WO2002031131A1 - Nouvelle phospholipase a1 (pla1) - Google Patents

Description

明 細 書

新規 P L A , 技術分野 本発明は、 新規なリパーゼ、 特にホスホリパーゼ ， ( p h o s p h o 1 i p a s e A , ；以下 P L A と呼ぶこともある） に関するもので ある。 さらに詳しくは、 新規 P L A，のアミノ酸配列の全部または一部 を有するぺプチドまたはポリぺプチド、 該ぺプチドまたはポリべプチド をコードするポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含有する組換え ベクター、 該組換えベクターで形質転換された形質転換体、 該形質転換 体を使ったぺプチドまたはポリべプチドの製造方法、 該ぺプチドまたは ポリペプチドに対する抗体、 これらを利用した化合物の同定方法、 該同 定された化合物、 該ポリべプチドもしくは該ポリヌクレオチドに作用す る活性阻害化合物または活性賦活化合物、 これらに関係する医薬組成物 とその製造方法およびこの医薬組成物を用いた治療方法、 並びにこれら に関係する疾病診断方法に関係する。 景技術

P L は、 グリセロリン脂質のグリセロール 1位のエステル結合を 加水分解する酵素である。 これまでに様々な臓器でこの酵素活性の存在 が検出されており、 また基質特異性により区別されるいくつかの P L A ，が報告されている。 c D N Aクロ一ニングされているものとしては、 蜂毒の P L A ( D o l m 1 )、 P S— P L A 〔ホスファチジルセリン ( P S ) およびリゾホスファチジルセリン （ 1 y s o P S ) のグリセ口 ールの 1位のエステル結合を特異的に加水分解する （特開平 1 0— 20 1 479号） （蛋白質 核酸 酵素， 44, 1 038— 1 042 , 1 99 9 )〕、 ヒ卜精巣の PA— P L A , 〔ホスファチジン酸 （P A) のグリセ ロールの 1位のエステル結合を特異的に加水分解する （J . B o l . C h e m., 273 , 5468— 5477 , 1 998 )〕等がある。 また、 リパ一ゼフアミリーの分子は、 しばしば卜リアシルグリセ口—ルを分解 する活性以外に、 P L A 性を併せ持つことが知られている （F E B S L e t t e r s , 320, 1 45 - 1 49 , 1 993 ) ( B i o c h e m i s t r y, 32， 4702 -4707 , 1 993 ) ( J . B o l . C h e m., 272, 21 92 - 2 1 98, 1 997 )。 さらに、 これま でに見つかつているリパーゼファミリ一に属する P L A，は全て、 短い リツ ド （L i d) (B . B . Α·, 1 376 , 41 7— 432， 1 998 )

( B i o c h em i s t r y, 32 , 4702 - 4707， 1 993 ) を有するが、 その生理的意義は必ずしも明らかになっていない。 また、 リパーゼ分子上の糖鎖がリパーゼ活性に関与する可能性が示唆されてい る （J . L p i d R e s ., 35 , 1 5 1 1 - 1 523 , 1 994 )

(J . L i p i d R e s ., 36， 939— 95 1 , 1 995 )。

P L A，の機能の一つにリン脂質 （p h o s p h o l i p i d ) を分 解する作用があるが、 生成物のひとつであるリゾホスファチジン酸 （ 1 y s o p h o s p h a t i d i c a c i d ;以下 L P Aと略称するこ ともある） （B. B . A., 1 1 98， 1 85 - 1 96 , 1 994) には 多くの生理活性が知られており、 生物学的有用性において着目されてい る 〔細胞工学， 1 7 , ( 5 ), 739— 745， 1 998〕。 L P Aの主要 な作用としては、 血圧の上昇作用 （ L i p i d s， 1 3 , 572 - 57 4 , 1 978 )、 血小板凝集作用 （Am. J . P a t h o l ., 96， 4 23— 438, 1 979 )、細胞増殖促進作用 （Ce l 1 , 59, 45 - 54, 1 989 ) があり、 またこれら以外にも、 ガン細胞の浸潤促進、 細胞接着、ス卜レスファイバーの形成、化学走性誘発、神経突起の退縮、 アポトーシスの抑制、 創傷治癒への関連等多様な作用が報告されている (Β. Β. Α·, 1 1 98， 1 85— 1 96， 1 994)。 ホスファチジン酸 （p h o s ph at i d i c a c d ;以下、 P Aと略称することもある） に対して特異性を持つ P L A，としては、 ヒ 卜精巣 P A— P L A，が知られており、 c D N Aもクローニングされて いるが、 該 P は細胞内の酵素であり、 リン脂質代謝の中心である ホスファチジン酸の s n— 1位の脂肪酸の代謝回転を決定する因子とし て捉えられている （J . B o l . C h em., 273， 5468 - 54 77, 1 998)。 また、 ヒ卜精巣 PA— P L A，は反応条件によっては- ホスファチジルェタノ一ルァミン（ P E )、ホスファチジルイノシトール (P I ) も加水分解することが報告されている。 本発明は、 上記のように多様な、 ある局面においてはむしろ悪益な作 用の原因物質となり得る L P Aの產生触媒たる P に関する新規な 物質を見いだし、 生体内における L P Aの制御を可能にすることを目的 のひとつとするものである。 発明の開示

本発明は、 （ 1 ) 下記の群より選ばれるポリべプチド ；

①配列表の配列番号 1 または 2に記載のアミノ酸配列で示されるポリぺ プチド、

②前記①のポリべプチドを含有するポリべプチド、 ③前記①のポリべプチドと少なくとも約 7 0 %のアミノ酸配列上の相同 性を有しかつホスファチジン酸を分解する活性を有するポリべプチド、 および

