WO2002005943A1 - Procede et dispositif de fabrication de particules polymeriques creuses contenant des substances d'interet - Google Patents

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WO2002005943A1
WO2002005943A1 PCT/FR2001/002302 FR0102302W WO0205943A1 WO 2002005943 A1 WO2002005943 A1 WO 2002005943A1 FR 0102302 W FR0102302 W FR 0102302W WO 0205943 A1 WO0205943 A1 WO 0205943A1
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particle
cavity
support plate
substance
interest
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PCT/FR2001/002302
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Philippe Mercier
Marianne Peyrot
Frédérique NGUYEN-CAUZAC
Fabien Kalcz
Yves Lazorthes
Fabien Hauzanneau
Brigitte Sallerin
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Kappa Biotech S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to a process for loading hollow polymeric particles into chemical or biochemical substances of interest, the hollow particles capable of receiving such substances of interest and the charged particles obtained by said process, as well as an automated device for injection of substances into said hollow particles.
  • a drug can be characterized by the nature of its active ingredient and its dosage form. The latter has an important effect on the therapeutic action of the drug by modifying the intensity and kinetics of activity of the active ingredient.
  • Traditional dosage forms such as tablets, oral or injectable solutions, creams, etc., make it possible to control the passage of the active ingredient in the body's blood circulation. But once in the bloodstream, the active molecule is no longer controlled: its distribution is kinetically and quantitatively dependent on factors such as the degree of affinity of the molecule for each tissue or organ or the blood flow supplying the target organs. The active molecules are unable to discern the specific sites for which they are intended, causing the appearance of side effects and limiting their use in certain therapies.
  • One method consists in trapping the active principle in a polymer network by carrying out a polymerization reaction in the presence of the active principle. We then speak of pre-loading.
  • the methods for preparing such polymeric particles are well known to those skilled in the art. They use chemical, thermal or electrochemical reactions, the operating conditions of which are dictated by the need to carry out the polymerization of the carrier matrix.
  • most of the active ingredients have significant chemical and thermal instability and are incompatible with the polymerization conditions, which cause a reduction in the functionality of the active molecule or even its premature degradation. In the case of cell encapsulation, at least 90% of the population is destroyed at the end of the process.
  • Another encapsulation method consists in introducing by diffusion the molecule of interest into a preexisting polymer matrix. We then speak of post-loading. This less aggressive method for organic molecules, however, is of reduced application. Indeed, the size of the objects which can diffuse in the meshes of the matrix is limited which eliminates a priori the encapsulation of macro-molecules and of all biological objects such as cells or organelles. On the other hand, a sufficient affinity must exist between the polymer matrix and the substance to be encapsulated so that the latter remains fixed in the polymer network and is not eliminated with the solvent. However, this affinity must be gentle enough not to denature the substance of interest and also to allow its release at a rate suitable for the intended use. Such constraints are most often incompatible with each other and encapsulation by post-loading remains of interest limited to particular cases.
  • cells are the natural reactors of choice for producing bio-molecules of interest. They can be thought of as open systems that are capable of producing metabolites with various biological properties.
  • numerous studies have been directed towards a better understanding of cell metabolism and the search for means of using animal or plant cells and unicellular organisms, possibly genetically modified, for the production of metabolites of interest (Lysaght M. and Aebisher P., 1999, "Encapsulated cells", Pour la science, N ° 199).
  • the intervention of cellular machinery and its retro-controls to adjust the rates of released biomolecules explains the advantage of using whole living cells to deliver biological assets. But for this the producing cells must be in a favorable environment.
  • the step of incorporating a substance of interest into a particulate polymer matrix is therefore extremely restrictive and delicate and constitutes at present the factor limiting the development of the microencapsulation technique and its wide application in many technical fields and primarily in the medical field.
  • the present invention proposes to overcome this problem by means of a process for encapsulating chemical or biological substances by injecting said substances into the cavity of a previously prepared hollow polymer particle. Also claimed is a device allowing the implementation of said process and which has in particular the essential advantage of being able to automate the implementation of this process while having a relatively simple structure. A method enabling hollow particles to be obtained which is completely free from any toxicity and therefore compatible with the preservation of the activity of the encapsulated substances is also proposed, as well as the particles obtained.
  • Such particles allow entities of various sizes to be encapsulated, starting from small entities such as salts in solution to solid elements in suspension such as cells including microorganisms, while preserving the integrity and the functionality entities thus formulated.
  • the proposed method makes it possible to encapsulate living cells excreting molecules of interest.
  • the present invention relates to a process for the preparation of particles formed from a polymer matrix comprising at least one cavity containing a chemical or biological entity of interest, consisting in: fixing on a support a hollow particle formed of a polymer matrix comprising at least one cavity, piercing the wall of said particle, injecting a substance d interest in said cavity, said substance consisting of one of the following phases: gaseous, liquid or solid, said phase containing a chemical or biological entity, recovering said particle whose cavity contains said substance.
  • the wall of a hollow particle used in the process according to the invention is a polymer matrix whose properties are chosen in a manner suited to the desired use, such as, for example, biocompatibility, non-toxicity, biodegradability, selective diffusion through the mesh of the polymer network, the specific affinity towards certain tissues or organs, the compatibility between the polymer matrix and the encapsulated substance, the stability in the storage medium, or other parameters.
  • the polymeric wall of the hollow particle according to the invention will preferably be biocompatible and non-toxic.
  • biocompatibility is meant that the particle does not disturb the implantation medium. Biocompatibility can also be ensured both vis-à-vis the implantation environment as vis-à-vis the active substances or encapsulated biological objects.
  • the implantation medium may be a physiological medium, as is the case during the administration of a drug by the oral, subcutaneous, intramuscular route, etc., or it may be a solution such as a medium cell culture, a food product such as an alcoholic beverage, a dairy product, a cosmetic product or any other medium.
  • the starting constituents and the operating conditions for the preparation of a hollow particle intended to receive a substance of interest will be chosen, so as to obtain a polymer matrix biocompatible with a given medium.
  • Such starting components are for example natural polysaccharide polymers such as chitosan, hyaluronic acids, alginates, carrageenans.
  • the operating conditions can be those implemented in the process for preparing hollow particles described below.
  • the particle used in the process according to the invention is also biodegradable.
  • the degradation rate determining the dose of active material released per unit of time it is according to the intended use of the particle that the choice of polymer is made.
  • the particles according to the invention can be used to transport substances to a target and quickly release them once at their destination.
  • the polymer network can be weakly crosslinked, allowing rapid enzymatic hydrolysis, and allowing the release of the active compounds in a few minutes or a few hours after administration of the particles.
  • the polymer network can then be strongly crosslinked or be grafted by specific radicals so as not to be rapidly degraded by cellular enzymes and to thus protect for several days and even several months the active agents contained in the particle or the immobilized cells.
  • the rate of degradation of the polymer is regulated by the nature of the starting monomer and by the choice of operating conditions. Those skilled in the art have complete specialized literature to modulate this parameter.
  • the polymer matrix may also have undergone chemical or physical treatments which confer particular properties on the particle.
  • particles unrecognizable by the reticuloendothelial system by grafting can be used in the polymer network of polyethylene glycol molecules known to be stealthy. It is also possible to mask cationic or anionic radicals by coupling with molecules of opposite charge. Molecules or radicals conferring particular physicochemical properties in the mass can also be grafted to the polymer matrix to modify the biodegradability, pigmentation, permeability to radiation, or to confer on the polymeric wall bioadhesive or mucoadhesive properties, or d still other properties.
  • the particles used in the process according to the invention are also endowed with selective diffusion properties of the molecules.
  • the matrix structure of the wall of said particles is analogous to a three-dimensional mesh network.
  • the mesh size is a function of the density of the polymer network itself determined by various well-known parameters, in particular the nature of the starting monomer and of the crosslinking agent, and the reaction time.
  • the crosslinking rate is then inversely proportional to the size of the meshes.
  • a polymer matrix composing the wall of a hollow particle intended for the encapsulation of cells will for example be chosen for its high crosslinking rate.
  • the hollow particles containing a substance of interest obtained by the process according to the invention are particularly suitable for the encapsulation of living cells because they protect the cells while allowing the nutrients necessary for the long-term viability of the latter to diffuse, but also the metabolites of interest, for example having a therapeutic, cosmetic, aromatic effect, or any other interesting effect.
  • the hollow particles according to the invention can be used for the transport and the maintenance in a chosen medium of organelles, such as for example chloroplasts or mitochondria, or of active cellular fractions such as enzymes or ribosomes.
  • organelles such as for example chloroplasts or mitochondria
  • active cellular fractions such as enzymes or ribosomes.
  • the particles in a particular embodiment of the method according to the invention, it is possible to cover the particles with a film giving them specific surface properties, such as a specific affinity for a tissue, properties of bioadhesion or mucoadhesion, or other useful properties as well.
  • the coating can be carried out by soaking in a solution of the compound to be deposited on the particle, or by spraying. The spraying can take place before or after the injection of substances of interest into the particle.
  • polymer matrices described in patent application WO 98/13030 under the title "Biodegradable ionic matrices of modular internal polarity with grafted polymer” are capable of meeting the characteristics sought for the polymer matrices forming the particles according to invention.
  • hollow particles formed of a matrix polysaccharide preferably based on modified or unmodified starch, of section between 0.1 and 5 mm, preferably between 0.2 and 2 mm, and comprising at least one cavity of section greater than 0.01 mm.
  • a particle is fixed on a support by a force, for example by suction through an orifice of section smaller than the section of the particle. Then, the wall of the fixed particle is pierced using an instrument which also makes it possible to inject the substance of interest.
  • This operation can be carried out manually using a syringe, the reservoir of which contains the substance to be injected, equipped with a needle. It can also be carried out using the automated device, object of the present invention, which will be described in detail below.
  • Recovery of the particle thus charged with the substance of interest is carried out by releasing the applied force, in a container optionally containing a solution allowing good preservation of the said substance, for example a saline solution, a buffered solution, a physiological solution, a aseptic solution, or whatever.
  • a solution allowing good preservation of the said substance, for example a saline solution, a buffered solution, a physiological solution, a aseptic solution, or whatever.
  • the particles finally obtained by the process according to the invention contain chemical, biochemical or biological active substances of all kinds.
  • the particle cavity may contain a gaseous, liquid or solid phase, pure or incorporating a chemical, biochemical or biological entity, constituting the substance of interest.
  • the gas phase can be any chemical compound in gaseous form due to temperature or due to a thermodynamic reaction.
  • the liquid phase can be an aqueous or alcoholic or oily solution or their mixture in the form of an emulsion or micro-emulsion of the oil in water or water in oil type.
  • the solid substances can for example be powders of variable particle size or fats, optionally in suspension or emulsified in the liquid phase.
  • a chemical, biochemical or biological entity can be any simple or complex, synthetic or natural entity having a chemical or biological activity or simply a property of interest for a given application. It can be an organic or biochemical mineral molecule (biochemical molecule means any chemical molecule having a biochemical activity, that is to say playing a role in a biological process), a cell, a microorganism, a cell fraction , biologically active or not.
  • Such a molecule can be for example: - an amino acid, a peptide in particular glucagon, somatostatin, calcitonin, interferons and interleukins, LHRH (Lutesine Hormone Releasing Hormone), erythropoietin, bradykinin antagonists, insulin, or a derivative peptide or polypeptide, protein, antibody, enzyme, proteoglycan;
  • oligonucleotide an oligonucleotide, an RNA, DNA molecule or a fraction thereof
  • a therapeutic active ingredient such as an antibiotic, an antiviral, an anticancer, a vasoconstrictor, a cardiotonic, a vasodilator, a diuretic or an antidiuretic, a neuroleptic, an antidepressant, an anti-inflammatory, an antiMstamine, an antifungal, a anti-allergic agent, an anesthetic, a diagnostic agent;
  • a biological entity can be a cell, biologically active or not, or a cell fraction biologically active or not.
  • a cell incorporated into a particle according to the invention may be any natural or genetically modified cell, of plant or animal origin including human, or a bacterium, a virus, a yeast or any other microorganism.
  • a cell fraction can for example be a membrane extract, an enzymatic extract, an organelle such as mitochondria or ribosomes.
  • the cells or active cell fractions trapped in the particles and protected by them are capable of excreting in the cavity of the particle, molecules resulting from the metabolism of said cells or cell fractions. Such molecules of interest can then diffuse through a polymeric wall of adequate mesh and produce their effects for long periods.
  • the mode of preparation of the particles intended to contain a substance of interest must make it possible to obtain particles having particular characteristics, such as for example, biocompatibility, non-toxicity, biodegradability, selective diffusion through the mesh of the polymer network , the specific affinity towards certain tissues or organs, compatibility between the polymer matrix and the encapsulated substance, stability in the storage medium, or other parameters.
  • the wall of the hollow particle is a polymer matrix whose composition is chosen as a function of the properties 0 physico -chemical that we want to obtain in fine.
  • the operating conditions for preparing the polymer matrix can be chosen from the many techniques available to those skilled in the art.
  • the nature of the starting monomer (s) only matters insofar as the synthesized polymer -> meets a specification adapted to the intended use of the hollow particle.
  • the basic matrix can be modified and adapted to the use which will be made of it, by chemical, thermal or other treatments, without the choice of the protocols used being limited due to the constraints linked to the fragility of the substances to be encapsulated.
  • the monomeric compound is therefore chosen according to the criteria set out above. It is understood that it may be a single monomer or two different monomers resulting in the formation respectively of a polymer in the strict sense or of a copolymer, or even one or more macromolecules themselves having a polymeric structure and joined by bridging usually using a crosslinking agent, resulting in the formation 5 of a crosslinked polymeric matrix.
  • the polymer matrix can be constituted by any known polymer meeting the specifications defined according to the requirements set out above. They can be of natural, synthetic or semi-synthetic origin.
  • polysaccharides such as for example starch, starch or cellulose chemically or enzymatically modified.
  • common polymers can also be used, such as polyesters, polyamides, polyacrylates, glycolic polylactics, or even peptides, polypeptides and proteins, peptide gels, gelatins, alginate gels. Their molecular weight is variable.
  • the polymer matrix constituting the wall can undergo various treatments.
  • the polymer matrix can be modified, that is to say that can be attached to it chemical groups such as functional compounds or ionic compounds, or compounds modifying the properties of the polymer such as a pigment for example. All these compounds can be chemically coupled to the matrix on the surface or in the polymer network by low energy bonds (for example hydrogen bonds), medium energy (for example ionic bonds) or high energy (for example bonds) covalent). They can also be physically trapped in the network.
