WO2002034898A1 - Enzima con actividad peroxidasa aislada de la alcachofa cynara scolymus, l., procedimiento para su aislamiento y purificación y aplicaciones - Google Patents

Enzima con actividad peroxidasa aislada de la alcachofa cynara scolymus, l., procedimiento para su aislamiento y purificación y aplicaciones Download PDF

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artichoke
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José Neptuno RODRIGUEZ LOPEZ
Dorotea Lopez Molina
José Bautista TUDELA SERRANO
Francisco Garcia Canovas
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Universidad De Murcia
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Definitions

  • the invention relates to an enzyme with peroxidase activity isolated from artichoke (Cynara scolymus, L.), to a process for its isolation and purification and its applications.
  • Peroxidases (EC 1.11.1.7) are oxidoreductases that are widely distributed throughout the phylogenetic scale and catalyze the oxidation of a large number of organic and inorganic substrates, using the oxidizing power of hydrogen peroxide. In addition to their academic and physiological interest, these enzymes are widely used in clinical laboratories and in the industry. Among them, extracted from horseradish root (HRP) is the most used.
  • HRP horseradish root
  • Peroxidase is widely used in clinical biochemistry. Thus, tests for the determination and quantification of metabolites such as glucose, uric acid, cholesterol or triglycerides in biological fluids use peroxidase as a coupled enzyme. It is also used in tests for viruses as well known as the human immunodeficiency virus (HIV) that causes AIDS or herpesvirus. Peroxidases are also used as biocatalysts for the generation of products of biotechnological and industrial interest such as phenolic resins, adhesives, antioxidants, antistatic and magnetic radiation protectors, food colors and bioactive detergent components.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • peroxidases can replace some chemical reagents and catalysts used today in certain types of industries. As an example, some peroxidases can replace chlorine in the process of bleaching paper during its recycling (US patent US 5,370,770) and also formaldehyde (mutagenic and carcinogenic) used in the manufacture of phenolic resins (US patent US 5,112 .752).
  • Another application of peroxidases in this section is its use for the treatment of liquid waste or soil contaminated with phenols, aromatic amines, chlorinated compounds and / or heavy metals (US Patent US 5,178,762).
  • the invention generally faces the problem of providing new sources of peroxidase.
  • Example 1 describes the isolation and purification of an enzyme from artichoke bracts presenting peroxidase activity [see Example 3.2].
  • said artichoke stems, leaves and bracts come from wastes from the artichoke canning industry, which causes a large amount of waste.
  • 70% by weight of the artichoke flower corresponds to wastes not intended for human consumption.
  • these are useful for animal feed and are intended for the production of silage forages.
  • the invention provides, in this case, a recovery of said waste. Therefore, an object of this invention is an enzyme with isolated artichoke peroxidase activity.
  • a further object of this invention is a process for the isolation of said enzyme with peroxidase activity from artichokes.
  • Another additional object of this invention is a process for the purification of said enzyme with peroxidase activity.
  • Another additional object of this invention is the use of said enzyme with peroxidase activity in the oxidation of reducing substrates, in Biomedicine and research, in industrial processes, in the elaboration of biosensors and in environmental applications.
  • FIGURES Figure 1 shows the absorption spectrum of an enzyme with purified artichoke peroxidase activity isolated by a method provided by this invention.
  • Figure 2 is a graph showing the relationship between the pH of the reaction and the relative activity of an enzyme with peroxidase activity isolated from purified artichoke by a method provided by this invention.
  • Figure 3 is a graph showing the relationship between the reaction temperature and the relative activity of an enzyme with purified artichoke peroxidase activity isolated by a method provided by this invention.
  • Figure 4 is a graph showing the stability of an enzyme with isolated peroxidase activity of purified artichoke by a method provided by this invention, with respect to time, at the optimum temperature.
  • FIG. 5 is a schematic of the applications of an enzyme with isolated artichoke peroxidase activity provided by this invention [POD: peroxidase].
  • the invention provides an enzyme with isolated artichoke peroxidase activity (Cynaxa scolymus, L.), sometimes referred to in this description as "enzyme of the invention".
  • Said enzyme can be isolated from artichoke stems, leaves and bracts by a procedure that will be described later and, if desired, partially or homogeneously purified.
  • Fractions containing the partially purified enzyme of the invention can be used in multiple clinical and diagnostic tests, as well as in industrial and biotechnological processes and in environmental applications, while fractions containing a more purified enzyme of the invention can be used to more specialized techniques and basic research.
  • said enzyme of the invention is an enzyme isolated from artichoke bracts, purified to homogeneity, which corresponds to the majority isoenzyme present in artichoke bracts.
  • Said isoenzyme has been characterized by the tests described in Example 3.
  • said enzyme is a glycosylated enzyme that, although it has peroxidase activity, is not an ascorbate peroxidase, has specificity for reducing substrates.
  • said enzyme has an activity greater than 40% between pH 3.5 and 7 approximately, and an optimum pH at approximately 4.5 (see Figure 2). Likewise, it has been observed that said enzyme has a relative activity greater than 40% between approximately 40 ° C and 85 ° C, an optimum temperature at approximately 70 ° C (see Figure 3) and is stable at the optimum temperature throughout of time (see Figure 4).
  • Said enzyme has shown its ability to oxidize numerous reducing substrates using the oxidizing power of hydrogen peroxide, according to the definition of peroxidases (EC
  • the enzyme of the invention can be obtained from alcahofa tissues, in particular stems, leaves and artichoke bracts, by a process comprising the steps of extracting said enzyme with peroxidase activity from said alcahofa tissues, the separation of said enzyme from other enzymes with oxidase activity possibly present in the plant material, and, optionally, the partial or homogeneity purification of said enzyme with peroxidase activity, which will be described in detail below.
  • said artichoke stems, leaves and bracts are part of the artichoke waste generated by the canning industry, whereby the procedure provided by this invention involves extraction and purification. of a product of great interest (enzyme with peroxidase activity) from an industrial waste that constitutes a new and economical source of enzyme with peroxidase activity.
  • the solid residue obtained after the extraction of said enzyme with peroxidase activity can be used as a fiber-enriched material for animal and / or human consumption, or as a source for obtaining other bioproducts with sanitary, agri-food or industrial applications.
  • Artichoke plant material including leaf, stem and the external part of the flower (bracts) is subjected to crushing and homogenization in an aqueous medium consisting of water or an aqueous saline solution, optionally buffered in a pH range between 3, 0 and 10. Additionally and optionally, said aqueous medium may contain one or more additives selected from antioxidants, phenolic sequestrants, cation chelating agents, phase distribution polymers, organic solvents and / or inhibitors or protease inactivators that may be present. in artichoke tissues. The whole process can be carried out in a temperature range between 4 and 30 ° C.
