WO2002001224A1 - Procede d'evaluation de l'activite de liaison d'un ligand a une proteine de liaison aux ligands - Google Patents

Procede d'evaluation de l'activite de liaison d'un ligand a une proteine de liaison aux ligands Download PDF

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WO2002001224A1
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ligand
antibody
protein
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Megumi Tanaka
Masaya Kakuta
Akiko Koga
Keiko Esaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the binding activity between a ligand and a ligand-binding protein.
  • Background technology Ming ''
  • BIAC0RE TM surface plasmon resonance sensor
  • BIAC0RE TM The basic structure of BIAC0RE TM consists of a light source and a prism, a detector and a microchannel.
  • the ligand is immobilized on a cassette-type sensor chip, and the analyte is injected there. If both have an affinity, the amount of binding is detected optically.
  • the principle of detection is a phenomenon called surface plasmon resonance.
  • the incident light at a certain angle is used to excite surface plasmons and is attenuated.
  • the angle varies depending on the change in the concentration of the solvent in contact with the metal thin film (sensor).
  • BIAC0RE TM is one of detecting this change.
  • 1000RU (resonance units). 1000RU is the change amount when bound protein of about l ng on thin gold sensor surface 1 Yuzuru 2, it is possible to sufficiently detect a change of about 50 RU (50 pg) if protein.
  • the sensor is a computer that comes with BIAC0RE TM Is converted into a binding curve called a gram and drawn on a computer display in real time (Toru Natsume et al., (1995) Experimental Medicine, 13, P563-569.) (Karl sson, R. et al, (1991) J. Immunol. Methods 145, p229-240.) 0
  • BIAC0RE TM allows the kinetic parameters of the antibody to be measured, namely the dissociation constant (KD), the dissociation rate constant (Kdi ss) and the association rate constant (K ass).
  • An object of the present invention is to provide a simple and highly accurate method for measuring the biological activity of a ligand (in particular, an antibody).
  • the present inventors studied a method for measuring the binding activity by quantifying the amount of binding of an antibody to an antigen in order to easily evaluate the biological activity of an antibody in vitro without kinetic analysis. By correcting the antibody concentration using a quantitative system for the amount of protein A and antibody bound, a highly accurate and simple antibody activity evaluation test method was successfully established, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for evaluating the binding activity between a ligand and a ligand-binding protein, which comprises measuring the binding activity between the ligand and the ligand-binding protein, and binding the ligand with the ligand-binding protein.
  • Either the ligand or the ligand binding protein may be immobilized.
  • the ligand may be an antigen or its antibody, an enzyme or its substrate protein, or a ligand for various receptors.
  • the ligand may be an antibody, and the ligand binding protein may be an antigen peptide.
  • the second ligand binding substance is the antibody constant region (Fc portion, L chain / region, L chain ⁇ Region, etc.), and a substance that specifically binds to a portion other than the antigen binding site such as a sugar chain, and in particular, may be a substance that specifically binds to the Fc portion of an antibody.
  • the substance that specifically binds to the Fc portion of the antibody may be protein A, protein G, protein L, Fc receptor or lectin.
  • a FLAG protein may be bound to a ligand, and a substance that specifically binds to the FLAG protein may be used as the second ligand-binding protein.
  • the ligand-binding protein and the second ligand-binding substance may be immobilized, respectively, and the same sample containing the ligand may be reacted with each other to measure the respective binding activity values.
  • the ligand is an antibody
  • the ligand binding protein is an antigen peptide
  • the second ligand binding substance is protein A.
  • the binding activity between the antigen peptide and the antibody may be corrected by the binding activity between the antibody and the second ligand binding substance.
  • the binding activity between the antibody and the antigen peptide can be evaluated by the binding activity ratio of the antibody calculated by the following formula (I). Binding activity between antibody and antigen peptide
  • Binding activity between the antibody and the second ligand-binding substance The binding activity between the antibody and the antigen peptide is calculated by the following formula (II).
  • the binding activity between the antibody and the second ligand-binding substance is calculated as follows: It can be calculated by equation (III).
  • Antibody and antigen peptide Binding concentration of antibody and antigen peptide in unknown sample.
  • the binding activity of the antibody of the unknown sample to the antigen can be evaluated by the binding activity ratio of the antibody calculated by the following formula ( ⁇ ). Binding activity between antibody and antigen peptide
  • Antibody binding activity ratio (%) -X 100 (1,) Binding activity value of antibody to protein A
  • the binding activity value of antibody to antigen is calculated by the following formula (II), and the binding activity value of antibody to protein A Can be calculated by the following formula ( ⁇ ⁇ ).
  • Antibody and antigen peptide Binding concentration of antibody and antigen peptide in unknown sample.
  • X 100 (II ⁇ ) binding activity The binding concentration of antibody and protein A in the standard sample The binding concentration of antibody to antigen peptide and the binding concentration of antibody to protein A were determined by surface plasmon resonance, fluorescence polarization measurement, Radioimmunoassay (RIA), enzyme-labeled solid-phase immunoassay (ELISA), HPLC, ultracentrifugation, titration calorimeter, etc. Of these, measurement by surface plasmon resonance is convenient because the interaction between the antibody and the antigen can be monitored in real time without labeling.
  • the antibody to be subjected to the method of the present invention may be an antibody against any antigen, and may be an antibody against parathyroid hormone-related peptide (hereinafter referred to as “PTHrP”) (hereinafter referred to as “anti-antibody”).
  • PTHrP antibody an antibody against the IL-6 receptor, an antibody against the HM1.24 antigen, an antibody against tissue factor (TF), and the like.
  • Antibodies can be either monoclonal or polyclonal. However, monoclonal antibodies are preferred. 'The class of antibody may be any of IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, but IgG is preferred. Also, the subclass of the H chain may be any of IgGl, IgG2, IgG3, and IgG4, but IgGl and IgG4 are desirable, and the subclass of the L chain may be any of ⁇ and ⁇ .
  • the monoclonal antibody may be humanized, humanized or chimerized.
  • those that can be measured by the measurement method of the present invention include antibody fragments such as Fab and (Fab ') 2 and reconstituted single chain Fv and the like.
  • the antibody does not form an oligomer such as a dimer, or has a small amount of formed oligomer (preferably 5% or less).
  • the “second ligand binding substance” refers to a substance that binds to a ligand at a site other than the binding site with a ligand binding protein (referred to as “first ligand binding substance”).
  • first ligand binding substance refers to a substance that binds to a ligand at a site other than the binding site with a ligand binding protein
  • the second ligand-binding substance is specific to a portion of the antibody other than the antigen-binding site, such as the constant region (Fc portion, L chain ⁇ region, L chain ⁇ region, etc.) and sugar chain.
  • the constant region Fc portion, L chain ⁇ region, L chain ⁇ region, etc.
  • sugar chain refers to a substance that binds specifically.
  • the substance that binds to the Fc portion include protein T, protein G, and Fc receptor.
  • Substances that bind to the L chain ⁇ region include protein L, anti- ⁇ antibodies and the like.
