WO2002013796A2 - Verwendung von protonenpumpen-hemmern zur behandlung von erkrankungen des bewegungsapparates - Google Patents

Verwendung von protonenpumpen-hemmern zur behandlung von erkrankungen des bewegungsapparates Download PDF

Info

Publication number
WO2002013796A2
WO2002013796A2 PCT/DE2001/003179 DE0103179W WO0213796A2 WO 2002013796 A2 WO2002013796 A2 WO 2002013796A2 DE 0103179 W DE0103179 W DE 0103179W WO 0213796 A2 WO0213796 A2 WO 0213796A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
proton pump
fibroblasts
cells
Prior art date
Application number
PCT/DE2001/003179
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002013796A3 (de
Inventor
Wilhelm Aicher
Steffen Gay
Michael George
Otto Müller
Thomas Pap
Wolfgang Parak
Original Assignee
Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum filed Critical Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum
Priority to DE10193322T priority Critical patent/DE10193322D2/de
Priority to AU2001291604A priority patent/AU2001291604A1/en
Publication of WO2002013796A2 publication Critical patent/WO2002013796A2/de
Publication of WO2002013796A3 publication Critical patent/WO2002013796A3/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis

Definitions

  • the present invention is concerned with musculoskeletal disorders such as Bone cancer (sarcomas %), osteoarthritis, osteoporosis, arthritis (including rheumatoid arthritis), aseptic loosening of the prosthesis etc.
  • the present invention is concerned with the treatment, early diagnosis and prevention of such diseases of the musculoskeletal system.
  • Bones are the supporting organ of the trunk and extremities. They are made up of collagen fibers and mineral salts and are subject to constant reconstruction. The bone mass is kept in a physiological balance between breakdown and build-up. Under pathological conditions such as osteoporosis, bone loss predominates.
  • the bone is broken down by osteoclasts and built up by osteoblasts, which differentiate into osteocytes.
  • the osteoblasts primarily express collagen, other matrix proteins and enzymes for mineralization, such as, for example, alkaline phosphatase.
  • matrix-degrading proteases such as Cathepsin also releases acid by expressing a specific ATPase that releases protons into the pericellular milieu.
  • This "proton pump” has homology to lysosoalen proton pumps and corresponding enzymes in kidney cells.
  • Rheumatoid arthritis is a chronic inflammatory autoimmune disease, the pathogenesis of which is largely unknown.
  • a characteristic feature of rheumatoid arthritis and aseptic loosening of the prosthesis is bone resorption through hyperplastic fibrous tissue.
  • activated fibroblast-like cells play an important role in the pathogenesis of pathological conditions in which the extracellular matrix is degraded by an inflamed and hyperplastic fibrous tissue.
  • synovial fibroblasts express relevant matrix-degrading enzymes and release factors which increase the activity of osteoclasts and facilitate the differentiation of macrophages into osteoclasts.
  • activated synovial fibroblasts of rheumatoid arthritis are effector cells that express matrix-degrading proteases such as collagenase, stromelysin and cathepsin in comparison with other fibroblasts with increased levels. It is known that an acidic pH environment is required for optimal cathepsin activity.
  • the literature assumes that macrophages or osteoclasts are responsible for proton production related to bone loss or remodeling; see Väänänen, in: Bilezinka, Raisz and Rodan (ed.): Principles of Bone Biology, Acad. Press, San Diego, USA, 1996, pages 103-114.
  • WO 89/03829 proposes omeprazole as an inhibitor of osteoporosis in order to increase the incorporation of calcium into the skeleton.
  • this object is achieved by the use of inhibitors for proton pumps for the treatment of diseases or pathological conditions of the musculoskeletal system which are associated with osteoblasts, fibroblasts and / or fibroblast-like cells.
  • the invention is further achieved by the use of an agent which serves to detect the expression of a proton pump in fibroblasts, osteoblasts and / or fibroblast-like cells in the diagnosis of diseases or pathological conditions of the musculoskeletal system.
  • the invention is solved by a diagnostic means for the detection of the pathologically changed expression of a Proton pump in fibroblasts, fibroblast-like cells and / or osteoblasts, which contains at least one nucleic acid molecule that hybridizes with a section of a gene coding for the proton pump.
  • the gene can be a primary transcript RNA (hnRNA) or a processed mRNA, but it is e.g. it is also conceivable to use antibodies against these gene products and / or the proton pump for detection.
  • hnRNA primary transcript RNA
  • mRNA processed mRNA
  • the inventors of the present application were able to show for the first time that when excited, PLF releases large amounts of acid components which contribute to the ability of the PLF to decalcify (decalcify) bones prior to their degradation and at the same time to change collagen fibers so that they are more easily soluble and therefore are degradable by collagenases.
  • the inventors were also able to show that activated synovial fibroblasts from patients with rheumatoid arthritis and prosthetic loosening fibroblasts express an mRNA for a proton pump. This proton pump was also found in osteoblasts. This detection of a proton pump on these mesenchymal cells, which the inventors succeeded for the first time, has surprising effects on the treatment and diagnosis options of many diseases of the musculoskeletal system.
  • the inventors were able to show that the proton pump expressed in the membrane inhibited by certain proton pump inhibitors can be.
  • the acidification of the extracellular medium without the use of the proton pump inhibitor decreases significantly after a proton pump inhibitor has been added. This not only shows that the extracellular acidification is caused by the proton pump, but also that it is a membrane-based proton pump. If the extracellular acidification was caused by a transport process from inside the PLF, the effect of the inhibition would take place much more slowly than with a membrane-based proton pump that builds up an extracellular pH gradient.
  • WO 99/66910 also describes osteoclasts as a starting point for therapies to prevent bone resorption.
  • the inventors of the present application have recognized that the osteoblasts, which are present in much greater numbers than osteoclasts and are also more durable, and the fibroblasts can also contribute to bone loss, so that these mesenchymal cells are surprisingly an excellent target for the treatment of diseases or pathological conditions of the musculoskeletal system represent.
  • the invention also relates to the use of substances to inhibit the expression or function of a proton pump, preferably expressed in the membrane, in fibroblasts and osteoblasts, which are associated with pathological processes, in particular of the musculoskeletal system, such as matrix degradation, rheumatoid arthritis, aseptic prosthetic loosening (APL), osteoporosis etc. are associated.
  • pathological processes in particular of the musculoskeletal system, such as matrix degradation, rheumatoid arthritis, aseptic prosthetic loosening (APL), osteoporosis etc. are associated.
  • the invention is not limited to pathological processes of the musculoskeletal system, but rather relates generally to mechanisms that include extracellular matrix. This is borne out by the fact that fibroblasts are ubiquitous in the body.
  • V-ATPase a proton pump which is expressed by synovial fibroblasts or prosthetic loosening fibroblasts, is involved in the pathological conditions mentioned.
  • V-ATPase The main inhibitors for H + -ATPase (called V-ATPase) are: bafilomycin AI, amiloride, KN0 3 , N-ethyl-maleimide, dicyclohexylcarbodiimide (DCCD), diethylstilbestrol, tributyltin, anti-sense nucleic acid molecules, peptides.
  • the inventors were able to detect the mRNA for beta 1H + -ATPase by RT-PCR. Very high levels of this mRNA could be detected in synovial fibroblasts or prosthetic loosening fibroblasts, so that means for detecting this mRNA or the still unprocessed hnRNA are suitable to be used as diagnostic means for detecting the pathological conditions mentioned at the beginning.
  • RT-PCR polymerase chain reaction
  • probe sequences can also be used which hybridize to the mRNA or the hnRNA.
  • Suitable primers for the PCR detection of the proton pump have the following sequences:
  • the invention also relates to the use of these primers for diagnostic purposes.
  • the invention further relates to nucleic acid molecules that bind to a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with the two primers mentioned above. This is based on the knowledge that nucleic acid molecules hybridizing to the mRNA or hnRNA can also be used as primers under stringent conditions, which differ in sequence from the primers mentioned above, but have the same primer binding site on the RNA. In addition, it is also possible that the primers are only part of a longer RNA molecule which has further nucleotides at the 3 'and / or 5' end which are complementary to the corresponding nucleotides in the target RNA.
  • the invention further relates to the use of such nucleic acid molecules at the DNA and / or RNA level in the context of therapy. As so-called anti-sense nucleic acid molecules, they can bind to the DNA or RNA in the affected cells and thus inhibit transcription, processing and / or translation and thus the expression of the proton pump in question.
  • This function can also be achieved by appropriate peptides that either bind to the coding DNA, the hnRNA or mRNA, or directly to the synthesized protein, in order to prevent the expression of the proton pump on the membrane of the fibroblasts.
  • fibroblasts involved in RA or APL express membrane-based proton pumps
  • means and measures have been provided in order not only to treat pathological conditions of the musculoskeletal system but also to be able to diagnose them at an early stage.
  • the diagnosis is based on the early detection of a high level of hnRNA or mRNA, which leads to the expression of the proton pump.
  • the therapy can also attack mRNA or hnRNA, but also the coding DNA, to prevent expression of the proton pump.
  • proton pump inhibitors in order to inhibit the function of proton pumps that have already been expressed.
  • Fibroblasts express both RA and APL enzymes that are involved in bone resorption.
  • the fibroblasts effect the required decalcification of the bone matrix before the breakdown by significantly lowering the pericellular pH value through the proton pump found.
