WO2002046460A2 - Methode de detection d'un risque d'atherosclerose - Google Patents
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- this subject when the allele A is detected, this subject is diagnosed as predisposed to atherosclerosis or to a disease due to atherosclerosis. More specifically, when the subject is homozygous AA, the risk of death is earlier. It also relates to an ex vivo method for the detection of subjects at risk of reduced life expectancy (risk of death earlier than the average for the population) or of subjects predisposed to a disease due to atherosclerosis, such as in particular coronary artery disease, myocardial infarction, ischemic stroke and arteriopathy of the lower limbs, comprising the identification of at least one variant of the ECE-1 gene, as defined above.
- this nucleic acid comprising at least one of the polymorphisms mentioned above is proposed in a readable computer medium as databases, in particular for analyzing and / or identifying the homologs, haplotypes, as a screening tool to detect the presence of one of these polymophisms.
- the use of this nucleic acid comprising at least one of the polymorphisms mentioned above is proposed to identify compounds capable of modifying the expression of the ECE-1 gene. Changing gene expression includes inhibiting or increasing gene expression. This can be done in particular by measuring the level of expression of a reporter gene (for example ⁇ -galactosidase) under the control of the promoter in host cells transfected in the presence and in the absence of the test compound.
- a reporter gene for example ⁇ -galactosidase
- - antisense primer 5'-AAGTATCAGGAAGGTGCCCTCAAT ⁇ 3 '(SEQ. ID NO: 9)
- - group 3 102 subjects having presented ischemia or myocardial infarction in which a coronary bypass was performed.
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Abstract
La présente invention a pour objet une méthode ex vivo de diagnostic de sujets à risque d'athérosclérose et les moyens utilisés pour cette méthode basée sur la mise en évidence de polymorphismes du gène de l'ECE-1. Elle concerne également une méthode ex vivo de détection d'un risque de diminution de l'espérance de vie (risque de décès plus précoce que la moyenne de la population) et de prédisposition à des maladies dues à l'athérosclérose, telles que notamment: maladie coronaire, infarctus du myocarde, accident ischémique cérébral, artériopathie des membres inférieurs.
Description
METHODE DE DETECTION D'UN RISQUE D'ATHEROSCLEROSE
La présente invention concerne une méthode ex vivo de diagnostic de sujets à risque d'athérosclérose et les moyens utilisés pour cette méthode basée sur la mise en évidence de polymorphismes du gène de l'ECE-1. Elle concerne également une méthode ex vivo de détection d'un risque de diminution de l'espérance de vie (risque de décès plus précoce que la moyenne de la population) et de prédisposition à des maladies dues à l'athérosclérose, telles que notamment : maladie coronaire, infarctus du myocarde, accident ischémique cérébral, artériopathie des membres inférieurs.
L'athérosclérose est la cause principale d'infarctus du myocarde, d'accident vasculaire cérébral et de gangrène des extrémités des membres. L'athérosclérose et ses complications (thrombose, resténose après angioplastie,...) sont des affections très fréquentes dans les pays industrialisés. II est estimé que ces affections sont responsables de 50% de la mortalité totale.
Le processus d'athérosclérose consiste en la formation de plaques fibro-graisseuses dans la paroi des artères (région sous-endothéliale) en réponse à une "aggression" par divers agents favorisants (les plus fréquents étant l'hypertension artérielle et l'hypercholestérolémie). Ces plaques vont ensuite augmenter de volume et pourront alors rétrécir le calibre de l'artère, avec dans certaines conditions un retentissement sur le débit sanguin dans l'artère. Enfin, la survenue d'un thrombus à la surface de la plaque d'athérome pourra obstruer totalement la lumière de l'artère et aboutir à une nécrose des organes d'aval, par absence d'apport en oxygène. L'étiologie de ces désordres est multifactorielle mais comporte une composante génétique, encore mal identifiée, dont la connaissance précoce permettrait d'instituer des traitements adaptés (approche pharmacogénétique).
L'endothéline est une des molécules biologiques les plus vaso- actives. Sa forme active est produite à partir de son précurseur (big-endothéline) par l'enzyme de conversion de l'endothéline-1. Différentes propriétés de l'endothéline (effet activateur et mitogène sur les cellules musculaires lisses de la paroi artérielle, effet chimiotactique sur les leucocytes circulants...) pouvaient faire soupçonner l'implication du système vasomoteur à endothéline dans la
genèse de la plaque d'athérome, et par là, la participation de ce système au déterminisme génétique du risque d'accident cardio-vasculaire. Certaines études ont montré une augmentation de l'expression de l'endothéline et de l'Enzyme de Conversion . de l'Endothéline dans le vaisseau athéromateux (Rossi et coll., Circulation. 1999; 99:1147-1155), ainsi qu'un effet protecteur d'un antagoniste de l'endothéline sur la survenue de lésions d'athérosclérose dans des modèles animaux (Barton et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998;95:14367-14372).
Le gène de l'enzyme de conversion de l'endothéline-1 (ECE-1 , enzyme ayant un rôle clé dans la production d'endothéline active) paraissant un candidat en pathologie vasculaire, les auteurs de la présente invention ont recherché des variants (polymorphismes) dans la séquence du gène, dans le but de réaliser ensuite des études d'association.: Ils ont étudié plus spécialement les régions promotrices du gène précédemment décrites (Valdenaire et coll., J. Biol. Chem. 1995;270:29794-29798 ; Valdenaire et coll., Eur. J Biochem. 1999 ; 264, 341-349, Orzechowski et coll., J. Mol. Med. 1997;75:512-521 ; Funke- Kaiser et coll., FEBS Lett. 2000;466:310-316).
