセプ夕一タンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は 、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる 。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原と（F)と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B ZF分離） 、 B、 F何れかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本 反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレングリコー ル、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固 相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として 固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 何れかの相の標識量 を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプタ一タンパク質ま たはその塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細につい ては、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィ ムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアッセ ィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発 行） 、 「メソッズ 'イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0 ) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techni ues (Part D : Selected Immunoassays) )、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniaues (Part E:Monoclonal Ant ibodie s and General Immunoassay Methods) ) ^ 同書 Vol. 121 (I讓 nochemical Tech niques (Part I： Hybridoma Techno loGy and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 ァ 力デミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプタータン パク質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプタータンパク質ま たその塩を定量することによって、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に 関連する各種疾患の診断をすることができる。 また、 本発明の抗体は、 体液や組織^:どの被検体中に存在する本発明のレセプ 夕一タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発 明のレセプタータンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製 時の各分画中の本発明のレセプタータンパク質等の検出、 被検細胞内における本 発明のレセプ夕一タンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチ ドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセ プタータンパク質またはその部分べプチドの量を変化させる化合物のスクリー二 ングに用いることができる。 ，
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明の レセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜に おける本発明のレセプター夕ンパク質またはその部分べプチドの量を変化させる 化合物のスクリ一二ング方法、
( i i ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明 のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜 における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ る化合物のスクリーニング方法、
( i i i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織 もしくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での 該レセプ夕一タンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該夕 ンパク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプタ一タンパク質 またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法、 および
( i v ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 レセプタ一タンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該タン パク質を確認することによる、 細胞膜における本発明のレセプタ一タンパク質ま たはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチド の定量は具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット 、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗 痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例えば 、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過し た後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肺、 大腸など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 へぺス緩衝 液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面活性剤 （例えば、 トリトン X— 1 0 0 TM、 Tw e e n— 2 0 TMなど） などを用い、 さらに遠心分 離や濾過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く 含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Pot ter— Elvehj em型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （Kinema t ica社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら 細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細胞膜の分 画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と して用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0〜3ひ O O r p m) で短時 間 （通常、 約 1〜 1 0分) 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0〜 3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分 中には、 発現したレセプタータンパク質等と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質 などの膜成分が多く含まれる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド は、 例えば、 本発明の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定法、 ウエスタンブロッ 卜解析などにより定量することができる。
このようなサンドィツチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことがで き、 ウエスタンブロットは公知の手段により行なうことができる。
( i i ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体を上記の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプ夕 —タンパク質またはその部分ペプチドを定量することができる。
細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を '変化させる化合物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞膜における本発明のレセプタ一タンパク質 またはその部分べプチドの量を定量することにより行なうことができ、
( i i ) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ 、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましく は 2日後〜 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその 部分べプチドの量を定量することにより行なうことができる。
細胞膜画分に含まれる本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチド の確認は具体的には以下のようにして行なう。