④前記アミノ酸配列において 1 ないし数個のアミノ酸の欠失、 置換、 付 加あるいは挿入といった変異を有し、 かつホスファチジン酸を分解する 活性を有するポリペプチド、 （ 2 )配列表の配列番号 1 または 2に記載の アミノ酸配列の少なくとも約 8個の連続するアミノ酸配列を有するぺプ チド、 （ 3 )前記 1 または 2のポリぺプチドまたはべプチドをコ一ドする ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、 （ 4 )前記 3のポリヌクレオチドま たはその相補鎖と選択的な条件下でハイブリダィゼ一ジョンするポリヌ クレオチド、 （ 5 )配列表の配列番号 3または 4に記載の塩基配列または その相補的配列の少なくとも約 1 5個の連続する塩基配列で示されるポ リヌクレオチド、 （ 6 )前記 3ないし 5の何れかのポリヌクレ才チドを含 有する組換えベクター、 （ 7 )前記 6の組換えべクタ一で形質転換された 形質転換体、 （8 )前記 7の形質転換体を培養する工程を含む、前記 1 ま たは 2のポリべプチドまたはべプチドの製造方法、 （ 9 )前記 1 または 2 のポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体、 （ 1 0 )ホス ファチジン酸を分解する活性を抑制する、前記 9の抗体、 （ 1 1 )前記 1 のポリべプチドと相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合 物、 および/または前記 3もしくは 4のポリヌクレオチドと相互作用し てその発現を阻害もしくは促進する化合物の同定方法であって、 前記 1 または 2のポリべプチドもしくはべプチド、 前記 3ないし 5の何れかの ポリヌクレオチド、 前記 6のベクター、 前記 7の形質転換体、 前記 9も しくは 1 0の抗体のうち、 少なくとも何れか一つを用いることを特徴と する方法、 （ 1 2 )前記 1 のポリペプチドと相互作用してその活性を阻害 もしくは活性化する化合物、 または前記 3もしくは 4のポリヌクレオチ ドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合物の同定方法で あって、 化合物とポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の相互作 用を可能にする条件下で、 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとスク リ一二ングすべき化合物とを接触させて化合物の相互作用を評価し （か かる相互作用はポリぺプチドまたはポリヌクレ才チドと化合物との相互 作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第 2の成分に関連したも のである）、次いで、化合物とポリぺプチドまたはポリヌクレオチドとの 相互作用により生じるシグナルの存在または不存在またはその変化を検 出することにより、 化合物がポリべプチドまたはポリヌクレオチドと相 互作用して、 その活性を活性化または阻害するかどうかを決定すること を含む方法、 （ 1 3 )前記 1のポリペプチドまたは前記 3もし〈は 4のポ リヌクレオチドの活性または生理学的作用を阻害もしくは活性化する化 合物の同定方法であって、 前記 7の形質転換体と、 該形質転換体中で発 現される前記 1のポリぺプチドがホスファチジン酸に作用することによ り生産されるリゾホスファチジン酸に対する受容体を発現させた別の形 質転換体とを用い、 化合物とこれら形質転換体の相互作用を可能にする 条件下で、 これら形質転換体とスクリ一ニングすべき化合物とを接触さ せて化合物の相互作用を評価し （かかる作用は形質転換体と化合物との 相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し得る第 2の成分に関連し たものである）、次いで、化合物と形質転換体との相互作用により生じる シグナルの存在または不存在またはその変化を検出することにより、 化 合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性または生理学的作用 を、 活性化または阻害するかどうかを決定することを含む方法、 （ 1 4 ) 前記 1 1 ないし 1 3の方法で同定される化合物、 （ 1 5 )前記 1のポリぺ プチドと相互作用してその活性を阻害もしくは活性化する化合物、 また は前記 3もしくは 4のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害 もしくは促進する化合物、 （1 6)前記 1または 2のポリペプチドもしく はべプチド、 前記 3ないし 5の何れかのポリヌクレ才チド、 前記 6のべ クタ一、 前記 7の形質転換体、 前記 9もしくは 1 0の抗体、 または前記 1 4もしくは 1 5の化合物のうち、 少なくとも何れか一つを含有するこ とを特徴とする医薬組成物、 （1 7 )個体における前記 1のポリペプチド の発現または活性に関連した疾病の診断方法であつて、 （ a )該ポリぺプ チドをコードしている核酸配列、 および/または （b) 個体由来の試料 中の該ポリペプチドをマ一カーとして分析することを含む方法、 （ 1 8) 前記 1 6の医薬組成物をホスホリパーゼ A に関連する疾患に用いるこ とを特徴とする治療方法、 （1 9)前記 1 6の医薬組成物の製造方法、か らなる。 図面の簡単な説明

図 1は、 新規 P LA ( s h o r t -t y p e) の配列およびその配 列の特徴を説明する図である。 図中、 二重下線はシグナル配列、 下線は 糖鎖付加予測部位、 両矢印の下線はリパーゼコンセンサス配列およびリ ッ ド領域、 四角で囲んだ S、 D、 Hは活性トライアドを示す。

図 2は図 1の続きであり、 新規 P L A！ (s h o r t— t y p e) の 配列およびその配列の特徴を説明する図である。 図中、 二重下線はシグ ナル配列、 下線は糖鎖付加予測部位、 両矢印の下線はリパーゼコンセン サス配列およびリツ ド領域、 四角で囲んだ S、 D、 Hは活性トライアド を示す。

図 3は、新規 P L A ,の作用を検討するための、新規 P L 発現細胞 と F u r a 2を取り込ませた L P A受容体 E DG 7発現細胞とを用いる バイオアツセィシステムを説明する図である。

図 4 ( A) は、 新規 P L A を発現させた S f 9が、 L PA受容体 E D G 7を発現させた S f 9の細胞内 C a ²⁺濃度を上昇させること、およ び新規 P L A！が媒介する L P A産生における P L Dの関与を示す図で ある。

図 4 ( B ) は、 E D G 7発現細胞における 1 —o l e y l — L P Aの濃 度作用曲線を示す図である。 発明を実施するための最良の形態

(新規 P L A

本発明において提供される新規 P L A，は、 c D N Aライブラリ一か ら、 新規なアミノ酸配列を有する物質としてその c D N Aが取得された ものである。 そして、 本発明の新規 P L A は、 ヒ 卜の精巣において、 その存在がノザンプロッティング法によって確認された。 本発明の新規 P L A,は以下のような性質を有する。 リン脂質、 特にホスファチジン 酸 （ PA) に作用して L P Aを生成する。 リパーゼファミリ—に保存さ れるコンセンサス配列および触媒卜ライアドならびにリッ ドと考えられ るアミノ酸を有する。 また、 既知 P L 類との相同性は約 40%未満 である。

(ポリべプチドまたはべプチド）

本発明の新規 P L A のアミノ酸配列は、 配列表の配列番号 1 または 2に記載のポリペプチドである。 さらに本発明のポリペプチドまたはべ プチドは、 該配列表の配列番号 1 または 2に記載のポリペプチドの少な くとも一部分を含有するポリべプチドまたはべプチドから選択される。 その選択されるポリペプチドまたはペプチドは、 配列表の配列番号 1 ま たは 2に記載のポリペプチドと、 アミノ酸配列上で約 40%以上、 好ま しくは約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは 約 90%、 特に好ましくは約 95%以上の相同性を有する。 この相同性 をもつポリべプチドまたはべプチドの選択は、 リン脂質、 特にホスファ チジン酸を分解し得る活性および/またはホスファチジン酸に対する基 質特異性の存在を指標にして可能である。 上記分解活性は公知の方法、 例えば、 放射性同位体 （ R I ) 標識基質、 蛍光基質、 もしくは発色基質 を用いた方法、 または実施例に記載の方法で測定できる （J . B i o c h e m, 1 03 , 442— 447 , 1 988 ) ( J . B i o c h e m., 1 1 7 , 1 280 - 1 287, 1 995 ) ( J . B i o c h em., 1 0 1， 53— 6 1 , 1 987 ) ( J . B i o l . C h e m. , 235 , 25 95 - 2599 , 1 960 ) ( J . B i o l . C h e m., 272 , 2 1 92 - 2 1 98 , 1 997 )。 アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、 自体公知であり、 例えばァ ミノ酸配列を直接決定する方法、 c D N Aの塩基配列を決定後これにコ 一ドされるアミノ酸配列を推定する方法等が挙げられる。 本発明のポリペプチドまたはペプチドは、 配列表の配列番号 1 または 2に記載のポリべプチドの部分配列を有するポリぺプチドまたはべプチ ドを包含し、 これらは例えば試薬、 標準物質、 または免疫原として利用 できる。 その最小単位としては 8個以上のアミノ酸、 好ましくは 1 0個 以上のアミノ酸、 より好ましくは 1 2個以上、 さらに好ましくは 1 5個 以上の連続するァミノ酸で構成されるァミノ酸配列からなり、 好ましく は免疫学的に同定し得るポリべプチドまたはべプチドを本発明の対象と する。 これらのペプチドは、 試薬もしくは標準物質、 または後述するよ うに新規 P L に特異的な抗体を作製するための抗原として単独また はキャリア （例えば、 キーホールリンペッ トへモシァニンまたは卵白ァ ルプミン等） と結合して使用できるが、 これらのように別種の蛋白質ま たは物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。 さらに、 このように特定されたポリべプチドまたはべプチドを基にし て、 リン脂質、 特にホスファチジン酸を分解し得る活性および/または ホスファチジン酸に対する基質特異性の存在を指標とすることにより、