  • the modification can be carried out before, during or after the crosslinking reaction. In certain cases, the modification reactions of the polymer matrix can be carried out after loading of the substance of interest into the hollow particle.
  • the techniques for grafting molecules and functions are well known to those skilled in the art and conventionally used in chemistry.
  • the crosslinking agent is added with vigorous stirring to obtain a total dispersion.
  • the crosslinking agent is chosen from bifunctional molecules, well known to those skilled in the art, such as epichlorohydrin, diepoxides, dialdehydes, dicarboxylates, diisothiocyanates, carbodiimides, etc.
  • the monomers can serve themselves crosslinking agent if they have several reactive sites. The addition of a polymerization initiator will sometimes be useful.
  • the gaseous fluid may be a pure gas such as nitrogen, carbon dioxide, a gaseous mixture such as air, or any gaseous mixture inert with respect to the polymeric wall and the substance interest.
  • the bubbling thus produced can optionally take place at the same time as a means of stirring the reaction mixture.
  • the addition of the crosslinking agent and the gas bubbling can be carried out concomitantly, so that as soon as the bridging reaction between the monomers is initiated, the reaction mixture, the viscosity of which increases, traps the micro-bubbles .
  • Fractionation of the viscous mixture into isolated particles is carried out by one of the techniques available to those skilled in the art: for example mechanical agitation in emulsion, grinding or extrusion. • the particles should be maintained in a dispersing medium until complete gelation of the polymeric network containing gaseous bubbles.
  • the viscous reaction mixture can be transferred to a hydrophobic medium and an emulsion is created by mechanical stirring until the polymer has completely solidified.
  • the transfer is carried out before the polymer network is frozen, this time varying mainly as a function of the strength and the amount of crosslinking agent used.
  • a hydrophobic medium commonly used is paraffin oil or silicone oil.
  • Another fractionation method consists in passing the viscous reaction mixture through a nozzle extruder, and in collecting the particles at the nozzle outlet in a hydrophobic bath with stirring.
  • grafted hollow particles are prepared.
  • a chemical radical carrying an ionic function or charge or giving the polymer matrix an advantageous property as set out above is reacted with the reaction mixture.
  • the addition of such a radical can be done as soon as the monomer is dissolved, or during the polymerization reaction, or else by impregnation at the end of the particle manufacturing process, depending on the nature of the grafted compound and the desired result.
  • the particles thus obtained are hollow. They are provided with one or more cavities filled with the gas used for bubbling. They can then be recovered by sieving, by filtration, by centrifugation or by any other convenient means, and optionally calibrated by sieving on calibrated grids. They can be, if necessary, sterilized or added with a preservative avoiding the development of microbial flora, and stored without risk of degradation for several months, even several years. Storage can be done in dry form or in a solution suitable for the use which is planned later. Transporting them is no problem.
  • the hollow particles according to the invention are specially intended for the encapsulation of chemical or biological substances of all kinds, and in particular of substances sensitive to their physicochemical environment. They can for example be filled with a gaseous, liquid or pure solid phase or incorporating a chemical or biological entity, constituting the substance of interest.
  • the cavity of the particle initially contains a gas, for example air or nitrogen. Subsequently, the cavity is filled with other gaseous substances, liquid or solid, or with a mixture of substances such as a solute or a suspension, including a cell suspension.
  • This operation, object of the present invention is carried out by piercing the wall of the particle and by injecting into the cavity a substance of interest, and can be carried out manually, or by any suitable automatic means.
  • the loading of the particles can be carried out by the automated apparatus specially designed for this purpose, which is also an object of the present invention.
  • the subject of the present invention is a device for filling with a substance of interest the cavity of a hollow particle, comprising:
  • Figure 1 shows the block diagram of the basic principle of the device according to the invention.
  • FIGS 2, 3, 4 show in schematic form, an embodiment of the device according to the invention in three parts.
  • FIG. 5 represents, in schematic form in top view, the embodiment of the device according to FIGS. 2 to 4.
  • FIG. 6 shows, under an optical microscope, the piercing of the wall of a hollow polysaccharide particle.
  • the pressure exerted by the needle deforms the flexible wall of the particle just before entering it.
  • the cavity appears as a white disc in the center.
  • FIG. 7 shows under a light microscope, a particle filled with PC 12 animal cells.
  • the cells form a dark, irregular p-mass in the cavity of the white-appearing particle.
  • the object of the invention comprises "at least one" element having a given function
  • the embodiment described may include several of these elements.
  • the embodiment of the object according to the invention as illustrated comprises several elements with identical function and if, in the description, it is not specified that the object according to this invention must necessarily include a particular number of these elements, the subject of the invention could be defined as comprising "at least one" of these elements.
  • the present invention also relates to a device making it possible to implement the method described above, for filling, with a substance of interest described above, the cavity 2 produced in a particle like that which has been described above. before.
  • Figure 1 shows the block diagram of the basic principle of such a device.
  • This device comprises means 10 for applying a first force to the particle so as to maintain it on a first face 11 of a support plate 12 arranged to generate a reaction force to this first force.
  • the particle maintained on the first face 11 of a support plate 12 is shown in broken lines and the device in this first configuration is represented in A.
  • the device further comprises means 13 for producing a breakthrough in the wall 1 so that it opens into the cavity 2 when the particle is held on the plate- support 12 by the first force.
  • the device in this second configuration is represented at B.
  • the device also includes means 14 for introducing, by this breakthrough, a determined quantity of a substance of interest into the cavity 2, the particle always being held on the first face 11 of the support plate 12.
  • the particle thus produced is recovered, for example, in a receptacle 27 as will be described below.
  • the device in this third configuration is shown in C.
  • the means 10 for applying a first force to the particle so as to maintain it on a first face of the support plate consist of a through orifice 15 produced in the support plate 12 and means 16 for creating a pressure difference on either side of the support plate, the highest pressure being applied on the side of the first face 11 of this plate.
  • the support plate is made of a relatively waterproof material and the maximum section of the orifice 15 is less than the minimum section of the particle.
  • the device further comprises means 29 for bringing the particle to the orifice 15, these latter means 29 comprising a reservoir 17 comprising at least one opening 18, this reservoir being capable of containing the particle so that, between the reservoir and the particle, a relatively large pressure drop can be created, and means 19 for positioning the support plate and the reservoir relative to each other at the first determined location A so that the opening 18 is located opposite the first face 11 of the support plate 12 and substantially in the axis of the orifice 15 so that, under the action of the pressure difference, the particle comes to position at the entrance to this hole 15.
  • Figures 2 to 5 show, in schematic form, an advantageous embodiment of the device according to the invention for filling, with a substance of interest of the cavities 2 made in the particles, automatically and according to the technique known to technicians under the terminology "in masked time”.
  • This device illustrated in Figures 2 to 5 and applying the basic structure described with reference to Figure 1, comprises at least three support plates 12-1, 12-2, 12-3, means 40 for moving in the space these three support plates so that they can successively take three first, second and third determined positions respectively referenced A, B, C, namely: the first position A in which a particle is fixed on the first face 11 of a support plate at the entrance to an orifice 15, the second position B in which the cavity 2 of the particle is filled with a determined quantity of the substance of interest, and the third position C in which the particle with its cavity 2 filled with the substance is recovered in a receptacle 27.
  • each of the three support plates 12-1, 12-2 and 12-3 comprises a plurality of orifices 15 making it possible to fix, at the same time, a plurality of e particles.
  • the means 40 for moving in space the three support plates are constituted by means for carrying out a simultaneous rotation R of these three support plates around an axis of rotation W so that they pass respectively and successively by the three first, second and third positions described above, and means for carrying out a translation T of the three support plates between two positions on the axis of rotation W.
  • these three support plates are located substantially in the same plane perpendicular to the axis of rotation W, one hundred and twenty degrees from each other.
  • the means 40 for obtaining the rotation and translation of the support plates are well known in themselves. They consist, for example, of two motors and a rack, one of the motors driving the rotation of the rack around its axis, the other motor causing the translation of this rack along its axis.
  • the means 29 for bringing a particle in front of each orifice consist of the reservoir 17, FIG. 2, which has an opening 18 of a cross section greater than each plate- support 12, the reservoir being able to contain a large quantity of particles to form at least one homogeneous layer 51 of these particles, so that a support plate 12 can come into contact with this layer.
  • the relatively large pressure drop defined above with regard to FIG. 1, part A, between a particle and the reservoir 17 is that which is created between the particles themselves, and possibly all of the particles. and the reservoir 17. In Consequently, for optimal operation of the device, it is necessary to ensure that the reservoir 17 contains a sufficient quantity of particles to form at least one layer 51 of continuous and homogeneous particles.
  • the means 13 for making a breakthrough in the wall 1 of a particle so that this breakthrough opens into the cavity 2 when the particle is held on the first face of the support plate 12 by the first force they can be formed in different ways, for example by a beam of laser radiation or the like.
  • they consist of at least a first needle 21 and means for moving this first needle and the support plate relative to one another, while maintaining the first force 10 on the particle so that it remains fixed relative to the support plate 12, so that the first needle 21 is able to penetrate into the cavity 2 by passing through the wall 1.
  • the means for moving the first needle and the support plate relative to each other and the means 14 for introducing, by the breakthrough, a determined amount of the substance of interest in the cavity 2 form a combination of means which are constituted by an injection device, for example a first syringe 22 capable of containing a sufficient quantity of the substance of interest, and means 23 for binding the first needle and the first syringe so that the substance contained in the syringe can be ejected and enter the cavity through the capillary of the first needle.
  • These means 23 which are well known in themselves are for example constituted by a male-female conical fitting.
  • This combination of means also comprises means for bringing the support plate 12-1, 2, 3, and the first needle 21 mounted in cooperation with the first syringe 22 to a second determined location B, means 24 for moving the first syringe relative to the support plate when it is positioned in this second determined location B, and means 25 for controlling the injection of the substance by the first needle 21 into the cavity 2 by controlling the first syringe 22, while maintaining the first force 10 on the particle.
  • FIG. 3 can be constituted in different ways, for example by a jack of any type acting on the piston of the syringe.
  • the device may further comprise, to promote the filling of the cavities 2 of the particles, means 33 for aspirating the gaseous phase contained in the cavity of each body substantially simultaneously with the introduction of the product and depending on the amount of substance introduced.
  • means 33 comprise for example at least a second needle 34 and a second syringe 35, means 36 for connecting the second needle and the second syringe, means for moving the second needle linked to the second syringe so that the second needle comes pass through the wall 1 of the particle to open into the cavity 2 when the support plate 12 is located at the second determined location B, and means 37 for controlling the second syringe 35 so that it is aspirating.
  • each support plate has a plurality of orifices 15 and can therefore hold a plurality of particles. It would therefore be possible to use a plurality of needle-syringe pairs 21-22 and 34-35 to simultaneously fill the cavities of the particles maintained on the same support plate. This realization would however be relatively complicated to implement and relatively expensive.
  • the means for moving the first needle 21 linked to the first syringe 22 and the second needle 34 linked to the second syringe 35 relative to the support plate consist of at least one plate 41, means 42 to link the two syringes 22, 35 to the plate 41 so that the two needles 21, 34 are located on two concurrent straight lines, means 50 for moving the plate along two axes in X and Y, and means 48, 49 for move the two needles 21, 34 respectively on the two concurrent straight lines.
  • These means 48, 49 will for example advantageously consist of controllable cylinders or the like respectively linked to the two syringes to allow the translation of each needle linked to its syringe.
  • the device can also further comprise means schematically represented at 43, for determining the presence and the position of the first and second needles 21, 34.
  • These means are well known in themselves and can consist of sensors operating according to the principle of triangulation by laser beams or the like. These sensors make it possible to check on the one hand that the needles are correctly positioned relative to the particle whose wall they must pierce, and on the other hand the integrity of each needle and possibly order the automatic replacement of the needle which would have has been detected as defective, for example broken.
  • the device further comprises a receptacle 27, means for moving this receptacle and the support plate 12 relative to one another at a third determined location C, after the desired quantity of substance of interest has been introduced. in cavity 2 and while maintaining the first force 10 on the particle, that is to say the pressure difference, and means for, on the one hand, canceling this first force and, on the other hand, applying a second force 28 on the particle for the detach from the support plate 12 and so that it is capable of being recovered in the receptacle 27.
  • the device further comprises means 30 for creating mechanical forces in a direction substantially tangential to the first face 11 of the support plate 12, so as to be able to detach all the particles which would have remained stuck on the first face 11 of the li2 support plate.
  • These means 30 are constituted for example by jets of gas or liquid under pressure.
  • the reservoir 17, the plate 41 and the receptacle 27 will be respectively positioned in determined locations for example on a base shown diagrammatically at E and the three support plates will be mounted in rotation and in translation relative to this base E so that they cooperate successively with the reservoir 17, the plate 41 and the receptacle 27 as described below, this base E thus serving to referential to all displacements defined in this description.
  • the means for creating a pressure difference are, as illustrated in FIGS. 2 to 5, constituted by means 45 for creating a sealed enclosure 46 with the second face 47 of the support plate 12 onto which the orifices open out. 15, and means 48 for producing the vacuum in this enclosure 46, for example by means of a vacuum pump or the like.
  • the second force 28 is constituted by the gravitational force itself, the axis of rotation W being in the vertical position and the first face 11 of the support plates being at a lower level relative to their second face 47.
  • the device described above in its embodiment illustrated in FIGS. 2 to 5 operates and is used in the following manner: It is first of all specified that the entire device as illustrated in FIGS. 2 to 5 comprises a management unit making it possible to control the operations described below, in particular the translation T, the rotation R of the three support plates 12-1, 12-2 and 12-3, the control 25, 37 of the syringes 22, 35, the control of the movement 48, 49 of these syringes, the control 50 of the plate 41, the control of the means 48 for producing a vacuum.
  • the device is originally in a position as illustrated in FIG. 5, in which the first support plate 12-1 faces the opening of the reservoir 17, the second support plate 12-2 faces the plate 41 and the third support plate 12-3 is opposite receptacle 27.
  • a first order is then given so that the axis W undergoes a translation T so that the first face 11 of the first support plate 12-1 comes into contact with the layer 51, then the means 48 for achieving a relative vacuum in enclosure 46 are controlled. A pressure difference is thus created between the space adjacent to the first face of the first support plate and the interior of the enclosure 46.
  • the layer 51 of particles is homogeneous, the particles which are opposite or near the inlets of the orifices 15 are sucked in and come to stick on these inlets to take a position like that which is schematically illustrated in FIG. 1.