  • said aqueous medium containing antioxidants e.g., ascorbic acid, and / or sequestrants phenols, for example polyvinylpyrrolidone soluble or activated carbon, and / or chelating agents cations, for example, ethylenediamine -tetraacetic disodium salt 2 -hydrate (EDTA), phase-sharing polymers such as polyethylene glycol (PEG), dextrans, organic solvents and / or inhibitors or inactivators of proteases such as 4- (2-aminoethylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF), bestatin, leupeptin, trans epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64), 1, 10-phenanthroline, pepstatin A, benzamidine and / or phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
  • antioxidants e.g., ascorbic acid, and / or
  • the soluble part is separated from the solid residue by means of any conventional solid-liquid separation technique, for example, by centrifugation, to obtain a first soluble fraction (containing peroxidase activity) and a first solid residue (containing retained some peroxidase activity).
  • Said first solid residue is subjected to one or more (generally two) additional washing cycles, homogenization in the previously mentioned aqueous medium and solid-liquid separation to obtain a second solid residue, which is removed, and second soluble fractions (containing peroxidase activity).
  • Said second soluble fractions are mixed with said first soluble fraction, constituting the crude extract.
  • the fraction of enzyme with peroxidase activity bound to cell membranes constitutes only 10% of the total activity and can be obtained by assisted extraction with detergents, including non-ionic detergents such as Triton X-100 or Triton X-114).
  • said crude extract comprising said first soluble fraction, optionally mixed with said second soluble fractions, is subjected to a washing, desalting and lyophilization process.
  • PPO polyphenol oxidase
  • the PPO precipitates at a low concentration of ammonium sulfate, while the enzyme with peroxidase activity is more stable in that salt at the low saturation concentrations with ammonium sulfate necessary to precipitate the PPO and precipitates at higher concentrations of saturation with ammonium sulfate, a Once the PPO has been separated.
  • the crude extract obtained in the extraction stage is subjected to fractionation with ammonium sulfate by saturation, firstly, between 25% and 35%, preferably with 30%, thereby precipitating a fraction containing all or most of the the PPO.
  • the separated soluble fraction which contains peroxidase activity, is brought to saturation with ammonium sulfate between 60% and 80%, preferably at 70%, obtaining a precipitate that, washed and dialyzed, has peroxidase activity and comprises a mixture of isoenzymes with peroxidase activity. It contains more than 80% of the initial units and is free of PPO.
  • the extract obtained can be subjected to a purification process to obtain the enzyme with partially purified peroxidase activity or homogeneity, or said extract can be dried or lyophilized and maintained as a source of enzyme with peroxidase activity for tests that do not require the use of said Enzyme with high purity. If desired, the extract containing peroxidase activity can be washed, desalted and lyophilized.
  • the enzyme of the invention in particular the isoenzyme with major peroxidase activity present in artichoke stems, leaves and bracts can be purified using any conventional protein purification technique, such as dialysis, ultrafiltration, chromatography, etc.
  • said Isoenzyme can be partially purified by chromatographic techniques, with fixed or expanded bed, for example, hydrophobic chromatography (Phenyl Shepharose, Butyl Sepharose, Octyl Sepharose, Phenyl Superóse, Alkyl Superóse), affinity chromatography (Concanavalin A-Sepharose), filtration chromatography gel (Sephadex G-75, G-100, G-200 Sephacryl S-100 HR, S-200 HR, S-300 HR; Superdex 200; Exceeded 12), ion exchange chromatography (DEAE-Cellulose; DEAE-Sepharose ; Mono S; Mono Q; Source S; Source Q; CM-Sepharose) or cast
  • said isoenzyme can be purified homogeneously from the extract obtained in the fractionation step by a combination of said protein purification techniques, in particular chromatographic techniques (see Examples 1.3 and 2).
  • said isoenzyme is a glycoprotein and has a cationic character, to purify it homogeneity, the cation exchange chromatography is performed at a pH between 4.0 and 6.0, preferably at pH 5.0.
  • all the fractions or extracts with peroxidase activity obtained at any stage of the process for obtaining the enzyme of the invention can be subjected to a washing, desalting and lyophilization process.
  • the enzyme of the invention can be subjected to immobilization by means of different methods such as bonding to solid supports, entrapment in gels, encapsulation in vesicles, crosslinking between enzyme molecules and confinement in membrane bioreactors.
  • the glycoprotein character of the enzyme of the invention facilitates its anchoring to multiple commercial polymers used as immobilization supports, such as magnetite or concanavalin-A. This fact represents an advantage over other non-glycosylated peroxidases at the time of their biotechnological application.
  • the bioreactor could be coupled to filtration systems, affinity, hydrophobic interaction, ion exchange, chelation or distribution.
  • the enzyme of the invention has a structure and activity similar to horseradish root peroxidase, and can be used in any proprietary application " of enzymes with peroxidase activity as shown in the scheme shown in Figure 5.
  • a general application of the enzyme of the invention is its use in the oxidation of reducing substrates.
  • the enzyme of the invention can be used, in a soluble or immobilized manner, in Biomedicine, for example, in clinical biochemistry, cytochemistry, immunochemistry and research, as a clinical or diagnostic reagent, for example, in assays for the determination and quantification of metabolites. as glucose, uric acid, cholesterol or triglycerides in biological fluids, and as a marker enzyme in immunoassays, for example, for virus detection.
  • the enzyme of the invention can also be used in industrial applications, for example, as biocatalysts for obtaining products of biotechnological and industrial interest, for example, phenolic resins, adhesives, antioxidants, antistatic and magnetic radiation protectors, food colors and bioactive components. of detergents
  • the enzyme of the invention can also be used in environmental applications, for example, in the bleaching of paper during its recycling and in the treatment of liquid residues or soils contaminated with phenols, aromatic amines, chlorinated compounds and / or heavy metals.
  • the enzyme of the invention can also be used in the preparation of biosensors for the detection of, for example, peroxides, monophenols, diphenols and polyphenols.
  • the invention insofar as it can valorise a waste from the canning industry, is also of interest to the Agricultural Cooperatives and to the artichoke processing industry since it implies a commercial exit of a little used industrial waste.
  • Example 1 describe the isolation and purification to homogeneity of an isoenzyme with major peroxidase activity in artichoke bracts, while in Example 3 said isoenzyme is characterized.
  • the soluble part was separated from the solid residue by centrifugation (9,000 rpm for 30 minutes).
  • the solid residue was subjected to two more cycles of washing, homogenization and centrifugation in the previous solutions. The supernatants of these fractions were combined constituting the crude extract.
  • the crude extract obtained in the previous step (Example 1.1) was brought to 30% saturation with ammonium sulfate. After 1 hour under stirring at 4 ° C, the extract was centrifuged at 35,000 rpm for 30 minutes and the precipitate, lacking peroxidase activity, was discarded. The supernatant was brought to 70% saturation with ammonium sulfate and left for 1 hour under stirring at 4 ° C. After centrifuging at 35,000 rpm for 30 minutes the precipitate was saved as a source of enzyme with peroxidase activity. This precipitate was dissolved in 20 mM acetate buffer pH 4.5 containing 1 M sodium chloride. The resulting solution was dialyzed against the same buffer, but without sodium chloride, at 4 ° C overnight. This extract consists of a mixture of isozymes with peroxidase activity that contains 80% of the initial units.
