WO2002017891A2 - Verfahren zur diagnostik von neuronalen erkrankungen sowie zur behandlung der defizienten primären hämostase - Google Patents

Verfahren zur diagnostik von neuronalen erkrankungen sowie zur behandlung der defizienten primären hämostase Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a method for the diagnosis of neuronal diseases and for the treatment of deficient primary hamostasis. Furthermore, the invention relates to a method for suppressing the immune system, which u. a. is important for transplantation medicine and for the treatment of allergies. Areas of application of the invention are medicine and the pharmaceutical industry.
  • serotonin is a neurotransmitter u. a. to stimulate peristalsis, vasodilation or constriction (dose-dependent) and increase muscle tone in the respiratory tract. It is not only a neurotransmitter in the CNS, but also a compound found everywhere in the periphery, where serotonin was first discovered through its activity as a strong vasoconstrictor (Ra ⁇ port et al., J. Biol. Chem. 176: 1237, 1948).
  • serotonin plays a crucial role in primary hamostasis, i.e. the hemostasis.
  • the serotonin stored in platelets is released at vascular lesion sites, after which it interferes with the primary hamostasis (Holland, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 151: 32-39, 1976).
  • TPH tryptophan hydroxylase
  • the invention is therefore based on the object of improving the diagnosis of neuronal diseases of the type mentioned. Another task is to develop means for the treatment of deficient primary hamostasis and means for suppression of the immune system based on new knowledge of the effect of serotonin,
  • the invention is implemented according to the claims.
  • the invention is based on the essential discovery that serotonin is synthesized in the body by differently expressed TPH isoenzymes in the neurons and in peripheral tissues. Genetic targeting has shown that an isoform, the peripheral enzyme (also called TPH), is responsible for maintaining primary hamostasis and T-cell mediated immune responses. Another isoform, the newly identified neuron-specific TPH (called nTPH) synthesizes serotonin independently in the CNS. Furthermore, some mechanisms have been elucidated. It was found a) that the main step of serotonin in primary hamostasis is mediated by von Willebrand factor. Furthermore, it was found that b) the serotonin in the blood platelets is essential for the normal number of circulating CD4 + cells and for their normal activity and thus represents a new target for immunosuppressive treatment.
  • TPH peripheral enzyme
  • nTPH neuron-specific TPH
  • the invention primarily relates to inhibitors or promoters of the two TPH isoforms which can be used for the diagnosis of neuronal diseases and for the treatment of deficient primary hamostasis. Furthermore, the invention relates to the use of these inhibitors for suppression of the immune system, which u. a. is important for transplantation medicine and for the treatment of allergies.
  • the method is characterized by influencing the nTPH and / or TPH regulation and thus the targeted serotonin production in the body.
  • the peripheral TPH has been shown to be necessary for primary hamostasis and for the T cell mediated immune response, whereas the newly identified nTPH, which is independently expressed and synthesizes serotonin in the CNS, is responsible for the serotonergic effects in behavioral physiology. This opens up new pharmacological possibilities for immunosuppression and for therapeutic influencing of hamostasis.
  • the nTPH and / or TPH regulation is influenced in the following ways: Specific inhibitors of the peripheral TPH isoforms are developed, which are based on the molecular differences described in the TPH isoforms, and on the other hand also inhibitors which are not common in the blood-brain barrier are. Specific inhibitors for the TPH isoforms can be found in vitro using very simple standard screening methods, since the cDNAs obtained from the two isoforms can be used with the aid of expression systems for the targeted expression of the pure isoforms. In addition to the diagnostic benefit, these inhibitors also have therapeutic applications, because elevated serotonin levels in the blood are found in a variety of complications.
  • a side effect of antidepressants that block the serotonin transporter is the occurrence of acute bleeding episodes, apparently due to insufficient serotonin storage in the platelets of the treated Patients.
  • the platelet serotonin transporter is identical to the actual target of the antidepressants, the CNS serotonin transporter.
  • the antidepressants are usually discontinued, with the result that the patient's condition deteriorates and the risk of depression-related suicide increases. This does not have to happen if commercial Willebrand factor (vWF) is infused in such an acute bleeding episode.
  • vWF commercial Willebrand factor
  • CsA cyclosporin A
  • the immunosuppressive effect of reduced serotonin levels in the blood can be used to apply the toxic substances, CsA, FK506 and rapamycin in lower doses.
  • the nTPH and / or TPH regulation can be influenced in the following ways:
  • nTPH and / or pTPH takes place molecular-biologically with ribozymes, antisense oligonucleotides or by antisense RNA expression, the sequence differences of the isoform mRNAs permitting only one mRNA to be influenced in each case.
  • pharmacological approaches with the help of specific TPH inhibitors, such as. B. p-chlorophenylalanine or p-ethynylphenylalanine worked.