  • lectins such as protein A, protein G, Fc receptor, protein L, RCA, LCA, and Con A are preferable, and more preferably, protein A, Protein G and protein L, most preferably protein A.
  • the present invention also provides a kit for evaluating the binding activity between a ligand and a ligand-binding protein, comprising a ligand-binding protein and a second ligand-binding substance.
  • the ligand binding protein may be an antigen peptide.
  • the kit of the present invention may further include other reagents and the like.
  • the kit of the present invention comprises a reagent (for immobilizing a substance that binds to an antigen and an antibody other than the antigen-binding site) on a sensor chip.
  • Any reagent may be used as long as it activates a functional group such as an amino group, a thiol group, or an aldehyde group and binds to a chip, for example, N-ethyl- ⁇ '-(3-dimethylaminopropyl ) Carbodiimide hydrochloride, ⁇ -hydroxysuccinimide, ethanoylamine hydrochloride, 2- (2-pyridinyldithio) ethanamine hydrochloride, cysteine, biotinhydrazide)) and the like.
  • the method and kit for evaluating the activity of a ligand (eg, an antibody) of the present invention can be used without adding a purification operation even if a heterologous protein is present as an impurity, a medium, or a stabilizing agent in a sample solution. For example, it is possible to evaluate the binding activity ratio as an antibody) molecule. Therefore, it can be used for quality control of antibody in the manufacturing process or as a purified drug substance, process control, and study of formulation design.
  • the binding activity ratio finally obtained by the method for evaluating the activity of the ligand (for example, antibody) of the present invention and the kit is not the concentration of the active ingredient in the sample solution but the second activity of the ligand (for example, antibody). Is the specific activity of the ligand binding activity relative to the ligand binding activity. Therefore, if the value is 100% or more, some degradation occurs in the portion other than the antigen-binding site (for example, Fc portion) of the antibody, and if it is 100% or less, some degradation occurs in the antigen-binding site of the antibody. The possibility is suggested. From this, it can be used for stability tests and setting of expiration dates by combining with other physical property evaluation methods.
  • the method and kit for evaluating the activity of a ligand (for example, an antibody) of the present invention can also be used for selecting highly active proteins (in particular, mutant proteins, various monoclonal antibodies, etc.). In particular, it is effective for selecting a mutant protein having high biological activity or stability by point mutation or the like. Antibodies are particularly useful for selecting reconstituted antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies from natural antibodies. In addition, multiple charged heterogeneous components detected in the protein substance (need to be used when applying the protein This is also an effective method for evaluating whether or not the detected plurality of minor peaks) are rProduced-Related Subs tances].
  • ligand eg, antibody
  • highly active proteins particularly, blood factors, mutant proteins, various monoclonal antibodies, etc.
  • body fluids such as blood and serum
  • Antibody fragments such as Fab, (Fab ') 2 , single-chain Fv ) And its binding activity can be measured simply and with high accuracy.
  • FIG. 1 shows a sensorgram when PTHrP (1-34 + Cys) was immobilized.
  • FIG. 3 shows a calibration curve (Duplicate) in the quantification of the amount of PTHrP binding.
  • FIG. 4 shows the cycles that were ignored from day one due to sensorgram disturbances.
  • FIG. 5 shows a sensorgram when protein A is immobilized.
  • FIG. 6 shows a sensorgram (ICcycle, protein A) at the time of measuring anti-PTHrP antibody a (2. Og / mL).
  • FIG. 7 shows a calibration curve (Duplicate) for quantification of the amount of protein A bound. This description includes part or all of the contents as disclosed in the description of Japanese Patent Application No. 2000-192829, which is a priority document of the present application. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • amount of binding PTHrP Contact and protein A anti-PTHrP antibody was respectively measured by BIAC0RE TM, a measure of the amount of binding of the anti-PTHrP antibody against PTHrP of anti-PTHrP antibody to protein A
  • BIAC0RE TM a measure of the amount of binding of the anti-PTHrP antibody against PTHrP of anti-PTHrP antibody to protein A
  • an anti-PTHrP antibody is produced according to the method described in W098 / 13388.
  • HBS buffer HBS-EP Buf fer
  • the anti-PTHrP antibody is diluted with water to prepare a solution of the anti-PTHrP antibody at an appropriate concentration (for example, 100 to 500 g), and this solution is diluted with HBS buffer to obtain various solutions.
  • a sensor chip CM5 (BIAC0RE Inc., Code # BR- 1000- 14) to BIAC0RE TM sets, flow HBS buffer at a flow rate of 5 ⁇ 20 L / min.
  • EDC N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • a borate buffer solution of, for example, 150 L, PTHrP (1-34 + Cys) (a synthetic peptide obtained by adding Cys to the C-terminus of the peptide 34 of PTHrP )
  • 40 mL of acetic acid buffer solution of cysteine sodium chloride for example, 150 xL of formic acid buffer solution of cysteine sodium chloride, 10 zL of glycine-hydrochloric acid buffer solution, for example, and IOL of 10 mM aqueous hydrochloric acid solution.
  • l-34 + Cys is immobilized on the chip.
  • EDC solution and NHS solution are mixed in equal volumes, for example, to 100 each.Acetate buffer solution of protein A, for example, 40 xL, ethanolamine-hydrochloride buffer, for example, 100 L, and daricin-hydrochloride buffer, for example, Protein A is immobilized on the chip by successively flowing, for example, 10 L of a 10 L aqueous solution of 10 mM hydrochloric acid.
  • binding activity ratio (%) is calculated by the following equation. Binding activity of anti-PTHrP antibody Binding activity value of anti-PTHrP antibody and PTHrP
  • Binding activity to protein A Concentration of binding between anti-PTHrP antibody and protein A-immobilized chip x of a standard sample
  • the present invention will be specifically described by the following examples. These examples are illustrative and do not limit the scope of the invention.
  • BIACORE TM upgrade (made by BIAC0RE)
  • Sensor Chip Sensor Chip CM5: (made by BIACORE)
  • Spectrophotometer DU-640 (BECKMAN)
  • Running Buf fer HBS buf fer BIA Certifed (0. O IM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.0053 ⁇ 4 (v / v) Surfactant P20) (BIACORE) Code # BR -1001-88 NHS: 0.05 M N-ydroxysuccinimide, amine coupling kit (BIACORE) Code # BR-1000-50
  • EDC 0.2 M N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, amine coupling kit (BIACORE) Code # BR-1000-50
  • Ethanol amine-HCl (pH 8.5): Amine coupling kit (BIACORE) Code # BR-1000-50
  • PTHrP (Table 34 + Cys): Synthetic product by Sude Corporation (cus tom pep tide JH 365, 21/11/94, B-CAL 35a.a.)
  • Anti-PTHrP antibody a, b, c, d, e, f in house However, all are for research lot II.
  • the flow rate was set to 5 L / min, the reagent was injected according to Table 1, and the antigen PTHrP (l-34 + Cys) was immobilized by the thiol coupling method.