  • This column was obtained from Pharmacia LKB, coupled to an FPLC system (KTA Explorer 100 from Pharmacia) and equilibrated with 20 M acetate buffer pE 5.0. After applying the sample at a rate of 2 ml / mm, a linear gradient from 0 to
  • the enzyme with isolated artichoke peroxidase activity catalyzes the oxidation of various compounds in the presence of hydrogen peroxide.
  • the activity of this peroxidase can be determined by the method described below, in which 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS), for example, is the reducing substrate .
  • ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid)
  • the enzyme provided by this invention is capable of oxidizing guaiacol at high speed but showed no activity against ascorbic acid, which demonstrates that the majority isoenzyme in artichoke bracts is not an ascorbate peroxidase.
  • reducing substrates such as ABTS, phenol, pyrogalol, catechol, 4- methylcatechol, 4-tert-butylcatechol, 4-hydroxyanisole, p-cresol, p-chloro-phenol or 4-amino-antipyrine , so it can be used as a coupled enzyme in metabolite determination assays that include any of these reducing substrates.
  • the tests were performed following the protocol described in Example 3.2 but using in each case the reducing substrate to be tested.
  • Samples were prepared by adding 0.1 ml of the enzyme solution to 1.8 ml of distilled water previously heated at temperatures between 10 ° C and 90 ° C. At each temperature and every 5 minutes, 0.05 ml aliquots were removed 39 of the enzyme solution that were used in enzyme activity assays following the procedure described in Example 3.2.
  • Figure 4 shows the stability of this enzyme at its optimum temperature.
  • the enzyme with peroxidase activity is a basic or cationic isoenzyme with a pl> 9.5. In addition, it is glycosylated as evidenced by its specific binding to concanavalin-A. Thus, when 800 U of said enzyme were incubated 1 hour with 1 ml of Shepharose bound to concanavalin-A at 4 ° C, 99.9% of the activity was retained by this support. Therefore, this specific binding can be used as an alternative purification step.

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Abstract

La enzima con actividad peroxidasa aislada a partir de la alcochofa (cynara scolymus, L.) es una proteína glicosilada que puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende la extracción de dicha enzima con actividad peroxidasa a partir de tejidos de alcochofa, la separación de dicha enzima de otras enzimas con actividad oxidasa eventualmente presentes en el material vegetal, y, opcionalmente, la purificación parcial o a homogeneidad de dicha enzima con actividad peroxidasa. Esta enzima puede utilizarse en la oxidación de sustratos reductores, como reactivo cl'inico o de diagnóstico, como enzima marcadora en inmunoensayos, para la elaboración de biosensores, como biocatalizador para la obtención de productos de interés biotecnológico e industrial y en aplicaciones medioambientales.

Description

ENZIMA CON ACTIVIDAD PEROXIDASA AISLADA DE LA ALCACHOFA (Cynara scolymus, L.), PROCEDIMIENTO PARA SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN Y APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a una enzima con actividad peroxidasa aislada de la alcachofa ( Cynara scolymus, L.), a un procedimiento para su aislamiento y purificación y a sus aplicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las peroxidasas (EC 1.11.1.7) son óxidorreductasas que se encuentran ampliamente distribuidas en toda la escala filogenética y que catalizan la oxidación de un amplio número de sustratos orgánicos e inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno. Además de su interés académico y fisiológico, estas enzimas son ampliamente utilizadas en laboratorios clínicos y en la industria. De entre ellas la extraída de la raíz del rábano picante (HRP) es la más usada.
La peroxidasa es utilizada ampliamente en bioquímica clínica. Así, los ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos como glucosa, ácido úrico, colesterol o triglicéridos en fluidos biológicos usan peroxidasa como enzima acoplada. También se utiliza en in unoensayos para la detección de virus tan conocidos como el virus de la imunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o herpesvirus . Las peroxidasas también se utilizan como biocatalizadores para la generación de productos de interés biotecnológico e industrial como resinas fenólicas, adhesivos, antioxidantes, antiestáticos y protectores de radiación magnética, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes . Otra propiedad de las peroxidasas ha hecho que la Comisión Científica de la Unión Europea las defina como una de las proteínas con mayor interés biotecnológico para el siglo XXI, y consiste en su aplicación para conservar el medio ambiente. En esta línea las peroxidasas pueden sustituir a algunos reactivos y catalizadores químicos usados hoy en día en cierto tipo de industrias. A modo de ejemplo, algunas peroxidasas pueden sustituir al cloro en el proceso de blanqueamiento del papel durante su reciclaje (patente norteamericana US 5.370.770) y también al formaldehído (mutagénico y cancerígeno) utilizado en la fabricación de resinas fenólicas (patente norteamericana US 5.112.752) . Otra aplicación de las peroxidasas en este apartado, es su uso para el tratamiento de residuos líquidos o suelos contaminados con fenoles, aminas aromáticas, compuestos clorados y/o metales pesados (patente norteamericana US 5.178.762).
El gran interés industrial de esta enzima ha dado lugar a la búsqueda de nuevas fuentes de peroxídasa que catalicen con mayor eficacia un determinado proceso y que sean más resistentes a la inactivación. Así, se ha patentado el aislamiento y empleo de una peroxidasa de soja para la formación de resinas fenólicas (patente norteamericana US 5.491.085). Esta enzima tiene una alta resistencia a la temperatura lo que permite una gran eficacia en este proceso, siendo un sustituto del formaldehído. Nuevas peroxidasas han sido también aisladas del microorganismo Coprlnus clnereus (patente norteamericana US 5.116.751).
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta, en general, con el problema de proporcionar nuevas fuentes de peroxidasa.
La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han identificado una enzima con actividad peroxidasa en alcachofa, en particular, en tallos, hojas y brácteas de alcachofa. En el Ejemplo 1 se describe el aislamiento y purificación de una enzima a partir de las brácteas de alcachofa que presenta actividad peroxidasa [véase el Ejemplo 3.2].
En una realización particular, dichos tallos, hojas y brácteas de alcachofa proceden de los desechos de la industria conservera de alcachofas, la cual origina una gran cantidad de desechos. Por ejemplo, el 70% en peso de la flor de la alcachofa corresponde a desechos no destinados al consumo humano. Sin embargo, éstos son útiles para la alimentación animal y están destinados a la elaboración de forrajes ensilados. La invención proporciona, en este caso, una valorización de dicho desecho. Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa.
Un objeto adicional de esta invención lo constituye un procedimiento para el aislamiento de dicha enzima con actividad peroxidasa a partir de alcachofas . Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un procedimiento para la purificación de dicha enzima con actividad peroxidasa .
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dicha enzima con actividad peroxidasa en la oxidación de sustratos reductores, en Biomedicina e investigación, en procesos industriales, en la elaboración de biosensores y en aplicaciones medioambientales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el espectro de absorción de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa purificada mediante un procedimiento proporcionado por esta invención.