  • Serotonin production is stimulated from a molecular biological point of view by tissue-specific overexpression of the TPH isoforms; pharmacologically, for example, the predecessor substance, 5-hydroxytryptophan, or substituted analogues can be administered, but not least also serotonin itself.
  • the method according to the invention for the diagnosis of neuronal diseases is characterized in that a specific inhibition of peripheral serotonin biosynthesis is carried out, subsequently the metabolite concentrations originating from the CNS are determined and the degree of disease is determined on the basis of a comparison curve. To do this, it is necessary to use substances that are not blood-brain barriers.
  • the invention also relates to the newly found neuronal tryptophan hydroxylase (nTPH), which differs from the previously known TPH in the regulatory domain (the catalytic domain is identical).
  • nTPH has the amino acid sequence given in Fig. 9.
  • A Schematic representation of the targeting process. The first four of the 11 exons of the TPH gene are indicated.
  • the knockout construct was integrated into an allele of ES cells by homologous recombination, thereby inactivating the first coding exon of the TPH gene.
  • the integrated neomycin resistance cassette also contains a transcription stop sequence.
  • the positions of the analytical amplicons for wild type and knockout identification are given, as well as the positions of the internal and external Southern blot probes.
  • the Eco Rl sites that enable the identification of wild-type and knockout animals in Southern blots are highlighted in bold (RI). Restriction sites: RI: Eco RI; Hd: Hind III; Bm: Bam HI; Sc: Sac I.
  • Trp and 5-HT in whole blood and in duodenum samples from 129SvJ, C57BL / 6, TPH (- / -), and TPH (+ / +) mice. Nd: undetectable ( ⁇ 25 fg / ⁇ l). *: statistically significant compared to all other mouse lines (p ⁇ 0.05).
  • 5-HT is significantly reduced in the hippocampus of TPH (- / -) mice compared to TPH (+ / +) mice, but not compared to the other laboratory mouse lines.
  • TPH (- / -) mice Prolonged bleeding times of TPH (- / -) animals. Normal bleeding times from control animals are 8-11 min, whereas TPH (- / -) mice bleed for an average of 35 min.
  • FIG. 1 Exemplary view of rejection of secondary skin grafts.
  • Arrowheads mark the sensitizing first grafts, arrows the second grafts.
  • the grafts on TPH (+ / +) and C57BL / 6 animals are noticeable at the same time after the transplant due to lack of revascularization and inflammation at the wound edges (white rejection) , or have already been completely rejected (first graft and two of the second grafts on the C57BL / 6 tier).
  • the ORF is highlighted in bold in the trinucleotide notation. In the 5 'flanking area, part of the putative new promoter is shown, in which a TATA box and the most probable transcription start point (+1) are marked.
  • the splicing donor site of exon 2b is shown in the 3 'flanking region. Intron sequences were highlighted in lower case, with the short intron of 53 bp symbolically spanned by a line from the sections of the ORF. For the sake of clarity, the respective consensus sequences were given under the splicing donor sites, branching site and acceptor site involved.
  • variant A is the known form of the TPH-n RNA.
  • Variant A has already been cloned and encodes an active TPH isoform.
  • Variants C and C lead to the expression of only the regulatory domains. To simplify matters, the mRNAs are only shown up to the 6th exon out of the 11 exons.
  • the upper part of the sequences shows the new section of TPH.
  • the conserved sequence sections of the regulatory domains of the AAAHs are given below.
  • the sequences were compared individually using the ClustalW program, and then put together by hand. Larger gaps were sometimes allowed to highlight the matching structural elements.
  • Striking sequence motifs are framed and named individually. Four of the five motifs match elements of the PAH secondary structure. Partially overlapping with the IEDN motif, an area of the regulatory domain is framed and highlighted in gray, which extends into the furrow of the catalytic center, as is known from crystallographic studies by PAH. Further explanations in the text.
  • nstph neuron-specific TPH (the new variant) of the mouse
  • musth TH of the mouse
  • muspah and humpah murine and human PAH
  • ptph peripheral TPH of the mouse (known variant).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen sowie zur Behandlung der defizienten primären Hämostase. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Suppression des Immunsystems, was u.a. für die Transplantationsmedizin und für die Behandlung von Allergien von Bedeutung ist. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Die Erfindung wird gemäss den Asnprüchen realisiert. Der Erfindung liegt die wesentliche Entdechung zugrunde, dass Serotoninim Körper durch unterschiedlich exprimierte TPH-Isoenzyme in den neuronen und in peripheren Geweben synthetisiert wird. Es wurde durch Gentargeting gezeigt, dass eine Isoform, das periphere Enzym (weiterhin TPH genannt) für die Aufrechterhaltung der primären Hämostase und der T-Zell-vermittelten Immunantworten verantwortlich ist. Eine weitere Isoform, das neu identifizierte neuronenspezifische TPH (als nTPH bezeichnet) synthetisiert Serotonin unabhängig davon im ZNS. Gegenstand der Erfindung ist auch die neu gefundene neuronale Tryptophan-Hydroxylase (nTPH), die sich von der bisher bekannten TPH in der regulatorischen Domäne unterscheidet.