1以上、 例えば 1〜1 00個、 好まし〈は 1〜30個、 より好ましくは 1〜20個、 さらに好ましくは 1〜1 0個、 特に好ましくは 1ないし数 個のアミノ酸の欠失、 置換、 付加あるいは挿入といった変異を有するァ ミノ酸配列からなるポリべプチドまたはべプチドも提供される。 欠失、 置換、 付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、 例えば、 部位特異的 変異導入法、 遺伝子相同組換え法、 プライマー伸長法またはポリメラ一 ゼ連鎖増幅法 （P C R ) を単独または適宜組み合わせて、 例えばサムブ ルック等編 [モレキュラークローニング， ァ ラボラ トリ一マニュアル 第 2版] コールドスプリングハーバーラボラ トリ一， 1 989、 村松正 實編 [ラボマニュアル遺伝子工学] 丸善株式会社， 1 988、 エールリ ヅヒ， H E. 編 [P C Rテクノ ロジ一， D N A増幅の原理と応用] ス 卜 ヅク トンプレス， 1 989等の成書に記載の方法に準じて、 あるいはそ れらの方法を改変して実施することができ、例えば U 1 m e rの技術（ S c i e n c e , 2 1 9, 666 , 1 983 ) を利用することができる。 上記のような変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、 活性、 または免疫学的活性等） を変化させないという観点からは、 例え ば、 同族アミノ酸 （極性アミノ酸、 非極性アミノ酸、 疎水性アミノ酸、 親水性アミノ酸、 陽性荷電アミノ酸、 陰性荷電アミノ酸、 芳香族ァミノ 酸等） の間での相互置換は容易に想定される。 後述するように、 リパー ゼフアミリーのコンセンサス配列およびリッ ド領域は活性の発現または 調節に重要と考えられ、 これらを含有する領域、 特に触媒卜ライアドを 含むコンセンサス配列は一次配列上および/または立体構造上保持され ていることが P L A，活性、特に P A— P L A 活性を維持するためには 好ましい。 また、 本発明のポリペプチドまたはペプチドは、 糖鎖の有無 に拘わらず本発明の範囲に包含されるが、 糖鎖が活性に影響する可能性 もあるため、 少なくとも 1 つのグリコシレ一ションサイ 卜は保持されて いることが好ましい。 本発明においては、 配列表の配列番号 1 または 2のアミノ酸配列で示 されるポリべプチドと同様の P L A ,活性を有するポリべプチドまたは その最小活性単位 （領域もしくはドメイン） も提供されるが、 それら以 外にも、 活性の強度または基質特異性を変更したポリペプチドが提供さ れる。 これらは、 例えば P L A 活性様物質もしくは P L A 拮抗物質と して、 または P L A ,活性を調節する物質のスクリ一ニング等において 有用である。 なお、 ヒ ト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の 範囲に包含される。 さらに、 本発明のポリべプチド等の検出もしくは精製を容易にするた めに、 または別の機能を付加するために、 N末端側や C未端側に別の蛋 白質、 例えばアル力リホスファターゼ、 3—ガラク 卜シダ一ゼ、 I g G 等の免疫グロプリン F c断片または F L A G— t a g等のぺプチドを直 接またはリンカーべプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用 いて付加することは当業者には容易であり、 これらの別の物質を結合し たポリべプチド等も本発明の範囲に包含される。 (ポリヌクレオチド）

一つの態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、 本発明のポリべプチドまたはべプチドのアミノ酸配列、 例えば配列表の 配列番号 1 または 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチ ドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖を意味する。 これらは例え ば上記新規 P L A，の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、 あるいは核酸に関する試薬または標準品としても利用できる。 好ましい ポリヌクレオチドを示す配列表の配列番号 3または 4において、 各々塩 基番号 1 1 5の A (a d e n i n e ) から塩基番号 1 494の A (a d e n i n e ) または塩基番号 1 1の A (a d e n n e ) から塩基番号 1 453の A (a d e n i n e )までがコ一ディング領域と推定される。 また、 配列番号 1のアミノ酸配列のアミノ酸番号 1の M (Me t) から アミノ酸番号 1 3の V ( V a 1 ) のまでをコードしている a t g〜g t gはシグナル配列をコ一ドしているものと推定される。 別の態様において本発明は、 本発明のポリべプチドまたはべプチドの アミノ酸配列、 例えば配列表の配列番号 1 または 2のアミノ酸配列をコ ―ドするヌクレオチド、 好ましくは配列表の配列番号 3または 4の塩基 配列で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の対応する領域に選 択的な条件下、 好まし〈はストリンジェン卜な条件でハイプリダイズす るポリヌクレオチドを提供する。 ハイプリダイゼ一ションの方法は、 例 えばサムブルック等編 [モレキュラークローニング， ァ ラボラ トリ一 マニュアル 第 2版]コ一ルドスプリングハ一バーラボラ トリ一，（ 1 9 89 )、 又は、 ショウ （S h aw) 等に記載の方法（Nucleic Acids Res.， 1 1巻、 555 - 573頁、 1 983年）、 又はそれらを適宜一部改変して行う ことができる。 ここで、 選択的ハイブリダィゼ一ション条件とは、 所望 の核酸、 例えば、 特定のプローブ （例えば、 配列番号 3の本発明の P L A，をコー ドする核酸） と所望の相同性を有する核酸を選択的に又は特 異的にハイブリダィズさせ、 他の無関係な核酸、 例えば、 相同性がより 低い核酸をハイブリダィズしないような条件をいう。 一般的に、 核酸の 2本鎖分子 （ハイブリツ ド） の安定性の指標として融解温度 （Tm) が 用いられるが、 これは鎖の長さ、塩基組成及び化学的条件（イオン強度、 化学変性剤の存在等） によって左右され、 通常、 ハイブリダィゼ—ショ ンは T m以下の温度で実施される。 D N A, R N A又はオリゴヌクレオ チドプローブでの完全な相補性のハイプリヅ ドの Tm値は経験的な実験 式が得られている （ヒ卜の分子遺伝学（Human Molecular Genetics, Tom Strachan and Andrew P. Read) 村松正貫監修、 メディカル . サイェン ス · ィンタ一ナショナル、 1 997年他）。 その概算値は、 プローブが 5 0ヌクレオチドより小さい場合、 Tm (°C) =4 (G + C ) + 2 (A + T) [A, T , G, Cはプローブ中の各塩基数] で求められる。完全な相 補性を選択的に得る為には、 ハイブリダィゼ一シヨン温度は、 Tmより 5°C低いかそれ以上の温度 （好ましくは Tm以下） を用い、 又ハイプリ ッ ドの安定性を保っためには 1組の不対合塩基につきハイプリダイゼ一 シヨン温度を Tmより約 5°C下げる必要がある。 又、 プロープが 50ヌ クレオチド以上の場合、 T m (°C) = 8 1 . 5°C+ 1 6. 61 o g M + 0. 4 1 (%G+%C) - 500/n - 0. 6 1 (%ホルムアミ ド） [M は溶液の 1価陽イオン強度（mo 1 /し）、 nは塩基対での 2本鎖の長さ] の式で計算され、 1 %の不対合塩基を含む毎に Tmは 1 °C減少するので、 ハイプリダイゼ一ション温度もそれに従い調整する。 ハイプリダイゼー ション温度の目安を完全相補性ハイプリヅ ドの T mより、例えば、 55°C、 好ましくは 40°C、 より好ましくは 25°C、 更に好ましくは 1 0°C、 特 に好ましくは 5°C低い温度とすることで、 所望の相同性の核酸を選択的 にハイブリダィズすることが出来る。 具体的には、 ショウ （S h aw) 等の方法を一部改変した方法がある。 即ち、 核酸を結合したフィルタ一 (例えば、 ナイロンメンブレン又はニトロセルロースフィルタ一） を、 6 5°Cでー晚、 0. 1 % S D Sを含む 3 X S S C (Standard Saline Citrate: 1 x S S C は 0. 1 5M N a C 1 , 0. 01 5Mクェン酸 ナトリウム） で洗浄し、 次いで、 50%ホルムアミ ド、 5 Xデンハルト 溶液、 0. 1 %S D S、 250 gZm 1の変性サケ精子 D N Aを含む 5 X S S C P ( I x S S C Pは、 0. 1 5M N a C 1 , 0. 01 5 M クェン酸ナトリウム、 1 0mM N a H ₂ P 0_4J 1 mM E D TA， p H 7 - 2 ) 中で、 42°C、 5時間 （又は 65° 2時間） プレハイプリ ダイゼーシヨンする。次に、 50%ホルムアミ ド、 1 xデンハル卜溶液、 0. 1 %S D S、 1 00 g/m 1の変性サケ精子 D N A、 1 0% (w /v) デキス 卜ラン硫酸を含む 5 x S S C Pに R I標識又は非 R I標識 プローブを適量添加し、 前記フィルタ一を 28°C (好ましくは 37°C、 より好ましくは 42 °C、更に好ましくは 50°C、特に好ましくは 65°C) で 1 8時間ハイブリダィゼ一シヨンさせる。 0. 1 %S D Sを含む 2 X S S C Pを用い、 室温 （好まし〈は 37°C) で 5分間 2回フィル夕一を 洗浄し、次いで、 0. 1 %S D Sを含む 0. 3 X S S C Pを用い、 37 °C (好ましくは 50°C、 より好ましくは 65°C) で 3回 （計 1時間） 洗浄 する。 その後、 オートラジオグラフィ一又は適当な検出方法でプロ—ブ の存在を特異的に検出する。 ハイプリダイゼ一シヨン条件及び洗浄条件 等は、使用するプローブ等に応じて適宜組み合わせることが可能である。 これらのポリヌクレ才チドは目的のポリヌクレオチド、 特に配列表の配 列番号 3または 4の塩基配列で示されるポリヌクレオチドまたはその相 補鎖にハイブリダィズするものであれば必ずしも相補的配列でなくとも よい。 例えば、 配列表の配列番号 3または 4の塩基配列またはその相補 配列に対する相同性において、 少なくとも約 4 0 %、 例えば、 約 7 0 % 以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 さらに 好ましくは約 9 5 %以上である。 また本発明のポリヌクレオチドは、 指 定された塩基配列の領域に対応する連続する 1 0個以上のヌクレオチド、 好ましくは 1 5個以上、 より好まし〈は 2 0個以上の配列からなるポリ ヌクレオチド、 才リゴヌクレオチドおよびそれらの相補鎖を包含する。 これらのポリヌクレオチドは、 本発明のポリぺプチド等の製造におい て、 新規 P L A をコードする核酸、 例えば、 その遺伝子、 もしくは m R A検出のためのプローブもしくはプライマ一として、 または遺伝子 発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として有用で ある。 その意味で、 本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ ドは翻訳領域のみでなく、 非翻訳領域に対応するものも包含する。 例え ば、 アンチセンスによって新規 P の発現を特異的に阻害するため には、 リパーゼファミリ一で保存されているコンセンサス配列領域以外 の新規 P L A ₁に固有な領域の塩基配列を用いることが想定される。 一 方、 保存配列を用いることにより新規 P L A，を含む複数のリパーゼの 発現を同時に抑制することも可能と考えられる。 ここで、 新規 P L A または同様の活性を有するポリべプチドをコ一ドする塩基配列の決定は. 例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の確認を行い、 その生 理活性、 特にホスファチジン酸を分解する活性を指標にして選別するこ とにより行うことができる。 無細胞蛋白質発現系を利用する場合は、 例 えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（ N a t u r e、 1 7 9、 1 6 0 ~ 1 6 1 _N 1 9 5 7 )。