La Figura 2 es una gráfica que muestra la relación entre el pH de la reacción y la actividad relativa de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa purificada mediante un procedimiento proporcionado por esta invención.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la relación entre la temperatura de la reacción y la actividad relativa de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa purificada mediante un procedimiento proporcionado por esta invención. La Figura 4 es una gráfica que muestra la estabilidad de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa purificada mediante un procedimiento proporcionado por esta invención, respecto al tiempo, a la temperatura óptima.
La Figura 5 es un esquema de las aplicaciones de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa proporcionada por esta invención [POD: peroxidasa] .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa ( Cynaxa scolymus, L . ) , en ocasiones denominada en esta descripción "enzima de la invención" . Dicha enzima puede ser aislada a partir de tallos, hojas y brácteas de alcachofa mediante un procedimiento que se describirá más adelante y, sí se desea, purificada parcialmente o a homogeneidad. Se pueden utilizar fracciones conteniendo la enzima de la invención parcialmente purificada en múltiples ensayos clínicos y de diagnóstico, así como en procesos industriales y biotecnológicos y en aplicaciones medio-ambientales, mientras que las fracciones conteniendo una enzima de la invención más purificada se pueden utilizar para técnicas más especializadas e investigación básica.
En una realización particular, dicha enzima de la invención es una enzima aislada a partir de brácteas de alcachofa, purificada a homogeneidad, que corresponde a la isoenzima mayoritaria presente en la brácteas de alcachofa. Dicha isoenzima ha sido caracterizada mediante los ensayos descritos en el Ejemplo 3. Como puede apreciarse, dicha enzima es una enzima glicosilada que, aunque tiene actividad peroxidasa, no es una ascorbato peroxidasa, tiene especificidad por sustratos reductores. Además, se ha observado que tiene un peso molecular de aproximadamente 42.000 dalton, determinado por electroforesis, y un punto isoeléctrico (pl) mayor de 9,5 aproximadamente. También se ha encontχ-ado que dicha enzima tiene una actividad superior al 40% entre pH 3,5 y 7 aproximadamente, y un pH óptimo a 4,5 aproximadamente (véase la Figura 2) . Asimismo, se ha observado que dicha enzima tiene una actividad relativa superior al 40% entre 40°C y 85°C aproximadamente, una temperatura óptima a aproximadamente 70°C (véase la Figura 3) y es estable a la temperatura óptima a lo largo del tiempo (véase la Figura 4) .
Dicha enzima ha mostrado su capacidad para oxidar numerosos sustratos reductores utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno, de acuerdo con la definición de las peroxidasas (EC
1.11.1.7) .
La enzima de la invención puede obtenerse a partir de tejidos de alcahofa, en particular, tallos, hojas y brácteas de alcachofa, mediante un procedimiento que comprende las etapas de extracción de dicha enzima con actividad peroxidasa a partir de dichos tejidos de alcahofa, la separación de dicha enzima de otras enzimas con actividad oxidasa eventualmente presentes en el material vegetal, y, opcional ente, la purificación parcial o a homogeneidad de dicha enzima con actividad peroxidasa, que se describirán detalladamente más adelante.
En una realización particular del procedimiento de obtención de la enzima de la invención, dichos tallos, hojas y brácteas de alcachofa forman parte de los desechos de alcachofa generados por la industria conservera, por lo que el procedimiento proporcionado por esta invención supone la extracción y purificación de un producto de gran interés (enzima con actividad peroxidasa) a partir de un desecho industrial que constituye una fuente nueva y económica de enzima con actividad peroxidasa. Además, el residuo sólido obtenido tras la extracción de dicha enzima con actividad peroxidasa se puede utilizar como material enriquecido en fibra para el consumo animal y/o humano, o bien como fuente para la obtención de otros bioproductos con aplicaciones sanitarias, agroalimentarias o industriales. 1. EXTRACCIÓN
Material vegetal de alcachofa, incluyendo hoja, tallo y la parte externa de la flor (brácteas) se somete a trituración y homogeneización en un medio acuoso constituido por agua o por una disolución acuosa salina, opcionalmente tamponado en un intervalo de pH comprendido entre 3,0 y 10. Adicional y opcionalmente, dicho medio acuoso puede contener uno o más aditivos seleccionados entre antioxidantes, secuestradores de fenoles, agentes quelantes de cationes, polímeros para reparto de fases, disolventes orgánicos y/o inhibidores o inactívadores de proteasas que pudieran estar presentes en los tejidos de alcachofa. El conjunto del proceso puede realizarse en un intervalo de temperatura comprendido entre 4 y 30°C. En una realización particular, a 4QC, dicho medio acuoso contiene antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico, y/o secuestradores de fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidona soluble o carbón activo, y/o agentes quelantes de cationes, por ejemplo, ácido etilendiamino-tetraacético sal disódica 2 -hidrato (EDTA) , polímeros para reparto de fases como polietilénglicol (PEG) , dextranos, disolventes orgánicos y/o inhibidores o inactivadores de proteasas como 4- (2-aminoetilbencenosulfonil fluoruro (AEBSF) , bestatina, leupeptina, trans~epoxisuccinil-L- leucilamido (4 -guanidino) butano (E-64) , 1 , 10-fenantrolina, pepstatina A, benzamidina y/o fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) .
Tras la homogeneización, la parte soluble se separa del residuo sólido por medio de cualquier técnica convencional de separación sólido-líquido, por ejemplo, por centrifugación, para obtener una primera fracción soluble (que contiene actividad peroxidasa) y un primer residuo sólido (que contiene retenido algo de actividad peroxidasa) . Dicho primer residuo sólido se somete a uno o más (generalmente dos) ciclos adicionales de lavado, homogeneización en el medio acuoso previamente mencionado y separación sólido-líquido para obtener un segundo residuo sólido, que se retira, y unas segundas fracciones solubles (que contienen actividad peroxidasa) . Dichas segundas fracciones solubles, sí se desea, se mezclan con dicha primera fracción soluble, constituyendo el extracto crudo. Después de este proceso más del 90% de las unidades de enzima con actividad peroxidasa se encuentra en la fracción soluble o extracto crudo (la fracción de enzima con actividad peroxidasa unida a membranas celulares constituye sólo un 10% de la actividad total y puede ser obtenida por extracción asistida con detergentes, entre ellos los detergentes no iónicos como Tritón X-100 o Tritón X-114) . Si se desea, dicho extracto crυdo, que comprende dicha primera fracción soluble, opcionalmente mezclada con dichas segundas fracciones solubles, se somete a un proceso de lavado, desalado y liofilización.
Por otra parte, mediante un simple lavado con agua de dicho segundo residuo sólido se obtiene un material rico en fibra y libre de biomoléculas solubles tales como carbohidratos, grasas, fenoles y proteínas, que puede ser utilizado para la fabricación de piensos compuestos para animales, como fuente de fibra en la alimentación humana o como fuente para la obtención de otros bioproductos con aplicaciones sanitarias, agroalimentarias o industriales. Adicionalmente, si se desea, dicho segundo residuo sólido lavado con agua puede ser desecado.