Description

Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen sowie zur Behandlung der
H de'ffiΪz7iiαeιn-i'tf-αe'nn n primmäärrpenn HTäaimrinocs'tf'aQcsαe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen sowie zur Behandlung der defizienten primären Hamostase. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Suppression des Immunsystems, was u. a. für die Transplantationsmedizin und für die Behandlung von Allergien von Bedeutung ist. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Mehrere Verhaltensstörungen wie Depressionen, Alkoholismus, Drogenmißbrauch, Schlaf- und Ernährungsstörungen sind eng verbundene Störungen des zentralen Nervensystems. Das Gewebehormon Serotonin spielt auf vielen Ebenen eine wesentliche Rolle. So ist Serotonin ein Neurotransmitter u. a. zur Anregung der Peristaltik, der Vasodilatation bzw. - konstriktion(dosisabhängig) und der Muskeltonussteigerung im Atmungstrakt. Es ist nicht nur ein Neurotransmitter im ZNS, sondern auch eine überall zu findende Verbindung in der Peripherie, wo Serotonin zuerst durch seine Aktivität als starker Gefäßverenger entdeckt wurde(Raρport et al., J. Biol. Chem. 176: 1237, 1948).
Außerdem spielt Serotonin eine entscheidende Rolle in der primären Hamostase, also der Blutungsstillung. Das in Blutplättchen gespeicherte Serotonin wird an Stellen vaskulärer Läsion ausgeschüttet, wonach es in die primäre Hamostase eingreift (Holland, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 151: 32-39, 1976).
Weiterhin vermittelt das Serotonin der Blutplättchen auch zwischen Komponenten des Immunsystems (Geba et al, J. Immunol. 157: 557-565, 1996). Die Mechanismus, die dabei ablaufen, sind bisher unbekannt.
Es ist bekannt, daß das Enzym Tryptophan-Hydroxylase (TPH), ein Enzym, das in den Neuronen und im peripheren Gewebe exprimiert wird, den ausbeutebestimmenden Schritt in der Biosynthese von Serotonin katalysiert und damit entscheidend für die Funktionsfähigkeit des serotonergen Systems im ZNS und in der Peripherie ist.(Boadle-Biber, Prog. Biophys. Mol. Biol. 60: 1-15, 1993)
Es gibt bereits einige medizinische Anwendungen, die auf der Wirkung von Serotonin im Körper beruhen. Die vermehrte Freisetzung von Serotonin durch Rauwolfia-Alkaloide bzw. die Bremsung des Serotoninabbaus mit Hilfe von MAO (Monoaminooxidase)hemmern werden zur Behandlung seelischer Depressionen genutzt, sein Antagonist Methysergid findet Anwendung in der Behandlung von Migräne.
Bisher ist es jedoch noch nicht gelungen, die Serotoninproduktion im Körper so gezielt zu beeinflussen, daß eine effektive Behandlung der oben genannten und anderer pathologischer Erscheinungen möglich ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Diagnose von neuronalen Erkrankungen der genannten Art zu verbessern. Eine weitere Aufgabe besteht darin, Mittel zur Behandlung der defizienten primären Hamostase sowie Mittel zur Suppression des Immunsystems auf der Basis neuer Erkenntnisse der Serotoninwirkung zu entwickeln,
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Der Erfindung liegt die wesentliche Entdeckung zugrunde, daß Serotonin im Körper durch unterschiedlich exprimierte TPH- Isoenzyme in den Neuronen und in peripheren Geweben synthetisiert wird. Es wurde durch Gentargeting gezeigt, daß eine Isoform, das periphere Enzym (weiterhin TPH genannt) für die Aufrechterhaltung der primären Hamostase und der T-Zell-vermittelten Immunantworten verantwortlich ist. Eine weitere Isoform, das neu identifizierte neuronenspezifische TPH (als nTPH bezeichnet) synthetisiert Serotonin unabhängig davon im ZNS. Ferner konnten einige Mechanismen aufgeklärt werden. Es wurde gefunden, a) daß der Hauptschritt des Serotonins in der primären Hamostase durch den von Willebrandfaktor vermittelt wird. Weiterhin wurde festgestellt, daß b) das Serotonin in den Blutplättchen wesentlich für die normale Anzahl zirkulierender CD4+ Zellen, sowie für deren normale Aktivität ist und damit ein neues Ziel für eine immunsuppressive Behandlung darstellt.