(形質転換体） 上記のような無細胞蛋白質発現系以外にも、本発明は、大腸菌、酵母、 枯草菌、 昆虫細胞、 動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換 え技術によっても、 本発明からなる新規 P L A，およびその由来物から なるぺプチドおよびポリべプチドは提供可能である。 本発明の具体例に おいては、 昆虫細胞を利用したが、 無論これに限定されるものではない (日本国特許第 2 1 2 9 4 8 7号および第 2 6 4 4 4 4 7号：組み替え バキユウロウィルス発現べクタ一の製法とポリべプチドの合成）。なお、 本発明の新規 P L A 遺伝子がコー ドする P L A，は糖蛋白質であるた め、 ポリべプチドまたはべプチドに糖鎖を付加し得る宿主である動物細 胞等の宿主を用いることが好ましい。 形質転換は、 自体公知の手段が応用され、 例えばレブリコンとして、 プラスミ ド、染色体、 ウィルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。 より好ましい系としては、 遺伝子の安定性を考慮するならば、 染色体内 へのインテグレート法であるが、 簡便には核外遺伝子を利用した自律複 製系の利用である。 ベクターは、 選択した宿主の種類により選別され、 発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子 配列とを構成要素とする。 組合せは原核細胞、 真核細胞によって分別さ れ、 プロモー夕一、 リボソーム結合部位、 夕一ミネ一ター、 シグナル配 列、 ェンハンサ一等を自体公知の方法によって組合せて利用できる。 本 発明の具体例においては、 バキュロウィルス系を利用したが、 無論これ に限定されるものではない。 形質転換体は、 自体公知の各宿主の培養条件に最適な条件を選択して 培養される。 培養は、 発現産生される新規 P およびその由来物か らなるぺプチドおよびポリぺプチドの酵素活性、 特にホスファチジン酸 を分解する酵素活性を指標にして行ってもよいが、 培地中の形質転換体 量を指標にして継代培養またはバッチにより生産してもよい。

(新規 P L A，およびその由来物回収）

培地からの新規 P L A およびその由来物からなるぺプチドおよびポ リベプチドの回収は、 ホスファチジン酸を分解する酵素活性を指標にし て、 分子篩、 イオンカラムクロマトグラフィー、 ァフィ二テイクロマ 卜 グラフィ一等を組合せるか、 溶解度差にもとづく硫安、 アルコール等の 分画手段によっても精製回収できる。 好ましくは、 アミノ酸配列の情報 に基づき、 該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、 ポリクローナル抗体 またはモノクローナル抗体によって、 特異的に吸着回収する方法を用い o

(抗体）

抗体は、 本発明の新規 P L A！およびその由来物からなるぺプチドま たはポリペプチドの抗原決定基を選別し、 作製する。 抗原は新規 P L A またはその断片でもよく、 少なく とも 8個、 好ましくは少な〈とも 1 0個、 より好ましくは少なくとも 1 2個、 さらに好ましくは 1 5個以上 のァミノ酸で構成される。 新規 P L A，に特異的な抗体を作製するため には、 リパーゼフアミリ一のコンセンサス配列領域以外の新規 P L A！ に固有な配列からなる領域を用いることが好ましい。 このアミノ酸配列 は、 必ずしも配列表の配列番号 1 または 2と相同である必要はなく、 蛋 白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、 露出部位が不連続部 位であれば、 該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有 効である。 抗体は、 免疫学的に新規 P L A，およびその由来物からなる ペプチドまたはポリペプチドを結合または認識する限り特に限定されな し、。 この結合または認識の有無は、 公知の抗原抗体結合反応によって決 疋される。 抗体を產生するためには、 本発明の新規 P L およびその由来物か らなるペプチドまたはポリペプチドを、 単独または担体に結合して、 ァ ジュバン卜の存在または非存在下で、 動物に対して体液性応答および Ζ または細胞性応答等の免疫誘導をおこなうことによって行われる。 担体 は、 自身が宿主に対して有害作用をおこさなければ、 特に限定されず例 えばセルロース、 重合アミノ酸、 アルブミン等が例示される。 免疫され る動物は、 マウス、 ラヅ 卜、 兎、 やぎ、 馬等が好適に用いられる。 ポリ クロ—ナル抗体は、 自体公知の血清からの抗体回収法によつて取得され る。 好ましい手段としては、 免疫ァフィ二ティクロマ卜グラフィ一法で ある。 モノクローナル抗体を生産するためには、 上記の免疫手段が施された 動物から抗体産生細胞 （例えば、 脾臓またはリンパ節由来） を回収し、 自体公知の永久増殖性細胞 （例えば、 Ρ 3 Χ 6 3 A g 8株等の骨髄腫細 胞株等） との融合によりハイプリ ドーマを作製する。 これをさらにクロ 一ン化した後、 本発明の P L A！を特異的に認識する抗体を産生してい るハイプリ ドーマを選別し、 該ハイプリ ド一マの培養液から抗体を回収 する。