2. FRACCIONAMIENTO
En las plantas existen, además de enzimas con activídd peroxidasa, otras enzimas con actividad oxidasa que interfieren con la peroxidasa cuando ésta se pretende usar como reactivo de análisis. Una de dichas enzimas con actividad oxidasa es la polifenol oxidasa, en adelante PPO, que se encuentra ampliamente distribuida en el reino vegetal y, en concreto, en la alcachofa, donde existe una gran concentración de dicha enzima. Pox- tanto, la separación de PPO y enzimas con actividad peroxidasa es importante para producir fracciones útiles de estas últimas enzimas. El método propuesto en esta invención facilita la separación de dichas enzimas mediante fraccionamiento con sulfato amónico. La PPO precipita a baja concentración de sulfato amónico, mientras que la enzima con actividad peroxidasa es más estable en esa sal a las bajas concentraciones de saturación con sulfato amónico necesarias para precipitar la PPO y precipita a concentraciones más altas de saturación con sulfato amónico, una vez que se ha separado la PPO.
El extracto crudo obtenido en la etapa de extracción se somete a fraccionamiento con sulfato amónico por saturación, en primer lugar, entre 25% y 35%, preferentemente con 30%, con lo que precipita una fracción que contiene la totalidad o la mayor parte de la PPO. La fracción soluble separada, que contiene actividad peroxidasa, se lleva a saturación con sulfato amónico entre 60% y 80%, preferentemente a 70%, obteniéndose un precipitado que, lavado y dializado, tiene actividad peroxidasa y comprende una mezcla de isoenzimas con actividad peroxidasa que contiene más del 80% de las unidades iniciales y está libre de PPO. El extracto obtenido se puede someter a un proceso de purificación para obtener la enzima con actividad peroxidasa purificada parcialmente o a homogeneidad, o bien dicho extracto se puede desecar o liofilizar y mantenerlo como fuente de enzima con actividad peroxidasa para ensayos que no requieran el empleo de dicha enzima con elevada pureza. Si se desea, el extracto conteniendo la actividad peroxídasa se puede lavar, desalar y liofilizar.
3. PURIFICACIÓN
La enzima de la invención, en particular la isoenzima con actividad peroxidasa mayoritaria presente en los tallos, hojas y brácteas de alcachofa se puede purificar usando cualquier técnica convencional de purificación de proteínas, tales como diálisis, ultrafiltración, cromatografía, etc. En particular, dicha isoenzima se puede purificar parcialmente mediante técnicas cromatográficas , con lecho fijo o expandido, por ejemplo, cromatografía hidrofóbica (Phenyl Shepharose, Butyl Sepharose, Octyl Sepharose, Phenyl Superóse, Alkyl Superóse) , cromatografía de afinidad (Concanavalina A-Sepharose) , cromatografía de filtración en gel (Sephadex G- 75, G-100, G-200 Sephacryl S-100 HR, S-200 HR, S-300 HR; Superdex 200; Superóse 12) , cromatografí de intercambio iónico (DEAE-Celulosa; DEAE-Sepharose; Mono S; Mono Q; Source S; Source Q; CM-Sepharose) o cromatografía de reparto (Source RPC, Resource RPC) . Adicionalmente, dicha isoenzima se puede purificar a homogeneidad a partir del extracto obtenido en la etapa de fraccionamiento mediante una combinación de dichas técnicas de purificación de proteínas, en particular de las técnicas cromatográficas (véanse los Ejemplos 1.3 y 2). En una realización particular, como dicha isoenzima es una glicoproteína y tiene carácter catiónico, para purificarla a homogeneidad, la cromatografía de intercambio catiónico se realiza a un pH comprendido entre 4,0 y 6,0, preferentemente a pH 5,0.
En general, todas las fracciones o extractos con actividad peroxidasa obtenidos en cualquier etapa del procedimiento de obtención de la enzima de la invención pueden ser sometidas a un proceso de lavado, desalado y liofilización.
La enzima de la invención puede ser sometida a inmovilización mediante distintos procedimientos como el enlace a soportes sólidos, el atrapamiento en geles, la encapsulación en vesículas, el entrecruzamiento entre moléculas de enzima y el confinamiento en biorreactores de membranas. El carácter glicoproteico de la enzima de la invención facilita su anclaje a múltiples polímeros comerciales usados como soportes de inmovilización, como por ejemplo la magnetita o la concanavalina-A. Este hecho supone una ventaja respecto a otras peroxidasas no glicosiladas a la hora de su aplicación biotecnológica . En todo caso, el biorreactor podría estar acoplado a sistemas de filtración, afinidad, interacción hidrofóbica, intex-cambio iónico, quelatación o reparto. La enzima de la invención tiene una estructura y actividad similar a la peroxidasa de la raíz del rábano picante, y puede utilizarse en cualquier aplicación propia "de las enzimas con actividad peroxidasa tal como se recoge en el esquema mostrado en la Figura 5. Así, una aplicación general de la enzima de la invención es su empleo en la oxidación de sustratos reductores .
La enzima de la invención puede utilizarse, de manera soluble o inmovilizada, en Biomedicina, por ejemplo, en bioquímica clínica, citoquímica, inmunoquímica e investigación, como reactivo clínico o de diagnóstico, por ejemplo, en ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos tales como glucosa, ácido úrico, colesterol o triglicéridos en fluidos biológicos, y como enzima marcadora en inmunoensayos, por ejemplo, para la detección de virus . La enzima de la invención también puede utilizarse en aplicaciones industriales, por ejemplo, como biocatalizadores para la obtención de productos de interés biotecnológico e industrial, por ejemplo, resinas fenólicas, adhesivos, antioxidantes, antiestáticos y protectores de radiación magnética, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes.
La enzima de la invención también puede utilizarse en aplicaciones medioambientales, por ejemplo, en el blanqueamiento del papel durante su reciclaje y en el tratamiento de residuos líquidos o suelos contaminados con fenoles, aminas aromáticas, compuestos clorados y/o metales pesados .
La enzima de la invención también puede utilizarse en la elaboración de biosensores para la detección de, por ejemplo, peróxidos, monofenoles, difenoles y polifenoles .
La invención, en la medida en que puede valorizar un desecho de la industria conservera, tiene interés, además, para las Cooperativas Agrarias y para la industria de transformación de la alcachofa ya que supone una salida comercial de un residuo industrial poco utilizado.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma. En los Ejemplos 1 y 2 se describe el aislamiento y purificación a homogeneidad de una isoenzima con actividad peroxidasa mayoritaria en las brácteas de alcachofa, mientras que en el Ejemplo 3 se caracteriza dicha isoenzima.