  • activated fibroblast-like cells in pathological conditions such as RA or APL can contribute directly to these conditions, so that, according to the inventors' knowledge, they are new targets for early detection and treatment of bone resorption in pathological conditions.
  • FIG. 1 shows the degradation of bones by prosthetic loosening fibroblasts (PLF) using a hematoxilin-eosin stain; when PLF is implanted with normal human bone tissue in SCID mice, it attaches to and penetrates deeply into the bone matrix (A, amplification x630); small pieces of bone are even reshaped by the fibroblasts (B, reinforcement x630); when implanted with PLF, both cartilage and bone are destroyed (C, reinforcement x630);
  • PLF prosthetic loosening fibroblasts
  • FIG. 2 shows that PLF releases large amounts of acidic components when stimulated with TNF-alpha; PLF were seeded on polycarbonate membrane dishes and pericellular acidification was measured using a cytoscopic microphysiometer; stimulation with different concentrations of TNF-alpha led to rapid acidification of the pericellular milieu; when stimulated with 10 ng / ml recombinant human TNF-alpha, the acidification reached a peak increase of 15% after 20 minutes;
  • FIG. 3 shows a curve comparable to that in FIG. 2, but for RA-FLS; the acidification reached its maximum increase of 60% when stimulated with 1 ng / ml TNF-alpha;
  • FIG. 4 shows a curve comparable to that in FIG. 3, but for early-passage osteoblasts; 5 shows in a representation similar to FIG. 2 the maximum change in acidification in percent for the addition of different concentrations of the proton pump inhibitors amiloride and bafilomycin for PLF;
  • FIG. 7 shows in a representation like FIG. 6 the time course of the change in the acidification for PLF when l ⁇ M bafilomycin is added between 40 and 75 min.
  • Example 1 Isolation of fibroblast-like cells
  • Tissue samples were taken from two patients with RA as part of a synoviorthesis. Normal synovial tissue was autopsied from individuals without an arthritic history.
  • Tissue samples from the synovial border membrane around loose, cemented hip prostheses were taken from five patients during a control operation.
  • Example 2 Bone and cartilage breakdown in the SCID mouse model
  • the SCID mouse co-implantation model was used.
  • human fibroblast-like cells are implanted together with normal human bone tissue and articular cartilage in mice with severe combined immunodeficiency (Severe Combined Immunodeficiency: SCID) and left there for 60 days. Since the SCID mice do not reject the human grafts, this model allows the investigation of the invasion of the fibroblast-like cells into the co-implanted bone tissue and articular cartilage in the absence of human inflammatory cells.
  • fibroblast-like cells together with bone tissue and articular cartilage was carried out according to the procedure described by Müller-Ladner, loc. Cit. Briefly, 10 5 cells after trypsinization, washing and centrifugation were taken up in 100 ⁇ l sterile culture medium and placed in the cavity of a sterile swab together with a 1 mm 3 piece of normal bone tissue and articular cartilage. The mice were anesthetized and the left kidney exposed, after which an implant was placed under the kidney capsule after a small incision. The peritoneal layer and skin were then sutured. After 60 days, the mice were sacrificed and the implants removed. The tissue was fixed in 4% buffered formalin and embedded in paraffin.
  • Fig. 1A it can be seen that the PLF had attached to the bone surface and resorbed the bone. In all of the samples examined, the PLF grew around the pieces of bone and created clear areas of absorption.
  • ultrasensitive pH measurements were carried out in the direct pericellular environment with a cytosensor microphysiometer (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, US).
  • This device includes a highly sensitive pH sensor, which is based on the light-addressable potentiometric sensor (LAPS) and contains a computer-controlled perfusion system; see, for example, Hafeman et al., Science 1998, volume 240, pages 1182-1185; Parce et al., Science 1989, Vol. 246, pp. 243-247; McConnell et al., Science 1992, vol. 257, pages 1906-1912; and Uwicka et al., Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 1994, volume 23, pages 87-113.
  • LAPS light-addressable potentiometric sensor
  • This device allows detection of proton production in the pericellular medium as the cells grow in membrane dishes positioned on a cytosensor chip used to measure acidification.
  • PLF and RA-FLS were in polycarbonate membrane dishes (Transverse 3402, pore size 3 ⁇ m, Corning Costar, Bodenheim, Germany) two days before the experiments at an initial density of 3 x 10 5 cells / ml in 1 ml DMEM medium with 10% FCS seeded per membrane bowl.
  • the cells were cyclically added with medium with recombinant human TNF-alpha (30 U / ml, Röche Biochemicals, Röche, Basel, Switzerland), ionomycin (10 mg / ml, Biomol, Hamburg, Germany), or control medium activated.
  • the control medium contained DMSO.
  • the dishes were removed and the cells stained with Comassie blue to show the uniform distribution of the cells during the measurement.
  • Osteoblasts were isolated from the trabecular bone in three patients. The bone was cut into small sections, the pieces were washed with PBS and incubated in PBS / Collagenase (Type VII, 1700 U / ml, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) for 60 minutes at 37 ° C. The pieces were sedimented, washed and incubated in complete DMEM medium with 10% FCS, antibiotics and growth factors as described in Parak et al., J. Rheumatol (2000), volume 27, pages 2312-2322.
  • PBS / Collagenase Type VII, 1700 U / ml, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany
  • osteoblasts were expanded in monolayer cultures. To confirm the cell line, the expression of osteocalcine was detected by immunohistochemistry.
  • the cells from confluent cultures were harvested using trypsin / EDTA (Life Technologies Eggenstein, Germany), washed in PBS enriched with 1% FCS and counted.
  • the osteoblasts were placed on polycarbonate membrane dishes (Transwells 3402, pore size 3 ⁇ m, Corning Costar, Corning, USA) two days before the experiments with an initial density of 300,000 cells / ml sown in 1 ml of complete DMEM medium per membrane bowl. In order to avoid serum artifacts associated with the FCS present in the medium, the cells were washed and incubated in serum-free medium for 24 hours before the examination.
  • TNE- ⁇ was added to the cells as above and the acidification rate measured.
  • the expression of the human H + -transporting ATPase was examined by RT-PCR and non-radioactive in situ hybridization.
  • the expression of the mRNA for the 58 kDa beta 1 subunit (ATP6B1, GenBank accession no. NM 001692) of the human v-ATPase was examined and for this purpose the following specific primers were designed:
  • RNA from cultured PLF was extracted according to the manufacturer's instructions using the TRIzol (R) RNA isolation kit (Gibco-BRL). After the first strand cDNA synthesis using oligo-d (T) 12 _ 12 primers and M-MuLV reverse transcriptase (Roche Mannheim) was a poly erasekettenre force (PCR) using the Taq (R) DNA polymerase (Stratagene) carried out.
  • the amplification was carried out over 34 cycles at 60 ° C for one minute and 72 ° C for two minutes.
  • the PCR product was then ligated into the pPCR-ScriptAmp SK + vector (Stratagene) according to the manufacturer's instructions.
  • pPCR-ScriptAmp SK + vector (Stratagene) according to the manufacturer's instructions.
  • a large-scale preparation was carried out using the Qiagen MaxiPrep Kit (Qiagen).
  • Commercial dideoxi sequencing was performed to determine the identity of the cloned cDNA fragments.
  • PCR resulted in the amplification of cDNA fragments of the expected 786 base pairs of ATP6B1 for all PLF samples with 100% agreement of the sequence of the cloned fragments with the published gene bank sequence (NM 001692).
  • the expression of the ATP6B1 was determined by non-radioactive in situ hybridization of the SCID mouse sections using digoxigenin-labeled RNA probes.
  • cDNA fragments cloned as described above were obtained by plasmid preparation and linearized to generate templates for hybridization with BamHl and Motl restriction enzymes.
  • Anti-sense and sense RNA probes were obtained by in vitro transcription with T3 and T7 RNA polymerase and a commercially available transcription kit (Stratagene) and labeled with digoxigenin UTP (Röche Mannheim).
  • the hybridized probes were detected using anti-digoxigenin Fab fragments which were coupled to alkaline phosphatase and NBT / BCIB substrate (Röche Mannheim). Negative control experiments were carried out using the appropriate sense probes.
  • both the ATPase inhibitor amiloride, which also inhibits v-ATPase at higher concentrations, and the specific v-ATPase inhibitor bafilomycin AI at different concentrations were used to determine the time course of H + release compared to untreated PLF analyze.
  • Amiloride was used in concentrations between 200 ⁇ M and 1 mM, bafilomycin AI in concentrations between 10 " 8 and 10" 5 M. After 90 seconds, the inflow was stopped and the acidification in response to the cells measured for a period of 30 seconds; 5 shows some concentration-dependent values of the acidification in percent. The addition of amiloride reduced the pericellular acidification by up to 40%, which resulted from a significant decrease in the pericellular pH. The plateau of maximum inhibition of H + release was reached after only 15 minutes and remained stable over the entire measuring time of 45 minutes without further increase.
  • FIG. 6 shows an example of the reaction to 50 ⁇ amiloride with an approximately 10% decrease in acidification after a few minutes.
  • bafilomycin AI led to an inhibition of pericellular acidification at concentrations of 10 "6 M of approximately 10%. This effect was also observed 15 minutes after the addition of bafilomycin AI; see FIG. 7
  • the extracellular acidification is based on a membrane-associated mechanism, ie the membrane-based proton pump, and not on slow transport from the interior of the cell.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Ausgehend von der Erkenntnis, daß Rheuma- und Prothesenlockerungsfibroblasten sowie Osteoblasten membranständige Protonenpumpen exprimieren, die durch Ansäuerung des extrazellulären Mediums zum Knochenabbau beitragen, wird vorgeschlagen, derartige Erkrankungen durch Hemmstoffe für Protonenpumpen zu behandeln und den Nachweis der Expression einer derartigen Protonenpumpe zu diagnostischen Zwecken zu verwenden.