Pし A，活性を抑制し得るポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル 抗体は、 直接本発明からなる新規 P L に結合し、 その活性を制御す ることができ、 リン脂質特に P Aからのし P A産生系の制御を容易に行 うことができる。 そのため、 L P Aが関連する各種悪益的疾患の治療お よび/または予防のために有用である。

(化合物の同定■ スクリーニング方法）

かく して調製された新規 Pし A，およびその由来物からなるぺプチド またはポリべプチド、 これらをコードするポリヌクレオチドおよびその 相補鎖、 これらのァミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換 させた細胞、 またはこれらを用いる蛋白質合成系並びに新規 P L お よびその由来物からなるぺプチドまたはポリべプチドを免疫学的に認識 する抗体は、 単独または複数を組合せることによって、 新規 P L お よびその由来物からなるぺプチドおよびポリべプチドまたはポリヌクレ 才チドに対する活性の調節物質または調節剤、 例えば活性阻害剤または 活性賦活剤の同定方法またはスクリーニング方法に有効な手段を提供す る。 例えば、 ペプチドまたはポリペプチドの立体構造に基づく ドラッグ デザィンによる拮抗剤の選別、 蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルで の発現調節剤の選別、 抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、 自体公 知の医薬品スクリーニングシステムにおいて、 利用可能である。 ここで 上記の調節とは、 阻害、 拮抗、 活性化、 活性促進、 活性賦活等を含む。 また、 本発明の新規 P L A およびその由来物からなるぺプチドまた はポリぺプチドまたは本発明のポリヌクレオチドもしくは形質転換体は. スクリ一ニング候補の化合物とこれらべプチドまたはポリべプチド等と の間の相互作用を可能にする条件を選別し、 この相互作用の有無を検出 することのできるシグナル （マーカー） を使用する系を導入し、 このシ グナル （マーカー） の存在もしくは不存在、 またはシグナル量の変化を 検出することにより、 本発明の新規 P L A およびその由来物からなる ぺプチドおよびポリべプチドの活性を賦活もしくは阻害する化合物、 ま たは本発明のポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは促進する化合物を 同定することができる。 シグナル （マ一力一） を使用する系としては、 本発明のポリペプチドの活性、 例えば、 P A等の基質を分解する活性を 測定する系またはポリヌクレオチドの発現量を測定する系が含まれ、 具 体的には実施例に例示されている。 これらは公知の方法を応用してもよ い o また本発明の新規 P L A，またはその由来物からなるポリべプチドを 発現させた形質転換体と、 該形質転換体中で発現される新規 P L A，ま たはその由来物からなるポリべプチドがホスファチジン酸に作用するこ とにより生産されるリゾホスファチジン酸に対する受容体を発現させた 別の形質転換体とを用い、 化合物と前記ポリペプチドまたはこれら形質 転換体の相互作用を可能にする条件下で、 前記ポリべプチドまたはこれ ら形質転換体とスクリ一ニングすべき化合物とを接触させて、 化合物と 形質転換体との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在また はその変化を検出することにより、 新規 P L A，およびその由来物から なるポリべプチドまたは本発明のポリヌクレオチドの活性または生理学 的作用を阻害もしくは活性化する化合物を同定することができる。 上記 形質転換体としては、 例えば本発明の新規 P L A またはその由来物か らなるポリべプチドを発現させた S f 9細胞と、 L P A受容体 E D G 7 を発現させた S f 9細胞との組み合わせが挙げられるが、 これに限定さ れない。 また、 本発明の新規 P L A およびその由来物からなるポリべ プチドの作用を検出するためのシグナルとしては、 例えば L P A受容体 E D G 7発現細胞に L P Aが結合することにより上昇する細胞内カルシ ゥ厶を検出すればよい。 細胞内カルシウムの検出は F u r a 2等を用い る自体公知の測定法を応用することができる。 なお、 本発明のポリぺプ チド等を他のリパーゼの相同物 （すなわち、 ポリペプチド等） または L P Aに置き換えた対照系における反応と比較することにより、 化合物の 作用の特異性を確認することができる。 また、 各形質転換体は、 対応す る遺伝子の発現が確認された細胞株などに置き換えてもよい。

(化合物、 医薬組成物）

このようにして同定された化合物は、 新規 P およびその由来物 からなるぺプチドおよびポリべプチドに関する、 活性もしくは作用の阻 害剤、 拮抗剤、 活性化剤、 促進剤、 または賦活剤の候補化合物として、 利用可能である。 また、 遺伝子レベルでの新規 P L A およびその由来 物に対する発現阻害剤、 発現拮抗剤、 発現活性化剤、 発現促進剤、 発現 賦活剤の候補化合物としても利用可能である。 その効果は、 L P Aに由 来する各種悪益的症状の予防および Zまたは治療を期待できる。 かく して選別された候補化合物は、 生物学的有用性と毒性のバランス を考慮して選別することによって、 医薬組成物として調製可能である。 また本発明からなる新規 P L およびその由来物からなるぺプチドま たはポリペプチド、 これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相 補鎖、 これらの塩基配列を含むベクター並びに、 新規 P L A，およびそ の由来物からなるぺプチドまたはポリべプチドを免疫学的に認識する抗 体は、それ自体を、診断マーカ一もしくは試薬等の疾病診断手段として、 または新規 P L A，の発現、 活性、 もしくは作用を阻害、 拮抗、 活性化、 促進、 賦活する機能を利用した治療薬等の医薬手段として使用し得る。 なお、 製剤化にあたっては、 ぺプチドまたはポリべプチド、 蛋白質、 ポ リヌクレオチド、 抗体等各対象に応じた自体公知の製剤化手段を導入す ればよい。 上記医薬組成物は、 本発明の新規 P L A，およびその由来物からなる ペプチドまたはポリペプチド、 ポリヌクレオチド、 ベクタ一、 形質転換 体、 抗体、 および上記本発明の化合物を利用して製造することが可能で ある。上記医薬組成物は、 P L A 特に新規 P L A に関連する疾患の治 療に有用である。 診断手段としては、 本発明の新規 P L A，およびその由来物からなる ペプチドまたはポリぺプチドの発現または活性に関連する疾患の診断手 段として有用であり、 診断は例えば当該べプチドをコ一ドしている核酸 配列との相互作用や反応性を利用して、 相応する核酸配列の存在量を決 定すること、 および/または当該べプチドについて個体中の生体内分布 を決定すること、 および/または当該ペプチドの存在、 個体由来の試料 中の存在量または活性量を決定すること等によって行われる。すなわち、 新規 P を診断マーカ一として検定するのである。 その測定法は、 自体公知の抗原抗体反応系、 酵素反応系、 P C R反応系等を利用すれば よい。 さらに、 公知の方法により単一ヌクレオチド多型 （ S N P) を検 出することも有用な診断手段である。 実施例