EJEMPLO 1
Obtención de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcahofa
1.1 Extracción
150 gramos de brácteas de alcachofa se congelaron en nitrógeno líquido para favorecer la trituración y homogeneización de este material rico en fibra. La homogeneizacíón se realizó en tampón acetato 50 mM pH 4,5 conteniendo ácido ascórbico 30 M, cloruro sódico 1 M, 1% (p/v) de polivinilpirrolidona soluble y ácido etilendiaminotetra-acético sal disódica 2 -hidrato (EDTA) 10 M. El tampón de extracción contenía los siguientes inhibidores de proteasas: pepstatina A (0,005 mM) , 1, 10-fenantrolina (1 mM) , PMSF (0,1 M) y benzamidina (l mM) . Después de homogeneizar, la parte soluble se separó del residuo sólido por centrifugación (9.000 r.p.m. durante 30 minutos) . El residuo sólido se sometió a dos ciclos más de lavado, homogeneización y centrifugación en las disoluciones anteriores. Los sobrenadantes de estas fracciones se juntaron constituyendo el extracto crudo.
1.2 Fraccionamiento
El extracto crudo obtenido en la etapa anterior (Ejemplo 1.1) se llevó al 30% de saturación con sulfato amónico. Después de 1 hora en agitación a 4°C, el extracto se centrifugó a 35.000 r.p.m. durante 30 minutos y el precipitado, carente de actividad peroxidasa, fue desechado. El sobrenadante se llevó al 70% de saturación con sulfato amónico y se dejó 1 hora en agitación a 4°C. Después de centrifugar a 35.000 r.p.m. durante 30 minutos el precipitado se guardó como fuente de enzima con actividad peroxidasa. Este precipitado se disolvió en tampón acetato 20 mM pH 4,5 conteniendo cloruro sódico 1 M. La disolución resultante se dializó frente al mismo tampón, pero sin cloruro sódico, a 4°C durante toda la noche. Este extracto consiste en una mezcla de ísoenzimas con actividad peroxidasa que contiene el 80% de las unidades iniciales .
1.3 Purificación a homogeneidad A partir del extracto obtenido en la etapa anterior (Ejemplo 1.2) se aisló una enzima con actividad peroxidasa, con un elevado grado de pureza, mediante un protocolo que comprende las siguientes etapas:
1.3.1 Etapa 1 Cromatografía hidrofóbica en Phenyl-Shepharose CL-4B Esta resina cromatográfica fue obtenida de Pharmacia LKB, y equilibrada con tampón fosfato 50 M pH 7,0 conteniendo sulfato amónico 1,5 M. Las disoluciones ricas en peroxidasa obtenidas en la etapa anterior se dializaron toda la noche frente a 2 litros de este mismo tampón. Aproximadamente 1 mi de resina fue usada por cada 3 mg de proteína. Después de aplicar la muestra a una velocidad de 2 ml/minuto, la colunma hídrofóbica se eluyó a la misma velocidad con un gradiente por etapas de sulfato amónico de 1,5 M y 0,4 M en tampón fosfato 50 mM pH 7,0, seguido por agua y 50% de polietilenglicol . Se recogieron fracciones de 7 mi y se ensayaron frente a su actividad peroxidasa y concentración de proteínas. Las fracciones mayoritarias conteniendo actividad peroxidasa eluyeron con el sulfato amónico 0,4 M, se juntaron y se concentraron en una membrana de icrofíltración con un diámetro de poro de 10.000 daltones. Posteriormente, esta disolución se dializó durante toda la noche a 4CC frente a 2 litros de tampón acetato 20 mM pE 5,0.
1.3.2 Etapa 2 Cromatografía de filtración en gel Sephacryl S--300 Esta columna fue obtenida de Pharmacia LKB, acoplada a un sistema de FPLC (ÁKTA Eaqplαrer 100 de Pharmacia) y equilibrada con tampσn acetato 20 mM pH 5,0. Se aplicaron 2 mi de la muestra a una velocidad de 1 mi/minuto y se recogieron fracciones de 5 mi que se ensayaron f ente a su actividad perαxidas . Las f acciones mayoritarias con actividad peroxidasa fluyeran en un pico camσrendido entre 38.000 y 46.000 daltanes de peso molecular. Estas fracciones fueron unidas y usadas para la siguiente etapa de purificación .
1.3.3 Etapa 3
Cramatpgra.fia de intercambio catiónico Resource S
Esta columna fue obtenida de Pharmacia LKB, acoplada a un sistema de FPLC (KTA Explorer 100 de Pharmacia) y equilibrada con tampón acetato 20 M pE 5,0. Después de aplicar la muestra a una velocidad de 2 ml/mmuto se aplicó un gradiente lineal desde 0 hasta
0,3 de clorure sódico en el mismo tampón y se recogieran fracciones de 0 , 5 mi . "Qn solo pico de actividad perαsddasa eluyó a
0 , 14 M de cloruro sódico . La elución de esta perαxidasa se detectó par el incremento de absarbancia a 404 n (absorbencia debida al grupo hemo) y su act-ividad se determinó usando ABTS como sustrato .
Las fracciones que mostraban actividad perexidasa se unieron, se desalaron y se liαfilizarαn. El espectro de absorción de esta enzima con actividad percαcidasa se muestra en la Figura 1.
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1, donde se aprecia el alto rendimiento proporcionado por el método de aislamiento y purificación propuesto por esta invención. Además, se observa que partiendo de una pequeña cantidad de material vegetai (150 gramos) se pueden obtener hasta 0,5 mg de una enzima pura a homogeneidad y can elevada actividad específica. Extrapolando estos datos a gran escala supondría la obtención de una gran cantidad de peroxidasa de un material desecbable y económico. Además, dependiendo del grado de pureza que se requiera, las pasos de purificación sad í n ser reducidos cor el correspondiente ahorro económico.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26 Tabla 1 Purificación de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa
O
>
CcΛ
CΛ c o o m
r
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
EJEMPLO 2
Purificación a homogeneidad de una enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa
En este ejemplo se describe otro método para obtener una enzima con actividad peroxidasa pura pero utilizando etapas cromatográficas alternativas.
2.1 Etapa 1 Cromatografía en DEAE-Celulosa Este intercambiador aniónico fue obtenido de Sig a, empaquetado en una columna y equilibrado con tampón Tris-HCl 20 mM pH 8,5. El extracto rico en peroxidasa obtenido en la fase de extracción se inyectó en dicha columna y fue eluido a una velocidad de 2 ml/minuto con un gradiente por etapas de tampón anterior libre de cloruro sódico, 0,1 M y 0,2 M de cloruro sódico en tampón Tris-HCl 20 mM pH 8,5. Se utilizó aproximadamente 1 mi de resina por cada 3 mg de proteína. Se recogieron fracciones de 7 mi y se ensayaron frente a su actividad peroxidasa y concentración de proteínas. Las fracciones mayoritarias conteniendo actividad peroxidasa fluyeron en las fracciones no unidas a la resina (tampón sin cloruro sódico) , se juntaron y se concentraron en una membrana de microfiltración con un diámetro de poro de 10.000 dalton. Posteriormente, esta disolución se dializó durante toda la noche a 4°C frente a 2 litros de tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5 conteniendo cloruro sódico 1 M y cloruro de magnesio 50 mM.