Description

Verwendung von Protonenpumpen-Hemmern zur Behandlung von Erkrankungen des Bewegungsapparates
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Erkrankungen des Bewegungsapparates wie z.B. Knochenkrebs (Sarkome...), Osteoar- throse, Osteoporose, Arthritis (einschl. rheumatoider Arthri- dis), aseptische Prothesenlockerung etc. Insbesondere beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit der Behandlung, der frühzeitigen Diagnose sowie Prävention derartiger Erkrankungen des Bewegungsapparates.
Knochen sind das Stützorgan des Rumpfes und der Extremitäten. Sie sind aus Collagenfasern und Mineralsalzen aufgebaut und unterliegen einem ständigen Umbau. Die Knochenmasse wird in einem physiologischen Gleichgewicht zwischen Ab- und Aufbau gehalten. Unter pathologischen Bedingungen wie bspw. der Osteoporose überwiegt dabei der Knochenabbau.
Der Knochen wird von Osteoklasten abgebaut und von Osteo- blasten aufgebaut, die dabei zu Osteozyten differenzieren. Die Osteoblasten exprimieren hierzu vor allem das Collagen, andere Matrixproteine und Enzyme zur Mineralisierung, wie beispielsweise die alkalische Phosphatase. Osteoklasten setzen dagegen neben matrixabbauenden Proteasen wie z.B. Cathepsin auch Säure frei, indem sie hierfür eine spezifische ATPase exprimieren, die Protonen ins perizelluläre Milieu abgibt. Diese "Protonenpumpe" weist eine Homologie zu lysoso alen Protonenpumpen und entsprechenden Enzymen in Nierenzellen auf.
Rheumatoide Arthritis ist eine chronische entzündliche Autoimmunkrankheit, deren Pathogenese größtenteils unbekannt ist. Eine charakteristische Eigenschaft von rheumatoider Arthritis und aseptischer Prothesenlockerung ist die Knochenresorption durch hyperplastisches fibröses Gewebe. Man geht heute davon aus, daß aktivierte fibroblastenartige Zellen in der Pathogenese von pathologischen Zuständen eine wichtige Rolle spielen, bei denen die extrazelluläre Matrix durch ein entzündetes und hyperplastisches fibröses Gewebe degradiert wird. Es ist bekannt, daß synoviale Fibroblasten relevante matrixabbauende Enzyme exprimieren und Faktoren freisetzen, die die Aktivität von Osteoklasten verstärken und die Differenzierung von Makrophagen in Osteoklasten erleichtern.
Müller-Ladner et al., Am J Pathol (1996) Band 149, 1607-1615 beschreiben in diesem Zusammenhang, daß synoviale Fibroblasten der rheumatoiden Arthritis progressiv Gelenkknor- pel zerstören, wenn sie in SCID-Mäuse koimplantiert werden, die ein Tiermodell für rheumatoide Arthritis darstellen. Fibroblasten von osteoarthritischen Patienten oder Hautfibroblasten zeigen ein derartiges Verhalten nicht.
Darüber hinaus sind aktivierte synoviale Fibroblasten der rheu- matoiden Arthritis Effektorzellen, die matrixabbauenden Protea- sen wie Collagenase, Stromelysin und Cathepsin im Vergleich mit anderen Fibroblasten mit erhöhtem Spiegel exprimieren. Es ist bekannt, daß für eine optimale Cathepsin-Aktivität ein saures pH-Milieu erforderlich ist. In der Literatur wird davon ausgegangen, daß Makrophagen oder Osteoklasten für die Protonenproduktion in Zusammenhang mit Knochenabbau oder -umbau verantwortlich sind; siehe Väänänen, in: Bilezinka, Raisz and Rodan (ed.): Principles of Bone Biology, Acad. Press, San Diego, USA, 1996, Seiten 103-114.
Parak et al, Abstract S17, Kongreß der Deutschen Gesellschaft für Immunologie, 23. - 26. September 1998, konnten darüber hinaus zeigen, daß aktivierte synoviale Fibroblasten, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) isoliert worden waren, durch metabolische Aktivierung Säure produzieren können. Die Mechanismen der Säureproduktion wurden nicht beschrieben. Die Autoren berichten über Messungen mit einem Zytosensor- Mikrophysiometer, aus denen hervorging, daß native synoviale Fibroblasten saure metabolische Produkte exkretieren, wenn sie durch Zytokine, Phorbolester oder Ionomycin angeregt werden.
Obwohl die Pathogenese von rheumatoider Arthritis und aseptischer Prothesenlockerung sich merklich unterscheidet, ist die progressive Zerstörung von Knochen durch ein fibroproliferati- ves Gewebe ein gemeinsames. Merkmal beider pathologischer Zustände . Darüber hinaus gibt es Ähnlichkeiten in der Morphologie zwischen dem hyperplastischen Synovium in rheumatoider Arthritis und der Grenzmembran, die sich bei aseptischer Prothesenlockerung zwischen der Prothese und dem Knochen ausbildet; Pap et al., Arthr. Rheum. , 1999, Band 42, A501. Die Autoren berichten, daß aktivierten Prothesenlockerungs-Fibroblasten (PLF) in SCID-Mäusen Knochen in vivo ohne die Hilfe von Osteoklasten resorbieren können und nach Stimulierung von Ionomycin schnell saure Komponenten freisetzen.
Die WO 89/03829 schlägt Omeprazol als Hemmstoff der Osteoporose vor, um den Einbau von Kalcium in das Skelett zu erhöhen.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, therapeutische sowie diagnostische Maßnahmen und Mittel bereitzustellen, um die oben angesprochenen pathologischen Zustände behandeln bzw. frühzeitig erkennen zu können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Hemmstoffen für Protonenpumpen zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen des Bewegungsapparates, die mit Osteoblasten, Fibroblasten und/oder fibroblastenartigen Zellen assoziiert sind. Ferner wird die Erfindung gelöst durch die Verwendung eines Mittels, das zum Nachweis der Expression einer Protonenpumpe in Fibroblasten, Osteoblasten und/oder fibroblastenartigen Zellen dient, in der Diagnose von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen des Bewegungsapparates.
Ferner wird die Erfindung gelöst durch ein diagnostisches Mittel zum Nachweis der pathologisch veränderten Expression einer Protonenpumpe in Fibroblasten, fibroblastenartigen Zellen und/oder Osteoblasten, das zumindest ein Nukleinsäuremolekül enthält, das mit einem Abschnitt eines für die Protonenpumpe kodierenden Genes hybridisiert.
Das Gen kann dabei eine Primärtranskript-RNA (hnRNA) oder eine prozessierte mRNA sein, es ist aber z.B. auch denkbar, Antikörper gegen diese Genprodukte und/oder die Protonenpumpe zum Nachweis zu verwenden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten nämlich erstmals zeigen, daß PLF bei Anregung große Mengen an Säurekomponenten freigeben, die zu der Fähigkeit der PLF beitragen, Knochen vor dessen Abbau zu Dekalzifizieren (Entkalken) und gleichzeitig Kollagenfasern so zu verändern, daß sie leichter löslich und damit durch Kollagenasen abbaubar sind.
Die Erfinder konnten weiter zeigen, daß aktivierte synoviale Fibroblasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis sowie Prothesenlockerungs-Fibroblasten eine mRNA für eine Protonenpumpe exprimieren. Diese Protonenpumpe wurde ebenfalls in Osteoblasten gefunden. Dieser erstmals den Erfindern gelungene Nachweis einer Protonenpumpe auf diesen mesenchymalen Zellen hat überraschende Auswirkungen auf die Behandlungs- und Diagnosemöglichkeiten vieler Erkrankungen des Bewegungsapparates.
