„Entzündungshemmende Wirkstoffe'
Die Erfindung betrifft die Verwendung von bicyclischen Diterpen-Verbindungen mit Labdan-Struktur als entzündungshemmende Wirkstoffe zur Herstellung von therapeutischen Zubereitungen zur Hemmung entzündlicher Prozesse und als entzündungshemmende Komponente in kosmetischen Zubereitungen zur Behandlung der Haut und der Schleimhaut.
Entzündungen sind gekennzeichnet durch Rötung, Wärmeentwicklung, Schwellung und Schmerz als Folge der gestörten Organfunktion, der Vasodilatation, der erhöhten Gefäßpermeabilität und der chemotaktischen oder toxischen Wirkung der dabei im Gewebe freigesetzten Mediatoren.
Entzündungshemmende Stoffe haben eine überragende Bedeutung sowohl bei der therapeutischen Behandlung vieler Krankheiten als auch in kosmetischen Produkten, in denen sie neben der antiphlogistischen auch antiallergische, hautberuhigende und schmerzlindernde Wirkungen haben. Eine herkömmliche Methode zur Behandlung von Entzündungen besteht in der Verwendung von Glucokortikoiden und deren Derivaten, welche der Bildung der für den Entzündungsprozess wichtigen Arachidonsäure durch Hemmung des Enzyms Phospholipase A2 entgegenwirken. Dabei treten jedoch auch unerwünschte Nebenwirkungen auf.
Zur Vermeidung solcher Kortikoid-Nebenwirkungen hat man auch schon solche Stoffe verwendet, die in der Lage sind, den anschließenden enzymatischen Arachidonsäureabbau zu blockieren, der zur Bildung der am Entzündungsprozess beteiligten Mediatoren, z.B. Bradykinin, Serotonin, Prostaglandine, Leukotriene, Histamine und Sauerstoffradikale führt.
Eine besondere Rolle spielen unter diesen Metaboliten der Arachidonsäure die Leukotriene und Prostaglandine. Durch die Hemmung eines oder der beiden Isoenzyme der Cyclooxygenase, nämlich der Cyclooxygenase 1 und/oder der Cyclooxygenase 2, kann man z.B. die Bildung der Prostaglandine hemmen und auf diese Weise Entzündungen therapieren. Auch Inhibitoren der 5-üpoxygenase, die der Bildung von Leukotrienen entgegenwirken, sind als entzündungshemmende Wirkstoffe beschrieben worden.
A.T.P. Ammon u.a. (Deutsche Apothekerzeitung, 136. Jahrgang (1996), Nr. 22, Seiten 17 bis 30) haben gezeigt, daß die bekannten entzündungshemmenden Wirkstoffe der Kamille, insbesondere Apigenin, Chamazulen und Bisabolol wirksame Inhibitoren der 5-Lipoxygenase sind und auf diese Weise der Bildung von Leukotrienen entgegenwirken.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, weitere hochwirksame Inhibitoren der 5-Lipoxygenase und/oder der Cyclooxygenase aufzufinden und für solche Stoffe ein neues Anwendungsfeld zu erschließen.
Aus WO 96/20704 A1 war bekannt, daß (+)-Sclareolid ein wirksamer Inhibitor für Zellproliferationen ist und daher zur therapeutischen Behandlung von Fibröse, gutartiger Prostatahyperplasie, Arteriosklerose, Psoriaris und anderer proliferativer oder karzinomer Krankheiten geeignet ist.
In WO 99/63978 A1 ist ein Verfahren zur Behandlung mikrobieller Infektionen mit sclareolähnlichen Verbindungen beschrieben, das die antibakteriellen und fungiziden Eigenschaften dieser Stoffe nutzt.
5-Lipoxygenase oder Cyclooxygenase hemmende oder antiphlogistische Eigenschaften des Sclareols oder anderer Diterpenoide mit Labdan-Struktur sind aus diesen Dokumenten nicht bekannt.
Es wurde nun gefunden, daß Sclareol und andere Verbindungen, die eine vom Labdan abgeleitete Struktur aufweisen, sehr wirksame Inhibitoren der 5- Lipoxygenase und/oder der Cyclooxygenase, und zwar einer oder beider Isoformen der Cyclooxygenase, sind und somit entzündungshemmende Eigenschaften aufweisen.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Diterpen-Verbindungen mit Labdan-Struktur als entzündungshemmende Wirkstoffe zur Herstellung von therapeutischen Zubereitungen zur Hemmung von entzündlichen Prozessen.