  • the axis W undergoes a reverse translation of the previous one to move the support plate 12-1 away from the opening 18 of the reservoir 17, then a rotation of one hundred and twenty degrees from this shaft W is controlled, in the dextrorsum direction with reference to FIG. 5, so that the support plate 12-1 assumes the position occupied by the second support plate 12-2 before this rotation.
  • the third support plate 12-3 is positioned opposite the opening 18 of the reservoir 17, it being noted that this third support plate 12-3 does not carry any particles on its first face 11.
  • the shaft W is controlled so that the third support plate 12-3 comes into contact with the layer 51 of particles
  • the means 48 are controlled to create a relative vacuum in the enclosure 46 and to aspirate the particles which settle on the inlets of the orifices 15, as described above for the first support plate 12-1.
  • the first plate 12-1 is positioned relative to the plate 41 carrying the syringes 22, 35 in order to be able to fill the cavities 2 as described below.
  • the plate 41 is controlled in X and in Y to bring the ends of the needles 21, 34 opposite each of the particles which are held on the inlets of the orifices 15.
  • the two syringes 22 , 35 are controlled in translation by the means 48, 49 so that the two needles pass through the wall 1 of the particle and open into the cavity 2 of this particle.
  • the syringe 22, which is presumed to contain the substance to be injected into cavity 2 is ordered to perform this injection.
  • the syringe 35 is controlled in the opposite direction to carry out a suction of the atmosphere contained in the cavity. The injection carried out by the first syringe 22 and the aspiration carried out by the second syringe 35 are stopped when the second syringe draws up injected substance.
  • the two syringes are controlled to remove the two needles from the particle, the openings made in the wall 1 being plugged in by the natural elasticity of the material constituting this wall.
  • the plate 41 is controlled in X and in Y so that the operations described above are carried out successively for all the particles maintained on the first support plate 12-1.
  • the shaft W then undergoes a translation to move the third support plate 12-3 away from the layer 51, then a second rotation of one hundred and twenty degrees, still in the dextrorsum direction, to simultaneously bring the third support plate 12- 3 opposite the plate 41 and bring the first support plate 12-1 opposite the receptacle 27, always maintaining the vacuum in the chambers 46 of these first and third support plates.
  • the second support plate 12-2 is positioned opposite the opening 18 of the reservoir 17.
  • the shaft W undergoes a new translation to bring the first face 11 of this second support plate into contact of the layer 51 of body 1 and its means 48 are activated to produce a vacuum in its enclosure 46 and to suck bodies 1 on the inlets of orifices 15, as described above.
  • the first support plate 12-1 being located opposite the receptacle 27, its means 48 are deactivated to remove the vacuum in its enclosure 46 and bring the interior of this enclosure to atmospheric pressure. Under the action of the gravitational force, the particles whose cavities have been filled with substance of interest fall into the receptacle to be recovered there. Optionally, the compressed gas jets make it possible to detach the particles which would have remained fixed on the support plate.
  • the cavities 2 of the particles maintained on the third support plate 12-3 are filled with substance of interest, as described above for the particles carried by the first plate -support 12-1.
  • the device makes it possible to fill the cavities 2 of the particles fully automatically according to the so-called "masked time” technique since three main operations can be carried out simultaneously.
  • the device comprises three support plates.
  • N support plates can comprise more than three support plates, for example a number N multiple of three, the N support plates then being uniformly distributed around the shaft W, at 360 ° / N one relative to each other, and mounted in association with N / 3 assemblies each essentially comprising a reservoir 17, a plate 41 with its two needle syringes as described above and a receptacle 27.
  • Hollow polymer particles filled with chemical or biological substances as described above have many applications in a wide variety of technical fields. They can be implemented as a product with a defined activity. They then constitute, for example, a product for therapeutic use which it is possible to administer either by oral, per lingual, vaginal, rectal route, and because of the reduced size of the particles, also by nasal, cutaneous, ocular, pulmonary and even parenterally, that is to say both intrathecal as intravenous or intramuscular. They can also be used in the composition of a cosmetic, phytosanitary, textile, hygiene, prevention or treatment product for degradation of the natural environment.
  • Particles according to the invention can also be used as one of the elements involved in a process for preparing a product, in particular thanks to the activity of living cells and the excretion of metabolites. It may be the production of a therapeutic product, or a cosmetic product, but also a food product, for example fermented or flavored using the substances delivered by the hollow particles according to the invention. Particles according to the invention can also be used in a diagnostic test.
  • starch having a molecular weight of approximately 10,000 are dispersed in 150 ml of water.
  • the mixing is carried out at room temperature with mechanical stirring using a stirring motor at 100 rpm for 2 hours.
  • the starch solution is then added with 300 ml of 6N sodium hydroxide solution and mixed for 2 hours at 100 rpm (SI solution).
  • the homogeneous mixture obtained is subjected to intensive bubbling: the reactor is connected to an air compressor under pressure of 1 bar. The bubbling is continued until the solution in gas bubbles is saturated. 4 ml of epichlorohydrin are then added to initiate the polymerization reaction while continuing aeration and with mechanical stirring at 150 rpm. After a few minutes, a low viscosity gel containing air bubbles is obtained, which is poured into 500 ml of paraffin oil and which is maintained under strong mechanical stirring carried out using a mixer (household mixer type) in a bath thermostatically controlled at 40 ° C for 2 hours. The particles formed are collected on a stainless steel sieve of mesh greater than 100 microns and are washed with reverse osmosis water.
  • Tr 17%
  • P (17) The hollow polysaccharide particles obtained are ready to be used directly for encapsulation or stored.
  • a solution of starch SI is prepared as above.
  • the mixture is then subjected to intensive bubbling by connecting the reactor to a nitrogen reserve at 0.5 bar.
  • the bubbling is continued until the solution in gas bubbles is saturated.
  • 4 ml of epichlorohydrin are then added to initiate the polymerization reaction while continuing aeration and with mechanical stirring at 150 rpm.
  • a low viscosity gel containing nitrogen bubbles is obtained.
  • the gel is then passed through an extruder to nozzle.
  • the gelatinous particles formed at the outlet of the nozzle are collected in a reactor containing 500 ml of silicone oil and kept under low mechanical stirring (50 rpm) in a bath thermostatically controlled at 40 ° C for 2 hours.
  • the particles formed are collected on a stainless steel sieve of mesh greater than 100 microns and are washed with reverse osmosis water.
  • the hollow polysaccharide particles obtained are ready to be used directly for encapsulation or stored.
  • the mixture obtained is subjected to intensive bubbling: the reactor is connected to a reserve of compressed air at 1 bar. The bubbling is continued until the solution in gas bubbles is saturated. 1 ml of epichlorohydrin is then added to initiate the polymerization reaction while continuing aeration and with strong mechanical stirring at room temperature. After a few minutes, a low viscosity gel containing air bubbles is obtained, which is dispersed in 250 ml of paraffin oil and which is maintained under strong mechanical stirring carried out using a mixer (household mixer type) in a bath thermostatically controlled at 40 ° C for 2 hours. The particles formed are collected on a stainless steel sieve of mesh between 100 and 500 microns and are washed several times with osmosis water.
  • Cationic hollow particles now have a specific affinity for anionic compounds. They are also bioadhesive towards biological tissues such as the intestinal mucosa.
  • Carboxymethyl cellulose is an anionic polymer with bioadhesive properties. Hollow particles are prepared according to Example No. 3, 50 g of which are dispersed in 250 ml of 2.5% aqueous carboxymethyl cellulose (Sigma) solution. The suspension is stirred slowly for 5 hours at room temperature, then the particles are collected on a stainless steel mesh screen of between 100 and 500 microns and washed several times with osmosis water.
  • a solution of starch SI is prepared as above.
  • the mixture is then subjected to intensive bubbling by connecting the reactor to a nitrogen reserve at 0.8 bar. The bubbling is continued until the solution in gas bubbles is saturated.
  • 2 ml of epichlorohydrin are then added to initiate the polymerization reaction while continuing aeration and with mechanical stirring at 150 rpm. After 2 min, 1 g of titanium dioxide is added to the reaction mixture while continuing the stirring. After 5 min, the mixture is dispersed in 1 l of paraffin oil at room temperature and stirred vigorously (household mixer) for 3 hours.
  • the particles formed are collected on a stainless steel sieve of mesh greater than 100 microns and are washed with reverse osmosis water.
  • the particles obtained are white and opaque. They are ready to be used directly for the encapsulation of light-sensitive or stored substances.
  • Tocopherol acetate also called vitamin E, is a hydrophobic molecule with antioxidant powers.
  • the anionic charges grafted to the polymer matrix allow, despite the hydrophobic nature of tocopherol acetate, to fix it in the network where it is physically trapped. Its antioxidant properties are used to protect substances of interest that are sensitive to oxidation.
  • the assay by HPLC chromatography of the tocopherol acetate impregnated in the particles indicates a loading of acetate of 8% by weight.
  • Chitosan makes it possible to bring positive charges to the hollow particle.
  • the particles prepared according to Example No. 6 above are taken up and washed with reverse osmosis water. Then 10 g of particles are poured very slowly into 250 ml of a solution containing 0.5% of chitosan and 1% of acetic acid, with magnetic stirring. Stirring is continued for 3 hours, then the particles are collected on a stainless steel sieve (opening 100 microns) and washed with a 0.1% acetic acid solution and then with reverse osmosis water.
  • the hollow particles obtained carry anionic charges and impregnated with antioxidant in the mass of the polymer matrix and are covered on the surface with cationic charges.
  • Retinol is a molecule sensitive to oxidation and to light.
  • the hollow particles pigmented white with titanium dioxide protect the encapsulated retinol.
  • the pigmented hollow particles prepared in Example No. 5 are placed in the automatic particle loading apparatus.
  • a soybean oil retinol solution (BASF) is placed in the syringe filling tank and the device is started.
  • the particles thus filled are collected to measure the retinol.
  • the particles are fragmented in an ultrasonic probe in an ice bath.
  • the amount of retinol released is measured by HPLC (high pressure liquid chromatography). It is found that the particles are loaded up to 0.5% by weight, with a yield of 90% in retinol.
  • the hollow particles prepared according to Example No. 1 are washed with bi-distilled water and then sterilized in an autoclave at 120 ° C at a pressure of 1.2 bar for 20 min. The particles are then washed under laminar flow host with DMEM cell culture medium.
  • PC12 rat carcinoma cells Greene LA et al, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2424-28
  • PC12 rat carcinoma cells Greene LA et al, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 2424-28
  • the hollow particles encapsulating the PC12 cells are recovered and immediately placed in an oven at 37 ° C. in DMEM cell culture medium.
  • the hollow particles are mechanically fragmented and the released cells are taken up in DMEM culture medium. Their viability is characterized by measuring the dehydrogenase activity of the mitochondria (toxicological test XTT, Sigma). The results show that the cells as well encapsulated are alive and active. The test repeated at regular time intervals indicates that the viability and the cellular activity are maintained after eight months of conservation of the particles loaded with PCI 2 cells in the culture medium.
  • the rate of degradation of the wall polysaccharide of the particles P (17) and P (8.5) of Example No. 1 is studied.
  • 0.5 g of each type of particle is weighed and then placed in the presence of amyloglucosidase (A 7255, Sigma) at a content of 40 mg in 10 ml of acetate buffer.
  • the suspension obtained is placed in a water bath at 55 ° C.
  • the glucose released by the amyloglucosidase hydrolysis of the crosslinked starch is measured as a function of time.
  • the assay is carried out by the DNS (di-nitro-salicylic acid) method specific for the reducing sugars for the two samples and for a range of control glucose.

Abstract

La présente invention concerne un procédé de chargement de particules polymériques creuses en substances chimiques, biochimiques ou biologiques d'intérêt, y compris des cellules vivantes, les particules creuses obtenues par ledit procédé et susceptibles de recevoir de telles substances d'intérêt, les particules chargées obtenues par ledit procédé, ainsi qu'un dispositif permettant d'automatiser la mise en oeuvre dudit procédé comprenant des moyens pour fixer sur un support une particule creuse, des moyens pour percer la paroi de ladite particule et des moyens pour injecter une substance d'intérêt dans ladite particule. Les particules remplies de substances chimiques, biochimiques ou biologiques selon l'invention ont de nombreuses applications dans des domaines techniques variés: thérapeutique, cosmétique, diagnostic, alimentaire, phytosanitaire, hygiène, prévention et traitement des dégradations de l'environnement naturel.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE FABRICATION DE PARTICULES POLYMÉRIQUES CREUSES CONTENANT DES SUBSTANCES D'INTÉRÊT
La présente invention concerne un procédé de chargement de particules polymériques creuses en substances chimiques ©u biochimiques d'intérêt, les particules creuses susceptibles de recevoir de telles substances d'intérêt et les particules chargées obtenues par ledit procédé, ainsi qu'un dispositif automatisé d'injection de substances dans lesdites particules creuses.
Un médicament peut être caractérisé par la nature de son principe actif et sa forme galénique. Cette dernière a un effet important sur l'action thérapeutique du médicament en modifiant l'intensité et la cinétique d'activité du principe actif. Les formes galéniques traditionnelles telles que les comprimés, les solutés buvables ou injectables, les crèmes, etc., permettent de contrôler le passage du principe actif dans la circulation sanguine de l'organisme. Mais une fois dans la circulation sanguine, la molécule active n'est plus contrôlée: sa distribution est cinétiquement et quantitativement dépendante de facteurs tels que le degré d'affinité de la molécule pour chaque tissu ou organe ou du flux sanguin irriguant les organes cibles. Les molécules actives sont incapables de discerner les sites spécifiques auxquels elles sont destinées, provoquant l'apparition d'effets secondaires et limitant leur emploi dans certaines thérapies. i Depuis une vingtaine d'années les progrès de la recherche galénique et bio-pharmaceutique ont permis de proposer plusieurs solutions pour mieux contrôler le devenir des molécules actives dans l'organisme. Une de ces solutions consiste à encapsuler les principes actifs dans des particules de taille microscopique ou macroscopique. Cette stratégie s'est avérée jusqu'à présent la plus intéressante et la plus prometteuse.
Des systèmes de délivrance variés utilisant des micro ou des macro-particules ont été proposés. Ils reposent sur le principe de Pencapsulation de molécules actives dans des matrices en général polymériques (R. Arshady, 1999, "Microspheres, microcapsules and liposomes", MML Séries, R. Arshaby Ed.).