Die Erfinder konnten zeigen, daß die membranständig exprimierte Protonenpumpe durch bestimmte Protonenpumpen-Hemmer inhibiert werden kann. Die ohne den Einsatz der Protonenpumpen-Hemmer erfolgte Ansäuerung des extrazellulären Mediums geht nämlich nach Zugabe eines Protonenpumpen-Hemmers innerhalb kürzester Zeit signifikant zurück. Dies zeigt nicht nur, daß die extrazelluläre Ansäuerung durch die Protonenpumpe bewirkt wird, sondern weiter, daß es sich um eine membranständige Protonenpumpe handelt. Würde die extrazelluläre Ansäuerung durch einen Transportprozeß aus dem Inneren der PLF heraus bedingt, würde die Wirkung der Inhibierung nämlich deutlich langsamer vonstatten gehen, als bei einer membranständigen Protonenpumpe, die einen extrazellulären pH-Gradienten aufbaut.
Bisher wurde im Stand der Technik davon ausgegangen, daß Fibroblasten zum Knochenabbau allein dadurch beitragen können, daß sie Zytokine exprimieren, die die Differenzierung von Ma- krophagen in Osteoklasten fördern können. Parak et al. a.a.O. sowie Pap et al. a.a.O. beschreiben lediglich, daß Säurefreisetzung gemessen wurde, sie spekulieren jedoch, daß eine metabolische Aktivierung, also bspw. eine vermehrte Glykolyse dafür verantwortlich ist. Sie gehen damit wie andere Autoren davon aus, daß die bei mesenchymalen Zellen beobachtete perizelluläre Ansäuerung durch Stoffwechselprodukte der Glykolyse hervorgerufen wird.
Aus ihren Ergebnissen leiten die Erfinder nun die überraschende Erkenntnis ab, daß die Säureproduktion durch Exprimierung einer Protonenpumpe bei Fibroblasten, fibroblastenartigen Zellen und/oder Osteoblasten eine wichtige Rolle bei den eingangs erwähnten Erkrankungen des Bewegungsapparates spielt und Ansatzpunkt für Therapie und Diagnostik sein kann. Im weiteren werden unter "Fibroblasten" auch "fibroblastenartige Zellen" verstanden.
Die erwähnten Erkenntnisse stehen im Gegensatz zu der bisherigen wissenschaftlichen Lehrmeinung, wie sie beispielsweise Teitelbaum in Science (2000), Band 289, Seiten 1504-1508 zusammenfaßt. Die Knochenresorption ist danach einzig und allein Funktion der Osteoklasten, die gemäß diesem Review-Artikel vorrangiges Ziel bei der Behandlung von Osteoporose sind.
Auch die WO 99/66910 beschreibt Osteoklasten als Ansatzpunkt für Therapien zur Verhinderung von Knochenresorption.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben jedoch erkannt, daß auch die in viel größerer Zahl als Osteoklasten vorhandenen und zudem langlebigeren Osteoblasten sowie die Fibroblasten zum Knochenabbau beitragen können, so daß diese mesenchymalen Zellen überraschenderweise einen hervorragenden Angriffspunkt für die Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen des Bewegungsapparates darstellen.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch die Verwendung von Substanzen, um die Expression oder Funktion einer vorzugsweise membranständig exprimierten Protonenpumpe in Fibroblasten und Osteoblasten zu inhibieren, die mit pathologischen Prozessen insbesondere des Bewegungsapparates, wie Matrixabbau, rheumatoider Arthritis, aseptischer Prothesenlockerung (APL), Osteoporose etc. assoziiert sind. Die Erfindung ist dabei nicht auf pathologische Prozesse des Bewegungsapparates beschränkt, sondern bezieht sich allgemein auf Mechanismen, die extrazelluläre Matrix einschließen. Dies wird durch die Tatsache getragen, daß Fibroblasten im Körper ubiquitär vorkommen.
Da z.B. das RA-Synovium gut gegenüber umgebendem Gewebe abgeschlossen ist, ist insbesondere hier eine direkte Applikation von sogenannten "Protonenpumpen-Hemmern" möglich.
Der Nachweis der Expression einer derartigen Protonenpumpe durch z.B. PCR-Primer im Rahmen einer frühzeitigen Diagnostik und/oder Prävention ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dies ist vor dem Hintergrund zu sehen, daß eine Protonenpumpe (V-ATPase), die von synovialen Fibroblasten oder Prothesenlockerungs-Fibroblasten exprimiert wird, an den genannten pathologischen Zuständen beteiligt ist.
Als Hemmstoffe für die H+-ATPase (V-ATPase genannt) kommen vorrangig in Frage: Bafilomycin AI, Amilorid, KN03, N-Ethyl- Maleinimid, Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD), Diethylstilböstrol, Tributylzinn, anti-sense Nukleinsäuremoleküle, Peptide.
Die US 5,821,265 erwähnt hier lediglich die Möglichkeit, Protonenpumpen in Osteoklasten durch Metall-EDTA-Komplexe zu blok- kieren.
Die Erfinder konnten durch RT-PCR die mRNA für beta lH+-ATPase nachweisen. In synovialen Fibroblasten oder Prothesenlockerungs-Fibroblasten ließen sich sehr hohe Spiegel dieser mRNA nachweisen, so daß Mittel zum Nachweis dieser mRNA bzw. der noch unprozessierten hnRNA geeignet sind, als diagnostisches Mittel zum Nachweis der eingangs genannten pathologischen Zustände verwendet zu werden. Selbstverständlich ist es nicht zwingend erforderlich, eine reverse Transkriptase- Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durchzuführen, es können auch Sondensequenzen verwendet werden, die an die mRNA bzw. die hnRNA hybridisieren.
Geeignete Primer für den PCR-Nachweis der Protonenpumpe haben folgende Sequenzen:
Oberer Primer: 5 ' -TGA CTT TGA GCA GAA TGG AAC C-3 ' SEQ-ID Nr. 1
Unterer Primer: 5 ' -CCC TCG CGG GAA TAG AAC T-3 ' SEQ-ID Nr. 2
Mit Hilfe dieser Primer konnte nachgewiesen werden, daß Rheuma- und Prothesenlockerungs-Fibroblasten mRNA für die Beta- Untereinheit von humaner H+-ATPase (ATP6B1, Genbanknummer NM_001692) exprimieren.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung auch die Verwendung dieser Primer für diagnostische Zwecke.
Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuremoleküle, die an ein Nukleinsäuremolekül binden, das unter stringenten Bedingungen mit den beiden oben erwähnten Primern hybridisiert. Hierbei wird von der Erkenntnis ausgegangen, daß auch unter stringenten Bedingungen an die mRNA bzw. hnRNA hybridisierende Nukleinsäuremoleküle als Primer verwendet werden können, die in der Sequenz zwar von den oben erwähnten Primern abweichen, aber dieselbe Primer-Bindungsstelle an der RNA aufweisen. Darüber hinaus ist es auch möglich, daß die Primer lediglich Bestandteil eines längeren RNA-Moleküls sind, das am 3'- und/oder 5 ' -Ende weitere Nukleotide aufweist, die zu den entsprechenden Nukleo- tiden in der Ziel-RNA komplementär sind. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung derartiger Nu- kleinsäuremoleküle auf DNA- und/oder RNA-Ebene im Rahmen einer Therapie. Als sogenannte anti-sense Nukleinsäuremoleküle können sie nämlich an die DNA bzw. RNA in den betroffenen Zellen binden und so die Transkription, die Prozessierung und/oder die Translation und damit die Expression der betreffenden Protonenpumpe inhibieren.
Diese Funktion kann auch durch entsprechende Peptide erreicht werden, die entweder an die kodierende DNA, die hnRNA oder mRNA binden, oder aber unmittelbar an das synthetisierte Protein, um auf diese Weise die Expression der Protonenpumpe auf der Membran der Fibroblasten zu verhindern.
Zusammenfassend läßt sich festhalten, daß ausgehend von der Erkenntnis, daß an RA oder APL beteiligte Fibroblasten membranständige Protonenpumpen exprimieren, Mittel und Maßnahmen bereitgestellt wurden, um pathologische Zustände des Bewegungsapparates nicht nur therapieren sondern auch frühzeitig diagnostizieren zu können. Die Diagnose beruht dabei auf dem frühen Nachweis eines hohen Spiegels von hnRNA oder mRNA, die zur Expression der Protonenpumpe führt. Die Therapie kann in einem frühen Stadium ebenfalls bei mRNA oder der hnRNA, aber auch bereits bei der kodierenden DNA angreifen, um die Expression der Protonenpumpe zu verhindern. Darüber hinaus ist es auch möglich, sogenannten Protonenpumpen-Hemmer einzusetzen, um die Funktion bereits exprimierter Protonenpumpen zu inhibieren.