Ils ' ont ainsi découvert quatre polymorphismes binucléotidiques (nommés en anglais "single nucleotide polymorphism" ou SNP), situés dans trois différentes régions promotrices (appelées A, B, C) ; la position de ces polymorphismes est donnée par rapport à leurs sites d'initiation de la traduction respectifs (codon ATG de départ) :
- région promotrice ECE-1 : polymorphisme G-377A . (Adénine se substituant à Guanine); séquence : 5'-TTTTGC(G/A)TGGGAT-3' (SEQ. ID NO:1) - région promotrice ECE-1B : polymorphisme C-25A ; (Adénine se substituant à Cytosine); séquence : 5'-GGGCAG(C/A)GGGACC-3' (SEQ. ID NO:2)
- région promotrice ECE-1 B : polymorphisme C-338A ; (Adénine se substituant à Cytosine); séquence : 5'-GGGCCA(C/A)ATCGAG-3' (SEQ. ID-NO.3)
- région promotrice ECE-1C : polymorphisme C-102T ; (Thymine se substituant à Cytosine); séquence : 5'-AGGCAG(C/T)CGAGCC-3' (SEQ. ID NO:4)
Après génotypage de plusieurs centaines de sujets témoins, les fréquences alléliques des allèles rares de ces polymorphismes sont de 30 % pour le polymorphisme ECE-1 B C-338A, 10 % pour les polymorphismes ECE-1A G-377A, ECE-1 B C-25A et ECE-1C C-102T. Ces allèles rares présentent entre eux un fort déséquilibre de liaison : absolu entre ECE-1A G-377A et ECE-1B C- 25A, complet entre ECE-1B C-338A et ECE-1A G-377A et incomplet entre ECE1B C-338A et ECE-1C C- 02T.
Il a été trouvé plus particulièrement que le polymorphisme ECE-1B C- 338A est un polymorphisme fonctionnel. Le polymorphisme ECE-1 B C-338A modifie l'expression du gène situé en aval, plus particulièrement le gène ECE-1. Après études génétiques d'association entre ces polymorphismes et des pathologies vasculaires, il a été trouvé que le gène de l'ECE-1 est un gène de susceptibilité à l'athérosclérose et qu'il influence également la longévité en augmentant le risque de mort prématurée. Les inventeurs ont plus particulièrement mis en évidence que les porteurs d'allèle A du polymorphisme C-338A sont plus fréquemment porteurs de plaques d'athérome que les sujets homozygotes CC.
Ainsi, ces résultats permettent d'envisager la détection, et en particulier la détection précoce, de sujets à risque d'athérosclérose prématurée (ou plus importante à âge égal). Ces résultats permettent également la détection d'un risque accru de maladies vasculaires liées à l'athérosclérose, ainsi que la détection d'un risque de mort prématurée.
La présente invention concerne donc une méthode ex vivo de diagnostic de sujets à risque d'athérosclérose comprenant la mise en évidence d'au moins un variant du gène de l'ECE-1 ou d'au moins un variant situé à proximité du gène ECE-1 en déséquilibre de liaison avec l'un de ces variants du gène.
Ainsi, par méthode ex vivo, on entend selon l'invention une méthode dont l'étape principale de détection du variant est réalisée ex vivo.
Plus spécifiquement, le variant mis en évidence se situe dans les régions promotrices du gène de l'ECE-1 , ces régions ayant été décrites dans les publications citées ci-dessus.
Plus particulièrement, le procédé est réalisé par mise en évidence d'au moins un variant du gène de PECE-1 ou d'une séquence voisine en déséquilibre
de liaison avec l'un de ces variants, ledit variant étant choisi parmi l'un des polymorphismes suivants : G-377A ; C-25A ;-C-338A et C-102T.
Elle concerne plus spécialement un procédé de diagnostic de sujets à risque d'athérosclérose par la détection du variant ECE-1 B C-338A décrit ci- dessus.
Ainsi, dans le cas du variant ECE-1B C-338A, lorsque l'allèle A est détecté, ce sujet est diagnostiqué comme prédisposé à l'athérosclérose ou à une maladie due à l'athérosclérose. Plus spécifiquement, lorsque le sujet est homozygote AA, le risque de décès est plus précoce. Elle concerne également une méthode ex vivo de détection de sujets à risque de diminution de l'espérance de vie (risque de décès plus précoce que la moyenne de la population) ou de sujets prédisposés à une maladie due à l'athérosclérose, telles que notamment maladie coronaire, infarctus du myocarde, accident ischémique cérébral et artériopathie des membres inférieurs, comprenant la mise en évidence d'au moins un variant du gène de l'ECE-1 , tel que défini précédemment.