Unter Diterpenoiden mit Labdan-Struktur werden dabei solche Verbindungen verstanden, die ein bicyclisches Decahydro-1 ,1 ,4a,6-tetramethylnaphthalin- Grundgerüst aufweisen. Solche Verbindungen sind z.B. im Dictionary of Terpenoids, Vol. 2 (J.W. Conolly, R.A. Hill) unter den Nummern Di-00145 bis Di- 00526 (Labdane, Secolabdane, Norlabdane) aufgeführt.
Besonders bevorzugt geeignete Diterpenoide sind
- das dort unter der Nummer Di-00428 aufgeführte 14-Labdane-8,13-diol, dessen (8α, 13 S)-Form als Sclareol, dem Hauptbestandteil des Muskateller Salbeiöls (Salvia sclarea) bekannt ist,
- das unter der Nr. Di-00522 aufgeführte 13, 14,15, 16-Tetranor-12,8-labdanolid, dessen (δα)-Form als Norambreinolid (bzw. Sclareolid) bekannt ist,
- das unter der Nr. Di-00503 angegebene 8,12-Epoxy-13,14,15,16- tetranorlabdane, dessen (δα)-Form als Ambroxan bekannt ist und
- die Verbindung 13,14,15,16-Tetranorlabdane-8α,12-diol (CA-Registriemummer 38419-75-9), die als Ambroxdiol bekannt ist.
Zahlreiche Diterpernoide mit Labdan-Struktur sind Riechstoffe oder Aromen und kommen als Bestandteile natürlicher ätherischer Öle vor. Die erfindungsgemäße
Verwendung bezieht sich daher nicht nur auf die chemisch reinen Diterpenoide, sondern auch auf solche ätherischen Öle, die diese Diterpenoide mit Labdan- Struktur in solchen Mengen enthalten, die eine antiphlogistische Wirkung entfalten können.
Nach Angaben in Drug and Cosmetic Industry, Jan. 1975, Seiten 34, 35 und 93,94 enthält ein absolutes Muskateller Salbeiöl ca. 0.9 Gew.-% eines Petrolether- Extrakts, aus dem mit Ethanol ca. 50-80 Gew.-% eines absoluten Extrakts gewonnen werden, der ca. 42 Gew.-% Sclareol enthält.
Zubereitungen zur Hemmung von entzündlichen Prozessen dienen einerseits therapeutischen Zwecken, wobei die entzündlichen Prozesse sowohl chronische Entzündungen (z.B. rheumatische Arthritis, Asthma, Psoriasis, chronische Polyarthritis, diabetische Spätschäden, Autoimmunerkrankungen, z.B. Morbus Crohn) als auch akute Entzündungen (z.B. bei Transplantationen, Metastasierungen bei Krebs) sein können. Die Behandlung mit dem 5- Lipoxygenase-Inhibitor kann parenteral oder topisch erfolgen.
Von besonderem Interesse ist vor allem die topische Applikation der erfindungsgemäß geeigneten Diterpene mit Labdan-Gerüst als entzündungshemmende Komponente in kosmetischen Zubereitungen zur Behandlung der Haut und der Schleimhäute. Kosmetika sollen nämlich nicht nur keine hautreizenden oder allergisierenden Komponenten enthalten, sondern sie sollen bei Anwendung auf gereizter und geröteter Haut eine hautberuhigende und entzündungshemmende Wirkung entfalten. Dies trifft vor allem für solche kosmetischen Hautbehandlungsmittel zu, die z.B. vor oder nach einer Belastung mit UV-Strahlung oder anderen Streßfaktoren auf die Haut aufgebracht werden. Hierzu gehören nicht nur Sonnenschutzmittel oder „After-Sun"-Zubereitungen, sondern auch Pflegecremes, die nach stärkerer mechanischer oder chemischer Beanspruchung der Haut angewendet werden, Antitranspirantien, die adstringierende, eiweißkoagulierende Salze enthalten und dadurch bei empfindlichen Verwendern zu Hautirritationen führen können, Haarnachbehandlungsmittel, die nach oxidativen oder reduktiven
Haarbehandlungen (Färbung, Dauerwelle) angewandt werden und die eventuelle Irritationen der Kopfhaut vermindern sollen. In Mund- und Zahnpflegemitteln können die Diterpene mit Labdan-Struktur zur Bekämpfung der chronischen Zahnfleischentzündung (Parodontitis) und akuter Entzündungen der Mundschleimhaut verwendet werden.