以下、 本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、 本発明は下記の 実施例に限定されない。

(遺伝子の単離）

ホスファチジルセリンを特異的に加水分解するラッ 卜ホスホリパーゼ A, ( P S - P L A (J . B i o l . C h e m . , 2 72 , (4)， 2 1 92 - 2 1 98, 1 997 ) のアミノ酸配列をプローブとして、 d b E ¾ 1 (d a t a b a s e o f E x p r e s s e d S e q υ e n c e T a g s ) に対して、 ホモロジ一サーチ （ t b 1 a s t n s e a r c h) を実施した。 その結果、 未知の核酸配列で相同性スコアの比較 的高かった、受託番号（a c c e s s i o n n o .) AA470035 の E S T配列を得た。 次に、受託番号（a c c e s s i o n n o.) AA47003 5の核 酸配列をプローブとして、 G e n B a n kに対してホモロジ一サーチ（ b Ί a s t n s e a r c h ) を実施した。 その結果、 受託番号 （ a c c e s s i o n n o .)A P 006556の配列と A P 001 347が明 らかとなつた。 これらの配列を基に、 プライマ一を設計し、 ヒト精巣全 R N Aから才リゴ d Tプライマーで作製した f i r s t s t r a n d を鎳型として、 P C R法により配列を確認した。 5' 側の配列が決定困 難であったので、 AT T T TG T T CAAACAG T GG CT CAG C Aのヌクレ才チド配列を有する p r i m e r A (配列番号 5 ) および T T CAAACAG T G G CT CAGCACAG T T Tのヌクレオチド 配列を有する p r i m e r B (配列番号 6 ) ならびに M a r a t h o n- R e a d y™ c D N A H uma n T e s t s (C l o n t e c h ) を用いて 5 ' — R A C E法により確認した。 その結果、 a l t e r n a t i v e s p 1 i c i n gによると考えられる、 第一ェクソ ンの長さが異なる 2種類のアイソフォ一厶の配列（「s h o r t- t y p e」 および Π o n g _ t y p e」 と記載することがある） が確認され た。 次に、 これらの配列を並べ、 その特色を解析した。 P S— P L A や、 リパーゼに特色的な、 活性卜ライア ドのアミノ酸残基や立体構造的 に活性ポケッ 卜近傍にあるリツ ドと呼ばれるループ構造領域 （ B. B . A., 1 376 , 41 7— 43 2, 1 998) (B i o c h em s t r y , 32 , 4702— 4707 , 1 993 ) (蛋白質 核酸 酵素， 44: 1 038 - 1 042, 1 999 ) が存在することが予測され、 その配列 上の特色から新規なホスホリパーゼ A である可能性が推測された。

(新規配列のクローニング）

実際に、 上記解析で予測された新規 P 遺伝子配列を有する c D N Aをクローニングする目的で、 フォヮ一ドプライマ一として配列表の 配列番号 7 ( P r i m e r C ： 5 ' -CGCGGAT CC AT G T T G C TCAAA TG T T TACA TAAT— 3， ) または配列表の配列番 号 8 ( P r i m e r D ： 5¹ -CG CGGA TCCA TG AG AG T A TACA T T T T TC T T TG T— 3，）およびリバ一スプライマ一とし て配列表の配列番号 9 ( P r i m e r E ： 5 ' -AAAT AT GCG G CCGC T TA T G T G T TC T T TG G T G TACA T G T— 3 ')の 塩基配列のオリゴヌクレ才チドを組み合わせて、 ヒ卜の精巣由来の R Ν A (C 1 o n t e c h ) を用いて、 R T— P C Rした。 増幅された 2種 類の遺伝子断片 （約 1 . 7 k b p) を、 各々プラスミ ド p FA S T B a c 1 (ライフテックオリエンタル社） のマルチクローニングサイ 卜中の B amH I/N o t I制限酵素サイ 卜に組み込んだ後、 大腸菌 J M 1 0 9に卜ランスフエクシヨンし、 ポジティブクローンを選択して、 クロ一 ン化した。プラスミ ドを回収し、常法により塩基配列を確認した。なお、 配列表の配列番号 3の塩基配列のコ一ド領域 （s h o r t— t y p eに 相当） を有するプラスミ ド（pFASTBac- PAPLAlp)を受託番号 F E R M P 一 1 8072として、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センター （旧名称：工業技術院生命工学工業技術研究所） （住所：〒 305 - 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に 2000年 1 0月 5日付で寄託した。更に該プラスミドは、平成 1 3年（ 2001 ) 8月 8日付けで、 特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダぺ ス卜条約に従う国際寄託に移管され、 受託番号 F E RM B P— 769 7が付与されている。

この配列表の配列番号 3 ( s h o r t- t y p e ) または配列番号 4 ( l o n g— t y p e) に記載の c D N Aは、 配列表の配列番号 1 ま たは 2に記載の各々 460または 481アミノ酸残基からなる蛋白質を 暗号化可能な、 各々 1 380または 1 443塩基からなるオープンリー ディングフレームを含み、 少なくとも配列番号 3 ( s h o r t— t y p e) では N末端領域に、 シグナル配列と予想される領域を有していた。 アミノ酸配列的な特色としては、 ァスパラギングリコシレ一シヨンサイ 卜のモチーフである N - { P}一 [S T]一 {P}. を s h o r tおよび L o n g— t y p e共に 2個所ずつ （N (A s n ) 63— L ( L e u ) 66および N (A s n ) 396 - S ( S e r ) 399、 ならびに、 N (A s n ) 84— L ( L e u) 87および N (A s n) 4 1 7 - S ( S e r ) 420 )) 有していた。

(既存蛋白質との相同性）

塩基配列の翻訳によって予想されるアミノ酸配列を用いて、 既存のデ —夕ベース （G e n b a n k) に対して t b l a s t nを用いたホモ口 ジ一サーチを実施した。 その結果、 本発明の新規リパーゼ （新規 P L A ) (c o l o n 1 i p a s e ) はヒ卜 P S— P L A, ( h P S - P L A ）、膊臓型リパーゼ （ h u m a n p a n c r e a t i c l i p a s e )、 肝臓型リパ―ゼ （ h e p a t i c l i p a s e )、 リポプロテ インリパーゼ（ l i p o p r o t e i n l i p a s e )、脬臓リパ一ゼ 関 ½蛋白質 1 (, p 1 r p 1 ； p a n c r e a t i c l i p a s e r e l ated p r o t e i n 1 ) および 2 (p 1 r p 2 ; pan c r e a t i c l i pas e r e l ate d p r o t e i n 2 ) と有意な相同性を示した。 その他、 立体構造的にリパーゼと相同性が高 い領域があるとされるビテロジェニンとの相同性も高かった。 これらの 相同性が高かつた既知蛋白質配列のうちビテロジェニンを除く上記各蛋 白質において、 酵素活性トライアドと予測されるアミノ酸残基 （本発明 の s ho r tおよび 1 o n g— t y p eのポリべプチドにおいては、 S ( S e r ) 1 59、 D (A s p) 1 83、 H (H i s) 253および S ( S e r ) 1 80、 D (A s p) 204、 H (H i s) 274 ) がすべ て保存されているのが確認されたので、 これらの配列を G E N E T Y X M u 1 t i p 1 e A 1 i g nme n tモジュール （ソフ トウェア開発 株式会社） を用いて、 マルチプルアラインメントを解析した。 その結果、 配列表の配列番号 1および 2のアミノ酸配列においては、 図 1に示すように、 共にリパーゼファミリ一に保存されているコンセン サス配列 GX SXG (G (G 1 y ) 1 57— G ( G 1 y ) 1 61および G (G 1 y ) 1 78— G ( G 1 y ) 1 82)、 I TG L D (I (l i e) 1 79— D (As p) 1 83および I (l i e) 200-D (As p) 204 ) および C X H (C (C y s ) 251 - H (H i s) 253およ び C (Cy s) 272— H (H i s) 274) (Xは任意のアミノ酸を示 す） が存在し、 これらには触媒活性卜ライア ドと考えられるアミノ酸残 基が全て含まれていることが判明した。 また、 立体構造的に活性卜ライ アドが存在するポケッ 卜の近傍に存在し、 リパーゼの活性発現を調節し ているリヅ ドと呼ばれるループ構造 （P (P r o) 239— K (L y s) 250および P (P r o) 260 -K (L y s) 271 ) が、 P S— P L A のそれと同じ残基数すなわち 1 2個存在することが判明した。 通 常、 P S— P LA，以外のリパーゼ群は、 リツ ド構造のアミノ酸残基数 が長く、 コリパーゼと呼ばれる蛋白性の因子が結合することによって活 性が発現されることが知られている （B. B. A., 1 376, 41 7— 432, 1 998) (B i o c h em i s t r y， 32， 4702— 47 07， 1 993 ) (蛋白質 核酸 酵素， 44， 1 038 - 1 042, 1 999 ) が、 比較的リヅ ドが短い P S - P L A については、 コリパー ゼの必要性は、 現在まで明らかにされていない。 従って、 今回得た塩基 配列から翻訳される蛋白質も、 P S— P L A，に似た機構で活性を発現 する可能性も予測される。 次に、 G E N ETYX Evo l u t i o na l t r e e (U P G MA me t ho d) モジュール （ソフ トウェア開発株式会社） によつ て、 Pし A リパーゼファミリーについて配列の進化的な系統樹を予測 した。 その結果、 新規配列は、 P S— P L A，と最も進化的に近い配列 であることが推測された。 以上のことから、 新規配列が翻訳された蛋白 質は、 リパーゼ群に近く、 特にホスホリパ一ゼに近縁な新規リパーゼで あることが推測された。