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß zwei separat regulierte serotonerge Systeme im ZNS und in der Peripherie existieren, definiert durch die periphere Isoform TPH bzw. durch die neuronale Isoform nTPH. Dieser Befund ist ein entscheidender Beitrag zur Nutzung dieser Systeme im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die Zweiteilung der Serotonin-Biosynthese auf molekularer Ebene ergibt unerwartete diagnostische und therapeutische Möglichkeiten. Das betrifft Korrelationen zwischen peripheren und zentral nervösen serotonergen Metaboliten. Das betrifft auch Möglichkeiten von diagnostischen Feinkorrelationen, denn die substraktive Betrachtung der vorliegenden Metabolitenkonzentrationen erlaubt die Feststellung des ZNS an Metaboliten in der Peripherie. So kann die periphere Serotonin-Biosynthese vorübergehend spezifisch inhibiert werden, um anschließend die vom ZNS stammenden peripheren Metabolitenkonzentrationen zu bestimmen. Der Nutzen einer solchen diagnostischen Methode, gerade bei persistenten psychiatrischen Störungen, sollte das vorübergehende Risiko von Blutungsepisoden und gestörter Zell-vermittelter Immunantworten überwiegen, da der feineren Diagnostik eine verbesserte Therapie folgen kann.
Gegenstand der Erfindung sind in erster Linie Inhibitoren bzw. Promotoren der beiden TPH- Isoformen, die zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen sowie zur Behandlung der defizienten primären Hamostase genutzt werden können. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Inhibitoren zur Suppression des Immunsystems, was u. a. für die Transplantationsmedizin und für die Behandlung von Allergien von Bedeutung ist.
Das Verfahren ist durch eine Beeinflussung der nTPH- und/oder TPH-Regulation und damit der gezielten Serotoninproduktion im Körper gekennzeichnet. Es wurde gezeigt, daß die periphere TPH für die primäre Hamostase und für die T-Zell-vermittelte Immunantwort notwendig ist, wohingegen die neu identifizierte nTPH, die unabhängig exprimiert wird und Serotonin im ZNS synthetisiert, für die serotonergen Effekte in der Verhaltensphysiologie verantwortlich ist. Dadurch ergeben sich neue pharmakologische Möglichkeiten zur Immunsuppression und zur therapeutischen Beeinflussung der Hamostase.
Die Beeinflussung der nTPH- und/oder TPH-Regulation erfolgt auf folgende Wegen: Es werden spezifische Inhibitoren der peripheren TPH-Isoformen entwickelt, die auf den beschriebenen molekularen Unterschieden der TPH-Isoformen beruhen, andererseits auch Inhibitoren, die nicht Blut-Hirnschranken-gängig sind. Spezifische Inhibitoren für die TPH- Isoformen können in vitro durch recht einfache Standard-Screeningmethoden gefunden werden, da die erhaltenen cDNAs der beiden Isoformen mit Hilfe von Expressionssystemen zur gezielten Expression der reinen Isoformen verwendet werden können. Diesen Inhibitoren kommen neben dem diagnostischen Nutzen auch therapeutische Anwendungsmöglichkeiten zu, denn erhöhte Serotonin-Spiegel im Blut werden bei einer Vielzahl an Komplikationen aufgefunden. a) In diesem Zusammenhang .ist erwähnenswert, dass bei der Anwendung von SSRI (serotonin specific reuptake inhibitors)-Antidepressiva in der psychopharmakologischen Therapie in einigen Fällen ernsthafte Blutungs-Komplikationen als Nebenwirkung bekannt geworden sind (Goldberg, Arch. Farn. Med. 7: 78-84, 1998). Diese Nebenwirkung kann auf die behandlungsbedingt erniedrigten Serotonin-Spiegel in Blutplättchen zurückgeführt werden (Bottlender et al., Fortschr. Neurol. Psychiatr. 66: 32-35, 1998). Diesem Anwendungsfeld zuzuordnen sind die neuen Erkenntnisse in der Beteiligung von Serotonin an der primären Hamostase. Eine Nebenwirkung von Antidepressiva, die blockierend auf den Serotonin-Transporter wirken, ist das Auftreten akuter Blutungsepisoden, offensichtlich wegen unzureichender Serotonin-Speicherung in den Thrombozyten der behandelten Patienten. Der Serotonin-Transporter der Thrombozyten ist nämlich identisch mit dem eigentlichen Ziel der Antidepressiva, dem Serotonin-Transporter des ZNS. Beim Auftreten solcher Blutungsepisoden werden die Antidepressiva in der Regel abgesetzt, mit der Folge, daß sich das Befinden des betroffenen Patienten verschlechtert und das Depressions-bedingte Selbstmord-Risiko steigt. Dazu muß es nicht kommen, wenn in einer solchen akuten Blutungsepisode handelsüblicher von Willebrand-Faktor (vWF) infundiert wird.
