WO2002053745A1 - Process for producing prenyl alcohol - Google Patents

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WO2002053745A1
WO2002053745A1 PCT/JP2001/011213 JP0111213W WO02053745A1 WO 2002053745 A1 WO2002053745 A1 WO 2002053745A1 JP 0111213 W JP0111213 W JP 0111213W WO 02053745 A1 WO02053745 A1 WO 02053745A1
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WO
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gene
promoter
seq
recombinant
dna
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PCT/JP2001/011213
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Chikara Ohto
Shusei Obata
Original Assignee
Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing prenyl alcohol.
  • Terranoid (isoprenoid) synthesis in vivo is achieved by sequentially condensing isopentenyl diphosphate (IPP, C 5 ) with an allylic diphosphate substrate to produce geranyl diphosphate, a linear prenyl diphosphate.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • GPP Cyclonyl diphosphate
  • FPP farnesyl diphosphate
  • GGPP germinylgeranyl diphosphate
  • Figure 1 Figure 1
  • the characters surrounded by a frame represent enzymes.
  • hmgR indicates hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase
  • GGPS indicates GGPP synthase
  • FPS indicates FKP synthase.
  • FPP is the most important biosynthetic intermediate, and a wide variety of terdinoids, such as steroids including ergosterol (provitamin D 2 ) and quinones (vitamin K, VK) It is a synthetic precursor of the side chain, sesquiterpenes, squalene (SQ), one molecule of a pharynesylated protein anchor, and natural rubber.
  • GGPP is also an important biosynthetic intermediate in vivo, including retinol (vitamin A, VA), i3-carotene (provitamin A), phylloquinone (vitamin Ki, VK ⁇ ), and tricopherols (vitamin E, VE). It is essential for the biosynthesis of compounds such as geranylgeranylated protein anchor molecules, chloroplast side chains, gibberellins, and Archia ether-type lipids.
  • FPP an alcohol derivative of GGPP Fuarunesorire (famesol) (FOH, C 15 ), nerolidol (nerolidol) (NOH, C 15 ), Geranirugera Niort (geranylgeraniol) (GGOH, C 2 .)
  • FPP an alcohol derivative of GGPP Fuarunesorire (famesol) (FOH, C 15 ), nerolidol (nerolidol) (NOH, C 15 ), Geranirugera Niort (geranylgeraniol) (GGOH, C 2 .)
  • FOH and NOH are currently synthesized by chemical synthesis, except that they are prepared in small quantities from natural products such as essential oils.
  • FOH and NOH synthesized by chemical synthesis generally have the same carbon skeleton, but double bonds are obtained as a mixture of type (ir ⁇ as type) and (-type (cis type) (A-type (£ E) -EOH or (£) - ⁇ is a form synthesized by the metabolic pathway of living organisms and has industrial value.
  • E ⁇ E ⁇ FOH or (-NOH Purification using column chromatography, precision distillation, etc., is necessary to obtain the pure form of A.
  • the thermally unstable allyl alcohol (FOH) and its isomer NOH (NOH) are required.
  • the biosynthesis method of (£) - ⁇ (hereinafter referred to as “FOH”) is desired, but not established, because of the characteristics such as the control of isomer production and the repeating structure of the reaction product.
  • FOH biosynthesis method of (£) - ⁇ (hereinafter referred to as “FOH”)
  • the budding yeast Saccharomyces In the cells of cerew's seed) it is supplied via the mevalonate pathway, but it is only known that the use of HMG-CoA reductase, which is considered to be the key enzyme, increases the squalene synthesizing ability (see 5-192184; Donald et al. (1997) Appl. Environ.
  • the present invention provides prenyl by culturing a recombinant produced by introducing a recombinant DNA for expression containing a HMG-CoA reductase gene, a ⁇ -isomerase gene, a PPP synthase gene, or a mutant gene thereof.
  • the purpose is to provide a method for producing alcohol.
  • the present inventor has conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, has been widely used in the fermentation industry since ancient times, synthesizes prenyl diphosphate through the mevalonate pathway or the DXP pathway, and makes full use of various methods related to genetic recombination.
  • a prenyl alcohol production system by introducing a gene capable of the enzyme involved in prenyl diphosphoric acid, using an available host, for example, a unicellular eukaryote (especially yeast) or a prokaryote (eg, bacteria, especially Escherichia coli) as an experimental material.
  • a gene for an enzyme involved in prenyl diphosphate synthesis eg, FPP synthase gene or ⁇ -isomerase gene
  • FPP synthase gene or ⁇ -isomerase gene eg, FPP synthase gene or ⁇ -isomerase gene
  • the present invention relates to a recombinant DNA or genomic integrator for expression comprising an HMG-CoA reductase gene, an FPP synthase gene or a ⁇ -isomerase gene or a mutant gene thereof, and a transcription promoter and a transcription terminator.
  • a method for producing prenyl alcohol which comprises introducing a DNA fragment for a recombinant into a host to produce a recombinant, culturing the recombinant, and collecting prenyl alcohol from the resulting culture.
  • prenyl alcohol those having 15 carbon atoms, For example, FOH or NOH can be mentioned.
  • the HMG-CoA reductase gene or its mutant gene includes those encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, or 6, or deletions thereof, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7 to 16. Those containing any one of the base sequences selected from the group are included.
  • Examples of the huanesyl diphosphate synthase gene or its mutant gene include those encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, 78, 80, 82 or 84, for example, SEQ ID NOs: 75, 77, 79, 81 and 83.
  • Examples of the IPP ⁇ -isomerase gene or its mutant gene include those encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86, for example, those containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 85.
  • Examples of the transcription promoter include any one selected from the group consisting of an ADH1 promoter, a TDH3 ⁇ GAP) promoter, a PGK1 promoter, a TRF2 promoter, a ⁇ promoter, and a ⁇ c promoter. However, a transcription promoter having an activity equivalent to these promoters can also be used.
  • the transfer terminator includes an AOffl terminator or a one-minute-one-one-one.
  • the host is a yeast, for example, a budding yeast such as Saccharomyces cerevisiae, specifically, A451, YPH499, YPH500, W303-1A or W303-1B or a strain derived therefrom, or a bacterium, for example, Escherichia coli). Specifically, JM109 or a strain derived therefrom is preferable.
  • prenyl alcohol for example, NOH or FOH can be produced at a concentration that cannot be reached by a culture of host cells alone (at least a concentration of 0.05 mg / l in the medium).
  • the present invention relates to a recombinant DNA or genomic intact expression comprising an HMG-CoA reductase gene, an FPP synthase gene or a ⁇ -isomerase gene or a mutant gene thereof, and a transcription promoter and a transcription terminator.
  • a recombinant obtained by introducing a DNA fragment for a great into a host, which is capable of producing at least 0.05 mg / l of ⁇ or NOH.
  • the host, promoter, and terminator are the same as described above.
  • the present invention will be described in detail. This description includes part or all of the contents as disclosed in the description and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2000-401701, which is a priority document of the present application.
  • the present inventor has developed a system for producing activated prenyl alcohol ((a / 7--prenyl alcohol)) in vivo using metabolic engineering techniques.
  • Enzyme catalyzes the synthesis of IPP and DMAPP (3,3-dimethylallyl diphosphate) as substrates, but usually does not progress to FOH, squalene synthesis by squalene synthase, geranylgeraernilic acid It progresses to GGPP synthesis by synthase, hexaprenyl diphosphate synthesis by hexaprenyl diphosphate synthase, etc. (Fig.
  • the present invention provides two independent pathways (mevalonate pathway and DXP pathway) that differ depending on the organism.
  • HMG-CoA reductase gene FPP synthase gene, or ⁇ -isomerase gene, which is considered to be involved in the activation of prenyl diphosphate synthesis.
  • Transformed cells that can produce prenyl alcohols such as NOH and FOH, which are not always specified in general metabolic pathway maps, but not squalene, which is always expected, or sterols, which are major end products.
  • the authors developed a biological mass production system for prenyl alcohol, and also deleted some regions of the HMG-CoA reductase gene in various patterns (Fig. 2).
  • Into a host under the control of a transcription promoter or by introducing an FPP synthase amino acid residue substitution mutant enzyme into the host to develop a biological mass production system for the above substances. .
  • a recombinant DNA for expression for transforming a host can be obtained by ligating or inserting a transcription promoter and a transcription promoter DNA into a gene to be expressed.
  • Genes to be expressed include HMG-CoA reductase gene (for example, HMG, Escherichia coli iEschericliia co) FPP synthase gene ispA, Bacillus stearothermophilus BaciUus stearothermophilus) -FV synthase gene, and IPP- ⁇ isomerase gene. Raise gene '' ( ⁇ 182) and the like (hereinafter abbreviated as HMG-CoA reductase gene and the like). These genes can be isolated by a cloning technique using PCE or a commercially available kit.
  • a gene expression cassette in which a transcription promoter and a transcription terminator are linked in advance to the HMG-CoA reductase gene or the like can be prepared in advance and incorporated into a vector.
  • the order of ligation and insertion is arbitrary, but the transcription promoter is connected upstream of the HMG-CoA reductase gene, etc., and the transcription promoter is connected to the downstream of the HMG-CoA reductase gene, etc. I do.
  • a transcription promoter and a transcription terminator such as an HMG-CoA reductase gene may be sequentially incorporated into an appropriate DNA, for example, a vector DNA, and may be incorporated in any order if the direction of transcription is considered. May be.
  • the DNA to be used is not particularly limited as long as it is likely to be genetically retained in the host cell.
  • examples include plasmid DNA, bacteriophage, retrotransposon DNA, and artificial chromosome DNA (YAC). And the like.
  • a replication function is not necessarily required, and a fragment prepared by PCR or chemical synthesis may be used.
  • Examples of the plasmid DNA include a YCp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123, a YEp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pYES2 or YEpl3, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, Yip-type E.
  • a YCp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123
  • a YEp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pYES2 or YEpl3, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, Yip-type E.
  • coli-yeast shuttle vector such as pAUElOl or pAUR135, Escherichia coli-derived plasmid (pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 or pTrc99A ColE-based plasmid such as pACYCl77 or pl5A-type plasmids such as pACYCl84, pSClOl-type plasmids such as pMW118, pMW119, pMW218 or pMW219, and Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.).
  • Retrotransposons include T factors and the
  • a selectable marker gene is used to introduce recombinant DNA into a host, but a marker gene is not always necessary when there is an assay method.
  • a constitutively expressed promoter or an inducibly expressed promoter can be used as the transcription promoter.
  • a constitutively expressed promoter means a transcription promoter of a gene involved in a major metabolic pathway, and is a promoter which is considered to have transcription activity under any growth condition.
  • the inducible expression type promoter refers to a promoter which has transcription activity under specific growth conditions and whose activity is suppressed under other growth conditions. Any transcription promoter may be used as long as it has activity in a host such as yeast.
  • 1 ⁇ 2 ⁇ promoter, promoter evening one, TJDH3 GAP) flop 1 a motor, ADH1 promoter can be used JPGK1 promoter, promoter.
  • promoters such as trp, lac, trc and ac can be used.
  • cis elements such as enhancers, splicing signals, poly-A-added signals, and selectable markers can be linked as desired.
  • selectable markers URA3, LEU2, TRP1, HZS ⁇ and marker gene to nutritional unsolicited of phenotype indicators such as, Amp Tet r, Cm r, Km ⁇ £ ZKJ- (7 anti such Biomaterial resistance genes.
  • a terminator derived from any gene may be used as long as it has activity in a host such as yeast.
  • yeast for expression in yeast, an ADH1 terminator, a CC terminator and the like can be used.
  • a terminator may also be used for expression in E. coli.
  • An SD sequence (represented by 5'-AGGAGG-3 ') can be incorporated as a ribosome binding site for translation upstream of the start codon of bacterial genes such as Escherichia coli.
  • the expression vector prepared as a recombinant DNA for gene transfer can be named and identified by displaying the gene name next to the plasmid name, unless otherwise specified. For example,? (When the H? _? Gene is ligated to the plasmid PRS434GAP having the 4 promoter, it is displayed as "pRS434GAP-HMGl". Except in special cases, when using other plasmids or promoters, Display in the same way.
  • the HMG-CoA reductase gene or the like may be a deletion type in which a partial region (up to 2217 bases) is deleted, a wild type gene or a base sequence of these deletion type genes.
  • a mutant gene in which one or several to several tens of bases are deleted, substituted or added may be used.
  • a deletion form in which a maximum of 739 amino acids have been deleted from the amino acid sequence of natural HMG-CoA reductase (SEQ ID NO: 2), a wild-type enzyme in which amino acid is deleted or One or several (for example, 1 to 10 and preferably 1 to 3) amino acids may be mutated by deletion, substitution or addition from the type enzyme.
  • the FPP synthase gene may also be a mutant gene in which one or several to several tens of bases have been deleted, replaced or added.
  • various mutant genes SEQ ID NOs: 79, 81 or 83 in which five bases of the wild-type FPP synthase gene (SEQ ID NO: 77) are substituted can be used.
  • mutant gene the 79th amino acid residue iyr of wild-type FPP synthase (SEQ ID NO: 78) was replaced with Asp (SEQ ID NO: 80), Glu (SEQ ID NO: 82) or Met (SEQ ID NO: 84). Encodes a mutated mutant enzyme.
  • a base substitution mutation that occurs in a DNA fragment obtained by amplifying wild-type DNA by PCR (polymerase chain reaction) using low-fidelity DNA polymerase such as Taq DNA polymerase is called a ⁇ PCR error, ''
  • a wild-type HMG-CoA reductase gene SEQ ID NO: 1
  • an HMG-CoA reductase gene having a substitution mutation of the encoded polypeptide due to a substitution mutation of a base due to a PCR error (Referred to as "HM6 ⁇ '") can also be used in the present invention.
  • FIG. 2A shows an embodiment of base substitution due to a PCR error when the wild-type HMG-CoA reductase gene (SEQ ID NO: 1) is changed to type III.
  • HU has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 4.
  • nucleotide mutations are represented by the base before substitution (indicated by one letter), the base number when the first base of the start codon of the HMG-CoA reductase gene is set to 1, the base after substitution (one letter) (Notation).
  • Amino acid mutation is PCR error type HMG-CoA
  • the amino acid residue before substitution (single letter notation)
  • the amino acid number of HMG-CoA reductase (single letter notation)
  • the amino acid residue after substitution (single letter notation)
  • the above PCR error-type nucleotide sequence can be partially corrected by site-directed mutagenesis or the like, and such a modified HMG-CoA reductase gene can also be used in the present invention. .
  • an HMG-CoA reductase gene (including a PCII error type) encoding a deletion form in which a region predicted to be a transmembrane domain of HMG-CoA reductase is deleted can also be used in the present invention.
  • FIG. 2B shows an example of a deletion gene MG1A of the PCR error type HMG-CoA reductase gene IMG. The top row is the HMG1 gene without deletion. The portion indicated by the thin line (1) is the deleted region. Table 1 shows which region of the HMG gene (SEQ ID NO: 3) was deleted in each of the deletion-type genes.
  • the HMi ⁇ 'deletion gene is represented by HMGJAxxy according to the pattern of deletion.
  • XX indicates the pattern of the deletion
  • y indicates the operation number (arbitrary number).
  • “ ⁇ 026” is displayed as an example of HMG1 ⁇ 02y (those with other deletion patterns are also displayed).
  • HMG1 (558-532) 5 'GTC TGC TTG GGT TAG ATT TTC TGA AAA 3'SEQ ID NO: 39
  • the recombinant DNA of the present invention is introduced into a host so that the HMG-CoA reductase gene and the like (including various mutant types; unless otherwise specified, the same applies hereinafter) can be introduced into a host. Can be obtained.
  • the host is prenylal
  • Fungi include myxomycota, algal fungi (Phycomycetes), ascomycetes, Ascomycota, fungi (Basidiom cota), and fungi (Fungi Imperfecti).
  • yeast As fungi, single-celled organisms are well known as industrially important yeasts, and examples include ascomycetous yeasts of ascomycetes, basidiomycetous yeasts of basidiomycetes, and incomplete fungal yeasts of incomplete fungi. .
  • ascomycete yeasts especially Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces' cerevisiae Saccharom y ces cerevisiae: known as baker's yeast), Kiyandida-Interview one Thiry MCandida or Pichia path Bokuri scan (JPichia pastris), etc., in fission yeast A Shizo Saccharomyces * Bomb Tl.
  • the yeast strain is not particularly limited as long as it can produce prenyl alcohol.
  • S. cerevisiae for example, the following strains: A451, EUG8, EUG12, EUG27, YPH499, YPH500, W303-1A, W303-1B, AURGG101 and the like can be mentioned.
  • an electo-portion method, a spheroplast method, a lithium acetate method, or the like can be employed as introducing the recombinant DNA into the yeast.
  • A451 (ATCC200589, MATa canl leu2 trpl ura3 aroT)
  • YPH499 (ATCC76625, MATa ura3-52 Jys2-801 ade2-W> ⁇ trpl- A 63 his3- ⁇ 200 leu2- ⁇ 1, Stratagene, La Jolla, CA)
  • W303-1A (MATa) eu2-Sleu2- ⁇ Yl his3- ⁇ ade2- ⁇ ura3- ⁇ trpl-1 canl-100)
  • W303-1B (MATa Ieu2-3 Ieu2-1YI his 3-11 ade2- 3-1 trpl-1 canl-100)
  • AURGG101 (A451, aurl :: AURl-C)
  • EUG27 (YPH500, EG9p :: URA3-GALlp)
  • Prokaryotes include ai'chaea and bacteria (bacteria).
  • bacteria bacteria
  • Archea Methanopacteri And halophiles such as Halobacterium of the genus Halobacterium, and thermophilic and eosinophilic bacteria such as the genus Sulpolobus.
  • bacteria include various Gram-negative or Gram-positive bacteria that have high industrial or academic value. subutilis) Bacillus genus such as Bacillus brevis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas petit da seudomo putida), Agrobacterium umme
  • Agrobacterium rhizogenes Corynebacterium (Corynebacterium glutamicum); Lactobacillus plantarum (Lactobacillus plantarum); Lactobacillus; Actinomyces Actinomycetes such as Streptmyces.
  • the recombinant DNA of the present invention can be replicated autonomously in cells, and is composed of a transcription promoter, an SD sequence as a ribosomal RNA binding region, and a gene of the present invention. Is preferred. A transfer terminator or the like can be appropriately inserted. Further, a gene controlling a promoter may be included. Examples of Escherichia coli include, but are not limited to, BL21, DH5, HB101, JM101, MBV1184, TH2, XL1-Blue, Y-1088. Any transcription promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli.
  • the method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, using calcium ions
  • This method is carried out by a method such as a conventional method, an election-portation method, or a method using a commercially available kit.
  • Whether or not the gene has been introduced into the host cell can be confirmed by a PCR method, a Southern plot hybridization method, or the like.
  • a PCR method prepare DNA from the recombinant, design primers specific for the introduced DNA, and perform PCR. Thereafter, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or capillary electrophoresis, etc., and stained with bromide TC or SYBR Green solution, or the DNA is detected with a UV detector. Then, confirm the introduced DNA by detecting the amplification product as a single band or peak.
  • amplification products can be detected by performing PCR using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like.
  • prenyl alcohol can be obtained by culturing the above-mentioned recombinant containing the introduced HMG-CoA reductase gene or the like, and collecting from the culture.
  • culture means not only the culture supernatant but also the cultured cells or cultured cells themselves, or the crushed cells or cells.
  • the method of culturing the recombinant of the present invention is performed according to a usual method used for culturing a host.
  • prenyl alcohols include those having 15 carbon atoms, such as funaresol (FOH;) and nerolidol (NOH). The prenyl alcohols accumulate in the culture alone or as a mixture, respectively.
  • the culture medium for culturing the recombinant obtained using the microorganism as a host is a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be utilized by the microorganism and which can efficiently culture the recombinant.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source include carbohydrates such as glucose, galactose, fructose, sucrose, raffinose, and starch; organic acids such as acetic acid and propionic acid; and alcohols such as ethanol and propanol.
  • nitrogen sources include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds.
  • the inorganic substance include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration stirring culture at 26 to 36 ° C, preferably 30 to 2 to 7 days when ceresiae is used as a host, and JE.m / i is used as a host. In case 37 and 12 ⁇ : 18 hours. Adjustment of pH is performed using an inorganic or organic acid, an alkaline solution or the like.
  • the culture may be carried out by adding an antibiotic such as ampicillin, chloramphenicol or o-leobasidin A to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a promoter e.g, galactose can be used as a carbon source.
  • IPTG isopropyl- / 3-D-thiogalactovyranoside
  • prenyl alcohol When cultured under the above culture conditions, prenyl alcohol can be produced in high yield by the host.
  • the host is AURGG101 and the vector is pYHMG044, it can produce 32 mg or more per liter of medium and 150 mg or more depending on the culture conditions.
  • the production efficiency of prenyl alcohol can be increased by further adding terpenoids, fats and oils, surfactants and the like to the above-mentioned medium.
  • terpenoids terpenoids, fats and oils, surfactants and the like.
  • Fats and oils soybean oil, fish oil, almond oil, olive oil
  • Surfactants Taditol, Triton X-305, Span 85, Adekinol LG109 (made by Asahi Denka), Adekinol LG294 (made by Asahi Denka), Adekinol LG295S (made by Asahi Denka), Adecanol LG297 (made by Asahi Denka) Ade Riki No. B-3009A (Asahi Denka), Ade Riki Pronic L-61 (Asahi Denka)
  • Fat concentration is 0.01% or more, preferably 1-3%, surfactant concentration is 0.005%
  • the target prenyl alcohol is collected by crushing the cells or cells by a homogenizer treatment or the like.
  • the cells may be directly extracted with an organic solvent or the like without crushing.
  • the prenyl alcohol of the present invention is produced extracellularly or extracellularly, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, prenyl alcohol is collected from the culture by extraction with an organic solvent or the like, and can be further isolated and purified using various chromatography and the like as necessary.
  • Table 2 shows an example of a preferred combination of the host strain and the vector as the introduced recombinant DNA and a relationship of prenyl alcohol production in the present invention.
  • GAP HMGl S. cerevisiae A451 0.05, 0.65-11.2, 4.9-11.2 0.05, 0.05-0.16, 0.16
  • GAP HMGl S. cerevisiae EUG8 (from A451) 0.2, 0.20-1.8, 1.8,
  • ADH, GAP, PGK, TE HMGl S. cerevisiae YPH499 0.05, 0.05-0.11, 0.11,
  • GAP HMGl S. cerevisiae EUG12 (derived from YPH499) 5.9, 5.9-18.3, 18.3 0.13, 0.13-0.30, 0.30
  • GAP HMGl S. cerevisiae EUG27 (YPH500) 3.2, 3.2-13.6, 13.6 0.05, 0.05-0.22, 0.22
  • GAL HMGl b cerevisiae A451 0-05,-,-
  • GAL HMGl S cerevisiae AURGG101 (A451 Tanaka) 0.05, 0.29-8.2, 8.2 0.05, 0.095-2.7, 2,7
  • VvdUo 1A cerevisiae VvdUo 1A 0.05, 0.05, 0.10-0.15, 0.15
  • FOH and NOH shows a lower limit, a preferred range, and a roughly preferred fl box in order from the left.
  • HMG1 or its mutant gene eg, MG1 '
  • UMGxxy was bound downstream of the constitutively expressed transcription promoter:
  • FOH was .05 mg, preferably 0.05_18.3 mg / l
  • NOH at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-0.3 mg / l.
  • FOH is at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-158 mg / I, and more preferably 53- 158 mg / l and NOH at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-23 mg / l, more preferably 2.4-23 mg / l.
  • ⁇ is at least 22 mg / l, preferably Produced 22-66 mg / l and produced NOH at least 12 mg / l, preferably 12-28 mg / l.
  • FOH is at least 0.05 mg / l, preferably Produced 0.05-158 mg, more preferably 53-158 mg / l, and produced NOH at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-23 mg / l, more preferably 2.4-23 mg / l.
  • FOH is at least 0.05 mg / l, preferably 0.05- It produced 18.3 mg / l, more preferably 5.9-18.3 mg / l, and produced NOH at least 0.05 mg / l, preferably 0.13-0.30 mg / l.
  • FOH is at least 3.2 mg / l, preferably 3.2 mg / l. -13.6 mg was produced and NOH was produced at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-0.22 mg / l.
  • FOH is at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-18.3 mg / l.
  • FOH is at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-158 mg / l, and more preferably 53-158 mg. per liter of NOH, preferably at least 0.05 mg / l, preferably 0.05-23 mg / l, more preferably 2.4-23 mg / l.
  • FOH is at least llmg / l, preferably It produced ll-90mg / l, more preferably 64-90mg / l.
  • FOH produced at least 0.15 mg / l, preferably 0.15-0.16 mg / l by phosphatase treatment without addition of IPP or DMAPP.
  • FIG. 1 is a diagram showing the metabolic pathways of mevalonate pathway-related enzymes.
  • FIG. 2A is a construction diagram of the deletion type HG ⁇ gene.
  • FIG. 2B is a diagram showing a pattern of substitution mutation.
  • FIG. 3 shows the plasmid pRS414.
  • FIG. 4 shows the plasmid pYES2.
  • FIG. 5 is a diagram showing the sequences of AOH / promoter and terminator.
  • FIG. 6A shows the plasmid pRS414PTadh.
  • FIG. 6B shows the plasmid pHS414TPadh.
  • FIG. 7A-1 shows the plasmid pRS434ADH.
  • FIG. 7A-2 shows the plasmid pRS434GAP.
  • FIG. 7B-1 shows the plasmid pRS434PGK.
  • FIG. 7B-2 shows the plasmid pRS434TEF.
  • FIG. 7C-1 shows the plasmid pRS436ADH.
  • FIG. 7C-2 shows the plasmid pRS436GAP.
  • FIG. 7D-1 shows the plasmid pRS436PGK.
  • FIG. 7D-2 shows the plasmid pRS436TEF.
  • FIG. 7E-1 shows the plasmid pRS444ADH.
  • FIG. 7E-2 shows the plasmid pRS444GAP.
  • FIG. 7F-1 shows the plasmid pRS444PGK.
  • FIG. 7F-2 shows the plasmid pRS444TEF.
  • FIG. 7G-1 shows the plasmid pRS446ADH.
  • FIG. 7G-2 shows the plasmid pRS446GAP.
  • FIG. 7H-1 shows the plasmid pRS446PGK.
  • FIG. 7H-2 shows the plasmid pRS446TEF.
  • FIG. 8 is a diagram showing a physical map of plasmid PALHMG106.
  • Figure 9 is a photograph showing the results of Southern blotting.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of PCR mapping.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of Northern plotting.
  • FIG. 12A is a diagram showing the specific activity of each prenyl diphosphate synthase in the crude enzyme solution
  • Figure 12B is a diagram showing the specific activity of each prenyl diphosphate synthase in the crude enzyme solution
  • Figure 13 FIG. 4 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pRS434GAP-HMGl or pRS444GAP-HMGl was introduced into A451.
  • FIG. 14 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pRS434GAP-HMGl or pHS444GAP-HMGl was introduced into A451.
  • FIG. 15 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pRS434GAP-HMGl or pRS444GAP-HMGl was introduced into A451.
  • FIG. 3 is a graph showing the production amount of prenyl alcohol in the present invention.
  • Figure 18 is a diagram showing pRS434GAP-HMGl, the production of Kino prenyl alcohol was introduced P RS444GAP-HMG1 in EUG12.
  • FIG. 19 is a view showing the amount of prenyl alcohol produced when pRS434GAP-HMG1 and pRS444GAP-HMGl were introduced into EUG27.
  • FIG. 20A shows the amount of prenyl alcohol produced when pYES-HMGl and pYHMG044 were introduced into the A451 strain.
  • FIG. 20B shows the amount of prenyl alcohol produced when pYES-HMGl and pYHMG044 were introduced into AURGG101 strain.
  • FIG. 21 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pYES-HMGl was introduced into W303-1A and W303-1B.
  • FIG. 22 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pYHMG026, pYHMG044, pYHMG056, pYHMG062, pYHMG076, pYHMG081, pYHMG100, pYHMG112, and pYHMG122 were introduced into A451.
  • FIG. 23 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pYHMG026, pYHMG044, pYHMG056, pYHMG062, pYHMG076, pYHMG081, pYHMGlOCK, pYHMG112, and pYHMG122 were introduced into AURGG101.
  • FIG. 24 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when pYHMG026, pYHMG044, pYHMG056, pYHMG062, pYHMG076, pYHMG081, pYHMGlOCK, pYHMG112, and pYHMG122 were introduced into AURGG101 (an enlarged view of FIG. 23).
  • FIG. 25 is a graph showing the amount of prenyl alcohol produced when pRS434GAP-HMGl or pRS444GAP-HMGl and pYHMG04 were introduced into AURGG101.
  • FIG. 26 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced when cultured in a culture solution containing E. colH IPP and DMAPP into which the mutant is gene has been introduced.
  • FIG. 27 is a graph showing the amount of prenyl alcohol produced when E. « ⁇ ′ into which a mutant i3 ⁇ 4a4 gene was introduced was cultured in a culture solution containing neither ⁇ nor DMAPP.
  • FIG. 28 is a diagram showing the amount of prenyl alcohol produced and the number of cells when the recombinant strain 15-2 (pYHMG044 / AURGG101) was cultured in jarf amen overnight.
  • Co7i SURE2 super competent cells purchased from Stratagene (La Jolla, CA) were used as hosts to construct vectors. 6 cerew'siae genome preparation, vector — YPH499 (Stratagene) was used for the introduction test.
  • Plasmids pRS404 and pRS414 were purchased from Stratagene. PAURl23 was purchased from Takara Shuzo, and pYES2 ( Figure 4) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA).
  • Yeast genomic DNA preparation kit "Gen Toru-kun” was purchased from Takara Shuzo, and genomic DNA was prepared from .cerevisiae YPH499 according to the attached protocol.
  • pRS414 (FIG. 3) was digested with Nael and PTOII, and a 4.1 kbp fragment not containing the flori and iac portions was purified by agarose gel electrophoresis. Also, pAUR123 was digested with ainHI, blunt-ended with Klenow enzyme, and then subjected to agarose gel electrophoresis. A 1.0 kbp fragment containing the transcription promoter (UWHlv) and the transcription terminator (OH2t) (Fig. 5, SEQ ID NO: 17) was purified. The 4.1 kbp fragment of pRS414 contains the replication origin of E.
  • Plasmid DNA was prepared from the obtained recombinant, and matsupin with SaR and Seal was prepared.
  • the CYC1 transcription terminator-CYClt fragment was prepared by PCR.
  • XhoI-TcyclFW 5'- TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG -3 '(SEQ ID NO: 18)
  • Apal-TcyclRV 5'-CAT TAG GGC CCG GCC GCAAAT TAAAGC CTT CG-3 '(SEQ ID NO: 19) ⁇
  • CYClt-XA was inserted into the JSoI- ⁇ I site of pRS404 and pRS406, and was designated as pRS404Tcyc and pRS406Tcyc, respectively.
  • a DNA fragment was prepared.
  • the DNA primers used are as follows.
  • SacI-PadhlFW 5'-GAT CGA GCT CCT CCC TAA CAT GTA GGT GGC GG-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • SacII-PadhlRV 5'-CCC GCC GCG GAG TTG ATT GTATGC TTG GTA TAG C-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • SacI-Ptdh3FW 5'-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-
  • SacII-Ptdh3RV 5 »-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC -3 '(SEQ ID NO: 23)
  • SacI-PpgklFW 5 * -TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG-3 '(SEQ ID NO: 24)
  • SacII-PpgklRV 5'-ATA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG-3 '(SEQ ID NO: 25)
  • SacI-Ptef2FW 5'-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • SacII-Ptef2RV 5'-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTG ACC-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • SacI-PadhlFW and SacII-PadhlRV were used as DNA primers for PCR, and pAUR123 was used for type II.
  • TDH3 (GAP) transcription promoter 7X> H3 ⁇ 4) (GAPp) SacI-Ptdh3FW and SacII-Ptdh3RV are used as PCR DNA primers for amplification, and SacI-PpgklFW and SacII-PpgklRV are used for PCR for PGK1 transcription promoter PGKlp amplification.
  • SacI-Ptef2FW and SacII-Ptef2RV were used as DNA primers for TEF2 transcriptional promoter-TEF2p amplification, and yeast genomic DNA was used for type II.
  • the reaction solution is 0.1 g pAUR123 or 0.46 yeast genomic DNA, 100 pmol primer DNA, lx ExTaq buffer (Takara Shuzo), 20 ninol dNTP, 0.5 u ExTaq DNA polymerase (Takara Shuzo) and 1 a1 perfect match polymerase.
  • PRS404Tcyc and pRS406Tcyc were the plasmids in which 2 ⁇ was inserted in the same direction as pYES2 in pRS2T, respectively, as pRS434Tcyc2 Ori and pRS436Tcyc2 li Ori. OrL pRS446Tcyc2H Ori.
  • Table 3 summarizes the expression vectors produced by the present invention.
  • each YEp-type vector prepared in the present invention normally functions as a vector.
  • N-terminal primer 5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3 "(SEQ ID NO: 28)
  • C-terminal primer (primer 2): 5--TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • PCR was performed in the following reaction mixture for 30 cycles, with denaturation at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 55 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 2 minutes as one cycle.
  • the determined base sequence was a mutant gene partially different from the base sequence shown in JB of GenBank (http: ⁇ www-ncbi.nlm.nih.gov / Genbank / index.html).
  • Fig. 2A The gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the mutant HMG-CoA reductase containing this PCR error is designated as HMG1 '.
  • the site-specific mutation was performed by the method described in "Protocols and application guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1" issued by Promega.
  • the following three types of oligos for mutagenesis were chemically synthesized.
  • HMG1 (190-216) 5'-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3, (SEQ ID NO: 30) HMG1 (1807-1833) 5'-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3 '(SEQ ID NO: 31)
  • HMGl (2713-2739) 5'-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • pT7HMGl was digested with 3 ⁇ 4 ⁇ 1, ApalA, ⁇ , and a 3.2 kbp HG_Z fragment was prepared by agarose gel electrophoresis. This was inserted into the Smal-SaR site of pALTER- ⁇ to create pALHMGl.
  • HMGl (558-532) 5'-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3, (SEQ ID NO: 33) HMG1 (1573-1599) 5'-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3 '(SEQ ID NO: 34)
  • HMGl (2458-2484) 5'-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3 '(SEQ ID NO: 35)
  • the plasmid with the sequence corrected in H ⁇ was designated as pALHMG106 (FIG. 8).
  • S. cerevisiae BTSl gene also called GGPP synthase gene
  • N-terminal primer 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3 '(SEQ ID NO: 36)
  • the PCR was performed in the same manner as in the reaction solution composition described in (1). Performed 30 cycles.
  • the pT7Blue T vector was treated with HamHI to remove the ⁇ gene, which was introduced into the aHL site of pYES2 (Invitrogen).
  • the obtained recombinant vector was designated as pYESGGPS.
  • E. genomic DNA was prepared from E. coli JM109 (Takara Shuzo) by the following method. After culturing JM109 in 1.5 ml 2xYT medium, the cells were collected by centrifugation, and 567 l of ⁇ ( ⁇ 8.0), 3 i 1 of 20 mg / mi protemase- (Boehrmger Mannheim, Mannheim, Germany) and 30 ⁇ 1 of 10% After adding SDS and keeping the temperature at 37 ° C for 1 hour, 1001 of 5M NaCl was added and mixed. To this was added 801 of a CTAB solution of NaCl (10% CTAB, 0.7 M NaCl), and heated at 65 for 10 minutes.
  • a CTAB solution of NaCl 10% CTAB, 0.7 M NaCl
  • the E. m / i-derived FPP synthase gene is was cloned by PCR using E. «? 7 genomic DNA as type I and the following synthetic oligo DNA as primers.
  • ISPA1 5'-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3 '(SEQ ID NO: 68)
  • ISPA2 5'-TC AGAATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3' (SEQ ID NO: 69)
  • lx ExTaq buffer 0.5 In a 100 il l reaction solution containing mM dNTP, 100 pmol ISPA1, 100 pmol ISPA2, 0.2 g E. coli genomic DNA, and 5 u ExTaq, 94 ⁇ ⁇ 1 min, 55 ° C 1 min, 72 1.5 min 30 PCR was performed by repeating the cycle.
  • Plasmids pALispA4, pALispAl6, and pALispAl8 into which the i ⁇ gene '(SEQ ID NO: 77) was correctly introduced were obtained by restriction enzyme mapping using coRI, >> aI, M, & al, and mHI.
  • pALispA16 a polypeptide encoded by E. coliispA according to the protocol described in "Protocols and applications guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1" issued by Promega.
  • the codon encoding the 79th amino acid residue T ⁇ r was modified by substitution mutation.
  • the following oligonucleotides for mutagenesis (also referred to as mutant oligos) were prepared by a chemical synthesis method.
  • ISPA-D 5'-ATC ATG AAT TAA TGA GTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3 '(SEQ ID NO: 70)
  • ISPA-E 5'-ATC ATG AAT TAA TGA TTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3 '(SEQ ID NO: 71)
  • mutant oligo ISPA-M 5'-ATC ATG AAT TAA TGA QL AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC -3 '(SEQ ID NO: 72)
  • the mutant oligo ISPA-M has 16th to 18th bases (3 bases) (Underlined) is the 79th wild type! Since it is a codon that encodes Vr, it is designed to encode Met.
  • mutant oligo ISPA-D and mutant oligo ISPA-E were designed to encode Asp and Glu, respectively.
  • the 26th to 31st bases (6 bases are underlined) were designed so that a new EcdT22l (Nsil) site could be created after substitution mutation introduction, This is an array designed to be easily distinguished by mapping.
  • the mutant oligo was previously phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (Promega) and gel-filtered and purified using Nick Culumn (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
  • T4 polynucleotide kinase Promega
  • Plasmids containing the substitution mutant is (designated as m) prepared using ISPA-M as the mutation oligo were designated as p4D p4E p4M, and similarly, the plasmids prepared using pALispA16 as the type III were designated pl6D, respectively. Plasmids prepared using pl6E pl6M and pALispA18 as type III were called pl8D pl8E pl8M, respectively.
  • the Escherichia coli ⁇ isomerase gene was previously named ORF182 (by NCBI BLAST search; GenBank accession number AE000372), but was replaced by ⁇ 'according to Hahn et al. (1999) J. Bacteriol., 181, 4499-4504. It is named. Plasmids obtained by cloning idi (SEQ ID NO: 85; encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 86) include p3-47-ll described in Hemmi et al. (1998) J. Biochem., 123, 1088-1096. p3-47-13 was used.
  • fps Bacillus stearothermophilus synthase gene
  • SEQ ID NO: 75 a Bacillus stearothermophilus synthase gene
  • SEQ ID NO: 76 a Bacillus stearothermophilus synthase gene
  • HM2 gene Using the pRS vectors (Figs. 6 and 7), which are E. coli-S. Cererisiae YEv-type shuttle vectors having a constitutively expressed transcription promoter, the HM2 gene
  • the subcloned plasmid was checked on the physical map by mapping the restriction enzymes JOwl, Spel, Nael, and Spl, and confirming the base sequence of the border region of the inserted 3.2 kbp J ⁇ f ⁇ gene fragment.
  • the prepared plasmid was selected.
  • the selected plasmids were pRS434GAP-HMGl, pRS444GAP-HMGl, pRS434TEF-HMG1, pRS444TEF-HMGl, pRS434PGK-HMGl and pRS444PGK-HMGl, respectively.
  • the vectors pRS414PTadh and pRS414TPadh containing the constitutively expressed transcription promoter DH2p (Fig. 6B) were treated with the restriction enzymes Sal and 6 ⁇ , and the same procedure as (1) was performed to obtain plasmids pRS414PTadh-HMGl and HMG1 gene inserted. pRS414TPadh-HMGl was produced.
  • pT7HMGl prepared in Example 2 (1) was treated with BsmBl SalL Seal to remove the gene HMG encoding the mutant HMG-CoA reductase by PCR error, and this was used as the B ⁇ of pYES2 (Invitrogen, Carlsbad, CA). -Introduced at XIiol site.
  • the obtained recombinant vector was designated as pYES-HMGl.
  • the nucleotide sequence in the vector was determined, it was confirmed that the nucleotide sequence was SEQ ID NO: 3.
  • pYES2 is a yeast expression shuttle vector having a ori of yeast 2 mDNA as a replication origin and a GA1 transcription promoter inducible with galactose (FIG. 4).
  • the 373A DNA sequencer confirmed that the reading frames of the amino acids upstream and downstream of HMG1 in the obtained plasmid DNA were not misaligned, and that no amino acid substitution due to PCR error occurred near the binding site. ). As a result, the following plasmid was obtained in which no amino acid substitution due to a PCR error occurred near the binding site and the gene could be deleted without shifting the reading frame.
  • the deletion type HMG1 gene is described as A02y (y represents an arbitrary operation number) according to the pattern of the deletion, and the pYES2 vector containing A02y is described as pYHMG026, for example. The same applies to the deletion form of).
  • HMG1 A 02y SEQ ID NO: 7
  • HMGl SEQ ID NO: 8
  • HMGl my: SEQ ID NO: 10
  • HMG1 MOy SEQ ID NO: 13
  • HMG1 Mly SEQ ID NO: 14
  • HMG1M2J SEQ ID NO: 15
  • a 1.9 kbp SaR fragment having the primary structure of Minne-Yone-ichi (i Up-CTOZt) was prepared.
  • PYES2 (l-27): 5 * -GGC CGC AAA TTAAAG CCT TCG AGC GTC-3 * (SEQ ID NO: 73)
  • PYES2 (861-835): 5'-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3 '(SEQ ID NO: 74)
  • This fragment was inserted into the SiR site of pAURlOl (Takara) to obtain pAURGG115.
  • the absence of PCR errors in the gene in PAUEGG115 was confirmed by DNA sequencing.
  • PAURGG115 was linearized with 00651 and introduced into the A451 strain by the lithium acetate method. Colonies growing at 30 ° C were used as transformants. The obtained transformant was selected once again on an aureobasidin selection plate by a single-mouth method.
  • AURGG101 was used as one of A451-derived host strains.
  • AURGG102 integrates ⁇ into the genome, but AURGG101 does not integrate into the genome, and It turns out to be simply a replacement for the gene C.
  • AURGG101 can be used as an example of an A451-derived host strain because ⁇ t RZ is not directly involved in prenyl alcohol or prenyl diphosphate synthesis.
  • a gene map around the squalene synthase gene EKG ⁇ was extracted from the yeast genome database, and PCR primer DNA was designed to amplify a DNA fragment for the transcription promoter-ERG9 ⁇ substitution.
  • pYES2 was digested with N & el and Nhel, blunt-ended with the Klenow enzyme, and pYES2 ⁇ in which the 2 ori portion had been deleted by self-ligation was changed to a ⁇ type. Prepared by PGR amplification.
  • the primers used in the PCR are as follows.
  • E-MCSf 5'- GCC GTT GAC AGA GGG TCC GAG CTC GGT ACC AAG-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • E-URA3r 5 *-CAT ACT GAC CCA TTG TCAATG GGT AAT AAC TGA T-3 '(SEQ ID NO: 50)
  • the above primer has a ⁇ 31105 ⁇ recognition site (underlined portion) so that T / A ligation can be performed with a 0.7 kbp DNA fragment containing the downstream portion of the open reading frame YHR189W and a 0.9 kbp DNA fragment containing the upstream portion of ERG9 in the S. cerevisiae genome. ) Is added.
  • the YHR189W fragment was prepared by PCR using the PCR primers YHR189Wf and YHR189Wr to transform the YPH499 genomic DNA into a ⁇ form
  • the ERG9 fragment was prepared by PCR using the PCH primers ERG9f and ERG9r to transform the YPH499 genomic DNA into a form.
  • YPH499 genomic DNA was prepared using "Gen Toru-kun”.
  • ERG9f 5'-ATG GGAAAG CTA TTA CAA T-3 '(SEQ ID NO: 53)
  • ERG9r 5'-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3 '(SEQ ID NO: 54)
  • YHR189W-3f 5'-CAA TG AGG GCTATA TAT G-3 '(SEQ ID NO: 55)
  • ERG9-2r 5'-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3 '(SEQ ID NO: 56)
  • the vector was introduced into yeast using a Frozen EZ yeast transformation II kit inserted into the shell from Zymo Research (Orange, CA).
  • the recombinant is based on SGR medium (Glucose 1 and raffinose in SD medium replaced with glucose), CSM (-URA) (purchased from BIO 101 (Vista, CA)) and 40 mg final concentration.
  • SGR medium Glucose 1 and raffinose in SD medium replaced with glucose
  • CSM -URA
  • BIO 101 Vera, CA
  • SGR-U medium agar medium supplemented with adenine sulfate at 30 ° C.
  • the grown cells are spread again on the same medium, cultured and cultured for single colony isolation. went.
  • the obtained recombinant was named EUG (ERG9 :: URA3-GALlv) strain, and clones derived from A451 were designated EUG1-10, clones derived from YPH499 were designated EUG11-20, and clones derived from YPH500 were designated EUG21-30. .
  • ERG8 expression was inhibited by glucose repression in SD medium and growth was inhibited. Clones were selected, and AUG8 was obtained from A451, EUG12 from YPH499, and EUG27 from YPH500.
  • the gene expression of the various recombinant yeasts produced was determined by measuring the enzymatic activity of prenyl diphosphate synthase. , Northern blot hybridization
  • the 1-2 strain was obtained by introducing pYES-HMGl into the A451 strain
  • the 3-2 strain was obtained by introducing pYHMG044 into A451
  • the 13-2 strain was obtained by introducing pYES-HMGl3 ⁇ 4AURGGIOI.
  • 15-2 is the introduction of pYHMG044 into AURGG101.
  • DNA prepared from yeast was digested with el and ⁇ I, and 3 g per lane was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis.
  • molecular weight markers 0.52 g each of lkb ladder and ⁇ ⁇ Pro from Promega (Madison, Wis.) Were used.
  • the DNA was denatured with alkali and neutralized according to a standard method, and transferred to a Hybond N nylon membrane (Amersham, Buckinghamshire, England) by a blot blotting with 20 ⁇ SSC.
  • One concubine, Menofreno Stratagene's UV cross-linker was used to irradiate ultraviolet rays under optimal cross-link conditions to fix the DNA on the membrane.
  • RNA was prepared by partially modifying the method described in Current Protocols Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.12.2-13.12.3. The modification is that the prepared RNA sample was further treated with DNase I.
  • a Yip-type vector prepared in Example 4 was integrated into the genome, the prepared yeast DNA 0.3-0.6 ig was transformed into a type II synthetic oligo.
  • PCR was performed using each combination of nucleotides AUR-FWc and AUR-HVc, and each combination of AUR-SAL1 and AUR-SAL2 as primers. PCR was performed under the conditions of repeating 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes.
  • AUR-RVc 5'-TCA CTA GGT GTAAAG AGG GCT-3 '(SEQ ID NO: 58)
  • AUR-SAL2 5'-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3 '(SEQ ID NO: 60)
  • PCR fragments were cloned from Clontech (Palo Alto, CA) S. cerevisiae cDNA library into pT7blue T vector-1 (Novagen, Madison, WI) to produce pT7ERG20. .
  • SCFPS1 5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAAATT AG-3 '(SEQ ID NO: 61)
  • SCFPS2 5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTAAAC TT-3 '(SEQ ID NO: 62) PCR DIG Probe Synthesis Kit ("Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) using pT7ERG20 as type I and SCi Sl and SCFPS2 as primers DIG level probe DNA was prepared by the following procedure: The experimental conditions were according to the protocol attached to Roche Diagnostics.
  • the PCR was performed under the conditions of repeating 30 cycles of 30 seconds at 94, 58 581 minute, and 3 minutes at 72.
  • the synthesis status of the DIG-labeled probe DNA was checked by agarose gel electrophoresis after the reaction.
  • BTS1 (1-21): 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3 '(SEQ ID NO: 63)
  • HMG1 (1267-1293): 5'-AAC TTT GGT GCAAAT TGG GTC AAT GAT-3 '(SEQ ID NO: 42)
  • HMGl (2766-2740): 5'-TCC TAA TGC CAA GAAAAC AGC TGT CAC-3 '(SEQ ID NO: 65) Probe V:
  • a DIG-labeled probe DNA was prepared in the same manner as Probe I.
  • AUR-FW 5'-ATG GCAAAC CCT TTT TCG AGA-3 '(SEQ ID NO: 66)
  • AUR-RV 5 * -AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3 * (SEQ ID NO: 67)
  • Southern blot hybridization was performed at 42 ° C for 24 hours using DIG Easy Hyb (Roche) at a probe concentration of 20 ng / ml.
  • Northern blot hybridization was performed using DIG Easy Hyb at a concentration of 100 ng / ml for 24 hours at 50 ° C. Each was pre-hybridized with the DIG Easy Hyb solution for 24 hours at the same temperature as the hybridization. After hybridization, 2x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C, 3 times for 10 minutes, 0.2x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C,
  • the extended prenyl diphosphoric acid was extracted with water-saturated butanol, and the radioactivity was partially measured with a liquid scintillation pump.
  • FIG. 9 shows the results of the Southern plot hybridization. Also, _? Nearby
  • FIGS. 9 and 10 show the results of mapping of the sides by PCR.
  • lanes 1 to 7 correspond to the strain numbers (No. 1 to No. 7) used in (6), respectively.
  • N indicates a fel-digested
  • S indicates a ⁇ I-digested DNA lane.
  • DNA in each lane was prepared from the following strains.
  • Lane 1 A451; Lane 2, AURGG101; Lane 3, AURGG102; Lane 4, PYES-HMG1 / A451; Lane 5, pYHMG044 / A451; Lane 6, pYES-HMGl / AURGGIOI; Lane 7, pYHMG044 / AURGGl01
  • ERG20 FPP synthase gene
  • the AURGG102 strain had BTS1 integrated in the AUR1 portion, but the AURGGIOI did not differ from the host A451.
  • AURGGIOI only the AUR1 gene was substituted and mutated to the ⁇ ra ⁇ -C gene derived from pAURlOl, and the GALl-BTSl fragment was not integrated into the genome.
  • AUR is a medium supplemented with aureobasidin.
  • Medium 1 is the preculture medium, and medium 2 is the main culture medium.
  • lanes 1 to 7 are the same as in FIG. One indicates a transcript in SD medium, and a + indicates a transcript in SG medium.
  • ERG20 transcripts tended to decrease in strains 13-2 (No. 6) and 15-2 (No. 7) when ⁇ 3 ⁇ 4 transcription was induced in SG medium.
  • the HMOZ transcript increased remarkably in the strain into which the 6L4Up-H fragment was introduced by the plasmid (No. 4-7) upon induction of transcription in SG medium.
  • FIG. 43 The relative amount was calculated, and the specific activity per total protein was calculated.
  • Figure 12 shows the results.
  • the upper panel shows FPP synthase (ITS) activity
  • the lower panel shows GGPP synthase (GGPS) activity.
  • the upper panel shows HexPP synthase (HexPS) activity
  • the lower panel shows PTase (total prenyl diphosphate synthase) activity.
  • the gray bars show the results on the SD medium
  • the white bars show the results on the SG medium.
  • Most of the total prenylniphosphate synthase activity was FPP synthase activity, and the activity was increased by SG medium.
  • the GGPP synthase activity is about one in 20000 of FPP synthase activity and about one in 300 of HexPP synthase activity. HexPP synthase activity decreased in SG medium.
  • a gene (gene after PCR error correction) was inserted into a vector pRS434GAP or PRS444GAP containing a constitutively expressed promoter (27DH3), and pRS434GAP-HMGl and pRS444GAP-HMGl were prepared and introduced into A451.
  • the obtained recombinants were designated as pRS434GAP-HMGl / A451 and pRS444GAP-HMGl / A451.
  • the cells were cultured at 130 rpm in a reciprocal shaking culture at 26 for 4 days.
  • the GC / MS used an HP6890 / 5973 GC / MS system (Hewlett-Packard, Wilmington, DE).
  • the column used is HP-5MS (0.25 mm x 30 m, film thickness 0.25 Urn), and the analysis conditions are as follows.
  • the GC / MS analysis conditions in this specification are all the same.
  • FIGS. 13 to L5 The results of measuring the production of prenyl alcohol are shown in FIGS. 13 to L5.
  • FIG. 14 shows the results when 10 more colonies were picked from pRS434 No. 3 in FIG. 13, and
  • FIG. 15 is a diagram summarizing the data shown in FIG. In the colony No. 10 (pRS434) in Fig. 14, FOH production of 4.9 mg / l was observed.
  • reference numerals 434 and 44 represent the results when the pRS434GAP and pRS444GAP vectors were used, respectively.
  • the graph on the right shows the results when the host (A451) was cultured before gene transfer.
  • A451 has a different balance between squalene synthase activity and mepalonic acid pathway activity, and has multiple copies or transcriptional activation of the HU gene. This results in the accumulation of the intermediate metabolite pharmacocylic acid (PP), which may result in the production of its dephosphorylated ⁇ .
  • PP intermediate metabolite pharmacocylic acid
  • mutations in iMV or SO7 in the A451 genotype may have conferred the ability to produce FOH.
  • any strain that has the same balance of squalene synthase activity and mevalonate pathway activity as A451 or that has a mutation in and / or KO7 produces F0H by HG ⁇ introduction similarly. Can be expected.
  • FOH production there was a tendency that productivity was better when pRS434GAP was used than when PRS444GAP was used as a vector.
  • the obtained recombinant was cultured in a YM medium (a medium using # 499 as a host; the same applies hereinafter) supplemented with adenine sulfate to a concentration of 40 ⁇ g / ml.
  • the culture conditions are the same as in (h).
  • the pentane-extracted fraction of the culture solution was analyzed by GC / MS.
  • the production of prenyl alcohol (NOH, FOH) was measured.
  • 414PT, 414TR 434, and 444 are the results obtained using l pRS414PTadh, pRS414TPadh, pRS434xxx, and pRS444 xxx vectors (where xxx indicates the alphabetic part of the gene name used for the promoter).
  • EUG8 EUG12, EU27
  • Glc growth suppression from A451, YPH499, and YPH500
  • Plasmids pRS434GAP-HMGl and pRS444GAP-HMGl and pRS444GAP-HMGl in which the HAf ⁇ gene (after correcting for PCR errors) has been inserted into pRS434GAP or PRS444GAP containing a vector containing a constitutively expressed promoter ( 2! DH3 ⁇ 4) l NOH, 0.20mg / l FOH production), EUGl2 (0.13mg / l NOH, 5.9mg / l FOH production), EU27 (0.038mg / l NOH, 3.2mg / l ⁇ production), prenyl alcohol production was measured.
  • FIG. 17 The results are shown in FIG. 17 (EUG8), FIG. 18 (EUG12), and FIG. 19 (EUG27).
  • EUG strain produced FOH when cultured in a YM medium using glucose (Glc) as a carbon source, but the introduction of HkfGJ improved the productivity.
  • EUG8 and YPH499 from A451 strain and EUG12 and EUG27 from YPH500 have different production profiles, and it is considered that YPH strains are more suitable for production.
  • HMGJ gene (HMG1 ', a PCR error mutant HMG1's inserted plasmid pYES2-HMG) was inserted into the vector pYES2 containing the inducible promoter G Wp. Enter.
  • the cells were cultured at 130 ° C. for 4 days in a reciprocating shaking culture at 130 rpm. However, before adding to the SG medium, the cells were washed with physiological saline so that no glucose component was brought in. After culturing in SG medium, prenyl alcohol (NOH, FOH) production was measured.
  • NOH, FOH prenyl alcohol
  • FIG. 20A shows the result of A451
  • FIG. 20B shows the result of AURGG101.
  • pYES is the name of the vector used for gene transfer.
  • the plasmid pYES2-HMG in which the HG2 gene was introduced into the vector pYES2 containing the inducible promoter GALJp was introduced into W303-1A and W303-1B. After culturing in SG medium, prenyl alcohol (NOH, FOH) production was measured (Fig. 21).
  • Example 7 a prenyl alcohol-producing recombinant yeast was developed using the full-length HMG-CoA reductase gene or its mutant gene, but in this example, a deleted HMG-CoA reductase gene was used. Thus, a prenyl alcohol-producing recombinant yeast was produced and produced.
  • HMG1 ⁇ 044 and concealed G1 ⁇ 122 were effective for FOH production (average O.Omg / ⁇ for HMG122 / A451).
  • FIG. 23 the rightmost column shows the production amount of host AURGG101 before gene transfer.
  • Figure 24 is an enlargement of the scale of Figure 23.
  • PRS434GAP-HMGl or pRS444GAP-HMGl prepared in Example 7 (2) was introduced into the 15-2 strain prepared in Example (2). After culturing in SG medium, the production of prenyl alcohol (NOH, FOH) was measured (FIG. 25).
  • the production of FOH when IPP and DMAPP were added to the medium was 86.4 mg / 1 for wild type ispA introduced (indicated by pALispA in Fig. 26), and the wild type fps Was introduced (indicated by pFE15NS2.9-l in FIG. 26), and it was 12.0 mg / 1.
  • the ratio was 11.1 mg / 16.3 mg / 1 when JM109 carrying pl8M and pl8E was cultured, and 72.7 mg / L pl6D when JM109 carrying p4D was cultured.
  • JM109 was cultured, it reached 93.3 mg / 1 (Fig. 26).
  • the JM109 carrying pALispA4 and p3-47-11 had an FOH production capacity of 0.15 mg / 0.16 mg / 1 with JM109 carrying pALispA4 and p3-47-13 (FIG. 27).
  • JM109 harbors two plasmids, pALispA4 and plasmid P3-47-11 or p3-47-13 containing ', that is, E. coli into which idi and ispA have been introduced, such as IPP and DMAPP
  • plasmid P3-47-11 or p3-47-13 containing ' that is, E. coli into which idi and ispA have been introduced, such as IPP and DMAPP
  • CSM-URA manufactured by BIO 101 In
  • DOB manufactured by BIO 101 Inc.
  • CSM-URA manufactured by BIO 101 In
  • DOB manufactured by BIO 101 Inc.
  • media 200 nil / 500 nil-Equipped Erlenmeyer flask with baffle
  • AURGG101 strain was inoculated with one platinum loop and cultured at 30 ° C. and 130 rpm for 2 days.
  • centrifugation (1500 g, 5 minutes, 4 ° C) and washing with sterile physiological saline were repeated three times to completely remove the glucose contained in the culture solution. Thereafter, 50 ml was inoculated (1%) in the evening of Fermen and cultured under the following conditions.
  • a method for producing prenyl alcohol is provided. According to the present invention, a large amount of biologically active prenyl alcohol can be obtained. Based on this, it is possible to synthesize isoprenide terpenoids having various physiological activities. Further, the active prenyl alcohol provided in the present invention can also be used as a raw material for finding a substance having a new physiological activity.

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Description

明 細 書 プレニルアルコールの製造方法 技術分野
本発明は、 プレニルアルコールの製造方法に関する。 背景技術
生体内でのテルぺノイド （イソプレノイド） 合成は、 ァリル性二リン酸基質に ィソペンテニルニリン酸 （isopentenyl diphosphate) (IPP, C5)を順次縮合するこ とによって直鎖プレニルニリン酸であるゲラニルニリン酸（geranyl diphosphate (GPP, C10 ))、 ファルネシルニリン酸 (farnesyl diphosphate (FPP, C15))、 ゲラ二 ルゲラエル二リン酸 （gemnylgeranyl diphosphate (GGPP, C2。)） が生合成され るところから始まる（図 1)。図 1において、枠で囲まれた文字が酵素を表す。 hmgR はヒドロキシメチルダルタリル -CoA (hydroxymethylglutaryl-CoA： HMG-CoA) 還元酵素、 GGPSは GGPP合成酵素、 FPSは FKP合成酵素を示す。
プレニルニリン酸のなかでも、 FPPは最も重要な生合成中間体であり、 膨大な 種類のテルぺノイド類、 例えば、 エルゴステロール （プロビタミン D2) を含むス テロイド類、 キノン （ビタミン K, VK) の側鎖、 セスキテルペン類、 スクアレン (SQ) , フアルネシル化タンパク質のアンカ一分子、 天然ゴムなどの合成前駆体 である。
GGPPもまた、 生体内では重要な生合成中間体であり、 レチノール （ビタミン A, VA)、 i3 -カロテン （プロビタミン A)、 フイロキノン （ビタミン Ki, VK^) 卜 コフエロール類（ビタミン E, VE)、ゲラニルゲラニル化タンパク質のアンカー分 子、 葉緑体の側鎖、 ジベレリン、 ァーキアのエーテル型脂質などを始めとする化 合物の生合成に必須である。
FPP, GGPPのアルコール誘導体であるフアルネソーリレ (famesol)(FOH, C15)、 ネロリ ドール (nerolidol)(NOH， C15)、 ゲラニルゲラ二オール (geranylgeraniol) (GGOH, C2。)は、 香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、 薬 理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質と してもまた重要な物質である （図 1 )。
従って、 異性体混合物でないいわゆる活性型プレニルアルコールの純品を大量 に生産できる系の確立が望まれている。
IPP の生体内での合成は、 すべてメバロン酸経路 （ァセチル補酵素 A (acetyl-CoA) からメパロン酸を経て IPPを合成する経路） によると考えられて きたが、 1980年代末より、 M. Rohmerらがバクテリアを用いて新しい IPP合成 経路を明らかにした。 これは、 非メバロン酸経路又は DXP(l-deoxyxylulose 5- phosphate)経路と呼ばれており、 ダリセルアルデヒド 3-リン酸とピルビン酸から 1-deoxyxylulose 5-p osphateを経て IFPを合成する経路である。
FOHや NOHは、 精油等の天然物から少量調製される以外には、現在化学合成 法により合成されている。 化学合成法で合成される FOH、 NOHは、 一般的には 炭素骨格が同じであるが、 二重結合が 型 (ir^as型)と ( -型 (cis型)の混合物と して得られる。 （a -型である（£ E)-EOH又は (£)-ΝΟΗは生物の代謝経路で合 成される形であり、 工業的利用価値を有する。 （E^E^FOH 又は ( - NOH を純粋 な形で得るためには、 カラムクロマトグラフィ一や精密蒸留などを利用した精製 が必要である。 しかし、 熱的に不安定なァリルアルコール (allylalcohol)である FOHとその異性体である NOHの精密蒸留は困難である。 また、 カラムクロマト グラフィ一による精製は、 多量の溶媒充填剤を必要とし、 順次溶出してくる各画 分を分析しながら回収し、 さらに溶媒を除去しなければならないなど、 操作が煩 雑でコストも高く、 工業実施には適さない。 そこで、 -、 （ -幾何異性体の生成 制御や反応産物の繰り返し構造などの特徴から、 （ £)-ΙΌΗ (以下 「FOH」 と記 す） の生合成法が望まれているが確立されていない。 FOH合成基質は、 例えば出 芽酵母であるサッカロマイセス ·セ
Figure imgf000004_0001
cerew'si e)の細胞 内ではメバロン酸経路を経て供給されるが、 そのキー酵素と考えられる HMG- CoA還元酵素を利用しても、 スクアレン合成能が上がることしか知られていない (特開平 5- 192184号公報； Donald et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 3341-3344)。 また、 ステロール取り込み能を獲得した特別な出芽酵母のスクァレ ン合成酵素遺伝子欠損株を培養しても、 培養液 1リットルあたり 1.3mgの FOH の蓄積が知られているだけであり（Chambon et a/(1990) Curr. Genet. 18, 41-46)、 (^)-NOH (以下 「NOH」 と記す） の生合成法は知られていない。 発明の開示
本発明は、 HMG-CoA還元酵素遺伝子、 ΙΡΡ Δ -イソメラーゼ遺伝子若しくは PPP合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む発現用組換え DNAの導入によ り作製された組換え体を培養することによるプレニルアルコールの製造方法を提 供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 発酵工業に古来 から広く用いられ、 メバロン酸経路あるいは DXP経路を経てプレニルニリン酸 合成を行い、 遺伝子組換えに関する様々な手法が駆使できる宿主、 例えば単細胞 真核生物 （特に酵母） 又は原核生物 （例えばバクテリア、 特に大腸菌） を実験材 料にして、 プレニルニリン酸合成に関わる酵素の遺伝子導入によるプレニルアル コール生産系の開発を行った。 酵母でプレニルニリン酸合成に関わる酵素の遺伝 子 （例えば HMG-CoA還元酵素遺伝子） を宿主細胞内で人為的に発現させる系を 構築するために、 恒常発現型又は誘導発現型転写プロモーターを含み、 各種栄養 要求性マーカーを持った発現シャトルベクターの作製を行い、 これに目的の遺伝 子又はその変異型遺伝子を組み込み、 これを各種宿主細胞へ導入した。 そして、 その培養物から NOH又は FOHを得、 上記目的を達成することに成功し、 本発 明を完成するに至った。 大腸菌では、 既存のベクターを用いプレニルニリン酸合 成に関わる酵素の遺伝子 （例えば FPP合成酵素遺伝子や ΙΡΡ Δ -ィソメラーゼ遺 伝子） を宿主細胞に導入しその培養物を脱リン酸化した後 FOHを得、 上記目的 を達成することに成功し本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 HMG-CoA還元酵素遺伝子、 FPP合成酵素遺伝子若しく は ΙΡΡ Δ -イソメラーゼ遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモータ 一及び転写ターミネータ一を含む、 発現用組換え DNA又はゲノムインテグレー ト用 DNA断片を、 宿主に導入して組換え体を作製し、 該組換え体を培養した後、 得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルァ ルコールの製造方法である。 プレニルアルコールとしては、 炭素数 15 のもの、 例えば FOH又は NOHが挙げられる。 HMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異 型遺伝子としては、 配列番号 2、 4又は 6に示すアミノ酸配列をコードするもの やその欠失体、 例えば配列番号 1、 3、 5及ぴ 7〜16からなる群から選ばれるい ずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。 フアルネシル二リン酸合成酵素遺伝 子又はその変異型遺伝子としては、 配列番号 76、 78、 80、 82又は 84に示され るアミノ酸配列をコードするもの、 例えば配列番号 75、 77、 79、 81及び 83か らなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。 IPP Δ -イソ メラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子としては、 配列番号 86 に示されるァミノ 酸配列をコードするもの、 例えば配列番号 85 に示される塩基配列を含むものが 挙げられる。 転写プロモーターとしては、 ADH1 プロモーター、 TDH3 { GAP) プロモーター、 PGK1プ iモーター、 TRF2プ Uモーター、 ^ プロモーター 及び^ cプロモーターかなる群から選ばれるいずれかのものが挙げられる。但し、 これらのプロモーターと機能的に同等の活性を有する転写プロモーターも使用す ることができる。 また、 転写ターミネータ一としては、 AOfflターミネータ一又 は 夕一ミネ一夕一が挙げられる。 但し、 これらのターミネータ一と機能的 に同等の活性を有する転写ターミネータ一も使用することができる。 さらに、 宿 主は、 酵母、 例えばサッカロマイセス ·セレビシェなどの出芽酵母、 具体的には A451、 YPH499、 YPH500、 W303-1A若しくは W303-1B又はこれらに由来する 株、 あるいはバクテリア、 例えば大腸菌 Escherichia coli)ヽ 具体的には JM109 又はこれに由来する株であることが好ましい。
本発明によれば、 プレニルアルコールとして例えば NOHや FOHを、 宿主細 胞のみの培養物では到達できない濃度（少なくとも培地中 0.05mg/lの濃度）で生 産することができる。
さらに、 本発明は、 HMG-CoA還元酵素遺伝子、 FPP合.成酵素遺伝子若しくは ΙΡΡ Δ -イソメラーゼ遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター 及び転写ターミネータ一を含む、 発現用組換え DNA又はゲノムィンテグレート 用 DNA断片を、 宿主に導入してなる組換え体であって、 少なくとも 0.05mg/lの ΕΌΗ又は NOHを生産することができる組換え体である。宿主、 プロモーター、 ターミネータ一の種類は前記と同様である。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本 国特許出願 2000-401701号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。 本発明者は、 代謝工学的な手法を用い、 生体内で活性型プレニルアルコール ((a/7- -プレニルアルコール)を生産させる系の開発に臨んだ。 一般に、 I Pは、 フアルネシル二リン酸合成酵素 （FPS) の触媒により、 IPP及ぴ DMAPP (3,3- dimethylallyl diphosphate) を基質として合成されるが、 通常 FOHへの反応は 進行せず、 スクアレン合成酵素によるスクアレン合成、 ゲラニルゲラエルニリン 酸合成酵素による GGPP合成、へキサプレニルニリン酸合成酵素によるへキサプ レニルニリン酸合成などに進行する （図 1 )。本発明は、 生物によって異なる二つ の独立な経路 （メバロン酸経路と DXP経路） を経るプレニルニリン酸合成の活 性化に関与すると考えられる HMG-CoA還元酵素遺伝子、 FPP合成酵素遺伝子、 又は ΙΡΡ Δ -ィソメラーゼ遺伝子の導入により、通常予想されるスクアレンや主要 最終産物であるステロ一ル類などではなく、 一般的な代謝経路マップ中にも明記 されていない NOHや FOH等のプレニルアルコールを産生することができる形 質転換細胞を見出し、 プレニルアルコールの生物学的な大量生産系を開発したも のである。 また、 HMG-CoA還元酵素遺伝子の一部の領域をさまざまなパ夕一ン で欠失させ（図 2 )、 その遺伝子を転写プロモー夕一制御下で宿主に導入し、 ある いは、 FPP合成酵素のアミノ酸残基置換変異型酵素を宿主に導入し、 上記物質の 生物学的な大量生産系を開発したものである。
1 . 発現用組換え DNA又はゲノムインテグレート用 DNA断片の作製
本発明において、 宿主を形質転換するための発現用組換え DNAは、 発現の目 的となる遺伝子に、 転写プロモーター及び転写夕一ミネ一ター DNA を連結又は 揷入することにより得ることができる。 発現の対象となる遺伝子としては、 HMG-CoA還元酵素遺伝子 （例えば HMG 、 大腸菌 iEschericliia co ) FPP合 成酵素遺伝子 ispA、 バチルス · ステアロザーモフィ ラス BaciUus stearothermophilus)-F V 合成酵素遺伝子、 IPP-△イソメ ラ一ゼ遺伝子 ' '(ΟΚΡ182)等 (以下、 HMG- CoA還元酵素遺伝子等と略す)が挙げられる。なお、 これらの遺伝子は、 PCEや市販のキットを利用したクローニング手法により単離 することが可能である。
また、 HMG-CoA還元酵素遺伝子等に、 予め転写プロモーター及び転写ターミ ネ一ターが連結された遺伝子発現カセットを作製しておいて、 これをベクターに 組み込むこともできる。 連結及び挿入の順序は任意であるが、 HMG-CoA還元酵 素遺伝子等の上流に転写プロモ一夕一を連結し、 HMG-CoA還元酵素遺伝子等の 下流に転写夕一ミネ一夕一を連結する。 本発明においては、 適当な DNA、 例え ばベクター DNAに順次 HMG-CoA還元酵素遺伝子等、 転写プロモーター及び転 写ターミネ一夕一を組み込んでもよく、 転写方向が考慮されていれば順不同で組 み込んでもよい。
使用される DNAは、 宿主細胞に遺伝的に保持される可能性のあるものであれ ば特に限定されず、 例えば、 プラスミド DNA、 バクテリオファージ、 レトロト ランスポゾン DNA、 人工染色体 DNA (YAC:yeast artificial chromosome) 等が 挙げられる。 また、 ゲノムインテグレーションによる導入のための発現用組換え DNA断片としては、 複製機能は必ずしも必要ではなく、 PCR法又は化学合成に より作製されたものを使用することも可能である。
プラスミド DNA としては、 例えば pRS413、 pRS414、 pRS415、 pRS416、 YCp50、 pAUR112又は pAUR123などの YCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、 pYES2 又は YEpl3 などの YEp 型大腸菌-酵母シャトルベクター、 pRS403、 pRS404、 pRS405、 pRS406、 pAUElOl又は pAUR135などの Yip型大腸菌-酵 母シャトルベクター、 大腸菌由来のプラスミド （pBR322、 pBR325、 pUCl8、 pUC19、 pUC118、 pUC119、 pTV118N、 pTV119N、 pBluescript, pHSG298、 pHSG396又は pTrc99Aなどの ColE系プラスミド、 pACYCl77又は pACYCl84 などの pl5A系プラスミド、 pMW118、 pMW119、 pMW218又は pMW219など の pSClOl系プラスミド等）、 枯草菌由来のプラスミド （例えば pUB110、 pTP5 等)などが挙げられ、ファージ DNAとしてはえファージ（Charon4A、 Charon21A, EMBL3、 EMBL4、 λ gtlO, A gtll, λ ΖΑΡ)、 ^X174、 Ml3mpl8又は Ml3mpl9 等が挙げられる。 レトロトランスポゾンとしては、 T 因子などが挙げられる。 YAC用ベクターとしては pYACC2などが挙げられる。
宿主への組換え DNAの導入には、選択マーカー遺伝子を用いる場合が多いが、 ァッセィ法がある場合は、 必ずしもマーカー遺伝子は必要ではない。
転写プロモーターは、 恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモーターを 用いることができる。 恒常発現型プロモーターとは、 主要代謝経路に関わる遺伝 子の転写プロモーターを意味し、 どの生育条件でも転写活性を有すると考えられ ているプロモーターである。 誘導発現型プロモーターとは、 特定の生育条件で転 写活性があり、その他の生育条件では活性が抑えられるプロモーターを意味する。 転写プロモーターは、 酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれを用い てもよい。例えば酵母での発現用として、 ½ ^プロモーター、 プロモー 夕一、 TJDH3 GAP)プ1 aモーター、 ADH1プロモーター、 JPGK1プロモーター、 プロモーター等を用いることができる。 また、 大腸菌での発現用として、 trp、 lac, trc、 acなどのプロモーターを用いることができる。
さらに、 所望によりェンハンサーなどのシスエレメント、 スプライシングシグ ナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一などを連結することができる。 なお、 選択マーカーとしては、 URA3、 LEU2, TRP1、 HZS^などの栄養非要求性の表 現型を指標とするマーカー遺伝子や、 Amp Tetr, Cmr, Km\ £ZKJ-(7等の抗 生物質耐性遺伝子が挙げられる。
転写ターミネータ一は、 酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれの遺 伝子に由来するターミネータ一を用いてもよい。 例えば酵母での発現用として、 ADH1ター ー ー、 C C ターミネータ一等を用いることができる。 また、 大腸菌での発現用として、 ターミネータ一が挙げられる。大腸菌をはじめと するバクテリアの遺伝子の開始コドン上流に SD 配列 （5'-AGGAGG-3'で代表さ れる） を 翻訳のためのリボソーム結合部位として組み込むこともできる。
本発明において遺伝子導入用組換え DNAとして作製された発現ベクターは、 特に記さない限り、 プラスミド名の次に遺伝子名を表示することで命名及ぴ識別 することができる。 例えば、 ？ ( 4乃プロモータ一を有するプラスミ ド PRS434GAPに H ?_？遺伝子を連結した場合は 「pRS434GAP-HMGl」 のよう に表示する。 特別の場合を除き、 他のプラスミドやプロモーターを用いた場合も 同じ要領で表示する。
さらに、 本発明においては、 HMG-CoA還元酵素遺伝子等は、 その一部の領域 (最大で 2217塩基） が欠損した欠失型や、 野生型遺伝子又はこれら欠失型遺伝 子の塩基配列のうち 1個又は数個〜十数個の塩基が欠失、 置換又は付加した変異 型遺伝子でもよい。 アミノ酸配列においても、 天然型 HMG-CoA還元酵素のアミ ノ酸配列 （配列番号 2 ) のうち最大で 739個のアミノ酸が欠失した欠失型や、 ァ ミノ酸が野性型酵素又はこれら欠失型酵素から 1個又は数個 （例えば 1 假〜 10 個、 好ましくは 1個〜 3個） のアミノ酸に欠失、 置換又は付加等の変異が生じて もよい。 具体的には、 野性型又は図 2B に例示するような欠失型遺伝子、 又はそ れらにコードされる酵素のアミノ酸配列において、 たとえば図 2 Aに示される箇 所の塩基又はアミノ酸の置換が、 1〜： 10箇所の範囲で部位特異的に生じていても よい。 FPP合成酵素遺伝子においても、 1個又は数個〜十数個の塩基が欠失、 置 換又は付加した変異型遺伝子でもよい。 具体的には野生型 FPP 合成酵素遺伝子 (配列番号 77)の塩基を 5個置換した各種変異型遺伝子 (配列番号 79、 81又は 83) を用いることが出来る。 この変異型遺伝子は、 野生型 FPP 合成酵素 （配列番号 78) の第 79番目のァミノ酸残基 iyrが Asp (配列番号 80)、 Glu (配列番号 82)又 は Met (配列番号 84)に置換変異した変異型酵素をコードしている。
また、 Taq DNAポリメラーゼ等の忠実性 （fidelity) の低い DNAポリメラー ゼを用いた PCR(polymerase chain reaction)で野性型 DNAを増幅させた DNA 断片に生じる塩基の置換変異を 「PCR エラー」 といい、 例えば、 野生型 HMG- CoA還元酵素遺伝子 (配列番号 1 ) を铸型に用いたときの PCRエラーによる塩 基の置換変異に起因するコードされるポリペプチドの置換変異を有する HMG- CoA還元酵素遺伝子 (「HM6^'」 とする） も、 本発明において使用することがで きる。野性型 HMG- CoA還元酵素遺伝子（配列番号 1)を铸型にしたときの、 PCR エラーによる塩基の置換の態様を図 2Aに示す。 HUは配列番号 3に示す塩基 配列を有しており、これによつてコードされるァミノ酸配列を配列番号 4に示す。 図 2 Aにおいて、ヌクレオチドの変異は、置換前の塩基（1文字表記）、 HMG-CoA 還元酵素遺伝子の開始コドンの第 1塩基を 1としたときの塩基番号、 置換後の塩 基（1文字表記）の順で表示してある。アミノ酸の変異は、 PCRエラー型 HMG-CoA 還元酵素のアミノ酸配列において、 置換前のアミノ酸残基 （ 1文字表記）、 HMG-CoA還元酵素のアミノ酸番号、 置換後のアミノ酸残基 （1文字表記） の順 で表示してある。 さらに、 上記 PCRエラー型の塩基配列を部位特異的変異誘発 法等により一部修正することもでき、 このような修正型の HMG-CoA還元酵素遺 伝子も、 本発明において使用することができる。 さらに、 HMG-CoA還元酵素の 膜貫通ドメインと予想されている領域を欠損させた欠失体をコードする HMG- CoA還元酵素遺伝子 (PCII エラー型を含む） も、 本発明において使用すること ができる。 例えば、 図 2Bにおいて、 PCRエラー型 HMG-CoA還元酵素遺伝子 IMG の欠失型遺伝子 MG1Aの例を示す。 最上段は欠失のない遺伝子 HMG1 である。 細線 （一） で表した部分は欠失した領域である。 それぞれの欠失型遺伝 子において、 HMG 遺伝子 （配列番号 3 ) のうちどの領域を欠失させたのかを表 1に示す。 HMi^ '欠失型遺伝子は、欠失のパターンに従って HMGJAxxyで表す。
XXは欠失のパターンを、 yは作業番号（任意の数字） を表す。 図 2Bには、 HMG1 △ 02y の例として 「Δ 026」 を表示した （他の欠失パターンのものも同様に表示 した）。
¾瑯瓛
表 1 欠失の態様
推定膜貫通ドメイ
欠失型名称 プライマ一 1 プライマ一 2 プラスミド ンの欠失 欠失領域 欠失後の配列
HMG1 Δ02γ HMG1 (558-532) HMG1 (799-825) pYHMG02X #2-#3 配列番号 7 HMG1 Δ04γ H GK1191-1165) HMGK1267-1293) PYHMG04X #6 第 1192塩基〜第 1266塩基 配列番号 8 HMG1 Δ05γ H G1 (1380-1354) H GK1573-1599) pYHMG05X #7 第 1381塩基〜第 1572塩基 配列番号 9 H GlA06y H G1 (558-532) HMGK1267-1293) pYHMG06X #2-#6 第 559塩基〜第 1266塩基 配列番号 10 HMG!A07y HMGK558-532) HMGK1573-1599) PYHMG07X #2-#7 第 559塩基〜第 1572塩基 配列番号 11 HMG1 Δ08γ HMGK27-1) H GK1573-1599) PYH G08X #1 - #7 第 27塩基〜第 1572塩基 配列番号 12 HMG1A10y HMGK27-1) H GK1816-1842) pYHMGIOX #1 - #フ(- 605 aa) 第 27塩基〜第 1815塩基 配列番号 13 HMG1 A11y HMGK27-1) H GK1891-1917) pYH GIIX #1一 #7(— 631 aa) 第 27塩基〜第 1890塩基 配列番号 14 H GlAl2y HMGK27-1) H G1 (1990-2016) PYHMG12X #1-#7(-663 aa) 第 27塩基〜第 1989塩基 配列番号 15 H G1 Al3y HMGK27-1) H G1 (2218-2244) PYHMG13X #1一 #7( - 739 aa) 第 27塩基〜第 2217塩基 ― 配列番号 16
プライマー配列
H GK27-1) 5' TTT GAG TCC CTT GAA TAG GGG GGG CAT 3' 配列番号 38
HMG1 (558-532) 5' GTC TGC TTG GGT TAG ATT TTC TGA AAA 3' 配列番号 39
H GK799-825) 5' CAG AAA ATG AAG ATT GCC GAG TAT GCC 3' 配列番号 40
H GK1191-1165) 5' AGA AGA TAG GGA TTT CTT TTC TGC TTT 3' 配列番号 41
HMGK1267 - 1293) 5' AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT 3' 配列番号 42
H GK1380-1354) 5' TTG CTG TTT AAA GTT TTC AGA GGG ATT 3' 配列番号 43
HMGK1573-1599) 5' CAT ACC AGT TAT ACT GCA GAG CAA TTG 3' 配列番号 44
H GK1816-1842) 5' GCA TTA TTA AGT AGT GGA AAT ACA AAA 3' 配列番号 45
HMGK1891-1917) 5' CCT TTG TAG GGT TTG GAG AAA AAA TTA 3' 配列番号 46
H GK1990-2016) 5' TCT GAT GGT TTA CCA TAT AAA AAT TAT 3' 配列番号 47
H GK2218-2244) 5' AAG GAT GGT ATG ACA AGA GGG CGA GTA 3' 配列番号 48
2 . 組換え体の作製
本発明の組換え体は、 本発明の組換え DNAを、 HMG-CoA還元酵素遺伝子等 (各種変異型を含む。特に記さない限り、 以下同じ。） が発現し得るように宿主中 に導入することにより得ることができる。 ここで、 宿主としては、 プレニルアル
10/1
差替え用 ¾ (規則 26》 コールを生産することができるものであれば特に限定される'ものではないが、 大 腸菌又は酵母が好ましい。
本発明において、 プロモータ一、 HMG-CoA還元酵素遺伝子等及び夕一ミネ一 夕一を含む組換え DNAは、 酵母などの単細胞真核微生物を含む真菌、 大腸菌な どの原核生物、動物細胞、植物細胞などに導入して組換え体を得ることができる。 真菌としては、 変形菌類 （Myxomycota)、 藻菌類 （Phycomycetes)、 子嚢菌類 、Ascomycota)、 担于 1¾類 （Basidiom cota)、 不完全菌類 (Fungi Imperfecti) が挙げられる。 真菌としては、 単細胞生物のものが工業上利用上重要な酵母とし てよく知られており、 子嚢菌類の子嚢菌酵母、 担子菌類の担子菌酵母又は不完全 菌類の不完全菌酵母が挙げられる。 酵母としては、 子嚢菌酵母、 特に出芽酵母で あるサッカロマイセス 'セレビシェ Saccharomyces cerevisiae：パン酵母として 知られる）、 キヤンディダ ·ュ一ティリ MCandida 又はピキア ·パス卜リ ス (JPichia pastris)等、 分裂酵母であるシゾサッカロマイセス * ボンべ
Figure imgf000014_0001
ら tlる。 酵母の株は、 プレニルアルコール を生産することができる限り特に限定されるものではない。 S. cerevisiaeの場合、 例えば下記の株： A451、 EUG8、 EUG12, EUG27、 YPH499、 YPH500、 W303-1A, W303-1B、 AURGG101などが挙げられる。 酵母への組換え DNAの導入方法は、 例えばエレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法等を採 用することができる。
A451 (ATCC200589, MATa canl leu2 trpl ura3 aroT)
YPH499 (ATCC76625, MATa ura3-52 Jys2-801 ade2-W>\ trpl- A 63 his3- Δ 200 leu2- Δ 1， Stratagene , La Jolla, CA)
YPH500 (ATCC76626, MATa ura3-52 Jys2-801 ade2-lQl trpl- A 6S hisS- Δ 200 leu2- Δ 1, Stratagene)
W303-1A {MATa ]eu2-S leu2-\Yl his3-\\ ade2-\ ura3-\ trpl-1 canl-100)
W303-1B (MATa Ieu2-3 Ieu2-1YI his 3-11 ade2- 3-1 trpl-1 canl-100)
AURGG101 (A451, aurl::AURl-C)
EUG8 (A451, EEG9p： URA3- GALlv)
11 EUG12 (YPH499, EEG9p : UEA3-GALlp)
EUG27 (YPH500, E G9p：： URA3- GALlp) 原核生物としては、 ァ一キア （ai'chaea) とパクテリア （bacteria, 細菌） が挙 げられる。 ァーキアとしては、 メタノパクテリ
Figure imgf000015_0001
などの メタン生産菌、 ハロパクテリゥム属 Halobacterium などの好塩菌、 スルフォ 口パス属 （Suぱ olobus) 等の好熱好酸性菌が挙げられる。 バクテリアとしては、 工業的又は学術的に利用価値の高い各種グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌、 例
Figure imgf000015_0002
subutilis) ゃパシラス ·ブレビス（Bacillus brevis)等のバシラス属、 シユードモナス ·プチ ダ seudomo putida) 等のシユードモナス属、 ァグロバクテリウム ·ッメ
{Agrobacterium rhizogenes) 等のァグロバクテリウム属、 コリネバクテリウ ム ·グルタミカム ( Corynebacterium glutamicum) 等のコリネパクテリゥム属、 ラクトバシラス ·プランタラム Lactobacillus plantarum) 等のラクトバシラス 属、 ァクチノマイセス属 (Actinomyces) やストレプ卜マイセス （ Streptmyces 等の放線菌類 (Actinomycetes)が挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、 本発明の組換え DNAが細胞中で自律複 製可能であると同時に、 転写プロモータ一、 リボゾーム RNA結合領域としての SD 配列、 本発明の遺伝子により構成されていることが好ましい。 転写ターミネ 一ターなどを適宜挿入することもできる。 また、 プロモーターを制御する遺伝子 が含まれていてもよい。 大腸菌としては、 BL21、 DH5 、 HB101, JM101、 MBV1184、 TH2、 XLl-Blue, Y- 1088等が挙げられるが、 これらに限定されるも のではない。 転写プロモーターは、 大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば いずれを用いてもよい。 例えば プロモーター、 cプロモーター、 PLプロモ 一夕一、 PRプロモーターなどの、 大腸菌やファージに由来するプロモーターが用 いられる。 acプロモーターなどのように、 人為的に設計改変されたプロモー夕 一を用いてもよい。 細菌への組換えベクターの導入方法は、 細菌に DNAを導入 する方法であれば特に限定されるものではない。 例えばカルシウムイオンを用い
12 る方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 その他市販のキットを使用する方法等によ り行われる。
遺伝子が宿主細胞に導入されたか否かの確認は、 PCR法、 サザンプロットハイ ブリダィゼ一シヨン法等により行うことができる。 例えば、 組換え体から DNA を調製し、 導入 DNA特異的プライマーを設計して PCRを行う。 その後は、 増幅 産物についてァガ口一スゲル電気泳動、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキ ャピラリー電気泳動等を行い、 臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色す るか、 あるいは UV検出器で DNAを検出し、 増幅産物を 1本のパンド又はピー クとして検出することにより、 導入 DNAを確認する。 また、 予め蛍光色素等に より標識したプライマーを用いて PCR を行い、 増幅産物を検出することもでき る。
3 . プレニルアルコールの生産
本発明において、 プレニルアルコールは、 導入された HMG-CoA還元酵素遺伝 子等を含む上記組換え体を培養し、 その培養物から採取することにより得ること ができる。 「培養物」 とは、 培養上清のほか、 培養細胞若しくは培養菌体自体、 又 は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。 本発明の組換え 体を培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。 プ レニルアルコールとしては、 炭素数 15のもの、 例えばフアルネソール （FOH；)、 ネロリドール （NOH) が挙げられる。 上記プレニルアルコールは、 それぞれ単独 で又は混合物として上記培養物中に蓄積される。
微生物を宿主として得られた組換え体を培養する培地は、 微生物が資化し得る 炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 組換え体の培養を効率的に行うことがで きる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 炭素源として は、 グルコース、 ガラクトース、 フラクト一ス、 スクロース、 ラフイノース、 デ ンプン等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノー ル等のアルコール類が挙げられる。 窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニ ゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸若 しくは有機酸のアンモニゥム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられ、 その他べ
13 プトン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一、 各種アミノ酸等が挙げられる。 無 機物としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸 カルシウム等が挙げられる。 培養は、 通常、 振盪培養又は通気攪拌培養などの好 気的条件下、 26 〜 36°C、 好ましくは cere siaeを宿主とした場合 30 で 2 〜7日、 JE. m/iを宿主とした場合 37 で 12〜： 18時間行う。 pHの調整は、 無機 又は有機酸、 アルカリ溶液等を用いて行う。培養は、 必要に応じてアンピシリン、 クロラムフエ二コール又はォ一レオバシジン A等の抗生物質を培地に添加して行 つてもよい。
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現べクタ一を導入した 組換え体を培養する場合は、 必要に応じてィンデューサーを培地に添加してもよ い。 例えば プロモータ一を用いた場合、 炭素源としてガラクトースを使用 することができる。 また、 イソプロピル- /3 -D-チォガラク卜ビラノシド （IPTG) で誘導可能な転写プロモータ一を有する発現べクターで形質転換した微生物 （例 えば大腸菌） を培養するときには、 IPTGを培地に添加することもできる。
上記培養条件で培養すると、 宿主により高収率でプレニルアルコールを生産す ることができる。 特に、 宿主が AURGG101、 ベクターが pYHMG044の場合に は、 培地 1リットルあたり 32mg以上、 培養条件によっては 150mg以上産生す ることが可能である。
本発明においては、 上記培地に、 さらにテルぺノイド、 油脂、 界面活性剤等を 添加してプレニルアルコールの生産効率を高めることができる。 これらの添加剤 として以下のものを例示することができる。
テルぺノイド ：スクアレン、 トコフエロール、 IPP、 DMAPP
油脂：大豆油、 魚油、 アーモンド油、 ォリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトン X-305、スパン 85、アデ力ノール LG109(旭 電化製)、 アデ力ノール LG294(旭電化製)、 アデ力ノール LG295S (旭電化製)、 ァ デカノール LG297(旭電化製)、 アデ力ノ一ル B-3009A (旭電化製)、 アデ力プロニ ック L- 61 (旭電化製）
油脂濃度は 0.01 %以上、 好ましくは 1〜3 %であり、 界面活性剤濃度は 0.005 %
14 〜1%、 好ましくは 0.05〜0.5%であり、 テルぺノイド濃度は 0.01 %以上、 好まし くは：！〜 3 %である。
培養後、 プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、 ホモ ジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のプレニル アルコールを採取する。 また、 細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよ い。 あるいは、 本発明のプレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場 合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により菌体又は細胞を除去す る。 その後、 有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコール を採取し、 必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製する ことができる。
本発明において、 宿主株と、 導入した組換え DNAとしてのベクターとの好ま しい組み合わせ及びプレニルアルコール生産の関係を例示すると表 2の通りであ る。
表 2
15 璐嗨： ¾■ 表 2 プロモーター 退 IE子 佰王 FOH生産； ¾(mg/l) NOH生産惠 (mg/l)
GAP HMGl S. cerevisiae A451 0.05, 0.65-11.2, 4.9-11.2 0.05， 0.05-0.16， 0.16
GAP HMGl S. cerevisiae EUG8(A451由来） 0.2, 0.20-1.8, 1.8 ，
ADH, GAP,PGK,TE: HMGl S. cerevisiae YPH499 0.05, 0.05-0.11, 0.11 ，
GAP HMGl S. cerevisiae EUG12(YPH499由来） 5.9, 5.9-18.3, 18.3 0.13, 0.13-0.30, 0.30
PGK'TEF HMGl S. cerevisiae YPH500 ，一 ) Ϊ ！
GAP HMGl S. cerevisiae EUG27(YPH500田采) 3.2， 3.2-13.6， 13.6 0.05， 0.05-0.22， 0.22
GAP HMGl S. cerevisiae W303"1A j 一，
GAP HMGl S. cerevisiae W303'1B ， ，
GAL HMGl b, cerevisiae A451 0-05，―，―
GAL HMGl S, cerevisiae AURGG101(A451田釆) 0.05， 0.29-8.2， 8.2 0.05， 0.095-2.7, 2,7
GAL HMGl b. cerevisiae YPH499 0.05， 0.05-0.057, 0.057 Ϊ
T HMGl a. cerevisiae xr loUU ) ，
/r ^
. cerevisiae VvdUo 1A Ϊ ， 0.05, 0.10-0.15, 0.15
HMTi~fl cerevisiae WoUo l±> 0.05, 0.091-0.14， 0.14 1 Λ T J±MLr(J4y o. cerevisiae U.Oo, u. -u.oly U.51 0.05, 0.05-0.058, 0.058
Λ T iilVlU(J4y b, cerevisiae
Figure imgf000019_0001
U.U5, U.U5 loo, od"15o 0.05， U.05"233 2.4-23
Λ T £iMLru4y o. cerevisiae iir±i4yy ) i
A T XllVL LrU^ cerevisiae x jrxiouu ， ϊ ：
GAL HMG04y O, υθΓθ νΊοΙαθ VV ouo 丄 ϋ i
GAL HMG04y . CGi GVISJae VV OUO _D ) ϊ J
GAL HMGxxy . υθΓθ νΊΰΙαθ U.Uo, U.Lit) 丄 1， 1)· 1丄 U.Uo, U.U5 0.12， U.l
GAL HMGxxy n 1 Q 1 Q
O Q. ΟΘΓΘνΙβΙίιθ
Figure imgf000019_0002
U.UO, )-丄1， U.ll
GAL HMGxxy S. cerevisiae YPH499 ) )
GAL HMGxxy S. cerevisiae YPH500 ， ) j j
GAL HMGxxy S. cerevisiae W303-1A ) , Ϊ
GAL HMGxxy S. cerevisiae W303-1B
GAP&GAL HMG&HMG04 S. cerevisiae AURGG10l(A451由来） 22, 22-66, 66 12, 12-28, 28
ispA E. coli JM109 11, 11-93, 73-93
fps E. coli JM109 12, ―,一 ) J
ispA &idi E. coli JM109 0.15, 0.15-0.16,— J ϊ
FOH, NOHの生 量は、左から順に下限、好ましい範囲、ざらに好ましい fl囲を示す。
-はデータなし。
表 2より、 例えば以下の生産量を示すことができる。
(1) 恒常発現型転写プロモーター下流に HMG1又はその変異型遺伝子 (例えば MG1')若しくはその欠失型遺伝子 UMGxxyを結合した： DNAを S.cerev^iae細 胞に導入した場合、 FOHを少なくとも O.05mg 、好ましくは 0.05_18.3mg/l生産 し、 NOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-0.3mg/l生産した。
(2) 誘導発現型転写プロモーター下流に HMG1又はその変異型遺伝子 (例えば
16/1
差替え用紙 （規則 26) H G^')若しくはその欠失型遺伝子 HMCha を結合した DNAを S.cereWs ae細 胞に導入した場合、 FOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-158mg/I、 さ らに好ましくは 53-158mg/l生産し、 NOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-23mg/l, さらに好ましくは 2.4-23mg/l生産した。
(3) 恒常発現型転写プロモーター下流に HMG^ 誘導発現型転写プロモーター 下流に の欠失型遺伝子 HMGQAyを結合した 2種の DNAを S.cerevisiae 細胞に導入した場合、 ΒΌΗを少なくとも 22mg/l、好ましくは 22-66mg/l生産し、 NOHを少なくとも 12mg/l、 好ましくは 12-28mg/l生産した。
(4) HMG1 又はその変異型遺伝子 (例えば Bkfi? )若しくはその欠失型遺伝子 ΗΜΟ χγを含む DNAを S.cerevisiae A451又は A451由来株の細胞に導入した 場合、 FOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-158mg 、 さらに好ましく は 53-158mg/l生産し、 NOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-23mg/l、 さらに好ましくは 2.4-23mg/l生産した。
(5) HMG1 又はその変異型遺伝子 (例えば 若しくはその欠失型遺伝子 ffMGxxyを含む DNAを S.cerevisiae YPH499又は YPH499由来株の細胞に導 入した場合、 FOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-18.3mg/l、 さらに好 ましくは 5.9-18.3mg/l生産し、 NOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.13- 0.30mg/l生産した。
(6) HMG1 又はその変異型遺伝子 (例えば 若しくはその欠失型遺伝子 厘 Gxxyを含む DNAを S.cerevisiae ΎΡΗ500又は YPH500由来株の細胞に導 入した場合、 FOHを少なくとも 3.2mg/l、好ましくは 3.2-13.6mg 生産し、 NOH を少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-0.22mg/l生産した。
(7) HMG1又はその変異型遺伝子 (例えば Hkff^')を含む DNAを S.cerevisiae 細胞に導入した場合、 FOH を少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-18.3mg/l
17 生産し、 NOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-2.7mg/l生産した。
(8) HU'の欠失型遺伝子 HMfexyを含む DNAを S.carew's ae細胞に導入し た場合、 FOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-158mg/l、 さらに好まし くは 53-158mg/l生産し、 NOHを少なくとも 0.05mg/l、 好ましくは 0.05-23mg/l、 さらに好ましくは 2.4-23mg/l生産した。
(9) 大腸菌の FPP合成酵素遺伝子 ispAの置換変異型遺伝子を含むプラスミド を大腸菌に導入し、 IPPと DMAPPを含む培養液で培養し、 フォスファターゼ処 理した場合、 FOHを少なくとも llmg/l、 好ましくは ll-90mg/l、 さらに好まし くは 64-90mg/l生産した。
(10) ispAと idiを大腸菌に入れると、 IPPや DMAPPの添加なしでもフォスフ ァタ一ゼ処理により FOHを少なくとも 0.15mg/l、 好ましくは 0.15-0.16mg/l生 産した。 図面の簡単な説明
図 1は、 メバロン酸経路関連酵素の代謝経路を示す図である。
図 2Aは、 欠失型 H G^遺伝子の構築図である。
図 2Bは、 置換変異のパターンを示す図である。
図 3は、 プラスミド pRS414を示す図である。
図 4は、 プラスミド pYES2を示す図である。
図 5は、 AOH /プロモーター、 ターミネ一ターの配列を示す図である。
図 6Aは、 プラスミド pRS414PTadhを示す図である。
図 6Bは、 プラスミド pHS414TPadhを示す図である。
図 7A-1は、 プラスミド pRS434ADHを示す図である。
図 7A-2は、 プラスミド pRS434GAPを示す図である。
図 7B-1は、 プラスミド pRS434PGKを示す図である。
図 7B-2は、 プラスミド pRS434TEFを示す図である。
18 図 7C- 1は、 プラスミド pRS436ADHを示す図である。
図 7C- 2は、 プラスミド pRS436GAPを示す図である。
図 7D-1は、 プラスミド pRS436PGKを示す図である。
図 7D-2は、 プラスミド pRS436TEFを示す図である。
図 7E-1は、 プラスミド pRS444ADHを示す図である。
図 7E-2は、 プラスミド pRS444GAPを示す図である。
図 7F-1は、 プラスミド pRS444PGKを示す図である。
図 7F-2は、 プラスミド pRS444TEFを示す図である。
図 7G-1は、 プラスミド pRS446ADHを示す図である。
図 7G-2は、 プラスミド pRS446GAPを示す図である。
図 7H-1は、 プラスミド pRS446PGKを示す図である。
図 7H-2は、 プラスミド pRS446TEFを示す図である。
図 8は、 プラスミド PALHMG106の物理地図を示す図である。
図 9は、 サザンブロッテイングの結果を示す写真である。
図 10は、 PCRマッピングの結果を示す写真である。
図 11は、 ノーザンプロッティングの結果を示す写真である。
図 12Aは、粗酵素液中の各プレニルニリン酸合成酵素の比活性を示す図である ( 図 12Bは、粗酵素液中の各プレニルニリン酸合成酵素の比活性を示す図である ( 図 13は、 A451に pRS434GAP-HMGl又は pRS444GAP-HMGlを導入したと きのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 14は、 A451に pRS434GAP-HMGl又は pHS444GAP-HMGlを導入したと きのプレニルアルコルの生産量を示す図である。
図 15は、 A451に pRS434GAP-HMGl又は pRS444GAP-HMGlを導入したと きのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 16 は、 YPH499 に pRS414PTadli-HMGl、 pRS414TPadh-HMGl , PRS434GAP-HMG1 、 pRS444GAP-HMGl 、 PRS434PGK-HMG1 、 pRS444PGK-HMGl, pRS434TEF-HMGl又は pRS444TEF-HMGlを導入した ときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 17は、 EUG8に pRS434GAP-HMGl、 PRS444GAP-HMG1を導入したとき
19 のプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 18は、 EUG12に pRS434GAP-HMGl、 PRS444GAP-HMG1を導入したと きのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 19は、 EUG27に pRS434GAP- HMG1、 pRS444GAP-HMGlを導入したと きのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 20Aは、 A451株に pYES-HMGl、 pYHMG044を導入したときのプレニル アルコールの生産量を示す図である。
図 20Bは、 AURGG101株に pYES-HMGl、 pYHMG044を導入したときのプ レニルアルコールの生産量を示す図である。
図 21は、 W303-1A、 W303-1Bに pYES-HMGlを導入したときのプレニルァ ルコールの生産量を示す図である。
図 22 は、 A451 に pYHMG026、 pYHMG044、 pYHMG056, pYHMG062, pYHMG076、 pYHMG081、 pYHMGlOO, pYHMG112、 pYHMG122を導入した ときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 23は、 AURGG101に pYHMG026、 pYHMG044、 pYHMG056、 pYHMG062, pYHMG076、 pYHMG081, pYHMGlOCK pYHMG112、 pYHMG122を導入した ときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 24は、 AURGG101に pYHMG026、 pYHMG044、 pYHMG056、 pYHMG062、 pYHMG076、 pYHMG081、 pYHMGlOCK pYHMG112、 pYHMG122を導入した ときのプレニルアルコールの生産量を示す図である（図 23の拡大図)。
図 25 は、 AURGG101 に pRS434GAP-HMGl 又は pRS444GAP-HMGl と pYHMG04 とを導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。 図 26は、 変異型 is 遺伝子を導入した E. colH IPPと DMAPPを含む培 養液で培養したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 27は、 変異型 i¾a4遺伝子を導入した E. «ώ'を、 ΙΡΡと DMAPPを含まな い培養液で培養したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
図 28は、 組換え体 15-2株 (pYHMG044/AURGG101)をジャーフアーメン夕一 培養したときのプレニルアルコールの生産量と細胞数を示す図である。
20 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例 1〕 発現ベクターの構築
Stratagene (La Jolla, CA)より購入した £；. co7i SURE2ス一パーコンピテント 細胞を宿主としてベクターの構築を行った。 6 cerew'siaeゲノム調製用、 ベクタ —導入テスト用には YPH499 (Stratagene) を用いた。
(1) E. coli-S. cerevisiaeンャ卜リレべクタ一
Stratagene社よりプラスミド pRS404及び pRS414 (図 3 ) を購入した。 宝酒 造より pAURl23を購入し、 Invitrogen社 (Carlsbad, CA) から pYES2 (図 4 ) を購入した。
(2) ゲノム DNA
宝酒造から酵母ゲノム DNA調製用キット 「Genとるくん」 を購入し、 添付の プロトコルに従って . cerevisiae YPH499 からゲノム DNAを調製した。
(3) pRS414へ ADHl -ADHlt断片の挿入
pRS414 (図 3 ) を Naelと PTOIIで切断し、 fl oriと i ac 部分を含まない 4.1 kbp断片をァガロースゲル電気泳動で精製した。 また、 pAUR123を ainHIで 切断し、 Klenow酵素で平滑末端にした後、 ァガロースゲル電気泳動で 転 写プロモータ一 UWHlv) 及ぴ 転写ターミネータ一 （ OH2t) を含む 1.0 kbpの断片 （図 5、 配列番号 17) を精製した。 pRS414の 4.1kbp断片には、 大腸 菌と酵母の複製開始点、 大腸菌用形質転換マーカー Amp1^と酵母用栄養要求性マ 一力一; 7¾ が残っており、 pAUR123 1.0 kbp断片は AOH¾ 、 DHZtおよび それらに挟まれたクロ一ニングサイトを含んでいる。 この二つの断片を宝酒造 DNAライゲーシヨンキットにより連結したのち SURE2へ形質転換した。
得られた組換え体からプラスミド DNAを調製し、 SaRと Sealによるマツピン
21 グでチェックしたところ、 二通りの向きで pRS414 へ揷入されたプラスミ ド pRS414PTadh (図 6A) 及び pRS414TPadh (図 6B) が得られた。
(4) pRSベクタ一へ 断片の揷入
CYC1転写ターミネータ一 CYClt断片は PCRで調製した。以下の PCR用オリ ゴ DNA:XhoI-TcyclFW と Apal-TcyclRVとの組合せを PCR用プライマー DNA に用い、 铸型として pYES2を用いた。
XhoI-TcyclFW： 5'- TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG -3' (配 列番号 18)
Apal-TcyclRV： 5'- CAT TAG GGC CCG GCC GCAAAT TAAAGC CTT CG - 3' (配列番号 19) ■
反応は、 0.1 H g pYES2, 50 pmol プライマー DNA, MgS04含有 lx iYuバッ ファー（Promega, Madison, WI), 10 nmol dNTP, 1.5 u Pfu DNAポリメラーゼ (Promega)及び 1 1 perfect match ポリメラーゼェンハンサ一 (Stratagene)を 含む 50 β ΐの反応液を調製し、 95°C 2分、 （95°C 45秒、 60 30秒、 72°C 1 分） X 30サイクル、 72で 5分、 4°Cストックの反応条件で行った。 増幅した DNA を XhoLと 4 lで切断し、 ァガロースゲル電気泳動で 260 bpの DNA断片を精 製し CYClt-XAとした。
pRS404、 pRS406 の JSoI-^^I 部位に CYClt-XA を揷入し、 それぞれ、 pRS404Tcyc、 pRS406Tcycとした。
(5) 転写プロモーターの調製
PAUR123又は酵母ゲノム DNAを踌型にして PCRにより転写プロモーターを 含む： DNA断片を調製した。 使用した DNAプライマーは以下の通りである。
SacI-PadhlFW： 5'-GAT CGA GCT CCT CCC TAA CAT GTA GGT GGC GG- 3' (配列番号 20)
SacII-PadhlRV： 5'-CCC GCC GCG GAG TTG ATT GTATGC TTG GTA TAG C-3' (配列番号 21)
SacI-Ptdh3FW： 5'-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-
22 3' (配列番号 22)
SacII-Ptdh3RV： 5»-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC -3' (配列番号 23)
SacI-PpgklFW:5*-TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG-3' (配列番号 24)
SacII-PpgklRV:5'-ATA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG-3' (配列番号 25)
SacI-Ptef2FW:5'-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3' (配列番号 26)
SacII-Ptef2RV:5'-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTG ACC-3' (配列番号 27)
ADH1 転写プロモータ一 DH2p 増幅用には SacI-PadhlFW 及び SacII- PadhlRVを PCR用 DNAプライマーに用い、銬型に pAURl23を用いた。 TDH3 { GAP) 転写プロモーター 7X>H¾) ( GAPp) 増幅用には SacI-Ptdh3FW 及び SacII-Ptdh3RV を PCR用 DNA プライマーに用い、 PGK1転写プロモーター PGKlp増幅用には SacI-PpgklFW及び SacII-PpgklRVを PCR用 DNAプライ マーに用い、 TEF2 写プ lモータ一 TEF2p 増幅用には SacI-Ptef2FW 及び SacII-Ptef2RVを PCR用 DNAプライマーに用い、铸型にはそれぞれ酵母ゲノム DNAを用いた。 反応溶液は、 0.1 g pAUR123又は 0.46 酵母ゲノム DNA， 100 pmol プライマ一 DNA, lx ExTaq ノ ッファー（宝酒造)， 20 ninol dNTP, 0.5 u ExTaq DNAポリメラ一ゼ (宝酒造)及び 1 a 1 perfect match ポリメラ一ゼェン ハンサーを含む 100 l溶液を調製し、 95°C 2分、（95°C 45秒、 60°C 1分、 72°C 2分) X 30サイクル、 72°C 4分、 4°Cストックの反応条件で行った。 増幅した 4 種の DNAを S3cLと Sadlで切断し、ァガロースゲル電気泳動でそれぞれ 620 bp、 680 bp、 710 bp、 400 bpの DNA断片を精製し、 ADHl TDH3p、 PGK1V、 TEF2pとした。
(6) 2 DNA複製開始領域の調製
YEpベクターである pYES2を Ssplと Nhelで切断後、 2 H DNA複製開始点
23 (2 ori) を含む 1.5 kbp断片をァガロースゲル電気泳動により精製し、 Klenow 酵素で平滑末端化し、 この DNA断片を 2 OriSNとした。
(7)YEp型発現ベクターの作製
pRS404Tcyc、 pRS406Tcycを BAP (bacterial alkaline phosphatase, 宝酒造） 処理した N&el部位に 2 μ OriSNを挿入し、 E. coli SURE2に形質転換した後プ ラスミド DNAを調製した。 これを、 ¾¾III及び 《?M、 Hpal, 又は、 ¾ l及 ぴ JV«IIにより切断後、 ァガロースゲル電気泳動し、 2 oriの挿入とその向き をチェックした。 作製した pRS404Tcyc、 pRS406Tcycに pYES2と同じ向きで 2 Ιΐ οήが揷入されたプラスミドをそれぞれ pRS434Tcyc2 Ori、 pRS436Tcyc2 li Oriとし、 pRS404Tcycに pYES2と反対向きで 2 x oriが挿入されたプラスミド をそれぞれ pRS AATcycS w OrL pRS446Tcyc2 H Oriとした。 pRS434Tcyc2 H Ori、 pRS436Tcyc2 Ori、 pRS444Tcyc2 H Ori 及 び PRS446Tcyc2 x Oriの 4種のプラスミドの Sacl-SacLI部位に、転写プロモーター を含む断片 ADfflp、 TOH GAPp), PGKlp又は TEF2pを挿入し DNAをクロ ーン化した。 その結果、 （ 1 84341¾7 2 ^ 01^から1)¾3434 015、 pRS434GAP, pRS434PGK及び pRS434TEF ifiヽ (ii) PRS436Tcyc2 ii Oriから pRS436ADH、 pRS436GAP, pRS436PGK及ぴ pRS436TEFが、 （iii) pRS444Tcyc2 Ori から pRS444ADH、 pRS444GAP、 pRS444PGK 及ぴ pRS444TEF が、 （iv) PRS446Tcyc2 β Ori から pRS446ADH、 pRS446GAP、 pRS446PGK 及び pRS446TEF力^ それぞれ得られた （図 7A〜7H)。
本発明で作製した発現ベクターを整理すると表 3の様になる。
24 表 3
Figure imgf000029_0002
(8) YEp型発現ベクターの酵母への導入
作製した YEp型発現べクタ一の DNA複製領域が機能するかを調べるため、各 YEp 型発現べクタ一約 40 n を Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA) を用いた方法で YPH499へ導入し（手順はキット同封の 説明書に従った）、 SD-W (DOB+CSM(-Trp), BIO101, Vista, CA) 寒天プレート 上で 30°Cで生育してくるコロニーを調べた。 結果を表 4に示す。
表 4
Figure imgf000029_0001
表 4の結果より、 本発明で作製した各 YEp型ベクターは、 ベクターとして正常 に機能することがわかった。
〔実施例 2〕 遺伝子のクローニング
(l) PCRによる HMG-CoA還元酵素遺伝子 （H G 遺伝子） のクローニング
25
差替え用紙 （規則 26) S. cerevisiae '遺伝子ク口一二ングは、 以下のように行つた。
GenBank にある S. cerevisiae 由来 HMG1遺伝子 (ァクセッションナンバー M22002)(M. E. Basson, et al, Mol. Cell. Biol. 8, 3797-3808 (1988):配列番号 1 ) の情報をもとに、 コードしているタンパク質の N末端、 C末端に該当する塩基配 列部分のプライマーを作製し、 これを用いて酵母の cDNA ライブラリー (Clontech製 No.CL7220-l, S. cerevisiae DBY746由来） を銬型とした PCRを 行つた。
N末端側プライマ一 （プライマー 1 ) ： 5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3" (配列番号 28)
C末端側プライマ一 （プライマ一 2 ) : 5--TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3' (配列番号 29)
PCRは、 以下の反応液中、 94°C 45秒の変性、 55°C 1分のアニーリング及び 72°C 2分の伸長を 1サイクルとしてこれを 30サイクル行った。
10x ExTaQ バッファー （宝酒造） 5 1
2. 5 iM dNTPミックス 4 i 1
5 u/ x l ExTaq (宝酒造） 1 ιι 1
10 pmol プライマー 1
10 pmol プライマー 2
0. 5 ng cDNA
計 50 にする
PCR後、 ァガ口一スゲル電気泳動により、 目的の位置 （3.2kbp) に断片が確認 されたので、 その 3.2kbpDNA断片を TAクローニング可能な pT7Blue Tベクタ 一 (Novagen， Madison, WI)にクロ一ニングし、 これを pT7HMGlとした。 クロ 一二ングした HMG-CoA還元酵素遺伝子の塩基配列を決定した。 その結果、 配列 番号 3の塩基配列及び配列番号 4のアミノ酸配列を確認した。 決定された塩基配 列は、 GenBank(http：〃 www-ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index. html)の Bid歹 (Jに示 した塩基配列と一部異なる変異型遺伝子となっていた （図 2 A)。 この PCRエラ 一を含んだ変異型 HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列 （配列番号 4 ) をコードす る遺伝子を HMG1 'とする。
26 (2) HMG1，の PCRエラーの修正
変異型 HMG-CoA 還元酵素をコ一ドする HM<¾'を有する pT7HMGl から H¾f6^'断片をサブクローニングし、 HMG-CoA還元酵素コ一ド領域の PCRエラ 一によるアミノ酸置換変異部分を、 部位特異的変異 (site-directed mutagenesis) 法により修正し、 pALHMGl06を作製した。 作製方法の詳細は以下の通りである。 プラスミド PT7HMG1をクローン化 HM ^として用いた。 また、 部位特異的 変異導入用ベクターとして pALTER- 1を使用した (Promega)。
部位特異的変異は、 Promega発行の" Protocols and application guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1"に記載の方法で行った。 変異導入 用オリゴは、 次の 3種類を化学合成した。
HMG1(190-216) 5'-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3，（配列番号 30) HMG1(1807-1833) 5'-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3' (配列番号 31)
HMGl(2713-2739) 5'-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3' (配列番号 32) まず、 pT7HMGlを ¾^1、 ApalA, ϋで切断し、 3.2kbpの H G_Z断片を ァガロースゲル電気泳動で調製した。 これを pALTER-Ιの Smal-SaR部位に挿 入し、 pALHMGl を作製した。 pALHMGl をアルカリ変性後、 上記変異導入ォ リゴ、 リペアオリゴとして Amp repair oligo(P:roinega)、 ノックアウトオリゴと し て Tet knockout oligo (Promega) を ア ニ ー リ ン グ さ せ、 K coli ES1301(Promega)に導入後、 g/mlアンピシリンで部位特異的変異が導入さ れたプラスミドを保持する形質転換体を集積培養し、 プラスミド DNAを調製し た。 以下の配列を有するプライマ一を用いて塩基配列をチェックしたところ、 HMG1(190- 216)、 HMG1(1807-1833), HMGl(2713-2739)に相当する配列は全 てこれらオリゴヌクレオチドの配列に修正されていた （配列番号 5 )。 なお、 修正 された配列によりコ一ドされるアミノ酸配列 （配列番号 6 ) は、 野生型 HMG1
27 によりコードされるアミノ酸配列 （配列番号 2 ) と一致しており、 サイレント変 異めみ残った遺伝子である。 この PCRエラー修正した J 6^は、 塩基配列は一 部異なるが、 野生型酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする ので遺伝子名を HMG_?とし、 以下、 本明細書中では野生型遺伝子 HMi^と区別 せずに使用する。
HMGl(558-532) 5'-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3，（配列番号 33) HMG1(1573-1599) 5'-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3' (配列番号 34)
HMGl(2458-2484) 5'-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3' (配列番号 35)
この H ^内の配列が修正されたプラスミドを pALHMG106とした（図 8)。
(3)ゲラニルゲラ二ルニリン酸合成酵素遺伝子 BTS1のり U—ニンザ
S. cerevisiae BTSl遺伝子 （GGPP合成酵素遺伝子ともいう） のクローニング は、 以下のように行った。
GenBankにある & cerevisiae由来 GGPP合成酵素遺伝子 (ァクセッションナ ンバー U31632)(Y. Jiang, et al, J. Biol. Chem. 270 (37), 21793-21799 (1995))の 情報をもとに N末端、 C末端にマッチするプライマーを作製し、 これを用いて酵 母の cDNAライブラリー （CL7220-1) を铸型とした PCIIを行った。
N末端側プライマー： 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3' (配列番号 36)
C末端側プライマー： 5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3' (配列番号 37)
PCRは、 （1)に記載の反応液組成と同様の; PCR反応液で、 94°C 45秒の変性、 55°C 1分のアニーリング及ぴ 72で 2分の伸長を 1サイクルとしてこれを 30サ ィクル行った。
28 PGR後、 ァガロースゲル電気泳動により目的の位置 （約 l.Okbp) に断片が確 認されたので、 遺伝子を TAクローニング可能な pT7Blue Tベクターにク ローニングし、 BTS1遺伝子の全領域の塩基配列を決定した。その結果、 GenBank の配列と完全に一致し、 S. carera'siae由来の遺伝子であることを確認した。
pT7Blue Tベクターを HamHI、 処理して ^ 遺伝子を取り出し、 これ を、 pYES2(Invitrogen社)の a HL サイトに導入した。 得られた組換え ベクターを pYESGGPSとした。
(4) Escherichia «ώ'由来の FPP合成酵素遺伝子 ispAのクローニング
E. ゲノム DNAは、 E. coli JM109 (宝酒造） から次の方法で調製した。 JM109を 1.5 ml 2xYT培地で培養後、遠心により集菌し、 567 lの ΤΕ (ρΗ 8.0)、 3 i 1の 20 mg/mi protemase- (Boehrmger Mannheim, Mannheim, Germany) 及び 30 ^ 1の 10% SDSを加え、 37°Cで 1時間保温後、 100 1の 5M NaClを加 え混合した。 これに、 80 1の CTABゾ NaCl溶液 （10% CTAB, 0.7 M NaCl) を 加え、 65でで 10分加熱した。 これを 700 x lのクロ口ホルム /イソァミルアルコ ール （24:1) で抽出し、 水層画分をさらに 600 111のフエノール/クロ口ホルム I イソアミルアルコール （25:24:1) で抽出した。 抽出後の水層画分に 0.6 容量のィ ソプロパノールを加えて遠心した。 沈殿画分を 70% エタノールで洗い、 乾燥後 100 il l ( TE (pH 8.0)に溶解し大腸菌ゲノム DNA溶液とした。 DNAを OD26Q で測定、 定量後、 DNA濃度が 1 ^ g/ ^ lになるように TEで調製した。
E. «?7ゲノム DNAを铸型にし、 以下の合成オリゴ DNAをプライマーに用い て PCRにより E. m/i由来の FPP合成酵素遺伝子 is のクローニングを行った。
ISPA1:5'-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3' (配列番号 68) ISPA2:5'-TC AGAATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3' (配列番号 69) lx ExTaqバッファー、 0.5 mM dNTP、 100 pmol ISPA1、 100 pmol ISPA2, 0.2 g E. coliゲノム DNA、 5 u ExTaqを含んだ 100 il lの反応溶液で、 94^Ό 1 分、 55°C 1分、 72 1.5分を 30サイクル繰り返すことで PCRを行った。 PCR 産物は jEcomと Sphlで切断後、 ァガロースゲル電気泳動で 1.0 kbpの DNA断 片を精製し、 pALTER-Ex2 (Promega) の EcoRl-SphL 部位に挿入し、 coli
29 JM109へ導入し遺伝子クローニングを行った。 coRI、》¾a¾I、 M、& al、 mHI を用いた制限酵素マッピングにより正しく i¾ ^遺伝子'（配列番号 77) が導入さ れたプラスミド pALispA4、 pALispAl6 、 pALispAl8が得られた。
(5) 変異型 FFP合成酵素遺伝子の作製
pALispA16 を用レ て、 Promega 発ィ了の "Protocols and applications guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1"に 記載のプロトコルに従つ て、 E. coliispAにコードされるポリペプチドの 79番目のァミノ酸残基 T^rをコ ードしているコドンを置換変異により改変した。 以下の変異導入用オリゴヌクレ ォチド （変異オリゴともいう） は、 化学合成法により調製した。
ISPA-D: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA GTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3' (配列番号 70)
ISPA-E: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA TTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3' (配列番号 71)
ISPA-M: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA Q L AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC -3' (配列番号 72) 上記変異オリゴ ISPA-Mは、 第 16番目〜第 18番目の塩基 （3塩基を下線で示 した部分）が野性型では 79番目の！Vrをコードしているコドンであるため、 Met をコードするように設計したものである。 同様にして、 変異オリゴ ISPA-D、 変 異オリゴ ISPA-Eは、 それぞれ Asp、 Gluをコードするように設計したものであ る。 上記変異オリゴにおいて、 第 26番目〜第 31番目の塩基 （6塩基を下線で示 した部分） は、 置換変異導入より新たに EcdT22l (Nsil) 部位ができるように設 計し、 変異遺伝子が制限酵素マッピングにより容易に区別できるように計画した 配列である。 変異オリゴは、 あらかじめ、 T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (Promega)により 5'末 ¾をリン酸ィ匕し、 Nick Culumn (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) を用いてゲル濾過精製してある。 変異導入の際にはリペアォ リゴとして Cm repair oligo (Promega)を、 ノックアウトオリゴとして Tet
30 knockout oligo (Promega)を用いた。 アルカリ変性させた pALispA16 に Cm repair oligo, Tet knockout oligo, 変異オリゴをァニールさせ R coli ES1301 "^ (Promega)へ形質転換した。 20 /i /ml の Cm (クロラムフエニコ一ル） 共 存下で生育してきた大腸菌からプラスミド DNAを調製し、 E. coH iOQへ形質 転換し、 20 x g/ml Cm寒天プレート上で生育してきたコロニ一からプラスミド DNAを調製した。 pALispA4を錡型にし、 ISPA- D ISPA-E ISPA- Mを変異ォ リゴに用いて作製した置換変異型 is (これを m という）を含むプラスミド を、 それぞれ p4D p4E p4Mとした。 同様に、 pALispA16 を錡型にして作製 したプラスミドをそれぞれ pl6D pl6E pl6Mとし、 pALispA18を铸型にして 作製したプラスミドをそれぞれ pl8D pl8E pl8Mとした。
(6) ΙΡΡ Δ -イソメラーゼ遺伝子 idiのクロ一ニング
大腸菌 ΙΡΡ Δイソメラーゼ遺伝子は、 以前の命名では ORF182 (NCBI BLAST サーチによる； GenBankァクセッション番号 AE000372) としていたが、 Hahn et al. (1999) J. Bacteriol., 181, 4499-4504により ί 'と名付けられている。 idi (配列番号 85；配列番号 86に示すアミノ酸配列をコードする） をクローニング したプラスミドとしては、 Hemmi et al. (1998) J. Biochem., 123, 1088-1096 記 載の p3-47-llと p3-47-13を用いた。
(7) Bacillus stearothermophilus FPP合成酵素遺伝子のクローニング
特開平 5-219961記載の pFE15を Notlと &HaIで切断後、 2.9kbpの転写単位を 含んだ Bacillus stearothermophilus 合成酵素遺伝子 (以下 fpsとする；)（配列 番号 75；配列番号 76 に示すアミノ酸配列をコードする） 断片を精製し、 PACYC177 (日本ジーン）の 6tal部位に挿入し、 これを pFE15NS2.9-lとした。
〔実施例 3〕 遺伝子の発現ベクターへの挿入
(1) pRS発現べクタ一へのサブクローニング
今回作製した恒常発現型転写プロモーターをもつ E. coli- S. cererisiaeYEv型 シャトルベクターである各 pRSベクター （図 6、 図 7) を用いて、 HM 2遺伝子
31 を発現ベクターに導入した。
PCRエラーを修正した HMG-CoA還元酵素遺伝子を含む pALHMG106 (図 8) を 6¾2slと S&Rで切断後、 ァガロースゲル電気泳動で 3.2 kbpの廢 遺伝子 断片を精製した。 これを pRS434GAP、 pRS444GAP、 pRS434TEF, pRS444TEF, pRS434PGK及ぴ pRS444PGKの &HaI-»S ^/[部位へ揷入した。サブクローン化し たプラスミドは、 JOwl、 Spel, Nael及び Sp lの各制限酵素マッピングと、 揷 入された 3.2 kbp J¾¾f ^遺伝子断片のボーダー領域の塩基配列確認により物理地 図をチェックし、 計画通りに作製できたプラスミドを選抜した。 選抜したプラス ミ ドは、 それぞれ、 pRS434GAP-HMGl、 pRS444GAP-HMGl , pRS434TEF- HMG1、 pRS444TEF-HMGl, pRS434PGK-HMGl, pRS444PGK-HMGl とし た。
(2) pRS414PTad -HMGl又は pRS414TPadh-HMGlの作製
恒常発現型転写プロモーター DH2p を含むベクター pRS414PTadh、 pRS414TPadh (図 6 B) を制限酵素 S alと 6¾ で処理し、 （1)と同様の操作を 行い、 HMG1 遺伝子が挿入されたプラスミ ド pRS414PTadh-HMGl 及び pRS414TPadh-HMGlを作製した。
(3) H G 発現用プラスミド pYES-HMGlの作製
実施例 2 (1) で作製した pT7HMGlを BsmBl SalL Seal処理して PCRエラ —による変異型 HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子 HMG を取り出し、 こ れを pYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA)の B ΉΙ-XIiol部位に導入した。 得られ た組換えベクターを pYES-HMGl とした。 ベクター内の塩基配列決定を行った ところ、 配列番号 3に示す塩基配列であることを確認した。 なお、 pYES2は、 複 製起点として酵母 2 mDNAの ori、 及ぴガラクトースで誘導可能な GA 1転写 プロモ一ターをもつ酵母発現用シャトルベクターである （図 4)。
(4) 欠失型 HMOT発現用プラスミド pYHMGxxyの作製
HMG-CoA還元酵素触媒部位と考えられている部分より上流の領域をコードす
32 る塩基配列を欠損させた欠失型 HMG-CoA還元酵素遺伝子発現ベクターを作製 するため、 （3)で作製した pYES-HMGlを錶型として、 PCR法でベクター部分と ともに afG コード領域の一部分を欠失させた断片を調製した。 得られた断片 を Klenow酵素で平滑末端にした後、 セルフライゲ一シヨンにより再び環化し、 .∞7iJM109へ形質転換させ、 プラスミド DNAを調製した。 プライマーとして 使用した合成 DNA配列とその組合せを表 1に示した。
得られたプラスミド DNA内の HMG1上流、下流のアミノ酸の読み枠がずれて いないことと、 その結合部位近辺に PCRエラーによるアミノ酸置換が起きてい ないことを 373A DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA) で確認した。 その結果、 結合部位近辺に PCRエラーによるアミノ酸置換がなく、 読み枠がず れずに遺伝子を欠失する事のできた以下のプラスミドを得た。 欠失型 HMG1遺 伝子は、 欠失のパターンに従って A 02y (yは任意の作業番号を表す） のように記 載し、 A 02yを含む pYES2ベクタ一を例えば pYHMG026と記すこととする （他 の欠失体も同様）。
HMG1 A 02y：配列番号 7
HMGl ：配列番号 8
ffMGl A 05y：配列番号 9
HMGl my：配列番号 10
HMG1 A 07y 配列番号 11
HMG1 08y 配列番号 12
HMG1 MOy：配列番号 13
HMG1 Mly：配列番号 14
HMG1M2J：配列番号 15
HMG1 MSy：配列番号 16
ベクター： pYHMG026, pYHMG027, pYHMG044, pYHMG045; pYHMG062, pYHMG063, pYHMG065, pYHMG076, pYHMG081, pYHMG083, pYHMG085, pYHMG094, pYHMGlOO, pYHMG106, pYHMG107, PYHMG108, pYHMG109, pYHMG112, pYHMGl22, PYHMG123, pYHMG125， pYHMG133
33 〔実施例 4〕 AURGG101の作製
実施例 2(3)に記載の pYESGGPS を铸型にして、 プライマー PYES2(l-27)と PYES2(861-835)を用いて PCR 法により、 GAL1 転写プロモータ一 = 53^2= CYC1 転写夕一ミネ一夕一の一次構造（i Up- CTOZt)を持つ 1.9kbp の SaR断片を調製した。
PYES2(l-27):5*-GGC CGC AAA TTAAAG CCT TCG AGC GTC-3* (配列番号 73)
PYES2(861-835): 5'-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3' (配列 番号 74)
この断片を pAURlOl(Takara)の S iR部位へ挿入し、 pAURGG115 を得た。 PAUEGG115内の 遺伝子に PCRエラーがないことは DNAシークェンシ ングにより確認した。
PAURGG115を 00651で線状化し、 酢酸リチウム法で A451株へ導入し、 1 g/mlオーレォパシジンを含む YPD寒天プレート （1%酵母エキス， 2% ぺプト ン， 2% デキストロース， 2% 寒天） 上で 30°Cで生育してくるコロニーを形質転換 体とした。 得られた形質転換体は、 もう一度オーレォバシジン選択プレート上で シングルコ口二一選抜した。
その結果、 A451 を宿主とした組換え体として AURGG101及ぴ AURGG102 の 2クローンが得られ、 本発明では AURGG101を A451由来宿主株の 1つとし て用いた。
なお、 サザンブロットハイプリダイゼーシヨン （図 9) と PCRマッピング （図 10) で明らかになったように、 AURGG102は^ がゲノムにインテグレート しているが、 AURGG101はインテグレートしておらず、 ひ がマーカー遺伝 子の Cに単に置き換わったものであることが分かっている。 ^t RZはプレ ニルアルコール又はプレニルニリン酸合成と直接関与していないので、 AURGG101は A451由来宿主株の例として使用できる。
サザンブロット Λイブリダィゼーシヨン、 ノーザンブロットハイブリダィゼー
' 34 シヨン、 PGRマッピングは、 後述の実施例 6に方法を記載してある。
〔実施例 5〕 各 EUG株の作製
酵母ゲノムデータベースから、スクアレン合成酵素遺伝子 EKG^付近の遺伝子 地図を引き出し、 転写プロモータ一 ERG9^ 置換用 DNA断片増幅のた めの PCRプライマー DNAを設計した。形質転換体選択マーカー遺伝子 URA3と 転写プロモーター <7ALJpを含む 1.8 kbp DNA断片は、 pYES2を N&elと Nhel 切断後 Klenow酵素で平滑末端化し、 セルフライゲ一シヨンにより 2 ori部分 を削除した pYES2△を錡型にして PGR増幅により調製した。
PCRで使用したプライマーは以下の通りである。
E-MCSf： 5'- GCC GTT GAC AGA GGG TCC GAG CTC GGT ACC AAG-3' (配 列番号 9)
E-URA3r： 5*- CAT ACT GAC CCA TTG TCAATG GGT AAT AAC TGA T-3' (配列番号 50)
上記プライマ一には、 S.cerevisiaeゲノム中のオープンリーディングフレーム YHR189Wの下流部分を含む 0.7 kbpDNA断片と ERG9の上流部分を含む 0.9 kbp DNA断片とで T/Aライゲーシヨンできるように Λ31105Ι認識部位 （下線 部分） を加えてある。 YHR189W断片は、 PCR プライマ一 YHR189Wf と YHR189Wrを用いて YPH499ゲノム DNAを铸型に PCRにより調製し、 ERG9 断片は、 PCHプライマー ERG9fと ERG9rを用いて YPH499ゲノム DNAを铸型 に PCRにより調製した。 YPH499ゲノム DNAは、 「Genとるくん」 を用いて調 製した。
YHR189Wf： 5'-TGT CCG GTAAAT GGA GAC-3' (配列番号 51)
YHR189Wr： 5'-TGT TCT CGC TGC TCG TTT-3' (配列番号 52)
ERG9f： 5'-ATG GGAAAG CTA TTA CAA T-3' (配列番号 53)
ERG9r： 5'-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3' (配列番号 54)
1.8 kbp DNA断片を ^τα1105Ιで消化後、 0.7 kbpDNA断片とライゲーション し、 これを錶型にしてプライマ一 YHR189Wf と E-MCSfを用いて 2nd PCRを行
35 つた。 増幅した 2.5 kbp DNA断片を 72ll05Iで消化後、 0.9 kbp DNA断片と ライゲ一シヨンし、 これを錶型にしてプライマ一 YHR189W-3f と ERG9-2rを用 いて 3rd PCRを行った。 増幅した 3.4 kbp DNA断片を形質転換用 DNA断片と した。
YHR189W-3f： 5'-CAA TG AGG GCTATA TAT G-3' (配列番号 55)
ERG9-2r： 5'-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3' (配列番号 56)
Zymo Research (Orange, CA) より貝冓入した Frozen EZ yeast transformation II kitを用いて酵母にベクターの導入を行った。 組換え体は、 SGR培地 （SD培 地のグルコース成分をガラク 1 スとラフィノースで置き換えたもの） をベース にし、 CSM(-URA) (BIO 101 (Vista, CA) より購入） と終濃度 40 mg/1になるよ うにアデニン硫酸塩を加えた寒天培地 （SGR-U培地） 上で 30°Cで培養し、 生育 してきた菌体をもう一度同じ培地に広げ、 培養しシングルコロニーアイソレーシ ョンを行った。
取得した組換え体は、 EUG (ERG9：： URA3- GALlv) 株と名付け、 A451 由来 のクローンを EUG1〜10、 YPH499由来のクローンを EUG11〜20、 YPH500由 来のクローンを EUG21へ- 30とした。
SD培地でグルコースリプレツシヨンにより ERG9発現が阻害され生育抑制の かかったクロ一ンを選抜し、 A451から EUG8力 YPH499 から EUG12 、 YPH500から EUG27が得られた。
なお、 EUG8、 EUG12、 EUG27から 「Gen とるくん」 を用いてゲノム DNA を調製しこれを铸型にして PCRを行った結果、 URA3と GALJpを含む 1.8 kbp の PCR断片がゲノム中の _ ^コード領域上流にィンテグレートされているこ とを確認した。
〔実施例 6〕 遺伝子解析、 酵素活性解析
本実施例では、 作製した各種組換え酵母 （各組換え体の作製については、 後述 するプレエルアルコールの生産についての実施例 7、 8を参照） の遺伝子発現を、 プレニルニリン酸合成酵素の酵素活性、 ノーザンブロットハイブリダィゼーショ
36 ン、 サザンプロットハイブリダィゼーシヨン、 PCRマッピングの各種手法を用い て解析した。 作製した組換え体のうち、 下記宿主株、 組換え体を用いた。 宿主へ の各ベクターの導入は、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.7.1-13.7.2 に記載の酢酸リチウム法、 又は、 Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA) を用レ ,こ方法で 入した (Ψ 順はキット同封の説明書に従った）。 なお、 1-2株は pYES-HMGlを A451株に 導入したものであり、 3-2株は pYHMG044を A451に導入したものであり、 13- 2株は pYES-HMGl ¾ AURGGIOIに導入したものであり、 15-2は pYHMG044 を AURGG101に導入したものである。
No.l 宿主株： A451
No.2 GALlp-BTSl (Yip)： AURGGIOI (A451,aurl::AU l-C)
No.3 GALlp-BTSl (Yip)： AURGG102 (A451 , ^ urlv.BTSl-A URl - Q
No.4 GALl^-HMGl (YEp)： 1-2 (pYES-HMGl/A451)
No.5 GALl^-HMGl Δ (YEp)： 3-2 (pYHMG044/A451)
No.6 GALl^-HMGKYEp)： 13-2 (pYES-HMGl/AURGGlOl)
No.7 GALlp- MGl Δ (YEp)： 15-2 (pYHMG044/AURGG101)
No.l-No.7の株を 26°Cで培養した 1 mlの前培養液を生理食塩水で洗い、 100 ml の培養液へ加え、 300 mlの三角フラスコ内で 26で、 1分あたり 120回の往復振 盪で培養した。 培地は SDおよび SG (SD培地のグルコースをガラクトースに置 き換えたもの） を用いた。 Z7J? ?マーカーを保持している組換え体は SD-U (SD に CSM(-URA)を加えたもの） 又は SG-U (SGに CSM(- URA)を加えたもの） 培 地にし、 AURGG株はオーレォバシジンを 1 g/lになるように加えた。
菌体増殖は OD6。。で測定し、 ODs。。が 3-4程度になった時点 （23-52時間） で培 養を止め、 氷中で冷却し、 以下に記載の DNA調製、 RNA調製、 粗酵素液調製を 行つた。 ひ） サザンプロッティング
37 酵母 DNA精製キット 「Genとるくん」 を用いて酵母 DNAの調製を行った。 手順は、 キット添付のプロトコルに従った。
酵母より調製した DNAは、 elおよび^^ Iで切断後 1レーンあたり 3 g を 0.8%ァガロースゲル電気泳動した。分子量マ一カーは、 Promega社 （Madison, WI) の l kb ラダ一と λ ΑίΓ άΠΙをそれぞれ 0.5 2 g使用した。 泳動後、 定法に 従ってアルカリ変性、 中和し、 Hybond N ナイロンメンブレン （Amersham, Buckinghamshire, England) に 20 x SSCによるキヤビラリ一ブロットで転写し た。 1妾、メノフレノ Stratagene社の UV cross-linkerで optimal cross-link の条件で紫外線照射し、 DNAをメンブレン上に固定した。
(2) ノ一ザンブロッテイング
Current Protocols m Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.12.2-13.12.3 記載の方法を一部改変して RNAを調製した。 上記改変は、 調製した RNAサンプルをさらに DNase Iで処理した点である。
フオルムアルデヒド変性ァガロースゲル電気泳動により RNAを分離後、 定法 に従って、 Hybond Nナイロンメンブレンに 20 x SSCによるキヤビラリーブ口 ッ卜で転写した。 1レーンあたり total RNAは 5 i g泳動した。 分子量マーカー は DIG-RNA Marker I 20 ngを使用した。 転写後、 メンブレンは Stratagene社 の UV cross-linkerで optimal cross-linkの条件で紫外線照射し、 RNAをメンブ レン上に固定した。
実施例 4で作製した Yip型べクタ一である pAURGG115由来の断片が、 ゲノ ムにどのようにィンテグレー卜されているかを調べるために、調製した酵母 DNA 0.3-0.6 i gを錶型にし、 合成オリゴヌクレオチド AUR-FWcと AUR-HVc、 およ ぴ AUR-SAL1と AUR-SAL2 との各組合せをプライマ一に用いて PCRを行った。 PCRは 94°C30 秒， 55°C1 分， 72°C 3 分を 30サイクル繰り返す条件で行つた。
AUR-FWc: 5'-TCT CGAAAAAGG GTT TGC CAT- 3' (配列番号 57)
AUR-RVc: 5'-TCA CTA GGT GTAAAG AGG GCT-3' (配列番号 58)
38 AUR-SAL1: 5'-TGT TGAAGC TTG CAT GCC TGC-3' (配列番号 59)
AUR-SAL2: 5'-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3' (配列番号 60)
(4) DIGラベルプローブ DNAの作製
ハイブリダィゼ一シヨンプロ一ブは Probe I、 II、 III及ぴ Vの 4種を作製した (表 5 )。
表 5 ハイブリダィゼ一シヨン用プローブ―
1ーブ番号 錶型 プライマ一 1 プライマ一 £
1 ERG20 PT7ERG20 SCFPS1 SCFPS2
BTS1
II BTSi pYES2— GGPS6
(1 -21)
HMG1
III HMG1 pYHMG I
(1267-1293)
V AURi PAUR123 AUR-RV AUR-FW
プローブ I:
合成オリゴヌクレオチド SCFPS1 と SCFPS2 をプライマ一にし iヒ 2て Clontech 社 （Palo Alto, CA) S. cerevisiae cDNA ライブラリより PCR断片を pT7blue T ベクタ一 （Novagen, Madison, WI)へクローニングし、 pT7ERG20を作製した。
SCFPS1: 5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAAATT AG-3' (配列番号 61)
SCFPS2: 5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTAAAC TT-3' (配列番号 62) pT7ERG20を錶型にして SCi Slと SCFPS2をプライマ一に用い、 PCR DIG Probe Synthesis Kit ("Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) により DIGフ ベルプローブ DNAを作製した。 実験条件は; Roche Diagnostics社添付のプロ卜 コルに従った。
PCRは 94で 30秒， 58^ 1分， 72で 3分のサイクルを 30サイクル繰り返す条件 で行った。 なお、 DIGラベルプローブ DNAは、 反応後ァガロースゲル電気泳動 により合成状態をチェックした。 フローブ Π:
39 合成オリゴヌクレオチド BTS1(1-21) 及び BTSl(1008-988)をプライマーにし、 pYESGGPS (実施例 2(3)参照） を铸型にしてプローブ Iと同様にして DIGラベル プローブ DNAを作製した。
BTS1(1-21): 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3' (配列番号 63)
BTSl(1008-988): 5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC-3' (配列番号 64) プローブ ΙΠ:
合成オリゴヌクレオチド HMG1(1267-1293)と HMGl(2766-2740)をプライマ —にし、 pYES-HMGl (実施例 3(3)参照） を鍀型にしてプローブ I と同様にして DIGラベルプローブ DNAを作製した。
HMG1(1267-1293): 5'-AAC TTT GGT GCAAAT TGG GTC AAT GAT-3' (配列 番号 42)
HMGl(2766-2740): 5'-TCC TAA TGC CAA GAAAAC AGC TGT CAC-3' (配列 番号 65) プローブ V:
合成オリゴヌクレオチド AUR-FWと AUR-HVをプライマーにし、 pAUR123 (宝酒造） を鎳型にして Probe Iと同様にして DIGラベルプローブ DNAを作製し た。
AUR-FW: 5'-ATG GCAAAC CCT TTT TCG AGA-3' (配列番号 66)
AUR-RV: 5*-AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3* (配列番号 67)
(5) ハイブリダィゼーシヨンとプローブの検出
サザンブロットハイブリダィゼ一ションは、 20 ng/mlのプロープ濃度で DIG Easy Hyb (Roche) を用いて 42°C24時間行った。 ノーザンブロットハイプリダイ ゼーションは、 100 ng/mlのプロ一プ濃度で DIG Easy Hybを用いて 50°C24時 間行った。それぞれ、あらかじめハイブリダィゼーシヨンと同じ温度で DIG Easy Hyb溶液で 24時間プレハイプリダイゼーシヨンを行ってある。 ハイブリダイゼ —ション後、 2x SSC, 0.1% SDS, 65°C , 10分で 3回、 0.2x SSC, 0.1% SDS, 65°C,
40 15-20 分で 2 回、 それぞれ洗浄した。 洗浄後メンブレンは DIG Luminescent Detection Kit (Roche) で DIGラベルプロ一プを化学発光させ、 X線フィルムに 感光させ可視化した。
(6) 酵素活性測定
各培養液から遠心により菌体を集め、 RNA調製と同様にして 4 でガラスビー ズで菌体を破砕後、 滅菌水に懸濁した。 微量冷却遠心機を用いて 12,000 r.p.m. で 10 分遠心し、 その上清を粗酵素画分とした。 粗酵素画分中のタンパク質濃度 は、 Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA)で BSAを標準夕ンパク質と して測定した。 粗酵素液 10 gを用い下記の 200 l反応カクテル中で、 37°C で 40分間反応させた。
0.125 m [】 ] IPP (185 GBq/mol)
0.125 mMゲラニルニリン酸 (Sigma Chemical, St. Louis, MO)
100 mM Tris *HC1 (pH 7.0)
10 mM NaF, 5 mM MgCl2
5 mM 2-メルカプトエタノール
0.05% Triton X- 100
0.005% BSA
反応後、 水飽和ブ夕ノールで伸長したプレニルニリン酸を抽出し、 一部は液体 シンチレーションカゥン夕一で放射活性を測定した。残りのサンプルは、 Koyama らの方法 (Koyama T" Fujii, H. and Ogura, K. 1985. Meth. Enzymol. 110: 153- 155) に従ってジャガイモ酸性フォスファタ一ゼで脱リン酸化後、薄層クロマトグ ラフィー（プレート LKC18 (Whatman, Clifton, NJ)、展開液 H20/acetone=l:19) で展開し、 Bio Image Analyzer BAS2000 (富士写真フィルム） でォ一トラジオグ ラムを可視化し、 相対放射活性を測定した。
(7) 結果と考察
(7-1) サザンプロットハイプリダイゼ一シヨンと PCRマツピング
サザンプロットハイブリダィゼ一シヨンの結果を図 9に示す。 また、 _？近
41 辺の PCRによるマッピングの結果を図 10に示す。 図 9及ぴ図 10において、 各 レーン 1 ~ 7は、 （6)において使用した株の番号 （No.l〜No.7) にそれぞれ対応 する。 Nは fel消化、 Sは^^ I消化 DNAのレーンを示す。 各レーンの DNA は以下の株より調製した。
レーン 1 , A451; レーン 2, AURGG101; レーン 3, AURGG102; レーン 4， PYES-HMG1/A451; レーン 5, pYHMG044/A451; レーン 6， pYES-HMGl/ AURGGIOI; レーン 7, pYHMG044/AURGGl01
ERG20 (FPP合成酵素遺伝子） は全ての株で同一であり、 6^ 遺伝子の周 辺のゲノムに変化がないことがわかつた （図 9)。
BTS1 ( GGPP 合成酵素遺伝子） と AUR1 をプローブに用いたところ、 AURGG102株では、 AUR1部分に BTS1がィンテグレーションされていたが、 AURGGIOIでは宿主の A451と変わらなかった。 AURGGIOIは AUR1遺伝子部 分のみが pAURlOl由来の ^ ra^-C遺伝子に置換変異しただけで、 GALl -BTSl 断片はゲノムに組み込まれていないことがわかった。 PCI こよって、 ゲノムイン テグレーシヨンの結果生じる ひ _?遺伝子座の重複を検出したところ、 やはり
AURGGIOI由来の株ではパンドが検出されず、 AURGG102株のみでバンドが検 出された （図 10)。
図 9において、 H G^をプローブにしたときには、 ¾Ι切断の時プラスミド 由来のパンドがみられた （No.4-7)。 また、 切断では 1-2株 （No.4) の様に 8-2 kbpのプラスミド由来のパンド （8.3 kbpのゲノム由来のパンドと重なってい る）が生じるはずなのに、 13-2株（No.6)、 15-2株（No.7)ではゲノム中の画 G1 付近と導入したプラスミド間で組換えが起こりバンドシフ卜がみられた。
サザンプロットハイブリダィゼーシヨンと PCRマッピングの結果から、 今回 使用した株の遺伝子型は表 6のようにまとめることができる。表中、 AURはォー レオバシジンを加えた培地で、 培地 1が前培養培地、 培地 2が本培養用の培地を 示す。
42 表 6 組み込まれた プラスミド中の
株番号 ¾名 遣伝子 遣伝子 培地 1 培地 2
1 A451 SD SG
2 AURGG1G1 SD-AUR SG-AUR
3 AURGG102 BTS1 、 SD-AUR SG-AUR
4 1-2 MG1 SD- U SG-U
5 3-2 HMGiA 044 SD- U SG-U
e 13—2 MG1 SD-U-AUR SG-U-AUR
7 15-2 HMGiA 044 SD-U-AUR SG-U-AUR
(7-2) ノーザンプロットハイブリダイゼ一シヨン
ノーザンブロットハイブリダィゼーシヨンの結果を図 11に示す。 プロ一ブは、 表 5の I、 II、 IIIを使用した。
図 11において、 各レーン 1~7は図 9と同様である。 また、 一は SD培地での 転写産物を、 +は SG培地での転写産物を示す。
ERG20の転写産物は、 SG 培地で <¾ 転写誘導をかけたときに 13-2 株 (No.6)、 15-2株 （No.7) で低下する傾向がみられた。
SG培地により GAL1転写プロモータ一制御下の遺伝子の転写誘導を行ったと ころ、 H7¾^転写産物は、 GUp- 断片がゲノムにインテグレートされてい る株、 すなわち AURGG102 (No.3 ) でのみ誘導が増加していた。
しかしながら、 転写産物と比較すると、 その転写誘導の度合いは低いこ とが分かる。 HMOZ転写産物は、 SG培地による転写誘導で、 プラスミドにより 6L4Up-H 断片が導入された株 （No.4-7) で顕著に増加した。
(7-3) プレニルニリン酸合成酵素活性
ァリル性二リン酸基質としてゲラニルニリン酸 （GPP) と 14 Cラベルした IPP とを用いて、 粗酵素液中のプレニルニリン酸合成酵素活性を調べた。
GPPと [14C]IPPを基質として合成された各プレニルニリン酸を脱リン酸化し、 TLC展開の後各スポットの放射活性を調べたところ、 FPP合成酵素活性が高く、 次に、 GGPP 合成酵素活性に比べてはるかに高い HexPP (へキサプレニルニリ ン酸） 合成酵素活性が検出された。 そこで、 オートラジオグラムから反応産物の
43 相対量を計算し、 総タンパク質あたりの比活性を計算した。 その結果を図 12 に 示す。 図 12Aは、 上パネルが FPP合成酵素 (ITS)活性、 下パネルが GGPP合成 酵素 (GGPS)活性を示す。 図 12Bは、 上パネルが HexPP合成酵素 (HexPS)活性、 下パネルが PTase (総プレニルニリン酸合成酵素） 活性を示す。 また、 灰色の棒 は SD培地での結果を、 白色の棒は SG培地での結果を示す。 総プレニルニリン 酸合成酵素活性のうちの多くが FPP合成酵素活性であり、 SG培地による活性上 昇がみられた。 特に、 FOHを大量生産する （実施例 9参照） 13-2株 （No.6) と 15-2株 （No.7) で顕著に増加していた。 全体的には、 GPP をァリル性基質にし たときの GGPP合成酵素活性は FPP合成酵素活性の 20000分の一、 HexPP合 成酵素活性の 300分の一程度である。 HexPP合成酵素活性は SG培地で低下した。
〔実施例 7〕 組換え体の培養とプレニルアルコール生産
(1) 恒常発現型プロモーターを連結した 遺伝子を A451に導入した場合 (「恒常発現プロモーター； HM(¾ ; A451」 のように表記する。 以下同様。） のプ レニルアルコール生産
FOB [高生産組換え体を工業利用するには、恒常発現型プロモーターを利用する と安価な通常培地を利用できるので有利である。そこで、予備実験において; FOH を産生する可能性のあることが認められた酵母 i S. cerevisiae) A451 株 (ATCC200589) を宿主に用い、 恒常発現型プロモーター制御下で HM(¾遺伝 子を発現させた。
恒常発現型プロモーター (二 7 DH¾3)を含むベクター pRS434GAP 又は PRS444GAPに 遺伝子 （PCRエラー修正後の遺伝子） を揷入し、 それぞ れ pRS434GAP-HMGl、 pRS444GAP-HMGl を作製し、 A451 に導入した。 得 られた組換え体を pRS434GAP-HMGl/A451、 pRS444GAP-HMGl/A451とした。
HMG-CoA還元酵素遺伝子を導入した酵母について、 任意に 10個のコロニー を選択した。 選んだコロニーから、 マーカー遺伝子 TRP1に応じた SD選択培地 である SD-W培地 （SDに CSM(-TRP)を加えたもの。 以下同様。） に菌株を接種 し、 前培養を行った。 その後、 前培養液 250 ^ 1 (恒常発現型プロモーターを使用 した酵母を用いて前培養を行った場合の添加量。 以下同様。） を 2.5 mlの YM培
44 地に加え、 26 で 4日間、 130 r.p.m.の往復振盪培養で培養した。
培養後、 培養液にメタノールを 2.5ml加えて混合後、 ペンタンを約 5ml加えて 激しく撹拌し、 静置した。 ペンタン層を新しいガラス試験管にとり、 ドラフト中 でペンタンを気化させ溶質成分を濃縮後、 ガスクロマトグラフィー/質量分析 (GC/MS) でプレニルアルコールを同定し、 内部標準としてゥンデ力ノールを用 いて定量した。 また、 その際、 菌体増殖の度合いを調べるため、 培養夜 50 1を 水で 30倍に希釈し、 600nmの吸光度を測定した。
GC/MS は、 HP6890/5973 GC/MS システム (Hewlett-Packard, Wilmington, DE) を用いた。 使用カラムは HP-5MS (0.25 mm x 30 m、 フィルム厚 0.25 U rn) であり、 分析条件は以下の通りである。 本明細書中での GC/MS分析条件は、 全 て同様である。
インレット温度 250°C
検出器温度 260°C
[MS ゾーン温度]
MS Quad 150°C
MS Source 230
マススキャン範囲 35-200
[ィンジェクションパラメ一夕一]
自動ィンジェクシヨンモード
サンプル容量 2 il l
3回のメタノール洗诤及び 2回のへキサン洗浄
スプリット比 1/20
キヤリャ一ガス ヘリウム 1.0 ml/分
溶媒遅延 2 分
[オーブン加熱条件]
115 90 秒
70°C /分で 250°Cまで加熱し、 2分間維持
70°C /分で 300でまで加熱し、 7分間維持
時間 0後
45 内部標準 エタノール中 0.01 1 1-ゥンデ力ノール
信頼標準 （^-ネロリ ドール （エーザィ）
(all-E)-ファルネソール (Sigma)
(ai/- -ゲラニルゲラ二オール （エーザィ）
スクアレン （東京化成工業）
プレニルアルコールの生産量を測定した結果を図 13〜； L5 に示す。 図 13 の pRS434 No.3からさらに 10コロニーとつたときの結果が図 14であり、 図 13に 示すデータをまとめた図が図 15である。図 14の No:10(pRS434)のコロニーにお いて 4.9mg/lの FOH生産が認められた。 また、 図 15において、 434、 44 は、 それぞれ pRS434GAP、 pRS444GAPベクタ一を用いたときの結果を表す。 一番 右のグラフが遺伝子導入前の宿主 (A451)を培養したときの結果を示す。
この結果より、 A451を宿主に用いると、 pRS434GAP-HMG/A451では NOH、 FOH とも生産性が向上し、 履 G1遺伝子の転写を活性化させるだけで； FOHは 平均 3.8mg/l、 コロニ一によっては、 最高で 11.2mg/l 生産された （図 13)。 PRS444GAP-HMG1/A451では NOHは最高 0.16mg/lであり、 FOH生産に主に 有効であることが分かった。
これは、 YPH499などの通常用いられている組換え DNA宿主株と比較して、 A451 はスクァレン合成酵素活性とメパロン酸経路活性のバランスとが異なつて おり、 HU遺伝子の多コピー化又は転写活性化により中間代謝産物のフアルネ シルニリン酸 (P P) が蓄積され、 結果としてその脱リン酸化物の ΓΌΗが生産さ れると考えられる。 あるいは、 A451の遺伝子型にみられる iM V または SO7 の変異によって FOHを生産する能力が付与されたとも考えられる。つまり、 A451 と同様なスクァレン合成酵素活性とメバロン酸経路活性のバランスを有している 株、 あるいは、 及び 又は KO7に変異を持つ株であれば、 どの株でも同 様に H G^導入で F0H生産が期待できることになる。 FOH生産に関しては、 PRS444GAPをベクターとして用いたときより pRS434GAPを用いたときの方が 生産性がよい傾向がみられた。
(2) 恒常発現型プロモーター； YPH499
46 恒常発現型プロモータ一 OH 、 GAP (=Τΰ 3ρ), PGKlp又は TEF2^を 含むベクター pRS414PTadh、 pRS414TPadh, pRS434GAP、 pRS444GAP、 pRS434PGK, pRS444PGK, pRS434TEF又は pRS444TEFに、それぞれ HMGl 遺伝子 （PGRエラ一修正後の遺伝子） を挿入した以下のプラスミドを YPH499 へ導入した。
pRS414PTadh-HMGl
pRS414TPadh-HMGl
pRS434GAP-HMGl
pRS444GAP-HMGl
pRS434PGK-HMGl
pRS444PGK-HMGl
PRS434TEF-HMG1
pRS444TEF-HMGl
得られる組換え体を、 40 ^ g/mlとなるようにアデニン硫酸塩を加えた YM培地 (ΎΡΗ499 を宿主としたときの培地。 以下同様。） で培養した。 培養条件は、 ひ） と同様である。 培養後、 培養液のペンタン抽出画分を GC/MS解析した。 培養後、 プレニルアルコール （NOH, FOH) の生産量を測定した。
結果を図 16に示す。 図 16において、 414PT、 414TR 434、 444は、 それぞ l pRS414PTadh, pRS414TPadh, pRS434xxx、 pRS444 xxxベクタ一 （xxxは プロモーターに用いた遺伝子名のアルファべット部分を示す） を用いたときの結 果を表す。 一番右のグラフが遺伝子導入前の宿主 (YPH499)を培養したときの結 果を示す。 図 16 より、 全ての組換え体で FOH の生産量が向上し、 PRS434GAP-HMG1 、 pRS444GAP-HMGl 、 PRS434TEF-HMG1 、 pRS444TEF-HMGl、 pRS434PGK-HMGl , PRS444PGK-HMG1 を導入した YPH499では NOHの生産性が上昇する株が得られた。
(3) 恒常発現型プロモーター； HMGl; EUG
A451、 YPH499, YPH500由来で Glc生育抑制がみられ、 ゲノムへのインテグ レーシヨンも完全に行われた EUG株 （EUG8、 EUG12, EU27) を選択した。
47 恒常発現型プロモーター (=2!DH¾))を含むベクタ一 pRS434GAP 又は PRS444GAPに HAf ^遺伝子 （PCRエラー修正後のもの） を揷入したプラスミ ド pRS434GAP-HMGl 及び pRS444GAP-HMGl を、 EUG8(0.021mg/l NOH， 0.20mg/l FOH 生産）、 EUGl2(0.13mg/l NOH, 5.9mg/l FOH 生産）、 EU27(0.038mg/l NOH, 3.2mg/l ΡΌΗ生産)へ導入し、 プレニルアルコール生産量 を測定した。
結果を図 17 (EUG8)、 図 18 (EUG12) , 図 19 (EUG27) に示す。
EUG株は、 グルコース （Glc) を炭素源とした YM培地で培養すると FOHを 生産するが、 HkfGJ導入で生産性が向上した。 A451株由来の EUG8と YPH499 や、 YPH500由来の EUG12、 EUG27では生産プロファイルが異なり、 YPH系 の株の方がより生産に適していると考えられる。
この結果から、 HMG ^導入により A451由来株、 YPH499由来株、 YPH500由 来株のプレニルアルコール生産性を向上できることが分かった。
(4) 誘導型プロモー夕一； HMG1; A451 & AURGG101
誘導型プロモーター G Wpを含むベクター pYES2に HMGJ遺伝子 （PCRェ ラー変異型 HMG1である HMG1' を挿入したプラスミド pYES2- HMGを、 A451 と実施例 4で作製した AURGG101 (A451, aurl AURl-C)へ 入 すこ。
それぞれの組換え体を前培養し、 25 m (誘導型プロモーターを使用した酵母 を用いて前培養を行ったときの量。 以下同じ。） の前培養液を 2.5 mlの SG培地 に加え、 26°Cで 4日間 130 r.p.m.の往復振盪培養で培養した。 ただし、 SG培地 に加える前には菌体を生理食塩水で洗浄し、 グルコース成分の持ち込みがないよ うにした。 SG 培地で培養後、 プレニルアルコール （NOH， FOH) の生産量を測 定した。
その結果、 pYES-HMGl/AURGGlOlで NOHを平均 1.43nig/l、 FOHを平均 4.31mg/l生産し、 変異型匿 G1である HU'を含む pYES-HMGlを導入した 組換え体でもプレニルアルコール高生産性を示すクローンが得られた （図 20)。 図 20Aは A451の結果、 図 20Bは AURGG101の結果である。 pYESは遺伝子導 入に用いたベクター名である。
48 A451由来株である AURGG101を宿主に用い、 0 を使用した場合は、 FOH を特に高生産するクローンが得られた。
(5) 誘導型プロモーター； HM(¾; W303-1A又は W303-1B
誘導型プロモータ一 GALJpを含むベクタ一 p YES2に H G2遺伝子を揷入した プラスミド pYES2-HMGを、 W303-1Aと W303-1Bへ導入した。 SG培地で培養 後、 プレニルアルコール （NOH, FOH) の生産量を測定した （図 21)。
HU遺伝子を導入すると （それぞれの株の左側の棒グラフ）、 全ての産物の 生産量が増加していた。 W303株の特徴としては、 NOHの生産に有効であった。
〔実施例 8〕 欠失型 HMG-CoA還元酵素遺伝子の高発現によるプレニルアル コール生産
実施例 7では HMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子の完全長のもの を用いてプレニルアルコール生産型組換え酵母を開発したが、 本実施例では欠失 型 HMG-CoA還元酵素遺伝子を用いてプレニルアルコール生産型組換え酵母を 作製し、 その生産を行った。
(1) 誘導型プロモーター； HMG1 ; 5
誘導型プロモーター ί ϋρ を含むベクタ一 pYES2 に欠失型 JZ G^'遺伝子を 揷入した以下のプラスミド (実施例 3(4)記載)をそれぞれ A451へ導入した。
PYHMG026
PYHMG044
pYHMG056
pYHMG062
pYHMG076
pYHMG081
pYHMGlOO
pYHMG112
pYHMG122
49 SG培地で培養後、 プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図 22)。
欠失型 HMG1遺伝子を誘導型プ口モーターで発現させると、 FOH高生産株が 得られた。 FOH 生産には HMG1 Δ 044 と 匿 G1 Δ 122 が効果があつた (HMG122/A451で平均 O.Omg/Ι)。
(2) 誘導型プロモーター； H¾TC¾ A ; AURGG101
誘導型プロモ一夕一 G LZpを含むベクター pYES2に、欠失型 J MGJ'遺伝子を 挿入した以下のプラスミド (実施例 3(4)記載)をそれぞれ AURGG101へ導入した。
PYHMG026
PYHMG044
PYHMG056
PYHMG062
pYHMG076
pYHMG081
pYHMGlOO
pYHMG112
PYHMG122
PYHMG133
SG培地で培養後、 プレニルアルコール （NOH, FOH) の生産量を測定した（図 23、図 24)。図 23において、一番右側のカラムは遺伝子導入前の宿主 AURGG101 の生産量を示す。 図 24は、 図 23のスケールを拡大したものである。
特に、 _ΗΜΟ?Δ 044を誘導型プロモーターで発現させた場合には、 プレニルァ ルコールを高生産する株 (15-2株)が得られた。 NOH、 FOHは平均でそれぞれ 12 mg/L 31.7 mg/1であり （図 23)、 最大生産量はそれぞれ、 23 mg/l、 53 mg/lであ つた。 HMG1 A 044以外では 0.05-0.06mg/l程度の N〇H、 FOH生産株が得られ (図 24)、 MG1 A 062導入株では最大で O.llmg/1 NOH、 0.13mg/l FOHを生産 した。
50 (3) 恒常発現型プロモーター ；匿 Gl、 誘導型プロモー夕一 ； HMG1 ； AURGG101
実施例 7(2)で作製した pRS434GAP-HMGl又は pRS444GAP-HMGlを、本実 施例 (2)で作製した 15-2 株へ導入した。 SG培地で培養後、 プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した （図 25)。
その結果、 15-2株の； FOH生産 53mg/lを向上させ、 最大で 66mg/l FOHを生 産する株が得られた。
〔実施例 9〕 Escherichia coliによるプレニルアルコールの生産
( 1) 実施例 2(4)、 （5)、 （7)で得られたプラスミドを ^ に導入し、 50 ml/300 ml flaskの 2x YT、 1 mM IPTG培地に前培養液を 0.5 ml加え、 必要に応 じた抗生物質（アンピシリン、 クロラムフエ二コール） と 5 mM (約 0.12% (W/V)) の IPPと DMAPPを加え、 37°Cで 16時間振盪培養した。
37°Cで 16時間振盪培養した後、 培養液上清と沈澱超音波破砕物にジャガイモ酸 性フォスファタ一ゼを加え、 ペンタンを有機溶媒としてプレニルアルコールを抽 出し、 実施例 7(1)にあるように GC/MSにより生産量を同定、 定量した。
その結果、培地に添加成分として IPPと DMAPPを加えたときの FOHの生産量 は、 野性型 ispAを導入した塲合 (図 26中の pALispAで示す)で 86.4 mg/1であり、 野性型 fpsを導入した場合 (図 26中の pFE15NS2.9-lで示す)で 12.0 mg/1であつ た。 また、 変異型 を導入した場合でも、 p l8M、 pl8Eを保持する JM109 を培養した場合はそれぞれ 11.1 mg/ 16.3 mg/1であり、 p4Dを保持する JM109 を培養した場合は 72.7 mg/L p l6D を保持する JM109 を培養した場合は 93.3 mg/1に達した（図 26)。
(2) IPPと DMAPPを添加しなくてもプレニルアルコール生産が行えるかどう かを確かめるため、 実施例 2(4)、 （6)で得られたプラスミド pALispA4と p3-47- 11、 又は pALispA4と p3-47-13を大腸菌 JM109に導入、 50 ml/300 ml flaskの 2x YT、 1 mM IPTG培地に前培養液を 0.5 ml加え、 必要に応じて抗生物質を加 え （アンピシリン、 クロラムフエ二コール）、 37 で 16時間振盪培養した。 その
51 結果、 pALispA4と p3-47- 11を保持する JM109で 0.15 mg/ pALispA4と p3- 47-13を保持する JM109で 0.16 mg/1の FOH生産能力があった（図 27)。
したがって、 'を含むプラスミド P3-47-11又は p3-47-13と、 を含むプラ スミド pALispA4の二種のプラスミドを保持する JM109、 すなわち idiと ispA を導入した大腸菌であれば、 IPPや DMAPP といった添加物なしでも 0.15-0.16 mg/1の FOHを生産する能力があることがわかった。
〔実施例 10〕 FOHの大量生産
1 培養条件
CSM-URA (BIO 101 In 製）及び DOB (BIO 101 Inc.製）培地（200nil/500nil- バッフル付き三角フラスコ） にスラントより実施例 8(2)に記載の 15-2株組換え 酵母（pYHMG044を保持する AURGG101株）を一白金耳植菌し、 30°C、 130rpm で 2日間培養した。 次に、 培養液に含まれているグルコースを完全に除くため、 遠心 （1500g、 5分、 4°C) 及び滅菌した生理食塩水による洗浄を 3回繰り返した。 その後、 フアーメン夕一に 50ml植菌 （1 % ) し、 以下の条件で培養した。
<フアーメンター培地 >
5 % ガラク卜ース
アミノ酸含有 YNB (Difco製）
1 % 大豆油 （ナカライテスク）
0.1%アデカノ一ル LG109 (旭電化）
<運転条件 >
培養装置： MSJ-U 10L培養装置 （丸菱バイォェンジ）
培地量： 5L
培養温度： 26DC
rf ¾k： 1 vvm
アンテーション： 300rpm
p H： 4N水酸化ナトリゥム溶液及び 2N塩酸溶液を用い、
以下のパラメーターで pHを比例制御
Proportional Band 1.00
52 Non Sensitive Band 0.15
Control Period 16 Sec
Full Stroke 1 Sec
Minim un Stroke 0 Sec
2 . 菌体数測定
培養液 100 lを生理食塩水で 1~20倍に希釈し、 血球計 （林理化学） で細胞 数を計数した。 0.06mm四方 （最少のグリッド 9つ分） の菌数を 4平均し、 以下 の式から培養液 1L当たりの菌数を算出した。
菌数 （l X 109/L-broth) = 0.444X (0.06mm四方の菌体数） X希釈倍率
3 . FOHの定量
FOH量は、 実施例 8と同様に同定 ·定量した。
4 . 結果
結果を図 28に示す。 図 28より、 変異型 HMG-CoA還元酵素遺伝子 H G^'の 欠失型遺伝子厘 を、 A451由来株である AURGG101に導入した組換 え酵母で、 培養液 1Lあたり平均 146mg、 最高で 158mgの FOHを生産できるこ とが示された。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 そのまま参考として 本明細書に取り入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明により、 プレニルアルコールの製造方法が提供される。本発明によれば、 生物学的に活性なプレニルアルコールを大量に入手できるため、 これをもとに 様々な生理活性のあるイソプレノィド ·テルぺノィドを合成することができる。 また、 本発明において提供された活性型プレニルアルコールは、 新たな生理活性 を持つ物質を見出すための原料としても利用することができる。
53 配列表フリーテキス卜
配列番号 18〜74：合成 DNA
54

Claims

請 求 の 範 囲
1- ヒドロキシメチルダルタリル- CoA還元酵素遺伝子、 イソペンテ二ルニリ ン酸 Δ -イソメラーゼ遺伝子若しくはフアルネシルニリン酸合成酵素遺伝子 又はこれらの変異型遗伝子並びに転写プロモーター及ぴ転写ターミネータ一 を含む、 発現用組換え DNA又はゲノムインテグレート用 DNA断片を、 宿 主に導入して組換え体を作製し、 該組換え体を培養した後、 得られる培養物 からプレニルアルコールを揉取することを特徴とするプレニルアルコールの 製造方法。
2. プレニルアルコールが炭素数 15のものである請求項 1記載の製造方法。
3. 炭素数 15 のプレニルアルコールがフアルネソ一ル又はネロリ ドールであ る請求項 2記載の製造方法。
4. フアルネソール又はネロリ ドールの培養物中の濃度が少なく とも 0.05mg/lである請求項 3記載の製造方法。
5. ヒドロキシメチルグル夕リル -CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子 が、 配列番号 1、 3、 5及び 7〜16からなる群から選ばれるいずれかの塩基配 列を含むものである請求項 1〜4のいずれかに記載の製造方法。
6. フアルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子が、 配列番号 75、 77、 79、 81及び 83からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む ものである請求項 1〜 4のいずれかに記載の製造方法。
7. イソペンテ二ルニリン酸△-イソメラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子が、 配列番号 85に示される塩基配列を含むものである請求項 1~4のいずれかに 記載の製造方法。
8. 転写プロモーターが、 ^ J? プロモーター、 TDH3 GAP、 プロモーター、
PGK1プロモーター、 TEF2プ Uモータ一、 GAL1プロモーター及ぴ tacプ ロモ—夕一からなる群から選ばれるいずれかのものである請求項 ι〜7のい ずれかに記載の製造方法。
9. 転写ターミネータ一が、 ADH1タ一ミネ一夕一又は ターミネータ一 である請求項 1〜 7のいずれかに記載の製造方法。
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10. 宿主が酵母又は大腸菌である請求項 1〜9のいずれかに記載の製造方法。
11. 酵母がサッカロマイセス 'セレピシェである請求項 10記載の製造方法。
12. サッカロマイセス 'セレピシェが、 A451、 YPH499, YPH500、 W303-1A 若しくは W303-1B又はこれらに由来する株である請求項 11記載の製造方法。
13. ヒドロキシメチルダル夕リル- CoA還元酵素遺伝子、 イソペンテ二ルニリ ン酸△-イソメラーゼ遺伝子若しくはフアルネシルニリン酸合成酵素遺伝子 又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモータ一及び転写ターミネ一夕一 を含む、 発現用組換え DNA又はゲノムインテグレート用 DNA断片を、 宿 主に導入してなる組換え体であって、少なくとも 0.05mg/lのフアルネソール 又はネロリ ドールを生産することができる組換え体。
14. ヒドロキシメチルダルタリル- CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子 が、 配列番号 1、 3、 5及び 7〜： L6からなる群から選ばれるいずれかの塩基配 列を含むものである請求項 13記載の組換え体。
15. フアルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子が、 配列番号 75、 77、 79、 81及び 83からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む ものである請求項 13記載の組換え体。
16. イソペンテ二ルニリン酸 Δ -イソメラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子が、 配列番号 85に示される塩基配列を含むものである請求項 13記載の組換え体。
17. 転写プロモーターが、 ADH1プ Uモーター、 TDH3 GAP) プロモーター、
PGK1プロモーター、 TEF2プ Uモータ一、 GAL1プロモーター及び プ ロモ—夕—からなる群から選ばれるいずれかのものである請求項 13〜16 の いずれかに記載の組換え体。
18. 転写ターミネータ一が、 ADH1夕一ミネ一ター又は CYC1ターミネータ一 である請求項 13〜； 16のいずれかに記載の組換え体。
19. 宿主が酵母又は大腸菌である請求項 13〜18のいずれかに記載の組換え体。
20. 酵母がサッカロマイセス ·セレピシェである請求項 19記載の組換え体。
21. サッカロマイセス 'セレピシェが、 A451、 YPH499、 YPH500、 W303-1A 若しくは W303-1B又はこれらに由来する株である請求項 20記載の組換え体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7851199B2 (en) 2005-03-18 2010-12-14 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US8691555B2 (en) 2006-09-28 2014-04-08 Dsm Ip Assests B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002010398A2 (en) 2000-07-31 2002-02-07 Hahn Frederick M Manipulation of genes of the mevalonate and isoprenoid pathways to create novel traits in transgenic organisms
US7172886B2 (en) * 2001-12-06 2007-02-06 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of isopentenyl pyrophosphate
US7192751B2 (en) * 2001-12-06 2007-03-20 The Regents Of The University Of California Biosynthesis of amorpha-4,11-diene
CA2567547C (en) * 2004-05-21 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
JP5590769B2 (ja) 2004-07-27 2014-09-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア イソプレノイド化合物を生産するための遺伝的に修飾された宿主細胞および同宿主細胞の使用方法
WO2007024718A2 (en) * 2005-08-19 2007-03-01 The Regents Of The University Of California Genetically modified host cells and use of same for producing isoprenoid compounds
JP2009511020A (ja) * 2005-10-07 2009-03-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 改変チトクロームｐ４５０酵素をコードする核酸およびその使用法
US8114645B2 (en) * 2006-05-19 2012-02-14 The Regents Of The University Of California Methods for increasing isoprenoid and isoprenoid precursor production by modulating fatty acid levels
DK2024504T4 (da) * 2006-05-26 2023-02-27 Amyris Inc Fremstilling af isoprenoider
BRPI0713105B8 (pt) * 2006-05-26 2021-05-25 Amyris Biotechnologies Inc método para produzir um isoprenóide
WO2009006386A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 The Regents Of The University Of California Host cells and methods for producing isoprenyl alkanoates
WO2009006429A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Regents Of The University Of California Host cells and methods for producing 3-methyl-2-buten-1-ol, 3-methyl-3-buten-1-ol, and 3-methyl-butan-1-ol
JP4821886B2 (ja) * 2009-06-04 2011-11-24 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母、当該組換え酵母を用いた分岐アルコールの製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001650A1 (en) * 1998-07-06 2000-01-13 Dcv, Inc. Doing Business As Bio-Technical Resources Method of vitamin production

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5460949A (en) * 1990-11-15 1995-10-24 Amoco Corporation Method and composition for increasing the accumulation of squalene and specific sterols in yeast
JP3198842B2 (ja) * 1994-03-24 2001-08-13 トヨタ自動車株式会社 ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ
JP3538998B2 (ja) * 1995-09-01 2004-06-14 トヨタ自動車株式会社 長鎖プレニル二燐酸合成酵素
JP3209103B2 (ja) * 1996-07-03 2001-09-17 トヨタ自動車株式会社 変異型プレニル二燐酸合成酵素
WO1999053071A1 (fr) * 1998-04-14 1999-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composes isoprenoides au moyen de micro-organismes et procede de detection de composes ayant une action antibacterienne ou herbicide
US6531303B1 (en) * 1998-07-06 2003-03-11 Arkion Life Sciences Llc Method of producing geranylgeraniol
CN1308623A (zh) * 1998-07-06 2001-08-15 伊斯曼化学公司 生产维生素e的方法
JP4013535B2 (ja) * 2000-12-28 2007-11-28 トヨタ自動車株式会社 微生物によるプレニルアルコールの高生産方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000001650A1 (en) * 1998-07-06 2000-01-13 Dcv, Inc. Doing Business As Bio-Technical Resources Method of vitamin production

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLANCHARD L. ET AL.: "Characterization of a lysine-to-glutamic acid mutation in a conservative sequence of farnesyl diphosphate synthase from saccharomyces cerevisiae", GENE, vol. 125, no. 2, 1993, pages 185 - 189, XP002909497 *
CHAMBON C. ET AL.: "Isolation and properties of yeast mutants affected in farnesyl diphosphate synthetase", CURR. GENET., vol. 18, 1990, pages 41 - 46, XP002909498 *
PLOCHOCKA D. ET AL.: "The role of ERG20 gene (encoding yeast farnesyl diphosphate synthase) mutation in long dolichol formation. Molecular modeling of FPP synthase", BIOCHIMIE, vol. 82, no. 8, August 2000 (2000-08-01), pages 733 - 738, XP002909496 *
POLAKOWSKI T. ET AL.: "Overexpression of a cytosolic hydroxymethyl-CoA-reductase leads to squalene accumulation in yeast; recombinant enzyme expression in saccharomyces cerevisiae; metabolic engineering for use in ergosterol production", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 49, no. 1, 1998, pages 66 - 71, XP002909495 *
See also references of EP1354954A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7851199B2 (en) 2005-03-18 2010-12-14 Microbia, Inc. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US9909130B2 (en) 2005-03-18 2018-03-06 Dsm Ip Assets B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US8691555B2 (en) 2006-09-28 2014-04-08 Dsm Ip Assests B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US9297031B2 (en) 2006-09-28 2016-03-29 Dsm Ip Assets B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi

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