Une méthode consiste à piéger le principe actif dans un réseau polymérique en réalisant une réaction de polymérisation en présence du principe actif. On parle alors de pré-chargement. Les procédés permettant de préparer de telles particules polymériques sont bien connus de l'homme de l'art. Ils mettent en œuvre des réactions chimiques, thermiques ou électrochimiques dont les conditions opératoires sont dictées par la nécessité de réaliser la polymérisation de la matrice porteuse. Cependant la plupart des principes actifs présentent une instabilité chimique et thermique importante et incompatible avec les conditions de polymérisation, qui engendrent une diminution de la fonctionnalité de la molécule active ou même sa dégradation prématurée. Dans le cas de l'encapsulation de cellules, c'est au moins 90% de la population qui est détruite au terme du processus.
Cette incompatibilité entre les substances à encapsuler et les conditions réactionnelles de la polymérisation constitue également un obstacle à l'encapsulation de molécules d'intérêt non thérapeutique telles que les molécules sensibles à l'oxydation comme les dérivés phénoliques, les molécules comme les vitamines ou les extraits végétaux sensibles à la chaleur, aux conditions de salinité et de pH. C'est pourquoi, à l'heure actuelle leur utilisation est peu développée dans des domaines techniques tels que la préparation de produits alimentaires, cosmétiques, d'hygiène, de protection de l' environnement ou d'autres encore.
Une autre méthode d'encapsulation consiste à introduire par diffusion la molécule d'intérêt dans une matrice polymérique préexistante. On parle alors de post-chargement. Cette méthode moins agressive pour les molécules organiques, est cependant d'application réduite. En effet, la taille des objets pouvant diffuser dans les mailles de la matrice est limitée ce qui élimine à priori l'encapsulation de macro-molécules et de tous les objets biologiques tels que des cellules ou des organites. D'autre part, une affinité suffisante doit exister entre la matrice polymérique et la substance à encapsuler pour que cette dernière reste fixée dans le réseau polymérique et ne soit pas éliminée avec le solvant. Cependant, cette affinité doit être assez douce pour ne pas dénaturer la substance d'intérêt et également pour permettre sa libération à un rythme adapté à l'usage prévu. Des telles contraintes sont le plus souvent incompatibles entre elles et l'encapsulation par post-chargement reste d'intérêt limité à des cas particuliers.
Dans tous les cas, la substance active est piégée dans la masse du réseau polymérique. Cet état de fait est en lui-même un obstacle à l'encapsulation de cellules vivantes et viables en particulier à cause de la limitation de fait des échanges entre la cellule et le milieu extérieur.
Or les cellules sont des réacteurs naturels de choix pour produire des bio-molécules d'intérêt. Elles peuvent être considérées comme des systèmes ouverts qui sont capables de produire des métabolites ayant des propriétés biologiques variées. Ces dernières années, de nombreuse études ont été orientées vers une meilleure connaissance du métabolisme cellulaire et vers la recherche des moyens d'utiliser des cellules animales ou végétales et des organismes unicellulaires, éventuellement génétiquement modifiés, pour la production de métabolites d'intérêt (Lysaght M. et Aebisher P., 1999, "Les cellules encapsulées", Pour la science, N°199). L'intervention de la machinerie cellulaire et de ses rétro-contrôles pour ajuster les taux de biomolécules libérées, explique l'avantage de l'utilisation de cellules entières vivantes pour délivrer des actifs biologiques. Mais pour cela les cellules productrices doivent se trouver dans un environnement favorable.
L'étape d'incorporation d'une substance d'intérêt dans une matrice polymérique particulaire est donc extrêmement contraignante et délicate et constitue à l'heure actuelle le facteur limitant le développement de la technique de micro-encapsulation et son application large dans de nombreux domaines techniques et en premier lieu dans le domaine médical.
La présente invention propose de s'affranchir de ce problème grâce à un procédé d'encapsulation de substances chimiques ou biologiques par injection desdites substances dans la cavité d'une particule polymérique creuse préalablement préparée. Est également revendiqué un dispositif permettant la mise en œuvre dudit procédé et qui présente notamment l'avantage essentiel de pouvoir automatiser la mise en œuvre de ce procédé tout en ayant une structure relativement simple. Un procédé permettant d'obtenir des particules creuses totalement exemptes de toute toxicité et par là même compatibles avec la préservation de l'activité des substances encapsulées est également proposé, ainsi que les particules obtenues.
De telles particules permettent d'encapsuler des entités de taille variée, en partant de petites entités comme des sels en solution jusqu'à des éléments solides en suspension comme des cellules y compris des micro-organismes, tout en préservant l'intégrité et la fonctionnalité des entités ainsi formulées. En particulier, le procédé proposé permet d'encapsuler des cellules vivantes excrétant des molécules d'intérêt.
DESCRIPTION
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de particules formées d'une matrice polymérique comprenant au moins une cavité contenant une entité chimique ou biologique d'intérêt, consistant à : fixer sur un support une particule creuse formée d'une matrice polymérique comprenant au moins une cavité, percer la paroi de ladite particule, injecter une substance d'intérêt dans ladite cavité, ladite substance étant constituée de l'une des phases suivantes : gazeuse, liquide ou solide, ladite phase contenant une entité chimique ou biologique, récupérer ladite particule dont la cavité contient ladite substance.
La paroi d'une particule creuse utilisée dans le procédé selon l'invention est une matrice polymérique dont les propriétés sont choisies de manière adaptée à l'usage souhaité, comme par exemple, la biocompatibilité, la non toxicité, la biodégradabilité, la diffusion sélective à travers le maillage du réseau polymérique, l'affinité spécifique vis-à-vis de certains tissus ou organes, la compatibilité entre la matrice polymérique et la substance encapsulée, la stabilité dans le milieu de stockage, ou d'autres paramètres encore.
Par exemple, pour les applications thérapeutiques, cosmétiques ou alimentaires, la paroi polymérique de la particule creuse selon l'invention sera de préférence biocompatible et non toxique. Par biocompatibilité on entend que la particule ne perturbe pas le milieu d'implantation. La biocompatibilité pourra au demeurant être assurée autant vis-à-vis du milieu d'implantation que vis-à-vis des substances actives ou des objets biologiques encapsulés.
Le milieu d'implantation peut être un milieu physiologique, comme c'est le cas lors de l'administration d'un médicament par voie orale, sous-cutanée, intramusculaire, etc., ou que ce soit une solution tel qu'un milieu de culture cellulaire, un produit alimentaire tel qu'une boisson alcoolisée, un produit laitier, un produit cosmétique ou tout autre milieu. On choisira les constituants de départ et les conditions opératoires de préparation d'une particule creuse destinée à recevoir une substance d'intérêt, de manière à obtenir une matrice polymérique biocompatible avec un milieu donné. De tels constituants de départ sont par exemple des polymères naturels polysaccharidiques comme le chitosan, les acides hyaluroniques, les alginates, les carragénanes. Les conditions opératoires peuvent être celles mises en œuvre dans le procédé de préparation de particules creuses décrit plus loin.
On peut souhaiter que la particule utilisée dans le procédé selon l'invention soit également biodégradable. La vitesse de dégradation déterminant la dose de matière active libérée par unité de temps, c'est en fonction de l'usage prévu de la particule que se fait le choix du polymère. Par exemple, les particules selon l'invention peuvent être utilisées pour transporter des substances jusqu'à une cible et les libérer rapidement une fois à destination. Pour cela le réseau polymérique peut être faiblement réticulé, autorisant une hydrolyse enzymatique rapide, et permettant la libération des composés actifs en quelques minutes ou en quelques heures après administration des particules.
Au contraire on peut avoir intérêt à libérer progressivement la substance transportée, ou même à la fixer pour des périodes longues, comme dans le cas des cellules immobilisées, au niveau d'une cible ou dans un milieu support. Le réseau polymérique peut alors être fortement réticulé ou être greffé par des radicaux spécifiques pour ne pas être dégradé rapidement par les enzymes cellulaires et pour protéger ainsi pendant plusieurs jours et même plusieurs mois les actifs contenus dans la particule ou les cellules immobilisées.
La vitesse de dégradation du polymère est réglée par la nature du monomère de départ et par le choix des conditions opératoires. L'homme de l'art dispose d'une littérature spécialisée complète pour moduler ce paramètre.
La matrice polymérique peut également avoir subi des traitements chimiques ou physiques conférant à la particule des propriétés particulières. Par exemple, on pourra utiliser des particules non reconnaissables par le système réticulo-endothélial par greffe dans le réseau polymérique des molécules de polyéthylène glycol connu pour être furtif. On pourra aussi masquer des radicaux cationiques ou anioniques par couplage avec des molécules de charge opposée. Des molécules ou radicaux conférant des propriétés physico-chimiques particulières dans la masse peuvent également être greffés à la matrice polymérique pour modifier la biodégradabilité, la pigmentation, la perméabilité aux rayonnements, ou de conférer à la paroi polymérique des propriétés bioadhésives ou mucoadhésives, ou d'autres propriétés encore.
Les particules mises en œuvre dans le procédé selon l'invention sont dotées en outre de propriétés de diffusion sélective des molécules. La structure matricielle de la paroi desdites particules est analogue à un réseau tridimensionnel maillé. La taille des mailles est fonction de la densité du réseau polymérique lui-même déterminé par différents paramètres bien connus, en particulier la nature du monomère de départ et de l'agent réticulant, et le temps de réaction. Le taux de réticulation est alors inversement proportionnel à la taille des mailles. Une matrice polymérique composant la paroi d'une particule creuse destinée à l'encapsulation de cellules sera par exemple choisie pour son taux de réticulation élevé. En effet les petites molécules comme le glucose (masse molaire de 180g/mol) ou l'inuline (masse molaire de l'ordre de 5000g/mol) passent à travers les mailles de la matrice, alors que des molécules plus grosses telles que l'albumine humaine (masse molaire d'environ 69 000 g/mol) ne franchissent pas le réseau polymérique. Les nutriments nécessaires à la vie des cellules peuvent donc diffuser du milieu d'implantation des particules jusqu'aux cellules. Les métabolites excrétés par les cellules encapsulées peuvent également diffuser à travers la paroi polymérique. En revanche, les cellules sont protégées de macromolécules telles que des anticorps ou des enzymes pouvant les endommager.
Ainsi les particules creuses contenant une substance d'intérêt obtenues par le procédé selon l'invention sont particulièrement adaptées à l'encapsulation de cellules vivantes car elles protègent les cellules tout en laissant diffuser les nutriments nécessaires à la viabilité à long terme de ces dernières, mais aussi les métabolites d'intérêt, par exemple possédant un effet thérapeutique, cosmétique, aromatique, ou tout autre effet intéressant.
De la même manière et pour les mêmes raisons, les particules creuses selon l'invention peuvent servir au transport et au maintien dans un milieu choisi d'organites, comme par exemple des chloroplastes ou des mitochondries, ou de fractions cellulaires actives telles que des enzymes ou des ribosomes.
En outre, dans un mode particulier de mise en œuvre du procédé selon l'invention, il est possible de recouvrir les particules d'une pellicule leur conférant des propriétés de surface particulières, telles qu'une affinité spécifique pour un tissus, des propriétés de bioadhésion ou de mucoadhésion, ou d'autres propriétés utiles encore. Le pelliculage peut être réalisé par trempage dans une solution du composé à déposer sur la particule, ou par pulvérisation. La pulvérisation peut avoir lieu avant ou après l'injection de substances d'intérêt dans la particule.
De manière générale, les matrices polymériques décrites dans la demande de brevet WO 98/13030 sous le titre "Matrices ioniques biodégradables de polarité interne modulable à polymère greffé" sont de nature à répondre aux caractéristiques recherchées pour les matrices polymériques formant les particules selon l'invention.
Il est ainsi possible de préparer en particulier des particules creuses formées d'une matrice polysaccharidique, de préférence à base d'amidon modifié ou pas, de section comprise entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,2 et 2 mm, et comprenant au moins une cavité de section supérieure à 0,01 mm.
Dans le procédé selon l'invention, une particule est fixée sur un support par une force, par exemple par aspiration à travers un orifice de section inférieure à la section de la particule. Puis, la paroi de la particule fixée est percée à l'aide d'un instrument permettant également d'injecter la substance d'intérêt. Cette opération peut être menée manuellement à l'aide d'une seringue dont le réservoir contient la substance à injecter, équipée d'une aiguille. Elle peut également être conduite à l'aide du dispositif automatisé, objet de la présente invention, qui sera décrit en détail plus loin.
La récupération de la particule ainsi chargée en substance d'intérêt est réalisée par libération de la force appliquée, dans un récipient contenant éventuellement une solution permettant une bonne conservation de ladite substance par exemple une solution saline, une solution tamponnée, une solution physiologique, une solution aseptique, ou autre.
Les particules obtenues finalement par le procédé selon l'invention contiennent des substances chimiques, biochimiques ou biologiques actives de toutes sortes. La cavité des particules peut contenir une phase gazeuse, liquide ou solide pure ou incorporant une entité chimique, biochimique ou biologique, constituant la substance d'intérêt.
La phase gazeuse peut être tout composé chimique se trouvant sous forme gazeuse du fait de la température ou du fait d'une réaction thermodynamique. La phase liquide peut être une solution aqueuse ou alcoolique ou huileuse ou leur mélange sous forme d'émulsion ou de micro-émulsion de type huile dans eau ou eau dans huile. Les substances solides peuvent être par exemple des poudres de granulométrie variable ou des graisses, éventuellement en suspension ou émulsionnées dans la phase liquide.
Une entité chimique, biochimique ou biologique peut être toute entité simple ou complexe, synthétique ou naturelle ayant une activité chimique ou biologique ou simplement une propriété intéressante pour une application donnée. Ce peut être une molécule minérale organique ou biochimique (on entend par molécule biochimique toute molécule chimique ayant une activité biochimique, c'est-à-dire jouant un rôle dans un processus biologique), une cellule, un micro-organisme, une fraction cellulaire, biologiquement actives ou pas.