Ainsi, la méthode selon l'invention peut notamment permettre de détecter des sujets à risque accru de complications cliniques (notamment thombotiques) de l'athérosclérose et d'affections cardiovasculaires associées et apparentées. La présente invention concerne également l'application au choix d'un traitement par des agents, notamment pharmacologiques, agissant sur les différentes composantes du système vasomoteur à endothéline (par exemple antagonistes de l'endothéline ou inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline). En effet, on peut envisager par exemple une action thérapeutique différente des diverses classes de traitements anti-athéromateux prophylactiques ou thérapeutiques chez les sujets porteurs d'un allèle de risque du gène de l'ECE-1. La détection d'allèles de risque du gène de l'ECE-1 permet d'envisager l'instauration d'un traitement préventif adapté chez les sujets porteurs. Le polymorphisme ECE1B C-338A est un polymorphisme fonctionnel, qui modifie l'expression du gène situé en aval. Ce résultat permet d'envisager une détection des sujets susceptibles de présenter une surexpression (ou une sous- expression) du gène de l'ECE-1. Ces sujets pourraient ainsi être plus
susceptibles de développer une quelconque maladie dans laquelle une modification de l'expression du gène de l'ECE-1 a un rôle pathogénique. En effet, il a été suggéré qu'une surexpression de l'ECE-1 pourrait avoir un rôle pathogénique dans l'athérosclérose (Minamino et al, Circulation 1997;95:221- 230) et également la maladie d'Alzheimer (Eckman et al, Journal of Biological Chemistry 2001 ;276:24540-24548).
Par conséquent, la présente invention a aussi trait à une méthode ex vivo de détection de sujets susceptibles de présenter une modulation de l'expression du gène ECE-1 qui comprend la mise en évidence d'au moins un variant du polymorphisme C-338A. Plus particulièrement, lorsque le variant A de ce polymorphisme est détecté, il peut être prévu une augmentation de l'expression du gène ECE-1.
La mise en évidence des allèles d'un des variants mentionnés ci-dessus, tels que notamment le variant ECE-1 B C-338A, peut se faire selon différentes méthodes bien connues de l'homme du métier.
Cette mise en évidence comprend en général deux étapes principales que sont l'extraction d'un échantillon de l'ADN génomique et la détection du variant. - Avantageusement, l'ADN extrait est amplifié par toute méthode connue en soi, telle que la méthode PCR (polymerase chain reaction), avant analyse de la variation allélique.
Il existe un grand nombre de méthodes analytiques qui peuvent être utilisées pour détecter une variation allélique de polymorphismes tels que précédemment décrits. La détection peut être effectuée par une méthode automatisée ou par une méthode visuelle directe.
En général, cette détection requiert une technique de détection de mutation, éventuellement une réaction d'amplification et optionnellement un système de génération de signal. Ainsi, cette détection de variants peut être réalisée en mettant en œuvre une ou plusieurs méthodes de différents types, telles que notamment : méthodes de séquençage, telles que le séquençage direct d'ADN, le ' séquençage par hybridation (avec utilisation de sondes d'oiigonucléotides),
méthodes basées sur l'hybridation, telles que l'hybridation spécifique d'alièle (ASO), la technique de 5'-exonucléase (Taqman™), l'hybridation sur « puces à ADN » (microarrays ou oligo-chips), techniques de ligation, telles que la technique de ligation d'oligonucléotides (OLA), techniques d'incorporation, tel que le « miniséquençage », techniques physico-chimiques, telles que la chromatographie liquide à haute pression en conditions dénaturantes (DHPLC), la spectrométrie de masse, les techniques avec enzymes de restriction, telles que la PCR générant des sites de restriction ou la technique RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism).
Cette mise en évidence d'un variant peut comprendre plus particulièrement les étapes suivantes :
- extraction d'un échantillon de l'ADN génomique d'un sujet ; - amplification de l'ADN ;
" - éventuellement transfert de l'ADN amplifié sur un support de détection du variant ;
- détection du variant.
L'extraction d'un échantillon de l'ADN génomique se fait à partir d'un tissu ou d'un fluide d'un individu. Ce tissu ou ce fluide correspond plus particulièrement à du sang, du plasma ou du fluide de la lymphe. Cette extraction peut donc se faire par prélèvement sanguin.
La présente invention concerne également les moyens utilisés notamment pour cette méthode de diagnostic basés sur des polymorphismes du gène de l'ECE-1.
La présente invention concerne ainsi un acide nucléique (ADN ou ARN) isolé correspondant à un fragment du gène de l'ECE-1 d'au moins 13 nucléotides de long, dans lequel au moins un des polymorphismes mentionnés ci-dessus est présent, ou un brin complémentaire de cet acide nucléique ou encore une séquence antisens de cet acide nucléique.
Le fragment présente au moins 13 bases, de préférence au moins 17 et encore mieux au moins 30. De préférence, il présente moins de 200 nucléotides et encore plus préférentiellement moins de 100 bases.
Le fragment selon l'invention peut provenir d'un composant naturel ou être synthétisé par des techniques bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, il est au moins 30 % en poids pur, plus préférentiellement au moins 60% pur, encore plus préférentiellement 90% en poids pur. Par acide nucléique dans lequel au moins un des polymorphismes mentionnés ci-dessus est présent, on entend selon l'invention un fragment nucléotidique présentant un fragment de la séquence nucléotidique dudit gène dans laquelle une des deux variantes alléliques d'au moins un desdits polymorphismes est présente. Selon un aspect de l'invention, il est proposé l'utilisation de cet acide nucléique comprenant au moins un des polymorphismes mentionnés ci-dessus dans un support lisible informatique à titre de bases de données, notamment pour analyser et/ou identifier les homologues, les haplotypes, comme outil de criblage pour détecter la présence de l'un de ces polymophismes. Selon un autre aspect de la présente invention, il est proposé l'utilisation de cet acide nucléique comprenant au moins un des polymorphismes mentionnés ci-dessus pour identifier des composés capables de modifier l'expression du gène ECE-1. La modification de l'expression du gène inclut l'inhibition ou l'augmentation de l'expression du gène. Ceci peut être notamment réalisé en mesurant le taux d'expression d'un gène rapporteur (par exemple β-galactosidase) sous contrôle du promoteur dans des cellules hôtes transfectées en présence et en absence du composé testé.