b) Erhöhte Serotonin-Konzentrationen während der Präeklampsie korrelieren mit den Zunahmen der CD4+-T-Zell-Subρopulationen. Mit spezifischen Inhibitoren der peripheren TPH-Isoform wird eine frühzeitige Behandlung der drohenden Präeklampsie ermöglicht, die weder einen Einfluß auf die Serotonin-Biosynthese im mütterlichen, noch im fötalen Gehirn ausübt.
c) Neben diesen Anwendungen wird auch ein positiver Einfluß von nur peripher wirkenden Inhibitoren auf die Transplantationsmedizin erreichbar. Eine wesentliche Einschränkung der herkömmlichen immunsuppressiven Therapie ist nämlich durch die nephro-, hepato- und neurotoxischen Nebenwirkungen der meistverwendeten Substanz, Cyclosporin A (CsA), gegeben. Neuere Immunsuppressiva natürlichen Ursprungs, wie FK506 und Rapamycin, ermöglichen daher in Kombinationspräparaten mit CsA eine effektivere (additive) immunsuppressive Behandlung mit erniedrigten Nebenwirkungen, da CsA dadurch niedrige dosiert zur Anwendung kommt.
Die immunsuppressive Wirkung erniedrigter Serotonin-Spiegel im Blut kann dazu genutzt werden, die toxischen Substanzen, CsA, FK506 und Rapamycin niedriger dosiert zum Einsatz zu bringen.
Die Beeinflussung der nTPH- und/oder TPH-Regulation kann gemäß der Erfindung auf folgenden Wegen erfolgen:
Die spezifische Herunterregulierung der nTPH und/oder pTPH erfolgt molekularbiologisch mit Ribozymen, Antisense-Oligonucleotiden oder durch Antisense-RNA-Expression, wobei die Sequenzunterschiede der Isoform-mRNAs die Beeinflussung jeweils nur einer mRNA erlauben. Außerdem wird gemäß der Erfindung auch mit pharmakologischen Ansätzen mit Hilfe spezifischer TPH-Inhibitoren, wie z. B. p-Chlorophenylalanin oder p-Ethinyl- phenylalanin, gearbeitet.
Die Serotonin-Produktion wird molekularbiologisch bevorzugt durch gewebsspezifische Überexpression der TPH-Isoformen stimuliert, pharmakologisch können beispielsweise die Vorgänger-Substanz, 5-Hydroxytryptophan, oder aber auch substituierte Analoga verabreicht werden, nicht zuletzt aber auch Serotonin selbst. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine spezifische Inhibierung der peripheren Serotoninbiosynthese durchgeführt wird, nachfolgend die aus dem ZNS stammenden Metabolitenkonzentrationen bestimmt werden und anhand einer Vergleichskurve der Krankheitsgrad ermittelt wird. Dazu ist es notwendig, Substanzen einzusetzen, die nicht Blut-Hirn-Schrankengängig sind.
Gegenstand der Erfindung ist auch die neu gefundene neuronale Tryptophan-Hydroxylase (nTPH), die sich von der bisher bekannten TPH in der regulatorischen Domäne unterscheidet (die katalytische Domäne ist identisch). nTPH hat die in Abb. 9 angebene Aminosäuresequenz.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele(Abbildungen) näher erläutert werden.
Abbildung 1. Erstellung der TPH(-/-)-Mäuse
A. Schematische Darstellung des Targeting- Verfahrens. Die ersten vier der 11 Exone des TPH-Gens sind angegeben. Das Knockout-Konstrukt wurde durch homologe Rekombination in ein Allel von ES-Zellen integriert, wodurch das erste kodierende Exon des TPH-Gens inaktiviert wurde. Außerdem enthält die integrierte Neomycin- Resistenzkassette eine Transkriptions-Stop-Sequenz. Die Positionen der analytischen Amplikons für Wild-Typ- und Knockout-Identifizierung sind angegeben, sowie die Positionen der internen und der externen Southernblot-Sonden. Die Eco Rl-Stellen, die die Identifizierung von Wild-Typ- und Knockout-Tieren in Southernblots ermöglichen sind fett hervorgehoben (RI). Restriktionsstellen: RI: Eco RI; Hd: Hind III; Bm: Bam HI; Sc: Sac I.
B. Agarosegel-Elektrophorese analytischer PCR-Produkte. Wie in A angegeben, wird für das Wild-Typ-Allel ein 1.1 kb-Fragment, für das Knockout- Allel ein 1.3 kb-Fragment erhalten.