(発現組織の確認）

新規 P L A，の発現組織を調べる目的で、 ヒ 卜正常組織に対してノザ ンブロッテイ ングを行った。 オープンリーディングフレーム内の c D N A断片である約 0. 5 k b pの PC R断片をプローブとして用いた。 す なわち、 P C Rプライマ一として、 配列表の配列番号 1 0に記載の AAAAACACCAGAAAAGTTGCTGTGAG (フォワー ドプライマ—配列 ：配列番号 3 の塩基配列の塩基番号 493— 51 8に相当） および配列表の配列番号 1 1に記載の GCTTGATAACCCAGCCGAGGACATG (リバースプライマ一配列 ： 配列番号 3の塩基配列の塩基番号 1 001— 1 025の相補鎖に相当） の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドを合成し、 PC Rをおこなう ことにより ³² P標識プローブを調製した。 ノザンブロッテイングは、 H uman Mu l t i p l e T i s s u e N o t h e r n B 1 o t (C I o n t e c h ) を用いてユーザ一マニュアル （ P T 1 200 - Κ C 1 ο η t e c h) に従って実施した。 その結果、 検討した正常組 織 （心臓、 脳、 胎盤、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 滕臓、 脾臓、 胸腺、 前 立腺、 精巣、 卵巣、 小腸、 結腸、 白血球） においては、 精巣において m R Aの高い発現が認められた。

(L P A受容体との関係）

本発明の新規 P LA は、 P Aに作用して加水分解し、 2—ァシル L P Aを産生する P L A （特願平 1 1— 1 87089) と最も高いアミ ノ酸配列上の相同性 （約 45%) を示したことから、 同榛の活性を有す る可能性が考えられた。 従って、 新規 P L A，は、 生体内での機能とし て、 L P Aを生産して L P A受容体にリガンドとして供給している可能 性がある。 L P A受容体は、 E DG 2、 EDG4、 および EDG 7が知 られているが、 中でも EDG7は、 不飽和脂肪酸を含む L PAに対し強 い反応性を示し、 1— ac y —L PAより 2— ac y l— L P Aに強 く反応するユニークな受容体であり、 そのリガンド特異性は E D G 2、 E DG4とは異なる （J . B o l . Ch em., 274, p p 2777. 6 - 27785, 1 999 )。 E DG 7を介するシグナル伝達には何らか の P L A，反応が関与することが予想されるので、新規 P L A，と E D G 7の生体組織における発現をノザンプロッティング法により調べたとこ ろ、 両方の m R NAが精巣によく発現していた。 次に、 新規 P L A が P Aを加水分解して L P Aを産生し、 E D G 7 にリガンドとして供給する可能性について検討した。 図 3に示すバイオ アツセィ系を用いて、 L P Aが新規 P L によって生産され得るか検 討をおこなった。 バイオアツセィ系には、 L P Aへの反応性を欠く昆虫 細胞 S f 9を使用した。 S f 9細胞に、 新規 P L を上記のバキュ口 ウィルス系を用いて発現させた（以下、酵素側と呼ぶこともある）。すな わち、 上記でクローン化した組換 p FAST Bacプラスミドを、 D H 1 0 BAC^TMコンビ一テントセル （G I BCO B R L) に卜ランスフ ェクシヨンし、 組換え B a c m i dを回収した。 得られた B a c m i d は、 Ce l 1 F ECT I N^TMとともに Sf 9細胞 （夜盗蛾 S p o d o p t e r a f r u g i pe r d aさなぎ卵巣組織由来） に卜ランスフエ クシヨンした。 その結果、 組換え型バキュロウィルス （B a c u 1 o V i r u s ) が培養上清中に回収された。 回収した組換ウィルスを感染さ せることにより新規 P L A 1を発現する S f 9細胞を得た。 また、 L P A受容体である E DG 7を、 J . B i o l . C h em., 274, p p 2 7776-27785, 1 999に記載の方法に準じてバキュロウィル ス系を用いて S f 9細胞に発現させた （以下、 受容体側と呼ぶこともあ る）。 この系においては、 新規 P L A，が十分に発現されて L P Aが産生 されれば、 L P A受容体を発現している細胞に L P Aが結合して細胞内 シグナル伝達が惹起され、 カルシウムイオン （Ca^{2 +} )の細胞内濃度が 上昇する。 すなわち、 新規 P LA の i n v i t r oでの L PA産生 とその作用を、 C a ^{2 +}の濃度変化を検出することにより、 検討すること ができる。 C a ²⁺濃度変化の測定は、 C a²⁺蛍光指示薬 F u r a— 2を 用いて行った。 まず、 L P A受容体を発現させた S f 9細胞を S f 9力 ルシゥムアツセィ用栄養液 （ 1 0 mM C a C 1_2J 60 mM KC 1， 1 7 mM M g C 1₂ , 1 0 mM N a C 1 , 1 0 m M ME S， 4m M グルコース， 1 1 OmM シュ一クロース， 0. 1 %ゥシ血清アル ブミン） に 5 X 1 0⁵細胞 Zm 1 となるように懸濁し、 2 M F u r 32—八1^1を 27°0で 1時間取り込ませた。 その後、 上記栄養液で 2回 洗浄後、 上記栄養液中に 5 x 1 0⁵細胞/ m l となるように懸濁した。 新規 P L A，を発現させた S f 9細胞は、上記栄養液に 5 X 1 0⁵細胞/ 50^ 1 となるように懸濁し、 30分間培養した。 キュべッ ト中に上記 で調製した L PA受容体発現細胞を 1 m l加え、 マイクロスターラーで 撹拌しながら 340 n mおよび 380 n mの励起光をあて、 それぞれの 500 n mでの蛍光強度とその比を、 C A F— 1 1 0型細胞内イオン測 定装置 （日本分光工業株式会社） により測定した。 これに新規 P L A 発現細胞を 50 Ί加えて同様に測定を行った。 また、 それぞれの測定 時に、 T r i t o n— X 1 00を添加して全 F u r a 2と細胞外 C a^{2 +} が結合した時の値と、 E G T Aを加えて全 C a^{2 +}がキレ一 卜されて F u r a 2が解離した時の値を同様に測定した。 上記各測定値を用いて、 下 記式により、 細胞内カルシウム濃度を算出した。

[C a ²⁺] ( n M ) = 224 x b/ax ( F - F m i n ) / ( Fma x 上記式において、 224は F u r a 2の解離定数、 aは T r i t o n X- 1 00を加えて全 F u r a 2と細胞外 C a^{2 +}が結合した時の 38 0 n m励起光による蛍光強度、 bは EG T Aを加え全 C a ^{2 +}がキレ一卜 されて F u r a 2が解離した時の 380 n m励起光による蛍光強度、 F は 340 nm励起光による蛍光強度ノ 380 nm励起光による蛍光強度 の比、 F ma xは T r i t o n X— 1 00を加えて全 F u r a 2と細胞 外 C a^{2 +}が結合した時の F、 F m i nは E G T Aを加え全 C a ^{2 +}がキレ —卜されて F u r a 2が解離したときの Fである。 その結果、 E D G 7を発現させた S F 9細胞に、 新規 P L A 発現 S f 9細胞の培養上清を加えると細胞内 C a ² +濃度の上昇が観察された (図 4 A )。 この現象は、受容体側または酵素側を野生型（w i 1 d— t y p e) バキュロウィルスで感染させた細胞に変えた場合には観察され なかった。 以上のことから、 新規 P L A は細胞内で内在性の P Aを基 質として加水分解して L P Aを産生し、 L P. A受容体である E D G 7を 発現している細胞に作用していることが示唆された。