  • anti-PTHrP antibody 4 lots a, b, c, d ⁇ Then, the amount of PTHrP binding was measured by the following operation, and the difference between rods was examined.
  • the unknown samples b, c, d are HBS solutions were prepared respectively.
  • the flow rate was set to 5 L / min, the reagent was injected according to Table 2, and protein A was immobilized by the amine coupling method.
  • the amount of PTHrP binding was measured by the same operation as in (1).
  • the same measurement was performed on the protein A-immobilized chip to obtain a sensorgram and a binding amount.
  • Figure 1 shows the immobilization of PTHrP.
  • Fig. 2 shows a typical example of one gram of the obtained sensor.
  • the sample concentration used for the quantification of the amount bound to the PTHrP (l-34 + Cys) -immobilized chip was determined using the conditions used in this experiment, ie, the concentrations of the standard samples for the calibration curve were 0,, 2, 3, 4, 5 g / mL At 6 points, the concentration of the unknown sample was set to about half, 2 g / mL.
  • Figure 5 shows the immobilization of protein A. Based on the linearity of the sensorgram and the calibration curve (Figs. 6 and 7) obtained from the prepared protein A-immobilized chip, it was determined that the amount of ligand immobilized could be used for the quantitative system. In addition, it was confirmed that the calibration curve was sufficiently linear in the concentration range of 0 to 5 ⁇ g / mL used for measurement with the PTHrP (1-34-Cys) -immobilized chip. Therefore, the sample concentration for quantitative determination of the binding amount to the protein A-immobilized chip was set to the same condition as the PTHrP (l-34-Cys) -immobilized chip for both the calibration curve sample and the unknown sample.
  • Binding activity value for PTHrP -X 100
  • CAL binding activity was calculated using e.3 and summarized in a table (Table 8).
  • f was 97.0%. Since the% cv value of the seven-time repeat accuracy was 0.95%, this difference was a significant difference, and it was suggested that ⁇ slightly reduced the activity with the antigen.
  • Anti-PTHrP antibody binding activity ratio (BIAC0 E) (%)
  • Binding activity value for PTHrP X100
  • the present invention provides a simple and accurate method for measuring the biological activity of a ligand.

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Description

合蛋白質との結合活性を評価する方法 技術分野
本発明は、 リガンドとリガンド結合蛋白質との結合活性を評価する方法に関す る。 背景技術 明 '
抗体と抗原の相互作用の測定には、 ラジオィムノアッセィ （MA)、 酵素標識固 田
相免疫測定法 （ELISA) などが従来用いられてきた。 最近、 表面プラズモン共鳴
(surface plasmon resonance, 以下「SPR」と記す。）という光学現象を利用して、 抗体と抗原の相互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができるよ うになつた。 その一例として、 BIAC0RETM と呼ばれる表面プラズモン共鳴センサ 一により抗体と抗原の相互作用を解析する装置が市販されている （BIAC0RE 社： 旧フアルマシアバイォテク社）。
BIAC0RETMの基本構造は、 光源とプリズム、 ディテクターとマイクロ流路から 成っている。 実際には、 カセット式のセンサーチップ上にリガンドを固定化し、 そこにアナライトをインジェクションする。 両者に親和性があれば、 その結合量 が光学的に検出される.
その検出原理は表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象である。 すなわち、 ガラス と金属薄膜との界面に全反射するように入射した光のうち、 ある角度の入射光は 表面プラズモンの励起に使われ減衰してしまう。その角度が金属薄膜（センサー） に接している溶媒の濃度変化に依存して変動する。 BIAC0RETMはこの変動を検出 するというものである。
BIAC0RETMではこの変化を共鳴シグナル （SPR s ignal) と呼び、 0. 1度の変化を
1000RU (resonance uni t s) としている。 1000RUは表面積 1讓2の薄金センサー上 に約 l ngの蛋白質が結合した場合の変化量であり、 蛋白 であれば 50RU (50pg) 程度の変化を十分検出することができる。
検出されたシグナルは、 BIAC0RETMに付属しているコンピューターがセンサー グラムと呼ばれる結合曲線に変換し、 リアルタイムにコンピューターディスプレ ィ上に描き出される（夏目徹 他、 ( 1995)実験医学、 13, P563-569. ) (Karl sson, R. et al , ( 1991) J. Immunol. Me thods 145, p229-240. ) 0