Die 5-lipoxygenasehemmende Wirkung wurde an menschlichen Granulocyten bestimmt. Dabei wurde eine ca. 50%ige Hemmung der 5-Lipoxygenase-Aktivität bei Konzentrationen von 1 bis 10 μg/ml und eine maximale Hemmung bei 30 bis 100 μg/ml entsprechend einer Konzentration von 0,03 bis 0,01 Gew.-% ermittelt.
Die inhibierende Wirkung auf die Cyclooxygenase wurde an menschlichen Blutplättchen anhand der Inhibierung der 12-Hydroxyheptatriensäure bestimmt. Dabei wurde eine 50%ige Hemmung bei einer Konzentration von 12,3 μg/ml Sclareol beobachtet.
Für die erfindungsgemäße Verwendung bedeutet dies für Sclareol, Sclareolid, Ambroxan und Ambroxdiol z.B., daß diese als Wirkstoffe in einer Menge von mehr als 0.001 Gew.-% bezogen auf die Zubereitung, eingesetzt werden. Bevorzugt sollten die erfindungsgemäß geeigneten entzündungshemmenden Diterpenoide mit Labdan-Struktur in einer Konzentration von mehr als 0,01 Gew.-% in den Zubereitungen enthalten sein.
Als Träger für die entzündungshemmenden Diterpenoide eignen sich alle physiologisch verträglichen Systeme, in denen die Terpenoide löslich sind oder sich gleichmäßig dispergieren lassen. Solche Systeme sind z.B. Salben, Öl-inWasser- oder Wasser-in-ÖI-Emulsionen physiologisch verträglicher Öle oder Fette, z.B. von Pflanzenölen, Liposomendispersionen, Mikroemulsionen oder Gele.
Für topische oder kosmetische Anwendungen können darüber hinaus auch Stiftpräparate, Aerosol-Sprays oder Puder als Träger dienen. In der kosmetischen Anwendung kommt den erfindungsgemäß geeigneten entzündungshemmen
Diterpenoiden vor allem für Sonnenschutzmittel eine besondere Bedeutung zu, da sie die durch übermäßige Lichteinwirkung verursachten entzündlichen Vorgänge des beginnenden Sonnenbrands wirksam lindern können. In solchen Mitteln werden die entzündungshemmenden Komponenten bevorzugt mit Lichtschutzmitteln kombiniert.
Eine besonders bevorzugte Ausführung der Erfindung sind daher kosmetische Zubereitungen mit einem Gehalt an Lichtschutzmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,01 bis 5 Gew.-% an entzündungshemmenden Diterpenoiden mit Labdan-Struktur, insbesondere aus der Gruppe Sclareol, Sclareolid, Ambroxan und Ambroxdiol oder eines Gemisches davon in einem geeigneten kosmetischen Träger enthalten.
Als Lichtschutzmittel können organische UV-Filtersubstanzen oder anorganische UV-Blocker eingesetzt werden. Geeignete UV-Filtersubstanzen sind z.B. Salicylate wie z.B. Homomenthylsalicylat, 2-EthylhexylsaIicylat, Menthylsalicyiat, Zimtsäureester wie z.B. 2-Ethylhexyl-p-Methoxycinnamat, 2-Ethoxyethyl-p- Methoxycinnamat, p-Methoxyzimtsäure-Diethanolammoniumsalz, Ethyl-4-bis(2- hidroxypropyl)-aminobenzoat, Glycerin-1 -(4-aminobenzoat), Menthyl-o- aminobenzoat, Octyl-dimethyl-p-aminobenzoat, p-Aminobenzoesäure, 2-Hydroxy- 4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure, 2,2'- Dihydroxy-4-methoxybenzophenon, 2,2',4,4'-Tetrahydroxybenzophenon, 2,2'-4- Dihydroxy-4,4'-dimethoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-octoxybenzophenon, 2- EthylhexyI-2-cyano-3,3-diphenylacrylat, 2-Phenyl-benzimidazol-5-sulfonsäure, 3- (4'-Methylbenzylidene)-campher, 1-p-Cumyl-3-phenylpropan-1 ,3-dion, 4-tert.Butyl- 4'-methoxydibenzoylmethan oder Benzoesäure-4,4',4"-(1 ,3,5-trianzin-2,4,6- triyl(triimino)-tris-(2-ethylhexyl)-ester.