C. Southernblot-Untersuchung Eco Rl-verdauter genomischer DNA. Wie in A angegeben, detektieren beide Sonden ein 10 kb-Fragment für das Wild-Typ-Allel und ein 8 kb- Fragment für das Knockout-Allel.
Abbildung 2. Quantifizierung von Tryptophan (Trp) und Serotonin (5-HT) in peripheren
Geweben und von Trp, 5-HT und 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) in ausgesuchten
Gehirnarealen A. Trp und 5-HT in Vollblut- und in Duodenum-Proben von 129SvJ-, C57BL/6-, TPH(-/-)-, und TPH(+/+)-Mäusen. N.d.: nicht detektierbar (< 25 fg/μl). *: statistisch gegenüber allen anderen Maus-Linien signifikant (p < 0.05). B. Trp, 5-HT und 5-HIAA in Hippocampus- und Frontalkortex-Proben von 129SvJ-, C57BL/6-, TPH(-/-)-, und TPH(+/+)-Mäusen. *: statistisch gegenüber allen anderen Maus-Linien signifikant (p < 0.05). 5-HT ist im Hippocampus von TPH(-/-)-Mäusen zwar gegenüber TPH(+/+)-Mäusen signifikant erniedrigt, nicht jedoch gegenüber den anderen Labormaus-Linien.
Abbildung 3. Gestörte primäre Hamostase in TPH(-/-)-Mäusen
A. Verlängerte Blutungszeiten von TPH(-/-)-Tieren. Normale Blutungszeiten von Kontroll- Tieren liegen bei 8 - 11 min, wohingegen TPH(-/-)-Mäuse im Mittel 35 min lang bluten.
B. Heilung des Phänotyps durch intrakardiale 5-HT-Injektion. Die applizierten 5-HT- Mengen führen zu 1/10 und dem 10-fachen der normalen Blutkonzentrationen.
C. Heilung des Phänotyps durch intrakardiale von Willebrandt-Faktor-Injektion. Der Effekt ist spezifisch für die TPH(-/-)-Mäuse, wohingegen Kontrolltiere nicht beeinflusst werden.
Abbildung 4. Gestörte T-Zell-vermittelte Immunantworten in TPH(-/-)-Mäusen
A. Zeitverlauf der Netto-Ohrenschwellung nach Oxazolon-Behandlung, indikativ für T-Zell- vermittelte Hypersensitivität des Spät-Typs. TPH(-/-)-Mäuse zeigen keine allergische Schwellungsreaktion.
B. Bestimmung von Leukocyten-Subpopulationen im peripheren Blut von TPH(-/-)-Tieren mit Hilfe der Fluß-Cytometrie. Nur CD4+-T-Zellen (CD4+/CD3+) sind signifikant vermindert (p < 0.05), nicht aber CD8+-T-Zellen.
C. Exemplarische Ansicht der Abstoßung von Haut-Zweittransplantaten. Pfeilspitzen kennzeichnen die sensibilisierenden Ersttransplantate, Pfeile die Zweittransplantate. Gegenüber den gut einheilenden Transplantaten an TPH(-/-)-Tieren fallen die Transplantate an TPH(+/+)- und C57BL/6-Tieren zum selben Zeitpunkt nach der Transplantation durch mangelnde Revaskularisierung und Entzündungen an den Wundrändern auf (weiße Abstoßung), oder sind bereits vollständig abgestoßen worden (Ersttransplantat und zwei der Zweittransplantate am C57BL/6-Tier).
Abbildung 5. Komplexität der TPH-Expression in der Maus
A. Sequenzvergleich der publizierten cDNA (Stoll et al., 1990), der klonierten alternativ gespliceten cDNA mit einer 34 bp- Verlängerung von Exon 3, und genomischer DNA. Chromosomale DNA weist die 34 bp- Verlängerung unmittelbar nach der Splicing-Donor- Stelle von Exon 3 auf, wonach ein obligatorisches GT-Dinucleotid folgt; das verlängerte Exon 3 wird im Folgenden Exon 3b genannt.