Une telle molécule peut être par exemple: - un acide aminé, un peptide en particulier le glucagon, la somatostatine, la calcitonine, les interférons et les interleukines, la LHRH (Lutesine Hormone Releasing Hormone) , l'érythropoïétine, les antagonistes de la bradykinine, l'insuline, ou un dérivé peptidique ou un polypeptide, une protéine, un anticorps, une enzyme, un protéoglycane;
- une vitamine;
- un oligonucléotide, une molécule d'ARN, d'ADN ou une fraction de celles-ci;
- une hormone ou un dérivé hormonal;
- un principe actif thérapeutique tel qu'un antibiotique, un antiviral, un anticancéreux, un vasoconstricteur, un cardiotonique, un vasodilatateur, un diurétique ou un antidiurétique, un neuroleptique, un antidépresseur, un anti-inflammatoire, un antiMstaminique, un antifongique, un agent anti-allergique, un anesthésique, un agent de diagnostic;
- un antiprotéase, un antiseptique, un antioxydant, un agent hydratant;
- un liposome;
- une huile essentielle, un extrait végétal - un insecticide, un fongicide;
- un arôme, un colorant, éventuellement de qualité alimentaire;
- une molécule absorbant un rayonnement, ou présentant des propriétés chromophores, fluorophores, ou radio-active;
Une entité biologique peut être une cellule, biologiquement active ou pas, ou une fraction cellulaire biologiquement active ou pas. Une cellule incorporée dans une particule selon l'invention peut être toute cellule naturelle ou génétiquement modifiée, d'origine végétale ou animale y compris humaine, ou une bactérie, un virus, une levure ou tout autre microorganisme. Une fraction cellulaire peut être par exemple un extrait membranaire, un extrait enzymatique, un organite tel que des mitochondries ou des ribosomes.
Les cellules ou les fractions cellulaires actives prisonnières des particules et protégées par elles sont susceptibles d'excréter dans la cavité de la particule, des molécules issues du métabolisme desdites cellules ou fractions cellulaires. De telles molécules d'intérêts peuvent alors diffuser à travers une paroi polymérique de maillage adéquat et produire leurs effets durant de longues périodes.
Le mode de préparation des particules destinées à contenir une substance d'intérêt doit permettre d'obtenir des particules possédant des caractéristiques particulières, comme par exemple, la biocompatibilité, la non toxicité, la biodégradabilité, la diffusion sélective à travers le maillage du réseau polymérique, l'affinité spécifique vis-à-vis de certains tissus ou organes, la compatibilité entre la matrice polymérique et la substance encapsulée, la stabilité dans le milieu de stockage, ou d'autres paramètres encore.
Or, comme expliqué précédemment, ces critères sont souvent difficiles à concilier avec les conditions opératoires nécessaires à la polymérisation de la matrice. Un procédé tout particulièrement adapté à ces contraintes est proposé pour la fabrication de particules creuses destinées à recevoir une substance d'intérêt, consistant à:
- mettre en solution dans un réacteur au moins un composé monomérique en présence d'un agent réticulant, 0 - insuffler un fluide gazeux dans le réacteur en maintenant sous agitation jusqu'à obtention d'un mélange visqueux saturé en micro-bulles,
- fractionner le mélange visqueux en particules polymériques isolées,
- placer les particules polymériques isolées dans un milieu dispersant jusqu'à gélifîcation complète, -> - récupérer les particules polymérisées.
Un avantage décisif du procédé décrit ci-après en détail, est que seules les propriétés souhaitées pour les particules creuses finales sont à prendre en compte: la paroi de la particule creuse est une matrice polymérique dont la composition est choisie en fonction des propriétés 0 physico-chimiques que l'on souhaite obtenir in fine. En effet, du fait que les substances chimiques ou biologiques à encapsuler seront introduites dans une étape ultérieure et indépendante, les conditions opératoires de préparation de la matrice polymérique peuvent être choisies parmi les nombreuses techniques à la disposition de l'homme de l'art. La nature du ou des monomères de départ n'a d'importance que dans la mesure où le polymère synthétisé -> répond à un cahier des charges adapté à l'usage prévu de la particule creuse. La matrice de base peut être modifiée et adaptée à l'usage qui en sera fait, par des traitements chimiques, thermiques ou autres, sans que le choix des protocoles utilisés soit limité du fait des contraintes liées à la fragilité des substances à encapsuler.
0 Le composé monomérique est donc choisi selon les critères exposés précédemment. Il est bien entendu qu'il peut s'agir d'un seul monomère ou de deux monomères différents aboutissant à la formation respectivement d'un polymère au sens strict ou d'un copolymère, ou encore une ou plusieurs macromolécules ayant elles-mêmes une structure polymérique et assemblées par pontage en général à l'aide d'un agent réticulant, aboutissant à la formation 5 d'une matrice polymérique réticulée. La matrice polymérique peut être constituée par tout polymère connu répondant au cahier des charges défini selon les exigences ci-dessus exposées. Ils peuvent être d'origine naturelle, synthétique ou semi-synthétiques. Pour la préparation des particules selon l'invention, on utilise de préférence des polysaccharides, comme par exemple l'amidon, l'amidon ou la cellulose modifiés chimiquement ou enzymatiquement. A titre d'exemple, peuvent également être utilisés des polymères communs comme les polyesters, les polyamides, les polyacrylates, les polylactiques glycoliques, ou encore les peptides, polypeptides et protéines, les gels peptidiques, les gélatines, les gels d'alginate. Leur poids moléculaire est variable.
Afin d'adapter ses propriétés à l'usage prévu de la particule creuse, la matrice polymérique constituant la paroi peut subir différents traitements.
En particulier, la matrice polymérique peut être modifiée c'est-à-dire que peuvent y être fixés des groupements chimiques tels que des composés fonctionnels ou des composés ioniques, ou des composés modifiant les propriétés du polymère comme un pigment par exemple. Tous ces composés peuvent être couplés chimiquement à la matrice en surface ou dans le réseau polymérique par des liaisons de faible énergie (par exemple des liaisons hydrogènes), de moyenne énergie (par exemple des liaisons ioniques) ou de forte énergie (par exemple des liaisons covalentes). Ils peuvent également être piégés physiquement dans le réseau. La modification peut être réalisée avant, pendant ou après la réaction de réticulation. Dans certains cas, les réactions de modification de la matrice polymérique peuvent être réalisées après chargement de la substance d'intérêt dans la particule creuse. Les techniques de greffage de molécules et de fonctions sont bien connues de l'homme de l'art et classiquement utilisées en chimie.
Après solubilisation du monomère, on ajoute l'agent réticulant sous agitation forte pour obtenir une dispersion totale.
L'agent réticulant est choisi parmi les molécules bifonctionnelles, bien connues de l'homme de l'art, comme Pépichlorhydrine, les diépoxydes, les dialdéhydes, les dicarboxylates, les diisothiocyanates, les carbodiimides, etc.. Les monomères peuvent servir eux-mêmes d'agent réticulant s'ils possèdent plusieurs sites réactifs. L'ajout d'un initiateur de polymérisation sera parfois utile.
Le fluide gazeux peut être un gaz pur tel que l' azote, le gaz carbonique, un mélange gazeux tel que de l'air, ou tout mélange gazeux inerte vis-à-vis de la paroi polymérique et de la substance d'intérêt. Le barbotage ainsi réalisé peut éventuellement tenir lieu en même temps de moyen d'agitation du mélange réactionnel. L'addition de l'agent réticulant et le barbotage gazeux peuvent se faire de manière concomitante, de façon à ce que dès l'initiation de la réaction de pontage entre les monomères, le mélange réactionnel dont la viscosité augmente, piège les micro-bulles.
Le fractionnement du mélange visqueux en particules isolées est réalisé par une des techniques à la disposition de l'homme de l'art: par exemple agitation mécanique en émulsion, broyage ou extrusion. Les • particules doivent être maintenues dans un milieu dispersant jusqu'à gélification complète du réseau polymérique renfermant les bulles gazeuses.
Pour réaliser le fractionnement en particules isolées, on peut transférer le mélange réactionnel visqueux dans un milieu hydrophobe et créer une émulsion par agitation mécanique jusqu'à solidification totale du polymère. Le transfert est réalisé avant la prise en gel du réseau polymérique, ce temps variant en fonction principalement de la force et de la quantité d'agent réticulant employé. Un milieu hydrophobe couramment utilisé est l'huile de paraffine ou l'huile de silicone.
Une autre méthode de fractionnement consiste à faire passer le mélange réactionnel visqueux dans une extrudeuse à buse, et à recueillir les particules en sortie de buse dans un bain hydrophobe sous agitation.
Dans une variante du procédé de fabrication de particules creuses selon l'invention, on prépare des particules creuses greffées. Pour cela, on fait réagir avec le mélange réactionnel un radical chimique portant une fonction ou une charge ionique ou conférant à la matrice polymérique une propriété intéressante telle qu'exposée plus haut. L'addition d'un tel radical peut se faire dès la solubilisation du monomère, ou pendant la réaction de polymérisation, ou encore par imprégnation à la fin du processus de fabrication de la particule, selon la nature du composé greffé et le résultat recherché.
Les particules ainsi obtenues sont creuses. Elles sont pourvues d'une ou de plusieurs cavités remplies du gaz utilisé pour le barbotage. Elles peuvent alors être récupérées par tamisage, par filtration, par centrifugation ou par tout autre moyen commode, et éventuellement calibrées par tamisage sur des grilles étalonnées. Elles peuvent être, si besoin, stérilisées ou additionnées d'un conservateur évitant le développement de la flore microbienne, et stockées sans risque de dégradation pendant plusieurs mois, voire plusieurs années. Le stockage peut être fait sous forme sèche ou dans une solution adaptée à l'usage qui en est prévu ultérieurement. Leur transport ne pose aucun problème.
Les particules creuses selon l'invention, préparées par le procédé ci-dessus décrit, sont spécialement destinées à l'encapsulation de substances chimiques ou biologiques de toutes sortes, et en particulier de substances sensibles à leur environnement physico-chimique. Elles peuvent par exemple être remplies d'une phase gazeuse, liquide ou solide pure ou incorporant une entité chimique ou biologique, constituant la substance d'intérêt.
Selon le procédé de préparation de la particule creuse contenant une substance d'intérêt selon l'invention, la cavité de la particule contient initialement un gaz, par exemple de l'air ou de l'azote. Par la suite, la cavité est remplie d'autres substances gazeuses, liquides ou solides, ou d'un mélange de substances tel qu'un soluté ou une suspension, y compris une suspension cellulaire. Cette opération, objet de la présente invention, est conduite en perçant la paroi de la particule et en injectant dans la cavité une substance d'intérêt, et peut être réalisée manuellement, ou par tout moyen automatique adapté. En particulier, le chargement des particules peut être effectué par l'appareil automatisé spécialement conçu à cet effet, qui est également un objet de la présente invention.
Ainsi, la présente invention a pour objet un dispositif de remplissage avec une substance d'intérêt de la cavité d'une particule creuse, comportant :
- des moyens pour appliquer une première force sur ladite particule de façon à la maintenir sur une première face d'une plaque-support agencée pour engendrer une force de réaction à ladite première force,
- des moyens pour réaliser une percée dans la paroi de ladite particule de façon que ladite percée débouche dans ladite cavité lorsque ladite particule est maintenue sur ladite plaque- support par ladite première force, et
- des moyens pour introduire, par ladite percée, une quantité déterminée de la substance d' intérêt dans ladite cavité.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront au cours de la description suivante donnée en regard des dessins annexés à titre illustratif mais nullement limitatif.
La figure 1 représente le synoptique du principe de base du dispositif selon l'invention.
Les figures 2, 3, 4 représentent sous forme schématique, un mode de réalisation du dispositif selon l'invention en trois parties.
La figure 5 représente, sous forme schématique en vue de dessus, le mode de réalisation du dispositif selon les figures 2 à 4.
La figure 6 montre sous microscope optique, le perçage de la paroi d'une particule polysaccharidique creuse. La pression exercée par l'aiguille déforme la paroi souple de la particule juste avant d'y pénétrer. La cavité apparaît comme un disque blanc au centre.
La figure 7 montre sous microscope optique, une particule remplie de cellules animales PC 12.
Les cellules forment une masse p -.sombre et irrégulière dans la cavité de la particule apparaissant en blanc.
Il est précisé que, sur l'ensemble des figures ci-dessus, jointes à la présente description, les mêmes références désignent les mêmes éléments, quelle que soit la figure sur laquelle elles apparaissent et quelle que soit la forme de représentation de ces éléments. De même, si des éléments ne sont pas spécifiquement référencés sur l'une des figures, leurs références peuvent être aisément retrouvées en se reportant à une autre figure.
Il est précisé également que, lorsque, selon la définition de l'invention, l'objet de l'invention comporte "au moins un" élément ayant une fonction donnée, le mode de réalisation décrit peut comporter plusieurs de ces éléments. De même, si le mode de réalisation de l'objet selon l'invention tel qu'illustré comporte plusieurs éléments de fonction identique et si, dans la description, il n'est pas spécifié que l'objet selon cette invention doit obligatoirement comporter un nombre particulier de ces éléments, l'objet de l'invention pourra être défini comme comportant "au moins un" de ces éléments.
La présente invention a aussi pour objet un dispositif permettant de mettre en œuvre le procédé décrit ci-avant, pour remplir, avec une substance d'intérêt décrite ci-avant, la cavité 2 réalisée dans une particule comme celle qui a été décrite ci-avant.
La figure 1 représente le synoptique du principe de base d'un tel dispositif. Ce dispositif comporte des moyens 10 pour appliquer une première force sur la particule de façon à la maintenir sur une première face 11 d'une plaque-support 12 agencée pour engendrer une force de réaction à cette première force. Dans le synoptique selon la figure 1 , la particule maintenue sur la première face 11 d'une plaque-support 12 est représentée en traits interrompus et le dispositif dans cette première configuration est représenté en A. Le dispositif comporte en outre des moyens 13 pour réaliser une percée dans la paroi 1 de façon qu'elle débouche dans la cavité 2 lorsque la particule est maintenue sur la plaque- support 12 par la première force. Le dispositif dans cette deuxième configuration est représenté en B.
Le dispositif comporte aussi des moyens 14 pour introduire, par cette percée, une quantité déterminée d'une substance d'intérêt dans la cavité 2, la particule étant toujours maintenue sur la première face 11 de la plaque-support 12.
Quand la cavité 2 est remplie de la quantité déterminée de la substance, la particule ainsi réalisée est récupérée, par exemple, dans un réceptacle 27 comme il sera décrit ci-après. Le dispositif dans cette troisième configuration est représenté en C. Dans une réalisation avantageuse, les moyens 10 pour appliquer une première force sur la particule de façon à la maintenir sur une première face de la plaque-support sont constitués par un orifice traversant 15 réalisé dans la plaque-support 12 et des moyens 16 pour créer une différence de pression de part et d'autre de la plaque-support, la pression la plus forte étant appliquée du côté de la première face 11 de cette plaque. De plus, la plaque-support est réalisée en un matériau relativement étanche et la section maximale de l'orifice 15 est inférieure à la section minimale de la particule.