2.2 Etapa 2
Cromatografía de afinidad en Concanavalina A-Shepharose Esta columna fue obtenida de Pharmacia LKB, acoplada a un sistema de FPLC (ÁKTA Explorer 1 00 de Pharmacia) y equilibrada con tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5 conteniendo cloruro sódico 1 M y cloruro de magnesio 50 mM. Después de aplicar la muestra a una velocidad de 0,5 ml/minuto, la columna se eluyó con un gradiente lineal desde 0 hasta 0,5 M de metil-α-D-manopiranósido en el mismo tampón y se recogieron fracciones de 1 mi . La elución de esta enzima con actividad peroxidasa se detectó por el incremento de absorbancia a 404 n (absorbancia debida al grupo he o) y su actividad se determinó usando ABTS como sustrato. Las fracciones que mostraban actividad peroxidasa fueron unidas y dializadas durante toda la noche a 4°C frente a 2 litros de tampón acetato 20 mM pH 5,4.
2.3 Etapa 3 Cromatografía de intercambio catiónico Resource S
Esta etapa cromatográfica se realizó como en el Ejemplo 1.3.3 y el rendimiento fue similar al observado en la Tabla 1.
EJEMPLO 3 Caracterización de la isoenzima con actividad peroxidasa mayoritaria en brácteas de alcahofa
3.1 Pureza de las disoluciones de enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa y purificada a homogeneidad El espectro de absorción visible-UV de la isoenzima mayoritaria con actividad peroxidasa aislada de brácteas de alcachofa y purificada a homogeneidad mediante el procedimiento descrito en cualquiera de los Ejemplos 1 ó 2 se muestra en la Figura 1. En enzimas con actividad peroxidasa, el cociente entre la absorbancia alrededor de 400 nm (debida al grupo hemo) y 280 nm (debida a la proteína) se conoce como Rz y es una indicación de la pureza de la muestra de enzima con actividad peroxidasa. Así, se consideran puras aquéllas muestras de ezi as con actividad peroxidasa con un Rz comprendido entre 3,0 y 3,6. El Rz de la proteína obtenida mediante el procedimiento de purificación a homogeneidad de la presente invención (Ejemplos 1 ó 2) es de 3,4, lo que indica un alto grado de pureza.
Además, esa elevada pureza también se observó medíante técnicas de electroforesis sobre geles de poliacrilamida en condiciones no disociantes (PAGE) y disociantes en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) . De hecho, las disoluciones de enzima con actividad peroxidasa purificada mostraban una sola banda electroforética (PAGE y SDS-PAGE) con un peso molecular de aproximadamente 42.000 daltones (SDS-PAGE). Estos resultados también confirmaban la naturaleza monomérica de dicha enzima.
3.2 Actividad enzimática La enzima con actividad peroxidasa aislada de alcachofa, proporcionada por esta invención, cataliza la oxidación de varios compuestos en presencia de peróxido de hidrógeno . La actividad de esta peroxidasa puede ser determinada por el método que se describe a continuación, en el que el ácido 2,2'-azino- bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), por ejemplo, es el sustrato reductor.
En primer lugar, 0,1 mi de ABTS 10 mM, 0,1 mi de peróxido de hidrógeno 5 mM y 0,2 mi de tampón fosfato-citrato 50 mM pH 4,7 fueron llevados a un volumen final de reacción de 0,95 mi. Después de atemperar la reacción a 25°C, se añadieron 0,05 mi de la disolución enzimática y la reacción fue seguida a 414 nm en un espectrofotómetro convencional durante 5 minutos. La actividad enzí ática fue calculada considerando un coeficiente de extinción molar de 31.100 M^cπf1 para el catión radical del ABTS (producto de la reacción) . Una unidad (U) de actividad peroxídasa es la cantidad de enzima que oxida 1 micromol de ABTS por minuto. La concentración de proteína (mg/ml) fue determinada con el método de Bradford. La combinación de ambas técnicas permitió calcular los importantes valores de actividad específica (U/mg) de la enzima con actividad peroxidasa proporcionada por esta invención.
3.3 Especificidad por el sustrato reductor Una forma de distinguir entre las diferentes clases de peroxidasas es comparar- sus actividades frente a guayacol y ácido ascórbíco. La enzima proporcionada por esta invención es capaz de oxxidar guayacol a alta velocidad pero no mostró actividad frente al ácido ascórbico, lo que demuestra que la isoenzima mayoritaria en brácteas de alcachofa no es una ascorbato peroxidasa. Además, mostraba una alta velocidad de catálisis con sustratos reductores como el ABTS, fenol, pírogalol, catecol, 4- metilcatecol, 4-terc-butilcatecol, 4-hidroxianisol, p-cresol, p- cloro-fenol o 4-amino-antipirina, por lo que puede ser usada como enzima acoplada en ensayos de determinación de metabolitos que incluyan alguno de estos sustratos reductores. Los ensayos se realizaron siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 3.2 pero utilizando en cada caso el sustrato reductor a ensayar.
3.4 pH óptimo El intervalo de pH óptimo al cual esta enzima con actividad peroxidasa muestra su máxima actividad fue examinado usando el mismo medio de reacción que el utilizado en el Ejemplo 3.2 pero sustituyendo el sustrato reductor ABTS por guayacol y utilizando diferentes tampones para los diferentes intervalos de pH: tampón acetato 30 mM para pH 3,5-5,5; tampón fosfato 30 M para pH 5,5-8,0; tampón Tris-HCl 30 mM para pH 7,5-9,0; y tampón glicina 30 mM para pH 8,5-9,0. Los resultados se muestran en la Figura 2.
3.5 Temperatura óptima La actividad de esta enzima con actividad peroxidasa se midió en un intervalo de temperatura comprendido entre 10 °C y 90 °C y los resultados se muestran en la Figura 3.
3.6 Estabilidad térmica
Se prepararon unas muestras añadiendo 0,1 mi de la disolución enzimática a 1,8 mi de agua destilada previamente calentada a temperaturas comprendidas entre 10 °C y 90 °C. A cada temperatura y cada 5 minutos, se retiraron alícuotas de 0,05 mi 39 de la disolución enzimática que se utilizaron en ensayos de actividad enzimática siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 3.2. La Figura 4 muestra la estabilidad de esta enzima a su temperatura óptima.
3.7 Otras propiedades
La enzima con actividad peroxidasa es una isoenzima básica o catiónica con un pl > 9,5. Además, se encuentra glicosilada como lo pone de manifiesto su unión específica a concanavalina- A. Así, cuando 800 U de dicha enzima se incubaron 1 hora con 1 mi de Shepharose unida a concanavalina-A a 4°C, el 99,9% de la actividad fue retenida por este soporte. Por tanto, esta unión específica puede ser utilizada como una etapa alternativa de purificación.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una enzima con actividad peroxidasa caracterizada porque es obtenible a partir de alcachofa ( Cynara scolymus, L.).