B. RNase Protection Assays von 80 μg total-RNA der angegebenen Organe und 10 μg der Mastocytoma-Zellen P815 (2x) mit der in 5A beschriebenen cDNA. Die Sonde identifiziert nun eindeutig sechs verschiedene Splice- Varianten der Maus-TPH-mRNA. Dabei fällt auf, daß nur noch ein Set von drei Varianten in den TPH-KO-Mäusen exprimiert wird. Die schwache Bande auf Höhe der bekannten TPH-mRNA, die in Duodenum und Lunge der TPH-KO(-/-)-Tiere zu sehen ist, beruht auf einer hohen Sequenzhomologie der Varianten. Die P815-RNAs zeigen, wie vergleichsweise niedrig die Expression von TPH in Geweben ist, fast am Rande der Detektionsgrenze. C. Alternatives Splicing zwischen Exon 3 und Exon 4. Die beteiligten Splicing-Donor- (SDS) und Splicing-Acceptor-Stellen (SAS) sind angegeben. Die Sequenzabschnitte der publizierten Sequenz sind als Exon 3 a und Exon 4a gekennzeichnet. Durch das Splicing von SDS2 auf SAS1 kommen die C-Varianten zustande, die nur für die regulatorischen Domäne der TPH-Isoformen kodieren (vgl. Abb. 7B). Das Splicing von SDS2 auf die interne SAS2 von Exon 4 hebt den Leserasterschub auf, der durch die zusätzlichen 34 bp von Exon 3b zustande kommen würde. Die konstanten Abschnitte sind hellgrau unterlegt, die alternativen Abschnitte dunkelgrau. Außerdem sind die alternativen Abschnitte, sowie flankierende Intron-Sequenzen kursiv angegeben.
Abbildung 6. Charakterisierung des neuen Exons 2b
A. Genomische Sequenz von Exon 2b der Maus mit flankierenden Sequenzen. Der ORF ist in der Trinukleotid-Schreibweise fett hervorgehoben. Im 5 '-flankierenden Bereich wird ein Teil des putativen, neuen Promotors gezeigt, worin eine TATA-Box und der wahrscheinlichste Transkriptionsstartpunkt (+1) markiert sind. Im 3 '-flankierenden Bereich ist die Splicing-Donorstelle von Exon 2b dargestellt. Intron-Sequenzen wurden in Kleinbuchstaben kursiv hervorgehoben, wobei das kurze Intron von 53 bp symbolisch durch eine Linie von den Abschnitten des ORFs überbrückt wurde. Zur Übersichtlichkeit wurden unter die beteiligten Splicing-Donorstellen, -Branchingstelle und -Akzeptorstelle die jeweiligen Konsensus-Sequenzen angegeben.
B. Untersuchung der Exon-Intron-Struktur des neuen Exons 2. Fünf von acht Nucleotiden stimmen in der Maus mit der Konsensus-Sequenz von Splicing-Donorstellen überein (fett und unterstrichen), vier in der Ratte und drei im Menschen. Das Intron zwischen dem neuen Exon 2 und Exon 3 ist in der Maus genau 948 bp lang, ähnlich wie in der Ratte und im Menschen.
Abbildung 7. Schematische Darstellung der TPH-Genstruktur
A. Schematische Gegenüberstellung der bekannten Splicing-Struktur (oben) mit der Struktur, die in der vorliegenden Arbeit für den Genabschnitt der regulatorischen Domäne erhalten wurde (unten). Die Promotor-Position, für die es experimentelle Evidenz gibt, wurde mit P2 gekennzeichnet.
B. Zusammenstellung aller neu entdeckten mRNA- Varianten. Der Promotor 1 ist überwiegend in der Peripherie aktiv, während der neue Promotor 2 für die Expression im CNS zuständig ist. Die als Variante A bezeichnete mRNA ist die bekannte Form der TPH- n RNA. Die Variante A' wurde bereits kloniert, und kodiert für eine aktive TPH-Isoform. Die Varianten B und B' sind zwar noch nicht kloniert, aber mit Hilfe von RPA- Versuchen mehrfach eindeutig nachgewiesen worden. Die Varianten C und C führen zur Expression nur der regulatorischen Domänen. Zur Vereinfachung sind die mRNAs nur bis zum 6. Exon der insgesamt 11 Exone dargestellt.
Abbildung 8. Aminosäure-Sequenzvergleich der neuen regulatorischen Domäne von TPH mit anderen AAAHs
Der obere Teil der Sequenzen zeigt den neuen Abschnitt von TPH. Unten sind die konservierten Sequenzabschnitte der regulatorischen Domänen der AAAHs angegeben. Die Sequenzen wurden mit Hilfe des ClustalW-Programms einzeln miteinander verglichen, und dann von Hand zusammengestellt. Dabei wurden teilweise größere Lücken erlaubt, um die übereinstimmenden Strukturelemente herauszustellen. Auffällige Sequenzmotive sind eingerahmt und einzeln benannt. Vier der fünf Motive stimmen mit Elementen der Sekαndärstmktur von PAH überein. Teilweise mit dem IEDN-Motiv überlappend ist ein Bereich der regulatorischen Domäne eingerahmt und grau unterlegt, der in die Furche des katalytischen Zentrums hinein reicht, wie aus kristallographischen Untersuchungen der PAH bekannt ist. Weitere Erläuterungen im Text. Die verwendeten Sequenzen sind: nstph = Neuronen-spezifische TPH (die neue Variante) der Maus, musth = TH der Maus, muspah und humpah = murine und humane PAH, ptph = periphere TPH der Maus (bekannte Variante).