Dans un mode de réalisation avantageux, le dispositif comporte en outre des moyens 29 pour amener la particule sur l'orifice 15, ces derniers moyens 29 comportant un réservoir 17 comportant au moins une ouverture 18, ce réservoir étant apte à contenir la particule de façon que, entre le réservoir et la particule, puisse se créer une perte de charge relativement importante, et des moyens 19 pour positionner la plaque-support et le réservoir l'un par rapport à l'autre au premier endroit déterminé A de façon que l'ouverture 18 soit située en regard de la première face 11 de la plaque-support 12 et sensiblement dans l'axe de l'orifice 15 pour que, sous l'action de la différence de pression, la particule vienne se positionner à l'entrée de cet orifice 15.
Les figures 2 à 5 représentent, sous forme schématique, un mode de réalisation avantageux du dispositif selon l'invention permettant d'effectuer le remplissage, avec une substance d'intérêt des cavités 2 réalisées dans les particules, de façon automatique et selon la technique connue des techniciens sous la terminologie " en temps masqué ".
Avec un tel dispositif, il est possible d'effectuer simultanément les trois opérations suivantes : la mise en place d'une première pluralité de particules sur les orifices 15 d'une première plaque-support, le remplissage des cavités d'une deuxième pluralité de particules qui avait été mise en place sur une deuxième plaque-support avant la mise en place de la première pluralité, et la récupération d'une troisième pluralité de particules qui avait été mise en place sur une troisième plaque-support avant la mise en place de la deuxième pluralité sur la deuxième plaque-support et dont les cavités 2 avaient été remplies avant le remplissage de cette deuxième pluralité.
Ce dispositif illustré sur les figures 2 à 5 et faisant application de la structure de base décrite en regard de la figure 1, comporte au moins trois plaques-supports 12-1, 12-2, 12-3, des moyens 40 pour déplacer dans l'espace ces trois plaques-supports de façon qu'elles puissent prendre successivement trois première, deuxième et troisième positions déterminées respectivement référencées A, B, C, a savoir : la première position A dans laquelle une particule vient se fixer sur la première face 11 d'une plaque support à l'entrée d'un orifice 15, la deuxième position B dans laquelle la cavité 2 de la particule est remplie avec une quantité déterminée de la substance d'intérêt, et la troisième position C dans laquelle la particule avec sa cavité 2 remplie de la substance est récupérée dans un réceptacle 27. Bien entendu, chacune des trois plaques-supports 12-1, 12-2 et 12-3 comporte une pluralité d'orifices 15 permettant de fixer, à la fois, une pluralité de particules.
Dans une réalisation avantageuse, les moyens 40 pour déplacer dans l'espace les trois plaques-supports sont constitués par des moyens pour réaliser une rotation R simultanée de ces trois plaques-supports autour d'un axe de rotation W de façon qu'elles passent respectivement et successivement par les trois première, deuxième et troisième positions décrites ci-avant, et des moyens pour réaliser une translation T des trois plaques-supports entre deux positions sur l'axe de rotation W. De façon avantageuse, ces trois plaques- supports sont situées sensiblement dans un même plan perpendiculaire à l'axe de rotation W, à cent vingt degrés les unes des autres.
Quant aux moyens 40 permettant d'obtenir la rotation et la translation des plaques-supports, ils sont bien connus en eux-mêmes. Ils sont par exemple constitués de deux moteurs et d'une crémaillère, l'un des moteurs entraînant la rotation de la crémaillère autour de son axe, l'autre moteur entraînant la translation de cette crémaillère suivant son axe.
Lorsque les plaques-supports comportent une pluralité d'orifices 15, les moyens 29 pour amener une particule en face de chaque orifice, sont constitués par le réservoir 17, figure 2, qui présente une ouverture 18 d'une section supérieure à chaque plaque-support 12, le réservoir étant apte à contenir une quantité importante de particules pour former au moins une couche homogène 51 de ces particules, de façon qu'une plaque-support 12 puisse venir au contact de cette couche. Dans ce cas, la perte de charge relativement importante définie ci-avant en regard de la figure 1, partie A, entre une particule et le réservoir 17 est celle qui se crée entre les particules elles-mêmes, et éventuellement l'ensemble des particules et le réservoir 17. En conséquence, pour un fonctionnement optimal du dispositif, il faut veiller à ce que le réservoir 17 contienne une quantité suffisante de particules pour former au moins une couche 51 de particules continue et homogène.
Quant aux moyens 13 pour réaliser une percée dans la paroi 1 d'une particule de façon que cette percée débouche dans la cavité 2 lorsque la particule est maintenue sur la première face de la plaque-support 12 par la première force, ils peuvent être constitués de différentes façons, par exemple par un faisceau de rayonnement laser ou analogue. Cependant, dans une réalisation actuellement préférentielle comme illustré sur la figure 3, il sont constitués par au moins une première aiguille 21 et des moyens pour déplacer cette première aiguille et la plaque-support l'une par rapport à l'autre, tout en maintenant la première force 10 sur la particule pour qu'elle demeure fixe par rapport à la plaque-support 12, de façon que la première aiguille 21 soit apte à pénétrer dans la cavité 2 en traversant la paroi 1.
Dans cette réalisation selon les figures 2 à 5, les moyens pour déplacer la première aiguille et la plaque-support l'une par rapport à l'autre et les moyens 14 pour introduire, par la percée, une quantité déterminée de la substance d'intérêt dans la cavité 2, forment une combinaison de moyens qui sont constitués par un dispositif d'injection, par exemple une première seringue 22 apte à contenir une quantité suffisante de la substance d'intérêt, et des moyens 23 pour lier la première aiguille et la première seringue de façon que la substance contenue dans la seringue puisse être éjectée et pénétrer dans la cavité en passant par le capillaire de la première aiguille. Ces moyens 23 bien connus en eux-mêmes sont par exemple constitués par un emboîtement conique mâle-femelle.
Cette combinaison de moyens comporte en outre des moyens pour amener la plaque-support 12-1 , 2, 3, et la première aiguille 21 montée en coopération avec la première seringue 22 en un deuxième endroit déterminé B, des moyens 24 pour déplacer la première seringue par rapport à la plaque-support quand elle est positionnée en ce deuxième endroit déterminé B, et des moyens 25 pour commander l'injection de la substance par la première aiguille 21 dans la cavité 2 en commandant la première seringue 22, tout en maintenant la première force 10 sur la particule.
Ces moyens 25 schématiquement illustrés sur la figure 3 peuvent être constitués de différentes façons, par exemple par un vérin de tout type agissant sur le piston de la seringue.
Dans une réalisation avantageuse, le dispositif peut comporter en outre, pour favoriser le remplissage des cavités 2 des particules, des moyens 33 pour aspirer la phase gazeuse contenue dans la cavité de chaque corps sensiblement simultanément à l'introduction du produit et en fonction de la quantité de substance introduite. Ces moyens 33 comportent par exemple au moins une seconde aiguille 34 et une seconde seringue 35, des moyens 36 pour lier la seconde aiguille et la seconde seringue, des moyens pour déplacer la seconde aiguille liée à la seconde seringue de façon que la seconde aiguille vienne traverser la paroi 1 de la particule pour déboucher dans la cavité 2 lorsque la plaque-support 12 est située au deuxième endroit déterminé B, et des moyens 37 pour commander la seconde seringue 35 de façon qu'elle soit aspirante.
Comme mentionné ci-avant, chaque plaque-support comporte une pluralité d'orifices 15 et peut donc maintenir une pluralité de particules. Il serait donc possible d'utiliser une pluralité de couples aiguille-seringue 21-22 et 34-35 pour effectuer simultanément le remplissage des cavités des particules maintenues sur une même plaque-support. Cette réalisation serait cependant relativement compliquée à mettre en œuvre et relativement onéreuse.
Aussi, de façon avantageuse, les moyens pour déplacer la première aiguille 21 liée à la première seringue 22 et la seconde aiguille 34 liée à la seconde seringue 35 par rapport à la plaque-support sont constitués par au moins une platine 41, des moyens 42 pour lier les deux seringues 22, 35 à la platine 41 de façon que les deux aiguilles 21, 34 soient situées sur deux droites concourantes, des moyens 50 pour déplacer la platine suivant deux axes en X et Y, et des moyens 48, 49 pour déplacer respectivement les deux aiguilles 21, 34 sur les deux droites concourantes. Ces moyens 48, 49 seront par exemple avantageusement constitués par des vérins commandables ou analogues respectivement liés aux deux seringues pour permettre la translation de chaque aiguille liée à sa seringue.
De façon avantageuse, le dispositif peut aussi comporter en outre des moyens schématiquement représentés en 43, pour déterminer la présence et la position des première et seconde aiguilles 21, 34. Ces moyens sont bien connus en eux-mêmes et peuvent être constitués de capteurs fonctionnant selon le principe de la triangulation par faisceaux lasers ou analogue. Ces capteurs permettent de vérifier d'une part que les aiguilles sont bien positionnées par rapport à la particule dont elles doivent percer la paroi, et d'autre part l'intégrité de chaque aiguille et éventuellement commander le remplacement automatique de l'aiguille qui aurait été détectée comme étant défectueuse, par exemple cassée.
Le dispositif comporte en outre un réceptacle 27, des moyens pour déplacer ce réceptacle et la plaque-support 12 l'un par rapport à l'autre en un troisième endroit déterminé C, après que la quantité voulue de substance d'intérêt ait été introduite dans la cavité 2 et tout en maintenant la première force 10 sur la particule, c'est-à-dire la différence de pression, et des moyens pour, d'une part, annuler cette première force et, d'autre part, appliquer une seconde force 28 sur la particule pour la détacher de la plaque-support 12 et pour qu'elle soit apte à être récupérée dans le réceptacle 27.
Avantageusement aussi, le dispositif comporte en outre des moyens 30 pour créer des forces mécaniques en direction sensiblement tangentielle à la première face 11 de la plaque-support 12, de façon à pouvoir détacher toutes les particules qui seraient restées collées sur la première face 11 de la plaque-support li2. Ces moyens 30 sont constitués par exemple par des jets de gaz ou de liquide sous pression. Bien entendu, dans le mode de réalisation du dispositif tel qu'illustré sur les figures 2 à 5, le réservoir 17, la platine 41 et le réceptacle 27 seront respectivement positionnés en des endroits déterminés par exemple sur une embase représentée schématiquement en E et les trois plaques-supports seront montées en rotation et en translation par rapport à cette embase E de façon qu'elles coopèrent successivement avec le réservoir 17, la platine 41 et le réceptacle 27 comme décrit ci-après, cette embase E servant de ce fait de référentiel à tous les déplacements définis dans la présente description.
Il est de plus bien évident qu'un tel dispositif est essentiellement destiné à être utilisé dans un milieu où régnent une pression atmosphérique et une force de gravitation. Dans ce cas, les moyens pour créer une différence de pression sont, comme illustré sur les figures 2 à 5, constitués par des moyens 45 pour créer une enceinte étanche 46 avec la seconde face 47 de la plaque-support 12 sur laquelle débouche les orifices 15, et des moyens 48 pour réaliser le vide dans cette enceinte 46, par exemple au moyen d'une pompe à vide ou analogue. Dans ce cas aussi, la seconde force 28 est constituée par la force de gravitation elle-même, l'axe de rotation W étant en position verticale et la première face 11 des plaques-supports étant à un niveau inférieur par rapport à leur seconde face 47.
Le dispositif décrit ci-dessus dans son mode de réalisation illustré sur les figures 2 à 5 fonctionne et s'utilise de la façon suivante : H est tout d'abord précisé que l'ensemble du dispositif tel qu'illustré sur les figures 2 à 5 comporte une unité de gestion permettant de commander les opérations décrites ci-après, notamment la translation T, la rotation R des trois plaques-supports 12-1, 12-2 et 12-3, la commande 25, 37 des seringues 22, 35, la commande du déplacement 48, 49 de ces seringues, la commande 50 de la platine 41 , la commande des moyens 48 pour réaliser un vide.
Ceci ayant été précisé, le dispositif se trouve originellement dans une position telle qu'illustré sur la figure 5, dans laquelle la première plaque-support 12-1 est en regard de l'ouverture du réservoir 17, la deuxième plaque-support 12-2 est en regard de la platine 41 et la troisième plaque-support 12-3 est en regard du réceptacle 27.
Dans cet état initial, aucune particule n'est maintenue sur les entrées des orifices 15, mais le réservoir 17 contient une couche importante 51 de particules dont les cavités 2 ne contiennent pas de substance d'intérêt.
Un premier ordre est alors donné pour que l'axe W subisse une translation T de façon que la première face 11 de la première plaque-support 12-1 vienne au contact de la couche 51, puis les moyens 48 pour réaliser un vide relatif dans l'enceinte 46 sont commandés. Il se crée ainsi une différence de pression entre l'espace voisin de la première face de la première plaque-support et l'intérieur de l'enceinte 46. Comme la couche 51 de particules est homogène, les particules qui se trouvent en regard ou à proximité des entrées des orifices 15 sont aspirées et viennent se coller sur ces entrées pour prendre une position comme celle qui est schématiquement illustrée sur la figure 1.
Tout en maintenant le vide dans l'enceinte 46, l'axe W subit une translation inverse de la précédente pour éloigner la plaque-support 12-1 de l'ouverture 18 du réservoir 17, puis une rotation de cent vingt degrés de cet arbre W est commandée, dans le sens dextrorsum par référence à la figure 5, de façon que la plaque-support 12-1 prenne la position qu'occupait la deuxième plaque-support 12-2 avant cette rotation. Dans cette même rotation, la troisième plaque-support 12-3 vient se positionner en regard de l'ouverture 18 du réservoir 17, étant noté que cette troisième plaque-support 12-3 ne porte pas de particule sur sa première face 11.
Dans cette deuxième position du dispositif, l'arbre W est commandé pour que la troisième plaque-support 12-3 vienne au contact de la couche 51 de particules, les moyens 48 sont commandés pour créer un vide relatif dans l'enceinte 46 et aspirer les particules qui se plaquent sur les entrées des orifices 15, comme décrit ci- avant pour la première plaque- support 12-1.
Dans le mouvement de translation de l'arbre W pour amener la troisième plaque-support 12-3 au contact de la couche 51 , la première plaque 12- 1 vient se positionner par rapport à la platine 41 portant les seringues 22, 35 pour pouvoir effectuer le remplissage des cavités 2 comme décrit ci-après.
Pour cela, la platine 41 est commandée en X et en Y pour amener les extrémités des aiguilles 21, 34 en regard successivement de toutes les particules qui sont maintenues sur les entrées des orifices 15. Pour chaque position des deux aiguilles, les deux seringues 22, 35 sont commandées en translation par les moyens 48, 49 de façon que les deux aiguilles traversent la paroi 1 de la particule et débouchent dans la cavité 2 de cette particule. Dans cette situation, la seringue 22, qui est présumée contenir la substance à injecter dans la cavité 2, est commandée pour effectuer cette injection. Simultanément, la seringue 35 est commandée en sens inverse pour réaliser une aspiration de l'atmosphère contenue dans la cavité. L'injection effectuée par le première seringue 22 et l'aspiration effectuée par la seconde seringue 35 sont arrêtées lorsque la seconde seringue aspire de la substance injectée.