Anstelle oder zusätzlich zu den organischen UV-Filtersubstanzen können auch feinteilige Metalloxide, z.b. Titandioxid, Zinkoxid, oder Aluminiumoxid, bevorzugt mit einer Teilchengröße von weniger als 500 nm, besser noch mit einer Teilchengröße von weniger als 100 nm, als sogenannte UV-Blocker enthalten sein.
Als kosmetische Träger eignen sich Öle, Lotionen, Emulsionen, Liposomen- Dispersionen, Cremes, Gele, Stifte, Zahnpasta, Mundwasser, Puder, Pump- Sprays oder Aerosolpräparate. Zur Herstellung solcher Träger werden die dafür gebräuchlichen Hilfsmittel in üblicher Weise eingesetzt. Die erfindungsgemäß geeigneten entzündungshemmenden Diterpenoide befinden sich dabei in der Ölphase gelöst oder auf Pulverkomponenten adsorbiert. Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der Erfindung näher erläutern:
Beispiele
1. Bestimmung der 5-Lipoxygenase-Hemmung 1.1 Methodik
(Nach Werz et a\., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1997, Vol. 356, pp 441-445):
Die 5-Lipoxygenase katalysiert die Umsetzung von Arachidonsäure zu Leukotrienen. Leukotriene sind Mediatoren in entzündlichen und allergischen Reaktionen von Granulozyten, Mastzellen, Monozyten und Macrophagen. Auch in den Keratinozyten der Haut werden Leukotriene bei entzündlichen Reaktionen gebildet. Inhibitoren der Leukotrien-Synthese können demnach eine entzündungshemmende bzw. hautberuhigende Wirkung haben.
Zur Prüfung der 5-Lipoxygenase-Hemmwirkung werden menschliche Leukämie- Zell-Linien durch Zugaben von DMSO, TGFßl (transforming growth factor ß1) und Dihydroxyvitamin D3 differenziert und dabei zugleich die 5-Lipoxygenase induziert. Nach 4 Tagen im Differemzierungsmedium werden die Zellen geerntet, in einem Glucose-haltigen PBS-Puffer aufgenommen und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Größere Zellbestandteile werden bei 10 000 g abzentrifugiert, wobei 5-Lipoxygenase im Überstand verbleibt. Dem Überstand werden ATP und die zu testenden Stoffe zugesetzt.
Es wurden Konzentrationen von 1 μg, 3 μg, 30 μg, 100 μg und 300 μg der Prüfsubstanzen pro ml Überstand eingesetzt. Als Lösungsmittel wurde Ethanol verwendet.
Die Ansätze wurden für 30 Sekunden bei 37 °C vorinkubiert und anschließend wurde die Lipoxygenase-Reaktion durch Zusatz von Arachidonsäure gestartet. Nach 10 Minuten Reaktionszeit wurde die Reaktion durch Zugaben von Methanol gestoppt und die entstandenen 5-Lipoxygenase-Produkte über HPLC quantifiziert.
Die Aktivität von 5-Lipoxygenase ohne Zugabe von Probe wurde zu 100 % gesetzt und die Aktivität der 5-Lipoxygenase mit Hemmstoff darauf bezogen. Unter Ergebnisse wird die Hemmwirkung der Proben in % angegeben.
1.2. Ergebnisse
Die Hemmwirkung der geprüften Substanzen bei einer Konzentration von jeweils 100 μg/ml Prüfsubstanz und der IC50-Wert sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Für die Substanzen Sclareol, Sclareolide und Ambroxan wurden Dosis-Wirkungs- Kurven (Abb. 1 bis 3) aufgenommen und der IC5o-Wert (Mindestkonzentration für eine 50 %ige Hemmwirkung) bestimmt.