2 Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque es una proteína glicosilada.
3. Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque no es una ascorbato peroxidasa.
4. Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un peso molecular de aproximadamente 42.000 dalton, determinado por electroforesis .
5. Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un punto isoeléctrico mayor de 9,5 aproximadamente.
6. Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una actividad superior al 40% entre pH 3,5 y 7 aproximadamente .
7. Enzima según la reivindicación 6, caracterizada porque tiene un pH óptimo a 4,5 aproximadamente.
8. Enzima según la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una actividad relativa superior al 40% entre 40 °C y 85 °C aproximadamente .
9 Enzima según la reivindicación 8, caracterizada porque tiene una temperatura óptima a aproximadamente 70 °C
10. Un procedimiento para la obtención de una enzima con actividad pexox dasa según la reivindicación 1, que compxende la extracción de dicha enzima con actividad peroxidasa a partir de tejidos de alcahofa, la separación de dicha enzima de otras enzimas con actividad oxidasa eventual ente presentes en el material vegetal, y, opcionalmente, la purificación parcial o a homogeneidad de dicha enzima con actividad peroxidasa.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dichos tejidos de alcachofa comprenden tallos, hojas y brácteas de alcachofa .
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dichos tallos, hojas y brácteas de alcachofa forman parte de los desechos de alcachofa generados por la industria conservera de alcachofas .
13. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la extracción de dicha enzima se efectúa mediante homogeneización de dichos tejidos de alcachofa en un medio acuoso, en un intervalo de temperatura comprendido entre 4 y 30 °C.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho medio acuoso está constituido por agua o por una disolución acuosa salina, opcionalmente tamponado en un intervalo de pH comprendido entre 3,0 y 10.
15. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho medio acuoso comprende, además, uno o más aditivos seleccionados entre antioxidantes, secuestradores de fenoles, agentes quelantes de cationes, polímeros para reparto de fases, disolventes orgánicos y/o inhibidores o inactivadores de proteasas y sus mezclas.
16 . Procedimiento según la reivindicación 13 , que comprende la trituración de dichos tej idos de alcachofa previa a la homogeneización de los mismos .
17 . Procedimiento según la reivindicación 13 , que comprende la separación, tras la homogeneización, de la parte soluble del residuo sólido, mediante un proceso de separación sólido-líquido convencional, para obtener una primera fracción soluble y un primer residuo sólido.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha separación sólido-líquido se realiza por centrifugación.
19. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho primer residuo sólido se somete a uno o más ciclos adicionales de lavado, homogeneización en medio acuoso y separación sólido- líquido, para obtener un segundo residuo sólido y unas segundas fracciones solubles que, opcionalmente se mezclan con dicha primera fracción soluble y constituyen un extracto crudo con actividad peroxídasa.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 19, en el que dicha primera fracción soluble, opcionalmente mezclada con dichas segundas fracciones solubles, se someten a un proceso de lavado, desalado y liofilización.
21. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho segundo residuo sólido se somete a un lavado con agua para obtener un material rico en fibra y libre de bio oléculas solubles, adecuado para la fabricación de piensos compuestos para animales, como fuente de fibra en la alimentación humana o como fuente para la obtención de otros bioproductos con aplicaciones sanitarias, agroalimentarias o industriales.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende, además, desecar dicho segundo residuo sólido lavado con agua.
23. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dichas enzimas con actividad oxidasa eventualmente presentes en el material vegetal comprenden la polifenol oxidasa.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la separación de la enzima con actividad peroxidasa de la polifenol oxidasa se realiza por fraccionamiento con sulfato amónico.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que la separación de la polifenol oxidasa se realiza por precipitación con sulfato amónico por saturación entre 25% y 35%.
26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la separación de la polifenol oxidasa se realiza por precipitación con sulfato amónico por saturación con 30%.
27. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que la separación de la enzima con actividad peroxidasa de la polifenol oxidasa se realiza, una vez separada dicha polifenol oxidasa, por precipitación con sulfato amónico por saturación entre 60% y 80%.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la separación de la enzima con actividad peroxidasa de la polifenol oxidasa se realiza, una vez separada dicha polifenol oxidasa, por precipitación con sulfato amónico por saturación con 70%.
29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, que comprende desecar o liofilizar el extracto resultante y mantenerlo como fuente de enzima con actividad peroxidasa para ensayos que no requieran el empleo de dicha enzima con elevada pureza.
30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, que comprende lavar, desalar y liof lizar el extracto resultante y mantenerlo como fuente de enzima con actividad peroxidasa.
31. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende la purificación total o parcial de dicha enzima con actividad peroxidasa mediante el empleo de una o más técnicas convencionales de purificación de proteínas.
32. Procedimiento según la reivindicación 31, que comprende la purificación parcial de dicha enzima con actividad peroxidasa mediante técnicas cromatográficas, con lecho fijo o expandido, seleccionadas entre cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de filtración en gel , cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de reparto.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la purificación parcial de dicha enzima con actividad peroxidasa se realiza mediante cromatografía de afinidad en una columna de Concanavalina A-Sepharose.
34. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la purificación parcial de dicha enzima con actividad peroxidasa se realiza mediante cromatografía de intercambio catiónico a un pH comprendido entre 4,0 y 6,0.
35. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que la cromatografía de intercambio catiónico se realiza a un pH de
5,0.
36. Procedimiento según la reivindicación 31, que comprende la purificación a homogeneidad de dicha enzima con actividad peroxidasa mediante una combinación de dos o más técnicas cromatográficas mencionadas en cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35.
37. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 36, que comprende lavar, desalar y liofilizar las fracciones con actividad peroxidasa.
38. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 37, que comprende la inmovilización de las fracciones con actividad peroxidasa mediante enlace a un soporte sólido, atrapamiento en geles, encapsulación en vesículas, entrecruzamiento de moléculas de enzima y confinamiento en biorreactores de membranas.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el enlace a un soporte sólido se realiza sobre magnetita o concanavalina-A.
40. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 39, en el que el biorreactor que comprende la enzima soluble o inmovilizada está acoplado a un sistema de filtración, afinidad, interacción hidrofóbica, intercambio iónico, quelatación o reparto.
41. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la oxidación de sustratos reductores.
42. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como reactivo clínico o de diagnóstico, para la determinación y cuantificación de metabolitos .
43. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como enzima marcadora en inmunoensayos .
44. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como biocatalizador para la obtención de productos de interés bíotecnológico e industrial.
45. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el blanqueamiento del papel durante su reciclaje.
46. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el tratamiento de residuos líquidos o suelos contaminados con fenoles, aminas aromáticas, compuestos clorados y/o metales pesados.
47. Empleo de una enzima con actividad peroxidasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la elaboración de biosensores para la detección de peróxidos y mono-, di- o polifenoles .
PCT/ES2001/000400 2000-10-24 2001-10-24 Enzima con actividad peroxidasa aislada de la alcachofa cynara scolymus, l., procedimiento para su aislamiento y purificación y aplicaciones WO2002034898A1 (es)

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