A ce stade, les deux seringues sont commandées pour retirer les deux aiguilles de la particule, les percées pratiquées dans la paroi l se rebouchant par l'élasticité naturelle du matériau constituant cette paroi.
La platine 41 est commandée en X et en Y pour que les opérations décrites ci-dessus s'effectuent successivement pour toutes les particules maintenues sur la première plaque support 12-1. L'arbre W subit alors une translation pour éloigner la troisième plaque-support 12-3 de la couche 51, puis une deuxième rotation de cent vingt degrés, toujours dans le sens dextrorsum, pour, simultanément, amener la troisième plaque-support 12-3 en regard de la platine 41 et amener la première plaque support 12-1 en regard du réceptacle 27, en maintenant toujours la dépression dans les enceintes 46 de ces première et troisième plaques- supports.
Dans cette deuxième rotation R, la deuxième plaque-support 12-2 vient se positionner en regard de l'ouverture 18 du réservoir 17. L'arbre W subit une nouvelle translation pour amener la première face 11 de cette deuxième plaque-support au contact de la couche 51 de corps 1 et ses moyens 48 sont activés pour réaliser une dépression dans son enceinte 46 et aspirer des corps 1 sur les entrées de orifices 15, comme décrit ci-avant.
Dans cette phase, la première plaque-support 12-1 se trouvant en regard du réceptacle 27, ses moyens 48 sont désactivés pour supprimer la dépression dans son enceinte 46 et ramener l'intérieur de cette enceinte à la pression atmosphérique. Sous l'action de la force de gravitation, les particules dont les cavités ont été remplies de substance d'intérêt tombent dans le réceptacle pour y être récupérées. Éventuellement, les jets de gaz comprimés permettent de détacher les particules qui seraient demeurées fixées sur la plaque-support. Pendant cette opération relative à la première plaque-support 12-1, les cavités 2 des particules maintenues sur la troisième plaque-support 12-3 sont remplies de substance d'intérêt, comme décrit ci- avant pour les particules portées par la première plaque-support 12-1.
Une troisième rotation de cent vingt degrés de l'arbre W, toujours dans le sens dextrorsum, est commandée pour amener la première plaque-support 12-1 en regard de l'ouverture 18 du réservoir 17, et toutes les opérations décrites ci-avant peuvent se répéter jusqu'à épuisement total des particules dans le réservoir 17.
A la description faite ci-dessus, on constate que le dispositif permet de remplir les cavités 2 des particules de façon entièrement automatique selon la technique dite "en temps masqué" puisque trois opérations principales peuvent s'effectuer simultanément. Dans le mode de réalisation décrit ci-dessus, le dispositif comporte trois plaques-supports.
Il est cependant bien évident qu'il peut comporter plus de trois plaques-supports, par exemple un nombre N multiple de trois, les N plaques-supports étant alors uniformément réparties autour de l'arbre W, à 360°/N l'une par rapport à l'autre, et montées en association avec N/3 ensembles comprenant chacun essentiellement un réservoir 17, une platine 41 avec ses deux seringues-aiguilles comme décrit ci-avant et un réceptacle 27.
Cette réalisation ne pose pas de difficultés pour un homme du métier connaissant la structure du dispositif selon le mode de réalisation décrit ci-avant.
Les particules polymériques creuses remplies de substances chimiques ou biologiques telles que décrites ci-dessus ont de nombreuses applications dans des domaines techniques très variés. Elles peuvent être mises en œuvre en tant que produit ayant une activité définie. Elles constituent alors par exemple un produit à usage thérapeutique qu'il est possible d'administrer au choix par voie orale, per linguale, vaginale, rectale, et du fait de la taille réduite des particules, également par voie nasale, cutanée, oculaire, pulmonaire et même par voie parentérale, c'est-à-dire aussi bien intrathécale qu'intraveineuse ou intramusculaire. Elles peuvent également entrer dans la composition d'un produit cosmétique, phytosanitaire, textile, d'hygiène, de prévention ou de traitement des dégradations de l'environnement naturel.
Elles peuvent aussi être utilisées comme un des éléments intervenant dans un procédé de préparation d'un produit, en particulier grâce à l'activité des cellules vivantes et à l'excrétion de métabolites. Il peut s'agir de la production d'un produit thérapeutique, ou d'un produit cosmétique mais aussi d'un produit alimentaire par exemple fermenté ou aromatisé à l'aide des substances délivrées par les particules creuses selon l'invention. Des particules selon l'invention peuvent aussi être utilisées dans un test de diagnostic.
Les exemples suivants illustrent des cas particuliers permettant de mieux comprendre la présente invention et ses nombreux avantages. Ils ne sauraient en aucune façon en limiter la portée. EXEMPLE N°l
Préparation de particules creuses polysaccharidiques remplies d'air, selon la technique d' émulsion eau dans huile.
Dans un réacteur de 1 litre, on disperse 50 g d'amidon ayant un poids moléculaire d'environ 10 000 dans 150 ml d'eau. Le mélange est effectué à température ambiante sous agitation mécanique à l'aide d'un moteur d'agitation à 100 rpm durant 2 heures. La solution d'amidon est alors additionnée de 300 ml de solution de soude 6N et mélangée 2 heures à 100 rpm (solution SI).
Le mélange homogène obtenu est soumis à un barbotage intensif: le réacteur est relié à un compresseur d'air sous pression de 1 bar. Le barbotage est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en bulles gazeuses. On ajoute alors 4 ml d'épichlorhydrine pour initier la réaction de polymérisation tout en continuant l' aération et sous agitation mécanique à 150 rpm. Au bout de quelques minutes, on obtient un gel de faible viscosité renfermant des bulles d'air, que l'on verse dans 500 ml d'huile de paraffine et que l'on maintient sous agitation mécanique forte réalisée à l'aide d'un mixeur (type mixeur ménager) dans un bain thermostaté à 40°C pendant 2 heures. Les particules formées sont récupérées sur un tamis en inox de maille supérieure à 100 microns et sont lavées à l'eau osmosée.
Elles ont un taux de réticulation Tr élevé avec Tr=17%, et sont notées P(17). Des particules faiblement réticulées (Tr=8,5%) sont obtenues par le même protocole en faisant réagir 50 g d'amidon avec 2 ml d'épichlorhydrine, et sont appelées P(8,5). Les particules creuses polysaccharidiques obtenues sont prêtes à être utilisées directement pour l'encapsulation ou stockées.
EXEMPLE N°2
Préparation de particules creuses polysaccharidiques remplies d'azote, selon la technique de l' extrusion.
On prépare une solution d'amidon SI comme précédemment. On soumet alors le mélange à un barbotage intensif en reliant le réacteur à une réserve d'azote sous 0,5 bar. Le barbotage est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en bulles gazeuses. On ajoute alors 4 ml d'épichlorhydrine pour initier la réaction de polymérisation tout en continuant l'aération et sous agitation mécanique à 150 rpm. Au bout de quelques minutes, on obtient un gel de faible viscosité renfermant des bulles d'azote. On fait alors passer le gel dans une extrudeuse à buse. Les particules gélatineuses formées en sortie de buse sont recueillies dans un réacteur contenant 500 ml d'huile de silicone et maintenues sous agitation mécanique faible (50 rpm) dans un bain thermostaté à 40°C pendant 2 heures. Les particules formées sont récupérées sur un tamis en inox de maille supérieure à 100 microns et sont lavées à l'eau osmosée. Les particules creuses polysaccharidiques obtenues sont prêtes à être utilisées directement pour l'encapsulation ou stockées.
EXEMPLE N°3
Préparation de particules creuses polysaccharidiques greffées positivement, remplies d'air par la technique d' émulsion eau dans huile.
Dans un réacteur de 0,5 litre, on disperse dans 30 ml d'eau 10 g d'amidon ayant un poids moléculaire d'environ 10 000. Le mélange est effectué à température ambiante sous agitation mécanique à l'aide d'un moteur d'agitation à 100 rpm durant 2 heures. La solution d'amidon est alors additionnée de 60 ml de solution de soude 6N et mélangée jusqu' à homogénéisation complète, on ajoute alors 3,2 ml d'une solution aqueuse de chlorure de (2,3 époxypropyl)triméthylaιnmonium à 75%.
Le mélange obtenu est soumis à un barbotage intensif: le réacteur est relié à une réserve d'air comprimé à 1 bar. Le barbotage est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en bulles gazeuses. On ajoute alors 1 ml d'épichlorhydrine pour initier la réaction de polymérisation tout en continuant l'aération et sous agitation mécanique forte à température ambiante. Au bout de quelques minutes, on obtient un gel de faible viscosité renfermant des bulles d'air, que l'on disperse dans 250 ml d'huile de paraffine et que l'on maintient sous agitation mécanique forte réalisée à l'aide d'un mixeur (type mixeur ménager) dans un bain thermostaté à 40°C pendant 2 heures. Les particules formées sont récupérées sur un tamis en inox de maille comprises entre 100 et 500 microns et sont lavées plusieurs fois à l'eau osmosée.
Les particules creuses cationiques ont maintenant un affinité spécifique envers les composés anioniques. Elles sont aussi bioadhésives envers des tissus biologiques tels que la muqueuse intestinale.
EXEMPLE N°4
Préparation de particules creuses cationiques traitées par la carboxyméthyl cellulose.
La carboxyméthyl cellulose est un polymère anionique aux propriétés bioadhésives. On prépare des particules creuses selon l'exemple N°3, dont on disperse 50g dans 250 ml de solution aqueuse de carboxyméthyl cellulose (Sigma) à 2,5%. La suspension est agitée lentement pendant 5 heures à température ambiante, puis les particules sont récupérées sur tamis inox de maille comprise entre 100 et 500 microns et lavées plusieurs fois à l'eau osmosée.
EXEMPLE N°5
Préparation de particules creuses polysaccharidiques pigmentées.
On prépare une solution d'amidon SI comme précédemment. On soumet alors le mélange à un barbotage intensif en reliant le réacteur à une réserve d'azote sous 0,8 bar. Le barbotage est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en bulles gazeuses. On ajoute alors 2 ml d'épichlorhydrine pour initier la réaction de polymérisation tout en continuant l'aération et sous agitation mécanique à 150 rpm. Après 2 mn, on ajoute 1 g de dioxyde de titane au mélange réactionnel tout en continuant l'agitation. Au bout de 5 mn, le mélange est dispersé dans 1 1 d'huile de paraffine à température ambiante et agité fortement (mixeur ménager) pendant 3 heures.
Les particules formées sont récupérées sur un tamis en inox de maille supérieure à 100 microns et sont lavées à l'eau osmosée. Les particules obtenues sont blanches et opaques. Elles sont prêtes à être utilisées directement pour l'encapsulation de substances sensibles à la lumière ou stockées.
EXEMPLE N°6
Préparation de particules polysaccharidiques creuses greffées négativement et imprégnées de vitamine E.
L'acétate de tocophérol, appelé aussi vitamine E, est une molécule hydrophobe possédant des pouvoirs anti-oxydants. Les charges anioniques greffées à la matrice polymérique permettent malgré le caractère hydrophobe de l'acétate de tocophérol, de le fixer dans le réseau où il est piégé physiquement. Ses propriétés anti-oxydantes sont mises à profit pour la protection des substances d'intérêt présentant une sensibilité à l'oxydation.
Dans un réacteur de 0,5 litre, on disperse 30 g d'amidon ayant un poids moléculaire d'environ 10 000 dans 100 ml d'une solution aqueuse contenant 5 g de trimétaphosphate de trisodium. Le mélange est effectué à température ambiante sous agitation mécanique à l'aide d'un moteur d'agitation à 150 rpm durant 1 heures. Puis on ajoute 10 ml de solution aqueuse de carbonate de sodium à 0,25 g/ml sous agitation jusqu'à homogénéisation complète. Le mélange obtenu est soumis à un barbotage intensif: le réacteur est relié à une réserve d'air comprimé à 1 bar. Le barbotage est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en bulles gazeuses. Le mélange obtenu est ensuite incubé à 40°C pendant lh. On ajoute alors sous forte agitation 10 ml de vitamine E sous forme d'acétate de tocophérol. Au bout de 2 mn le mélange saturé en bulles d'air et contenant l'acétate de tocophérol est dispersé dans un litre d'huile de paraffine thermostaté à 40°C sous agitation mécanique forte réalisée à l'aide d'un mixeur (type mixeur ménager) pendant 2 heures. Les particules formées sont récupérées sur un tamis en inox de maille supérieure à 100 microns et sont lavées plusieurs fois à l'eau osmosée.
Le dosage par chromatographie CLHP de l'acétate de tocophérol imprégné dans les particules indique un chargement en acétate de 8% en poids.
EXEMPLE N°7
Préparation de particules polysaccharidiques anioniques, imprégnées de vitamine E et recouvertes d'une pellicule de chitosan.
Le chitosan permet d'apporter des charges positives à la particule creuse. Les particules préparées selon l'exemple N°6 ci-dessus sont reprises et lavées à l'eau osmosée. Puis 10 g de particules sont versées très lentement dans 250 ml d'une solution contenant 0,5% de chitosan et 1% d'acide acétique, sous agitation magnétique. L'agitation est poursuivie 3 heures, puis les particules sont récupérées sur tamis inox (ouverture 100 microns) et lavées par une solution d'acide acétique à 0,1% puis à l'eau osmosée. Les particules creuses obtenues sont porteuses de charges anioniques et imprégnées d' antioxydant dans la masse de la matrice polymérique et sont recouvertes en surface de charges cationiques.
EXEMPLE N°8
Préparation de particules creuses par coréticulation d'amidon et de chondroïtine sulfate
Dans un réacteur de 1 litre, on disperse 45 g d'amidon ayant un poids moléculaire d'environ
10 000 dans 150 ml d'eau. Le mélange est effectué à température ambiante sous agitation mécanique à l'aide d'un moteur réglé à 100 rpm, pendant 1 heure. On ajoute 5 g de chondroïtine sulfate et on poursuit l'agitation 1 heure. On ajoute 300 ml de soude 6N et on poursuit l'agitation 2 heures. On soumet alors le mélange homogène à un barbotage intensif en reliant le réacteur à une réserve d'air sous 1 bar. Le barbotage est poursuivi jusqu'à saturation de la solution en bulles gazeuses. On ajoute alors 3 ml d'épichlorhydrine tout en continuant l'aération et sous agitation mécanique à 150 rpm. Au bout de 5 mn, le mélange saturé en bulles d'air est dispersé dans un litre d'huile de paraffine à 40°C. Après 2 heures d'agitation, les particules creuses constituées du copolymère amidon/chondroïtine sulfate sont récupérées sur un tamis en inox (ouverture 100 microns) et lavées à l'eau osmosée.