Diese Inhibierung entweder der Expression oder der Funktion der Protonenpumpen auf den genannten Fibroblasten oder auf Osteoblasten erreicht den gewünschten therapeutischen Effekt des- halb, weil dadurch die Ansäuerung des extrazellulären Mediums vermindert und somit die Voraussetzungen beseitigt werden, die den Matrixabbau erst ermöglichen. Interessant ist in diesem Zusammenhang, daß sowohl die FLS (Fibroblast Like Synoviocytes) als auch Prothesenlockerungsfibroblasten die Fähigkeit besitzen, Knorpel und Knochen ohne die Hilfe von Osteoklasten zu resorbieren.
Fibroblasten exprimieren sowohl bei RA als auch bei APL Enzyme, die an der Knochenresorption beteiligt sind. Die erforderliche Dekalzifizierung der Knochenmatrix vor dem Abbau bewirken die Fibroblasten dadurch, daß sie durch die gefundene Protonenpumpe den perizellulären pH-Wert signifikant absenken. Auf diese Weise können aktivierte fibroblastenartige Zellen in pathologischen Zuständen wie RA oder APL direkt zu diesen Zuständen beitragen, so daß sie nach Erkenntnis der Erfinder neue Angriffspunkte sind, um Knochenresorption in pathologischen Zuständen frühzeitig erkennen und therapieren zu können.
Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung werden jetzt nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert. Fig. 1 zeigt anhand einer Hämatoxilin-Eosin-Färbung den Abbau von Knochen durch Prothesenlockerungsfibroblasten (PLF); wenn PLF mit normalem humanem Knochengewebe in SCID-Mäusen implantiert wird, lagert es sich an die Knochenmatrix an und dringt tief in sie ein (A, Verstärkung x630); kleine Knochenstücke werden sogar durch die Fibroblasten umgeformt (B, Verstärkung x630); bei Co-Implantation mit PLF werden sowohl Knorpel als auch Knochen zerstört (C, Verstärkung x630) ;
Fig. 2 zeigt, daß PLF bei Stimulierung mit TNF-alpha große Mengen an sauren Komponenten freigeben; PLF wurden auf Polycarbonat-Membranschälchen ausgesät und die perizelluläre Ansäuerung unter Verwendung eines Zytosensormikrophysiometers gemessen; die Stimulierung mit unterschiedlichen Konzentrationen von TNF- alpha führte zu einer schnellen Ansäuerung des perizellulären Milieus; bei Stimulierung mit 10 ng/ml rekombinantem humanem TNF-alpha erreichte die Ansäuerung nach 20 Minuten einen Spitzenanstieg von 15 %;
Fig. 3 zeigt eine vergleichbare Kurve wie in Fig. 2, jedoch für RA-FLS; die Ansäuerung erreichte ihre maximale Zunahme von 60 % bei einer Stimulierung bereits mit 1 ng/ml TNF-alpha;
Fig. 4 zeigt eine vergleichbare Kurve wie in Fig. 3, jedoch für frühpassagige Osteoblasten; Fig. 5 zeigt in einer Darstellung ähnlich Fig. 2 die maximale Änderung der Ansäuerung in Prozent für die Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen der Protonen- pumpenhemmer Amilorid und Bafilomycin für PLF;
Fig. 6 zeigt den Zeitverlauf der Änderung der Ansäuerung für PLF ohne, mit und wieder ohne Zugabe von 50 μM Amilorid; die Zugabe erfolgte zwischen ca. 26 min. und ca. 48 min. ;
Fig. 7 zeigt in einer Darstellung wie Fig. 6 den Zeitverlauf der Änderung der Ansäuerung für PLF bei Zugabe von lμM Bafilomycin zwischen 40 und 75 min.
Beispiel 1: Isolation von fibroblastenartigen Zellen
Von zwei Patienten mit RA wurden Gewebeproben im Rahmen einer Synoviorthese entnommen. Normales synoviales Gewebe wurde im Rahmen einer Autopsie von Individuen ohne arthritische Vorgeschichte entnommen.
Gewebeproben von der synovialen Grenzmembran um lose, einzementierte Hüftgelenksprothesen wurden von fünf Patienten bei einer Kontrolloperation entnommen.
Normales humanes Knochengewebe und Gelenkknorpel wurden vom Oberschenkelkopf eines Unfallpatienten entnommen.
Alle Gewebeproben wurden zerkleinert und mit Dispase I über Nacht enzymatisch verdaut. Die freigesetzten Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium, Life Technologies, Inc.) mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS, Gemini G Biological Products, Callabasa, CA) in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % C02 gezüchtet. Nach Inkubation über Nacht wurden nicht- adhärente Zellen entfernt und die adhärenten Zellen viermal passagiert. Durch ELISA wurde bestätigt, daß die Kulturüberstände frei von Mycoplasmen waren.
Beispiel 2: Knochen- und Knorpelabbau im SCID-Maus-Modell
Um das aggressive Verhalten der in Beispiel 1 aufbereiteten RA- FLS (fibroblastenartige Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis) und PLF (Prothesenlockerungsfibroblasten) zu untersuchen, wurde das SCID-Maus-Co-Implantationsmodell verwendet. Bei diesem Modell werden humane fibroblastenartige Zellen zusammen mit normalem humanem Knochengewebe und Gelenkknorpeln in Mäuse mit schwerem kombiniertem Immundefekt (Severe Combined Immunodeficiency: SCID) implantiert und dort für 60 Tage belassen. Da die SCID-Mäuse die humanen Transplantate nicht abstoßen, erlaubt dieses Modell die Untersuchung der Invasion der fibroblastenartigen Zellen in das co-implantierte Knochengewebe und Gelenkknorpel in Abwesenheit von humanen entzündlichen Zellen.
Zwei Wochen alte, weibliche SCID-Mäuse (Charles Rivers GmbH, Sulzfeld, Deutschland) wurden permanent unter keimfreien Bedingungen gehalten.
Die Co-Implantation von fibroblastenartigen Zellen zusammen mit Knochengewebe und Gelenkknorpeln erfolgte nach dem von Müller- Ladner a.a.O. beschriebenen Verfahren. Kurz gefaßt wurden 105 Zellen nach Trypsinisierung, Waschen und Zentrifugieren in 100 μl sterilem Kulturmedium aufgenommen und zusammen mit einem 1 mm3 großen Stück normalen Knochengewebes und Gelenkknorpeln in die Kavität eines sterilen Tupfers gegeben. Die Mäuse wurden anästhesiert und die linke Niere freigelegt, woraufhin nach einem kleinen Einschnitt ein Implantat unter die Nierenkapsel plaziert wurde. Daraufhin wurden die peri- toneale Schicht und die Haut vernäht. Nach 60 Tagen wurden die Mäuse geopfert und die Implantate entfernt. Das Gewebe wurde in 4 % gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet.
In Fig. 1 sind Schnitte der Explantate nach Hämatoxylin-Eosin- Färbung gezeigt.
In Fig. 1A ist zu erkennen, daß die PLF sich an die Knochenoberfläche angelagert und den Knochen resorbiert hatten. In allen untersuchten Proben wuchsen die PLF um die Knochenstücke herum und erzeugten klare Resorptionsbereiche.
In Fig. 1B ist zu erkennen, daß kleine Teile des Knochens durch die aggressive PLF sogar umgeformt wurden. In Fig. 1 ist zu erkennen, daß die Implantation von sowohl Knorpel- als auch Knochenstücken zur Zerstörung beider Implantate führte.
Durch immunhistoσhemische Verfahren konnte gezeigt werden, daß die in den Knochen und den Korpel eingedrungenen fibroblastenartigen Zellen humanen Ursprungs waren. In keiner der Proben wurden an den Stellen der Knochenresorption osteoklastenartigen murine Zellen gefunden. Beispiel 3: Extrazelluläre Ansäuerung durch aktivierte Fibroblasten und Osteoblasten