La présente invention a également trait aux amorces nucléotidiques permettant de détecter les polymorphismes mentionnés ci-dessus. Ainsi, la présente invention concerne en outre une amorce nucléotidique spécifique d'un allèle capable de détecter au moins un des polymorphismes cités ci-dessus.
Une amorce nucléotidique est utilisée, généralement conjointement avec une amorce commune, dans une réaction d'amplification, telle que PCR, ce qui permet de distinguer les allèles par amplification sélective d'un allèle à une position particulière de la séquence.
L'amorce spécifique d'alièle selon l'invention présente de préférence 17 à 50 nucléotides, plus préférentiellement 17 à 30 nucléotides.
L'amorce spécifique d'alièle correspond de préférence exactement à l'allèle à détecter, mais leurs dérivés peuvent également convenir, dérivés dans lesquels 6 à 8 des nucléotides à l'extrémité 3' correspondent à l'allèle à détecter et dans lesquels jusqu'à 10 (8, 6, 4, 2 ou 1) des nucléotides restants peuvent varier sans affecter de manière significative les propriétés de l'amorce.
Les amorces peuvent être préparées selon les méthodes de synthèse connues de l'homme du métier. Des exemples de méthodes peuvent être trouvés dans des livres standard, par exemple "Protocols for oligonucleotides and analogues; Synthesis and properties," Methods in Molecular Biology Séries ; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 089603-247-7;1993; 1st Edition.
Les techniques de réaction PCR sont décrites dans de nombreuses publications, on peut notamment citer les brevets EP 0200362, EP 0201184, US 4683195, US 4800159 et US 4683202.
Les amorces selon l'invention peuvent être marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
Le variant peut donc être détecté par référence à la perte ou au gain de sites, éventuellement créés, reconnus par des enzymes de restriction. Ainsi, selon une variante particulière de l'invention, la mise en évidence de variants du gène ECE-1 peut être réalisée de la manière suivante :
- a) amplification de l'ADN par PCR en présence d'amorces telles que notamment décrites précédemment ;
- b) soumission de l'ADN amplifié selon a) à l'action d'au moins une enzyme de restriction permettant la différenciation des allèles ;
- c) séparation des fragments obtenus en b) ; d) identification de l'allèle par comparaison des fragments séparés en c) avec des témoins ayant subi au moins les étapes b) et c) et présentant les différents génotypages des polymorphismes précédemment décrits. L'amplification de l'ADN est plus particulièrement effectuée par la
- technique PCR à l'aide d'une amorce oligonucléotidique sens et d'une amorce oligonucléotidique antisens, complémentaires de l'ADN de la région amplifiée.
La séparation des fragments d'ADN peut être notamment réalisée par électrophorèse sur gel, préférentiellement sur gel de polyacrylamide.
Plus particulièrement, on utilise à l'étape c) l'enzyme qui convient, sachant que : - l'allèle A du polymorphisme ECE-1A G-377A crée un site de restriction Nia III,
- l'allèle A du polymorphisme ECE-1B C-25A supprime un site de restriction MspA1 I,
- l'allèle T du polymorphisme ECE-1C C-102T crée un site de restriction Taq I. , En outre, plus particulièrement, pour le polymorphisme ECE-1B C-338A qui ne crée ni ne supprime de site de restriction, son génotypage a été effectué par une technique d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) spécifique d'alièle, en utilisant les amorces oligonucléotidiques suivantes :
- amorce commune : 5'-CCTCTGGAAATCTGCTGGGTAAG-3' (SEQ. ID NO:5)
- amorce spécifique de l'allèle A : 5'-GTATCAGGAAGGTGCCCTCTATT-3' (SEQ. ID NO:6)
- amorce spécifique de l'allèle C : 5'-GTATCAGGAAGGTGCCCTCGATG-3' (SEQ. ID NO:7), Chaque échantillon d'ADN doit donc subir, dans ce cas (sans création et suppression de sites de restriction), deux amplifications pour déterminer d'abord la présence ou l'absence de l'allèle A, puis la présence ou l'absence de l'allèle C. Chaque amplification est une réaction de PCR « duplex », avec amplification conjointe d'un fragment contrôle de plus grande taille (témoin positif du succès de la réaction de PCR).
Cette technique de génotypage utilisée pour le polymorphisme ECE-1 B -Ç 338A étant plus longue et plus coûteuse qu'une réaction de PCR habituelle (car double amplification en conditions très strictes), on préfère utiliser une . réaction de PCR-RFLP, combinant une amplification du fragment d'intérêt avec ' des amorces oligonucléotidiques dont l'une est modifiée de manière à créer un site de coupure pour une enzyme de restriction, telle que notamment l'enzyme Tsp509 I, en présence de l'allèle en question, telle que l'allèle A, suivie d'une digestion par l'enzyme de restriction.