EXEMPLE N°9
Particules polysaccharidiques creuses chargées en rétinol et dosage de contrôle.
Le rétinol est une molécule sensible à l'oxydation et à la lumière. Les particules creuses pigmentées en blanc par le dioxyde de titane permettent de protéger le rétinol encapsulé.
Les particules creuses pigmentées préparées à l'exemple N°5 sont placées dans l'appareil automatique de chargement des particules. Une solution de rétinol en huile de soja (BASF) est placée dans le bac de remplissage de la seringue et l'appareil est mis en marche. Les particules ainsi remplies sont récupérées pour doser le rétinol. Les particules sont fragmentées dans une sonde à ultra-sons dans un bain de glace. La quantité de rétinol libérée est dosée par CLHP (chromatographie liquide haute pression). On trouve que les particules sont chargées à hauteur de 0,5% en poids, avec un rendement de 90% en rétinol.
EXEMPLE N°10 Chargement de cellules de carcinome pulmonaire de rat PC 12 dans des particules creuses polysaccharidiques et mesure de la viabilité cellulaire
Les particules creuses préparées selon l'exemple N°l sont lavées à l'eau bi-distillée puis stérilisées dans un autoclave à 120°C à une pression de 1,2 bar pendant 20 mn. Les particules sont ensuite lavées sous hôte à flux laminaire avec du milieu de culture cellulaire DMEM
(Dulbecco's Modifîed Eagle's Médium, Sigma) puis placées dans le réservoir du dispositif de chargement des particules. Les cellules de carcinome de rat PC12 (Greene L.A. et al, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 73, 2424-28) sont mises en suspension dans du milieu de culture DMEM neuf et placées dans la seringue de l'appareil de chargement automatique. Puis l' appareil est mis en marche.
Les particules creuses encapsulant les cellules PC12 sont récupérées et mises immédiatement à l'étuve à 37°C dans du milieu de culture cellulaire DMEM
Pour la mesure de la viabilité des cellules ainsi encapsulées, les particules creuses sont fragmentées mécaniquement et les cellules libérées sont reprises par du milieu de culture DMEM. Leur viabilité est caractérisée par la mesure de l'activité déshydrogénase des mitochondries (test toxicologique XTT, Sigma). Les résultats montrent que les cellules ainsi encapsulées sont vivantes et actives. Le test répété à intervalles de temps régulier indique que la viabilité et l'activité cellulaire sont maintenues après huit mois de conservation des particules chargées en cellules PCI 2 dans le milieu de culture.
EXEMPLE N°ll
Comparaison des cinétiques de dégradation enzymatique des particules en fonction du taux de réticulation. -
La vitesse de dégradation de la paroi :polysaccharidique des particules P(17) et P(8,5) de l'exemple N° 1 est étudiée. Une quantité de 0,5 g de chaque type de particules est pesée puis est mise en présence d'amyloglucosidase (A 7255, Sigma) à une teneur de 40 mg dans 10 ml de tampon acétate. La suspension obtenue est placée dans un bain-marie à 55°C. Le glucose libéré par l'hydrolyse par l'amyloglucosidase de l'amidon réticulé est dosé en fonction du temps. Le dosage est effectué par la méthode au DNS (acide di-nitro-salicylique) spécifique des sucres réducteurs pour les deux échantillons et pour une gamme de glucose témoin.
Les résultats obtenus exprimés en pourcentage de sucre libéré, sont les suivants:
temps particules P(8,5) particules P(l 7)
0 0 % 0 %
15 mn 17% 3 % lh 36% 9 %
2h 72 % 22 %
3h 80 % 38 %
4h 84 % 61 %
5h 90 % 65 %

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de préparation d'une particule formée d'une matrice polymérique comprenant au moins une cavité contenant une entité chimique ou biologique d'intérêt, consistant à : fixer sur un support une particule creuse formée d'une matrice polymérique comprenant au moins une cavité, percer la paroi de ladite particule, injecter une substance d'intérêt dans ladite cavité, ladite substance étant constituée de l'une des phases suivantes : gazeuse, liquide ou solide, ladite phase contenant une entité chimique ou biologique, récupérer ladite particule dont la cavité contient ladite substance.
2- Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite particule creuse est formée d'une matrice polysaccharidique, de préférence à base d'amidon, de section comprise entre 0,1 et 5 mm, de préférence entre 0,2 et 2 mm, et comprenant au moins une cavité de section supérieure à 0,01 mm.
3- Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite substance d'intérêt injectée dans ladite cavité est une phase liquide contenant au moins l'un des éléments suivants: molécule biochimiquement active, cellule biologiquement active, fraction cellulaire biologiquement active.
4- Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel on modifie en outre les propriétés de surface de ladite particule polymérique.
5- Particule polymérique comprenant au moins une cavité contenant une phase gazeuse, liquide ou solide incorporant une entité chimiquement ou biologiquement active, obtenue par le procédé selon l'une des revendications précédentes.
6- Particule selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite cavité contient une phase liquide et au moins l'un des éléments suivants: molécule biochimiquement active, cellule biologiquement active, fraction cellulaire biologiquement active.
7- Procédé de préparation d'une particule formée d'une matrice polymérique et comprenant au moins une cavité, destinée à la préparation d'une particule selon la revendication 5, consistant à: mettre en solution, dans un réacteur, au moins un composé monomérique en présence d'un agent réticulant pour obtenir un mélange réactionnel, insuffler un fluide gazeux dans le réacteur sous agitation jusqu'à obtention d'un mélange visqueux saturé en micro-bulles, fractionner le mélange visqueux en particules polymériques isolées, placer les particules polymériques isolées dans un milieu dispersant jusqu'à gélification complète.
8- Procédé selon la revendication 7, dans lequel ledit fluide gazeux est choisi parmi l'air, l'azote, le gaz carbonique, un mélange de ceux-ci.
9- Procédé selon la revendication 7, dans lequel on fait en outre réagir au moins un composé chimique avec le mélange réactionnel, ledit composé chimique étant choisi parmi les composés suivants: composé fonctionnel, composé ionique, composé modifiant au moins une propriété de ladite matrice polymérique, combinaison de ces composés.
10- Particule polymérique creuse obtenue par un procédé selon une des revendications 7 à 9, formée d'une matrice polysaccharidique, de préférence à base d'amidon, et susceptible de recevoir une entité chimiquement ou biologiquement active.
11- Dispositif pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, permettant le remplissage de la cavité de ladite particule polymérique creuse avec une substance d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comporte :
- des moyens (10) pour appliquer une première force sur ladite particule de façon à la maintenir sur une première face (11) d'une plaque-support (12) agencée pour engendrer une force de réaction à ladite première force,
- des moyens (13) pour réaliser une percée dans la paroi (1) de ladite particule de façon qu'elle débouche dans ladite cavité (2) lorsque ladite particule est maintenue sur ladite plaque- support par ladite première force, et
- des moyens (14) pour introduire, par ladite percée, une quantité déterminée d'une substance d'intérêt dans ladite cavité (2).
12- Dispositif selon la revendication 11 , caractérisé en ce que les moyens (10) pour appliquer une première force sur ladite particule de façon à la maintenir sur une première face de la plaque-support agencée pour engendrer une force de réaction à ladite première force, sont constitués par un orifice traversant (15) réalisé dans ladite plaque-support (12), ladite plaque- support étant réalisée en un matériau relativement étanche, la section maximale dudit orifice (15) étant inférieure à la section minimale de la particule, et des moyens (16) pour créer une différence de pression de part et d'autre de ladite plaque-support, la pression la plus forte étant appliquée du côté de la première face (11) de la plaque-support (12).
13- Dispositif selon la revendication 12; caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens (29) pour amener la particule sur l'orifice (15), ces derniers moyens (29) comportant un réservoir (17) comportant au moins une ouverture (18), ledit réservoir étant apte à contenir ladite particule de façon que, entre ledit réservoir et la particule, puisse se créer une perte de charge relativement importante, et des moyens (19) pour positionner ladite plaque-support et ledit réservoir l'un par rapport à l'autre en un premier endroit déterminé (A) de façon que ladite ouverture (19) soit située en regard de la première face (11) de la plaque-support (12) et sensiblement dans l'axe dudit orifice (15) pour que, sous l'action de la différence de pression, la particule vienne se positionner à l'entrée de cet orifice.
14- Dispositif selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que les moyens (13) pour réaliser une percée dans la paroi de ladite particule de façon qu'elle débouche dans ladite cavité lorsque ladite particule est maintenue sur ladite plaque-support par ladite première force sont constitués par au moins une première aiguille (21) et des moyens pour déplacer ladite première aiguille et ladite plaque-support l'une par rapport à l'autre, tout en maintenant la différence de pression, de façon que ladite première aiguille soit apte à pénétrer dans ladite cavité (2) en traversant la paroi (1) de ladite particule.
15- Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que les moyens pour déplacer ladite première aiguille et ladite plaque-support l'une par rapport à l'autre tout en maintenant la différence de pression, de façon que ladite première aiguille soit apte à pénétrer dans ladite cavité en traversant la paroi de la particule, et les moyens (14) pour introduire, par ladite percée, une quantité déterminée de la substance d'intérêt dans ladite cavité (2), sont constitués par un dispositif d'injection, de préférence par une première seringue (22) apte à contenir une quantité suffisante de substance d'intérêt, des moyens (23) pour lier ladite première aiguille et ladite première seringue, des moyens pour amener ladite plaque-support et ladite première aiguille montée en coopération avec ladite première seringue en un deuxième endroit déterminé (B), des moyens (24) pour déplacer ladite première seringue (22) par rapport à ladite plaque-support (12) quand elle est positionnée audit deuxième endroit déterminé (B), et des moyens (25) pour commander l'injection de la substance par ladite première aiguille (21) dans ladite cavité (2) en commandant ladite première seringue (22), tout en maintenant la différence de pression.
16- Dispositif selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce qu'il comporte un réceptacle (27), des moyens pour déplacer ledit réceptacle et ladite plaque-support l'un par rapport à l'autre en un troisième endroit déterminé (C) tout en maintenant ladite différence de pression, et des moyens pour, d'une part annuler ladite première force après que la quantité voulue de substance d'intérêt ait été introduite dans ladite cavité (2), et d'autre part appliquer une seconde force (28) sur ladite particule pour la détacher de ladite plaque-support (12) et pour qu'elle soit apte à être récupérée dans ledit réceptacle (27).
17- Dispositif selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (30) pour créer des forces mécaniques en direction sensiblement tangentielle à ladite première face (11) de ladite plaque-support (12).
18- Dispositif selon l'une des revendications 11 à 17, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens (33) pour aspirer l'atmosphère contenue dans ladite cavité (2) sensiblement simultanément à l'introduction de ladite substance, en fonction de la quantité de substance introduite dans ladite cavité.
19- Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que les moyens (33) pour aspirer l'atmosphère contenue dans la cavité comportent au moins une seconde aiguille (34) et une seconde seringue (35), des moyens (36) pour lier lesdites secondes aiguille (34) et seringue (35), ladite plaque-support (12) étant située audit deuxième endroit déterminé (B), des moyens pour déplacer ladite seconde aiguille liée à la seconde seringue de façon que ladite seconde aiguille (34) vienne traverser paroi (1) pour déboucher dans la cavité (2), et des moyens (37) pour commander la seconde seringue (35) de façon qu'elle soit aspirante.
20- Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 19, caractérisé en ce qu'il comporte au moins trois plaques-supports (12-1,2,3), des moyens (40) pour déplacer dans l'espace lesdites trois plaques-supports de façon qu'elles puissent prendre successivement trois première, deuxième et troisième positions déterminées (A, B, C), cesdites trois positions étant respectivement : la première position (A) dans laquelle une particule vient se fixer sur la première face (11) d'une plaque support, la deuxième position (B) dans laquelle la cavité (2) de la particule est remplie avec une quantité déterminée de la substance d'intérêt, et la troisième position (C) dans laquelle la particule avec sa cavité (2) remplie de produit, est récupérée dans un réceptacle (27).
5 21 - Dispositif selon la revendication 20, caractérisé en ce que les moyens (40) pour déplacer dans l'espace les trois plaques-supports sont constitués par des moyens pour réaliser une rotation (R) simultanée desdites trois plaques-supports autour d'un axe de rotation (W) de façon qu'elles passent respectivement et successivement par les trois dites première, deuxième et troisième positions, et des moyens pour réaliser une translation entre deux positions (T) i o desdites trois plaques-supports suivant ledit axe de rotation (W)
22- Dispositif selon la revendication 19 et l'une des revendications 20 et 21, caractérisé en ce que les moyens pour déplacer la première aiguille (21) liée à la première seringue (22) et la seconde aiguille (34) liée à la seconde seringue (35) par rapport à la plaque-support sont i constitués par au moins une platine (41), des moyens (42) pour lier les deux seringues (22,
35) à la platine (41) de façon que les deux première et seconde aiguilles (21, 34) soient situées sur deux droites concourantes, des moyens (50) pour déplacer la platine suivant deux axes (en X et Y), et des moyens (48, 49) pour déplacer respectivement les deux aiguilles (21, 34) sur les deux droites concourantes.
20
23- Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (43) pour déterminer la présence et la position desdites première et seconde aiguilles (21, 34).
24- Dispositif selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que chacune des trois plaques-supports comporte une pluralité d'orifices (15).
25
25- Dispositif selon l'une des revendications 16 à 24, caractérisé en ce que, lorsqu'il est destiné à être utilisé dans un milieu où régnent une pression atmosphérique et une force de gravitation, les moyens pour créer une différence de pression sont constitués par des moyens (45) pour créer, avec la seconde face (47) de la plaque-support (12) sur laquelle débouche ledit orifice (15), une enceinte étanche (46) et des moyens (48) pour réaliser le vide dans ladite enceinte (46), et que ladite seconde force est constituée par la force de gravitation.
26- Application d'une particule selon l'une des revendications 5 et 6, à au moins l'un des usages suivants: thérapeutique, cosmétique, de diagnostic, alimentaire, phytosanitaire,
35 hygiénique, de prévention et traitement des dégradations de l' environnement naturel.
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