Abbildung 9. Aminosäure-Sequenz der nTPH

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Beeinflussung des Serotoninspiegels durch spezifische Regulierung der TPH- und/oder der nTPH-Aktivität.
2. Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen sowie zur Behandlung der defizienten primären Hamostase, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Beeinflussung der TPH- und/oder der nTPH-Regulation erhöht oder erniedrigt wird.
3. Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine spezifische Inhibierung der peripheren Serotoninbiosynthese durchgeführt wird, nachfolgend die aus dem ZNS stammenden Metabolitenkonzentrationen bestimmt werden und anhand einer Vergleichskurve der Krankheitsgrad ermittelt wird.
4. Verfahren zur Behandlung der defizienten primären Hamostase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Beeinflussung der TPH-Regulation erhöht wird.
5. Verfahren zur Behandlung der defizienten primären Hamostase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion erhöht öder daß Serotonin verabreicht wird.
6. Verfahren zur Behandlung der defizienten primären Hamostase nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch gewebsspezifische Überexpression erhöht wird.
7. Verfahren zur Behandlung der defizienten primären Hamostase nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Zugabe der Vorgängersubstanz 5-Hydroxytryptophan erhöht wird.
8. Verfahren zur Behandlung der defizienten primären Hamostase nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Zugabe von substituierten Analoga von 5-Hydroxytryptophan erhöht wird.
9. Verfahren zur Behandlung von Arteriosklerose/Thrombose, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion erniedrigt wird.
10. Verfahren zur Behandlung von Arteriosklerose/Thrombose nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Ribozyme erniedrigt wird.
11. Verfahren zur Behandlung von Arteriosklerose/Thrombose nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Antisense-Oligonukleotide erniedrigt wird.
12. Verfahren zur Behandlung von Arteriosklerose/Thrombose nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion durch Antisense-RNA-Expression erniedrigt wird.
13. Verfahren zur Behandlung von Arteriosklerose/Thrombose nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Serotoninproduktion mit Hilfe spezifischer TPH-Inhibitoren wie p-Chlorophenylalanin oder p-Ethinylphenylalanin erniedrigt wird.
14. Verfahren zur Behandlung in Diabetes Mellitus auftretender Arteriosklerose/Thrombose nach Ansprüchen 9, 10, 11, 12 und 13.
15. Verfahren zur Behandlung von Überreaktionen oder unerwünschter normaler Reaktionen des Immunsystems (z.B. Allergien, Immun-, sowie Autoimmun-Erkrankungen, Risiko- Schwangerschaften wie Präeklampsie, sowie in der Transplantationsmedizin zur immunsuppressiven Therapie), dadurch gekennzeichnet, dass die Serotoninproduktion erniedrigt wird.
16. Präparat zur Behandlung der Praeklamsie nach Anspruch 15, enthaltend Inhibitoren (Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-RNA-Expression, p- Chlorophenylalanin oder p-Ethinylphenylalanin), mit denen die Serotoninproduktion erniedrigt wird.
17. Präparat zur Behandlung von Allergien nach Anspruch 15, enthaltend Inhibitoren (Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-RNA-Expression, p- Chlorophenylalanin oder p-Ethinylphenylalanin), mit denen die Serotoninproduktion erniedrigt wird.
18. Präparat zur Behandlung von Immun-, sowie Autoimmun-Erkrankungen nach Anspruch 15, enthaltend Inhibitoren (z.B.: Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-RNA- Expression, p- Chlorophenylalanin oder p-Ethinylphenylalanin), mit denen die Serotoninproduktion erniedrigt wird.
19. Kombinationspräparat zur Behandlung von Blutungsepisoden in der psychopharmakologischen Behandlung von Depressionen mit Antidepressiva, die auf den Serotonin-Wiederaufnahme-Transporter wirken, enthaltend Antidepressiva und von Willebrand-Faktor.
20. Kombinationspräparat zur immunsuppressiven Therapie bei Transplantationen, enthaltend gängige Immunsuppressiva (z.B.: CsA, FK506 oder Rapamycin) und Inhibitoren (z.B.: Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide, Antisense-RNA-Expression, p- Chlorophenylalanin oder p-Ethinylphenylalanin), mit denen die Serotoninproduktion erniedrigt wird.
21. Sequenz der neuronalen TPH, wie in Abb. 9 angegeben.
22. DNA-Konstrukt für die Erzeugung peripher Serotonin-defizienter Tiere, wie in Abb. 1 dargestellt.
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