Les amorces utilisées pour la dite amplification sont :
- amorce sens : 5'-TAGGGTTATAGGAGAGGGCTCAGG-3' (SEQ. ID NO:8)
- amorce antisens : 5'-AAGTATCAGGAAGGTGCCCTCAAT~3'(SEQ. ID NO:9)
Selon un autre aspect de l'invention, il est proposé une sonde d'oligonucléotides spécifique d'un allèle d'un des polymorphismes décrits ci- dessus capable de détecter un polymorphisme tel que précédemment décrit.
La sonde selon l'invention présente de préférence 17 à 50 nucléotides, plus préférentiellement de 17 à 35 nucléotides, encore plus préférentiellement de 17 à 30. En général, ces sondes comprennent des séquences de bases entièrement complémentaires à la position du variant dans le gène. Cependant, il est possible d'introduire un ou plusieurs mesappariements, dans la mesure où le pouvoir discriminatoire de. la sonde n'en est pas affecté de manière substantielle. Les sondes selon l'invention peuvent être marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
La présente invention a également trait à un kit de diagnostic de sujets à risque d'athérosclérose prématurée (ou plus importante à âge égal), de sujets à risque accru de maladies vasculaires liées à l'athérosclérose, ou de sujets à risque accru de mort prématurée, qui comprend une sonde ou une amorce telle que précédemment décrite.
Le kit peut comprendre en outre au moins un composé pour amplifier l'ADN. Ce composé est avantageusement une enzyme polymérase utilisable dans une réaction PCR. Ce composé peut être par exemple la Taq polymérase. Le kit peut également comprendre un réactif pour réaliser une électrophorèse sur gel, de préférence sur gel de polyacrylamide.
Des exemples concrets mais non limitatifs de l'invention vont maintenant être présentés.
EXEMPLES :
1. "Identification d'un polymorphisme fonctionnel
Identification du polymorphisme :
L'ADN génomique a été extrait du sang de sujets en utilisant les techniques habituelles. Pour chaque région promotrice (ECE A, ECE1 B-ECE1 D, ECE1 C), 1000 paires de bases de l'ADN génomique ont été amplifiées par PCR, chez 30 sujets, utilisant AmpliTaq Gold (Perkin Elmer), tel que décrit dans Ito C. et al. "Histamin H2 receptor gène variants : lack of association with schizophrenia" Mol. Psychiatry, 2000, 5:159-64, (ECE1A, ECE1 C) ou GC-RICH PCR System (Roche Diagnostics), suivant les instructions du fabricant (ECE1B-ECE1 D). Les produits PCR ont été criblés pour variations de séquences par séquençage direct sur un séquenceur ADN automatique 4000L Li-Cor, tel que décrit dans Ito C. et al. "Histamin H2 receptor gène variants : lack of association with schizophrenia" Mol. Psychiatry, 2000, 5:159-64. Il a été déterminé dans les séquences de type sauvage ou variantes la présence d' éléments cis en utilisant le programme d'ordinateur Matinspector, tel que décrit dans Quandt K. et al. "Matlnd and Matinspector : new fast and . versatile tools for détection of consensus matches in nucleotide séquence data", Nucleic Acids Res. (1995) 23:4878-84.
Dosage de gènes rapporteurs : Toutes les positions de nucléotides (np) sont données par rapport au site d'initiation de traduction de ECE1 B. Les ADN génomiques de deux sujets (l'un homozygote pour l'allèle A et l'autre pour l'allèle C en position -338) sont utilisés pour les tests d'activité de promoteurs. Les régions d'ADN génomique entre np -823 et -2 (promoteur ECE1 B), et entre -823 et +258 (incluant la séquence entière du promoteur spécifique ECE1 D) ont été sous-clonées dans le vecteur pSEAP2-Basic sans promoteur (Great EscAPe SEAP Reporter System 3, Clontech) en amont du gène SEAP (Secreted Alkaline Phosphatase). Après vérification des séquences, les quatre constructions de gènes, désignées respectivement ECE1 B-338A, ECE1 B-338C, ECE1 D-338A et ECE1 D-338C, ont été transfeçtées de manière transitoire dans les cellules ECV304. Le plasmide pcDNA3.1/HisB/LacZ (Invitrogen), contenant le gène de la β-galactosidase sous contrôle d'un promoteur CMV, a été utilisé à titre de standard interne. L'activité phosphatase alkaline a été mesurée à l'aide d'un fluoromètre (Dynatech)
utilisant le phosphate de 4-méthylumbelliferyle en tant que substrat et normalisé vis-à-vis de l'activité β-galactosidase.
Génotypage : Un fragment d'ADN de 446 paires de bases (np -759 à -314) a été amplifié par PCR, tel que précédemment décrit dans Ito et al. (voir ci-dessus) (la température d'hybridation était de 56°C, toutes les réactions contenaient 5 % de DMSO). Les promoteurs oligonucléotides sens et antisens correspondent respectivement aux séquences représentées par SEQ ID n° 8 et SEQ ID n° 9. Les promoteurs antisens ont été modifiés à la position 22 (nucléotide -335 du promoteur ECE1B), créant ainsi un site de reconnaissance pour l'endonucléase de restriction Tsp509l en présence de l'allèle A en position -338. Le produit PCR de 446 paires de bases contenait donc soit 1 (-338C) ou 2 (-338A) site(s) de restriction pour Tsp509l. L'étape de digestion a été réalisée selon les recommandations du fabricant (New England Biolabs), et les produits ont été portés sur 3 % de gel d'agarose marine et visualisés par coloration au bromure d'éthidium.
Identification du polymorphisme dans la région promotrice ECE1 B : L'analyse de la séquence a révélé une substitution de C en A à la position
-338 dans la région promotrice ECE1 B. Ce variant (dénommé ECE1B C-338A) était présent dans 19 chromosomes sur 60 (32 %) et a créé un site de liaison potentiel pour les facteurs de transcription de la famille E2F.
Effet fonctionnel du polymorphisme ECE1 B C-338A :
Le polymorphisme ECE1B C-338A a été localisé dans une région qui réguleJ'expression des ARN messagers de ECE1 B et ECE1D. En utilisant les constructions de gènes rapporteurs du promoteur allélique, il a été analysé si la substitution de C. en A avait un effet sur l'expression du gène. Les constructions de gène rapporteur contenaient soit 822 paires de bases de la seule séquence promotrice ECE1 B (constructions ECE 1B-338A et ECE1B-338C) soit un séquence de 1081 paires de bases incluant les deux régions promotrices ECE1B et ÈCE1 D (constructions ECE1 D-338A et ECE1D-338C). Ces
constructions ont été individuellement transfectées dans les cellules ECV304, qui expriment les deux ARN messagers de ECE1 B et ECE1 D. Ainsi, la présence de l'allèle A dans. le promoteur ECE1B seul est responsable d'une augmentation modérée de l'expression du gène rapporteur, alors qu'avec la séquence génomique plus longue contenant les deux régions promotrices ECE1B et ECE1 D, en présence de l'allèle A, une augmentation de quatre fois l'expression du gène rapporteur a été obtenue.
2. Etude EVA Le polymorphisme ECE1 B C-338A, et plus particulièrement l'allèle "à risque" A, a été étudié à partir de 931 sujets en bonne santé, âgés de 59 à 71 ans, inclus dans l'étude du vieillissement artériel (Etude EVA). Il a été étudié plus spécifiquement l'effet de l'allèle "à risque" sur l'athérogénèse au niveau des artères carotides. Sur un suivi de quatre ans, l'épaisseur intima-média a été mesurée sur l'artère carotide commune au moyen d'ultra-sons mode-B à haute résolution en utilisant un algorythme tel que décrit dans Zureik M et al. "Cross- sectional and 4-year longitudinal associations between brachial puise pressure and common carotide intima — média thickness.in a gênerai population" ; Stroke (1999), 30:550-5.
Analyse des données :
L'association entre l'augmentation moyenne de l'épaisseur intima-media et le génotype de ECE1B C-338A a été évaluée par analyse de la variance (ANOVA) ; l'analyse de la covariance (ANCOVA) a été réalisée pour examiner l'effet du génotype ECE1 B C-338A sur la progression de l'épaisseur intima- media en contrôlant simultanément les covariants.
Les.résuitats sont les suivants :
" Association du polymorphisme ECE1B C-338A avec la progression de l'épaisseur intima-media :
Dans la cohorte de 957 participants de l'étude EVA avec un suivi de quatre ans sur l'épaisseur intima-média, 931 sujets (97 %) ont pu être génotypes pour
le polymorphisme ECE1 B C-338A. Dans le groupe, la fréquence de l'allèle A était de 30 %, les fréquences génotypiques observées dans cette population sont en équilibre de Hardy-Weinberg, soit approximativement 10 % de sujets
AA, 40 % de sujets AC et 50 % de sujets CC. Sur ce suivi de quatre ans, il a été également montré que l'augmentation de l'épaisseur intima-média mesurée de façon standardisée sur l'artère carotide commune était significativement plus importante chez les porteurs de l'allèle A que chez les non-porteurs (sujets AA ou AC contre sujets CC : 0,051 ± 0,04 mm contre 0,034 ± 0,005 mm ; p= 0,01).
Ces résultats montrent donc une influence du variant ECE1 dans la phase précoce du processus d'athérogénèse.
3. ETUDE GENIC Le polymorphisme ECE-1 B C-338A a été génotype chez les sujets participant à l'étude multicentrique GENIC (Elbaz et coll., Blood 2000 ; 95-586- 591 ), soit 477 sujets témoins dont 452 avaient subi un examen des artères carotides par échographie-doppler, et 457. patients atteints d'infarctus cérébral de causes variées.
Le génotypage a d'abord été effectué par une technique d'amplification par PCR spécifique d'alièle, en utilisant la polymérase AmpliTaq Gold (Perkin- Elmer), avec un cycle de 10 minutes de denaturation à 95°C suivi de 35 cycles d'amplification (95°C pendant 30 secondes, 58°C pendant 30 secondes, 72°C pendant 30 secondes). Le génotypage a ensuite été simplifié par l'utilisation d'une technique de PCR-RFLP. La polymérase AmpliTaq Gold (Perkin-Elmer) a été utilisée avec un cycle de 10 minutes de denaturation à 95°C suivi de 35 cycles d'amplification (95°C pendant 30 secondes, 56°C pendant 30 secondes, 72°C pendant 30 secondes), et d'une extension finale de 10 minutes à 72°C. Cette amplification a été suivie d'une digestion par l'enzyme de restriction Tsp5091 pendant 2 heures à 65°C. Pour les deux méthodes de génotypage, les fragments d'ADN obtenus ont été ensuite soumis à une électrophorèse sur gel d'Agarose (2 % dans le premier cas, 3 % dans le deuxième), avec révélation par coloration au bromure d'éthidium.
Ce génotypage des témoins de l'étude GENIC a permis d'obtenir les résultats suivants. "
Premier résultat : Les porteurs homozygotes de l'allèle A (sujets AA, représentant 8% de l'effectif total de cette population d'âge compris entre 20 et 89 ans) avaient un âge moyen de 60,2 ans, significativement différent de celui des sujets AC et CC regroupés, soit 66,4 ans (p=0,007). En outre, la proportion de sujets AA varie selon la classe d'âge : 11 ,1% chez les moins de 60 ans, 6,7% chez les plus de 60 ans.
Deuxième résultat : les porteurs de l'allèle A sont plus fréquemment porteurs de plaques d'athérome que les sujets homozygotes CC. Cela est directement visible en comparant la fréquence des plaques entre sujets AC et CC, dont les âges ne sont pas statistiquement différents : 53,1 % des sujets AC sont porteurs de plaques d'athérome carotidiennes, contre 37,8% des CC (p=0,0004 ; OR=2,28 [1 ,44-3,59]). Après ajustement sur l'âge, l'"Odds Ratio" des porteurs d'au moins un allèle A (AC + AA) est de 1 ,90 [1 ,22-2,95] (p=0,004). L'Odds Ratio" (désigné OR) est un facteur d'approximation du risque relatif de développer des plaques d'athérome.
La prise en compte de la deuxième composante de l'étude GENIC, à savoir 457 sujets ayant présenté un accident ischémique cérébral, donne un résultat concordant : l'analyse en cas-témoins du groupe des patients atteints d'infarctus cérébral lié à l'athérosclérose montre un excès de porteurs de l'allèle A dans le groupe des patients par rapport aux témoins appariés sur l'âge et le sexe (OR=1 ,54 [0,80-2,90], après ajustement sur les antécédents cardio-vasculaires).
4. Etude EURQASPIRE (EURQpean Action to Secondary Prévention through Intervention to Reduce Events) :
Il a été étudié trois groupes de sujets atteints de maladie coronaire symptomatique, présentant trois degrés de sévérité de l'athérosclérose : - groupe 1 : 172 sujets ayant présenté une ischémie ou un infarctus myocardiques; chez lesquels il n'a pas été réalisé d'angioplastie ni de pontage coronaires (ni avant ni après l'événement ischémique) ;
- groupe 2 : 106 sujets ayant présenté une ischémie ou un infarctus myocardiques, chez lesquels il a été réalisé une angioplastie coronaire mais qui n'ont jamais subi de pontage ;
- groupe 3 : 102 sujets ayant présenté une ischémie ou un infarctus myocardiques chez lesquels il a été réalisé un pontage coronaire.
Ces trois groupes sont considérés comme de sévérité croissante en ce qui concerne l'athérosclérose coronaire, car (i) une angioplastie n'est réalisée que lorsque le degré de sténose de l'artère coronaire dépasse 50 % du diamètre artériel (tandis qu'un infarctus myocardique peut survenir sur une plaque d'athérosclérose non sténosante) et (ii) le pontage coronaire est préféré chez les patients présentant plusieurs sténoses artérielles ou une sténose d'un tronc commun.
En comparant les fréquences génotypiques dans les différents groupes, les résultats suivants ont été obtenus : 1. L'allèle A est plus fréquent dans le groupe 2 que dans le groupe
1 (OR=1 ,8 (OR : odds ratio) ; p=0,03) ;
2. dans le groupe 3, on ne trouve aucun homozygote AA. Ceci suggère que l'homozygotie pour l'allèle "à risque" pourrait être responsable d'un effet iéthal chez les sujets présentant une athérosclérose sévère. Ainsi, ces résultats permettent d'établir une influence des variants du gène
ECE1 sur le risque d'athérosclérose coronaire et la longévité.
Claims
1. Méthode ex vivo de diagnostic de sujets à risque d'athérosclérose, de détection de sujets à risque de diminution de l'espérance de vie ou de sujets prédisposés à des maladies dues à l'athérosclérose, qui comprend la mise en évidence d'au moins un variant dans le gène de l'ECE-1 ou d'au moins un variant situé à proximité du gène ECE-1 en déséquilibre de liaison avec des variants du gène.
2. Méthode ex vivo de détection de sujets à risque de diminution de l'espérance de vie ou de sujets prédisposés à une maladie due à l'athérosclérose, qui comprend la mise en évidence d'au moins un variant dans le gène de l'ECE-1 ou d'au moins un variant situé à proximité du gène ECE-1 en déséquilibre de liaison avec des variants du gène.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que la maladie due à l'athérosclérose est choisie parmi maladie coronaire, infarctus du myocarde, accident ischémique cérébral et artériopathie des membres inférieurs.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le variant.se situe dans les régions promotrices du gène de l'ECE-1.
5. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le variant est choisi parmi l'un des polymorphismes suivants : ECE-1A G-377A ; ECE-1 B C-25A ; ECE-1 B C-338A et ECE-1C C-102T.
6. Méthode selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le variant correspond au polymorphisme ECE-1 B C-338A.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mise en évidence du variant comprend les étapes suivantes :
- extraction d'un échantillon de l'ADN génomique d'un sujet, - éventuellement amplification de l'ADN,
- éventuellement transfert de l'ADN amplifié sur un support de détection du variant,
- détection du variant.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'ADN est amplifié par la réaction PCR.
9. Méthode selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la détection de variants peut être réalisée en mettant en oeuvre une ou plusieurs méthodes de différents types choisis parmi : méthodes de séquençage, telles que le séquençage direct d'ADN, le séquençage par hybridation (avec utilisation de sondes d'oligonucléotides), méthodes basées sur l'hybridation, telles que l'hybridation spécifique d'alièle (ASO), la technique de 5'-exonucléase (Taqman™), l'hybridation sur « puces à ADN » (microarrays ou oligo-chips), techniques de ligation, telles que la technique de ligation d'oligonucléotides (OLA), techniques d'incorporation, tel que le « miniséquençage », - techniques physico-chimiques, telles que la chromatographie liquide à haute pression en conditions dénaturantes (DHPLC), la spectrométrie de masse, les techniques avec enzymes de restriction, telles que la PCR générant des sites de restriction ou la technique RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphïsm).
10, Méthode selon l'une des revendications 7 à 9, dans laquelle les étapes mises en oeuvré sont les suivantes : - a) amplification de l'ADN par PCR en présence d'amorces ;
- b) soumission de l'ADN amplifié selon a) à l'action d'au moins une enzyme de restriction permettant fa différenciation des allèles ;
- c) séparation des fragments obtenus en b) ; - d) identification de l'allèle par comparaison des fragments séparés en c) avec des témoins ayant subi au moins les étapes b) et c) et présentant les différents génotypages des variants définis selon l'une des revendications 1 à 6.
11. Méthode selon l'une des revendications 7 à 10, dans laquelle l'amplification est effectuée par la technique PCR à l'aide d'une amorce oligonucléotidique sens et d'une amorce oligonucléotidique antisens, complémentaires de l'ADN de la région amplifiée.
12. Méthode selon la revendication 11 , dans laquelle on utilise deux réactions de PCR spécifiques d'allèles pour génotyper le polymorphisme ECE- 1B C-338A, avec les oligonucléotides antisens spécifiques d'alièle suivants : amorce spécifique de l'allèle A : 5'-
GTATCAGGAAGGTGCCCTCTATT-3' (SEQ. ID NO:6) - amorce spécifique de . l'allèle C : 5'-
GTATCAGGAAGGTGCCCTCGATG -3' (SEQ. ID NO:7).
13. Méthode selon la revendication 11 , dans laquelle on utilise une amplification avec au moins une amorce modifiée de manière à créer un site de coupure pour une enzyme de restriction, l'amplification étant suivie d'une coupure par l'enzyme de restriction, notamment pour génotyper le polymorphisme ECE- B C-338A.
14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'amplification est effectuée avec les amorces suivantes :
- amorce sens : 5'-TAGGGTTATAGGAGAGGGCTCAGG-3' (SEQ. ID NO:8) - amorce antisens : 5'-AAGTATCAGGAAGGTGCCCTCAAT-3' (SEQ. ID NO:9).
15. Méthode selon la revendication 14, dans laquelle la coupure est effectuée par l'enzyme de restriction Tsp509 I.
16. Acide nucléique isolé correspondant à un fragment du gène de l'ECE-1 d'au moins 13 nucléotides de long, dans lequel au moins un des polymorphismes mentionnés à la revendication 5 est présent, ou un brin complémentaire de cet acide nucléique ou une séquence antisens de cet acide nucléique.
17. Amorce nucléotidique spécifique d'un allèle capable de détecter au moins un des. polymorphismes mentionnés à la revendication 5.
18. Amorce selon la revendication précédente capable de détecter le polymorphisme ECE-1B C-338A, présentant une des séquences suivantes :
- amorce spécifique de l'allèle A : 5'- GTATCAGGAAGGTGCCCTCTATT-3' (SEQ. ID NO:6)
- amorce spécifique de l'allèle C : 5'- GTATCAGGAAGGTGCCCTCGATG-3' (SEQ. ID NO:7).
19. Sonde d'oligonucléotides spécifique d'un allèle capable de détecter au moins un des polymorphismes mentionnés à la revendication 5.
20. Kit dé diagnostic pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une des revendication 1 à 15, qui comprend une sonde ou une amorce définie selon l'une des revendications 17 à 1.9.
21. Kit selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un composé pour amplifier l'ADN.
22. Kit selon la revendication 20 ou 21 , caractérisé en ce qu'il comprend en outre un réactif pour réaliser une électrophorèse sur gel, de préférence sur gel de poiyacrylamide.
23. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 16 pour identifier des composés capables de modifier l'expression du gène ECE-1.
24. Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 16 comme outil de criblage pour détecter la présence de l'un des polymorphismes mentionnés à la revendication 5.
25. Méthode ex vivo de détection de sujets susceptibles de présenter une modulation de l'expression du gène ECE-1 , qui comprend la .mise en évidence d'au moins un variant du polymorphisme C-338A, cette mise en évidence étant plus particulièrement définie par l'une des revendications 7 à 15.
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