2. Bestimmung der Cyclooxygenase-Hemmung
2.1 Methodik
Die Untersuchung der Inhibierung der Cyclooxygenase-1 (COX1 )-Aktivität wurde mittels der Bestimmung der 12-HHT-Freisetzung (12-Hydroxyheptade- catriensäure) aus menschlichen Blutplättchen durchgeführt. Dazu wurde Blutplasma durch Zentrifugation (800 g, 10 min, Raumtemperatur) gereinigt, der blutplättchenhaltige Überstand mit PBS-Puffer ( bei pH 5,9 im Volumenverhältnis 1 :1 versetzt und durch erneute Zentrifugation bei 2000 g (15 min, Raumtemperatur) pelletiert. Das Pellet wurde in PBS-Puffer / 0,9 Gew.-% NaCI im Volumenverhältnis 1 :1 resuspendiert durch Wiederholung des Zentrifugationsschritts (2000 g 15 min, Raumtemperatur) gewaschen und schließlich in PBS-Puffer resuspendiert.
108 Blutplättchen (resuspendiert in 1 ml PBS mit pH 7,4 mit zusätzlich 1 mg/ml Glucose und 1 mM CaCI2) wurden mit der zu testenden Verbindung zunächst 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 10 min bei 37 °C mit 2 μM lonophore A23187 (CAS-Nummer: 52665-69-7) und 20 μM Arachidonsäure inkubiert. Gestoppt wurde durch Zugabe von 1 ml Methanol und 30μl 1 N HCI. 200 ng Prostaglandin B1 als innerer Standard sowie 0,5 ml PBS wurden hinzugefügt und 10 min (800 g, Raumtemperatur) zentrifugiert. Im Überstand wurde die Menge des freigesetzten 12-HHTs mittels HPLC bestimmt.
Die Aktivität der COX1 ohne Zugabe von Probe wurde zu 100 % gesetzt und die Aktivität des Enzyms mit Hemmstoff darauf bezogen.
PBS-Puffer: Phosphate Buffer Saline, 10 mM K^PO^K HPO^ pH 5,9 mit 150 mM NaCI (nach Zusatz von 0,1 % Diethylpyrocarbonat autoklaviert, Maniatis, 1982)
2.2 Ergebnisse
Die Hemmwirkung der geprüften Substanzen bei einer Konzentration von jeweils 100 μg/ml Prüfsubstanz und der IC
50-Wert sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Für die Prüfsubstanz Sclareol wurde eine Dosis-Wirkungs-Kurve (Abb. 4) aufgenommen und der ICso-Wert (Mindestkonzentration für eine 50 %ige Hemmwirkung) bestimmt.
3. Anwendungsbeispiele
3.1 Lotion zur Hautberuhigung
Ölphase: Emulgade® SE 6,0 Gew.-% Lanette® O 1 ,5 Gew.-% Cetiol® 868 10,0 Gew.-% Cetiol® V 4,0 Gew.-% Sclareol 1 ,0 Gew.-%
Wässr. Phase: Glycerin (85 %ig) : 8,0 Gew.-%
Wasser (entsalzt) : 69,5 Gew.-%
3.2 Lichtschutzemulsion (O/W)
Ölphase: Paraffinöl 25,0 Gew.-% Cetylalkohol 2,0 Gew.-% Lanolin ahydr. 2,0 Gew.-% Arlacel® 165 2,0 Gew.-%
Oxynex® 2004 0,02 Gew.-% Eusolex® 8020 1 ,5 Gew.-% Eusolex® 6300 1 ,0 Gew.-% Sclareol 0,5 Gew.-%
Wässr. Phase: Sorbit (70 %ig) : 3,0 Gew.-% Glycerin 2,0 Gew.-%
PHB-Methylester 0,2 Gew.-% EDTA 0,02 Gew.-% Wasser (TEA bis pH = 7,2) ad 100 Gew.-%
Es wurden folgende Handelsprodukte verwendet:
Emulgade® SE Gemisch von Partialglyceriden, Fettalkoholen,
Fettalkohlethoxylaten und Wachsestern
Lanette® O Cetyl-/Stearylalkohol Cetiol® V Decyloleat Arlacel® 165 Glycerylstearat/PEG 100-Stearat-Gemisch Oxynex® 2004 BHT/Citronensäure/Ascorbylpalamitat-Gemisch Eusolex® 8020 4-lsopropyldibenzoylmethan Eusolex® 6300 4-Methylbenzyliden Campher