Um die Fähigkeit von PLF und RA-FLS zu untersuchen, saure Komponenten freizusetzen, wurden ultrasensitive pH-Messungen in der direkten perizellulären Umgebung mit einem Zytosensor- Mikrophysiometer (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, US) durchgeführt. Dieses Gerät umfaßt einen hochsensitiven pH- Sensor, der auf dem lichtadressierbaren potentiometrischen Sensor (LAPS) beruht und ein rechnergesteuertes Perfusionssystem enthält; siehe bspw. Hafeman et al., Science 1998, Band 240, Seiten 1182-1185; Parce et al., Science 1989, Band 246, Seiten 243-247; McConnell et al., Science 1992, Band 257, Seiten 1906- 1912; sowie Uwicka et al., Annual Review of Biophysics and Bio- molecular Structure, 1994, Band 23, Seiten 87-113.
Dieses Gerät erlaubt die Detektion der Protonenproduktion im perizellulären Medium, während die Zellen in Membranschälchen wachsen, die auf einem Zytosensorchip positioniert sind, der verwendet wird, um die Ansäuerung zu messen.
PLF und RA-FLS wurden in Polycarbonat-Membranschälchen (Transverse 3402, Porengröße 3 μm, Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) zwei Tage vor den Experimenten bei einer Anfangsdichte von 3 x 105 Zellen/ml in 1 ml DMEM-Medium mit 10 % FCS pro Membranschälchen ausgesät.
Um die Protonenabgabe zu analysieren, wurden die Zellen durch zyklische Zugabe von Medium mit rekombinantem humanem TNF-alpha (30 U/ml, Röche Biochemicals, Röche, Basel, Schweiz), Ionomycin (10 mg/ml, Biomol, Hamburg, Deutschland), oder Kontrollmedium aktiviert. Bei den Ionomycin-Messungen enthielt das Kontrollmedium DMSO.
Nach 90 Sekunden wurde der Zufluß gestoppt, und die Ansäuerung wurde als Antwort der Zellen auf die Stimulierung über einen Zeitraum von 30 Sekunden gemessen. Die Ansäuerungsrate wurde gemessen als maximale Ansäuerung rmax pro Zyklus, normiert auf den Gleichgewichtswert req und für jede Probe in Prozent berechnet. Auf diese Weise entspricht 100 % einer fehlenden Antwort und größere Werte entsprechen einer Ansäuerung.
Nach den Experimenten wurden die Schälchen entfernt und die Zellen mit Comassie-Blau angefärbt, um die gleichmäßige Verteilung der Zellen während der Messung zu zeigen.
Eine Stimulierung von PLF mit einem kalziumabhängigen Signal, wie es durch die Zugabe von Ionomycin induziert wird, führte zu einer schnellen und signifikanten Freigabe von sauren Komponenten. Dies wurde anhand einer Zunahme in der Ansäuerungsge- schwindigkeit um 5 % nach 20 Minuten erkannt.
Eine Stimulierung von PLF mit TNF-alpha bei verschiedenen Konzentrationen zeigte noch stärkere Effekte. Während eine Inkubation der PLF mit 1 ng/ml TNF-alpha nicht zu einer signifikanten Stimulierung der PLF führte, ergab die Zugabe von 10, 100 bzw. 300 ng/ml TNF-alpha eine substantielle Ansäuerung des perizellulären Milieus. Wie in Fig. 2 zu erkennen, ergab sich die maximale perizelluläre Ansäuerung von 15 % bei 10 ng/ml TNF-alpha nach 20 Minuten. Eine weitere Erhöhung der TNF-alpha- Konzentration führte nicht zu einem verstärktem Effekt. Fig. 3 zeigt das Ergebnis vergleichbarer Messungen an RA-FLS. Es ergab sich bei einer TNF-alpha-Konzentration von 1 ng/ml eine Zunahme der perizellulären Ansäuerung von 60 %, eine weitere Erhöhung der TNF-alpha-Konzentration führte zu keiner weiteren Zunahme der Ansäuerung.
Eine vergleichbare extrazelluläre Ansäuerung wurde wie folgt auch bei Osteoblasten festgestellt:
Osteoblasten wurden vom trabekulären Knochen von drei Patienten isoliert. Der Knochen wurde in kleine Schnitte geschnitten, die Stücke wurden mit PBS gewaschen und in PBS/Collagenase (Typ VII, 1700 U/ml, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Stücke wurden sedimen- tiert, gewaschen und in vollständigem DMEM-Medium mit 10 % FCS, Antibiotika und Wachstumsfaktoren inkubiert, wie beschrieben bei Parak et al., J. Rheumatol (2000), Band 27, Seiten 2312- 2322.
Die Osteoblasten wurden in Monolayer-Kulturen expandiert. Um die Zellinie zu bestätigen, wurde die Expression von Osteo- calcin durch Immunhistochemie detektiert.
Für Messungen im Zytosensormikrophysiometer wurden die Zellen von konfluenten Kulturen unter Verwendung von Trypsin/EDTA (Life Technologies Eggenstein, Deutschland) geerntet, in mit 1 % FCS angereichertem PBS gewaschen und gezählt.
Die Osteoblasten wurden auf Polycarbonat-Membranschälchen (Transwells 3402, Porengröße 3 μm, Corning Costar, Corning, USA) zwei Tage vor den Experimenten mit einer Anfangsdichte von 300.000 Zellen/ml in 1 ml vollständigem DMEM-Medium pro Membranschälchen ausgesät. Um mit dem in dem Medium vorhandenen FCS assoziierte Serumartefakte zu vermeiden, wurden die Zellen gewaschen und vor der Untersuchung in serumfreiem Medium für 24 Stunden inkubiert.
Um die Protonenabgabe zu analysieren, wurde den Zellen wie oben TNE-α zugegeben und die Ansäuerungsrate gemessen.
Fig. 4 zeigt das Ergebnis einer derartigen Messung für frühpas- sagige Osteoblasten. Bei TNF-α Konzentrationen von 10-100 ng/ml reagieren die Osteoblasten mit einer um 20 bis ungefähr 35 % erhöhten Protonensekretion, bei geringeren Konzentrationen von TNF-α steigt die Ansäuerungsrate um etwa 20 %.
Beispiel 4: Nachweis einer membranständigen Protonenpumpe
Um den potentiellen Mechanismus zu identifizieren, der für die Freigabe von sauren Komponenten durch PLF verantwortlich ist, wurde die Expression der humanen H+-transportierenden ATPase durch RT-PCR und nichtradioaktive in situ Hybridisierung untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Expression der mRNA für die 58 kDa beta 1 Untereinheit (ATP6B1, GenBank Zugangs-Nr. NM 001692) der humanen v-ATPase untersucht und zu diesem Zweck die folgenden, spezifischen Primer entworfen:
Oberer Primer: 5' -TGA CTT TGA GCA GAA TGG AAC C-3 ' SEQ-ID Nr. 1
Unterer Primer: 5 ' -CCC TCG CGG GAA TAG AAC T-3 ' SEQ-ID Nr. 2. Die gesamte RNA von kultivierten PLF wurde nach den Vorschriften des Herstellers unter Verwendung des TRIzol(R)RNA- Isolationskits (Gibco-BRL) extrahiert. Nach der Erststrang cDNA-Synthese unter Verwendung von Oligo-d (T)12_12 Primern und M-MuLV reverse Transkriptase (Röche Mannheim) wurde eine Poly- erasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Taq(R)DNA- Polymerase (Stratagene) durchgeführt.
Die Amplifizierung erfolgte über 34 Zyklen jeweils bei 60°C für eine Minute und 72°C für zwei Minuten. Das PCR-Produkt wurde dann in den pPCR-ScriptAmp SK + Vektor (Stratagene) nach den Anweisungen des Herstellers ligiert. Nach der Transformation von Epicurian Coli(R) XLl-Blue MRF'Kan superkompetenten Zellen und Selektion von Klonen erfolgte eine Großmaßstabspräparation unter Verwendung des Qiagen MaxiPrep Kit (Qiagen) . Um die Identität der klonierten cDNA-Fragmente zu bestimmen, wurde eine kommerzielle Dideoxi-Sequenzierung durchgeführt.
Die PCR führte zur Verstärkung von cDNA-Fragmenten der erwarteten 786 Basenpaare von ATP6B1 für alle PLF-Proben mit hundertprozentiger Übereinstimmung der Sequenz der klonierten Fragmente mit der veröffentlichten Genbanksequenz (NM 001692).
Die Expression der ATP6B1 wurde durch nichtradioaktive in situ Hybridisierung der SCID-Mausschnitte unter Verwendung von Di- goxigenin-markierten RNA-Sonden bestimmt.