BIAC0RETMによって、 抗体のカイネテイクスパラメ一ター、 すなわち解離定数 (K D )、 解離速度定数 （Kd i ss) および結合速度定数 （K as s) を測定すること ができる。
しかし、 上記のような BIAC0RETMによる抗原抗体反応の速度論的解析は条件検 討等に時間を要するため、 多検体の処理には適当ではない。 そのため、 BIAC0RET Mの有する特異性を保持しつつも、 抗体の品質設計及び処方設計検討に適当な、 簡便且つ精度の高い抗体の生物活性の測定が可能な方法が必要である。 発明の開示
本発明は、 簡便且つ精度の高いリガンド （特に、 抗体） の生物活性測定法を提 供することを目的とする。
本発明者らは、速度論的解析なしに簡便に in vi troで抗体の生物活性評価を行 うことを目的として、 抗体の抗原に対する結合量の定量による結合活性測定法の 検討を行ったところ、 プロティン Aと抗体の結合量の定量系で抗体濃度の補正を 行うことにより、 精度が高く且つ簡便な抗体の活性評価試験法を確立することに 成功し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 リガンドとリガンド結合蛋白質との結合活性を評価する 方法であって、 リガンドとリガンド結合蛋白質との結合活性値を測定するととも に、 該リガンドと、 該リガンド結合蛋白質との結合部位以外の該リガンドの部位 に結合する第二のリガンド結合物質との結合活性値を測定することを特徴とする 方法を提供する。
リガンドまたはリガンド結合蛋白質のどちらか一方は固定されていてもよい。 リガンドは、 抗原またはその抗体、 酵素またはその基質蛋白質、 または種々の 受容体に対するリガンドであるとよい。
上記の方法において、 リガンドが抗体であり、 リガンド結合蛋白質が抗原ぺプ チドであってもよい。
第二のリガンド結合物質は、 抗体の定常領域 （F c部分、 L鎖/ 領域、 L鎖 λ 領域等）、糖鎖などの抗原結合部位以外の部分に特異的に結合する物質から選択す ることができ、 特に、 抗体の F c部分に特異的に結合する物質であってもよい。 抗体の F c部分に特異的に結合する物質は、 プロテイン A、 プロテイン G、 プ 口ティン L、 F cレセプターまたはレクチンであるとよい。
本発明の方法においては、 リガンドに F L A G蛋白質を結合させ、 第二のリガ ンド結合蛋白質として該 F L A G蛋白質に特異的に結合する物質を用いてもよい。 リガンド結合蛋白質および第二のリガンド結合物質を、 各々固定させ、 リガン ドを含む同一試料をそれぞれ反応させて、 それぞれの結合活性値を測定してもよ い。
本発明の好ましい一態様において、 リガンドが抗体であり、 リガンド結合蛋白 質が抗原べプチドであり、 第二のリガンド結合物質がプロテイン Aである。
本発明の方法により抗原ペプチドと抗体との結合活性を評価する場合、 抗原べ プチドと抗体との結合活性値を、 抗体と第二のリガンド結合物質との結合活性値 で補正するとよい。 "
例えば、 下記の計算式（I) で算出される抗体の結合活性比で抗体と抗原べプチ ドとの結合活性を評価することができる。 抗体と抗原べプチドとの結合活性値
抗体の結合活性比（％) = X 100 (I)
抗体と第二のリガンド結合物質との結合活性値 抗体と抗原ペプチドとの結合活性値は下記の計算式（I I)で、 抗体と第二のリガン ド結合物質との結合活性値は下記の計算式（I I I)で算出することができる。 抗体と抗原べプチド 未知試料の抗体と抗原べプチドとの結合濃度
X 100 (Πト との結合活性値 標準試料の抗体と抗原べプチドとの結合濃度
抗体と第二のリガンド 未知試料の抗体と第二のリガンド結合物質との結合濃度
X 100 (III) 結合物質との結合活性値 標準試料の抗体と第二のリガンド結合物質との結合濃度 抗体と抗原ペプチドとの結合濃度および抗体と第二のリガンド結合物質との結 合濃度は、表面プラズモン共鳴、蛍光偏光度測定法、ラジオィムノアッセィ（MA)、 酵素標識固相免疫測定法 （ELISA)、 HPLC, 超遠心分析法または滴定型熱量測定に より測定することができるが、 特に、 表面プラズモン共鳴により測定することが 好ましい。
上記の方法の一例として、 下記の計算式 （Γ ) で算出される抗体の結合活性比 で未知試料の抗体の抗原に対する結合活性を評価することができる。 抗体と抗原べプチドとの結合活性値
抗体の結合活性比（％) = - X 100 (1，） 抗体とプロテイン Aとの結合活性値 抗原に対する抗体の結合活性値は下記の計算式（I I)で、 プロテイン Aに対する 抗体の結合活性値は下記の計算式（Π Γ )で算出することができる。
抗体と抗原べプチド 未知試料の抗体と抗原べプチドとの結合濃度
X 100 (I I) との結合活性値 標準試料の抗体と抗原べプチドとの結合濃度 抗体とプロテイン Aと 未知試料の抗体とプロティン Aとの結合濃度
X 100 (II Γ) の結合活性値 標準試料の抗体とプロティン Aとの結合濃度 抗体と抗原ペプチドとの結合濃度および抗体とプロテイン Aとの結合濃度は、 表面プラズモン共鳴、 蛍光偏光度測定法、 ラジオィムノアッセィ （RIA)、 酵素標 識固相免疫測定法 （ELISA)、 HPLC, 超遠心分析法、 滴定型熱量計等により測定す ることができる。 このうち、 表面プラズモン共鳴による測定は、 抗体と抗原の相 互作用を標識なしでリアルタイムにモニターすることができるので、便利である。 本発明の方法の対象となる抗体は、いかなる抗原に対する抗体であってもよく、 副甲状腺ホルモン関連ペプチド （Parathyroid Hormone re l ated Pept ide, 以下、 「PTHrP」 という。） に対する抗体 （以下、 「抗 PTHrP抗体」 という。）、 IL— 6レセ プタ一に対する抗体、 HM1. 24抗原に対する抗体、 組織因子 （TF) に対する抗体な どを例示することができる。
抗体は、 モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよ いが、 モノクローナル抗体が好ましい。 ' 抗体のクラスは、 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE のいずれであってもよいが、 IgG が望ましい。 また H鎖のサブクラスは、 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4のいずれであつ てもよいが、 IgGl及び IgG4が望ましく、 L鎖のサブクラスは κ、 λのいずれであ つても良い。
モノクローナル抗体は、 ヒト化、 ヒト型化あるいはキメラ化されたものであつ てもよい。
また、 本発明の測定方法で測定できるものとしては、 Fab， （Fab' ) 2などの抗体 断片や、 一本鎖 Fvなどの再構成されたものも含まれる。
抗体は、 ダイマーなどのオリゴマーを形成しないか、 あるいはオリゴマーの形 成量が少ない （好ましくは 5%以下の） ものであることが望ましい。
本明細書において、 「第二のリガンド結合物質」 とは、 リガンド結合蛋白質（「第 一のリガンド結合物質」 といえる。） との結合部位以外の部位でリガンドと結合す る物質をいう。 リガンドが抗体である場合、 第二のリガンド結合物質とは、 抗体 の定常領域 （F c部分、 L鎖 κ領域、 L鎖 λ領域等）、 糖鎖などの抗原結合部位以 外の部分に特異的に結合する物質をいう。 F c部分に結合する物質としては、 プ 口ティン Α、 プロテイン G、 F cレセプ夕一等が挙げられる。 L鎖 κ領域に結合 する物質としてはプロテイン L、 抗 κ抗体等が挙げられる。 L鎖 λ領域に結合す る物質としては抗 λ抗体等が挙げられる。糖鎖に結合する物質としては、 R C A、 L C A、 C o n A等のレクチンなどが挙げられる。