(新規 P L A ,が媒介する L P A産生における P L Dの関与）

膜リン脂質を P Aに変換するホスホリパーゼ D ( P L D) は、 卵巣癌 細胞による L P A産生においても関与している。 新規 P L A，による L P A産生における P L Dの役割を見出すために、 上記の新規 P L A 1発 現 S f 9細胞を放線菌由来の P L Dで処理し、 30分後の培養上清を回 収した。 この培養上清をし P A受容体 E DG 7発現 S f 9細胞に作用さ せ、 細胞内カルシウムを上述のように測定した。 その結果、 P L Dを処 理しない場合に比べてより低濃度で細胞内 C a応答を誘導した。 すなわ ち、 新規 し八，は L PA (おそらく 2— a c y l — 1 — 1 y s o PA) を P L Dの活性化との協同作用により産生するものと考えられた。 產業上の利用可能性

本発明は、 P L A， リパーゼファミリ一に属する新規 P L A，を提供す るものである。 新規 P LA，はホスファチジン酸 （ P A) に対する基質 特異性を有する細胞結合性の糖蛋白質であり、 P Aを加水分解してリゾ ホスファチジン酸（ L P A)を産生させるものである。さらに本発明は、 新規な P A特異的リパーゼ （P L による細胞における L P A產生 と、 L P A受容体である E D G 7への細胞からの L P Aの受け渡し機構 の存在を見出したことにより、 P L A ファミリ一の生理的意義、 L P A受容体のリガンドを産生する機構を解明する手がかりを提供するもの であり、 この知見を利用した新規医薬組成物、 診療手段の提供は、 リバ ーゼ関連の臨床ならびに基礎の医用領域において大きな有用性を提供す る

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 下記の群より選ばれるポリペプチド；

①配列表の配列番号 1 または 2に記載のアミノ酸配列で示されるポリぺ プチド、 .

②前記①のポリべプチドを含有するポリべプチド、

③前記①のポリべプチドと少なくとも約 7 0 %のアミノ酸配列上の相同 性を有しかつホスファチジン酸を分解する活性を有するポリべプチド、 および

④前記アミノ酸配列において 1 ないし数個のアミノ酸の欠失、 置換、 付 加あるいは挿入といった変異を有し、 かつホスファチジン酸を分解する 活性を有するポリべプチド。

2 . 配列表の配列番号 1 または 2に記載のアミノ酸配列の、 少なくとも 約 8個の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。

3 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリべプチドまたはべプチ ドをコ一ドするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。

4 . 請求の範囲第 3項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖と選 択的な条件下でハイプリダイゼ一ションするポリヌクレオチド。

5 . 配列表の配列番号 3または 4に記載の塩基配列またはその相補的配 列の、 少なくとも約 1 5個の連続する塩基配列で示されるポリヌクレオ チド。

6 . 請求の範囲第 3項ないし第 5項に記載の何れかのポリヌクレオチド を含有する組換えベクター。

7 . 請求の範囲第 6項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転 換体。

8 . 請求の範囲第 7項に記載の形質転換体を培養する工程を含む、 請求 の範囲第 1項または第 2項に記載のポリべプチドまたはべプチドの製造 方法。

9 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリべプチドまたはべプチ ドを免疫学的に認識する抗体。

1 0 . ホスファチジン酸を分解する活性を抑制する、 請求の範囲第 9項 に記載の抗体。

1 1 · 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドと相互作用してその活性 を阻害もしくは活性化する化合物、 および/または請求の範囲第 3項も しくは第 4項に記載のポリヌクレ才チドと相互作用してその発現を阻害 もしくは促進する化合物の同定方法であって、 請求の範囲第 1項または 第 2項に記載のポリべプチドもしくはべプチド、 請求の範囲第 3項ない し第 5項に記載の何れかのポリヌクレオチド、 請求の範囲第 6項に記載 のベクター、 請求の範囲第 7項に記載の形質転換体、 請求の範囲第 9項 もしくは第 1 0項に記載の抗体のうち、 少なくとも何れか一つを用いる ことを特徴とする方法。

1 2 . 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドと相互作用してその活性 を阻害もしくは活性化する化合物、 または請求の範囲第 3項もしくは第 4項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは 促進する化合物の同定方法であって、 化合物とポリべプチドまたはポリ ヌクレオチドとの間の相互作用を可能にする条件下で、 ポリべプチドま たはポリヌクレ才チドとスクリ一ニングすべき化合物とを接触させて化 合物の相互作用を評価し （かかる相互作用はポリペプチドまたはポリヌ クレオチドと化合物との相互作用に応答した検出可能シグナルを提供し 得る第 2の成分に関連したものである）、次いで、化合物とポリべプチド またはポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在また は不存在またはその変化を検出することにより、 化合物がポリべプチド またはポリヌクレオチドと相互作用して、 その活性を活性化または阻害 するかどうかを決定することを含む方法。

1 3 . 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第 3項 もしくは第 4項に記載のポリヌクレオチドの活性または生理学的作用を 阻害もしくは活性化する化合物の同定方法であって、 請求の範囲第 7項 に記載の形質転換体と、 該形質転換体中で発現される請求の範囲第 1項 に記載のポリべプチドがホスファチジン酸に作用することにより生産さ れるリゾホスファチジン酸に対する受容体を発現させた別の形質転換体 とを用い、化合物とこれら形質転換体の相互作用を可能にする条件下で、 これら形質転換体とスクリ一二ングすべき化合物とを接触させて化合物 の相互作用を評価し （かかる作用は形質転換体と化合物との相互作用に 応答した検出可能シグナルを提供し得る第 2の成分に関連したものであ る）、次いで、化合物と形質転換体との相互作用により生じるシグナルの 存在または不存在またはその変化を検出することにより、 化合物がポリ ぺプチドまたはポリヌクレオチドの活性または生理学的作用を、 活性化 または阻害するかどうかを決定することを含む方法。

1 4 . 請求の範囲第 1 1項ないし第 1 3項に記載の方法で同定される化 合物。

1 5 . 請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドと相互作用してその活性 を阻害もしくは活性化する化合物、 または請求の範囲第 3項もしくは第 4項に記載のポリヌクレ才チドと相互作用してその発現を阻害もしくは 促進する化合物。

1 6 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリペプチドもしくはべ プチド、 請求の範囲第 3項ないし第 5項に記載の何れかのポリヌクレオ チド、 請求の範囲第 6項に記載のベクタ一、 請求の範囲第 7項に記載の 形質転換体、 請求の範囲第 9項もしくは第 1 0項に記載の抗体、 または 請求の範囲第 1 4項または第 1 5項に記載の化合物のうち、 少なくとも 何れか一つを含有することを特徴とする医薬組成物。

1 7 . 個体における請求の範囲第 1項に記載のポリペプチドの発現また は活性に関連した疾病の診断方法であって、 （ a )該ポリペプチドをコー ドしている核酸配列、 および/または （ b ) 個体由来の試料中の該ポリ ぺプチドをマ一カーとして分析することを含む方法。

1 8 . 請求の範囲第 1 6項に記載の医薬組成物をホスホリパーゼ ，に 関連する疾患に用いることを特徴とする治療方法。

1 9 . 請求の範囲第 1 6項に記載の医薬組成物の製造方法 S