Die wie oben beschrieben klonierten cDNA-Fragmente wurden durch Plasmidpräparation gewonnen und zur Erzeugung von Templates für die Hybridisierung mit BamHl und Motl-Restriktionsenzymenen li- nearisiert. Anti-sense und sense RNA-Sonden wurden durch in vitro Transkription mit T3- und T7-RNA-Polymerase und einem kommerziell verfügbaren Transkriptionskit (Stratagene) erhalten und mit Di- goxigenin-UTP (Röche Mannheim) markiert.
Die in situ Hybridisierung der Explantat-Schnitte mit den so gewonnenen Sonden erfolgte wie bei Kriegsmann et al. beschrieben. Nach der Prähybrisisierung wurden die Schnitte über Nacht bei 52°C mit den Digoxigenin-markierten RNA-anti-sense-Sonden inkubiert. Ungebundene Sonden wurden bei 37°C für 45 Minuten mit 10 μg/ l RNase (Röche Mannheim) verdaut, woraufhin die Schnitte bei 50°C für fünf Minuten mit SSC/Formamid gewaschen wurden. Anschließend folgten vier abgestufte SSC/SDS-Bäder bei 50°C für jeweils 15 Minuten. Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungen mit 2 % Pferd-Normalserum wurden die hybridisierten Sonden unter Verwendung von Anti-Digoxigenin Fab-Fragmenten de- tektiert, die an alkalische Phosphatase und NBT/BCIB-Substrat (Röche Mannheim) gekoppelt waren. Negative Kontrollexperimente wurden unter Verwendung der entsprechenden Sense-Sonden durchgeführt.
Auf diese Weise konnte die Expression der mRNA für die 58 kDa beta 1 v-ATPase Untereinheit in PLF an Stellen der Knochenresorption in den SCID-Maus-Proben gezeigt werden.
Auch hier konnte durch immunhistochemische Verfahren mit einem Antikörper bestätigt werden, daß die positiven Zellen humanen Ursprungs waren, also nicht aus der Maus selbst stammten.
Um zu zeigen, daß die humane v-ATPase auf der äußeren Zellmembran der PLF exprimiert wird, wurde eine Immun- Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt. Wie erwartet, konnte die intrazelluläre Expression der humanen v-ATPase in allen PLF gezeigt werden. Es gab jedoch ebenfalls eine klare Anfärbung auf der Zelloberfläche der PLF, was die Expression der v-ATPase nicht nur innerhalb der PLF sondern auch auf der äußeren Zellmembran zeigt. Diese Daten wurden sowohl durch die Immun-Gold- als auch die Diaminobenzidin-Methode bestätigt.
Beispiel 5: Inhibierung der Protonenpumpe
Um den funktioneilen Beitrag der membranständigen v-ATPase auf die Freigabe von sauren Komponenten durch die PLF zu testen, wurden die Wirkungen von ATPase-Inhibitoren auf die perizelluläre Ansäuerung im Zytosensormikrophysiometer untersucht.
Zu diesem Zweck wurden sowohl der ATPase-Inhibitor Amilorid, der bei höheren Konzentrationen auch die v-ATPase inhibiert, als auch der spezifische v-ATPase-Inhibitor Bafilomycin AI bei verschiedenen Konzentrationen verwendet, um den Zeitverlauf der H+-Freigabe verglichen mit unbehandelten PLF zu analysieren.
Amilorid wurde in Konzentrationen zwischen 200 μM und 1 mM, Bafilomycin AI in Konzentrationen zwischen 10"8 und 10"5 M eingesetzt. Nach 90 Sekunden wurde der Zufluß gestoppt und die Ansäuerung als Antwort der Zellen für einen Zeitraum von 30 Sekunden gemessen; Fig. 5 zeigt einige konzentrationsabhängige Werte der Ansäuerung in Prozent. Die Zugabe von Amilorid verringerte die perizelluläre Ansäuerung um bis zu 40 %, was sich aus einer signifikanten Abnahme des perizellulären pH-Wertes ergab. Das Plateau maximaler Inhibierung der H+-Freigabe wurde schon nach 15 Minuten erreicht und blieb über der gesamten Meßzeit von 45 Minuten ohne weitere Zunahme stabil. Fig. 6 zeigt beispielhaft die Reaktion auf 50 μ Amilorid mit einer ca. 10%igen Abnahme der Ansäuerung nach wenigen Minuten.
Die Zugabe von Bafilomycin AI führte zu einer Inhibierung der perizellulären Ansäuerung bei Konzentrationen von 10"6 M von ungefähr 10 %. Auch dieser Effekt wurde schon 15 Minuten nach Zugabe von Bafilomycin AI beobachtet; siehe Fig. 7
Auch aus diesen Ergebnissen läßt sich ableiten, daß die extrazelluläre Ansäuerung auf einem Membran-assoziierten Mechanismus, also der membranständigen Protonenpumpe beruht und nicht auf einem langsamen Transport aus dem Inneren der Zelle.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Hemmstoffen für Protonenpumpen zur Behandlung von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen des Bewegungsapparates, mit denen Osteoblasten, Fibroblasten und/oder fibroblastenartige Zellen assoziiert sind.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Erkrankungen des Bewegungsapparates umfassen: Knochenkrebs, Osteoarthrose, Osteoporose, Arthritis, rheumatoide Arthritis, aseptische Prothesenlockerung.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , wobei die Protonenpumpe membranständig exprimiert ist und einen extrazellulären pH-Gradienten aufbaut.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Hemmstoff ausgewählt ist aus der Gruppe: Bafilomycin AI, Amilorid, KN03, N-Ethyl-Maleinimid, Dicyclohexylcarbodii- mid, Diethylstilböstrol, Tributylzinn, anti-sense Nuklein- säuremoleküle, Plasmide.
5. Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz "Oberer Primer" (SEQ-ID Nr. 1)
5 ' -TGA CTT TGA GCA GAA TGG AAC C-3 ' .
6. Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz "unterer Primer" (SEQ-ID Nr. 2)
5 ' -CCC TCG CGG GAA TAG AAC T-3 * .
7. Nukleinsäuremolekül, das an ein Nukleinsäuremolekül bindet, das unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül aus Anspruch 5 oder 6 hybridisiert.
8. Nukleinsäuremolekül, das das Nukleinsäuremolekül aus einem der Ansprüche 5 bis 7 enthält.
9. Verwendung zumindest eines Nukleinsäuremoleküls aus einem der Ansprüche 5 bis 8 für diagnostische Zwecke, insbesondere zum Nachweis einer Erkrankung des Bewegungsapparates .
10. Verwendung zumindest eines Nukleinsäuremoleküls aus einem der Ansprüche 5 bis 8 zum Inhibieren oder Nachweis der Expression einer Protonenpumpe in Fibroblasten, Osteoblasten und/oder fibroblastenartigen Zellen.
11. Kit, das zumindest ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 5 bis 8 enthält.
12. Verwendung eines Mittels, das zum Nachweis der Expression einer Protonenpumpe in Fibroblasten, Osteoblasten und/oder fibroblastenartigen Zellen dient, in der Diagnose von Erkrankungen oder pathologischen Zuständen des Bewegungsapparates.
13. Diagnostisches Mittel zum Nachweis der pathologisch veränderten Expression einer Protonenpumpe in Fibroblasten, Osteoblasten und/oder fibroblastenartigen Zellen, das zumindest ein Nukleinsäuremolekül enthält, das mit einem Abschnitt eines für die Protonenpumpe kodierenden Genes hybridisiert.
14. Therapeutisches Mittel zur Inhibierung der Expression und/oder Funktion einer Protonenpumpe in Fibroblasten, Osteoblasten und/oder fibroblastenartigen Zellen, das zumindest ein Nukleinsäuremolekül enthält, das mit einem Abschnitt eines für die Protonenpumpe kodierenden Genes hybridisiert.
PCT/DE2001/003179 2000-08-11 2001-08-09 Verwendung von protonenpumpen-hemmern zur behandlung von erkrankungen des bewegungsapparates WO2002013796A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10193322T DE10193322D2 (de) 2000-08-11 2001-08-09 Verwendung von Protonenpumpen-Hemmern zur Behandlung von Erkrankungen des Bewegungsapparates
AU2001291604A AU2001291604A1 (en) 2000-08-11 2001-08-09 Use of proton pump inhibitors for treating diseases of the locomotor system