抗体の抗原結合部位以外の部分に結合する物質としては、 プロテイン A、 プロ ティン G、 F cレセプター、 プロテイン L、 R C A、 L C A、 C o n A等のレク チンが好ましく、 さらに好ましくは、 プロテイン A、 プロテイン G、 プロテイン Lであり、 もっとも好ましくはプロテイン Aである。
また、 本発明は、 リガンド結合蛋白質および第二のリガンド結合物質を含む、 リガンドとリガンド結合蛋白質との結合活性を評価するためのキットを提供する。 リガンド結合蛋白質は抗原ペプチドであってもよい。本発明のキットは、さらに、 他の試薬などを含んでもよい。 例えば、 抗原に対する抗体の結合活性の測定に表 面プラズモン共鳴を利用する場合には、 本発明のキットは、 抗原及び抗体の抗原 結合部位以外に結合する物質をセンサーチップに固定するための試薬 （抗原の、 アミノ基、 チオール基、 アルデヒド基などの官能基を活性化させてチップ上に結 合させるための試薬であればいかなる試薬でもよく、 例えば、 N-ェチル - Ν' - ( 3 - ジメチルァミノプロピル） カルポジイミドヒドロクロリド、 Ν-ヒドロキシコハク 酸イミド、 ェタノ一ルァミン塩酸、 2 - ( 2 -ピリジニルジチォ） ェタンアミンヒ ドロクロリド、 システィン、 ピオチンヒドラジド）） などをさらに含んでもよい。 本発明のリガンド （例えば、 抗体） 活性の評価法およびキットは、 仮に試料溶 液中に異種タンパク質が不純物或いは培地や安定化剤として存在していても、 精 製操作を加えることなしにリガンド （例えば、 抗体） 分子としての結合活性比を 評価する事が可能である。 したがって製造過程にある或いは精製された原薬とし ての抗体の品質管理ゃィンプロセスコントロール、 処方設計の検討に利用するこ とができる。
また、 本発明のリガンド （树えば、 抗体） 活性の評価法およびキットにより最 終的に得られる結合活性比は、 試料溶液中の活性成分の濃度ではなく、 リガンド (例えば、 抗体） の第二のリガンド結合活性に対するリガンド結合活性の比活性 である。 したがってその値が 100%以上であれば、 抗体の抗原結合部位以外の部分 (例えば Fc部分） に何らかの分解が、 100%以下であれば抗体の抗原結合部位に何 らかの分解が生じている可能性が示唆される。 このことから他の物性評価法と併 用することにより安定性試験及び使用期限の設定にも利用することができる。 さらに、 本発明のリガンド （例えば、 抗体） 活性の評価法およびキットは、 高 活性な蛋白質 （特に、 変異蛋白質、 種々のモノクローナル抗体など） の選抜に利 用することもできる。 特にポイントミューテーシヨン等による高い生物活性ある いは安定性を示す変異タンパク質の選抜に有効である。 抗体では、 天然の抗体か ら、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体等の再構成された抗体の選抜に特に有用である。 また、 抗体等のタンパク質医薬品の製造承認申請を行う際に必要とされる、 夕 ンパク質原体中に検出される複数の電荷的へテロ成分 （タンパク質原体をイオン 交換クロマトグラフィーにかけたときに検出される複数のマイナーピーク） が rProduc t-Re l at ed Subs t ances] であるか否かの評価方法としても有効である。 また、 本発明のリガンド （例えば、 抗体） 活性の評価法およびキットを利用す ることにより、 血液、 血清等の体液中の高活性な蛋白質 （特に、 血中因子、 変異 蛋白質、 種々のモノクローナル抗体、 Fabや（Fab' ) 2などの抗体断片、 一本鎖 F v など） の定量や結合活性を、 簡便に且つ高い精度で測定することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 PTHrP (l-34+Cys)固定化時のセンサーグラムを示す。
図2は、抗？1¾^抗体& (2. 0 /i g/mL)測定時のセンサーグラム （ICyc le)を示す。 図 3は、 PTHrP結合量の定量における検量線（Dupl icate)を示す。
図 4は、 センサーグラムの乱れよりデ一夕から無視されたサイクルを示す。 図 5は、 プロテイン A固定化時のセンサーグラムを示す。
図 6は、 抗 PTHrP抗体 a (2. O g/mL)測定時のセンサーグラム（ICyc le, プロテ ィン A)を示す。
図 7は、 プロティン A結合量の定量における検量線（Dupl icate)を示す。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 0 - 1 9 2 8 2 9号の明細 書に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の方法の一例として、 BIAC0RETMにより抗 PTHrP抗体の PTHrPお よびプロテイン Aに対する結合量をそれぞれ測定し、 PTHrPに対する抗 PTHrP抗 体の結合量の測定値をプロティン Aに対する抗 PTHrP抗体の結合量の測定値で補 正することによって、 PTHrPに対する抗 PTHrP抗体の結合活性を評価する方法に ついて説明する。
まず、 抗 PTHrP抗体は W098/13388に記載の方法に従って製造する。
抗 PTHrP抗体を水で希釈し、 適当な濃度 （例えば、 1 0 0〜 5 0 0 g/mL) の 抗 PTHrP抗体の溶液を調製する。 これを一般試験法の吸光度法 （日局） により定 量後、 HBS緩衝液 （HBS-EP Buf fer (BIAC0RE社）） で適当な濃度 （例えば、 1 0〜 5 0 u g ) に希釈した溶液を 3回調製する。 それぞれの溶液に HBS緩衝液を加 え、 ある濃度 （例えば、 l〜5 g/mL) の溶液を調製する。 これらを、 未知試料 液 1、 2および 3とする。
上記の操作を抗 PTHrP抗体の標準品についても行い、 標準試料溶液 1、 2、 3を 用意する。 また別に、 抗 PTHrP抗体を水で希釈し、 適当な濃度 （例えば、 1 0 0〜5 0 0 g ) の抗 PTHrP抗体の溶液を調製して、 この溶液を HBS緩衝液で希釈して、 種々の濃度 （例えば、 0〜5 /ig/mL) の抗 PTHrP抗体の溶液を調製し、 これらを 検量線用標準溶液 A、 B、 C、 D、 E、 Fとする。
次に、 PTHrP およびプロテイン A固定化チップを用意する。 まず、 BIAC0RETM にセンサーチップ CM5 (BIAC0RE社、 Code # BR- 1000- 14) をセットし、 流速 5 〜20 L/minで HBS緩衝液を流す。 これに EDC (N-ェチル -N' - (3-ジメチルアミ ノプロピル）-カルポジイミドヒドロクロリ ド） 溶液と NHS (N-ヒドロキシコハク 酸イミド） 溶液をそれぞれ等量ずつ混合した溶液を例えば 150 _iL、 PDEA (2- (2- ピリジニルジチォ）エタンァミンヒドロクロリド） のホウ酸緩衝液溶液を例えば 150 L, PTHrP (1-34+Cys) (PTHrPの 卜 34ペプチドの C末端に Cysを付加した合 成ペプチド） の酢酸緩衝液溶液を例えば 40 し システィン一塩化ナトリウムの ギ酸緩衝液溶液を例えば 150 xL、 グリシン -塩酸緩衝液を例えば 10 zL、 10mM塩 酸水溶液を例えば IO Lを順次流すことにより、 PTHrP(l-34+Cys)をチップ上に固 定化する。フローセルを変え同様に、流速 5〜 2 0 L/minで HBS緩衝液を流す。 これに EDC溶液と NHS溶液をそれぞれ等量ずつ混合した溶液を例えば 100 し プ ロティン Aの酢酸緩衝液溶液例えば 40 xL、エタノールアミン-塩酸緩衝液を例え ば 100 L、 ダリシン-塩酸緩衝液を例えば 10 L、 10mM塩酸水溶液を例えば 10 L を順次流すことにより、 プロティン Aをチップ上に固定化する。
PTHrP 固定化チップ及びプロテイン A固定化チップそれぞれについて、 検量線 用標準溶液 A、 B、 C, D、 E、 F、 標準試料溶液 1、 2、 3及び未知試料溶液 1、 2、 3 を流し、 同一バッチから二回測定を行う。 分析は、 標準試料溶液及び未知試料溶 液を 1〜 1 00 xL好ましくは 1 0 L注入する 2分間を結合相とし、その後 HBS 緩衝液に切り換え、 2 0〜6 0秒後のレゾナンス ·ュニット（RU)と、 ベースライ ンとの差を結合量とする。 その後、 15mM塩酸溶液を注入し、 センサーチップの洗 浄、 再生を行う。 この結合、 洗浄、 再生を分析の 1サイクルとし、 センサーダラ ムを得、付属のソフトを用いて検量線を作成し、それぞれの結合濃度を算出する。 その結合濃度から、 結合活性比（%)を次の式で算出する。 抗 PTHrP抗体の結合活 抗 PTHrP抗体と PTHrPとの結合活性値
X 100 性比 （％) 抗 PTHrP抗体とプロテイン Aとの結合活性値
PTHrP に対する抗 PTHrP 未知試料の抗 PTHrP抗体と PTHrP固定化チップとの結合濃度
X 100 抗体の結合活性値 標準試料の抗 PTHrP抗体と固定ィヒチップとの結合濃度 未知試料の抗 PTHrP抗体とプロテイン A固定化チップ 抗 PTHrP抗体とプロティ との結合濃度
ン Aとの結合活性値 標準試料の抗 PTHrP抗体とプロティン A固定化チップ x との結合濃度 本発明を以下の実施例により具体的に説明する。 これらの実施例は説明のため のものであって、 本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例 1〕
I .実験材料
本実施例で使用した装置、 試薬および試料は以下の通りである。
( 1) 装置
BIACORE™ upgrade ： (BIAC0RE社製）
Sensor Chip ： Sensor Chip CM5 ： (BIACORE社製）
分光光度計 ： DU- 640 (BECKMAN社製）
(2) 試薬
Running Buf fer： HBS buf fer BIA Cert i f i ed (0. O IM HEPES pH7. 4， 0. 15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0. 005¾ (v/v) Surfact ant P20) (BIACORE社） Code # BR-1001-88 NHS : 0. 05 M N- ydroxysuccinimide, アミンカップリングキット (BIACORE 社） Code # BR - 1000 - 50
EDC： 0. 2 M N-e t yl-N' - (3-dimethyl aminopropyl) -carbodi imide hydrochl oride, ァミンカップリングキット （BIACORE社） Code # BR- 1000 - 50
Ethanol amine-HCl (pH8. 5) ： アミンカップリングキッ ト （BIACORE 社） Code # BR- 1000 - 50
PDEA：チオールカップリングキッ ト （BIACORE社） Code # BR- 1000-58
PTHrP (卜 34+Cys) ：サヮデ一社による合成品 (cus tom pep t ide JH 365, 21/11/94, B-CAL 35a. a. )
プロテイン A： (CAPPEL社） Cat # 55832, Lot # 40690
L-Cystein, NaCl, HC1
0.1 M Borate- Na Buffer (pH8.5)
10 mM Acetate- Na Buffer (pH4.0, 5.0)
0.1 M Na- Formate Buffer (pH4.3)
0.1 M Gly-HCl Buffer (pH2.5)
(3) 試料
抗 PTHrP抗体 a, b, c, d, e, f : in house ただし、 いずれも研究用ロット II.実験
(1) 抗原 PTHrP (l-34+Cys)固定化チップに対する抗 PTHrP抗体結合量定量の検討 i) センサーチップへの抗原 PTHrP (卜 34+Cys)の固定化
流速を 5 L/minに設定し、 表 1 に従って試薬をインジェクトし、 チオール カツプリング法による抗原 PTHrP(l-34+Cys)の固定化を行った。
表 1. PTHrl l- 34+Cys)の固定化条件 インジ ェクシヨン ¾
NHS/EDC 100 ^L
PDEA (5.4mg/250 ^L 0.1M Na- Borate Buffer (pH8.5)) 100〃L
PTHrP (1-34+Cys) (10 ^g/mL lOmM Na- Acetate Buffer (pH5.0) )
50mM Cys I 1M NaCl (0.1M Na - Formate Buffer (pH4.3) 100 ^L
0.1M Gly-HCl (pH2.5) 10 L lOmM HC1 .
ii) 複数ロット間差の PTHrP結合活性実測
i)の条件で作成したチップを用い、 抗 PTHrP抗体 4ロット a, b, c， d \ ついて以下の操作で PTHrP結合量の測定を行い、ロッド間差を検討した。 a, b, c, dの試料原液を精製水で希釈して約 500 g/fflL溶液を調製後、 吸光度法により濃 度を決定した。 その濃度をもとに、 標準試料とした aは、 検量線用に 0， 1, 2, 3, 4， 5 g/mL(n=l)及びコントロールとして 2 g/mL(n=3)、 未知試料である b, c, d は、
Figure imgf000012_0001
の HBS溶液をそれぞれ調製した。 まず、 流速を 5 L/minに設 定し、 試料溶液を lO tLインジェクトする 2分間を結合相とし、 その後ランニン グバッファーに切り換え、 30秒後のレゾナンス ·ユニット（RU)と、 インジェクト 直前のベースラインとの差を結合量とした。 その後、 15mMHClをインジェクトす ることによりセンサーチップの洗浄、 再生を行った。 この結合、 再生を分析の 1 サイクルとし、 それぞれの試料溶液について二回測定を行い、センサーグラム及 び結合量を得た。
(2) プロティン A固定化チップに対する結合量（抗体濃度）定量の検討
i) 抗 PTHrP抗体 e の PTHrP結合活性実測
抗 PTHrP抗体 a， e の試料原液を精製水で希釈して約 100 g/mL溶液を調製後、 吸光度法により濃度を決定した。 その濃度をもとに、 標準試料である a は、 検量 線用に 0, 1, 2， 3, 4, 5/^/111 （11=1)及びコントロールとして 2 §/1^ (11=3)、 未 知試料である e は、 2^g/mL (n=3)の HBS溶液をそれぞれ調製した。 （1)と同様の 操作で FTHrP結合量の測定を行った。
ii) センサーチップへのプロテイン Aの固定化
流速を 5 L/minに設定し、 表 2に従って試薬をインジェクトし、 アミンカ ップリング法によるプロティン Aの固定化を行った。
一 表 2. 一プロテイン Aの固定化条件
試薬 インシ" Iクシヨン量
NHS/EDC 150 L プロテイン A (50^g/mL 0.1 M Na - Borate Buffer (pH4.0)) 50^L
Ethanol amine 150 L
0.1 M Gly-HCl (pH2.5) 10/ L '
10 mM HC1 IO L i i i) 抗 PTHrP抗体 e の PTHrP/プロティン A結合活性実測
標準試料である a は、 吸光度法での濃度をもとに検量線用に 0, 1， 2, 3, 4, 5 g/mL (n=l)及びコントロールとして 2 g/mL (n=3)の HBS溶液を調製した。未知 試料である e は、 試料原液を 1000倍希釈した溶液 (n=3)を調製した。 まず、 （1) と同様の操作で PTHrP結合量の測定を行った。 次に、 プロテイン A固定化チップ に対しても同様の測定を行い、 センサーグラム及び結合量を得た。
(3) 本測定法を用いた繰り返し精度の測定
吸光度法での濃度をもとに標準試料である aは、 検量線用に 0, 1， 2, 3, 4, 5 g/mL (n=l)及びコントロールとして 2 g/mL (n=3)、 未知試料である ί は、 2 g/mL (n=3)の HBS溶液をそれぞれ調製した。 （2) - i i i)と同様に、 PTHrP固定化チ ップ、 プロテイン A固定化チップそれぞれについて、 0〜 5 g/mLの検量線用サン プル（n=l)、 2 g/mL の未知試料サンプル（η=3)をインジェクトし結合量を二回測 定することを一回の測定とした。 この試料調製からの一連の操作を計 7回同様に 行い、 繰り返し精度を検討した。
I I I.結果及び考察
(1) 抗原 PTHrP (l-34+Cys)固定化チップに対する、 結合量定量の検討
PTHrPの固定化の様子を図 1に示す。作製した PTHrP (l-34+Cys)固定化チップ の評価、 適切な検量線の濃度範囲及び試料の濃度を設定するために、 ほぼ同等の 品質が保証されている抗 PTHrP抗体の 4ロッ卜について、 PTHrPとの結合量の測 定を行った。 得られたセンサ一グラムの代表例を図 2に示す。
得られた結合量から BIAC0RETM附属の濃度定量用計算ソフトを用いて検量線の 作成を行った（図 3)。その結果、センサーグラム上（図 2)で結合相がほぼ直線であ り且つ解離がみられないこと、 この濃度範囲で検量線（図 3)が直線性を保ってい ることから考えて、 定量系に用いることのできるリガンド固定化量であると判断 した。 よって PTHrP (l-34+Cys)固定化チップに対する結合量定量の試料濃度は、 この実験で用いた条件、 すなわち検量線用標準試料の濃度を 0, ， 2, 3, 4， 5 g/mLの 6点、 未知試料の濃度をおよそ半分の 2 g/mLに設定した。
i i) 複数ロット間差の解析
次にこの検量線を用いて、 センサ一グラムから得られた結合量から附属のソ フトを用いて実サンプルである 4ロットの結合濃度の算出を行った。 なお、 この 際センサーグラムが乱れ適切な結合量が得られなかったサイクルについては値を 無視した（図 4 )。 この結合濃度をもとに PTHrP結合活性を（ea. 1)に定義し 4口 ットの結果をまとめた（表 3)。 その結果、 n=3 のばらつきが、 3%以内という、 高 い精度の測定系であることがわかった。 この実験からは 4ロットの PTHrP結合活 性に有意差はないと判断された。
未知試料の結合濃度
PTHrP結合活性比（BIAC0RE) (%) =' X 100 (e . 1) 標準試料の結合濃度 表 3 . PTHrP結合活性測定 （ロット間差） 結果
Figure imgf000014_0001
(2) プロティン A固定化チップに対する結合量（抗体濃度）定量の検討
i) プロティン A固定化チップの評価及び試料濃度の検討 抗 PTHrP抗体 eついて、吸光度法をもとに試料濃度を調製し PTHrP (l-34-Cys) 固定化チップとの結合濃度を測定（I- (2) - i) )した。 その結果、 標準試料である a と比較して PTHrP結合活性が 46%となった（表 4)。 この原因として生物活性の低 下が懸念されたが、 280nm に吸収を持つ夾雑物の混入も否定できず、 結果として 吸光度法による濃度が抗体濃度を反映しておらず蛋白含量の低下が起こったこと も考えられた。 そこで、 BIAC0RET Mを用いた抗体濃度定量系として、 プロテイン A固定化チップとの結合量定量系を取り入れ、 抗体濃度の補正を行い精度及び正 確さを高めることを試みた。
表 4 . 抗 PTHrP抗体 eの PTHrP結合活性測定結果
Figure imgf000015_0001
プロティン Aの固定化の様子を図 5に示す。作製したプロティン A固定化チッ プから得られたセンサーグラム及び検量線（図 6、 7)の直線性から、 定量系に用 いることのできるリガンド固定化量であると判断した。 また PTHrP (1-34- Cys)固 定化チップでの測定に用いられる濃度範囲 0〜 5 ^ g/mLで、十分に検量線が直線性 を示すことを確認した。 よってプロテイン A固定化チップに対する結合量定量の 試料濃度は、 検量線試料及び未知試料とも PTHrP (l- 34- Cys)固定化チップと同条 件に設定した。
i i) e 結合活性の解析
次に PTHrP、 プロテイン Αそれぞれの検量線を用いて、 センサーグラムから 得られた結合量から附属のソフトを用いて結合濃度の算出を行い、 結果をまとめ た（表 5)。 PTHrP に対する結合活性を、 プロテイン Aとの結合量から算出された 濃度で補正し、 抗 PTHrP抗体結合活性を （eq. 2) に新たに定義し結果をまとめた (表 6)。 その結果、 e は、 a に比較して結合活性が 94%であり、 若干の活性の低 下が示唆された。
以上のように、 プロテイン Aとの結合量の定量により、 PTHrP との結合量の測 定時と同じ試料濃度で抗体濃度を確認することで、 より正確な抗 PTHrP抗体結合 活性を測定することが可能となった。
― PTHrPに対する結合活性
抗 PTHrP抗体結合活性比（BIAC0RE) (¾) = " X 100 (eq. 2) プロティン Aに対する結合活性
― PTHrP固定化チップと未知試料との結合濃度 一
PTHrPに対する結合活性値 = -X 100
PTHrP固定化チップと標準試料との結合濃度 プロテイン Aに対する結合 プロティン A固定化チップと未知試料との結合濃度
活性値 ■χ ΐοο プロティン A固定化チップと標準試料との結合濃度 表 5 . 抗 PTHrP抗体 eの PTHrP及びプロティン A結合活性測定結果
Li gaud : PTHrP
試料 π 結合量 (R ) 検量線から算出された 三回測定
結合濃度 g/mL)
1st. 2nd. 1st. 2nd. 平均 ¾cv. 平均 ¾cv
cycle cycle cycle cycle dupl i
a 1 760. 9 779. 1. 98 2. 03 2. 01 1. 76 2. 02 0. 50
2 768. 8 788. 3 2. 00 2. 05 2. 03 1. 75
3 763. 2 783. 2 1. 99 2. 04 2. 02 1. 75
e 1 824. 852. 5 2. 14 2. 21 2. 18 2. 28 2. 17 0. 70
2 819. 0 838. 5 2. 13 2. 18 2. 16 1. 64
3 834. 0 849. 7 2. 17 2. 20 2. 19 0. 97 Li gaud : プロテイン A
Figure imgf000017_0001
表 6 . e結合活性測定結果
Figure imgf000017_0002
(3) 本測定法を用いた繰り返し精度の測定と実測
これまでの結果をもとに設定した、 プロティン Aによる濃度補正を含めた PTHrPとの結合活性測定法の評価のために、標準品を a にして ί の測定を行った。 1回の測定中、 同じバッチからの Dup l iのバラつきはすべて 4%未満（全測定サイ クル中の 83%は 2%未満）、n=3のバラつきはすべて 3%未満（全測定サイクル中の 90% は 2%未満）であったが、 7回の繰り返し実験のバラつきは 1%未満（0. 95%)であり、 かなり精度の高い実験系であることがわかった（表 7, 8)。
e . 3を用いて CAL結合活性を計算し表にまとめた（表 8)。 aの生物活性を 100% とした時、 f は 97. 0%であった。 7回繰り返し精度の％cv値は 0. 95%であったこと から、 この差は有意な差で ί は若干抗原との活性が低下していることが示唆され た。 抗 PTHrP抗体結合活性比 (BIAC0 E) (%)
PTHrP固定化チップと ίとの結合濃度/ PTHrP固定化チップと aとの結合濃度
X 100 プロテイン A固定化チップと ίとの結合濃度/プロテイン Α固定^チップと aとの結合濃度
(eq. 3) 表 7 . 抗 PTHrP抗体 f 結合活性 7回測定結果のまとめ
Figure imgf000018_0001
表 8 . f の結合活性 7回測定結果のまとめ
Figure imgf000019_0001
0. 95 (¾cv)
― PTHrPに対する結合活性―
抗 PTHrP抗体結合活性比 (BIAC0RE) (¾) = ■χ ιοο
プロティン Aに対する結合活性
― PTHrP固定化チップと未知試料との結合濃度 ―
PTHrPに対する結合活性値 = ■X 100
PTHrP固定化チップと標準試料との結合濃度 プロテイン Aに対する結合 プロテイン A固定化チップと未知試料との結合濃度 活性値 ■χ ιοο
プロティン A固定化チップと標準試料との結合濃度
IV. まとめ
この測定系は、 抗体をインジェクションした後バッファーに切り換え一定時間 を経過した時点での結合量を単純に PTHrP結合活性量と定義しており、 解離の影 響を無視しているので厳密な意味での生物活性とはいえない。 しかしながら、 セ ンサーグラムの形状から結合速度に比較して解離速度が十分に小さいことが観測 された試料に関しては、 速度論的解析を要さない簡便な活性評価として、 この方 法で十分であると判断した。 以上、 BIAC0RETMを用いて、 速度論的解析なしに精度が高く簡便に in vi troで CAL 生物活性評価が可能な試験法を発明した。 本法は、 他の生物活性試験法を適 宜組み合わせ、 BIAC0RETMの原理から生じる問題点を補うことで、 より正確で生 体内を反映した試験法になるものと考える。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として 本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 簡便且つ精度の高いリガンドの生物活性測定法が提供された。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . リガンドとリガンド結合蛋白質との結合活性を評価する方法であって、 リガ ンドとリガンド結合蛋白質との結合活性値を測定するとともに、 該リガンドと、 該リガンド結合蛋白質との結合部位以外の該リガンドの部位に結合する第二のリ ガンド結合物質との結合活性値を測定することを特徴とする方法。
2 . リガンドまたはリガンド結合蛋白質のどちらか一方が固定されていることを 特徴とする請求の範囲第 1項記載の方法。
3 . リガンドが、 抗原またはその抗体、 酵素またはその基質蛋白質、 または種々 の受容体に対するリガンドであることを特徴とする請求の範囲第 1項または第 2 項記載の方法。
4 . リガンドが抗体であり、 リガンド結合蛋白質が抗原ペプチドであることを特 徵とする請求の範囲第 1項または第 2項記載の方法。
5 . 第二のリガンド結合物質が、 抗体の定常領域または糖鎖に特異的に結合する 物質であることを特徴とする請求の範囲第 4項記載の方法。
6 . 抗体の定常領域が、 F c部分、 L鎖 κ領域または L鎖 λ領域であることを特 徵とする請求の範囲第 5項記載の方法。
7 . 第二のリガンド結合物質が、 抗体の F c部分に特異的に結合する物質である ことを特徴とする請求の範囲第 5項記載の方法。
8 . 抗体の F c部分に特異的に結合する物質が、 プロテイン A、 プロテイン G、 プロテイン L、 F cレセプターまたはレクチンである請求の範囲第 6項または第 7項に記載の方法。
9 . リガンドに F L A G蛋白質を結合させ、 第二のリガンド結合蛋白質として該 F L A G蛋白質に特異的に結合する物質を用いることを特徴とする、 請求の範囲 第 1項乃至第 4項のいずれかに記載の方法。
1 0 . リガンド結合蛋白質および第二のリガンド結合物質を、 各々固定させ、 リ ガンドを含む同一試料をそれぞれ反応させて、 それぞれの結合活性値を測定する ことを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 9項のいずれかに記載の方法。
1 1 . 第二のリガンド結合物質がプロテイン Aであることを特徴とする請求の範 囲第 4項記載の方法。
1 2 . 抗原ペプチドと抗体との結合活性値を、 抗体と第二のリガンド結合物質と の結合活性値で補正することを特徴とする請求の範囲第 4項乃至第 1 1項のいず れかに記載の方法。
1 3 . 下記の計算式（I) で算出される抗体の結合活性比で抗体と抗原ペプチドと の結合活性を評価する請求の範囲第 4項乃至第 1 2項のいずれかに記載の方法。
抗体と抗原べプチドとの結合活性値
抗体の結合活性比（％) = X 100 (I) 抗体と第二のリガンド結合物質との結合活性値
1 4 . 抗体と抗原ペプチドとの結合活性値が下記の計算式（II)で算出され、 抗体 と第二のリガンド結合物質との結合活性値が下記の計算式（II I)で算出される請 求の範囲第 1 3項記載の方法。
抗体と抗原べプチド 未知試料の抗体と抗原ペプチドとの結合濃度
X 100 (II) との結合活性値 標準試料の抗体と抗原べプチドとの結合濃度 抗体と第二のリガンド 未知試料の抗体と第二のリガンド結合物質との結合濃度
X 100 (III) 結合物質との結合活性値 標準試料の抗体と第二のリガンド結合物質との結合濃度
1 5 . リガンドとリガンド結合蛋白質との結合濃度およびリガンドと第二のリガ ンド結合物質との結合濃度が、 表面プラズモン共鳴、 蛍光偏光度測定法、 ラジオ ィムノアッセィ （RIA)、 酵素標識固相免疫測定法 （ELISA)、 HPLC、 超遠心分析法 または滴定型熱量測定により測定される請求の範囲第 1項乃至第 1 4項のいずれ かに記載の方法。
1 6 . リガンドとリガンド結合蛋白質との結合濃度およびリガンドと第二のリガ ンド結合物質との結合濃度が表面プラズモン共鳴により測定される請求の範囲第 1 5項記載の方法。
1 7 . リガンドがモノクローナル抗体である請求の範囲第 1項乃至第 1 6項のい ずれかに記載の方法。
1 8 . モノクローナル抗体がヒト型化されたものである請求の範囲第 1 7項記載 の方法。
1 9 . モノクローナル抗体が副甲状腺ホルモン関連ペプチドに対する抗体である 請求の範囲第 1 7項または第 1 8項に記載の方法。
2 0 . リガンド結合蛋白質および第二のリガンド結合物質を含む、 リガンドとリ ガンド結合蛋白質との結合活性を評価するためのキット。
2 1 . リガンド結合蛋白質が抗原ペプチドであることを特徴とする請求の範囲第 2 0項記載のキット。
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