( i i i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例え,ば、 マウス、 ラット 、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラ ット、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば 、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例 えば、 浸水ス卜レス、 電気ショック、 明喑、 低温など） などを与え、 一定時間経 過した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 心臓、 胎盤、 肺など） 、 また は臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞 等を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表 層での該レセプタータンパク質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上 の該タンパク質を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜における 本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分べプチドの量を確認することがで ぎる。
( i V ) 本発明のレセプタータンパク質もしくはその部分ペプチドを発現する 形質転換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明のレセプタータンパク質またはその部分ペプチドの量を変化させ る作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレセ プ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を増加させることにより、 Gタン パク質共役型レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク質のリン酸化 、 c _ f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など ) を増強させる化合物、 （口） 細胞膜における本発明のレセプタ一タンパク質ま たはその部分べプチドの量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させ る化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物 、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプタータンパク質等の生 理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプ夕一タンパク質等の生 理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプタ一タンパク質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとするこ とができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を.投与することができる。
(11) 細胞膜における本発明のレセプタータンパク質またはその部分べプチ ドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤 本発明のレセプタータンパク質は上記のとおり、 例えば、 心臓または中枢機能 など生体内で何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 細 胞膜における本発明のレセプ夕一タンパク質またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物は、 本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予 防および/または治療剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプ夕一タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防お よび/または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することが できる。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も.しくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルべ一ト 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用い られ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用して もよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど) 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトやその 他の哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 kgとし て） においては、 一日につき約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが 、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 よ り好ましくは約 0， 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(12) 本発明のレセプタータンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 に対する抗体による中和
本発明のレセプ夕一タンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対す る抗体の、 それらレセプタータンパク質などに対する中和活性とは、 すなわち、 該レセプタータンパク質の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味 する。 従って、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプタ一タンパク質の関 与するシグナル伝達、 例えば、 該レセプタータンパク質を介する細胞刺激活性 （ 例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動 、 細胞内タンパク質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進す る活性または抑制する活性など） を不活性化することができる。 したがって、 該 レセプ夕一タンパク質の過剰発現などに起因する疾患の予防および/または治療 に用いることができる。
(13) 本発明の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードする DN Aを有するトランスジエニック動物の作出
本発明の DN Aを用いて、 本発明のレセプ夕一タンパク質等を発現するトラン スジエニック動物を作出することができる。 動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など ( 以下、 動物と略記する場合がある） が挙げられるが、 特に、 マウス、 ゥサギなど が好適である。
本発明の D N Aを対象動物に導入するにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で発 現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるの が一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D NAを導入する場合、 こ れと相同性が高い動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させうる各種プロ モーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へマ イク口インジェクションすることによって本発明のレセプ夕一タンパク質等を高 産生する D N A導入動物を作出できる。 このプロモ一夕一としては、 例えば、 ゥ ィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモー夕一 も使用しうるが、 好ましくは心臓で特異的に発現する遺伝子のプロモーターが用 いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D NAの導入は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A導入後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のレセプ夕一タンパク質等が存在することは、 作出動物の子孫が 全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のレセプタータンパク質等を有す ることを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞およ び体細胞の全てに本発明のレセプタ一夕ンパク質等を有する。
本発明の D NA導入動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 D NA保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが導入された動物は、 本発明のレセプタータンパク質等が高発 現させられているので、 本発明のレセプ夕一タンパク質等に対するァゴニストま たはァン夕ゴニストのスクリ一二ング用の動物などとして有用である。
本発明の D N A導入動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の D NA導入マウスの組織中の D NAもしくは R NAを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプタータンパク質 が存在する組織を分析することにより、 本発明のレセプタータンパク質等につい て分析することができる。 本発明のレセプタ一タンパク質等を有する組織の細胞 を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由 来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 ま た、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬 の選択も可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセプ 夕一タンパク質等を単離精製することも可能である。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 そ の表示は、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号ある いは当該分野における慣用略号に基づくものである。 その例を以下に示す。 また アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すも のとする。
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：パリン
Leu ：ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s • "ジン
Ar g ：アルギニン
H i s
P h e ：フエ二 Jレアラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
Pro ：プロリン A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
p G 1 u ：ピログルタミン酸
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
B u ：ブチル基
P h ：フエニル基
TC ：チアゾリジン一 4 (R) —力ルポキサミド基 また、 本明細 :中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T 0 s P—トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
C 12B z 1 2， 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 z 2一クロ口べンジルォキシカルボニル
B r— Z 2一プロモベンジルォキシカルポニル
B o c t一ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエノール
T r t 卜 Uチル
Bum t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t
HOOB t 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4一ォキソ一
1, 2， 3一べンゾ卜リアジン
HONB 1ーヒドロキシ一 5 _ノルポルネンー 2， 3—
ジカルポキシイミド DCC ： N， N' —ジシクロへキシノレ力ノレポジイ ミ ド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
配列番号： 1
本発明のヒト由来新規 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質 TGR 30の アミノ酸配列を示す。
配列番号： 2
本発明のヒト由来新規 Gタンパク質共役型レセプタータンパク質 TGR 30を コードする c DN Aの塩基配列を示す。
配列番号： 3
以下の実施例 1における P CR反応で使用したプライマー 1の塩基配列を示す 配列番号： 4
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマー 2の塩基配列を示す
以下の実施例 1で得られた形質転換体大腸菌 （Escherichia coli) TOP10/pCR2 .1- hTGR30は、 2001年 （平成 13年） 3月 5日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業技術総合 研究所 特許生物寄託センター （旧 経済産業省産業技術総合研究所生命工学ェ 業技術研究所： N I BH) に寄託番号 F ERM BP— 7487として、 200 1年 （平成 1 3年） 2月 20日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17— 85 (郵便番号 532— 8686) の財団法人 ·発酵研究所 （ I F O) に寄託番号 I FO 16574として寄託されている。 実施例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュ ラー .クローニング（Molecular cloning)に記載されている方法に従った。 実施例 1 ヒト腎臓の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードする c DN Aのクロ一ニングと塩基配列の決定
ヒト腎臓 cDNA (CL0NTECH社） を錶型とし、 2個のプライマ一、 プライマ一 1 (配列番号： 3) およびプライマー 2 (配列番号： 4) を用いて P CR反応を 行った。 該反応における反応液の組成は上記 cDN Aを 1Z10量铸型として使 用し、 Advantage- GC2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） 1ノ50量、 プライマー 1 (配列番号： 3) およびプライマ一 2 (配列番号： 4) を各 0. 5 M、 dN 丁？ 3を200 21^、 および酵素に添付のバッファーを 1Z5量、 GC Meltを 1 Z5量加え、 20 1の液量とした。 P CR反応は、 94Ό · 5分の後、 94°C • 30秒、 60で · 30秒、 68V, · 4分のサイクルを 35回繰り返し、 最後に 68°C - 5分の伸長反応を行った。 該 P CR反応産物を TAクローニングキット (Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクタ一 p CR 2. 1 (Invitrogen社 ) へサブクローニングした。 これを大腸菌 TOP 10に導入し、 cDNAを持つ クローンをアンピシリン含有 LB寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列 を解析した結果、 新規 G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質をコードする c DNA配列 （配列番号： 2) を得た。 また、 このアミノ酸配列 （配列番号： 1) を含有する新規 G夕ンパク質共役型レセプタータンパク質を T G R 30と命名し た。 また形質転換体を大腸菌 (Escherichia coli) T0P10/pCR2.1- GR30と命名 した。 産業上の利用可能性
本発明の Gタンパク質共役型レセプタ一タンパク質もしくはその部分ペプチド またはその塩、 該レセプタータンパク質またはその部分べプチドをコードするポ リヌクレオチド （例えば、 DNA、 RN Aおよびそれらの誘導体） は、 ①リガン ド （ァゴニスト） の決定、 ②抗体および抗血清の入手、 ③組換え型レセプ夕一夕 ンパク質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系の開発 と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド ·レセプ夕 一との比較にもとづいたドラッグデザインの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプロ一 プゃ P C Rプライマーの作成のための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作出ま たは⑧遺伝子治療剤等の医薬等として用いることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有することを特徴とする Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質ま たはその塩。
2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する請求項 1記載の Gタンパク 質共役型レセプタータンパク質。
3 . 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の部分ペプチドま たはその塩。
4. 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質をコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
5 . D NAである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する請求項 5記載の D NA。
7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一。
8 . 請求項 7記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
9 . 請求項 8記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レ セプ夕一タンパク質またはその塩を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載 の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩の製造法。
1 0 . 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは請求項 3記載の部分べプチドまたはその塩に対する抗体。
1 1 . 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質のシグナル伝達 を不活性化する中和抗体である請求項 1 0記載の抗体。
1 2 . 請求項 1 0記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 3 . 請求項 1 0記載の抗体を含有してなる医薬。
1 4. 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくは請求項 3記載の部分べプチドまたはその塩を用いることにより得られうる請求項 1記載 の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンド。
1 5 . 請求項 1 4記載の Gタンパク質共役型レセプターのリガンドを含有してな る医薬。
1 6 . 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一タンパク質もしくは請求項 3記載の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載の G タンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩に対するリガンドの決定方 法。
1 7 . 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは請求項 3記載の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 8 . 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質もしくは請求項 3記載の部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと請求 項 1記載の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質またはその塩との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 9 . 請求項 1 7記載のスクリーニング方法または請求項 1 8記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の Gタンパク質共役型 レセプタータンパク質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩
2 0 . 請求項 1 9記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 1 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイ プリダイズするポリヌクレオチド。
2 2 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含 有してなるポリヌクレオチド。
2 3 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とす る請求項 1記載の G夕ンパク質共役型レセプ夕一タンパク質の m R N Aの定量方 法。
2 4. 請求項 1 0記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載の Gタンパ ク質共役型レセプタータンパク質の定量方法。
2 5 . 請求項 2 3または請求項 2 4記載の定量方法を用いることを特徴とする請 求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプ夕一の機能が関連する疾患の診断方法。
2 6 . 請求項 2 3記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の G夕 ンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩 のスクリ一二ング方法。
2 7 . 請求項 2 4記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜における請求 項 1記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化合物また はその塩のスクリーユング方法。
2 8 . 請求項 2 6記載のスクリーニング方法を用いて得られうる請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現量を変化させる化合物またはそ の塩。
2 9 . 請求項 2 7記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜における 請求項 1記載の Gタンパク質共役型レセプタータンパク質量を変化させる化合物 またはその塩。
3 0 . 請求項 2 8記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 1 . 請求項 2 9記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 2 . 中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 循環器系疾患、 呼吸器系疾患、 消 ィ匕器系疾患、 免疫系疾患、'炎症性疾患または感染症の予防 ·治療剤である請求項 1 3、 請求項 1 5、 請求項 2 0、 請求項 3 0または請求項 3 1記載の医薬。
3 3 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 9、 請求項 2 8または請求項 2 9記載の化合 物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 内分泌疾患、 代 謝疾患、 癌、 循環器系疾患、 呼吸器系疾患、 消化器系疾患、 免疫系疾患、 炎症性 疾患または感染症の予防 ·治療方法。
3 4 . 中枢疾患、 内分泌疾患、 代謝疾患、 癌、 循環器系疾患、 呼吸器系疾患、 消 化器系疾患、 免疫系疾患、 炎症性疾患または感染症の予防 ·治療剤を製造するた めの請求項 1 9、 請求項 2 8または請求項 2 9記載の化合物またはその塩の使用
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029626A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Bayer Healthcare Ag Regulation of human p2y15 g protein-coupled receptor
US7056685B1 (en) 2002-11-05 2006-06-06 Amgen Inc. Receptor ligands and methods of modulating receptors
US7312086B2 (en) 2000-12-07 2007-12-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of diagnosing colon adenocarcinoma using the human g-protein coupled receptor hgprbmy23

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001036473A2 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Pharmacia & Upjohn Company Human g protein-coupled receptors
WO2001036471A2 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
WO2001049847A2 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26904, 38911, and 39404, seven-transmembrane proteins/g-protein coupled receptors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001036473A2 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Pharmacia & Upjohn Company Human g protein-coupled receptors
WO2001036471A2 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
WO2001049847A2 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26904, 38911, and 39404, seven-transmembrane proteins/g-protein coupled receptors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANSSENS, R. ET AL.: "Cloning and tissue distribution of the human P2Y1 receptor", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 221, no. 3, 1996, pages 588 - 593, XP002907622 *
LEON, C. ET AL.: "Cloning and sequencing of a human cDNA encoding endothelial P2Y1 purinoceptor", GENE, vol. 171, no. 2, 1996, pages 295 - 297, XP004042812 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7312086B2 (en) 2000-12-07 2007-12-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of diagnosing colon adenocarcinoma using the human g-protein coupled receptor hgprbmy23
US7713699B2 (en) 2000-12-07 2010-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Methods of diagnosing colon adenocarcinoma using mRNA encoding the human g-protein coupled receptor, HGPRBMY23
WO2004029626A1 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Bayer Healthcare Ag Regulation of human p2y15 g protein-coupled receptor
US7056685B1 (en) 2002-11-05 2006-06-06 Amgen Inc. Receptor ligands and methods of modulating receptors

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