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10040052A DE10040052A1 (de) 2000-08-11 2000-08-11 Verwendung von Protonenpumpen-Hemmern zur Behandlung von Entzündungen, insbesondere von Erkrankungen des Bewegungsapparates
DE10040052.3 2000-08-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002013796A2 true WO2002013796A2 (de) 2002-02-21
WO2002013796A3 WO2002013796A3 (de) 2002-09-12

Family

ID=7652636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2001/003179 WO2002013796A2 (de) 2000-08-11 2001-08-09 Verwendung von protonenpumpen-hemmern zur behandlung von erkrankungen des bewegungsapparates

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2001291604A1 (de)
DE (2) DE10040052A1 (de)
WO (1) WO2002013796A2 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005077365A2 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 Istituto Superiore di Sanità Novel uses for proton pump inhibitors
EP1779848A1 (de) * 2005-10-28 2007-05-02 Nikem Research S.R.L. V-atpase Inhibitoren zur Behandlung von Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen
EP2837373A1 (de) * 2010-06-04 2015-02-18 Kao Corporation Neuartiger Faktor zur Förderung der Zersetzung von Hyaluronsäure und Hemmer dafür

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2538910A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-24 Altana Pharma Ag Use of known active ingredients as radical scavengers

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991006296A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Aktiebolaget Astra Bafilomycine macrolides for treatment of bone affecting diseases
EP0639644A1 (de) * 1993-08-16 1995-02-22 Ciba-Geigy Ag Neue Makrolide und ihre Verwendung

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY103790A (en) * 1987-10-30 1993-09-30 Ab Hassle Novel compound for the treatment of several bone affecting diseases
JPH01203325A (ja) * 1988-02-08 1989-08-16 Takeda Chem Ind Ltd 骨粗鬆症予防治療剤
US5763480A (en) * 1994-02-14 1998-06-09 The Jewish Hospital Of St. Louis Inhibitors of cell-medicated disorders
US6010852A (en) * 1997-02-27 2000-01-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human proton atpase subunit
DE19828068C2 (de) * 1998-06-24 2003-12-18 Peter Dietsch Mittel zur spezifischen Hemmung osteoklastärer Knochenresorption
AUPQ051099A0 (en) * 1999-05-24 1999-06-17 Tachas, George Dr Novel products and processes in treatment and/or prophylaxis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991006296A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Aktiebolaget Astra Bafilomycine macrolides for treatment of bone affecting diseases
EP0639644A1 (de) * 1993-08-16 1995-02-22 Ciba-Geigy Ag Neue Makrolide und ihre Verwendung

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARTKIEWICZ ET AL.: "Characterization of the osteoclast vacuolar H-ATPase B-subunit" GENE, Bd. 160, 1995, Seiten 157-164, XP004042137 *
DATABASE EMBL [Online] EMBL; 2. Juli 1999 (1999-07-02) "EMBL:HSPROTP - HUMAN ENDOMEMBRANE PROTON PUMP SUBUNIT MRNA, COMPLETE CDS." retrieved from HTTP://WWW.EBI.AC.UK/SRS/ Database accession no. M25809 XP002194450 *
KARET F E ET AL: "MUTATIONS IN THE GENE ENCODING B1 SUBUNIT OF H+-ATPASE CAUSE RENAL TUBULAR ACIDOSIS WITH SENSORINEURAL DEAFNESS" NATURE GENETICS, NEW YORK, NY, US, Bd. 21, Nr. 1, Januar 1999 (1999-01), Seiten 84-90, XP001057623 ISSN: 1061-4036 *
LAITALA T ET AL: "INHIBITION OF BONE RESORPTION IN VITRO BY ANTISENSE RNA AND DNA MOLECULES TARGETED AGAINST CARBONIC ANHYDRASE II OR TWO SUBUNITS OF VACUOLAR H+-ATPASE" JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, NEW YORK, NY, US, Bd. 93, Nr. 6, Juni 1994 (1994-06), Seiten 2311-2318, XP001057630 ISSN: 0021-9738 *
LAITALA-LEINONEN: "DECREASED BONE RESORPTION, OSTEOCLAST DIFFERENTIATION, AND EXPRESSION OF VACUOLAR H+-ATPASE IN ANTISENSE DNA-TREATED MOUSE METACARPAL AND CALVARIA CULTURES EX VIVO" ANTISENSE NUCLEIC ACID DRUG DEV, Bd. 9, 1999, Seiten 155-169, XP001057634 *
MATSUDA: "PROTON SECRETION MECHANISM OF OSTEOCLASTS" J OSAKA CITY MEDICAL CENTER, Bd. 41, Nr. 2, Juni 1992 (1992-06), Seiten 653-661, XP001057632 Osaka, Japan *
NUMATA M ET AL: "EXPRESSION AND LOCALIZATION OF MRNA FOR THE 16 KD SUBUNIT OF V-ATPASE IN THE RAT EMBRYO" JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY, HISTOCHEMICAL SOCIETY INC. NEW YORK, US, Bd. 43, Nr. 8, August 1995 (1995-08), Seiten 761-769, XP001055989 *
PAP T ET AL: "ARTHRITIS AND RHEUMATISM, LIPPINCOTT, PHILADELPHIA, US" ARTHRITIS AND RHEUMATISM, LIPPINCOTT, PHILADELPHIA, US, Bd. 42, Nr. 9, SUPPL, September 1999 (1999-09), Seite S154 XP001057614 ISSN: 0004-3591 in der Anmeldung erw{hnt *
SUNDQUIST K ET AL: "INHIBITION OF OSTEOCLAST PROTON TRANSPORT BY BAFILOMYCIN A1 ABOLISHES BONE RESORPTION" BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, Bd. 168, Nr. 1, 16. April 1990 (1990-04-16), Seiten 309-313, XP001057615 ISSN: 0006-291X *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005077365A2 (en) * 2004-02-12 2005-08-25 Istituto Superiore di Sanità Novel uses for proton pump inhibitors
WO2005077365A3 (en) * 2004-02-12 2005-12-01 Inst Superiore Di Sanita Novel uses for proton pump inhibitors
JP2007522182A (ja) * 2004-02-12 2007-08-09 イスティチュート スペリオーレ ディ サニータ プロトンポンプ阻害剤の新規使用
EP1779848A1 (de) * 2005-10-28 2007-05-02 Nikem Research S.R.L. V-atpase Inhibitoren zur Behandlung von Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen
EP2837373A1 (de) * 2010-06-04 2015-02-18 Kao Corporation Neuartiger Faktor zur Förderung der Zersetzung von Hyaluronsäure und Hemmer dafür
US9056096B2 (en) 2010-06-04 2015-06-16 Kao Corporation Hyaluronic acid decomposition-promoting factor and inhibitor thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DE10040052A1 (de) 2002-03-07
AU2001291604A1 (en) 2002-02-25
DE10193322D2 (de) 2003-08-21
WO2002013796A3 (de) 2002-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7383488B2 (ja) 結節性硬化症複合体の処置におけるカンナビジオールの使用
NURSE et al. The effect of cromakalim on the normal and hyperreflexic human detrusor muscle
Kim et al. Combination of Runx2 and BMP2 increases conversion of human ligamentum flavum cells into osteoblastic cells
Rovetta et al. Cobalt triggers necrotic cell death and atrophy in skeletal C2C12 myotubes
EP1200831B1 (de) Modulatorische bindungsstelle an kaliumkanälen zum screening
Zhang et al. 3D-printing magnesium–polycaprolactone loaded with melatonin inhibits the development of osteosarcoma by regulating cell-in-cell structures
Wang et al. Controlled-release mitomycin C-polylactic acid film prevents epidural scar hyperplasia after laminectomy by inducing fibroblast autophagy and regulating the expression of miRNAs.
He et al. A decellularized spinal cord extracellular matrix-gel/GelMA hydrogel three-dimensional composite scaffold promotes recovery from spinal cord injury via synergism with human menstrual blood-derived stem cells
JP2021138720A (ja) 腫瘍細胞を非腫瘍細胞に変換するための医薬的連合体及びその使用
Li et al. Sclareol inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis and promotes osteoblastogenesis through promoting CCN1 expression via repressing the MAPK pathway
KR20110005501A (ko) 말초신경재생을 위한 신경성장인자 전달용 신경도관의 개발
Xue et al. Mitophagy impairment mediates the pathogenesis of CoCrMo particle-induced osteolysis via NLRP3/caspase-1/GSDMD-dependent pyroptosis in macrophages
EP1738781A2 (de) Verwendung von Propolis als Beschichtungmaterial für medizinische Implantate
WO2005045008A1 (en) Method for inducing chondrogenesis on mesenchymal stem cells
WO2002013796A2 (de) Verwendung von protonenpumpen-hemmern zur behandlung von erkrankungen des bewegungsapparates
DE60118769T2 (de) Verwendung von langem pentraxin ptx3 zur behanlung von durch geänderte aktivität des fgf-2 wachstumsfaktors hervorgerufene krankheiten
CN109846864A (zh) 异甘草素及其在治疗急性肺脏肝脏及脑组织损伤中的应用
CN113925972A (zh) Otub1蛋白用于治疗骨质疏松症的应用
Globa et al. Morphological parameters of bladder rats with infravesical obstruction with the introduction of biologically active compositions
US9233128B2 (en) Use of cryptotanshinone
WO2004106519A2 (de) Mrp8/mrp14 inhibitoren und ihre verwendung zur prävention und/oder behandlung von hypertrophen narben und keloiden
CN114560817B (zh) 一种用于抑制纤维化的小分子药物及其应用
Fasolino et al. Eumelanin decorated poly (lactic acid) electrospun substrates as a new strategy for spinal cord injury treatment
Prandini et al. TRPA1 channels modulate inflammatory response in respiratory cells from cystic fibrosis patients
DE69433472T2 (de) Recognin-vakzine

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
REF Corresponds to

Ref document number: 10193322

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20030821

Kind code of ref document: P

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10193322

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP