JP2004507491A - 神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法 - Google Patents
神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004507491A JP2004507491A JP2002522865A JP2002522865A JP2004507491A JP 2004507491 A JP2004507491 A JP 2004507491A JP 2002522865 A JP2002522865 A JP 2002522865A JP 2002522865 A JP2002522865 A JP 2002522865A JP 2004507491 A JP2004507491 A JP 2004507491A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- serotonin
- tph
- treating
- serotonin production
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
- A61K38/13—Cyclosporins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本発明は、神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法に関する。更に本発明は、移植医療及びアレルギーの治療にとりわけ重要な免疫抑制方法に関する。本発明は、医療及び製薬産業の分野で用いられる。本発明は、特許請求の範囲にしたがって実施される。本発明は、末梢組織とニューロンで別々に発現するＴＰＨアイソエンザイム類によりセロトニンが合成されるという発見に基づく。末梢酵素（以下ＴＰＨと略す）であるアイソフォームの、一次止血及びＴ細胞を介する免疫応答維持への関与を示すため、ジーンターゲッティングを用いる。他のアイソフォームである新規に同定されたニューロン特異的ＴＰＨ（以下ｎＴＰＨと略す）がこれとは関わりなく中枢神経系においてセロトニンを合成する。更に本発明は、既知のＴＰＨと調節ドメインにおいて異なる、新規に同定された神経単位トリプトファン・ヒドロキシラーゼ（ｎＴＰＨ）に関する。
Description
【０００１】
本発明は、神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法に関する。更に本発明は、移植医療及びアレルギー治療にとりわけ重要である免疫抑制方法に関する。本発明は、医療及び製薬産業の分野で用いられる。
【０００２】
鬱、アルコール症、薬物乱用、不眠症及び栄養障害といったいくつかの挙動障害は、中枢神経系に密接に関係する障害である。組織ホルモンであるセロトニンは様々なレベルおいて重要な役割を果たす。セロトニンは、とりわけ蠕動運動、血管拡張及び収縮（投薬量依存性の）をそれぞれ刺激するとともに、気管の弾力性を増加させる神経伝達物質である。セロトニンは中枢神経系における神経伝達物質であるだけでなく、加えてその化合物は、強力な血管収縮活性によりセロトニンが最初に発見された部位である末梢の至る所に存在する（Ｒａｐｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １７６：１２３７， １９４８）。
【０００３】
更に、セロトニンは一次止血、つまり出血抑制において重要な役割を演じる。血小板中に貯蔵されているセロトニンは血管障害部位に分泌されることにより一次止血を抑える（Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １５１：３２−３９， １９７６）。
【０００４】
更に、血小板のセロトニンは、免疫系化合物の間を媒介する（Ｇｅｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：５５７−５６５， １９９６）。この機構は、今なお未知である。
【０００５】
ニューロン及び末梢組織で発現するトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ）は、セロトニン生合成の産生量限定段階を触媒することが知られており、中枢神経系及び末梢におけるセロトニン作動系の機能に不可欠な酵素である（Ｂｏａｄｌｅ−Ｂｉｂｅｒ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６０：１−１５， １９９３）。
【０００６】
生体内のセロトニンの効果に関連し、既にいくつかの医療上の適用がある。インドジャボク属アルカロイド類によるセロトニン放出の増加、及びＭＡＯ（モノアミノオキシダーゼ）阻害剤を用いたセロトニン壊変の遅延は、それぞれ精神的抑うつ治療に用いられる。一方、その拮抗剤メチセルジドは、片頭痛治療に応用される。
【０００７】
生体内のセロトニン産生の調節により、上記及び他の病理学的現象の効果的治療を可能とする方法は、未だ実現されていない。
【０００８】
従って、上記の種類の神経性疾患の診断方法の改良が本発明の課題である。更に、セロトニンの効果の新発見に基づく免疫抑制剤とともに、一次止血障害の治療薬剤の開発も課題である。
【０００９】
本発明は、請求の範囲にしたがって実施される。本発明は、ニューロンと末梢組織で別々に発現するＴＰＨアイソエンザイム類によりセロトニンが生体内で合成されるという本質的発見に基づく。末梢酵素（以下ＴＰＨと略す）であるアイソフォームが一次止血及びＴ細胞を介する免疫応答の維持に関与していることを示すために、ジーンターゲッティングを用いた。末梢ＴＰＨとは別の他のアイソフォームである新規に同定されたニューロン特異的ＴＰＨ（以下ｎＴＰＨと略す）は中枢神経系においてセロトニンを合成する。
【００１０】
更にいくつかのメカニズムの解明により下記を見出した。
ａ）一次止血におけるセロトニンの主要段階はフォン・ウィルブランド因子によって媒介される。さらに、下記を確立した。
ｂ）血小板中のセロトニンは、正常数のＣＤ４＋細胞循環とともに、その正常活性に不可欠であるため、免疫抑制治療の新規の標的となる。
【００１１】
要約すると、中枢神経系と末梢においてそれぞれ末梢ＴＰＨアイソフォーム及びニューロンｎＴＰＨアイソフォームとして特定され、２つの別個に制御されるセロトニン作動系の樹立を可能とする。この結果は、本発明の技術範囲内でのこれらの系の使用に大変寄与するものである。
【００１２】
分子レベルでのセロトニン生合成の２分法により、予期せぬ診断及び治療における可能性が得られる。これは末梢神経及び中枢神経のセロトニン作動性代謝産物間の相互作用に結び付く。さらに、中枢神経系の代謝産物の確認を可能とする代謝産物濃度を減ずる定量により、診断上役立つ相関関係を示す可能性がある。これに続く中枢神経系由来の末梢代謝産物の濃度決定のための、末梢セロトニン生合成特異的な一過性抑制が可能となる。このような診断法の利点としては、特に持続性精神障害の場合に正確な診断の後に改良した治療法が続くため、出血症状の一過的危険性及び障害性細胞を介する免疫応答に効果的であると思われる。
【００１３】
本発明は、第一に神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療に使用可能な両ＴＰＨアイソフォームに対する阻害剤又は促進剤に関する。更に、本発明は、移植医療及びアレルギー治療において重要な免疫抑制にこれらの阻害剤を使用することに関する。
【００１４】
本方法は、ｎＴＰＨ及び／又はＴＰＨ制御変調及びこれによる生体内の特異的なセロトニン産生を特徴とする。末梢ＴＰＨは一次止血及びＴ細胞を介する免疫応答において重要である。これに対し新規に同定されたｎＴＰＨ（中枢神経系において独立して発現しセロトニンを合成する）は、行動生理学におけるセロトニン作動系の効果に関与しているということが示された。これは、免疫抑制及び止血の治療操作に新しい薬理学的可能性をもたらす。
【００１５】
ｎＴＰＨ及び／又はＴＰＨ制御変調は、次のように起こる。すなわち、上記のＴＰＨアイソフォームの分子的差異による末梢ＴＰＨアイソフォーム特異的阻害剤、一方、血液脳関門を通過できない阻害剤を開発する。二種のアイソフォームのｃＤＮＡを用いた特異的発現系により純正アイソフォームが得られるため、ＴＰＨアイソフォーム特異的阻害剤は極めて単純なスクリーニング法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで見つけることができる。さらに、複数の合併症で血中セロトニンレベル上昇が見出されることから、これらの阻害剤は診断に加え治療にも利用することができる。
【００１６】
ａ） このような状況で、精神薬理学的治療においてＳＳＲＩ（セロトニン特異的再取り込み阻害剤）抗鬱剤使用中に、いくつかの症例で重篤な出血合併症が副作用として知られるようになった（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ａｒｃｈ． Ｆａｍ． Ｍｅｄ． ７：７８−８４， １９９８）ことに言及するのは意義深い。これらの副作用の原因は、上記の治療による血小板中のセロトニンレベルの低下によると言える（Ｂｏｔｔｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｒｔｓｃｈｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ． ６６：３２−３５， １９９８）。このことに関連する応用分野は、一次止血においてセロトニンを関与させるという新知見である。セロトニン輸送の制限方法において作用する抗鬱剤の副作用の一つは、急性出血性症状発現が起こり易いことであり、明らかにこれは治療患者の血小板へのセロトニン貯蔵が不十分なためである。すなわち、血小板のセロトニン輸送体は、中枢神経系のセロトニン輸送体である抗鬱剤の特異的標的と同一であると言える。このような出血性症状発現の場合には、通常において抗鬱剤は置換され、苦しむ患者状態の衰弱ならびにうつ病により誘発される自殺危険度の増加ををもたらす。これは、上記の急性出血性症状発現中の市販品のフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）投与により回避することができる。
【００１７】
ｂ）子癇前症でのセロトニン濃度の上昇は、ＣＤ４＋−Ｔ細胞亜群増加と相関関係にある。末梢ＴＰＨアイソフォーム特異的阻害剤を用いることにより、顕著な子癇前症の初期治療が可能となる。この治療は母体および胎児の脳でのセロトニン生合成のどちらにも影響を及ぼさない。
【００１８】
ｃ）これらの適用に加え、末梢にのみ作用する阻害剤の移植薬剤への陽性の効果が達成されうる。最も一般的に使用される物質シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の腎臓性、肝臓性、及び神経性の毒性副作用により、通常の免疫抑制治療の決定的制限が生じる。ＣｓＡとＦＫ５０６やラパマイシンとの併用調剤のような比較的最近の天然起源の免疫抑制剤により、ＣｓＡを低用量で適用することができ、低副作用性の効果的（相加的）な免疫抑制治療が可能となる。
【００１９】
ＣｓＡやＦＫ５０６やラパマイシンといった毒性物質を低用量で適用することにより、低血中レベルのセロトニンによる免疫抑制効果を得ることができる。
【００２０】
本発明によれば、ｎＴＰＨ及び／又はＴＰＨ制御の処置は、以下の方法で行うことができる：
ｎＴＰＨ及び／又はｐＴＰＨ特異的下方制御は、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、あるいはアンチセンスＲＮＡ発現により、分子生物学的手法を用いてなし得る。これらの方法においては、アイソフォームのｍＲＮＡの配列の違いにより各ｍＲＮＡ一分子につき一回限りの変調作用が直ちに可能となる。更に、本発明により、例えばｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニンのようなＴＰＨ特異的阻害剤を用いた薬理学的設定もまた適用される。
【００２１】
セロトニン産生は、分子生物学的手法を用いたＴＰＨアイソフォームの組織特異的過剰発現により刺激されることが望ましいが、例えば前駆化合物５−ヒドロキシトリプトファンのみならず、置換類似体、そして最後に述べるが特にセロトニン自体の薬理学的投与も可能である。
【００２２】
神経性疾患の診断に関する本発明の方法は、末梢のセロトニン生合成の特異的阻害、これに続く中枢神経系由来の代謝産物濃度の決定、そして相対曲線に基づく疾患進行度の把握により特徴付けられる。本発明の方法ためには、血液脳関門を通過できない化合物を用いることが必要である。
【００２３】
更に本発明は、その調節ドメイン（触媒領域は同一である）が既知のＴＰＨと異なる、新しく同定されたニューロンのトリプトファン水酸化酵素（ｎＴＰＨ）に関する。ｎＴＰＨは配列表１に図示するアミノ酸配列を有する。
【００２４】
実施形態（図）に基づいて本発明を以下に詳しく説明する。
図１．ＴＰＨ（−／−）−マウスの作出
Ａ． ターゲッティング法の模式図。ＴＰＨ遺伝子の１１エキソンの最初の４つを示す。ノックアウトコンストラクトは、相同組み換えによりＥＳ細胞の一つの対立遺伝子に挿入され、ＴＰＨ遺伝子の最初にコードするエキソンは不活性化された。更に、挿入されたネオマイシン耐性カセットは転写停止配列を含んでいた。野生型及び欠失型の確認のための分析用アンプリコンの位置を、内部及び外部サザンブロット・プローブの位置とともに示す。サザンブロットでの野生型及び欠失型動物を確認できる同一のＥｃｏＲＩ部位を太字（ＲＩ）で示す。制限部位：ＲＩ： Ｅｃｏ ＲＩ； Ｈｄ： Ｈｉｎｄ ＩＩＩ； Ｂｍ：Ｂａｍ ＨＩ； Ｓｃ：Ｓａｃ Ｉ。
Ｂ． アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分析。Ａで述べたように、野生型対立遺伝子では１．１ｋｂ断片が、欠失型対立遺伝子については１．３ｋｂ断片が、それぞれ得られた。
Ｃ． ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット試験。Ａで述べたように、両プローブは野生型対立遺伝子では１０ｋｂ断片を、欠失型対立遺伝子については８ｋｂ断片を検出する。
【００２５】
図２。末梢組織でのトリプトファン（Ｔｒｐ）とセロトニン（５−ＨＴ）ならびに脳の選択した領域でのＴｒｐ、５−ＨＴ及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）との定量化。
Ａ． １２９ＳｖＪ−、Ｃ５７ＢＬ／６−、ＴＰＨ（−／−）−、及びＴＰＨ（＋／＋）−マウスの全血並びに十二指腸サンプルにおけるＴｒｐと５−ＨＴ。Ｎ．ｄ：検出せず（＜２５ｆｇ／μｌ）。＊：他のすべてのマウス系統に比較して統計的に有意（ｐ＜０．０５）。
Ｂ． １２９ＳｖＪ−、Ｃ５７ＢＬ／６−、ＴＰＨ（−／−）−、及びＴＰＨ（＋／＋）−マウスの海馬及び前頭皮質サンプルにおけるＴｒｐ、５−ＨＴ、及び５−ＨＩＡＡ。＊：他のすべてのマウス系統に比較して統計的に有意（ｐ＜０．０５）。５−ＨＴは、ＴＰＨ（＋／＋）−マウスに較べてＴＰＨ（−／−）−マウスの海馬で有意に低い。しかし、他の研究所内マウス系統との比較はしなかった。
【００２６】
図３。ＴＰＨ（−／−）−マウスにおける止血障害
Ａ． ＴＰＨ（−／−）−動物の出血時間の遅延。対照動物の正常な出血時間は８〜１１分である。一方ＴＰＨ（−／−）−マウスは平均で３５分間出血する。
Ｂ． 心臓内５−ＨＴ注入による表現型の回復。作用させた５−ＨＴ量は正常な血中濃度の１／１０及び１０倍であった。
Ｃ． 心臓内フォン・ウィルブランド因子注入による表現型の回復。効果はＴＰＨノックアウトマウスに特異的である。一方、対照動物は影響を受けない。
【００２７】
図４。ＴＰＨ（−／−）−マウスにおけるＴ細胞を介する免疫応答の障害。
Ａ． オキサゾロン処理後の、Ｔ細胞を介する遅延性過敏症の指標である耳の純膨化のタイムコースを示す。ＴＰＨ（−／−）−マウスはアレルギー性膨化反応を示さない。
Ｂ． フローサイトメトリーを用いたＴＰＨ（−／−）−動物の末梢血中の白血球亜群の決定。ＣＤ４＋−Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）のみが有意に減少した（ｐ＜０．０５）が、ＣＤ８＋ −Ｔ細胞はそうでなかった。
Ｃ． 皮膚二次移植の拒絶反応の例示的図示。矢頭は最初の移植に対する感受性を示し、矢印は２次移植を示す。移植で良好に治癒したＴＰＨ（−／−）−動物と比較して、ＴＰＨ（＋／＋）−及びＣ５７ＢＬ／６−動物への移植は、創傷の外縁（白色拒絶反応）において同時に起こる不十分な脈管再生及び感染により同定されるか、あるいは既に完全に拒絶反応を示す（Ｃ５７ＢＬ／６−動物での１次移植と二つの２次移植）。
【００２８】
図５。マウスにおけるＴＰＨ発現の複雑性。
Ａ． 公表されたｃＤＮＡ（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）のエキソン３に３４ｂｐの伸張を有する単離された択一的スプライシングｃＤＮＡの配列アラインメントとゲノムＤＮＡ。染色体ＤＮＡは、エキソン３のスプライシング・ドナー部位の直後に３４ｂｐ伸張を有し、必須のＧＴジヌクレオチドが続き、伸張したエキソン３は次に示されるエキソン３ｂ内にある。
Ｂ． ５Ａで記述したｃＤＮＡによる８０μｇの上記組織の総ＲＮＡおよび１０μｇの肥満細胞細胞Ｐ８１５（２ｘ）を用いたＲＮＡａｓｅプロテクションアッセイ。プローブは、マウスＴＰＨ−ｍＲＮＡの６つのスプライシング変異体を明確に同定する。３種の変異体の一群のみがＴＰＨ−ＫＯマウスで発現されることに注目すべきである。ＴＰＨ−ＫＯ（−／−）動物の直腸と肺で確かめることのできる既知のＴＰＨ−ｍＲＮＡの位置における薄いバンドは変異体間の高いホモロジーに起因する。Ｐ８１５−ＲＮＡは組織中のＴＰＨの発現が比較してみると如何に低いか、つまり検出可能水準ぎりぎりかを示す。
Ｃ． エキソン３とエキソン４との間における択一的スプライシング。関与するスプライシング・ドナー部位（ＳＤＳ）及びスプライシング・アクセプター部位（ＳＡＳ）を示す。公表された配列中のこれらの配列部分をエキソン３ａ及びエキソン４ａとしてマークする。ＳＡＳ１とＳＤＳ２とのスプライシングの結果、ＴＰＨアイソフォームの調節ドメインのみをコードするＣ変異体が生じる（図７Ｂを参照）。エキソン４の内部のＳＡＳ２とＳＤＳ２とのスプライシングにより、エキソン３ｂにおける３４ｂｐの追加に起因するフレーム・シフトを排除する。不変領域は軽い灰色に、択一的セグメントは暗灰色に影付けする。更に、択一的セグメントは、隣接するイントロン配列と同様にイタリック体で示してある。
【００２９】
図６。新規エキソン２ｂの解析。
Ａ． 隣接する配列を有するマウスのエキソン２ｂのゲノム配列。トリヌクレオチド表記法によりＯＲＦを太字で記す。５’側の隣接領域では、想定される新規プロモーター部分を示す。プロモーター部分では一つのＴＡＴＡボックス及び最も可能性の高い転写開始（＋１）を示す。３’側の領域では、エキソン２ｂのスプライシング・ドナー部位を図示する。イントロン配列はイタリックの小文字で示され、そこでは５３ｂｐの短いイントロンとＯＲＦセグメントを線を用いて架橋している。分かり易くするため、スプライシング・ドナー部位、スプライシング・分岐部位、ならびにスプライシング・アクセプター部位の下に、各々の共通配列を示す。
Ｂ． 新規エキソン２ｂのエキソン・イントロン構造の考察。マウスでの８の塩基のうちの５つが、スプライシング・ドナー部位（太字で下線付き）のコンセンサス配列と確認される、それはラットで４つ、ヒトで３つ確認される。マウスでの新規エキソン２及びエキソン３の間のイントロンは正確に９４８ｂｐであり、ラット及びヒトに類似する。
【００３０】
図７。ＴＰＨ遺伝子構造の模式図。
Ａ． 調節ドメイン（下部）の遺伝子セグメントについての本研究で得られた構造と既知のスプライシング構造（上部）の模式的比較。実験的証明により裏付けられるプロモーターの位置をＰ２で示す。
Ｂ． 新規のｍＲＮＡ変異体の構築。プロモーター１は末梢において第一に活性が高い。一方、新規のプロモーター２は中枢神経系における発現に関与している。変異体Ａとして示したｍＲＮＡは、ＴＰＨ−ｍＲＮＡの既知の形状である。変異体Ａ’は既に単離されており、活性ＴＰＨアイソフォームをコードしている。変異体Ｂ及びＢ’はまだ単離されていないが、ＲＮＡａｓｅプロテクションアッセイにより数回は明らかに同定されている。変異体Ｃ及びＣ’は調節ドメインのみの発現を誘導する。分かり易くするため、全体で１１エキソンのうち６番目のエキソンまでのｍＲＮＡ類のみを示す。
【００３１】
図８。他のＡＡＡＨ類を有するＴＰＨの新規調節ドメインのアミノ酸配列アラインメント。
配列の上部はＴＰＨの新規部分を示す。下部は、ＡＡＡＨ類の調節ドメインにおいて配列が保存されている部分を示す。各配列を互いに、ｃｌｕａｔａｌＷ−プログラムを用いてアラインし、手動により構築する。そして、同一の構成要素を示すために大きい間隙を部分的に許容している顕著な配列モチーフを枠で囲み、各々命名している。５つのモチーフのうちの４つは、ＰＡＨの二次構造における構成要素と同一である。ＩＥＤＮモチーフと部分的に重複し、調節ドメイン領域は、枠で囲って灰色の影付けがしてあり、ＰＡＨの結晶学的試験により知られている触媒中心の溝に到達している。更なる説明は本文中にある。用いた配列は：ｎｓｔｐｈ＝マウスのニューロン特異的ＴＰＨ（新規変異体）、ｍｕｓｔｈ＝マウスのＴＨ、ｍｕｓｐａｈ及びｈｕｍｐａｈ＝マウス及びヒトのＰＡＨ、ｐｔｐｈ＝マウスの末梢ＴＰＨ（既知の変異体）。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＰＨ（−／−）マウスの作出を表す。
【図２】末梢組織でのトリプトファン（Ｔｒｐ）とセロトニン（５−ＨＴ）ならびにＭの選択した領域でのＴｒｐ、５−ＨＴ及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）との定量化を表す。
【図３】ＴＰＨ（−／−）−マウスにおける止血障害を表す。
【図４】ＴＰＨ（−／−）−マウスにおけるＴ細胞を介する免疫応答障害を表す。
【図５】マウスにおけるＴＰＨ発現の複雑性を示す。
【図６】新規エキソン２ｂの解析を示す。
【図７】ＴＰＨ遺伝子構造の模式図である。
【図８】他のＡＡＡＨ類を有するＴＰＨの新規調節ドメインのアミノ酸配列アラインメントを示す。
本発明は、神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法に関する。更に本発明は、移植医療及びアレルギー治療にとりわけ重要である免疫抑制方法に関する。本発明は、医療及び製薬産業の分野で用いられる。
【０００２】
鬱、アルコール症、薬物乱用、不眠症及び栄養障害といったいくつかの挙動障害は、中枢神経系に密接に関係する障害である。組織ホルモンであるセロトニンは様々なレベルおいて重要な役割を果たす。セロトニンは、とりわけ蠕動運動、血管拡張及び収縮（投薬量依存性の）をそれぞれ刺激するとともに、気管の弾力性を増加させる神経伝達物質である。セロトニンは中枢神経系における神経伝達物質であるだけでなく、加えてその化合物は、強力な血管収縮活性によりセロトニンが最初に発見された部位である末梢の至る所に存在する（Ｒａｐｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １７６：１２３７， １９４８）。
【０００３】
更に、セロトニンは一次止血、つまり出血抑制において重要な役割を演じる。血小板中に貯蔵されているセロトニンは血管障害部位に分泌されることにより一次止血を抑える（Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １５１：３２−３９， １９７６）。
【０００４】
更に、血小板のセロトニンは、免疫系化合物の間を媒介する（Ｇｅｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：５５７−５６５， １９９６）。この機構は、今なお未知である。
【０００５】
ニューロン及び末梢組織で発現するトリプトファン水酸化酵素（ＴＰＨ）は、セロトニン生合成の産生量限定段階を触媒することが知られており、中枢神経系及び末梢におけるセロトニン作動系の機能に不可欠な酵素である（Ｂｏａｄｌｅ−Ｂｉｂｅｒ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６０：１−１５， １９９３）。
【０００６】
生体内のセロトニンの効果に関連し、既にいくつかの医療上の適用がある。インドジャボク属アルカロイド類によるセロトニン放出の増加、及びＭＡＯ（モノアミノオキシダーゼ）阻害剤を用いたセロトニン壊変の遅延は、それぞれ精神的抑うつ治療に用いられる。一方、その拮抗剤メチセルジドは、片頭痛治療に応用される。
【０００７】
生体内のセロトニン産生の調節により、上記及び他の病理学的現象の効果的治療を可能とする方法は、未だ実現されていない。
【０００８】
従って、上記の種類の神経性疾患の診断方法の改良が本発明の課題である。更に、セロトニンの効果の新発見に基づく免疫抑制剤とともに、一次止血障害の治療薬剤の開発も課題である。
【０００９】
本発明は、請求の範囲にしたがって実施される。本発明は、ニューロンと末梢組織で別々に発現するＴＰＨアイソエンザイム類によりセロトニンが生体内で合成されるという本質的発見に基づく。末梢酵素（以下ＴＰＨと略す）であるアイソフォームが一次止血及びＴ細胞を介する免疫応答の維持に関与していることを示すために、ジーンターゲッティングを用いた。末梢ＴＰＨとは別の他のアイソフォームである新規に同定されたニューロン特異的ＴＰＨ（以下ｎＴＰＨと略す）は中枢神経系においてセロトニンを合成する。
【００１０】
更にいくつかのメカニズムの解明により下記を見出した。
ａ）一次止血におけるセロトニンの主要段階はフォン・ウィルブランド因子によって媒介される。さらに、下記を確立した。
ｂ）血小板中のセロトニンは、正常数のＣＤ４＋細胞循環とともに、その正常活性に不可欠であるため、免疫抑制治療の新規の標的となる。
【００１１】
要約すると、中枢神経系と末梢においてそれぞれ末梢ＴＰＨアイソフォーム及びニューロンｎＴＰＨアイソフォームとして特定され、２つの別個に制御されるセロトニン作動系の樹立を可能とする。この結果は、本発明の技術範囲内でのこれらの系の使用に大変寄与するものである。
【００１２】
分子レベルでのセロトニン生合成の２分法により、予期せぬ診断及び治療における可能性が得られる。これは末梢神経及び中枢神経のセロトニン作動性代謝産物間の相互作用に結び付く。さらに、中枢神経系の代謝産物の確認を可能とする代謝産物濃度を減ずる定量により、診断上役立つ相関関係を示す可能性がある。これに続く中枢神経系由来の末梢代謝産物の濃度決定のための、末梢セロトニン生合成特異的な一過性抑制が可能となる。このような診断法の利点としては、特に持続性精神障害の場合に正確な診断の後に改良した治療法が続くため、出血症状の一過的危険性及び障害性細胞を介する免疫応答に効果的であると思われる。
【００１３】
本発明は、第一に神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療に使用可能な両ＴＰＨアイソフォームに対する阻害剤又は促進剤に関する。更に、本発明は、移植医療及びアレルギー治療において重要な免疫抑制にこれらの阻害剤を使用することに関する。
【００１４】
本方法は、ｎＴＰＨ及び／又はＴＰＨ制御変調及びこれによる生体内の特異的なセロトニン産生を特徴とする。末梢ＴＰＨは一次止血及びＴ細胞を介する免疫応答において重要である。これに対し新規に同定されたｎＴＰＨ（中枢神経系において独立して発現しセロトニンを合成する）は、行動生理学におけるセロトニン作動系の効果に関与しているということが示された。これは、免疫抑制及び止血の治療操作に新しい薬理学的可能性をもたらす。
【００１５】
ｎＴＰＨ及び／又はＴＰＨ制御変調は、次のように起こる。すなわち、上記のＴＰＨアイソフォームの分子的差異による末梢ＴＰＨアイソフォーム特異的阻害剤、一方、血液脳関門を通過できない阻害剤を開発する。二種のアイソフォームのｃＤＮＡを用いた特異的発現系により純正アイソフォームが得られるため、ＴＰＨアイソフォーム特異的阻害剤は極めて単純なスクリーニング法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで見つけることができる。さらに、複数の合併症で血中セロトニンレベル上昇が見出されることから、これらの阻害剤は診断に加え治療にも利用することができる。
【００１６】
ａ） このような状況で、精神薬理学的治療においてＳＳＲＩ（セロトニン特異的再取り込み阻害剤）抗鬱剤使用中に、いくつかの症例で重篤な出血合併症が副作用として知られるようになった（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ａｒｃｈ． Ｆａｍ． Ｍｅｄ． ７：７８−８４， １９９８）ことに言及するのは意義深い。これらの副作用の原因は、上記の治療による血小板中のセロトニンレベルの低下によると言える（Ｂｏｔｔｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｒｔｓｃｈｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ． ６６：３２−３５， １９９８）。このことに関連する応用分野は、一次止血においてセロトニンを関与させるという新知見である。セロトニン輸送の制限方法において作用する抗鬱剤の副作用の一つは、急性出血性症状発現が起こり易いことであり、明らかにこれは治療患者の血小板へのセロトニン貯蔵が不十分なためである。すなわち、血小板のセロトニン輸送体は、中枢神経系のセロトニン輸送体である抗鬱剤の特異的標的と同一であると言える。このような出血性症状発現の場合には、通常において抗鬱剤は置換され、苦しむ患者状態の衰弱ならびにうつ病により誘発される自殺危険度の増加ををもたらす。これは、上記の急性出血性症状発現中の市販品のフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）投与により回避することができる。
【００１７】
ｂ）子癇前症でのセロトニン濃度の上昇は、ＣＤ４＋−Ｔ細胞亜群増加と相関関係にある。末梢ＴＰＨアイソフォーム特異的阻害剤を用いることにより、顕著な子癇前症の初期治療が可能となる。この治療は母体および胎児の脳でのセロトニン生合成のどちらにも影響を及ぼさない。
【００１８】
ｃ）これらの適用に加え、末梢にのみ作用する阻害剤の移植薬剤への陽性の効果が達成されうる。最も一般的に使用される物質シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の腎臓性、肝臓性、及び神経性の毒性副作用により、通常の免疫抑制治療の決定的制限が生じる。ＣｓＡとＦＫ５０６やラパマイシンとの併用調剤のような比較的最近の天然起源の免疫抑制剤により、ＣｓＡを低用量で適用することができ、低副作用性の効果的（相加的）な免疫抑制治療が可能となる。
【００１９】
ＣｓＡやＦＫ５０６やラパマイシンといった毒性物質を低用量で適用することにより、低血中レベルのセロトニンによる免疫抑制効果を得ることができる。
【００２０】
本発明によれば、ｎＴＰＨ及び／又はＴＰＨ制御の処置は、以下の方法で行うことができる：
ｎＴＰＨ及び／又はｐＴＰＨ特異的下方制御は、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、あるいはアンチセンスＲＮＡ発現により、分子生物学的手法を用いてなし得る。これらの方法においては、アイソフォームのｍＲＮＡの配列の違いにより各ｍＲＮＡ一分子につき一回限りの変調作用が直ちに可能となる。更に、本発明により、例えばｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニンのようなＴＰＨ特異的阻害剤を用いた薬理学的設定もまた適用される。
【００２１】
セロトニン産生は、分子生物学的手法を用いたＴＰＨアイソフォームの組織特異的過剰発現により刺激されることが望ましいが、例えば前駆化合物５−ヒドロキシトリプトファンのみならず、置換類似体、そして最後に述べるが特にセロトニン自体の薬理学的投与も可能である。
【００２２】
神経性疾患の診断に関する本発明の方法は、末梢のセロトニン生合成の特異的阻害、これに続く中枢神経系由来の代謝産物濃度の決定、そして相対曲線に基づく疾患進行度の把握により特徴付けられる。本発明の方法ためには、血液脳関門を通過できない化合物を用いることが必要である。
【００２３】
更に本発明は、その調節ドメイン（触媒領域は同一である）が既知のＴＰＨと異なる、新しく同定されたニューロンのトリプトファン水酸化酵素（ｎＴＰＨ）に関する。ｎＴＰＨは配列表１に図示するアミノ酸配列を有する。
【００２４】
実施形態（図）に基づいて本発明を以下に詳しく説明する。
図１．ＴＰＨ（−／−）−マウスの作出
Ａ． ターゲッティング法の模式図。ＴＰＨ遺伝子の１１エキソンの最初の４つを示す。ノックアウトコンストラクトは、相同組み換えによりＥＳ細胞の一つの対立遺伝子に挿入され、ＴＰＨ遺伝子の最初にコードするエキソンは不活性化された。更に、挿入されたネオマイシン耐性カセットは転写停止配列を含んでいた。野生型及び欠失型の確認のための分析用アンプリコンの位置を、内部及び外部サザンブロット・プローブの位置とともに示す。サザンブロットでの野生型及び欠失型動物を確認できる同一のＥｃｏＲＩ部位を太字（ＲＩ）で示す。制限部位：ＲＩ： Ｅｃｏ ＲＩ； Ｈｄ： Ｈｉｎｄ ＩＩＩ； Ｂｍ：Ｂａｍ ＨＩ； Ｓｃ：Ｓａｃ Ｉ。
Ｂ． アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の分析。Ａで述べたように、野生型対立遺伝子では１．１ｋｂ断片が、欠失型対立遺伝子については１．３ｋｂ断片が、それぞれ得られた。
Ｃ． ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット試験。Ａで述べたように、両プローブは野生型対立遺伝子では１０ｋｂ断片を、欠失型対立遺伝子については８ｋｂ断片を検出する。
【００２５】
図２。末梢組織でのトリプトファン（Ｔｒｐ）とセロトニン（５−ＨＴ）ならびに脳の選択した領域でのＴｒｐ、５−ＨＴ及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）との定量化。
Ａ． １２９ＳｖＪ−、Ｃ５７ＢＬ／６−、ＴＰＨ（−／−）−、及びＴＰＨ（＋／＋）−マウスの全血並びに十二指腸サンプルにおけるＴｒｐと５−ＨＴ。Ｎ．ｄ：検出せず（＜２５ｆｇ／μｌ）。＊：他のすべてのマウス系統に比較して統計的に有意（ｐ＜０．０５）。
Ｂ． １２９ＳｖＪ−、Ｃ５７ＢＬ／６−、ＴＰＨ（−／−）−、及びＴＰＨ（＋／＋）−マウスの海馬及び前頭皮質サンプルにおけるＴｒｐ、５−ＨＴ、及び５−ＨＩＡＡ。＊：他のすべてのマウス系統に比較して統計的に有意（ｐ＜０．０５）。５−ＨＴは、ＴＰＨ（＋／＋）−マウスに較べてＴＰＨ（−／−）−マウスの海馬で有意に低い。しかし、他の研究所内マウス系統との比較はしなかった。
【００２６】
図３。ＴＰＨ（−／−）−マウスにおける止血障害
Ａ． ＴＰＨ（−／−）−動物の出血時間の遅延。対照動物の正常な出血時間は８〜１１分である。一方ＴＰＨ（−／−）−マウスは平均で３５分間出血する。
Ｂ． 心臓内５−ＨＴ注入による表現型の回復。作用させた５−ＨＴ量は正常な血中濃度の１／１０及び１０倍であった。
Ｃ． 心臓内フォン・ウィルブランド因子注入による表現型の回復。効果はＴＰＨノックアウトマウスに特異的である。一方、対照動物は影響を受けない。
【００２７】
図４。ＴＰＨ（−／−）−マウスにおけるＴ細胞を介する免疫応答の障害。
Ａ． オキサゾロン処理後の、Ｔ細胞を介する遅延性過敏症の指標である耳の純膨化のタイムコースを示す。ＴＰＨ（−／−）−マウスはアレルギー性膨化反応を示さない。
Ｂ． フローサイトメトリーを用いたＴＰＨ（−／−）−動物の末梢血中の白血球亜群の決定。ＣＤ４＋−Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ３＋）のみが有意に減少した（ｐ＜０．０５）が、ＣＤ８＋ −Ｔ細胞はそうでなかった。
Ｃ． 皮膚二次移植の拒絶反応の例示的図示。矢頭は最初の移植に対する感受性を示し、矢印は２次移植を示す。移植で良好に治癒したＴＰＨ（−／−）−動物と比較して、ＴＰＨ（＋／＋）−及びＣ５７ＢＬ／６−動物への移植は、創傷の外縁（白色拒絶反応）において同時に起こる不十分な脈管再生及び感染により同定されるか、あるいは既に完全に拒絶反応を示す（Ｃ５７ＢＬ／６−動物での１次移植と二つの２次移植）。
【００２８】
図５。マウスにおけるＴＰＨ発現の複雑性。
Ａ． 公表されたｃＤＮＡ（Ｓｔｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０）のエキソン３に３４ｂｐの伸張を有する単離された択一的スプライシングｃＤＮＡの配列アラインメントとゲノムＤＮＡ。染色体ＤＮＡは、エキソン３のスプライシング・ドナー部位の直後に３４ｂｐ伸張を有し、必須のＧＴジヌクレオチドが続き、伸張したエキソン３は次に示されるエキソン３ｂ内にある。
Ｂ． ５Ａで記述したｃＤＮＡによる８０μｇの上記組織の総ＲＮＡおよび１０μｇの肥満細胞細胞Ｐ８１５（２ｘ）を用いたＲＮＡａｓｅプロテクションアッセイ。プローブは、マウスＴＰＨ−ｍＲＮＡの６つのスプライシング変異体を明確に同定する。３種の変異体の一群のみがＴＰＨ−ＫＯマウスで発現されることに注目すべきである。ＴＰＨ−ＫＯ（−／−）動物の直腸と肺で確かめることのできる既知のＴＰＨ−ｍＲＮＡの位置における薄いバンドは変異体間の高いホモロジーに起因する。Ｐ８１５−ＲＮＡは組織中のＴＰＨの発現が比較してみると如何に低いか、つまり検出可能水準ぎりぎりかを示す。
Ｃ． エキソン３とエキソン４との間における択一的スプライシング。関与するスプライシング・ドナー部位（ＳＤＳ）及びスプライシング・アクセプター部位（ＳＡＳ）を示す。公表された配列中のこれらの配列部分をエキソン３ａ及びエキソン４ａとしてマークする。ＳＡＳ１とＳＤＳ２とのスプライシングの結果、ＴＰＨアイソフォームの調節ドメインのみをコードするＣ変異体が生じる（図７Ｂを参照）。エキソン４の内部のＳＡＳ２とＳＤＳ２とのスプライシングにより、エキソン３ｂにおける３４ｂｐの追加に起因するフレーム・シフトを排除する。不変領域は軽い灰色に、択一的セグメントは暗灰色に影付けする。更に、択一的セグメントは、隣接するイントロン配列と同様にイタリック体で示してある。
【００２９】
図６。新規エキソン２ｂの解析。
Ａ． 隣接する配列を有するマウスのエキソン２ｂのゲノム配列。トリヌクレオチド表記法によりＯＲＦを太字で記す。５’側の隣接領域では、想定される新規プロモーター部分を示す。プロモーター部分では一つのＴＡＴＡボックス及び最も可能性の高い転写開始（＋１）を示す。３’側の領域では、エキソン２ｂのスプライシング・ドナー部位を図示する。イントロン配列はイタリックの小文字で示され、そこでは５３ｂｐの短いイントロンとＯＲＦセグメントを線を用いて架橋している。分かり易くするため、スプライシング・ドナー部位、スプライシング・分岐部位、ならびにスプライシング・アクセプター部位の下に、各々の共通配列を示す。
Ｂ． 新規エキソン２ｂのエキソン・イントロン構造の考察。マウスでの８の塩基のうちの５つが、スプライシング・ドナー部位（太字で下線付き）のコンセンサス配列と確認される、それはラットで４つ、ヒトで３つ確認される。マウスでの新規エキソン２及びエキソン３の間のイントロンは正確に９４８ｂｐであり、ラット及びヒトに類似する。
【００３０】
図７。ＴＰＨ遺伝子構造の模式図。
Ａ． 調節ドメイン（下部）の遺伝子セグメントについての本研究で得られた構造と既知のスプライシング構造（上部）の模式的比較。実験的証明により裏付けられるプロモーターの位置をＰ２で示す。
Ｂ． 新規のｍＲＮＡ変異体の構築。プロモーター１は末梢において第一に活性が高い。一方、新規のプロモーター２は中枢神経系における発現に関与している。変異体Ａとして示したｍＲＮＡは、ＴＰＨ−ｍＲＮＡの既知の形状である。変異体Ａ’は既に単離されており、活性ＴＰＨアイソフォームをコードしている。変異体Ｂ及びＢ’はまだ単離されていないが、ＲＮＡａｓｅプロテクションアッセイにより数回は明らかに同定されている。変異体Ｃ及びＣ’は調節ドメインのみの発現を誘導する。分かり易くするため、全体で１１エキソンのうち６番目のエキソンまでのｍＲＮＡ類のみを示す。
【００３１】
図８。他のＡＡＡＨ類を有するＴＰＨの新規調節ドメインのアミノ酸配列アラインメント。
配列の上部はＴＰＨの新規部分を示す。下部は、ＡＡＡＨ類の調節ドメインにおいて配列が保存されている部分を示す。各配列を互いに、ｃｌｕａｔａｌＷ−プログラムを用いてアラインし、手動により構築する。そして、同一の構成要素を示すために大きい間隙を部分的に許容している顕著な配列モチーフを枠で囲み、各々命名している。５つのモチーフのうちの４つは、ＰＡＨの二次構造における構成要素と同一である。ＩＥＤＮモチーフと部分的に重複し、調節ドメイン領域は、枠で囲って灰色の影付けがしてあり、ＰＡＨの結晶学的試験により知られている触媒中心の溝に到達している。更なる説明は本文中にある。用いた配列は：ｎｓｔｐｈ＝マウスのニューロン特異的ＴＰＨ（新規変異体）、ｍｕｓｔｈ＝マウスのＴＨ、ｍｕｓｐａｈ及びｈｕｍｐａｈ＝マウス及びヒトのＰＡＨ、ｐｔｐｈ＝マウスの末梢ＴＰＨ（既知の変異体）。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＰＨ（−／−）マウスの作出を表す。
【図２】末梢組織でのトリプトファン（Ｔｒｐ）とセロトニン（５−ＨＴ）ならびにＭの選択した領域でのＴｒｐ、５−ＨＴ及び５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）との定量化を表す。
【図３】ＴＰＨ（−／−）−マウスにおける止血障害を表す。
【図４】ＴＰＨ（−／−）−マウスにおけるＴ細胞を介する免疫応答障害を表す。
【図５】マウスにおけるＴＰＨ発現の複雑性を示す。
【図６】新規エキソン２ｂの解析を示す。
【図７】ＴＰＨ遺伝子構造の模式図である。
【図８】他のＡＡＡＨ類を有するＴＰＨの新規調節ドメインのアミノ酸配列アラインメントを示す。
Claims (22)
- ＴＰＨ及び／又はｎＴＰＨ活性の特異的制御によるセロトニンレベルの変調方法。
- ＴＰＨ及び／又はｎＴＰＨ制御変調によるセロトニン産生の増加又は減少を特徴とする神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法。
- 末梢セロトニン生合成の特異的阻害、中枢神経系から生じる代謝産物濃度の決定、及び相対曲線を用いた疾患進行度の決定を特徴とする請求項２に記載の神経性疾患の診断方法。
- ＴＰＨ制御変調によるセロトニン産生増加を特徴とする請求項２に記載の一次止血障害の治療方法。
- セロトニン産生増加又はセロトニン投与を特徴とする請求項２に記載の一次止血障害の治療方法。
- 組織特異的過剰発現によるセロトニン産生増加を特徴とする請求項５に記載の一次止血障害の治療方法。
- 前駆物質である５−ヒドロキシトリプトファン投与によるセロトニン産生増加を特徴とする請求項５又は６に記載の一次止血障害の治療方法。
- ５−ヒドロキシトリプトファンの置換類似体添加によるセロトニン産生増加を特徴とする請求項５又は６に記載の一次止血障害の治療方法。
- セロトニン産生低下を特徴とする動脈硬化／血栓症の治療方法。
- リボザイムによるセロトニン産生低下を特徴とする請求項９に記載の動脈硬化／血栓症の治療方法。
- アンチセンスオリゴヌクレオチドによるセロトニン産生低下を特徴とする請求項９に記載の動脈硬化／血栓症の治療方法。
- アンチセンスＲＮＡ発現によるセロトニン産生低下を特徴とする請求項９に記載の動脈硬化／血栓症の治療方法。
- ｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニンのような特異的ＴＰＨ阻害剤使用によるセロトニン産生低下を特徴とする請求項９に記載の動脈硬化／血栓症の治療方法。
- 請求項９〜１３のいずれかに記載の真性糖尿病において生じる動脈硬化／血栓症の治療方法。
- セロトニン産生低下を特徴とする、免疫系過剰反応又は不要な正常反応（例えば、アレルギー、免疫疾患及び自己免疫疾患、子癇前症のような危険性妊娠、免疫抑制治療のための移植医療）の治療方法。
- セロトニン産生を低下させる阻害剤（リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ発現、ｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニン）を含有する請求項１５に記載の子癇前症の治療用薬剤。
- セロトニン産生を低下させる阻害剤（リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ発現、ｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニン）を含有する請求項１５に記載のアレルギー治療用薬剤。
- セロトニン産生を低下させる阻害剤（リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ発現、ｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニン）を含有する請求項１５に記載の免疫疾患及び自己免疫疾患治療用薬剤。
- セロトニン再取り込み輸送体に作用し、抗鬱剤とフォン・ウィルブランド因子とを含有する、抗鬱剤を用いた鬱の精神薬理学的治療における出血症状発現治療用の併用薬剤。
- セロトニン産生を低下させる通常の免疫抑制剤（例えば、ＣｓＡ、ＦＫ５０６又はラパマイシン）及び阻害剤（例えば、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ発現、ｐ−クロロフェニルアラニン又はｐ−エチニルフェニルアラニン）を含有する、移植における免疫抑制治療用の併用薬剤。
- 配列表１に示したニューロンＴＰＨの配列。
- ＴＰＨ遺伝子の最初にコードするエキソンが不活性化された末梢セロトニン欠失動物の作出のためのＤＮＡコンストラクト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10043124A DE10043124A1 (de) | 2000-08-31 | 2000-08-31 | Verfahren zur Diagnostik von neuronalen Erkrankungen sowie zur Behandlung der defizienten primären Hämostase |
| PCT/DE2001/003178 WO2002017891A2 (de) | 2000-08-31 | 2001-08-27 | Verfahren zur diagnostik von neuronalen erkrankungen sowie zur behandlung der defizienten primären hämostase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004507491A true JP2004507491A (ja) | 2004-03-11 |
Family
ID=7654658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002522865A Withdrawn JP2004507491A (ja) | 2000-08-31 | 2001-08-27 | 神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7049336B2 (ja) |
| EP (1) | EP1317265A2 (ja) |
| JP (1) | JP2004507491A (ja) |
| DE (1) | DE10043124A1 (ja) |
| WO (1) | WO2002017891A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010531889A (ja) * | 2007-06-26 | 2010-09-30 | レクシコン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | トリプトファンヒドロキシラーゼ阻害剤を含む組成物 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10232151A1 (de) * | 2002-07-16 | 2004-02-05 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Neuronal exprimierte Tryptophanhydroxylase und ihre Verwendung |
| JP2007510406A (ja) * | 2003-10-24 | 2007-04-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | トリプトファン水酸化酵素アイソフォーム２の発現に影響を与える化合物の同定方法 |
| CN105816858A (zh) * | 2007-12-28 | 2016-08-03 | 巴克斯特国际公司 | 重组vwf配方 |
| US11197916B2 (en) | 2007-12-28 | 2021-12-14 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Lyophilized recombinant VWF formulations |
| CN102387784B (zh) * | 2008-10-21 | 2014-04-02 | 巴克斯特国际公司 | 冻干的重组vwf配方 |
| BR112012016918A2 (pt) * | 2009-12-21 | 2016-04-12 | Univ College Cork Nat Univ Ie | detecção do risco de pré-eclâmpsia |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3686414A (en) * | 1969-03-06 | 1972-08-22 | Billie Kenneth Koe | P-chlorobenzyl compounds and their serotonin lowering ability |
| AU8770282A (en) * | 1981-08-27 | 1983-03-03 | Shaun R. Coughlin | Composition for the treatment of atherosclerosis |
| DE3650733T2 (de) * | 1985-09-11 | 2000-05-04 | Btg Int Ltd | Pharmazeutische Zubereitungen und medizinische Verwendungen von Dioxopiperidinderivaten, insbesondere als Verstärker der Immunantwort sowie als antivirale und antibakterielle Wirkstoffe |
| DE10112882A1 (de) * | 2001-03-15 | 2002-09-19 | Max Delbrueck Centrum | Verwendung von Tryptophan-Derivaten zur spezifischen zytostatischen Behandlung von Serotonin-produzierenden Tumoren |
-
2000
- 2000-08-31 DE DE10043124A patent/DE10043124A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-08-27 EP EP01971618A patent/EP1317265A2/de not_active Ceased
- 2001-08-27 US US10/363,474 patent/US7049336B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-27 JP JP2002522865A patent/JP2004507491A/ja not_active Withdrawn
- 2001-08-27 WO PCT/DE2001/003178 patent/WO2002017891A2/de not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010531889A (ja) * | 2007-06-26 | 2010-09-30 | レクシコン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | トリプトファンヒドロキシラーゼ阻害剤を含む組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002017891A2 (de) | 2002-03-07 |
| DE10043124A1 (de) | 2002-03-14 |
| US20040014656A1 (en) | 2004-01-22 |
| US7049336B2 (en) | 2006-05-23 |
| WO2002017891A3 (de) | 2002-10-17 |
| EP1317265A2 (de) | 2003-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ding et al. | Pressure overload induces severe hypertrophy in mice treated with cyclosporine, an inhibitor of calcineurin | |
| Iniaghe et al. | Dimethyl fumarate confers neuroprotection by casein kinase 2 phosphorylation of Nrf2 in murine intracerebral hemorrhage | |
| Kiuru-Enari et al. | Hereditary gelsolin amyloidosis | |
| EP1545560B1 (de) | Zusammensetzungen zur hemmung der proteinkinase c alpha zur behandlung von diabetes mellitus | |
| Bolino et al. | Niacin‐mediated Tace activation ameliorates CMT neuropathies with focal hypermyelination | |
| Bersano et al. | Heritable and non-heritable uncommon causes of stroke | |
| US20130210899A1 (en) | Method and Therapeutic for the Treatment and Regulation of Memory Formation | |
| Wang et al. | Estrogen modulation of eNOS activity and its association with caveolin-3 and calmodulin in rat hearts | |
| EP3849618A1 (en) | Compositions and methods for hemoglobin production | |
| Fang et al. | Central galanin receptor 2 mediates galanin action to promote systemic glucose metabolism of type 2 diabetic rats | |
| Aungst et al. | Critical role of trkB receptors in reactive axonal sprouting and hyperexcitability after axonal injury | |
| US5888982A (en) | Regulation of vascular smooth muscle cell heme oxygenase-1 | |
| Odiete et al. | Type 1 diabetes mellitus abrogates compensatory augmentation of myocardial neuregulin-1β/ErbB in response to myocardial infarction resulting in worsening heart failure | |
| Tamayo et al. | Beneficial effects of paricalcitol on cardiac dysfunction and remodelling in a model of established heart failure | |
| JP2004507491A (ja) | 神経性疾患の診断及び一次止血障害の治療の方法 | |
| Thollon et al. | If inhibition in cardiovascular diseases | |
| WO2021145871A1 (en) | A method of treatment in predisposed subjects for lmna-related dilated cardiomyopathy | |
| Zhou et al. | Antiarrhythmic effects of beta3-adrenergic receptor stimulation in a canine model of ventricular tachycardia | |
| Poewe et al. | Parkinson disease (Primer) | |
| Yang et al. | Molecular approaches for the treatment and prevention of Friedreich's ataxia | |
| EP1057489B1 (en) | Use of midkine family proteins in the treatment of ischemic diseases | |
| Yu et al. | Effect of hemorrhagic shock on apoptosis and energy-dependent efflux system in the brain | |
| JP2019505549A (ja) | ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長症候群（ＰＲＯＳ ＣＬＯＶａＳ症候群）の処置に使用するためのＢＹＬ７１９（アルペリシブ） | |
| Cwerman-Thibault et al. | Neuroglobin effectively halts vision loss in Harlequin mice at an advanced stage of optic nerve degeneration | |
| Haj Salem et al. | Autosomal recessive cerebellar ataxias |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20081104 |