WO2001096355A1 - Derives de nucleosides - Google Patents

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WO2001096355A1
WO2001096355A1 PCT/JP2001/005011 JP0105011W WO0196355A1 WO 2001096355 A1 WO2001096355 A1 WO 2001096355A1 JP 0105011 W JP0105011 W JP 0105011W WO 0196355 A1 WO0196355 A1 WO 0196355A1
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acid
derivative
nucleoside derivative
nucleoside
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PCT/JP2001/005011
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Yoshihisa Inoue
Takehiko Wada
Original Assignee
Japan Science And Technology Corporation
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to novel nucleoside derivatives.
  • Nucleic acids are highly functional macromolecules responsible for the accumulation and transmission of genetic information in living bodies. Specific recognition between nucleic acids or between nucleic acids and proteins plays an important role in the expression and regulation of nucleic acid functions. With the rapid development of genetic engineering and molecular biology in recent years, the mechanism of function expression has been further understood at the molecular level. Many causative genes of the disease have been elucidated, and the mechanism of its onset has been elucidated. against this backdrop, gene therapy, which treats diseases at the gene level by using specific recognition molecules that mimic the mode of recognition of natural nucleic acids as drugs, has attracted attention.
  • a gene transfer method that artificially introduces a defective or defective gene sequence into a patient's gene involves the synthesis of a protein that causes disease by binding an antisense molecule to mRNA in a base-specific manner.
  • the “antisense method”, which inhibits the DNA, and the “antigene method”, which combines the antisense moiety with the DNA region encoding the pathogenic protein to inhibit the transcription step, have been studied.
  • the so-called antisense molecules used in the “antisense method” and “antigene method” have many properties, among which 1) high nucleobase sequence recognition ability, ⁇ ⁇ high stability of the complex, ) High stability to biological substances, especially enzymes, 4) high cell toxicity, 5) specific interaction with nucleic acids, and 6) non-toxicity to living organisms are important.
  • antisense molecules include 1) derivatives modified around phosphate bonds, 2) derivatives modified at the glycosyl bond or hydroxyl group of the ribose sugar moiety, 3) derivatives modified at the base moiety, 4) There are nucleic acid model molecules having a skeleton structure other than the sugar-phosphate skeleton.
  • derivatives of 1) include phosphorothioate type in which the oxygen atom of the phosphate group of the phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom, phosphorodithioate type, phosphoroamidate type, and methyl
  • Derivatives of 2) include phosphonate-type and methylphosphonothioate-type oligonucleotides; ⁇ -anomeric oligonucleotides in which a base is coordinated with a sugar moiety in a manner opposite to a 3-darcosyl bond; Oligonucleotide in which the 3'-5 'phosphodiester bond has been changed to a 2'-5' bond using a liponucleotide.
  • 2'-methoxy compound in which the 2'-position of the report is methylated is a derivative of 3
  • Modifying bases such as 5-fluorouracil (5-FU), in which the 5-position of peracyl is substituted with fluorine, and fluorescent etenoadenosine; and sugars are used as derivatives of 4).
  • Peptide nucleic acids ( ⁇ ⁇ ) having a peptide skeleton in place of the acid skeleton OE. Uhlman, A. Peyman, Chem. Rev., 1990, 90, 544; OE. Uhlman, A. Peyman, G. Breipol, D .. Will, Angew, Chem. Int., Ed. Engl., 199 8, 37, 2796, etc.).
  • peptide nucleic acid not only has base-specific recognition ability and can withstand enzymatic degradation, but also has a very high affinity with nucleic acid because it has a neutral peptide chain in the main chain. It is a compound that has attracted attention because it has the advantages of having two tees and being able to easily obtain an arbitrary sequence by an amide bond formation reaction.
  • too high an affinity, such as binding to a target containing a mismatch is a disadvantage, and because of having a hydrophobic peptide chain, oligomers of 15-mers or more cannot be used in cells. Disadvantages have been reported, such as nonspecific adsorption to inner proteins and poor water solubility.
  • An object of the present invention is to provide a novel nucleoside derivative. More specifically, the present invention is useful as an antisense molecule because it has a higher affinity for a nucleic acid base sequence than a natural nucleic acid and has a property of being less susceptible to hydrolysis by in vivo enzymes. And a novel nucleoside derivative.
  • the nucleoside derivative provided by the present invention is a compound useful as an antisense molecule in an antisense method.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention relates to nucleoside derivatives and methods for producing the same, as described in the following 1. to 14.
  • a nucleoside derivative represented by the general formula (1) 1. A nucleoside derivative represented by the general formula (1).
  • X is the same or different and is a pyrimidine or purine nucleobase or a derivative thereof
  • ⁇ and Y ′ are the same or different and are serine, threonine, oretin, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, cysteine , Methionine, ⁇ -hydroxylysine, N-aminoethyldaricin, N-aminoethylserine, N-aminoethyllysine, N-aminoethylorutin, N-aminoethylaspara.formic acid, N-aminoethylglutamic acid, homo glutamate, beta one Chiokarupo two Ruasuparagin acid is any of at least one amino acid or amino acid derivative selected arch Sairyoku Lupo sulfonyl glutamic acid, and (from 5 Chio Cal Poni Le group homo consisting glutamic acid, R 1 represents a
  • X represented by the general formula (1) is substituted with peracyl represented by the formula (2) or a derivative thereof.
  • 1 ⁇ and 1 ⁇ are the same or different and are an oxygen atom or a sulfur atom, and R 4 is a hydrogen atom, a halogen, an alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group.
  • X represented by the general formula (1) is: 5-fluorouracil, 5-promouracil, 5-odouracil, 2-thioperacil, 4-thioperacil, 2,4-dithioperacil, 5-methylperacil, 5-vinylperacil, 5 - Echiniruurashiru, 5 one Furuoroshitoshin, 5-bromo, 5- ® one Doshitoshin, 5- Echirushi cytosine, hypoxanthine, 8-Furuoroguanin, 8 Puromoguanin, 8 - 3 one Doguanin, iota, New 6 - Etenoadenin, 8 _ Furuoroadenin 9.
  • m is an integer of 1 to 3
  • R 5 is an oxygen atom or a sulfur atom
  • * means a binding site to A in the nucleoside derivative represented by the general formula (1). Where A is a single pound.
  • m is an integer of :! to 3
  • R 6 is an oxygen atom or a sulfur atom
  • * means a binding site to A in the nucleoside derivative represented by the general formula (1). , Where A is a single pound.
  • 'R 7 is a hydrogen atom, a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, a hydroxymethyl group, an aminobutyl group, or an aminopropyl group, and * is the same as A in the nucleoside derivative represented by the general formula (1).
  • A is a carbonyl group or a thiocarbonyl group.
  • Step 1 aminating the 5'-hydroxyl group of a nucleoside or a derivative thereof to produce a 5'-amino-nucleoside derivative, the following formula
  • R 5 is an oxygen atom or a sulfur atom
  • m is an integer of 1 to 3
  • n is an integer of 1 to 100.
  • a derivative thereof with pentachlorophenyl trichloroacetate Reacting to produce an amino acid- ⁇ -pentachlorophenyl ester derivative, and the 5′-amino-nucleoside derivative obtained in Steps 1 and 2 and the amino acid- ⁇ -pentanol phenyl, respectively.
  • the method for producing a nucleoside derivative according to claim 4 comprising a step 3 of reacting with an ester derivative.
  • step 1 l
  • step 2 for deprotecting the C-terminus of the monomer
  • step 3 for deprotecting the N-terminus of the monomer
  • step 2 The oligomer or polymer of the nucleoside derivative according to 5, further comprising a step 4 of subjecting the C-terminal deprotected product to a condensation reaction with the N-terminal deprotected product obtained in the step 3, and a step of repeating the steps 2 to 4 as necessary.
  • N 2 to 100
  • R 7 is a hydrogen atom, a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, a hydroxymethyl group, an aminobutyl group or an aminopropyl group, D represents a carboxyl protecting group, and E represents an amino protecting group.
  • step 1 is carried out in the presence of N, N'-carbonilimidazole, phosgene, N, N'-thiocarbonilimidazole or thiophosgene.
  • X is the same or different and is pyrimidine or purine nucleobase or And Y and Y 'are the same or different, and serine, threonine, ordinine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, cysteine, methionine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ -aminoethyldaricin, ⁇ -Aminoethylserine, ⁇ -aminoethylilericin, ⁇ -aminoethylo ⁇ !
  • Renitin ⁇ -aminoethylaspartic acid, ⁇ -aminoethylglutamic acid, homoglutamic acid, ⁇ -thiocarbinylaspartic acid, arch talent Luponyldararylemin At least one selected from the group consisting of an acid, and ⁇ -thiocarbonyl homoglutamic acid
  • R 1 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and ⁇ is any of a single bond, a carbonyl group or a thiocarbonyl group.
  • F is a 9-fluorenylcarbonyl group, and G is a hydroxyl group or a benzylester group. 1 is an integer from 0 to 5.
  • X is the same or different and is a pyrimidine or purine nucleobase or a derivative thereof
  • Y and Y ′ are the same or different and are serine, threonine, or Ditin, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, cysteine, methionine, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ -aminoethyldaricin, ⁇ -aminoethylserine, ⁇ -aminoethylilericin, ⁇ -aminoethylornithin, ⁇ At least one selected from the group consisting of —aminoethylaspartic acid, ⁇ -aminoethylglutamic acid, homoglutamic acid, ⁇ -thiocarbonylaspartic acid, arch talented luponylglutamic acid, and ⁇ - ⁇ thiocarponylhomogglutamic acid
  • R 1 is a hydrogen atom or
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the steps of solid-phase synthesis of the nucleoside derivative (PRNA oligomer or polymer) of the present invention.
  • FIG. 2 is a chromatogram showing the results of HPLC analysis of PRNA oligomer 1 produced (solid phase synthesis) in Example 10.
  • the nucleoside derivative of the present invention is a novel compound which has not been described in the literature, and is represented by the following formula (1).
  • X is the same or different and is a pyrimidine or purine nucleobase or a derivative thereof
  • ⁇ and Y ′ are the same or different and are serine, threonine, ordinine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, cysteine , Thionine, d-hydroxylysine, N-aminoethyl ⁇ / glycine, N-aminoethylserine, N-aminoethyllysine, N-aminoethylorutin, N-aminoethylaspartic acid, N-aminoethylglutamic acid, homo Glutamic acid, ⁇ -thiocarbonylaspartic acid, archocarbonylglutamic acid, and ⁇ -thiocarbonylhomoglutamic acid, at least one selected from the group consisting of amino acids or amino acid derivatives, and R 1 is a hydrogen atom or a hydroxy
  • Each group of the nucleoside derivative represented by the above general formula (1) is specifically as follows.
  • the pyrimidine nucleobase represented by X means peracyl, cytosine and thymine, and the purine nucleobase means adenine and guanine.
  • the derivative of these nucleobases is not particularly limited, but examples thereof include halogenated derivatives of peracyl, cytosine, thymine, adenine or guanine, deamino derivatives, and derivatives having a sulfur atom in place of an oxygen atom. it can.
  • R 2 and R 3 are the same or different and are an oxygen atom or a sulfur atom
  • R 4 is a hydrogen atom, a halogen, an alkyl group, an alkenyl group or an alkynyl group.
  • Specific examples include a fluorine atom, a bromine atom, an iodine atom and a chlorine atom, and a fluorine atom, a bromine atom and an iodine atom are preferred.
  • alkyl group examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a t-butyl group, a pentyl group and a hexyl group.
  • a straight-chain or branched lower alkyl group having from 6 to 6 can be mentioned.
  • Alkenyl groups include vinyl, aryl, propyl, isopropyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-methylaryl, 3-butenyl, 4-pentenyl, and 5- Examples thereof include a linear or branched lower alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as a xenyl group and a 1,3-butanenyl group.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, 2-propynyl group, 2-butynyl group, 2-pentynyl group, 2-hexynyl group, and 2-penten-4-ynyl, etc.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, 2-propynyl group, 2-butynyl group, 2-pentynyl group, 2-hexynyl group, and 2-penten-4-ynyl, etc.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, 2-propynyl group, 2-butynyl group, 2-pentynyl group, 2-hexynyl group, and 2-penten-4-ynyl, etc.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, 2-propynyl group, 2-butynyl group, 2-pentynyl group, 2-hexynyl group, and 2-penten-4
  • cytosine derivatives include halogenated cytosine derivatives such as 5-fluorocytosine, 5-promocytosine and 5-hydroxycytosine; and cytosine derivatives having an alkynyl group such as 5-ethynylcytosine. Preferably 5-fluorocytosine.
  • guanine derivative examples include a deaminoguanine derivative such as hypoxanthine, and a halogenated guanine derivative such as 8-fluoroguanine, 8-promoguanine, and 8-odoguanine. Preferred are hypoxanthin and 8-promoguanine.
  • halogenated adenine derivatives such as 8-fluoroadenine, 8-bromoadenine and 8-odoadenine.
  • 8-fluoroadenine 8-bromoadenine
  • 8-odoadenine 8-odoadenine.
  • the nucleoside derivative (1) of the present invention may have the above-mentioned one kind of base as the nucleic acid base (X) in one molecule, or may have two or more kinds of different bases. Good. Suitable nucleobases include peracyl, thymine, cytosine, guanine and adenine.
  • the amino acid represented by Y or Y 'or a derivative thereof is not particularly limited as long as it does not exhibit immunogenicity due to its polymerization (oligoamino acid, polyamino acid).
  • Amino acids such as serine, threonine, aspartic acid, dalminic acid, lysine, arginine, cystine, methionine and ordinine; and hydroxylysine, ⁇ -aminoethyldaricin, ⁇ ⁇ -aminoethylserine, ⁇ -aminoethyllysine , ⁇ -aminoethylorutin, ⁇ -aminoethylaspartic acid, ⁇ -aminoethylglutamic acid, homoglutamic acid, ⁇ -thiocarbonylamino acid (3-thiocarponylaspartic acid, arch talent Luponylglutamic acid, ⁇ - Derivatives of amino acids such as serine,
  • glutamic acid aspartic acid, homodalminic acid, ⁇ -thiocarborylaspartic acid, r-thiocarbonyldalminic acid, ⁇ -thiocarbonylhomoglutamic acid and ⁇ -aminoethyldaricin.
  • these amino acids and amino acid derivatives may be any of d form, 1 form, and racemic form.
  • the monomer of the amino acid represented by (Y- ( ⁇ ′ ⁇ ) ⁇ — or a derivative thereof or the ⁇ terminus of the polymer thereof may be a free amino group, but is not particularly limited. It may have any functional group having a bond, a carbamic acid bond, a thiocarbamic acid bond, a urea bond, a thiourea bond or a phosphoramide bond, and the C-terminal may also be a free carboxy group. It is preferable, but not particularly limited, and may have any functional group having, for example, an amide bond or an ester bond.
  • Amino acids and amino acid derivatives represented by ⁇ are bonded to the 5'-carbon of the sugar-base moiety by an amide bond, thioamide bond, carbamic acid bond, thiocarbamic acid bond, dithiocarbamic acid bond, urea bond, thiourea bond, ester bond, etc. But said 5 The position of the functional group in the amino acid or amino acid derivative which binds to the '-carbon via these bonds is not particularly limited.
  • aspartic acid a dicarboxylic acid
  • glutamic acid has an ⁇ - or ⁇ -carboxyl group
  • homoglutamic acid has an ⁇ - or ⁇ -carboxyl group
  • 5,- An amide bond can be formed with an amino group
  • / 3-thiocarbonylaspartic acid is an ⁇ -thiocarpoxyl group
  • r-thiocarbonyldarminic acid is an r-thiocarboxyl group
  • 'A thioamide bond can be formed with the -amino group.
  • 1 is usually an integer of 0 to 5, preferably 0 to 2, and more preferably 0 or 1.
  • ⁇ is usually an integer of 1 to 100, preferably an integer of 6 to 50, and more preferably an integer of 8 to 20.
  • the nucleoside derivative targeted by the present invention includes a 5′-amino group of 5′-amino-nucleoside directly or via a carbonyl, thiocarbonyl, carbamic acid, thiocarbamic acid, urea or thiourea bond.
  • the nucleoside derivative of the present invention specifically includes compounds I, ⁇ , and ⁇ shown below.
  • m is an integer of 1 to 3
  • R 5 is an oxygen atom or a sulfur atom
  • * means a binding site to A in the nucleoside derivative represented by the general formula (1). ].
  • m is an integer of 1 to 3
  • R 6 is an oxygen atom or a sulfur atom
  • * means a binding site to A in the nucleoside derivative represented by the general formula (1). ].
  • X, Y ′, R ⁇ 1 and n are the same as above.
  • A is a carbonyl group or a thiocarbonyl group.
  • Y is the following formula (iii)
  • R 7 is a hydrogen atom, a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, a hydroxymethyl group, an aminobutyl group, an aminopropyl group or a 4-amino-3-hydroxypropyl group, and * is represented by the general formula (1).
  • R 7 is a hydrogen atom, a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, a hydroxymethyl group, an aminobutyl group, an aminopropyl group or a 4-amino-3-hydroxypropyl group, and * is represented by the general formula (1).
  • PR nucleoside derivative
  • NA1 ⁇ -type
  • PRNA2 ⁇ -type
  • PRNA3 AEG-type
  • the nucleoside derivative of the present invention can be produced by various methods.
  • the 5′-amino-nucleoside is obtained by aminating the hydroxyl group (5′-hydroxyl group) bonded to the 5 ′ carbon of the sugar moiety of the nucleoside of general formula (la) or a derivative thereof.
  • Step 2 reacting the nucleoside derivative (lb) and the amino acid derivative (Id) respectively produced by the above-mentioned steps to obtain the nucleic acid of the present invention.
  • It can be produced Sid derivative (1-i) (Step 3).
  • step 3 various methods for substituting a hydroxyl group with an amino group can be used. Specifically, for example, the Mitsunobu method (T. Hata, et al., J. Chem. So, Perkin 1, 306, (1976) ), T. Hata, et al., Chem. Lett., (1975) pp.977-980) can be applied. Specifically, it can be carried out according to the following formula.
  • Step (1) is a reaction for azidating the 5′-7] acid group of the nucleoside or its derivative (la).
  • the nucleoside or its derivative (ia) can be converted to triphenylphosphine (PRh 3 ), lithium azide (L iN 3) and carbon tetrabromide (CB r 4) 5 by reacting with '-N 3 - nucleoside derivatives (la') can be obtained.
  • the reaction solvent is a hydrocarbon-based solvent such as cyclohexane, benzene, and toluene; dichloromethane, chloroform, dichloroethane, trichloroethane, Halogenated hydrocarbon solvents such as benzene and the like; water; alcohol solvents such as methanol, ethanol and isopropanol; carboxylic acids such as formic acid and acetic acid; ether solvents such as tetrahydrofuran and dioxane; acetic anhydride; acetone; Dimethylphosphoramide / dimethylamide; dimethylsulfoxide; acetonitrile; THF; Preferred are dimethylformamide and dimethylsulfoxide, which are preferably used after drying.
  • the amount of the solvent to be used is generally 20 to 1000 parts by weight, preferably about 50 to 100 parts by weight, per 1 part by weight of the nucleoside of the general formula (la) or a derivative thereof.
  • the triphenyl phosphine, lithium azide and tetracarbon are used in an amount of about 1 to 10 mol, respectively, per 1 mol of the nucleoside of the general formula (la) or a derivative thereof.
  • Such a reaction can be carried out usually within a range of 0 to 80%, and is completed in about: 36 hours.
  • the reaction is stopped by adding a polar solvent such as methanol, and then the solvent is distilled off. Note that by performing the ordinary purification method such as further chromatography as necessary, 5 '- ⁇ 3 - nucleoside derivative (la) leaves in isolation.
  • Step (2) is a reaction for aminating the azido group of the 5′-N 3 -nucleoside derivative (la ′), and can be performed, for example, by reacting with hydrogen in a suitable solvent.
  • This reaction is preferably performed in the presence of a catalyst such as palladium-supported carbon or ruthenium-supported carbon.
  • the reaction solvent is a hydrocarbon-based solvent such as cyclohexane, benzene, and toluene; a hydrocarbon-based solvent such as dichloromethane, chloroform, dichloroethane, trichloroethane, and cyclobenzene; water; methanol, ethanol Alcohol solvents such as isopropanol; carboxylic acids such as formic acid and acetic acid; ether solvents such as tetrahydrofuran and dioxane; acetic anhydride; acetone; polar solvents such as dimethylformamide and dimethylsulfoxide.
  • alcohol solvents such as methanol and ethanol, and dimethylformamide.
  • Such a reaction can be carried out usually at room temperature, preferably in the range of 0 to 5, and is completed in about 0.5 to 48 hours.
  • the residue obtained by concentrating the reaction filtrate is reprecipitated with a methanol-based solvent or the like, whereby a 5′-NH 2 -nucleoside derivative of the general formula (lb) can be obtained.
  • the methanol-based solvent it is preferable to use a mixed solvent of methanol and ethanol.
  • Step 2 can be performed by reacting the amino acid (lc) with pentachlorophenyltrichloroacetate in a suitable solvent.
  • the reaction solvent is a hydrocarbon-based solvent such as cyclohexane, benzene, and toluene; a hydrocarbon-based solvent such as dichloromethane, chloroform, dichloroethane, trichloroethane, and cyclobenzene; water; methanol, ethanol Alcohol solvents such as isopropanol; carboxylic acids such as formic acid and acetic acid; ether solvents such as tetrahydrofuran and dioxane; acetic anhydride; acetone; dimethylformamide; acetonitrile; Preferred are polar solvents such as dimethylformamide and dimethylsulfoxide.
  • the amount of the solvent to be used is generally 10 to 1000 parts by weight, preferably about 20 to 100 parts by weight, per 1 part by weight of the amino acid.
  • the reaction can be performed in a range of 0 to 80, and is completed in about 0.5 to 48 hours.
  • Step 3 can be carried out by adding the 5′-book 2 -nucleoside derivative (lb) obtained in Step 1 to the reaction solution of Step 2 above and mixing the resulting mixture. )) Of the present invention (P RNA 1).
  • P RNA 1 Used in reaction 5 '-NH 2 - ratio of nucleoside derivatives (lb) with an amino acid derivative (Id) is not particularly limited, 5' _NH 2 - nucleoside derivative (lb) polyamic Bruno acid derivative per 1 mol (Id) The range is about 0.8 to 1 mol.
  • the reaction is carried out at a temperature in the range of 0 to 40, preferably 0 to 40 ° C, and is generally completed in about 24 to 48 hours.
  • the reaction product obtained by each of the above reactions is separated from the reaction system by a conventionally known means, and can be further purified.
  • Such purification methods include recrystallization, column chromatography, preparative thin-layer chromatography, Examples include an elution method and a reprecipitation method.
  • Reaction Scheme 12 shows that a 5′- ⁇ 3 ⁇ 4-nucleoside derivative (lb) is bonded to the ⁇ -aminopropyl group of an amino acid in which both the amino group and the aminooxy group are protected via the 5′-amino group.
  • a monomer compound 5 in which a nucleoside is bonded to the amino acid peptide main chain is synthesized (step 1), and the resulting monomer is used as a unit to repeatedly perform a selective deprotection-condensation cycle.
  • the N-terminus of the monomer and The nucleoside derivative of the present invention is produced by continuously extending the C-terminal (steps 2 to 4).
  • Step 1 is a reaction in which the ⁇ -carboxyl group of the amino acid or its derivative, which is a peptide main chain unit, is linked to the 5′-amino group of the nucleoside derivative as described above.
  • An amino acid derivative in which a group (such as an ⁇ -carboxyl group) is protected and a 5′- ⁇ ⁇ 2 -nucleoside derivative (lb) produced according to the method of Step 1> in Reaction Scheme 11 described above are used. .
  • amino protecting group for the amino acid used here general amino protecting groups used for peptide synthesis can be widely mentioned.
  • amino protecting groups include, for example, an optionally substituted carbobenzoxy group, tributyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl group, phthalyl group, formyl group, acetyl group, trifluoroacetyl group Group, p-toluenesulfonyl group, triphenylmethyl group, cyclohexyloxycarbonyl group, 0-nitrophenylsulfenyl group, t-amyloxycarbonyl group, benzyl group, alkyl- or arylthio
  • Examples include a carbonyl group, a 0-nitrophenoxyacetyl group, a chloroacetyl group, a benzenesulfonyl group, a dibenzylphosphoryl group, a trialkylsilyl group, an arylidene group
  • a butoxyloxycarbonyl group and a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group can be exemplified.
  • the former is particularly useful in the liquid phase synthesis of the nucleoside derivative of the present invention because it is an amino protecting group that can be deprotected under acidic conditions, and the latter is particularly useful because it is an amino protecting group that can be deprotected under basic conditions. It is useful for the solid phase synthesis of the nucleoside derivative of the present invention.
  • Examples of the carboxyl protecting group for amino acids generally include esters such as methyl ester, ethyl ester, tributyl ester, benzyl ester and P-nitrobenzyl ester, and ⁇ ′-substituted hydrazide. From the viewpoints of high yield and high selective deprotection, benzylylesterol ⁇ -two-opening benzyl ester, which can be removed by catalytic hydrogenation, is preferred.
  • More preferred amino acids or derivatives thereof include an amino acid having an amino group protected with a t-butyloxycarbonyl group (Boc-) and a carboxyl group protected with a free or benzyl ester group (-OBzl) or a derivative thereof.
  • amino acids in which the amino group is a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group (Fmoc-) and amino acids in which the carboxy / group is free or protected by a benzyl ester group (-OBzl) or derivatives thereof can be exemplified.
  • any of the N, ⁇ -C-protected amino acids into which any of the above protecting groups has been introduced can be produced according to a conventional method.
  • the binding reaction between the N, ⁇ C-protected amino acid and the 5′- 2 -nucleoside derivative (lb) is performed by DCC (dicyclohexylcarbodiimide), WSC (7K-soluble dicyclohexylcarbodiimide), B0P (benzotriazole).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC 7K-soluble dicyclohexylcarbodiimide
  • B0P benzotriazole
  • condensing agents such as trioxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate and HOBt (dihydroxybenzotriazole), HONSu (N-hydroxysuccinimide), paranitrophenol, pentafluorophenol, pentachlorophenol, etc.
  • the reaction can be carried out by an amide bond forming reaction using the system.
  • the produced monomer (5) can be isolated and purified from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, there can be mentioned a method of extracting the residue obtained by removing the solvent from the reaction solution with ethyl acetate, and then purifying the residue by column chromatography or the like.
  • Steps 1 to 4 are steps for forming an oligomer by subjecting the monomer (5) obtained in the above ⁇ Step 1> to unity condensation and extension reaction. Specifically, (Selective deprotection-condensation cycle) by repeating the reaction cycle (selective deprotection-condensation cycle) consisting of the selective deprotection reaction of the carboxyl terminal and the amino terminal of the mer (steps 2 and 3) and the subsequent condensation reaction (step 4). (Deprotection-condensation / repetition cycle) This is a process for producing an oligomer (polymer).
  • the selective deprotection-condensation cycle is performed as follows.
  • the benzyl ester group which is the carboxyl protecting group of the N, C-protected monomer (5) formed in step 1> above, is eliminated by catalytic hydrogenation reaction, and the N-protection having a free carboxyl group is removed.
  • the amino-protecting group and the carboxyl-protecting group are eliminated from the C-protected P RNA oligomer obtained above, and P RNA 2 (r PNA) having a free amino group and a carboxyl group is prepared by a conventional method.
  • the method described in Example 3 can be specifically exemplified.
  • the nucleoside derivative (1) of the present invention in which A in Formula (1) is a single pound can be produced.
  • R 8 is an oxygen atom or a sulfur atom.
  • any of the protecting groups described above in relation to PRNA 2 can be used as the amino-protecting group and the olepoxyl-protecting group of the amino acid.
  • aminoethylene glycine (AEG) in which R 7 is a hydrogen atom, is used as the peptide main chain
  • Boc-AE G-OBn produced using ethylenediamine as a starting material as a compound having N- and C-terminal protecting groups Is preferably used.
  • steps A, B and C are performed as follows.
  • step A the method of introducing a Boc group into 2-bromoethylamine (3a) can be performed according to a conventional method.
  • 2-bromoethylamine (3a) dissolved in an appropriate solvent is specifically used.
  • the reaction can be carried out by adding di-1-butyl dicarbonate ((Boc) 20 ) dropwise to the mixture.
  • dioxane, THF, dimethylformamide, chloroform, methylene chloride and the like can be used as the solvent.
  • the mixing ratio of di-tobutyl dicarbonate to 1 mol of 2-bromoethylamine (3a) is usually 1 to 2 mol, preferably about 1.2 mol.
  • the dropping is preferably performed at a temperature in the range of 110 to 20 ° C.
  • reaction product N-protected compound
  • a conventional method Specifically, water is added to the residue obtained by removing the solvent from the reaction solution, and the resulting aqueous layer is extracted with a non-polar organic solvent such as black form.
  • a non-polar organic solvent such as black form.
  • a butoxycarponyl group is introduced into the amino group of the benzyl ester derivative of the amino acid by reacting the benzyl ester derivative of the amino acid with the N-protected compound obtained above (Boc-amino acid derivative-0Bn, N, C -Protected amino acid derivative) (3b).
  • This reaction can be carried out in a solvent such as chloroform, methylene chloride, dioxane, dimethizoleformamide, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the mixing ratios of diisopropylethylamine and benzyl bromoacetate used in 1 mol of N-Boc_l, 2-aminoethane are about 0.5 to 2 mol and about 1 to 2 mol, respectively.
  • the reaction is preferably performed in the range of 0-6. Usually, such a reaction is completed in 0.5 to 24 hours.
  • the reaction product (N, C-protected amino acid derivative) (3b) obtained by the above reaction is separated from the reaction system and purified by a conventionally known means. Examples of such purification methods include recrystallization, column chromatography, preparative thin-layer chromatography, and solvent extraction.
  • step 1 the 5'- 2- nucleoside derivative (lb) synthesized by the method of Reaction Scheme 11 (step 1) is reacted with the N, C-protected amino acid derivative (3b) obtained above.
  • N, C-protected PRNA3 monomer (3c) can be produced.
  • the 5′-N3 ⁇ 4-nucleoside derivative (lb) is previously reacted with ⁇ , ⁇ ′-carbonyldiimidazole (CDI), phosgene,, ⁇ ′ -thiocarponyldiimidazole (TCDI) or tiophosgene to obtain
  • CDI ⁇ , ⁇ ′-carbonyldiimidazole
  • TCDI phosgene
  • TCDI ⁇ ′ -thiocarponyldiimidazole
  • tiophosgene tiophosgene
  • the mixing ratio of the above CDI and the like used for 1 mol of the 5′-NH 2 -nucleoside derivative (lb) is usually about 1 to 2 mol, preferably about 1 mol.
  • This reaction is preferably performed at a low temperature in order to suppress a side reaction of the 5′-H 2 -nucleoside derivative (lb) with a 3 ′ friend and / or a 2 ′ hydroxyl group. It is preferably carried out in the range of -78 to -40.
  • the reaction system is returned to room temperature, and the N, C-protected amino acid derivative (3b) is added.
  • N, C-proportion of protected amino acid derivative (3b) is, 5 '- H 2 - nucleoside derivative (lb) normally 1-2 moles relative to 1 mole, preferably:! Is ⁇ 1 5 moles. .
  • the reaction product (N, C-protected PRNA3 monomer (3c)) obtained by the above reaction is separated from the reaction system by a conventionally known means and purified.
  • a purification method include a recrystallization method, column chromatography, preparative thin layer chromatography, a dissolution / dissolution method, and a precipitation method.
  • the isolation and purification of the above product is preferably performed at room temperature or lower.
  • the oligomerization of the resulting N, C-protected PRNA3 monomer (3c) can then be carried out in a conventional manner, for example, as described above for PRNA2, in the step of elimination of the lipoxyl protecting group.
  • a so-called selective deprotection comprising a step 3 for elimination of an amino-protecting group, and a step 4 for condensing the C-protected product and the N-protected product by an amide bond forming reaction. Examples include a method of repeatedly performing a condensation cycle, a solid phase synthesis method, a sequential condensation method, and a fragment condensation method.
  • nucleoside derivatives in which A is a carbonyl group include serine, threonine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, cystine and orditin, ⁇ -hydroxylysine, ⁇ -aminoethylglycine, ⁇ -aminoethylserine, ⁇ -aminoethyllysine, ⁇ -aminoethylorutin, ⁇ -aminoethylaspartic acid, ⁇ -aminoethylglutamic acid, or N, N '
  • the nucleoside derivative in which ⁇ is a thiocarbonyl group can be prepared by reacting with the above amino acid derivative or an oligomer or polymer thereof by reacting with thiopyrrondiimidazole (CDI) or phosgene.
  • Nildimidazole or thiophosge It can be produced by reacting with The nucleoside derivatives of the present invention, Te nucleoside derivatives smell of the general formula (1), - ( ⁇ - ⁇ '),) ⁇ -.
  • eta 1 shows Amino acids, amino acid derivatives or their amino-terminal amino groups are protected with a tert-butoxycarbonyl group (Boc-group) or a 9-fluorenylcarbonyl group (Fmoc_ group), and the C-terminal carboxyl group
  • the groups include free or mono-nucleoside derivatives (PRNA monomers) protected with benzyl esters.
  • the 9-fluorenylcarbonyl group (Fmoc -group) is an amino protecting group that can be reversibly deprotected under basic conditions. Therefore, the mononucleoside derivative in which the N-terminus is protected by a Tmoc- group is useful as a raw material for solid-phase synthesis of an oligo or polynucleoside derivative as an Fmoc-PRNA monomer (Fmoc-mononucleoside derivative).
  • the Fmoc-mononucleoside derivative (Fmoc-PRNA monomer) can be prepared by compound 5 (N, C-protected PRNA2 monomer) prepared according to the above-mentioned reaction formula 12 or compound 3 c (N , C-protected PR A3 monomer) as raw material, first deprotection of N-terminal Boc-group by TFA, then introduction of Fmoc- group using Fmoc-Osu (N- (9-fluorenylcarbonyloxy) succinimide) By doing.
  • Mononucleoside derivative in which terminal hydroxyl group is protected with benzyl ester Can be prepared as Further, by removing the protecting group at the C-terminal according to a conventional method such as catalytic reduction, a mononucleoside derivative (PRNA monomer) 9 having a free hydroxyl group can be prepared.
  • the solvent used for the catalytic reduction, especially DMF, is preferably purified and used so as not to contain free amine.
  • the present invention can provide a solid phase synthesis method of an oligo or polynucleoside derivative using the Fmoc-mononucleoside derivative, particularly the Fmoc-PRNA monomer, as a raw material by providing the monomer.
  • the oligo or polynucleoside derivative of the present invention can be automatically synthesized using an apparatus.
  • the solid-phase synthesis of the oligo- or polynucleoside derivative of the present invention can be carried out by using the above-mentioned Fmoc-mononucleoside derivative (Fmoc-PRNA monomer) as a raw material of a monomer using a conventionally known peptide solid-phase synthesis method (for example, , GR Marchall, RB Merrifield, "Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports, Ed. By GR Stark, p. Ill-169, Academic Press, NY (1971), etc.)
  • the solid phase used for the synthesis may be a solid phase carrier widely used for the conventionally known peptide solid phase synthesis method, and the coupling reaction may be carried out.
  • Fmoc-PRNA monomer Fmoc-mononucleoside derivative
  • Kaiser test using a ninhydrin reagent
  • step 1 Introducing the monomer) into the solid support (step 1), removing the amino protecting group of the Fmoc-nucleoside derivative (Fmoc-PRNA) (step 2), and adding the N-terminal of the N-deprotected nucleoside derivative
  • step 3 The step of condensing the Fmoc-mononucleoside derivative (Fmoc-PRNA monomer) (step 3), the coupling reaction of step 3 and the elimination step of step 2 are repeated to successively extend the mononucleoside derivative (PRNA monomer) Step (Step 4), a step of cutting out the obtained nucleoside derivative polymer from the solid support (Step 5) can be produced.
  • the condensation reaction confirmatory test such as Kaiser one test to confirm the progress of the reaction.
  • the reaction confirmation test by alternating the condensation reaction, reliably Fmoc-PRNA monomer can be condensed and extended.
  • the nucleoside derivative (1) of the present invention can be used as an antisense molecule in an antisense method.
  • the nucleoside derivative of the present invention can be used as it is, but it can also be used as a so-called chimeric molecule in a form incorporated in a part of a base sequence such as a DNA sequence, an RNA sequence, or a DNA / RNA derivative.
  • derivatives of DNA and RNA include those having the same physiological function as nucleic acids such as DNA and RNA, and nucleic acid derivatives that are presently or in the future, such as nucleic acid derivatives conventionally known as antisense molecules such as PNA.
  • the body is included.
  • a derivative of DNA or RNA those represented by the following formula can be exemplified.
  • R 9 is an oxygen atom or a sulfur atom
  • R 1Q is O-, S-, NH 2 , NHR 11 , NRUR 12 , or R 11 .
  • R 11 and R 12 are the same or different and are CH 3 , (CH 2 ) nCH 3 , (CH 2 ) nNHZ, (CH 2 ) nNZZ, or (CH 2 ) nNH 2 [Z or Z ′ Are the same or different and are lower alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms such as methyl group, ethyl group, propyl group, n-propyl group, tributyl group, i-butyl group and n-butyl group; Is an integer of 0 to 10.]
  • the nucleoside derivative of the present invention can be bound to DNA, RNA or a derivative thereof directly or via a spacer.
  • the mode of such a bond is not particularly limited, in the case of a direct bond, the 3 ′ or 5 ′ end of the nucleoside derivative has a phosphodiester bond, a methylphosphonate bond at the 5 ′ end or 3 ′ end of the DNA or a derivative thereof, Methylphosphonothioate bond, phosphorothioate
  • the binding method include a bond bond, an amide bond, a sulfoamide bond, an ethylene glycol bond, and a thiomalimarin bond.
  • the nucleoside derivative of the present invention binds to DNA, RNA or a derivative thereof via a spacer
  • the 5,1-amino group of DNA, RNA or a derivative thereof and the carboxyl group of the nucleoside derivative may be used.
  • nucleoside derivative can be bound to DNA, RNA or a derivative thereof according to a conventional method.
  • nucleoside derivative of the present invention and the above-mentioned chimeric molecule containing the derivative may be prepared as a pharmaceutical preparation by mixing pharmaceutically acceptable conventional additives such as buffers, stabilizers, and diluents, and a carrier.
  • pharmaceutically acceptable conventional additives such as buffers, stabilizers, and diluents, and a carrier.
  • Such preparations can be used for various mammals including humans, and various administration forms can be adopted according to the purpose. Examples of such a form include parenteral preparations such as injections, suppositories, external preparations, eye drops, nasal drops, catheter administration, and the like, which can be produced by methods well known in the art.
  • nucleoside derivatives and the chimeric molecules of the present invention according 9 which can be applied to use to the plant cells as pesticides and plant modifier is also not particularly limited, tablets, capsules, prepared in the form of a solution, such as You can also.
  • peracyl pyrimidine nucleobase
  • inosine purine nucleobase
  • dartamic acid is mainly used as the amino acid or its derivative ( ⁇ , ⁇ ,).
  • other nucleobases and amino acids or derivatives thereof can be used as well.
  • N 4 -benzoylcytidine (13.3 g, 96%).
  • the N 4 —benzoylcytidine (13.0 g, 37.4 mmol), trifenylphosphine (28.0 g, 107 marl ol) and lithium azide (13.0 g, 266 mmol) were suspended in dry DMF, and the suspension was added to the suspension.
  • carbon tetrabromide (35.5 g, 107 t ol).
  • ethyl acetate (1500 ml) was added, and the mixture was washed with water and saturated saline (1000 ml each).
  • PRNA 2 Peptide liponucleic acid having an oligo ( ⁇ -L-glutamic acid) skeleton was produced according to the following reaction formula.
  • Glutamic acid with amino-terminal protected by t-butoxycarbonyl group and carbonyl group by benzyl ester group N-1-butoxycarbonyl-L-glutamic acid a-benzylester (Boc-isoGln-OBzI) (2.52 g, 7.47 mmol) ), HOBT (l. Olg, 7.47 band01) and OP reagent (benzotriazole-trioxytris (dimethylamino) phosphorum hexafluorophosphate) (3.30 g, 7.47% 01) Diisopropylethylamine (1.30 ml, 7, 47 t) was added to the solution (100 ml).
  • Boc-isoGln (5'U) -OH (compound 6) (1.25 g, 2.65 mmol), HOBt (0.358 g, 2.65 thigh 01) obtained in (2) above, and 80?
  • Reagent 1.173, 2.65 t ) was dissolved in DMF solution (50 ml), and diisopropylethylamine (0.97 ml, 5.57 mol) was added to the mixture.
  • the TFA'isoGln (5'U) -OBzl (compound 7) (1.68 g, 2.92 tmol) obtained in (3) above was added, and the reaction solution was added. Stirred at room temperature for 2 hours.
  • Boc- (isoGln (5'U)) 4 -OBzl (0.600 g, 0.369 ol) obtained in (7) above was added to the methanol-DMF solution (1: 1 v / v, 30 ml) of (11). Palladium on carbon (10, about 0.1 lg) was added. After continuously stirring under a hydrogen atmosphere (lbar) for 4 hours, the reaction solution was filtered and the filtrate was distilled off under reduced pressure to obtain a powdered tetramer Boc- (isoGln (5'U)) 4 -0H (Compound 12) was obtained (0.550 g, yield 97).
  • the Boc- (isoGln (5′U)) 4 -OBzl (compound 11) (0.600 g, 0.369 t ol) obtained in the above (7) was dissolved in TFA (5 ml), and the solution was set at 0 for 30 minutes. I left it. Then, TFA was distilled off under reduced pressure, and 100 ml of ether was added to obtain TFAisoGln (5'U) 4 -OBzl (compound 13) in powder form (0.593 g, yield 98%).
  • PRNA 2 having a free N-terminus was prepared according to the following reaction formula.
  • Boc- (isoGln (5'U) 8 -Lys (CIZ) -Bzl (compound 16) obtained in (1) above (0.300 g, 0.0 90 cafe ol) was dissolved in TFA (10 ml) and the solution was stored under a -nitrogen atmosphere at 110.
  • m-cresol (0.97 ml, 9.27 orchid) and trimethylsilal triflate (3.00 ml, 16.6 benzyl) were added sequentially, and the mixture was stirred at 0 for 1 hour. did.
  • Ether 200 ml was added and the precipitate was filtered. The precipitate was dissolved in a 5% aqueous ammonia solution.
  • Boc-AEG-OBn was produced according to the following reaction formula.
  • N-Boc-1,2-aminoethane (4.64 g, 29.0 t ol) and disopropylethylamine (4.50 g, 34.8 dandelion ol) were dissolved in black mouth form (40 ml).
  • Boc-AEG (5'U) -OBn was prepared according to the following reaction formula c
  • Boc- AEG (5 'U)-OBn 5′-Amino-5′-doxyduridine (5, -H 2 -Urd) (1.80 g, 7.40 mmol) prepared in Reference Example 1 was dissolved in dry DMF (50 ml), and -5 (- In TC, a solution of CDI (1.14 g, 7.04 brainol) in DMF (40 ml) was added dropwise over 1 hour, and the reaction system was stirred at ⁇ 50 for 30 minutes, and then gradually heated to room temperature.
  • Boc-AEG-0Bn (1.72 g, 7.40 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 days.After completion of the reaction, DMF was distilled off under reduced pressure at room temperature, and the residue was subjected to column chromatography. (Silica gel; chloroform-methanol (20: 1 v / v)) to obtain Boc-AEG (5′U) -0Bn (2.64 g, 4.58 g, yield 65%). White solid.
  • Example 5 Using Boc-AEG (5'U) -0H and TFAAEG (5'U) -OBn prepared above, dimer Boc- (AEG (5'U)) according to the method of Example 2 (4). 2.) Prepare 2- OBn. Furthermore, an oligomer can be prepared according to the method of Example 2 (5) to (: 11).
  • Example 5 Using Boc-AEG (5'U) -0H and TFAAEG (5'U) -OBn prepared above, dimer Boc- (AEG (5'U)) according to the method of Example 2 (4). 2.) Prepare 2- OBn. Furthermore, an oligomer can be prepared according to the method of Example 2 (5) to (: 11). Example 5
  • Example 2 obtained in (5) Boc- (isoGln (5'U )) 4 - 0H ( Compound 9) 343mg (0.37imol), distilled DMF and HOB t 56mg (leq) and BOP reagent 184 mg (leq) The mixture was dissolved at 0 ° C and stirred for about 1 hour until the temperature returned to room temperature. To this solution, 131 mg (2 eq) of diisopropylethylamine (DIEA) was added, and then TFAisoGln (5′U) -OBzl (compound 7) obtained in Example 2 (3) (251 mgaeq) was added. And stirred at room temperature for 2 hours. After the reaction, the solvent was concentrated under reduced pressure and reprecipitated from ethanol to obtain a trimer Boc- (isoGln (5'U)) 3 -OBzl. Yield 200mg, Yield 37.9%
  • Boc- (isoGln (5'U)) 3 -OBzl (200nig) obtained above was dissolved in methanol and added with palladium-supported carbon (10%, about 40 mg). By about 2 hours under a hydrogen atmosphere, Boc-by reprecipitation by E one ether (isoGln (5'U)) to obtain a 3 -0H. Yield 190 mg, yield 9
  • Boc-isoGln (5'I) -OBzl (1.09 g, 1.86 t ol) obtained in (1) above in methanol, add about 40 mg of carbon supported on palladium, and react for about 2 hours under hydrogen atmosphere.
  • Boc-isoGln (5'I) -0H was obtained. Yield 900mg, Yield 97.5
  • Boc-isoGln (5'I) -0H (182 mg, 0.37 t ol), HOB t (50 rag, 1 eq) and B ⁇ P reagent (162 mg, 1 eq) obtained in the above (2) were added to distilled DMF. And stirred for about 1 hour until the temperature returned to room temperature. To this solution was added 115 mg (2 eq) of diisopropylethylamine (DIEA), and 220 mg (leq) of TFA'isoGln (5'I) -OBzl prepared in (3) was added. Stirred for hours.
  • DIEA diisopropylethylamine
  • Example 2 Boc-isoGln (5'U) -0H (compound 6) prepared in (2) 945 mg (2.Ommol), HOB t 270 mg (leq) and BOP reagent 890 mg (leq) were dissolved in distilled DMF at 0. Then, the mixture was stirred for about 1 hour until the temperature returned to room temperature. To this solution, 0.74 mg (2 eq) of diisopropylethylamine (DI EA) was added, and then 1.32 g (l.l) of the TFAisoGln (5'I) -0 Bzl prepared in Example 6 (3) above was added. leq), and the mixture was stirred at room temperature for about 2 hours.
  • DI EA diisopropylethylamine
  • Boc-isoGln (5'U) -isoGln (5'I) -OBzl (527 mg, 0.56 fraction 1) prepared in (1) above was dissolved in methanol, and the palladium-supported carbon (10%, about 40fflg) was dissolved. Was added. The reaction was carried out for about 2 hours under a hydrogen atmosphere to obtain Boc_isoGln (5′U) -isoGln (5′I) -0H (yield 466 mg, 98%).
  • Boc-isoG1n (5'U) -isoGln (5'I) -OBz1 prepared in the above (1) was dissolved in TFA and reacted at 0 for 2 hours. Then, TFA was distilled off under reduced pressure, and ether was added to obtain TFA.isoGln (5'U) -isoGln (5'I) -0Bzl. Yield 798 mg, 98%.
  • Boc-isoGln ((5′U) -isoGln (5, I)) 2 -0H 65 mg (4.1 Xl (T3 ⁇ 4ol), HOBt 5.5 mg (leq) and BOP reagent 18.2 mg (leq) prepared in (5) above) was dissolved in distilled DMF with and stirred for about 1 hour until the temperature returned to room temperature.12.9 mg (2 eQ) of DIEA was added to this solution, and then the TFA ′ isoGln ((5 ′) prepared in the above (6) was added.
  • ⁇ -NR (270MHz; DMSO): (51.35 (s, 9H), 1.79 (m, 4H), 2.15 (m, 2H), 2.33 (t, 2H), 3.76-4.13 (m, 7H), 4.27 ( q, IH), 4.55 (q, IH), 5.04 (s, 2H), 5.17 (d, IH), 5.39 (d, lH), 5.51 (d, lH), 5.64 (d, lH), 5.73 ( d, IH), 5.83 (d, IH), 6.87 (d, IH), 7.34 (m, 5H), 7.64 (d, lH), 7.91-8.05 (m, 2), 8.11 (s, lH), 8.31 (s, IH);
  • Boc-isoGln (5'I) -isoGln (5'U) -0Bzl (527 mg, 0.56 ol) prepared above was dissolved in methanol, and palladium on carbon (10%, about 40fflg) was added. The reaction was performed under a hydrogen atmosphere for about 2 hours to obtain Boc-isoGln (5'I) -isoGln (5'U) -0H (yield 410 mg, 91%).
  • Example 2 2.196 g (3.81 mmol) of TFA * isoGln (5'U) -OBzl (compound 7) prepared in (3) and Fmoc-Osu (N- (9-fluorenylcarponyloxy) succinimide) 1.537 g (l. 2 eq) was dissolved in distilled DMF at 0 ° C and stirred. 1.99 g (2 eq) of DIEA was added to this solution, followed by stirring at room temperature for 30 minutes. The solution was concentrated under reduced pressure, and methanol was added to obtain Fmoc-isoGln (5'U) -OBzl by crystallizing. Yield 2.156g, Yield 82.8%
  • PRNA oligomers were produced according to the scheme described in FIG.
  • a solid-phase carrier resin NovaSyn (registered trademark) TGR-Resin (manufactured by Pharmacia) having a polyethylene dalicol chain as a spacer was used.
  • the solid phase carrier in which the amino group is protected by the oc-group is well swollen with N-methylpiperidone (NMP), and then reacted with 20% piperidine (PPD) ZNMP for 15 minutes.
  • NMP N-methylpiperidone
  • PPD piperidine
  • the Fmoc protecting group was removed from the solid support resin.
  • the mixture was vortexed every 5 minutes, and washed 5 times with NMP after completion of the reaction.
  • the PA extension reaction was carried out by successively condensing Fmoc-PRNA monomers having an Fmoc protecting group at the N-terminus and free at the C-terminus by repeating the following reaction.
  • Fmoc-PRA monomer (3 eq to resin) and 2- (1H-benzotriazole-toluyl) -1,1,3,3-tetramethylperonium hexafluorophosphate ) (HBTU) (3 eq) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) (3 eq) were dissolved in NMP, introduced into a column packed with the above resin, and diisopropylethylamine (DIEA) (6 eq) was added. The reaction was performed for 0 minutes. The mixture was ported every 5 minutes, and washed 5 times with NMP after completion of the reaction.
  • DIEA diisopropylethylamine
  • the N-terminus of the PRNA oligomer was deprotected by treating with 20% PPDZNMP and washed five times with NMP. The resin was further washed five times with a black hole form and the resin was dried under vacuum. The synthetic PRNA oligomer was then excised from the resin with TFA containing 5% water as a scavenger. TFA was distilled off with an evaporator, and the TFA solution was passed through the column and added to cold ether to obtain a white solid precipitate. It was then centrifuged. The supernatant was removed by decantation, and the residue was dried under vacuum to obtain a crude product of P-leg oligomer.
  • the crude product was subjected to analytical HPLC under the following conditions to confirm that it was a single peak, and the molecular weight was identified by MALDI-TOF. Further, the target fraction was fractionated through a preparative column, and the obtained fraction solution was freeze-dried to obtain a white solid.
  • Solution A Adjust the composition of Solution B from 100: 0 to 0: 100 for 30 minutes
  • FIG. 2 shows the results of HPLC analysis.
  • a condensation extension reaction is performed using the above Fmoc-isoGIn (5'U) -0H and iFmoc-isoGln (5'I) -0H as the aforementioned Fmoc-PRNA monomer, and the final condensation reaction was performed using Fmoc-Lys (OBzl) -0H to synthesize the following two types of octamer PRNA.
  • a chimeric nucleic acid (PRNA (Urd) -DNA (Thd) dimer) of PRNA having peracyl as a base and DNA having thymine as a base was synthesized according to the following scheme.
  • Example 2 N 4 - 1-Butokishikarupo two Lou N s - (5 - Dokishi - 5, - Urijiru) - alpha of L- Isoguruta Minbe Njiruesuterire (Boc-isoGln (OBzl)) - a carboxyl group,
  • Example 2 5′-H 2 -Urd (Reference Example 1) was introduced using the B0P reagent and HOBt according to the method described in Example 2, and then the a-carpoxyl group was removed by catalytic reduction according to Example 2 (2).
  • Boc-isoGln (5'U) -0H was synthesized (88% yield).
  • the 5′-hydroxyl group of thymidine is protected with a 4,4′-dimethoxytrityl chloride (DMTr-C1) group according to the method described in (1) to generate 5, -DMTr-Thd.
  • DMTr-C1 4,4′-dimethoxytrityl chloride
  • CEDIPA cyanoethyl ⁇ , ⁇ '-bis (diisopropyl) chlorophosphodiamidite
  • the 3'-amidite derivative of 5'-aminothymidine (5'-DMTr-NH-3'-CEDIPA-Thd) is condensed by activating with DIPA and tetrazole and then deprotected with TCA again.
  • a thymidine tetramer having an amino group at the 5 'end was synthesized.
  • the nucleoside derivative of the present invention is not easily degraded not only for exonuclease but also for endonuclease, and can exist in a living body for a long time after administration to the living body. Further, the nucleoside derivative of the present invention has excellent affinity for nucleic acids (RNA, DNA). Therefore, the nucleoside derivative of the present invention can be prepared as it is as an antisense molecule, or as an antisense molecule by introducing it into another molecule such as DNA, RNA or a derivative thereof. Furthermore, the nucleotide derivatives of the present invention are useful as antisense molecules in this sense because their in vivo degradation products are nucleotide-amino acid derivatives and have no or very low biotoxicity.
  • antisense molecules are used in antisense methods to control gene expression.
  • the nucleoside derivative of the present invention can inhibit the function of the target gene by using it as an antisense molecule, and is effective in treating genetic diseases such as cancer and genetic diseases.
  • the nucleotide derivative of the present invention has a base moiety that is syn- It has the property that it can be switched to the orientation and from the syn orientation to the anti orientation. Therefore, by controlling such conditions, it is possible to control the ability of the gene to bind to the nucleotide sequence, and a new antisense molecule capable of reversibly controlling on-off of gene function expression in the antisense method. It is expected as.

Description

明 細 書 ヌクレオシド誘導体 技術分野
本発明は、 新規なヌクレオシド誘導体に関する。
核酸は生体の遺伝情報の蓄積並びに伝達を担う高度な機能高分子である。 核酸 の機能発現とその調節機能には核酸間あるいは核酸—ダンパク質間での特異的認 識が重要な役割を果たしている。 近年の遺伝子工学や分子生物学の急速な発展に 伴い、 機能発現の機構はさらに分子レベルで理解されるようになってきた。 疾病 の原因遺伝子も数多く解明され、その発症機構についても明らかになりつつある。 そのような成果を背景として、 天然核酸の認識様式を模倣した特異的認識分子を 薬剤として用いることにより、 疾病を遺伝子レベルで治療する遺伝子療法が注目 を集めている。 遺伝子治療法には、 欠陥 ·欠損した遺伝子配列を患者の遺伝子に 人為的に導入する 「遺伝子導入法」 、 アンチセンス分子を mRN Aに塩基特異的 に結合させ疾病の原因となるタンパク質の合成を阻害する 「アンチセンス法」 、 病因タンパク質をコードした DNA領域にアンチセンス分チを转合させ転写段階 を阻害する 「アンチジーン法」 等が検討されている。
上記方法のうち、 「アンチセンス法」 や 「アンチジーン法」 に用いられる所謂 アンチセンス分子に求められる性質は数多くあるが、 中でも 1)高い核酸塩基配列 認識能、 ¾コンプレックスの高い安定性、 3)生体物質、 特に酵素に対する高い安 定性、 4)高い細胞 過性、 5)核酸との特異的な相互作用性、 及び 6)生体に対す る無毒性等が重要である。
当初、 アンチセンス分子として天然型のオリゴヌクレオチドを用いる試みがな されたが、 これらは、上記の 1) 及び 2)を比較的満足するものの、 3)の要件を充 足せず、 生体内のヌクレア一ゼによって即座に酵素分解されてしまい、 目的の成 果が得られないという問題がある。 現在報告されているアンチセンス分子には、 1)リン酸結合の周りを修飾した誘 導体、 2)リボース糖部のグリコシル結合或いは水酸基を修飾した誘導体、 3)塩基 部を修飾した誘導体、 4)糖—リン酸骨格以外の骨格構造を有する核酸モデル分子 等がある。 具体的には、 1)の誘導体としては、 ホスホジエステル結合のリン酸基 部の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチォエート型の他、 ホスホロジチォ ェ一ト型、 ホスホロアミデート型、 メチルホスホネート型及びメチルホスホノチ ォエート型のォリゴヌクレオチドを； 2)の誘導体としては、 塩基が) 3—ダルコシ ル結合とは逆に糖部に配位してなる α—ァノマー型のオリゴヌクレオチド、 並び に糖 3' -5'ホスホジエステル結合をリポヌクレオチドを用いた 2' -5'結合に変化さ せたオリゴヌクレオチドゃリポースの 2'位をメチルェ一テル化した 2' -メトキシ 体を： 3)の誘導体としては、ゥラシルの 5位をフッ素で置換した 5-フルォロウラ シル (5- FU)や蛍光性のェテノアデノシン等のような修飾性塩基を；また、 4)の誘 導体としては、 糖—リン酸骨格に代えてペプチド骨格を有するペプチド核酸 (Ρ ΝΑ) を挙げることができる （OE. Uhlman, A. Peyman, Chem. Rev. , 1990, 90, 544; OE. Uhlman, A. Peyman, G. Breipo l, D. . Wi l l, Angew, Chem. Int. , Ed. Engl. , 199 8, 37, 2796など） 。
ここでペプチド核酸 (P NA) は、 塩基特異的認識能を有し酵素分解にも耐え るというだけでなく、 中性のぺプチド鎖を主鎖にもつことから核酸との非常に高 いァフィ二ティーを有することや、 アミド結合形成反応により簡便に任意の配列 を得ることができるという長所をもつこと等から注目されている化合物である。 しかしながら、 ミスマッチを含むターゲットとも結合してしまう等、 高すぎるァ フィ二ティ一は逆に欠点ともなり、 また疎水的なぺプチド鎖を有することに起因 して、 15量体以上のオリゴマーでは細胞内タンパクと非特異的に吸着したり水難 溶性である等といった短所も報告されている。
このように P NAを始めとする多くのアンチセンス分子には、 未だ改良の余地 が残されている。 発明の開示
本発明は新規なヌクレオシド誘導体を提供することを目的とするものである。 より詳細には、 本発明は天然核酸よりも核酸塩基配列に対して高いァフィ二ティ 一を有し、 また生体内の酵素による加水分解を受けにくい性質を備えることによ つてアンチセンス分子として有用な新規ヌクレオシド誘導体を提供することを目 的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために日夜鋭意研究を重ねていたところ、 本発明で提供するヌクレオシド誘導体がアンチセンス法においてアンチセンス分 子として有用な化合物であることを見出した。
本発明はかかる知見に基づき完成されたものである。
すなわち本発明は、 下記 1 . 〜1 4. に掲げる、 ヌクレオシド誘導体及びその製 造方法に関するものである。
1 . 一般式 ( 1 ) で表されるヌクレオシド誘導体。
Figure imgf000005_0001
(式中、 Xは同一または異なってピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 γ及び Y' は同一または異なってセリン、 トレオニン、 オレ 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 ό—ヒドロキシリシン、 N—アミノエチルダリシン、 N—アミノエチ ルセリン、 N—アミノエチルリシン、 N—アミノエチルオル二チン、 N—ァミノ ェチルァスパラ.ギン酸、 N—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β 一チォカルポ二ルァスパラギン酸、 アーチ才力ルポニルグルタミン酸、 及び (5— チォカルポニルホモグルタミン酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも 1種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 また Αはシングルボンド、 力ルポニル基若しくはチォカルポニル基のいずれかで ある。 また、 1は 0〜5の整数であり、 nは 1〜100の整数である。 ）
2. 一般式 ( 1 ) で示される Xが、 式 （2 ) で示されるゥラシルまたはその誘 導体である 1記載のヌクレオシド誘導体。
Figure imgf000006_0001
(式中、 1^及び1^は、 同一または異なって、 酸素原子または硫黄原子であり、 R4は水素原子、 ハロゲン、 アルキル基、 アルケニル基またはアルキニル基であ る。 ）
3. 一般式 （1 ) で示される Xが、 5—フルォロウラシル、 5—プロモウラシ ル、 5—ョードウラシル、 2—チォゥラシル、 4—チォゥラシル、 2, 4 -ジチォゥ ラシル、 5—メチルゥラシル、 5—ビニルゥラシル、 5—ェチニルゥラシル、 5 一フルォロシトシン、 5—ブロモシトシン、 5—ョ一ドシトシン、 5—ェチルシ トシン、 ヒポキサンチン、 8—フルォログァニン、 8—プロモグァニン、 8 - 3 一ドグァニン、 Ι, Ν6-ェテノアデニン、 8 _フルォロアデニン、 8—プロモアデニ ン及び 8 -ョードアデニンよりなる群から選択される少なくとも 1種である 1記 載のヌクレオチド誘導体。
4. 一般式（1 ) 中、 Υが式（i)で表されるものである 1記載のヌクレオシド誘 導体。
Figure imgf000006_0002
(式中、 mは 1〜3の整数であり、 R 5は酸素原子または硫黄原子であり、 *は 一般式 ( 1 )で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部位を意味する。 尚、 ここで Aはシングルポンドである。 ）
5. 一般式 (1) 中、 Yが式（ii)で表されるものである 1記載のヌクレオシド 誘導体。
Figure imgf000007_0001
(式中、 mは:!〜 3の整数であり、 R 6は酸素原子または硫黄原子であり、 *は 一般式 (1)で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部位を意味する。尚、 ここで Aはシングルポンドである。 ）
6. 一般式（1) 中、 Yが式（iii)で表されるものである 1記載のヌクレオシド 誘導体。
Figure imgf000007_0002
N—本 (ii i)
„7一 /
CH
Figure imgf000007_0003
(式中、' R7は水素原子、 カルボキシメチル基、 カルボキシェチル基、 ヒドロキ シメチル基、アミノブチル基若しくはァミノプロピル基であり、 *は一般式（1) で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部を意味する。 尚、 ここで Aは力 ルポニル基またはチォカルボ二ル基である。 ）
7. ヌクレオシドまたはその誘導体の 5' -水酸基をァミノ化して 5' -ァミノ-ヌク レオシド誘導体を製造する工程 1、 下式
Figure imgf000008_0001
(式中、 R 5は酸素原子または硫黄原子であり、 mは 1〜3の整数であり、 nは 1〜100の整数である。 )で示されるアミノ酸またはその誘導体をペンタクロロフ ェニルトリクロ口アセテートと反応させてアミノ酸 - ω -ペンタクロロフエ二ルェ ステル誘導体を製造する工程 2、及び工程 1と工程 2でそれぞれ得られた 5' -アミ ノ-ヌクレオシド誘導体とアミノ酸- ω-ペン夕クロ口フエニルエステル誘導体と を結合反応させる工程 3を有する、 請求項 4記載のヌクレオシド誘導体を製造す る方法。
8. 5' -ァミノ-ヌクレオシド誘導体と Ν末端と C末端が保護された下式
Figure imgf000008_0002
(式中、 R 6は酸素原子または硫黄原子であり、 mは 1 ~ 3の整数である。 Dは 力ルポキシル保護基、 Eはァミノ保護基を意味する。 ) で示されるアミノ酸また はその誘導体とを反応させてヌクレオシド誘導体のモノマー （n = l)を製造する 工程 1、 該モノマーの C末端を脱保護する工程 2、 該モノマーの N末端を脱保護 する工程 3、 工程 2で得られた C末端脱保護物と工程 3で得られる N末端脱保護 物を縮合反応する工程 4、 さらに必要に応じて工程 2〜 4を反復する工程を有す る、 5記載のヌクレオシド誘導体のオリゴマーまたはポリマー（n = 2〜100) を 製造する方法。
9 . 5' -アミノ-ヌクレオシド誘導体と N末端と C末端が保護された下式
E
Figure imgf000009_0001
(式中、 R 7は水素原子、 カルポキシメチル基、 カルポキシェチル基、 ヒドロキ シメチル基、 アミノブチル基若しくはァミノプロピル基であり、 Dはカルポキシ ル保護基、 Eはァミノ保護基を意味する。 ) で示されるアミノ酸またはその誘導 体とを反応させてヌクレオシド誘導体のモノマー （n =l)を製造する工程 1、 該 モノマーの C末端を脱保護する工程 2、該モノマーの N末端を脱保護する工程 3、 工程 2で得られた C末端脱保護物と工程 3で得られる N末端脱保護物を縮合反応 する工程 4、 さらに必要に応じて工程 2〜4を反復する工程を有する、 6記載の ヌクレオシド誘導体のオリゴマ一またはポリマー（n = 2〜100)を製造する方法。
1 0. 工程 1の反応を、 N， N' -カルボ二ルイミダゾール、 ホスゲン、 N， N' -チォ カルボ二ルイミダゾールまたはチォホスゲンの存在下で行うことを特徵とする 8 記載の製造方法。
1 1 . 下記一般式で表される N保護-ヌクレオシド誘導体。
Figure imgf000009_0002
(式中、 Xは同一または異なつてピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 Y及び Y' は同一または異なってセリン、 トレオニン、 オル 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 δ—ヒドロキシリシン、 Ν—アミノエチルダリシン、 Ν—アミノエチ ルセリン、 Ν—アミノエチリレリシン、 Ν—アミノエチルオ^!レニチン、 Ν—ァミノ ェチルァスパラギン酸、 Ν—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β —チォカルボ二ルァスパラギン酸、 アーチ才力ルポニルダリレ夕ミン酸、 及び δ— チォカルボニルホモグルタミン酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも
1種のアミノ酸又はァミノ酸誘導体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 Αはシングルボンド、カルポニル基若しくはチォカルポニル基のいずれかである。 また Fは 9-フルォレニルカルポニル基であり、 Gは水酸基またはべンジルエステ ル基である。 1は 0〜5の整数である。 ）
1 2 . 1 1のヌクレオシド誘導体を単量体原料として用いる、 オリゴまたはポ リヌクレオシド誘導体の固相製造法。
1 3 . 1 1に記載する N保護-ヌクレオシド誘導体を固相に結合する工程、固相 に結合したヌクレオシド誘導体から N保護基を脱離する工程、 及び該ヌクレオシ ド誘導体に 1 2に記載する N保護-ヌクレオシド誘導体を結合する工程を含む、 1 2記載のォリゴまたはポリヌクレオシド誘導体の固相製造法。
1 4. 下記一般式で表されるヌクレオシド誘導体：
Figure imgf000010_0001
(式中、 Xは同一または異なってピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 Y及び Y' は同一または異なってセリン、 トレォニン、 オル 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 δ—ヒドロキシリシン、 Ν—アミノエチルダリシン、 Ν—アミノエチ ルセリン、 Ν—アミノエチリレリシン、 Ν—アミノエチルオル二チン、 Ν—ァミノ ェチルァスパラギン酸、 Ν—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β ーチォカルボ二ルァスパラギン酸、 アーチ才力ルポニルグルタミン酸、 及び δ— · チォカルポニルホモグルタミン酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも 1種のアミノ酸又はァミノ酸誘導体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 また Αはシングルボンド、 カルボニル基若しくはチォカルボニル基のいずれかで ある。 また、 1は 0〜5の整数であり、 nは 2〜100の整数である。 ）
の製造における、 原料としての 1 1に記載の N保護-ヌクレオシド誘導体の使用。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明のヌクレオシド誘導体（P RN Aのオリゴマーまたはポリマー） の固相合成の工程を示す概略図である。
図 2は、 実施例 1 0で製造 （固相合成） した P R NAオリゴマー 1の H P L C 分析結果を示すクロマ卜グラムである。 発明を実施するための最良の形態
本発明のヌクレオシド誘導体は、文献未記載の新規化合物であって、下式（1 ) によって表わされるものである。
Figure imgf000011_0001
(式中、 Xは同一または異なってピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 γ及び Y ' は同一または異なってセリン、 トレオニン、 オル 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 d—ヒドロキシリシン、 N—アミノエチ^/グリシン、 N—アミノエチ ルセリン、 N—アミノエチルリシン、 N—アミノエチルオル二チン、 N—ァミノ ェチルァスパラギン酸、 N—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β 一チォカルポ二ルァスパラギン酸、 アーチォカルボニルグルタミン酸、 及び δ— チォカルボニルホモグルタミン酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも 1種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 また Αはシングルボンド、 力ルポニル基若しくはチォカルボニル基のいずれかで ある。 また、 1は 0〜5の整数、 nは 1〜100の整数である。 ）
上記一般式 ( 1 ) で示されるヌクレオシド誘導体の各基は、 具体的には以下の 通りである。
Xで示されるピリミジン核酸塩基とはゥラシル、 シトシン及びチミンを、 プリ ン核酸塩基とはアデニン及びグァニンを意味するものである。 これらの核酸塩基 の誘導体としては、 特に制限はされないが、 ゥラシル、 シトシン、 チミン、 アデ ニン若しくはグァニンのハロゲン化誘導体、 脱ァミノ誘導体、 または酸素原子に 代えて硫黄原子を有する誘導体などを挙げることができる。
具体的には、 ゥラシルの誘導体としては、 式 （2 ) で表される化合物を挙げる ことができる。
Figure imgf000012_0001
(式中、 R 2及び R 3は同一または異なって、 酸素原子または硫黄原子であり、 R 4は水素原子、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基である。 ) ここでは八ロゲンとしては、 具体的にフッ素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子、 塩 素原子を挙げることができるが、 好ましくはフッ素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子 である。
アルキル基としては、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 ブ チル基、 イソブチル基、 t-ブチル基、 ペンチル基及びへキシル基等の、 炭素数 1 〜 6を有する直鎖状または分岐状の低級アルキル基を挙げることができる。 アルケニル基としては、 ビニル基、 ァリル基、 プロぺニル基、 イソプロぺニル 基、 2—メチル一1 —プロぺニル基、 2—メチルァリル基、 3—ブテニル基、 4 —ペンテニル基、 5—へキセニル基、 1， 3-ブタンジェニル基等の、 炭素数 1〜6 を有する直鎖状または分岐状の低級アルケニル基を挙げることができる。
アルキニル基としては、 ェチニル基、 2—プロピニル基、 2—プチニル基、 2 —ペンチニル基、 2—へキシニル基、 2—ペンテン一 4—ィニル等の、 炭素数 1 〜 6を有する直鎖状または分岐状の低級アルキニル基を挙げることができる。 より具体的には、 5—フルォロウラシル、 5—プロモウラシル及び 5 _ョード ゥラシル等のハロゲンィ匕ゥラシル誘導体； 2—チォゥラシル、 4—チォゥラシル 及び 2， 4-ジチォゥラシル等の酸素原子に代えて硫黄原子を有するゥラシル誘導 体； 5—メチルゥラシル、 5—ビニルゥラシル、 及び 5—ェチニルゥラシル等を 挙げることができる。
またシトシンの誘導体として、 具体的には 5—フルォロシトシン、 5—プロモ シトシン及び 5—ョ一ドシトシン等のハロゲン化シトシン誘導体； 5—ェチニル シトシンなどのアルキニル基を有するシトシン誘導体を挙げることができる。 好 ましくは 5—フルォロシトシンである。
グァニンの誘導体として、 具体的にはヒポキサンチンといった脱アミノグァ二 ン誘導体、 並びに 8—フルォログァニン、 8—プロモグァニン及び 8—ョードグ ァニン等のハロゲン化グァニン誘導体を挙げることができる。 好ましくはヒポキ サンチン及び 8—プロモグァニンである。
アデニンの誘導体として、 具体的には下式で示される 1，N6 -ェテノアデニン；
Figure imgf000013_0001
並びに 8—フルォロアデニン、 8—ブロモアデニン及び 8—ョードアデニン等の ハロゲンィ匕アデニン誘導体を挙げることができる。好ましくは 1，N6 -ェテノアデニ ン及び 8—ブロモアデニンである。
本発明のヌクレオシド誘導体（ 1 )は、 1分子中に核酸塩基 (X)として上記 1種 類の塩基を有するものであってもよいし、 また 2種以上の異なる塩基を有するも のであってもよい。 核酸塩基として好適にはゥラシル、 チミン、 シトシン、 グァ ニンまたはアデニンを挙げることができる。
一般式 （1 ) 中、 Yまたは Y' で示されるアミノ酸またはその誘導体は、 その 重合 （オリゴアミノ酸、 ポリアミノ酸） によって免疫原性を発現しないものであ れば特に制限されず、 具体的にはセリン、 トレオニン、 ァスパラギン酸、 ダル夕 ミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メチォニン及びオル二チン等のアミ ノ酸；並びに ヒドロキシリシン、 Ν—アミノエチルダリシン、 Ν—アミノエ チルセリン、 Ν—アミノエチルリシン、 Ν—アミノエチルオル二チン、 Ν—アミ ノエチルァスパラギン酸、 Ν—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 ω—チォカルボニルアミノ酸 （3—チォカルポ二ルァスパラギン酸、 アーチ才力 ルポニルグルタミン酸、 δ—チォカルポニルホモグルタミン酸等） といったアミ ノ酸の誘導体を挙げることができる。好ましくはグルタミン酸、ァスパラギン酸、 ホモダル夕ミン酸、 βーチォカルボ二ルァスパラギン酸、 rーチォカルボニルダ ル夕ミン酸、 δーチォカルボニルホモグルタミン酸及び Ν—アミノエチルダリシ ンである。 なお、 これらのアミノ酸及びアミノ酸誘導体は、 d体、 1体、 ラセミ 体のいずれであってもよい。
また一 （Y- (Υ'^ ) η—で示されるアミノ酸若しくはその誘導体の単量体また はその重合物の Ν末端はフリーのアミノ基であってもよいが、 特に制限されず、 例えばアミド結合， 力ルバミン酸結合， チォカルバミン酸結合， 尿素結合、 チォ 尿素結合又はホスホロアミド結合を有する任意の官能基を有していても良い。 ま た C末端も同様にフリ一のカルボキシ基であつてもよいが、 特に制限されること なく、 例えばアミド結合若しくはエステル結合を有する任意の官能基を有してい ても良い。
Υで示されるアミノ酸及びアミノ酸誘導体は、 アミド結合、 チオアミド結合、 カルバミン酸結合、チォカルバミン酸結合、 ジチォカルバミン酸結合、尿素結合、 チォ尿素結合、 エステル結合等によって糖—塩基部の 5' -炭素と結合するが、 該 5 ' -炭素とこれらの結合を介して結合するアミノ酸又はアミノ酸誘導体中の官能基 の位置は特に制限されない。 例えば、 ジカルボン酸であるァスパラギン酸の場合 はひ一または /3—カルボキシル基、 グルタミン酸の場合は α—またはァ—カルボ キシル基、 ホモグルタミン酸の場合は α—または δ—カルボキシル基、 と 5，-アミ ノ基との間でアミド結合を形成することができ、 また /3—チォカルボニルァスパ ラギン酸は α—チォカルポキシル基、 r一チォカルポニルダル夕ミン酸は r—チ ォカルボキシル基、と 5' -ァミノ基との間でチォアミド結合を形成することができ る。 また、 ジァミンであるリシンの場合は α-アミノ基若しくは ε -ァミノ基と 5， -ァミノ基との間で、セリンの場合は (9 -ヒドロキシル基と 5，-ァミノ基との間で前 述する結合を形成することができる。
本発明において 1は通常 0〜 5の整数であるが、 好ましくは 0〜 2の整数であ り、 より好ましくは 0または 1の整数である。
本発明において ηは通常 1〜1 0 0の整数であるが、 好ましくは 6〜5 0の整 数であり、 より好ましくは 8〜2 0の整数である。
なお、 本発明が対象とするヌクレオシド誘導体には、 5' -アミノ-ヌクレオシド の 5' -ァミノ基に、 直接またはカルポニル基、 チォカルポニル基、 力ルバミン酸， チォカルバミン酸， 尿素若しくはチォ尿素結合を介して、 上記アミノ酸若しくは その誘導体（以下、 アミノ酸類ともいう）が結合してなる所謂「アミノ酸類-ヌク レオシド」 の単量体 （1 = 0、 η = 1 ) およびその重合物 （1 = 0、 η = 2〜10 0) 、 並びに 5' -アミノ-ヌクレオシドの 5' -ァミノ基に直接またはカルボニル基、 チォカルポニル基、 力ルバミン酸， チォカルバミン酸， 尿素若しくはチォ尿素結 合を介して、 これらのアミノ酸類の重合物（オリゴアミノ酸類、ポリアミノ酸類） が結合してなる所謂「オリゴ又はポリアミノ酸類-ヌクレオシド」の単量体（1 = 1〜5、 η = 1 ) およびその重合物 （1 = 1〜5、 η = 2〜100) が包含される。
本発明のヌクレオシド誘導体には、 具体的には下記に示される化合物 I、 Π及 び ΙΠが包含される。 化合物 I ：
Figure imgf000016_0001
(式中、 X、 Y， 、 R 1及び nは前記と同じ。 Aはシングルポンドである c また Yは下式 (i)
Figure imgf000016_0002
[式中、 mは 1〜3の整数であり、 R 5は酸素原子または硫黄原子であり、 *は一 般式 ( 1 )で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部位を意味する。 ]であ る。 ）
'化合物 Π：
Figure imgf000016_0003
(式中、 X、 Y， 、 R 1及び ηは前記と同じ。 Αはシングルポンドである c また Yは下式 (i i)
Figure imgf000017_0001
[式中、 mは 1〜3の整数であり、 R 6は酸素原子または硫黄原子であり、 *は一 般式（1)で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部位を意味する。 ]であ る。 )
•化合物 m：
Figure imgf000017_0002
(式中、 X、 Y' 、 R\ 1及び nは前記と同じ。 Aはカルボニル基またはチォ カルポニル基である。 また、 Yは下式（iii)
Figure imgf000017_0003
[式中、 R7は水素原子、 カルポキシメチル基、 カルポキシェチル基、 ヒドロキシ メチル基、アミノブチル基、ァミノプロピル基若しくは 4-ァミノ- 3-ヒドロキシ プロピル基であり、 *は一般式 (1) で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの 結合部を意味する。 ]である。 ） 尚、 上記式 ι、 π及び mで示されるヌクレオシド誘導体を、 以下それぞれ PR
NA1 (α-型） 、 PRNA2 (ァ-型） 及び PRNA3 (AEG型） と称する。 本発明のヌクレオシド誘導体は種々の方法で製造され得るが、 P RN A 1の 1 例として、 Y基として式（i)で示される基を有するヌクレオシド誘導体（1-i) (1 =0の場合） は、 次のようにして製造することができる。
汉 J¾、式一 1
Figure imgf000018_0001
(la) (lb)
5
Figure imgf000018_0002
(lc) (Id)
Figure imgf000018_0003
(式中、 X、 R R5、 m及び nはそれぞれ前記と同じ）
反応式一 1において、 一般式 (la)のヌクレオシド又はその誘導体の糖部の 5'炭 素に結合した水酸基 （5'-水酸基） をァミノ化することによって 5'-アミノーヌク レオシド誘導体 (lb) を製造し （工程 1) 、 また別途、 L-ァスパラギン酸、 D -ァ スパラギン酸、 /3—チォカルポニル- L-ァスパラギン酸、 ）3—チォカルポ二ル- D- ァスパラギン酸 （以上、 m=l) 、 L -グルタミン酸、 D -グルタミン酸、 アーチォ カルポニル -L -グルタミン酸、 アーチ才力ルポ二ル- D-グルタミン酸 （以上、 m= 2)、 L-ホモダリレタミン酸、 D-ホモグルタミン酸、 δ—チォカルポニル- L-ホモグ ル夕ミン酸、 —チォカルポニル- D-ホモグルタミン酸（以上、 m=3)などのァ ミノ酸 （lc) をペンタクロロフェニルトリクロ口アセテートと反応することによ つてアミノ酸誘導体 (Id)を製造し （工程 2) 、 次いで上記の工程によってそれぞ れ製造されたヌクレオシド誘導体 (lb)とアミノ酸誘導体 (Id)とを反応させること により、 本発明のヌクレオシド誘導体 (1-i)を製造することができる （工程 3) 。 工程 1においては水酸基をァミノ基に置換する各種の方法を用いることがで き、 具体的には例えば Mitsunobu法 (T.Hata, et al.， J. Chem. So ， Perkin 1, 306, (1976)、 T.Hata, et aし, Chem. Lett., (1975) pp.977 - 980)を適用す ることができる。 具体的には下式に従って実施できる。
<工程 1>
Figure imgf000019_0001
(式中、 X及び R1はそれぞれ前記と同じ）
工程 (卜 1)は、 ヌクレオシドまたはその誘導体 (la)の 5' - 7]酸基をアジド化する 反応であり、 例えば適当な溶媒下、 ヌクレオシドまたはその誘導体 (ia)をトリフ ェニルホスフィン（PRh3)、 アジ化リチウム（L iN3)、及び四臭化炭素（C B r4) と反応させることによって 5' -N3-ヌクレオシド誘導体 (la')が得られる。 ここで反応溶媒としては、 シクロへキサン、 ベンゼン、 トルエン等の炭化水素 系溶媒；ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロェタン、 トリクロロェタン、 クロ口ベンゼンなどのハロゲン化炭素水素系溶媒；水；メタノール、エタノール、 イソプロパノールなどのアルコール系溶媒；ギ酸、 酢酸などのカルボン酸類；テ トラヒドロフラン、 ジォキサンなどのエーテル系溶媒；無水酢酸；アセトン；ジ メチルホ^/ムアミド、 ジメチルスルホキシド；ァセトニトリル； TH F；塩ィ匕メ チレンなどが挙げられる。 好ましくはジメチルホルムアミド、 ジメチルスルホキ シドであり、 これらは乾燥して使用されることが好ましい。 溶媒の使用量は、 一 般式 (la)のヌクレオシド又はその誘導体 1重量部に対して通常 20〜1000重量部、 好ましくは 50〜 100重量部程度である。
なお、 トリフエニルホスフィン、 アジ化リチウム及び四:^匕炭素は一般式 (la) のヌクレオシド又はその誘導体 1モルに対してそれぞれ 1〜10モル程度で使用さ れるのが好ましい。
かかる反応は通常 0〜 8 0 Όの範囲で行うことができ、 ：!〜 3 6時間程度で完 結する。 反応はメタノールなどの極性溶媒を添加することによって停止され、 次 いで溶媒が留去される。 なお、 必要に応じて更にカラムクロマトグラフィーなど の通常の精製方法を行うことにより、 5' - Ν 3 -ヌクレオシド誘導体 (la )が単離で さる。
工程（卜 2)は、 上記 5' -N 3-ヌクレオシド誘導体（la' )のアジド基をァミノ化す る反応であり、 例えば適当な溶媒下で、 水素と反応させることによって行うこと ができる。 この反応はパラジウム担持炭素、 ルテニウム担持炭素等の触媒の存在 下で行うことが好ましい。
ここで反応溶媒としては、 シクロへキサン、 ベンゼン、 トルエン等の炭化水素 系溶媒；ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロェタン、 トリクロロェタン、 クロ口ベンゼンなどのハロゲン化炭素水素系溶媒；水；メタノール、エタノール、 イソプロパノールなどのアルコール系溶媒；ギ酸、 酢酸などのカルボン酸類；テ トラヒドロフラン、 ジォキサンなどのエーテル系溶媒；無水酢酸；アセトン；ジ メチルホルムアミド、 ジメチルスルホキシド等の極性溶媒などが挙げられる。 好 ましくはメ夕ノール、 エタノール等のアルコ一ル系溶媒及びジメチルホルムァミ ドである。 溶媒の使用量は、 一般式（la' )の 5' - N 3-ヌクレオシド又はその誘導体 1重量部に対して通常 20〜 1000重量部、 好ましくは 50〜100重量部程度である。 かかる反応は通常室温、 好ましくは 0〜 5 の範囲で行うことができ、 0 . 5〜4 8時間程度で完結する。 反応終了後、 反応濾液を濃縮して得られる残渣を メタノール系溶媒等により再沈殿させることにより、一般式 (lb)の 5' - NH2 -ヌクレ オシド誘導体を得ることができる。 なお、 メタノール系溶媒としては、 好ましく はメタノ一ルとェ夕ノールの混合溶媒を使用することが望ましい。
<工程 2 >
工程 2はアミノ酸（lc)を適当な溶媒中でペンタクロロフェニルトリクロロアセ テートと反応させることにより実施できる。
ここで反応溶媒としては、 シクロへキサン、 ベンゼン、 トルエン等の炭化水素 系溶媒；ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 ジクロロェタン、 トリクロロェタン、 クロ口ベンゼンなどのハロゲン化炭素水素系溶媒；水；メタノール、エタノール、 イソプロパノールなどのアルコール系溶媒；ギ酸、 酢酸などのカルボン酸類；テ トラヒドロフラン、 ジォキサンなどのェ一テル系溶媒；無水酢酸；アセトン；ジ メチルホルムアミド；ァセトニトリル； THF；塩化メチレンなどが挙げられる。 好ましくはジメチルホルムアミド、 ジメチルスルホキシド等の極性溶媒である。 溶媒の使用量は、 アミノ酸 1重量部に対して通常 10~1000重量部、 好ましくは 20 〜100重量部程度である。 当該反応は 0〜 8 0 の範囲で行うことができ、 0 . 5〜 4 8時間程度で完結する。
<工程 3 >
工程 3は、上記工程 2の反応液中に前記工程 1で得られた 5 ' -冊2-ヌクレオシド 誘導体 (lb)を添加し、混合することによって実施でき、 これによつて一般式 (卜 i) で示される本発明のヌクレオシド誘導体 (P RNA 1 ) を得ることができる。 反 応に用いられる 5' -NH2-ヌクレオシド誘導体（lb)とアミノ酸誘導体 (Id)の割合は、 特に制限されないが、 5' _NH2-ヌクレオシド誘導体（lb) 1モルに対してポリアミ ノ酸誘導体 (Id) 0. 8〜1モル程度の範囲が挙げられる。当該反応は 0〜4 0 、 好ましくは 0〜 4 0 °Cの範囲で行われ、 一般に 2 4〜 4 8時間程度で完結する。 上記の各反応によつて得られる反応生成物は、 従来公知の慣用手段によつて反 応系内より分離され、 更に精製することができる。 かかる精製方法としては、 再 結晶法、 カラムクロマトグラフィー、 プレパラティブ薄層クロマトグラフィー、 溶 出法及び再沈殿法などを挙げることができる。
また P RNA 2の 1例として、 Y基として式（i i)で示される基を有するヌクレ オシド誘導体 ( 1 = 0の場合） は、 下記反応式— 2に示す方法に従って製造でき る。
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
(式中、 X R 1及び R 6 mはそれぞれ前記と同じ）
反応式一 2は、 ァミノ基と力ルポキシル基の両方が保護されてなるアミノ酸の α -力ルポキシル基に、 5' - Ν¾-ヌクレオシド誘導体（lb)をその 5' -アミノ基を介し て結合することによって、 アミノ酸のぺプチド主鎖にヌクレオシドが結合してな るモノマー （化合物 5 ) を合成し （工程 1 ) 、 次いで得られたモノマーをュニッ トとして、選択的脱保護-縮合サイクルを繰り返し行つて該モノマーの N末端及び C末端を連続的に伸長することによって本発明のヌクレオシド誘導体を製造する ものである （工程 2〜4) 。 尚、 上記アミノ酸としては、 L-ァスパラギン酸、 D- ァスパラギン酸、 ]3—チォカルポニル- L-ァスパラギン酸、 ーチォカルボエル- D -ァスパラギン酸 （以上、 m= l ) 、 L-グルタミン酸、 D -グルタミン酸、 アーチ ォカルポニル -L-グルタミン酸、 アーチ才力ルポニル- D -グルタミン酸 （以上、 m = 2 ) 、 L-ホモグルタミン酸、 -D-ホモグルタミン酸、 δ—チォカルポニル- L -ホ モグルタミン酸、 δ—チォカルポニル- D-ホモグルタミン酸（以上、 m= 3 )など の、 1分子中に 2つのカルボキシル基を有するものを挙げることができる。
<工程 1 >
工程 1は前述するようにペプチド主鎖単位であるアミノ酸またはその誘導体の α -カルボキシル基をヌクレオシド誘導体の 5' -ァミノ基に結合する反応であり、 出発原料としてアミノ基と α位以外の力ルポキシル基 （ω-カルボキシル基など） が保護されたアミノ酸誘導体と、 前述する反応式一 1のく工程 1 >の方法に従つ て製造される 5' - ΝΗ2-ヌクレオシド誘導体 (lb)が用いられる。
ここで用いられるアミノ酸のァミノ保護基としては、 ペプチド合成に用いられ る一般のァミノ保護基を広く挙げることができる。かかるァミノ保護基としては、 例えば置換されていてもよいカルボベンゾキシ基、卜ブチルォキシカルボニル基、 9-フルォレニルメトキシカルボ二ル基、 フタリル基、 ホルミル基、 ァセチル基、 トリフルオルァセチル基、 p-トルエンスルホニル基、 トリフエニルメチル基、 シ クロへキシルォキシカルボ二ル基、 0-ニトロフエニルスルフエ二ル基、 t-ァミル ォキシカルポニル基、 ベンジル基、 アルキル-又はァリルチオカルボニル基、 0 - ニトロフエノキシァセチル基、 クロルァセチル基、 ベンゼンスルホニル基、 ジべ ンジルホスホリル基、 トリアルキルシリル基、 ァリリデン基、 ァセトァセチル基 などが挙げられる。 高収率及び高選択的脱保護という観点から、 好ましくはトブ チルォキシカルポニル基、 9-フルォレニルメトキシカルポ二ル基を挙げることが できる。 前者は酸条件下で脱保護ができるァミノ保護基であるため特に本発明の ヌクレオシド誘導体の液相合成に際して有用であり、 後者は塩基性条件下で脱保 護ができるアミノ保護基であるため特に本発明のヌクレオシド誘導体の固相合成 に際して有用である。 またアミノ酸のカルボキシル保護基としては、 一般的にメチルエステル、 ェチ ルエステル、 卜ブチルエステル、 ベンジルエステル及び P-ニトロべンジルエステ ルなどのエステル類、並びに Ν' -置換ヒドラジド等を挙げることができるが、高収 率及び高選択的脱保護という観点から、 その脱離が接触的水素ィ匕によって行うこ とのできるベンジリレエステゾレゃ ρ-二ト口べンジルエステルが好ましい。
より好ましいアミノ酸またはその誘導体として具体的には、 ァミノ基が t-プチ ルォキシカルボ二ル基 (Boc-) で、 またカルボキシル基がフリーかべンジルエス テル基 (-OBzl)で保護されてなるアミノ酸またはその誘導体、 ァミノ基が 9 -フル ォレニルメトキシカルポニル基 (Fmoc-)で、 またカルポキシ /基がフリーかベン ジルエステル基 (-OBzl)で保護されてなるアミノ酸またはその誘導体を例示する ことができる。 なお、 上記任意の保護基が導入された N，ァ C-保護アミノ酸はいず れも常法に従って製造することができる。
上記の N，ァ C-保護アミノ酸と 5' - 2-ヌクレオシド誘導体（lb)との結合反応は、 DCC (ジシクロへキシルカルポジイミド） 、 WSC (7K溶性ジシクロへキシルカルポ ジイミド） 、 B0P (ベンゾトリアゾ一ル -卜ィルォキシトリス（ジメチルァミノ）ホ スホニゥム へキサフルォロホスフェート）などの縮合剤と HOBt (卜ヒドロキシべ ンゾトリァゾール） 、 HONSu (N-ヒドロキシスクシンイミド） 、 パラニトロフエノ —ル、 ペンタフルオロフェノール、 ペンタクロロフエノールなどの添加系を用い たアミド結合形成反応によって実施できる。 かかる反応はジィソプロピルェチル ァミンの存在下、 DMF (N，N -ジメチルホルムアミド）、 DMS0ジメチルスルホキシド）、 CHC13、 CH2CI 2及び CH3CN等の非極性溶媒中で行うことができ、 かかる反応によつ てモノマ一 （化合物 5) が生成される。
生成されたモノマー（5)は、反応液から常法に従って単離精製することができ る。 具体的には、 反応液から溶媒を除去して得られる残渣から酢酸ェチルを用い て抽出し、 次いでカラムクロマトグラフィー等を利用して精製する方法を挙げる ことができる。
ぐ工程 1〜4>
工程 1〜 4は上記 <ェ程 1 >で得られたモノマー（5)をュニットとして縮合伸 長反応することによってオリゴマ一を形成する工程である。 具体的には上記モノ マーのカルボキシル末端とァミノ末端の選択的脱保護反応 （工程 2、 3 ) とそれ に続く縮合反応 （工程 4) からなる反応サイクル （選択的脱保護-縮合サイクル） を反復することによって（選択的脱保護-縮合/反復サイクル）オリゴマ一（ポリ マー） を製造する工程である。
より詳細には選択的脱保護-縮合サイクルは下記のようにして実施される。
① まず上記く工程 1 >で生成される N, C-保護モノマ一（5)のカルボキシル保護 基であるべンジルエステル基を接触水素化反応によって脱離して、 フリーのカル ポキシル基を有する N -保護モノマー (化合物 6、 n=l)を生成する （工程 2) 。
②一方で、上記く工程 1 >で生成される N，C-保護モノマー (5)のァミノ保護基で ある t-ブチルォキシ力ルポ二ル基をトリフロ口酢酸などを用いた酸処理によって 脱離させて、フリ一のアミノ基を有する C-保護モノマ一 (化合物 7、 n=l)を生成す る （工程 3 )
③引き続いて、上記工程 2と工程 3の反応によって生成される化合物 6と化合物 7 とを、 HOBtと B0P試薬を用いたアミド結合形成反応によって縮合させることによつ て 2量体 (化合物 8、 n = 2)が生成される （工程 4)
上記の①〜③の工程サイクルを繰り返すことによつて、 力ルポキシル基とァミ ノ基が保護された P RNAオリゴマ一ができる （2回反復： 4量体 (化合物 11) 、 3回反復： 8量体 （化合物 14) ) 。
上記で得られた C-保護 P RNAオリゴマーについて、アミノ保護基及びカル ポキシル保護基を脱離させて、 フリ一のァミノ基及びカルボキシル基を有する P RNA 2 (r P NA)の調製は常法に従って行うことができるが、具体的には、 実施例 3に記載する方法を例示することができる。
以上、 反応式一 1または 2で示される方法によれば、 一般式 ( 1 ) において A がシングルポンドである本発明のヌクレオシド誘導体 ( 1 ) が製造できる。
P RNA 3の一例として、 Y基として式（i i i)で示される基を有するヌクレオシ ド誘導体 (1-i i i) ( 1 = 0の場合） は、 下記反応式一 3に示す方法に従って製造 できる。 反応式一 3
Figure imgf000026_0001
ェ程 1
(lb)
Figure imgf000026_0002
Ph
(3c)
(式中、 X、 R 1 , R 7はそれぞれ前記と同じ。 R 8は酸素原子または硫黄原子で ある。 ）
反応式— 3は、ァミノ基と力ルポキシル基の両方が保護されてなるアミノ酸 (化 合物 3b) のひ-アミノ基に、 5' - NH2 -ヌクレオシド誘導体 (化合物 lb)をその 5' -アミ ノ基を介して結合することによって、 ぺプチド主鎖にヌクレオシドが結合してな るモノマ一 (化合物 3c) を合成し（工程 1 ) 、 次いで得られたモノマー (3c)をュニ ットとして、 アミド結合形成反応を用いて伸長することによって本発明のヌクレ オシド誘導体（卜 i i i)を製造するものである （工程 2〜4) 。
なお、 アミノ酸のァミノ保護基及び力ルポキシル保護基は、 P RNA 2に関連 して前述するいずれの保護基をも使用できる。 ぺプチド主鎖として R 7が水素原 子であるアミノエチレングリシン (AEG)を用いる場合、 N末端及び C末端に保護 基を有する化合物として、 エチレンジァミンを出発原料として製造される Boc-AE G-OBnが好適に用いられる。
具体的には、 各工程 A， B及び Cは次のようにして実施される。
工程 Aにおいて、 2 -プロモェチルァミン (3a)に Boc基を導入する方法は、常法に 従って行うことができるが、 具体的には適当な溶媒に溶解した 2-プロモェチルァ ミン (3a)に二炭酸ジ- 1-ブチル（(Boc) 20)を滴下することによって実施できる。 こ こで溶媒としては、 ジォキサン、 THF、 ジメチルホルムアミド、 クロ口ホルム、 塩化メチレン等が使用できる。 なお、 2 -プロモェチルァミン（3a) 1モルに対する 二炭酸ジ-トブチルの配合割合は、 通常 1〜 2モル、 好ましくは 1 . 2モル程度で ある。 滴下は一 1 0〜2 0 °Cの範囲で行われるのが好ましい。
次いで反応液から常法に従って、 反応生成物 （N -保護化合物） が単離精製され る。 具体的には、 反応液から溶媒を除去した残渣に水を配合し、 得られた水層を クロ口ホルムなどの非極性有機溶媒で抽出する。 次いで有機層に移行した N-Boc- 保護化合物を力ラムクロマトグラフィ一などを利用して精製する方法が挙げられ る。
次いでアミノ酸のベンジルエステル誘導体を上記で得られた N-保護化合物と反 応させることによって、 アミノ酸のベンジルエステル誘導体のァミノ基にブトキ シカルポニル基が導入される （Boc-アミノ酸誘導体 - 0Bn、 N，C -保護アミノ酸誘導 体） （3b)。 かかる反応はクロ口ホルム、 塩ィ匕メチレン、 ジォキサン、 ジメチゾレホ ルムアミド、 ジメチルスルホキシド等の溶媒中で行うことができる。 なお、 N - Bo c_l， 2 -アミノエタン 1モルに対して用いられるジィソプロピルェチルアミン及び ブロモ酢酸ベンジルの配合割合は、それぞれ 0 . 5〜2モル程度、及び 1〜2モル 程度である。 反応は 0〜 6 の範囲で行われるのが好ましい。 通常かかる反応 は 0. 5 ~ 2 4時間で完結する。 上記の反応によって得られる反応生成物 （N，C-保護アミノ酸誘導体） （3b)は、 従来公知の慣用手段によって反応系内より分離され、 精製される。 かかる精製方 法としては、 再結晶法、 カラムクロマトグラフィー、 プレパラティブ薄層クロマ トグラフィー、 溶媒抽出法などを挙げることができる。
次いで工程 1において、 反応式一 1 (工程 1 ) の方法で合成される 5' - 2-ヌク レオシド誘導体 (lb)を上記で得られる N， C-保護アミノ酸誘導体 (3b)と反応するこ とにより、 N, C-保護 PRNA3モノマ一（3c) が製造できる。 この場合、 予め 5' - N¾- ヌクレオシド誘導体 (lb)を、 Ν, Ν' -カルボニルジイミダゾール (CDI)、ホスゲン、 , Ν' -チォカルポニルジイミダゾール（TCDI) またはチォホスゲンと反応させ、得ら れる反応生成物と上記の N， C-保護アミノ酸誘導体 (3b)と反応させることが好まし い。 かかる反応は DMF、 クロ口ホルム、 塩ィ匕メチレン、 ジメチルスルホキシド 等の非極性溶媒中で行うことができる。
なお、 5' - NH2-ヌクレオシド誘導体（lb) 1モルに対して用いられる上記 C D I 等の配合割合は、 通常 1〜 2モル程度、 好ましくは 1モル程度である。 かかる反 応は 5' - H2-ヌクレオシド誘導体（lb)の 3'友び/又は 2'の水酸基との副反応を抑制 するために、低温で行うことが好ましく、通常- 120〜O ：、好ましくは- 78〜- 40で の範囲で行われる。反応 0. 5〜2時間後に、 当該反応系を室温に戻し、 N, C-保護 アミノ酸誘導体 (3b)が添加される。 N, C-保護アミノ酸誘導体 (3b)の配合割合は、 5 ' - H2-ヌクレオシド誘導体 (lb) 1モルに対して通常 1〜 2モル程度、好ましくは ：!〜 1 . 5モル程度である。
上記の反応によって得られる反応生成物（N, C-保護 PRNA3モノマ一（3c) )は、従 来公知の慣用手段によって反応系内より分離され、 精製される。 かかる精製方法 としては、 再結晶法、 カラムクロマトグラフィー、 プレパラティブ薄層クロマト グラフィ一、 溶,出法及ぴ 沈殿法などを挙げることができる。 なお、 上記生 成物の単離及び精製は室温若しくはそれ以下の温度で行うことが好ましい。
次いで得られる N， C-保護 PRNA3モノマー（3c) のオリゴマー化は常法に従って行 うことができ、 例えば、 P RNA 2に関連して前述するように、 力ルポキシル保 護基の脱離工程 2、 ァミノ保護基の脱離工程 3、 及び脱 C保護物と脱 N保護物と をアミド結合形成反応によって縮合する工程 4からなる、いわゆる選択的脱保護 - 縮合サイクルを反復実施する方法、 固相合成法、 逐次縮合法及びフラグメント縮 合法等を挙げることができる。
なお、 式 （1 ) において、 Aがカルポニル基であるヌクレオシド誘導体は、 セ リン、 トレオニン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 シス ティン及びオル二チン、 δ—ヒドロキシリシン、 Ν—アミノエチルグリシン、 Ν —アミノエチルセリン、 Ν—アミノエチルリシン、 Ν—アミノエチルオル二チン、 Ν—アミノエチルァスパラギン酸、 Ν—アミノエチルグルタミン酸、 またはこれ らのォリゴマーもしくはポリマーを原料にして N， N' -力ルポ二ルジィミダゾール (CDI)またはホスゲンなどと反応させることにより、また Αがチォカルポニル基で あるヌクレオシド誘導体は、 上記上記アミノ酸誘導体またはこれらのオリゴマー もしくはポリマーを原料にして Ν， Ν' -チォ力ルポ二ルジィミダゾールまたはチォ ホスゲンなどと反応させることにより製造することができる。 本発明のヌクレオシド誘導体には、 一般式 ( 1 ) のヌクレオシド誘導体におい て、 — （Υ- ίΥ' ) ,) η- (但し、 1は 0〜5の整数、 ηが 1である。 ） で示され るアミノ酸、アミノ酸誘導体またはそれらの Ν末端のァミノ基が tert-ブトキシカ ルポニル基（Boc-基）や 9-フルォレニルカルポニル基（Fmoc_基）で保護されてな り、 C末端のカルボキシル基はフリ一か、 またはべンジルエステルで保護されて なるモノヌクレオシド誘導体 (PRNAモノマー) が含まれる。 9 -フルォレニルカル ポニル基（Fmoc -基）は、塩基性条件で可逆的に脱保護できるアミノ保護基である。 よって N末端が Tmoc-基で保護されてなる当該モノヌクレオシド誘導体は、 Fmoc - P R NAモノマ一（Fmoc-モノヌクレオシド誘導体）としてオリゴまたはポリヌク レオシド誘導体を固相合成するための原料として有用である。
当該 Fmoc-モノヌクレオシド誘導体 （Fmoc-PRNAモノマー） は、 前述する反応式 一 2に従って調製される化合物 5 (N, C-保護 PRNA2モノマー）または反応式— 3に 従って調製される化合物 3 c (N, C-保護 PR A3モノマー）を原料として、 まず N末 端の Boc -基を T F Aによって脱保護し、次いで Fmoc- Osu (N- (9-フルォレニルカル ポニルォキシ）スクシンイミド） を用いて Fmoc-基を導入することにより、 。末端 の力ルポキシル基がベンジルエステルで保護されてなるモノヌクレオシド誘導体 として調製することができる。 また C末端の保護基を接触還元等の常法に従って 脱離することによって力ルポキシル基がフリ一のモノヌクレオシド誘導体 (PRNA モノマー） 9が調製できる。 なお、 接触還元に用いる溶媒、 特に DM Fは遊離ァ ミンが含まれないように精製して用いることが好ましい。
本発明は、 上記 Fmoc-モノヌクレオシド誘導体、 特に Fmoc- PRNAモノマーの提供 により、 これを原料とするォリゴまたはポリヌクレオシド誘導体の固相合成法を 提供することができる。 該固相合成によれば、 本発明のオリゴまたはポリヌクレ オシド誘導体を装置を用いて自動的に合成することが可能となる。
なお、 本発明のオリゴまたはポリヌクレオシド誘導体の固相合成は、 上記 Fmoc -モノヌクレオシド誘導体（Fmoc - PRNAモノマ一）を単量体の原料として使用して、 従来公知のペプチド固相合成法 （例えば、 G. R. Marchal l, R. B. Merri f ield, " Bio chemical Aspects of React i ons on Sol id Supports ， Ed. by G. R. Stark, p. I l l 〜169， Academic Press, N. Y. (1971)など）に従ってカップリング及び脱離反応を 反復することにより行うことができる。 なお、 合成に使用する固相もまた従来公 知のペプチド固相合成法に使用される固相担体を広く用いることができる。また、 カツプリング反応は、ニンヒドリン試薬を用いたカイザー試験によって Fmoc-モノ ヌクレオシド誘導体（Fmoc-PRNAモノマー）の導入を逐次確認しながら行うことが 好ましく、 これによつて高い収率でオリゴまたはポリヌクレオシド誘導体を製造 することができる。 本発明のォリゴまたはポリヌクレオシド誘導体についての具 体的な固相合成法については、実施例に後述するが、基本的には Fmoc -モノヌクレ オシド誘導体 （Fmoc- PRNAモノマー） を固相担体に導入する工程 （工程 1 ) 、 Fmo c -ヌクレオシド誘導体 (Fmoc-PRNA) のァミノ保護基を脱離する工程 （工程 2 ) 、 該 N-脱保護ヌクレオシド誘導体の N末端に Fmoc-モノヌクレオシド誘導体 （Fmoc- PRNAモノマ一） を縮合させる工程 （工程 3 ) 、 工程 3のカップリング反応と工程 2の脱離工程を反復して逐次モノヌクレオシド誘導体 （PRNAモノマー） を伸長す る工程 （工程 4 ) 、 得られたヌクレオシド誘導体重合物を固相担体から切りだす 工程 （工程 5 ) によって、 製造することができる。 なお、 工程 3の後、 縮合反応 の進行度合を確認するためにカイザ一試験などの縮合反応確認試験を行うことも できる。 なお、 当該反応確認試験は、 縮合反応と交互に行うことによって、 確実 に Fmoc- PRNAモノマ一を縮合させて伸長させることができる。
本発明のヌクレオシド誘導体 (1) はアンチセンス法においてアンチセンス分 子として用いることができる。 この場合、 本発明のヌクレオシド誘導体はそのま まで用いることもできるが、 DNA配列や RNA配列または DNA/RNA誘導 体等の塩基配列の一部に組み込まれた態様で、 所謂キメラ分子として用いること もできる。 ここで DNAや RNAの誘導体には、 DNAや RNAなどの核酸と同 等な生理学的機能を有するものの他、 PN Aなどのアンチセンス分子として従来 公知の核酸誘導体など、 現在若しくは将来見出される核酸類似体が包含される。 例えば DN Aまたは RN Aの誘導体としては、 下式で示されるものを例示するこ とができる。
OH
Figure imgf000031_0001
(但し、 式中、 X及び R1は前記と同じ。 R 9は酸素原子または硫黄原子、 R1Qは O一、 S―、 NH2、 NHR11, NRUR12、 または R11を意味する。 またここで R 11及び R 12は同一又は異なって、 CH3、（CH2)nCH3、 （CH2)nNHZ、 (C H2)nNZZ，、または（CH2)nNH2である [Zまたは Z'は、同一または異なって、 メチル基、 ェチル基、 卜プロピル基、 n-プロピル基、 卜ブチル基、 i-ブチル基、 n -ブチル基等の炭素数 1〜 4の低級アルキル基であり、 nは 0〜10の整数であ る。 ]。 )
本発明のヌクレオシド誘導体は、 直接またはスぺーサーを介して、 DNA、 R N Aまたはそれらの誘導体に結合することができる。 かかる結合の様式は特に制 限されないが、 直接結合の場合、 ヌクレオシド誘導体の 3， 末端または 5， 末端 に DNAまたはそれらの誘導体の 5' 末端または 3' 末端が、 ホスホジエステル 結合、 メチルホスホネート結合、 メチルホスホノチォェ一ト結合、 ホスホロチォ ェ一ト結合、 アミド結合、 スルホアミド結合、 エチレングルコール結合、 チオフ ォ一マリレ結合などによって結合する様式を挙げることができる。 また、 本発明の ヌクレオシド誘導体がスぺーサ一を介して D NA、 RN Aまたはそれらの誘導体 と結合する態様として、 D NA、 RNAまたはそれらの誘導体の 5，一ァミノ基と ヌクレオシド誘導体のカルボキシル基とを、 メチレン基、 エチレン基、 プロピレ ン基、 ブチレン基、 等の炭素数 1〜1 0の低級アルキレン基の重合物 ( (CH2) n、 n = l〜10) 、 またはメチレンォキシ基やエチレンォキシ基等の炭素数 1 ~ 4の低級アルキレンォキシ基の重合物 ( (C H2 C H20) n、 (CH20) n、 n = l〜10) を介して結合してなるものを例示することができる。
なお、 このようなヌクレオシド誘導体と DNA、 RNAまたはそれらの誘導体 との結合は、 常法に従って行うことができる。
また、 本発明のヌクレオシド誘導体及び該誘導体を含む上記キメラ分子は、 例 えば緩衝剤、 安定剤、 希釈剤などの薬学的に許容される慣用の添加剤並びに担体 を配合して製剤として調製することもできる。 かかる製剤は、 人を含む各種の哺 乳動物に用いることができ、 目的に応じて各種の投与形態を採用することができ る。 かかる形態としては、 注射剤、 坐剤、 外用剤、 点眼剤、 点鼻薬、 カテーテル 投薬等の非経口製剤を挙げることができ、 これらは当業界で周知の方法によって 製造できる。 また本発明のヌクレオシド誘導体及び上記キメラ分子は農薬や植物 改質剤として植物細胞に対して適用乃至使用することができる 9 かかる場合も、 特に問わず、 錠剤、 カプセル剤、 液剤等の形態に調製することもできる。 実施例
以下に参考例及び実施例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。ただし、 本発明はこれらの実施例等によって何ら制限されるものではない。 なお、 実施例 においては、 例示として塩基 （X) としてゥラシル （ピリミジン核酸塩基） とィ ノシン （プリン核酸塩基） 、 またアミノ酸又はその誘導体 （Υ、 Υ，） としてダル タミン酸を主に用いているが、 他の核酸塩基及びアミノ酸又はその誘導体も同様 に使用することができる。
参考 l 5' -アミノ- 5' -デォキシゥリジン （5' - NH2- Urd) の製造 (1) 5' -アジド- 5' -デォキシゥリジンの製造
乾燥した DMF (120ml) にゥリジン （5.5g， 22.5nunol) 、 トリフエニルホスフ イン（11.8g， 45.0腿 ol)及びアジ化リチウム（5.51g， 112.6讓 ol)を溶解させた。 続いて撹拌条件下で、 四臭化炭素 （14.92g， 45.0腿 ol) を加え、 2時間撹拌した 後、 約 5 mlのメタノールを加え、 反応を停止した。 DMFを減圧留去した後、 残 渣をカラムクロマトグラフィー （silica gel; クロ口ホルム一メタノール（30: lv /v)) により精製し、 5'-アジド -5'-デォキシゥリジン（5.40 21.2mmol、 収率 9 4%) を得た。 白色固体。
リ max (Se board) /cm"1 ： 3370, 2080, 1690， 1270, 1100， 1060
(5H (270MHz ; DMS-d6) ： 3.59(2H,m, 5' -H), 3.92 (2H, in, 3' -H, 4'-H), 4.13(lH,q, J2.)r-J2.,3.=5.0， 2' -H)， 5.30 (1H, d， J ', 5.0, 3' -OH)， 5.50 (1H, d, JCH2.5.6, 2' - OH)， 5.67 (1H, d, J5;67.9, 5-H), 5.77 (1H, d， J .5.6, l'-H), 7.69 (1H, d， J6,57.9， 6-H), 11.38(lH,s,3-NH)
(2) 5' -ァミノ- 5' -デォキシゥリジンの製造
上記で得られた 5'-アジド -5'-デォキシゥリジン （2.51g、 9.33MO1) のメタノ —ル溶液 （100ml) 中に、 パラジウム担持炭素 Pd/C (10%、 約 0.25g) を添加した。 水素をパブリングさせながら （latm) 、 室温下で 2時間撹拌反応した。 次いで得 られた反応液を濾過してパラジウム担持炭素を除去し、 濾液を減圧下で蒸発留去 して、 残渣をメタノール-エタノールで再沈殿させることにより、 粉末状の 5 '-ァ ミノ- 5'-デォキシゥリジン （5'-皿2 - Urd) を得た （2.22g、 収率 98%) 。 白色固 体。
リ max (KBr disc) /cur1 ： 3400, 1680, 1640, 1500, 1460， 1270, 1120, 1050 XH MR (270MHz; DMS-d6)： (52.74(2H,m, 5' -H), 3.74(1H， q, J4.,3.=J4.,5.=4.6， 4'—H)， 3.92 (1H, t, J3',2'=J3.,4.=4.8， 3'一 H), 4.05 (1H， t, Ι2.;1.=Ι2.ι3.=5.5, 2'— H)， 5.11 (4H, b r,2'-OH,3'-OH,5'-NH2), 5.62 (1H, d, J5>67.8, 5-H), 5.75 (1H， d, Jr,2.5.6， Γ— H)， 7.87(lH,d, J6>58.0,6-H)
Found ： C.42.81; H.5.63; N, 16.98.
Calc. For C9H13N305- 1/2H20: C, 42.86; H,5.59; N, 16.66¾:FAB MS (NBA)： m/z 244 (M+H) 参考例 2 5' -ァミノ- 5' -デォキシシチジン （5' - N¾ - Cyd) の製造
ピリジン （200ml) 中に懸濁したシチジン （9.72g、 40.0mmol) をトリメチルク ロロシラン（25.6ml、 200M1O1) に添加した。 15分間撹拌した後、 ベンゾィルク 口ライド （23.2ml、 200画 ol) を添加し、 室温下で 2時間反応させた。次いで反応 混合液を氷浴中で冷却し、 水 （40ml) を添加した。 5分後、 28%アンモニア水溶 液 （40ml) を添加し、 混合液を室温下で 15分間撹拌した。 次いで減圧下で溶媒 を除去し、 アセトンを添加して白い固体物を沈殿させた。 該沈殿物を濾別して、 水で再結晶化して N4—ベンゾィルシチジン （13.3g、 96%) を得た。 当該 N4— ベンゾィルシチジン （13.0g、 37.4mmol) 、 トリフエニルホスフィン （28.0g, 10 7匪 ol) 及びリチウムアジド （13.0g,266mmol) を乾燥 DMF中で懸濁させ、 該懸 濁液の中に四臭化炭素（35.5 g、 107腿 ol)を添加した。 3時間室温で撹拌した後、 酢酸ェチル （1500ml) を添加し、 水と飽和食塩水 （各々 1000ml) で洗浄した。 有 機層を硫酸マグネシウムで乾燥させて、 溶媒を減圧下で蒸発させた。 残渣をメタ ノールで再結晶化して 5'-アジド- 5'-デォキシ -N4 -べンゾィルシチジン （12.4g， 収率 89%) を得た。 5'-アジド- 5'-デォキシ- N4-ベンゾィルシチジン （10.0g， 2 6.9mmol) のメタノール一 DMF (l:lv/v, 100ml)溶液を 10°パラジウム担持炭素 (約 l.Og)と共に、水素気流下で、激しく撹拌した。得られた混合液を濾過して、 濾液を減圧下で蒸発させて 5'-アミノ- 5' -デォキシ- N4 -ベンゾィルシチジンを 得た （9.04g、 収率 97%) 。
次いで得られた 5' -ァミノ- 5' -デォキシ- N4 -べンゾィルシチジン （8.5g, 24.5m mol) を 28%のアンモニア水溶液 (200ml) に溶解して、 24時間室温下で撹拌し た。得られた溶液を蒸発乾固し、アセトンを添加して 5'-ァミノ- 5'-デォキシシチ ジンを得た (5.76g，収率 97%) 。
レ max (KBr disc) /cm1 ： 3400, 1690， 1660, 1470, 1320, 1220, 1120
XH NMR (270MHz ; DMS0-d6) ： 52.75(2H,m, 5'-H), 3.71 (1H, q， J4,,3.=J4,,5.=4.9， 4'一 H), 3.86(m, J3.,2.=J3,,4,=5.4，3，— H)， 3.93 (1H, J ,=J2.,3.=4.4， 2' - H)， 4.95 (3H, b r,3'-OH,5'-NH2), 5.25(1H, br, 2'-0H), 5.7K1H, d, J5;67.3, 5-H) , 5.76 (1H, d, J,., 2.4.4,1'-H), 7.14(lH,br,4-NH2), 7.77(1H, d, J6>57.3, 6-H) Found ： C, 44.52; H,5.79; N,23.33.
Calc. For C9H14N404: C, 44.63; H,5.83; N, 23.13¾:
FAB MS (NBA): in/z 243 ( +H) 参考例 3 5' -ァミノ- 5'-デォキシイノシン （5'- ΝΗ2 - Ins) の
ィノシン 890mg(3.0画 ol)を減圧下にて一時間乾燥させた。 これにリチウムアジ ド 1.02g (21mmol) を加えてさらに一時間乾燥させた。 この反応容器に蒸留 DM F40mlを加え、 撹拌しながら約 10分減圧した。 さらにトリフエニルホスフィン 2. 20 g (8.4醒 ol)を加え、 トリフエニルホスフィンが溶解したのを確認後、四臭化炭 素 2.78 g (8.14腿 ol)を加えて反応を開始させた。 このとき、 溶液は黄色に変化し た。 8時間後、 TLCにより反応完了を確認してメタノールで反応をクェンチし た。 この溶液を減圧留去し残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー (移動相、 MeOH: CHC13=1 ： 5)により精製し、 5' -アジド- 5' -デォキシイノシンを得た。 単離収量 775mg、 単離収率 88%。
次に、 得られた 5'-アジド- 5'-デォキシイノシンをメタノールに溶解し、 パラ ジゥム担持炭素 Pd/C (10%, 80mg) を触媒として水素により 12時間還元し 5' -ァ ミノ- 5' -デォキシイノシンを得た。 収率 91%。
¾ NM (270MHz; 画- ) ： <53.61(m, 2H), 4.10(m, 8H), 4.63(m, 2H), 5.40(d,
1H), 5.63(d, 1H), 5.90(d, 1H), 8.08(s, 1H) :
IR (KBr) n 1610, 1695 cm"1 ：
MS (FAB)： m/z 267 (M+, 39.4):
UV (phosphate buffer) Amax ( ε ) 258nm 参考例 4 5 '-アミノ- 5' -デォキシチミジン （5， - NH2-Thd) の製造
チミジン 2.42g(10.0匪 ol)を減圧下にて一時間乾燥させた。これにリチウムアジ ド 2.20g (4.5eq) を加えてさらに一時間乾燥させた。 この反応容器に蒸留 DMF 50mlを加え、 撹拌しながら約 10分減圧した。 さらにトリフエニルホスフィン 3.41 g (1.3eq)を加え、 トリフエニルホスフィンが溶解したのを確認後、四:^匕炭素 4. 97g(1.5eq)を加えて反応を開始させた。 このとき、 溶液は黄色に変化した。 40 分後、 TLCにより反応完了を確認してメタノールで反応をクェンチした。 この 溶液を減圧留去し残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (移動相、 MeOH： C HC13=1 ： 9)により精製し、 5'-アジド- 5'-デォキシチミジンを得た。
^- MR (DMSO, 270MHz) ： 51.79(s,3H), 2.01-2.32 (m, 2H) , 3.56 (d, J=5.4Hz, 2H) , 3.83(q,J=Hz, IH), 4.19(m, IH), 5.42(d,4.4Hz,lH), 6.20(t, J=6.84Hz, IH), 7.5 0(s，lH)， 11.35(s,lH)
次に得られた 5'-アジド -5'-デォキシチミジンをメタノールに溶解させ、 10% パラジゥ ムノカーボンを触媒とし水素により還元し 5'-ァミノ- 5'-デォキシチミ ジンを得た。 収量 1.734g、 収率 71.6%;
^-NMR (DMSO, 270MHz) ： <51.78(s， 3H)， 1.96-2.19 (m, 2H), 2.62-2.76 (d, J=5.37 Hz,2H), 3.64(q, IH), 4.19(m, IH), 6.14(t, J-6.84Hz, IH), 7.66(s,lH)' 実施例 1 ポリ（N Ύ - (5' -デォキシ- 5' -ゥリジル) - L -ダル夕ミン） （PRNA1 ) ペンタクロロフェニルトリクロ口アセテート （0.454g， 1. lOmmol) 及びジイソ プロピルェチルァミン （0.1741111，1.00讓01) をポリ （レグル夕ミン酸） (0.129g) の DMF (20ml) 溶液に、 0°C下で撹拌しながら注意深く添加した。 1時間後、 得られた反応液に参考例 1の方法に従って製造した 5' -ァミノ- 5' -デォキシゥリ ジン （0.267g, l.lOmmol) を添加し、 60°Cで 10時間加熱した。 次いで、 溶媒 を減圧下で除去して、 残渣にエタノールを添加してポリ （Nr （5'-デォキシ- 5' -ゥリジル) - L-グルタミン） を得た （0.314g) 。 白色固体。
UV(H20, H7.2) Amax=262nm (ε=9.8Χΐ03) ；
リ max (KBr disc) /cm"1 ： 3350, 3100, 2900, 1680， 1540, 1460, 1390， 1260 XH NMR (270MHz ; DMS0-d6)： 61.88(2H,br, j8 -CH2) , 2.15(2H,br, r -CH2) , 3.34 (1. 81H,br,5'-H), 3.80(1.85H， m, 3' - H, 4'— H), 4.07(0.92H, br, 2' -H), 4.22(lH,br, α-CH), 5.17(0.93H,s,3'-OH), 5.40(0.93H, s, 2' -OH) , 5.67(0.93H，br， 5 - H), 5. 72(0.93H,br,l'-H), 7.65(0.92H,br, 6-H), 8.01 (1.90H,m, a-NH,5'-NH), 11.33 (0.93H, br, 3-NH)
Found ： C, 46.97; H,5.30; N, 13.47.
El.Anal.Calcd. For (Cl4H18N407)。.53(c5H7N03)。.47: C.47.01; H,5.28; N, 13.48¾: 実施例 2 P RNA 2
下式の反応式に従って、オリゴ（ァ- L -グルタミン酸）骨格を有するペプチドリ ポ核酸 (P RNA 2 ) を製造した。
Figure imgf000037_0001
(1) N4- 1-ブトキシカルボニル- Ν5- (5' -デォキシ -5' -ゥリジル) - L -ィソグルタミ ンベンジルエステル （Boc- isoGln (5' U)- OBzl) (化合物 5 ) の製造
ァミノ末端を t-ブトキシカルポニル基、 カルボニル基をべンジルエステル基で 保護したグルタミン酸: N - 1-ブトキシカルボ二ル- L -グルタミン酸 ァ-ベンジルェ ステル (Boc- isoGln - OBzI) (2. 52g， 7.47mmol) , HO B t (l. Olg, 7.47匪01)及び O P試薬 (ベンゾトリァゾ一ル-卜ィルォキシトリス（ジメチルァミノ）ホスフォリ ゥム へキサフルォロホスフェート） （3. 30g, 7.47讓01)を溶解した0 溶液（1 00ml) 中に、 ジイソプロピルェチルァミン（1. 30ml, 7, 47腿 ol)を添カ卩した。 3 0 秒間、 0 で撹拌した後、参考例 1で製造した 5' -ァミノ- 5' -デォキシゥリジン（1 b) (2.00g, 8. 22匪 ol)を添カ卩し、 該反応混合液を室温で 1時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減圧留去し、得られた残渣を酢酸ェチル (200ml)中に懸濁させた。該懸濁液 を等容量の 4 %炭酸水素ナトリゥム、 5 %硫酸水素力リゥム及び飽和食塩水で十 分洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して、減圧下で濃縮した。 得られた残渣をカラムクロマトグラフィー （固相：シリカゲル、 移動相：クロ口 ホルム-メタノール (30:1 v/v)) で精製し、 粉末状の Boc- isoGln(5'U)- Obzl (化合 物 5、 iPl) を得た (3.70g, 88%) 。
リ max (KBr) /cm"1 : 3420、 1680, 1520, 1460, 1390, 1250, 1170
'H-NMR (270MHz ; DMSO— d6) ： 51.37(9H,s, t-Bu-H), 1.77-1.88(2H,m, /3-CH2), 2. 36(2H, t, JT;^7.8, r-CH2), 3.29 (2H,m, 5' -H) , 3.83 (2H, m, 3' -H, 4' -H) , 3.94(1 H， Q,
Figure imgf000038_0001
2' -H)， 5.07 (2H, s， Ph CH2)， 5.18(lH，d，JOI .=4.9，3'—OH)， 5.40(1H, d, JOH>2.=5.4, 2' -OH), 5.63(1H, d, J5>6 8.3, 5-H) , 5.74(lH,d,Jr)2.=5.9, l'-H), 6.94(1H， d， , CH=7.8， Boc - NH)， 7.35(5 H, m, Ar-H) , 7.64QH, d, J6;5=7.8, 6-H), 8.00(1H, t， ,5.=5.6， 5' - NH), 11.35(1H, s,3-NH),
Found ： C 55.06; H,6.02; N,9.76.
Calc. For C26H34N4010-1/4H20： C 55.07; H,6.13; N,9.88¾:
MALDI-TOF HRMS(a-CHCA), m/z found 585.220 (M+Na) , calculated 585.217
(2) Na-t-ブトキシカルポニル- N5— (5' -デォキシ- 5' -ゥリジル) - L-ィソダル夕ミ ン （Boc - isoGln(5'U)— 0H) (化合物 6、 n=l)の M (i)
上記で得られた Boc- isoGln(5'U)-0Bz 1 (1.80g, 3.20mmol) (5)のメタノール溶 液 (50ml)にパラジウム担持炭素 （10%， 約 0.2g) を添加した。 水素雰囲気下 (lat m)で 2時間継続的に撹拌した後、反応液を濾過して濾液を減圧留去して、粉末状 の Boc- isoGln(5'U)-0Hを得た (1.44g, 収率 95%) 。
リ max (KBr) /cm—1 ： 3320, 1680， 1530, 1460, 1390， 1250, 1170
¾-NMR (270MHz； DMS0-d6) ： 51.37(9H,s, t-Bu-H), 1.69-1.82(2H,m, ^-CH2), 2. 19(2H, t, JT;(3=7.3, r-C¾), 3.29-3.39 (2H, ,5'-H), 3.83(2H， m, 3' - H， 4' - H)， 3. 92 (1H, q,
Figure imgf000038_0002
2' -H), 5.63(1H, d, J5i6 8.3, 5-H) , 5.73(lH,d, J >2.=5.9, l'-H), 6.92 (1H， d， J皿， CH=8.3, Boc—NH), 7.65 (1H, d, J6>5=7.8, 6-H)， 7.98 (1H， t, ,5.=5.4, 5' -NH), 11.35 (1H, s， 3-NH)， MALDI-TOF HRMS(CK-CHCA), m/z found 495.17 (M+Na), calculated 495.170
(3) N5-(5，-デォキシ- 5'-ゥリジル)- L-イソグルタミンベンジルエステル' トリ フルォロ酢酸塩 (TFA- isoGln(5'U)-0Bzl) (化合物 7， n=l)の製造 (ii) 上記（1)で得られた Boc - isoGln(5'U) - OBzl (1.80g， 3.20讓 ol) (5)を TFA(10 ml)に溶解し、該溶液を Ot:で 30分間放置した。次いで TF Aを減圧留去して、ェ ステルを 200ml 添加して粉末状の TFA* isoGln(5' U)- OBzlを得た （1.81g, 収率 9 8%) 。
max (KBr) /cnf1 :3420、 1680, 1560， 1460, 1270, 1200, 1130
Ή—NMR (270MHz; DMS0-d6) ： (51.97(2Η,ιπ, |8-CH2), 2.44(2H, ί, Jr,e=8.1, r~CH2), 3.82 (3H, m, NH3 +CH, 3' -H, 4'一 H) , 4.11 (1H, q,
Figure imgf000039_0001
2， 2'一 H) , 5.08 (2H, s, P hC¾) , 5.24(lH,d, J0H_3.=4.9, 3' -OH), 5.47(lH,d, J0H>2-=5.4, 2'-0H), 5.63(lH,d, J 5,6=8.3， 5— H)， 5.75(lH,d, J,.i2.=5.4,l'-H), 7.36(5H,m, Ar-H), 7.66(1H, d, J6>5=8. 3, 6-H), 8.10(3H,br,NH3 +), 8.62(1H, t, 1¾5.5.4,5'-NH), 11.37(1H, s, 3-NH), MALDI-TOF HRMS(o!-CHCA), m/z found 463.178(M-CF3C00), calculated 463.183 (4) 2量体 (Boc-(isoGln(5'U)) 0Bzl) (化合物 8)の 方法 (iii)
上記 (2)で得られた Boc- isoGln(5'U)- OH (化合物 6) (1.25g, 2.65mmol)、 HOB t (0.358g, 2.65腿01)及び80?試薬（1.173， 2.65腿 ol)を溶解した DMF溶液 (50ml) 中に、 ジイソプロピルェチルァミン (0.97ml， 5.57腿 ol)を添カ卩した。 3 0秒間 0 °Cで撹拌した後、上記 (3)で得られた TFA' isoGln(5' U) -OBzl (化合物 7) (1. 68g, 2.92腿 ol)を添加し、 該反応液を室温で 2時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減 圧留去し、 得られた残渣をカラムクロマトグラフィー （固相：シリカゲル、 移動 相：クロ口ホルム-メタノール（10:lv/v))で精製し、粉末状の Boc- (isoGln(5'U)) 2— OBzl (化合物 8、 n=2)を得た （1.70g, 収率 70 %)
リ max (KBr) /cm—1 ： 3420, 1680, 1540, 1380, 1270, 1200
Ή- MR (270MHz； DMS0-d6) ： (51.36 (9H, s, t-Bu-H)， 1.80 (4H, m, /3-C¾) , 2.15(2 H，Ur, .1, r-CH2), 2.35C2H, t, Jr>^7.8,ァ— CH2)， 3.83(5H, m,Boc- HCH, 3'-H and 4'-H)， 4.03(2H,q, J2. =J2.3.=4.4，2，— H)， 4.26(111, q, ，^ ^ァ.3， a— C H), 5.06(2H,s,PhCH2), 5.16 (2H, s, 3' -OH) , 5.39 (2H, d, JOH>2.=4.4, 2' -OH), 5.62 (lH,d, J5, 6=8.3, 5-H), 5.64(lH,d, J5>6=7.8, 5-H), 5.73(2H, d, Jr>2.=5.9, 1' -H) , 6. 85(1 H， d, J亂 CH=8.3， Boc - H)， 7.35(5H, m, Ar-H), 7.63(1H, d, J6>5=7.8, 6-H), 7.64 (lH,d, J6i5=7.8,6-H), 7.95(2H, m,5'-NH), 8.14(1H, t，； ^,^=10.7， a— NH)， 11.33 (2H， s, 3 - NH)；
MALDI-TOF HR S (α-CHCA), ra/z found 939.339 ( INa) , calculated 939.335
(5) 2量体 (Boc-(isoGln(5'U))2-0H) (化合物 9， n=2)の製造方法 （i)
上記で得られた Boc-(isoGln(5'U) )2-0Bzl (0.850g, 0.927匪 ol) (8)のメタノー ル溶液 (50ffll)にパラジウム担持炭素（10，約 O.lg) を添加した。水素雰囲気下 (1 bar)で 4時間継続的に撹拌した後、反応液を濾過して濾液を減圧留去して、粉末 状の Boc-(isoGln(5'U))2-OH (化合物 9)を得た (0.736g, 収率 96 。
リ max (KBr) /cm"1 ： 3390, 1680, 1540, 1470, 1390, 1280
Ή-NMR (270MHz； DMS0-d6) ： δΐ.37 (9Η, s, t-Bu-H) , 1.67-1.81 (4H, m, j3— CH2)， 2.14(4H，m，ァ— CH2), 3.58(4H, m,5'-H), 3.92 (4H,m, 3' -H and 4'-H), 4.03-4.24 (3H, m, 2' -H and Boc-NHCH)， 4. 2 (1H, q, JCHiNH=JCHi β=Ί.1, α-CH)， 5.17-5.39 (4H， m,2'-0H and 3' -OH), 5.67(2H, d, J5_6-8.3, 5-H), 5.86 (2H, d, J,.>2.=7.8,1'-H), 6. 99 (1H, d,
Figure imgf000040_0001
6-H), 7.88(2H,m, 5' -NH), 8.16 (lH,m, a— NH), 11.35 (2H, s, 3-NH) ;
MALDI-TOF HRMS ( a -CHCA) , m/z found 849.293 ( +Na), calculated 849. 88.
(6) 2量体 (TFA-isoGln(5'U)2-OBzl) (化合物 10, n=2)の^ i (ii)
上記 (4)で得られた Boc- (isoGln(5'U))2- OBzl (化合物 8) (0.85g, 0.927腿 ol) を TFA(5ml)に溶解し、該溶液を 0でで 30分間放置した。次いで TFAを減圧留去 して、 エーテルを 100ml 添加して粉末状の TFA · isoGln(5'U)2- OBzl (化合物 10)を 得た （0.846g， 収率 98%) 。
リ max (KBr) /cm—1 ： 3420, 1680, 1540, 1470, 1280, 1200, 1140;
-NMR (270MHz； DMS0 - d6) ： δ 1.89(4H，m， ]3- C ), 2.25-2.34(4H,m, r-CH2), 3. 59 (4H, m,5'-H), 3.86(6H,m,NH3 +CH, a-CH,3'-H, 4'— H)， 4.11 (2H,m， 2'— H)， 5.08 (2H， s, PhC¾) , 5.20 (2H, m, 3' -OH)， 5.70 (2H, d, J5,6=7.8， 5-H) , 5.77 (2H, d, J =5. 9, l'-H), 7.36(5H,m, Ar-H), 7.89(1 Η,ΒΙ, 5' -NH), 8.10(4H,m, a—皿, N¾+)， 8.56 (1H, DI,5'-NH), 11.32 (2H, s, 3-NH) ;
MALDI-TOF HRMS(a-CHCA), m/z found 817.296 ( -CF3C00) , calculated 817.30 1.
(7) 4量体 (Boc-(isoGln(5'U))4-0Bzl) (化合物 11)の製造方法 (iii) 上記 (5)で得られた 2量体 Boc-isoGln(5'U)2 - OH (化合物 9) (0.662g, 0.801讓 o 1)、 HOB t (0.108g, 0.801腿 oi)及び B〇P試薬 (0.354g, 0.801miol)を溶解し た DMF溶液 (30ml) 中に、 ジイソプロピルェチルァミン (0.29ml， 1.68匪 ol)を 添加した。 30秒間 0°Cで撹拌した後、 上記 (6)で得られた TFA' isoGln(5'U)2-0 Bzl( ^ llO) (0.82g, 0.881腿 ol)を添加し、 該反応液を室温で 2時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減圧留去し、 得られた残渣をカラムクロマトグラフィー 個相： シリカゲル、 移動相：クロ口エタノールを添加して、 粉末状の 4量体 Boc- (isoGl 11(5'[0)4-0821(化合物10を得た （I.22g, 収率 94%)
レ max (KBr) /cm"1 ： 3300, 1680, 1540, 1460, 1390, 1270, 1080;
¾-NMR (270MHz； DMS0-d6) ： δ 1.37(9H, s, t-Bu-H), 1.71-1.82(8H,m, i3-CH2), 2.14(6H,m， ァ- CH2), 2.35 (2H, t, J >/3=7.6, r-C¾), 3.26-3. 4(8H,m, 5' -H), 3.83 (9H,m, Boc-NHCH, 3' -H and 4'-H), 4.0 (4H, m,2'-H), 4.22(3H,m, a-CH), 5.06(2 H,s,PhCH2), 5.16(4H,d, J0H,3.=4.4, 3' -OH), 5.39(4H, d, JOH,2.-5. , 2' -OH) , 5.65(4 H， d, J 5,6=7.3, 5-H)， 5.73 (4H, d, J 2 3.9, 1'一 H)， 6.87 (1H, d, J華 =7.8， Boc-NH) , 7.35 (5H,m, Ar-H), 7.65(4H， d, J6,5=8.3, 6 - H), 7.96(4H, m,5'-NH), 8.12(3H,m, a~ NH), 11.34(4H,s,3-NH);
MALDI-T0F HRMS(Q;-CHCA), m/z found: 1647.57 (M+Na) , calculated 1647.570. (8) 4量体 (Boc-(isoGln(5'U))4-0H) (化合物 12)の製造方法 （i)
上記 (7)で得られた Boc- (isoGln(5'U))4- OBzl (0.600g, 0.369画 ol) (11)のメ 夕ノール - DMF溶液 (1:1 v/v、 30ml)にパラジウム担持炭素（10，約 0. lg) を添加 した。 水素雰囲気下 (lbar) で 4時間継続的に撹拌した後、 反応液を濾過して濾 液を減圧留去して、粉末状の 4量体 Boc- (isoGln(5'U))4-0H (化合物 12)を得た（0. 550g, 収率 97 。
レ max (KBr) /CDT1 ： 3420, 1680, 1540, 1490, 1380, 1210, 1130;
Ή—NMR (270MHz； DMS0 - d6) ： δΐ.37 (9Η, s， t-Bu-H) , 1.69-1.82 (8H, m, β— CH2)， 2. 15 (8H, m, r— C ) , 3.85 (9H， m, Boc-NHCH, 3' -H and 4' - H) , 4.04 (4H, , 2'-H), 4.2 0(3H,m, -C ), 5.21 (4H, br, 3' -OH), 5.37(4H, br, 2' -OH), 5.64(4H, d, J5,6=7.8, 5 - H), 5.73(4H,d， J 2,=5.9, Γ - H)， 6.87(lH,d,
Figure imgf000041_0001
BOC-NH), 7.65 (4H， d， J6,5 =8.3, 6-H), 7.95(4H,m,5'-NH), 8.13 (3H， m， α -赚， 11.33(4H, s, 3- H) ; MALD I -T0F HRMS ( -CHCA) , m/z found 1557.52(M+Na), calculated 1557.523.
(9) 4量体 (TFA-isoGln(5'U)4-0Bzl) (化合物 13)の製造 (ii)
上記（7)で得られた Boc-(isoGln(5'U)) 4- OBzl (化合物 11) (0.600g, 0.369腿 ol) を TFA (5ml)に溶解し、該溶液を 0でで 30分間放置した。次いで TFAを減圧留 去して、 エーテルを 100ml添加して粉末状の TFA · isoGln(5' U) 4- OBzl (化合物 13) を得た (0.593g, 収率 98%)
max (KBr) /cm—1 ： 3420, 1680， 1540, 1460, 1390, 1270, 1130
'H-NMR (270MHz； DMS0-d6) : 6\.76-1.89 (8H, m, β— C¾)， 2.13—2.25 (6H, m, γ— C¾)， 2.34C2H, t, Jr>^8.3, r-CH2), 3.83 (9H, m, NH3 +CH, 3' -H and 4'-H), 4.05-4.22(7 H,m, α-CH and 2'-H), 5.06(2H， s,PhC¾), 5.16(3H,m, 3'-0H), 5.24(1H， d， J0H,3.= 4.9, 3' -OH) , 5.42(3H,m,2'-0H), 5.48(1H, d, JOH,2.=5.4,2'-OH), 5.64(4H,m, 5-H), 5.73(4H,m, l'-H), 7.35 (5H, m, Ar-H) , 7.66(4H,ra, 6-H), 7.95(3H,i, 5' -NH), 8.1 3(6H,m, a-NH and H3 +), 8.61 (lH.m, 5' -NH), 11.35 (4H,m, 3-NH) ;
MALDI-TOF HRMS (a -CHCA), m/z found 1548.52 (M-CF3C00+Na) .calculated 154 8.526.
(10) 8量体 (Boc-(isoGln(5'U))8-0Bzl) (化合物 14)の製造方法 (iii)
上記（8)で得られた 4量体 Boc - isoGln(5'U)4-0H (化合物 12) (0.468g, 0.305讓 o 1) > HOB t (0.041g, 0.305醒 ol)及び BOP試薬 (0.135g, 0.305腿 ol)を溶解し た DMF溶液 (30ml) 中に、 ジイソプロピルェチルァミン（0.11ml, 0.641腿 ol) を添加した。 30秒間 0でで撹拌した後、 上記 (9)で得られた TFA · i soGln(5' U) 4 -OBzl (化合物 13) (0.550g, 0.335腿 ol)を添加し、 該反応液を室温で 4時間撹拌し た。 反応後、 溶媒を減圧留去し、 メタノールを添加して、 粉末状の 8量体 Boc_(i soGln(5'U))8_0Bzl (化合物 14)を得た （0.854g, 収率 92%) 。
レ max (KBr) /cm"1 ： 3420, 1680， 1530, 1460, 1400, 1270, 1130;
'H-NMR (270MHz； DMS0-d6) ： <51.37(9H,s, t-Bu-H), 1.71-1.82 (16H, m, i3-C¾), 2.14(14H,m, r-CH2), 2.34(2H, t, Jr>0=7.8, r-C¾), 3.25-3.42 (16H,m, 5'-H), 3. 83(17H,m,Boc-NHCH,3'-H and 4'-H), 4.05 (8H，m， 2' - H)， 4.20(7H,m, a-CH), 5.0 6(2H,s,PhCH2), 5.15(8H, d, J0H,3.=3. , 3' -OH) , 5.39(8H,d， JOH,2.=5.4，2，— 0H)， 5.6 4(8H, d, J5>6=7.8， 5-H)， 5.73 (8H, d, J,.>2.=5.4， l'-H), 6.87 (1H， d， Jra,CH=7.3, Boc-N H)， 7.35(5H, in, Ar-H), 7.64(8H,d, J6>5=7.8, 6-H), 7.95(8H, m,5'-NH), 8.13(7H, m, -NH), 11.33(8H, s, 3-NH) ;
MALDI-TOF HRMS(cx-CHCA), m/z found 3064.04(M+Na), calculated 3064.041. (11) 8量体 (Boc-(isoGln(5'U))80H) (化合物 15)の製造方法 (i)
上記 (10)で得られた 8量体 Boc_(isoGln(5'U))8-0Bzl (化合物 14) (0.800g, 0.2 63Dimol) のメタノール- DMF溶液 (l:3v/v、 50ml)にパラジウム担持炭素 （10 ， 約 O.lg) を添加した。 水素雰囲気下 (lbar) で 6時間継続的に撹拌した後、 反応 液を濾過して濾液を減圧留去して、 C末端のベンジル保護基が脱離した、 粉末状 の Boc -（isoGln(5'U))8-0H (化合物 15)を得た （0.745g， 収率 96 。
リ max (KBr) /cm—1 ： 3410, 1680， 1540, 1470, 1390, 1260, 1110
¾-NMR (270MHz； DMS0-d6) ： 61.37(9H,s, t-Bu-H), 1.70-1.82(16H,m, j3-C¾), 2.15(16H，m,ァ -CH2), 3.83(17H,m,Boc-NHCH, 3'-H and 4' -H) , 4.05 (8H，m， 2'— H), 4.19(7H,in, ¾-CH), 5.18(8H,m, 3' -OH), 5.29(8H,m, 2' -OH), 5.65(8H, d, J5>6= 7.8, 5-H), 5.73(8H, d, Jr>2.=5.9, 1' -H), 6.88(1H, d，； [冊, CH=8.8，Boc -冊）， 7.65 (8H, d, J6>5=8.3,6-H), 7.95(8H,i,5'-NH), 8.14(8H,m, CK-NH), 11.33(8H, s, 3-NH) ; MALDI-TOF画 S(a - CHCA), m/z found 2973.99(M+Na), calculated 2973.994. 実施例 3
下記の反応式に従って、 フリ一の N末端を有する P RNA 2を調製した。
15
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
(1) Boc- (isoGln(5'U)8- Lys(CIZ)- Bzl (化合物 16) の製造方法 （i)
上記実施例 2 (11)で得られた8量体80じ-（1306111(5'11))8-011(化合物15) (0.700 g, 0.237薩 ol) 、 HOB t (0.032g, 0.237讓 ol)及び BOP試薬 (0.105g， 0.237m mol)を溶解した DMF溶液 (30ml) 中に、 ジイソプロピルェチルァミン（0.04ml， 0.237腿 ol)を添加した。 30秒間 0。Cで撹拌した後、 Nし 2-クロ口べンジルォキ シカルポニル- 0-ベンジル- L-リジン (0.106g.0.261蘭 ol)を添加し、 混合液を室温 で 4時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減圧留去し、 メタノールを添加して、 粉末状 の Boc -（isoGln(5'U)8-Lys(CIZ)-Bzl (化合物 16)を得た (0.712g, 収率 90%) 。 max (KBr) /cm—1 ： 3330, 1680, 1540, 1470, 1390, 1270, 1130
'H-NMR (270MHz； DMS0 - ） ·· δ 1.36 (13H, m, t-Bu-H, r— CH2 (Lys) and δ一 CH2 (Lys)), 1.57-1.84 (18H,m, jS-CH2(Glu) and )3-CH2(Lys)) , 2.14(16H, m, /3-CH2(Glu)) , 2.98(2H,m, ε— CH2(Lys))， 3.83 (17H, m, Boc-NHCH, 3'-H and 4'-H), 4.05(8H,m,2 '-Η), 4.20(8H,m, a-CH), 5.07(2H, s,PhCH2), 5.08 (2H, s, Cl-PhCH2) , 5.16(8H, d, J0Hi3.=3.9,3'-0H), 5.39(8H,d, J0„,2.=5.4, 2' -OH) , 5.65(8H, d, J5,6=7.8, 5-H) , 5. 73 (8H, d, J,.,2.=5.9, l'-H), 6.87(1H， d, ;^^=7.3,Boc—NH), 6.99(1H, m, ε - NH(Ly s))， 7.35(5H, ni, Ar-H(Bzl)), 7.45(4H，m，Ar- H(C卜 Z))， 7.65 (8H, d, J6;5=7.8, 6- H), 7.96(8H, m,5'-NH), 8.14(8H,m, ~M), 11.33(8H, s, 3- H) ;
MALDI-T0F HRMS(o!-CHCA), m/z found 3360.13(M+Na), calculated 3360.134 (2) HCl'(isoGln(5'U)8-Lys - OH (化合物 17) の製造方法 (ii)
上記（1 )で得られた Boc - (isoGln(5'U) 8 - Lys (CIZ)-Bzl (化合物 16) (0.300g, 0.0 90廳 ol)を TFA(lOml)に溶解し、該溶液を-窒素雰囲気下で一10 の状態で保存 した。チオア二ソール（1.84ml, 15.7腿01)、 m -クレソール (0.97ml， 9.27蘭 )及び トリメチルシラルトリフラート（3.00ml, 16.6讓 ol)を逐次的に添加し、 該混合液 を 0 で 1時間撹拌した。 エーテル（200ml) を添加し、沈殿物を濾過した。沈殿 物を 5%アンモニア水溶液に溶解した。 30分後、 溶媒を減圧下留去し、 残渣を ジォキサン中の 4M塩酸で 30分間処理した。 溶媒を減圧留去し、 残渣をゲルろ過 及び逆相 HPLCで精製して、 粉末状の HC l-(isoGln(5'U) 8-Lys-0H (化合物 17)を 得た （0.223g、 収率 82%) 。
リ max (KBr) /cm—1 ： 3420, 1680, 1540, 1460, 1390, 1270, 1110;
¾-NMR (270MHz； DMS0-d6) ： δ 1.35 (4Η, ra， γ— CH2 (Lys)， δ— CH2 (Lys) )， 1.70-1. 83(16H,m, )3-CH2(Glu)) , 2.14(16H，m，ァ- CH2(Glu))， 2.98(2H, m, ε- CH2(Lys))， 3.84(17H,m,NH3 +CH,3'-H and 4'-H), 4.06(8H, m,2'-H), 4.20(8H，m， ひ一 CH)， 5.1 7(8H,m,3'-0H), 5. 1 (8H,m, 2' -OH), 5.65 (8H, d, J5i6=7.8, 5-H) , 5.73(8H, d， J 2，= 5.9, l'-H), 7.24(2H,br, ε-Μ2), 7.65(8H, d, J6,5=7.8, 6-H), 7.95(7H, m,5'-NH), 8.14(llH,m, a-NH and NH3 +), 8.59 (1H, m, 5' -NH) , 11.34 (8H, m, 3-NH)；
MALDI-T0F顧 S(a— CHCA)， m/z found 2980.86(M-HC1), calculated 2980.055. 実施例 4 Boc-AEG(5'U) - OBnオリゴマー （PRNA3) の製造
(1) Boc - AEG- OBnの製造
Boc- AEG- OBnを下記の反応式に従って製造した。
撃' '簡 2 (Boc)20 H
Figure imgf000045_0001
、 ,N 。vph dioxane CH2CI2 0 H 0
Boc-AEG-OBn
① N - BOC - 1， 2-アミノエタンの合成
エチレンジァミン （52.5g，874un ) のジォキサン (300ml)溶液に、 撹拌条件下 で二炭酸ジ- 1-ブチル （(Boc)20) のジォキサン （300ml) 溶液を 10時間かけて滴 下した。 滴下終了後、 24時間撹拌を続けた。 反応終了後、 ジォキサンを減圧留去 し、残渣に水 400mlを加えた。不溶固体を濾過により除去した後、水層をクロロホ ルム（500mlX4)で抽出した。 有機層は一つにまとめ、 硫酸マグネシウムにより 乾燥させた。 乾燥後、 濾液を減圧濃縮し、 カラムクロマトグラフィー (silica ge 1； クロ口ホルム -メタノール（10:1 v/v))により精製し、 N - Boc- 1，2-アミノエタン (14.6g,91.4mmoU 収率 8 (Boc 20基準)） を得た。 白色固体。
② Boc- AEG-OBnの合成
得られた N - Boc- 1， 2 -アミノエタン (4.64g, 29.0腿 ol)とジィソプロピルェチルァ ミン (4.50g， 34.8匪 ol)をクロ口ホルム (40ml)に溶解させ、 撹拌条件下、 ブロモ酢 酸べンジル (6.57g, 28.7mmol)のク口口ホルム（30ml)溶液を 1時間かけて滴下し た。 滴下終了後、 24時間撹拌を続けた。 溶媒を減圧留去後、 残渣をカラムクロマ トグラフィ一（silica gel; 酢酸ェチルのみ）により精製し、 Boc- AEG-OBn (7, 00g. 22.7mmol, 収率 79%) を得た。 無色液体。
δ H (270MHz； DMS0 - d6) ： 1.31 (9H, s, t-Bu-H) , 2.49 (2Η, t, J6.6, BocNHCH2-CH2) , 2.92(2H, m, Boc-NH-CH2) , 3.31 (2H, s, CH C00Bn) , 5.06(2H, s,Ph-CH), 6.67(1H, br,Boc-NH), 7.26-7.31 (5H,m, Ar-H)
(2) Boc- AEG(5'U)- OBnの製造
Boc- AEG (5' U) -OBnを下式の反応式に従つて製造した c
Figure imgf000046_0001
Ph
Boc- AEG (5 'U)- OBn 参考例 1で調製した 5' -ァミノ- 5' -デォキシゥリジン （5， - H2 - Urd) (1.80g, 7. 40mmol)を乾燥した DMF(50ml)に溶解し、 撹拌条件下で—5(TCにおいて CD I (1.14g，7.04腦ol)のDMF (40ml)溶液を 1時間かけて滴下した。 反応系は— 50 で 30分間撹拌を行った後、 室温まで徐々に昇温させた。 次いで上記で製造した Bo c- AEG- 0Bn(1.72g,7.40mmol)を加え、室温で 2日間撹拌を行った。反応終了後、室 温で DM Fを減圧留去した後、 残渣をカラムクロマトグラフィー（silica gel;ク ロロホルム -メタノール (20:1 v/v))により精製し、 Boc-AEG(5'U)-0Bn (2.64g, 4. 58醒 oし 収率 65%) を得た。 白色固体。
リ max (KBr) /cm"1 ： 3380, 1690, 1540, 1460, 1390, 1250, 1170
δΗ (270MHz； DMS0-d6) ： 1.35 (9H, s， t-Bu-H)， 2.9-3.1 (2H， m, Boc- HCH)， 3.2 - 3.4(4H,m,Boc HCH2-CH2,5'-H), 3.85 (1H, q, 4' -H) , 3.89(1H, q, 3'-H), 4.01 (1H, q,2'-CH), 4.06(2H,s,CH2COOBn), 5.08(1H， (U3._oH.3.— H, 4.9， 3' - 0H)， 5.11(2H,s,P h-CH2) , 5.35(lH,d,
Figure imgf000047_0001
5.7,2'— OH), 5.60(1H, d, J5I6 10.5,5-H), 5.70(1H, d, Jに 2,— H 5.4.5，Γ—Η)， 6.65(lH,br，5'- NH)， 6.77(1H, br,Boc-NH), 7.31-7.36(5 H, m, Ar-H), 7.64(1H, d, J6i5 7.8,6-H), 11.33(1H, s, 3-NH) ;
m/z (FAB)600(M+Na) +。
(3) Boc_AEG(5'l0- OHの製造
上記で得られた Boc- AEG(5'U) - OBn (0.2g, 0.35 mmol) のメタノール溶液 (30 ' ml) にパラジウム担持炭素 （Pd/C、 10 i¾Pd, 0.02g) を加え、 撹拌条件下で、 水 素を 1時間バブリングさせて反応させた。反応終了後、濾過により Pd/Cを除去し、 濾液を減圧濃縮した。残渣をメ夕ノ一ル-エタノールにより再沈殿させることにゆ より、 Boc-AEG(5'U)- 0H (0.16g, 0.33mmol, 収率 95%) を得た。 白色固体。
リ max (KBr) /cm—1 ： 3390, 1690, 1540, 1460, 1400, 1250, 1170
δ H (270MHz； DMS0— d6) ： 1.35 (9H, s, t-Bu-H)， 3.01 (2H， m， Boc-NHCH2) , 3.15-3. 33 (4H, m, Boc-NHC¾-CH2, 5' -H2) , 3.78-3.82 (2H, m, HN-CH-C0, ' -H) , 3.89-3.91(3 H,m,3'H,CH2C00H), 3.98-4.00(lH,m, 2' -H), 5.07 (1H, br, 3' -OH) , 5.32(1H, d, J2..0 - H 5.0,2' -OH), 5.62(lH,d, J5>6 8.4, 5-H), 5.62 (1H， d， Jに 2.—H 5.9.Γ-Η), 6.57 (lH,br,5'-NH), 6.77 (1H, t，； [B。c— 4.7,Boc-NH), 7.63(lH,d, 65 8.1, 6-H), 11.3 2 (1H， s， 3-NH)； rn/z (FAB)510(M + Na) +。
(4) TFA · AEG (5' U)_OBnの製造方法
上記 (2)で得られた Boc- AEG(5' U)- OBnを T F Aに溶解し、該溶液を 0 "Cで 30分間 放置した。 次いで TF Aを減圧留去して、 エステルを添加して TFA' AEG(5'U) - 0B nを得た。
(5) オリゴマーの製造
上記で調製した Boc- AEG(5'U)- 0Hと TFA · AEG(5' U) - OBnを用いて、 実施例 2 (4) の方法に従って 2量体 Boc- (AEG(5'U))2-OBnを調製する。さらに、実施例 2 (5)〜(： 1 1)の方法に従って、 オリゴマーを調製することができる。 実施例 5
(1) 3量体 (Boc-(isoGln(5'U))3-0Bzl) の製造
実施例 2 (5)で得られた Boc- (isoGln(5'U))4- 0H (化合物 9) 343mg(0.37imol) 、 HOB t 56mg(leq)及び BOP試薬 184mg(leq)を蒸留 DMFに 0°Cで溶解させ て室温に戻るまで約 1時間ほど撹拌した。 この溶液にジィソプロピルェチルアミ ン (DIEA)を 131mg(2eq)添加え、 次いで実施例 2 (3)で得られた TFA · isoGln(5'U)- OBzl (化合物 7)を 251mgaeq)加えて室温で 2時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧濃 縮してエタノ一ルから再沈殿することにより、 3量体 Boc- (isoGln(5' U)) 3 - OBzl を得た。 収量 200mg、 収率 37.9%
Ή-NMR (270MHz； D S0) ： 51.36(s,9H), 1.58-1.92 (m, 6H) , 2.14(t, 3H) , 2.34(t, 3H), 3.74-3.94 (m, 7H), 3.98-4.10(m, 3H), 4.15-4.30 (in, 2H), 5.06(s,2H), 5.20 (m, 3H) , 5.40(m, 3H), 5.63(m, 3H), 5.73(d,3H), 6.90(d, 1H), 7.35(m, 5H), 7.65 (d,3H), 7.98 (m, 3H), 8.15(m, 2H), 11.35(s,3H)
(2) 3量体 (Boc-(isoGln(5'U))3-0H) の製造
上記で得られた Boc- (isoGln(5'U))3- OBzl (200nig) をメタノールに溶解してパ ラジウム担持炭素 （10%，約 40mg) を添カ卩した。 水素雰囲気下で約 2時間反応させ て、 ェ一テルにより再沈殿させることにより Boc- (isoGln(5'U))3-0Hを得た。 収 量 190mg， 収率 9
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： S1.36(s，9H), 1.59-1.90 (m, 6H), 2.07-2.30 (m, 6H), 3.73-3.93 (m, 6H), 3.99-4.09 (m, 3H), 4.13-4.30 (m, 2H), 5.05-5.48 (m, 4H), 5.5 8-5.77(m, 6H), 6.90(d, 1H), 7.61-7.71 (fli, 3H), 7.93-8.22 (m, 5H), li.35(s,3H) UV (phosphate buffer) Amax ( ε ) 262nm 実施例 6 プリン塩基系 （イノシン） 一ヌクレオシド誘導体
(1) Nし卜ブトキシカルポ二ル- N5 - (5' -デォキシ -5' -ィノシル) - L-ィソダル夕 ミンべンジルエステル （Boc - isoGln(5' I) - OBzl) の製造
N - 1-ブトキシカルポ二ル- L-グルタミン ァ-ベンジルエステル (Boc-L-Glu(OBz 1)) (1.32g, 3.9腿 ol) 、 HOB t (526mg, leq)及び BOP試薬（
1.747g, leq)を蒸留 DMFに 0 :で溶解し、室温に戻るまで約 1時間程撹拌した。 この溶液に DIEAを 613mg(leq) 加え、 次に参考例 3で調製した 5' -ァミノ- 5' -デォ キシイノシンを 1.04g(leq) 加え、 室温で約 2時間撹拌した。 溶媒を減圧濃縮し シリ力ゲルカラムクロマトグラフィ一 (MeOH: CHC13 =1： 9)により精製することに より Boc-isoGln(5' I )- OBzlを得た。収量 1.56 g、 収率 68%。：
Ή - NMR (270MHz； 画) ： 51.33(s,9H), 1.82(m, 8H), 2.35(t, 2H), 3.38(m, 2H), 3.97 (m, 3H) , 4.54 (q, 1H), 5.05(s,lH), 5.31(d,lH), 5.48(d,lH), 5.83(d, m), 6.96(d，lH)， 7.34 (m, 5H), 8.07(t, 1H), 8.12(s, 1H), 8.30(s,lH):
I R (KBr) n 1610, 1695 cm"1 ：
MS (FAB) m/z 587 (M+, 39.4) ：
UV (phosphate buffer) λ丽 ( £ ) 258nm
(2) Na-t-ブトキシカルポニル- Ν5—(5' -デォキシ- 5' -ィノシル) - L-ィソグルタ ミン （Boc - isoGln(5' D-0H) の製造
上記（1)で得られた Boc-isoGln(5'I)- OBzl (1.09g, 1.86腿 ol) をメタノールに 溶解し、 パラジウム担持炭素を約 40mg添加し、 水素雰囲気下で約 2時間反応させ て Boc- isoGln(5' I)-0Hを得た。 収量 900mg、 収率 97.5
1 H-NMR (270MHz； DMS0) ： 51.33(s,9H), 1.82(m,8H), 2.35(t, 2H), 3.38(m, 2H), 3.97(m, 3H), 4.54 (q, 1H), 5..31 (d, 1H), 5.48(d, 1H), 5.83(d, 1H), 6.96 (d, 1H) , 8.07(t,lH)， 8.12(s，lH), 8.30(s,lH)
UV (phosphate buffer) λ max ( ε ) 249nm (3) Ν5-(5'-デォキシ- 5' -イノシル) -L-イソグルタミンベンジルエステル · ト リフルォロ酢酸塩 (TFA - isoGln(5' I)-0Bzl) の製造
上記（1)で得られた Boc- isoGln(5'I) - OBzl (l.Olg, 1.72酬 ol) を TFAに溶解 し、 0 で 2時間反応させた。次いで TF Aを減圧留去して、エーテルを加えて T FA* isoGln(5' I)- OBzlを得た。 収量 1.03mg， 収率 99 。
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： <51.97(dd, 2H), 2.43(t,2H), 3.38(m, 2H), 3.81(m, 3H), 4. ll(q, 4H), 4.54(q, IH), 5.08(s,2H), 5.31(d, IH), 5.48(d, IH), 5.83(d, IH), 6.96(d, IH), 7.36(m, 5H), 8.07(t,lH), 8.12(s,lH), 8.30(s,lH)
(4) 2量体 (Boc-(isoGln(5'I))2-0Bzl) の製造
上記（2)で得られた Boc - isoGln(5' I)-0H (182mg, 0.37腿 ol) 、 HOB t (50rag, 1 eq)及び B〇 P試薬 (162mg, 1 eq)を蒸留 D M Fに 0 で溶解し、室温に戻るまで 約 1時間ほど撹拌した。 この溶液中に、 ジイソプロピルェチルァミン（DIEA) を 1 15mg(2eq)加え、次いで (3)で調製した TFA'isoGln(5' I)- OBzlを 220mg(leq)加えて、 室温で約 2時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減圧留去し、 得られた残渣をカラムク 口マトグラフィー（¾¾¾:MeOH:AtOEc=l:2)で精製することによって 2量体 B oc -（isoGln(5' I))2- OBzlを得た (収量 320mg， 収率 78%)
'H-NMR (270MHz； DMS0) ： δ 1.31 (s, 9H)， 1.59-1.97(m, 4H), 2.15 (t, 2H) , 2.33(t, 2H), 3.82-4.05 (m, 2H), 4.21-4.32 (q, IH), 4.56(t,2H), 5.03(d, IH), 5.50(bloa ded-s, lH),5.82(d, 2H), 6.93(d, IH), 7.33 (m, 5H), 7.97-8.23 Cm, 7H)
UV (phosphate buffer) Amax ( ε ) 248nm
(5) 2量体 (Boc-(isoGln(5' I))2-0H) 製造
上記 (4)で得られた Boc-(isoGln(5'I))2-OBzl (320mg) をメタノールに溶解し、 パラジウム担持炭素 （10 ^約 40mg) を添加した。 水素雰囲気下で約 2時間反応さ せて Boc- (isoGln(5' Ι))Γ0Ηを得た （収量 298mg， 収率 88%) 。
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： 01.31(s,9H), 1.59-1.97(m, 4H) , 2.15(t, 2H) , 2.33(t, 2H), 3.82-4.05 (m, 2H), 4.21-4.32 (q, IH), 4.56(t,2H), 5.50(bloaded-s, IH) , 5.82(d,2H),6.93(d, IH), 7.97-8.23 (m, 7H))；
UV (phosphate buffer) Amax (ε) 248nm 実施例 7 ピリミジン—プリン混合配列を有する PRNA(l)
(1) 2量体 (Boc-isoGln(5'U)-isoGln(5' I)-0Bzl) の製造
実施例 2 (2)で調製した Boc - isoGln(5'U)- 0H (化合物 6) 945mg(2. Ommol) , HOB t 270mg(leq)及び BOP試薬 890mg(leq)を蒸留 DMFに 0 で溶解し、 室温に戻 るまで約 1時間ほど撹拌した。 この溶液中に、 ジイソプロピルェチルァミン （DI EA) を 0.74mg(2eq)加え、 次いで上記実施例 6 (3)で調製した TFA · isoGln(5'I)- 0 Bzlを 1.32g(l. leq)加えて、室温で約 2時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧留去し、 得られた残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー（移動相： eOH： AtOEc=l: 9) で精製することによって Boc_isoGln(5'U)-isoGln(5'I)-OBzlを得た （収量 1.8 6g， 収率 97.2%) 。
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： ^1.35(s,9H), 1.79 (m, 4H) , 2.15(m, 2H), 2.33(t,2H), 3.76-4.13 (m, 7H), 4.27(q, IH), 4.55(q, IH), 5.04(s,2H), 5.17(d，lH)， 5.39 (d, IH) , 5.51(d, IH), 5.61(d,lH), 5.73(d, IH), 5.83(d, IH), 6.87(d, IH), 73.4 (m，5H)， 7.64(d, IH), 7.91-8.05 (m, 2), 8. ll(s,lH), 8.31(s,lH);
MS (FAB) m/z 941 (M+, 12.1)
(2) 2量体 （Boc— isoGln(5'U)-isoGln(5'I)_OH) の製造
上記（1)で調製した Boc- isoGln(5'U) - isoGln(5'I)-OBzl(527mg, 0.56画 1)をメ 夕ノールに溶解し、 パラジウム担持炭素 （10%,約 40fflg) を添加した。 水素雰囲気 下で約 2時間反応させて Boc_isoGln(5'U)- isoGln(5' I)- 0Hを得た （収量 466mg， 収率 98%) 。
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： (51.36 (s, 9H) , 1.58-1.91 (m, 4H) , 2.05-2.27(m, 4H), 3.74-4.07(ffl, 6H), 4.24(q, IH), 4.55(t, IH), 5.08-5.59(m, 3H), 5.64(d, IH), 5.73(d, IH), 5.83(d, IH), 6.88(d, IH), 7.65(d, IH), 7.90-8.25 (m, 4), 8.31 (s, 1 H), 11.34 (s, IH);
UV (phosphate buffer) Amax (ε) 258nm
(3) 2量体 （TFA- isoGln(5'U)-isoGln(5'I)-0Bzl) の製造
上記（1 )で調製した Boc- i s oG 1 n (5 ' U) - i s oGl n (5 ' I ) -OBz 1を T F Aに溶解し、 0 で 2時間反応させた。 次いで TF Aを減圧留去して、 エーテルを加えて TFA · iso Gln(5'U) - isoGln(5' I)-0Bzlを得た。 収量 798mg, 収率 98%。
Figure imgf000052_0001
, を TFAに溶解し、 0 で 2時間反応させた。 次いで TF Aを減圧留去して、 ェ —テルを加えて再沈殿させることによって TFA* isoGln((5'U) - isoGln(5'I))2 - 0B ζίを得た。 収量 290mg， 収率 92%。
Ή-N R (270MHz； DMS0)： 51.95 (m, 4H)， 2.38-2.50 (m, 4H) , 3.42-4. 5 ( , 2H) , 3. 75-3.87(m, 6H), 4.11-4.14 (q, 2H) , 5.08(s, 4H) , 5.27(m, 2H), 5.49(m, 2H), 5.63 (m，2H)， 5.75(m, 2H), 7.36 (m, 5H), 7.66(d,2H), 8.10(bloaded-s, 6), 8.64(t,2 H)， 11.39(s,2H)
(7) 8量体 （Boc-isoGln((5'U)- isoGln(5'I))4- OBzl) の製造
上記 (5)で調製した Boc- isoGln((5'U)- isoGln(5， I))2-0H 65mg(4.1 X l(T¾ol)、 HOBt 5.5mg(leq)及び BOP試薬 18.2mg(leq)を蒸留 DMFに で溶解し、 室温 に戻るまで約 1時間ほど撹拌した。 この溶液中に、 DIEAを 12.9mg(2eQ)加え、次い で上記 (6)で調製した TFA' isoGln((5'U)-isoGln(5' I)) 2- OBzlを 69.2mg(leq)加え て、室温で約 2時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧濃縮し、 DMFに溶解した後、 エタノールにより再沈殿させて Boc - isoGln((5'U)- isoGln(5' I)) 4- OBzlを得た (収量 113mg， 収率 88.0%) 。
'H- MR( 70MHz; DMS0)： δ 1.35 (s, 9H)， 1.57-1.96 (m, 16H), 2.13 (m, 14H), 2.33 (t,4H), 3.74-4.32 (m, 28H), 4.56(m, 4H), 5.03(s,2H), 5.17(m, 4H), 5.30(m,4 H)， 5.40(m,4H), 5.53(m, 4H), 5.63(d, 2H), 5.66(d, 2H), 5.72(m,4H), 5.83(m,4 H)， 6.89 (m, 1H, 7.32(m, 5H), 7.59-7.70 (m, 5H), 7.84-8.35 (m, 4), 11.32(s,4H); MS (TOP) m/z 3139 (M+) 実施例 8 ピリミジン—プリン混合配列を有する PRNA(2)
(1) 2量体 (Boc - isoGIn(5'I)- isoGIn(5'U) - OBzl) の製造
実施例 6 (2)で調製した Boc-isoGln(5'I)- OH 520mg(1.05國 ol)、 HOBt 142mg(le q)及び BOP試薬 465mg(leq)を蒸留 DMFに 0°Cで溶解し、 室温に戻るまで約 1 時間ほど撹拌した。 この溶液中に、 DIEAを 330mg(2eQ)加え、 次いで実施例 2 (3) で調製した ? ^(^111(5'11)-0821を60511¾(163)加ぇて、室温で約2時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減圧濃縮し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一 （移動相： MeOH: At0Ec=l:9) で精製することによって Boc- isoGln(5' I)- isoG ln(5'U)-0Bzlを得た （収量 652mg, 収率 66.0%) 。
Ή-N R (270MHz ; DMSO) ： (51.35 (s, 9H) , 1.79(m, 4H), 2.15(m, 2H), 2.33(t,2 H)， 3.76-4.13 (m, 7H), 4.27(q, IH), 4.55(q, IH), 5.04(s,2H), 5.17(d, IH), 5.3 9(d，lH)， 5.51(d，lH)， 5.64(d，lH), 5.73(d, IH), 5.83(d, IH), 6.87(d, IH), 7.3 4(m, 5H), 7.64(d,lH), 7.91-8.05 (m, 2), 8.11(s，lH)， 8.31(s, IH) ;
MS (FAB) m/z 941 (M+, 10.9)
(2) 2量体 (Boc-isoGIn(5'I)-isoGln(5'U)-OH) の製造
上記で調製した Boc-isoGln(5' I)-isoGln(5' U)-0Bzl (527mg, 0.56画 ol)をメタ ノールに溶解し、 パラジウム担持炭素 （10%,約 40fflg) を添加した。 水素雰囲気下 で約 2時間反応させて Boc- isoGln(5'I)- isoGln(5'U)- 0Hを得た (収量 410mg, 収率 91%) 。
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： 1.36(s,9H)， 1.58-1.91 (m, 4H), 2.05-2.27(m, 4H) , 3.74-4.07 (m, 6Η) , 4.24(q, IH), 4.55(t,lH), 5.08-5.59 (m, 3H), 5.64(d，lH), 5.73(d, IH), 5.83(d, IH), 6.88(d, IH), 7.65(d, IH), 7.90-8.25 (m, ), 8.31(s, 1 H),11.34(s,lH);
UV (phosphate buffer) λ腿 ( ε ) 259ηιη 実施例 9 3量体 (Boc-isoGln(5'U)-isoGln(5' l)-isoGln(5' U)-0Bzl) の製造 実施例 7 (2)で調製した Boc - isoGln(5'U)-isoGln(5'I)- OH 80mg(0.094画 ol)、 H OBt 12.71¾(：16(1)及び80?試薬41.611¾(160)を蒸留01^?に0でで溶解し、 室温 に戻るまで約 1時間ほど撹拌した。 この溶液中に、 DIEAを 30mg(2eq)加え、次いで 実施例 2 (3)で調製した TFA' isoGln(5'U)- OBzlを 54.2mg(leq)加えて、室温で約 2 時間撹拌した。 反応後、 溶媒を減圧濃縮し、 得られた残渣を DMFに溶解してメ 夕ノール Zェ一テルにより再沈殿させて 3量体 Boc_isoGln(5'U) - isoGln(5' I) - is oGln(5'll)- OBzlを得た （収量 98mg, 収率 88.0 ) 。
'H-NMR (270MHz； DMS0) ： 51.36(s,9H), 1.60-1.95 (i, 8H), 2.05- 2.20 (m，4H), 2.33(t,2H), 3.74-4.08 (m, 9H), 4.22(m, 2H), 4.57(q, IH), 5.05(s,2H), 5.14- 5.20(m,2H)， 5.29(d, IH), 5.40(i, 2H),5.52(d, IH), 5.61(d,lH), 5.65(d, IH), 5.73(d,2H), 5.83(d, 2H), 6.90(d,lH)， 7.34 (m, 5H), 7.64(d, 2H), 7.92-8.04 (m, 3H),8.09-8.24(m,3H), 8.32 (s, IH), 11.35(s,lH);
MS (FAB) m/z 1295(M+, 2.4) 実施例 10 ヌクレオシド誘導体 （PRNA(r型)オリゴマー） の固相合成
(1) Fmoc-PRNA単量体 （ァ型） の製造
(i) Να- 9-フルォレニルメトキシカルボニル- Ν5- 5'-デォキシ -5'-ゥリジ二ル- L-イソグルタミンベンジルエステル （Fmoc-isoGln(5'U)-0Bzl )
実施例 2 (3)で調製した TFA* isoGln(5'U) - OBzl (化合物 7) 2.196g(3.81mmol) と Fmoc - Osu (N- (9-フルォレニルカルポニルォキシ） スクシンイミド） 1.537g(l. 2eq)を蒸留 DMFに 0°Cで溶解し撹拌した。この溶液に D I E Aを 1.99 g (2eq)加 えて室温で 30分間撹拌した。 この溶液を減圧濃縮し、 メタノールを加えて Fmoc-i soGln(5'U)- OBzlを結晶ィ匕させて取得した。 収量 2.156g、 収率 82.8%
Ή-NMR (270MHz; DMS0) ： δ 1.86(m， 2H)， 2.37(t,2H), 3.83(m, 2H), 4.03(m, 3H), 4.16-4.3 Km, 3H), 5.07(s,2H), 5.22(d, IH), 5.44(d, IH), 5.61(d, IH), 5.74 (d，2H)， 7.26-7.44 (m, 9H), 7.55-7.76 (d, 4H), 7.88(d,2H), 8.14(t,3H), 11.34 (s， IH)
(ii) Na- 9-フルォレニルメトキシカルボ二ル- N 5-5' -デォキシ- 5' -ゥリジ二 ル- L -ィソグル夕ミン (Fmoc-i soGln (5 ' U) -OH)
上記（i)で得られた Fmoc-i soGl n (5' U) -OBz 1 2· 156g (3.15腿 o 1)をメタノール /D MF(1:1)に溶解し、パラジウム担持炭素（10 ,約 40mg) を添加した。水素雰囲気 下で約 20分間反応させて Fmoc_isoGln(5' U) - 0Hを得た。これをさらにェ一テルより 再沈殿させて精製した。 収量 2.08g， 収率 99%
lH -腿（270MHz; 画) ： δ1.86(ιη, 2Η), 2.37(t,2H), 3.83(m, 2H), 4.03(m, 2H), 416-4.31 (m, 2H), 5.22(d, IH), 5.44(d, IH), 5.61(d, IH), 5.74(d, 2H), 7.26-7. 44 (m, 4H), 7.54-7.77 (d, 4H) , 7.88(d, 2H), 8.15(t,3H), 11.35(s,lH)
(Hi) Na - 9-フルォレニルメ卜キシカルボ二ル- Ν5-5'-デォキシ- 5'-イノシ 二ル- L-イソグルタミンベンジルエステル （Fmoc - isoGln(5' I)-0Bzl)
実施例 6 (3)で調製した TFA · isoGln(5' I)- OBzl 910mg(l.51腳 ol)と Fmoc- Osu 6 llmg(1.2eq)を蒸留 DMFに (TCで溶解し撹拌した。この溶液に D I EAを 475mg(2 eq) 加えて室温で 2時間撹拌した。 この溶液を減圧濃縮し、 シリカゲルカラムク 口マトグラフィー （MeOH： CHC13 = 1:9) で精製した。 収量 943,8nig、 収率 87.7% Ή-NMR (270MHz； 画) ： δ 1.72-2.01 (m, 2H), 2.15(t,2H), 2.37(t,2H), 3.2 5-3.52 (m, 6H), 3.91-4.09 (m, 3H), 4.55 (q, 1H) , 5.06(s,2H), 5.35(d, 1H), 5.53 (d, 1H), 5.84(d, 1H), 7.25-7.4 (m, 9H), 7.63(d, 1H), 7.72(t,2H), 7.88(d,2H), 8.10(s，lH)， 8.20(t,lH), 8.33(s,lH)
(iv) N 9 -フルォレニルメトキシカルポニル- Ν5-5'-デォキシ- 5' -イノシニ ル- L -イソグルタミン （Fmoc - isoGln(5' I) - OH)
上記（iii)で得られた Fmoc- isoGln(5' I) - OBzl 943.8mg(l.32画 ol)をメタノール /DMF(1:1)に溶解し、 パラジウム担持炭素 （10%，約 40mg) を添加した。 水素雰 囲気下で約 2時間反応させて Fmoc- isoGln (5' I)- OHを得た。これをさらにェ一テル より再沈殿させて精製した。 収量 880mg， 収率 93.2%
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： δ 1.65-1.96(m, 2H), 2.23(t,2H)， 3.32-3.50 (m, 3H), 3.90-4.08 (m, 3H), 4.15-4.30 (m, 3H), 4.55(t, 1H), 5.83(d,lH), 7.26-7. 6 (m, 4 H), 7.6 (d, 1H), 7.68-7.78 (m, 2H), 7.88(d, 2H), 8.10(s, 1H), 8.20(i,lH), 8.3 3(s,lH)
(2) PRNAオリゴマーの製造 （図 1)
図 1に記載するスキームに従って PRNAオリゴマーを製造した。 なお、 固相担体 樹脂として、 ポリエチレンダリコール鎖をスぺ一サ一として持つ NovaSyn (登録商 標） TGR-Resin (フアルマシア製）を用いた。
①固相担体樹脂の調製
まず、 ァミノ基が oc -基で保護された固相担体樹月旨を N-メチルピ口リドン (NM P)でよく膨潤させ、 次いで 20%のピぺリジン (PPD) ZNM Pで 15分間反応させて、 固相担体樹脂から Fmoc保護基を除去した。 5分おきにポルテックスにかけ、 反応 終了後 NM Pで 5回洗浄した。
② PRNAの伸長反応
P Aの伸長反応は、 N末端に Fmoc保護基を有し、 C末端がフリーの Fmoc- PRNA 単量体を下記の反応をくり返すことにより順次縮合させることによつて行つた。 <縮合反応 > Fmoc- PR A単量体（樹脂に対して 3eq)と 2- (1H -べンゾトリァゾ一ル-卜ィル) -1， 1, 3， 3-テトラメチルゥロニゥム へキサフルォロホスフェート） （HBTU) (3eq)と 1 -ヒドロキシベンゾトリアゾール （HOBt) (3eq) を NMPに溶解し、 上記樹脂を 充填したカラムに導入し、 ジイソプロピルェチルァミン （DIEA) (6eq)を加えて 2 0分間反応させた。 5分おきにポルテックスにかけ、反応終了後 NMPで 5回洗浄 した。
<反応確認試験 >
Fmoc- PRNA単量体の結合の有無をフリーのアミノ基と反応するニンヒドリン試 薬を用いたカイザー試験 （100 、 2分間） によって確認した。 試験の結果、 陽性 の場合 （未反応のァミノ基が存在する場合） は、 再度上記縮合反応を行い、 反応 が完結するまで繰り返した。
上記の縮合反応と反応確認試験を交互に行うことによって、 所望の Fmoc- PRNA 単量体を 1つずつ伸長させて、 固相担体樹脂上に PRNAオリゴマ一を合成した。 ③合成 PRNAオリゴマーの樹脂からの単離及び精製
合成後、 20% P P DZNMPで処理することによって PRNAオリゴマーの N末端 を脱保護して、 NMPで 5回洗浄した。 さらに 5回クロ口ホルムで洗浄して樹脂 を真空乾燥させた。次いでスカベンジャ一として 5 %水を含有する T F Aで合成 P RNAオリゴマーを樹脂から切り出した。 T F Aをエバポレーターで留去し、 T F A 溶液をカラムに通液しなから冷エーテルに加えることによって白色固体を沈殿取 得した。 次いで、 これを遠心分離し。 上清をデカンテ一シヨンで除去して残渣を 真空乾燥することによつて P腿ォリゴマーの粗生成物を得た。 粗生成物は下記の 条件の分析用 HPLCに付して、単一ピークであることを確認し、 MALDI- T0Fにより分 子量同定を行った。 さらに分取カラムにかけて目的の画分を分取し、 得られた分 画溶液を凍結乾燥して、 白色固体を得た。
く H P L C条件〉
分析カラム：ナカライ C0SM0SIL 4. 6 X 150mm Type waters,
imL/min
分取カラム：ナカライ C0SM0SIL 10 X 250腿 Type waters, 3mL/inin
溶離液 A液： 0. 1 % T F A/水 B液： 0.08% TF A/ァセトニトリル
移動相： A液： B液の組成が 100:0〜0:100に 30分になるように調整
検出 ： 260nm波長の UV検出
(2-1) PR Aオリゴマーの製造
(i) 前述する Fmoc-PRNA単量体として、 固相担体樹脂への最初の結合反応を、 N 末端を 9-フルォレニルメトキシカルポニル基、 C末端をべンジルエステル基で保 護したリジン（Fmoc-Lys(OBzl)-OH)を用いて行い、それ以降の縮合反応を実施例
10 (1) (ii)及び (iv)で調製した Fmoc- isoGln(5'U) - 0H及び oc— isoGln(5' I) -OH を用いて行うことによって下記の 8量体 P RN Aを合成した。
① H2- Lys- isoGln(5'U)- isoGln(5'U)- isoGln(5'U)- isoGln(5'U)- isoGln(5'U) - is oGln(5' I)-isoGln(5' I)-isoGln(5' U)-0H (匪オリゴマー 1) 収率 88%、 TO
F-MS m/z = 3021.8 (M+)
HPL C分析の結果を図 2に示す
(i i) 前述する Fmoc-PRNA単量体として上記 Fmoc - is oG In (5' U)-0H及び iFmoc - isoG ln(5'I)-0Hを用いて縮合伸長反応を行い、 最後の縮合反応を Fmoc- Lys (OBzl) - 0H を用いて行う下記の 2種類の 8量体 P R N Aを合成した。
• NH2-isoGln(5'U)-isoGln(5' I)-isoGln(5' I)-isoGln(5'U)-isoGln(5'U)-isoG ln(5'U)-isoGln(5'U)-isoGln(5'U)-Lys-OH (PRNAオリゴマー 2)、収率 80%、
T0F-MS m/z = 3021.8 (M+)
· NH2-isoGln(5' I)-isoGIn(5' I)-isoGln(5' I)-isoGln(5' I)-isoGln(5' I) - isoG ln(5' I)-isoGln(5' I)-isoGln(5' I)-Lys-0H (PRNAオリゴマ一 3) 、 収率 85%、 T
OF - MS m/z = 3165.9 (M+) 実施例 11 キメラ分子 2量体 (PRNA(Urd)-DNA(Thd)) の製造
塩基としてゥラシルを有する PRNAと塩基としてチミンを有する DNAとのキメラ 核酸 （PRNA(Urd)- DNA(Thd) 2量体） を下記のスキームに従って合成した。
Figure imgf000059_0001
N4- 1-ブトキシカルポ二ルー Ns—（5，-デォキシ- 5，-ゥリジル)- L-イソグルタ ミンべンジルエステリレ（Boc- isoGln(OBzl))の α -カルボキシル基に、実施例 2 (1) の方法に従って、 B0P試薬と HOBtを用いて 5'- H2-Urd (参考例 1) を導入し、 次い で実施例 2 (2)に従つてァ -カルポキシル基を接触還元によつて脱保護することに より、 Boc - isoGln(5'U)- 0Hを合成した (収率 88%) 。 次ぃで80(^0 111(5'1])-011 326mg(0.5mmol)と HOBt 67.5mg(leq)と BOP試薬 222mg(leq)を蒸留 DMFに 0 で溶 解させ一時間程室温に戻るまで撹拌した。 この溶液にジィソプロピルェチルアミ ン （DIEA) を 97mg (1.5eq) 加え、 次いで参考例 4で調製した 5' -NH2- Thd 424mg (1.05eQ)を加えて室温で約 3時間撹拌した。 TLCで反応終了を確認後、 メタノ —ルでクェンチした。 この溶液を減圧濃縮し、 5mlのメタノールを加え、 この溶液 をェ一テルで再沈殿させることにより標記の PRNA(Udr)-DNA (Thd)を得た。 収量 33 2mg, 収率 95%
Ή-NMR (270MHz； DMS0) ： δ 1.59-1.91 (m, 5H), 1.98-2.21 (m, 4H), 3.12-3.54 (m, 4H), 3.65-4.16 (m, 6H), 5.18(d, J=4.9, IH), 5.29(d, J=3.9, IH), 5.40 (d, J=5.4H z, IH), 5.64(d, J=8.3Hz, IH), 5.73(d, J=5.9Hz, IH), 6.13(t, J=1H), 6.89(d, J=8. 3, IH) , 7.50(s，lH)， 7.64(d, J=7.8Hz, 1H)， 7.90-8.04 (m, 2H), 11.30(s,2H) 7.5 0 実施例 12 キメラ分子 12量体 (PRNA(Urd) 8-DNA(Thd) 4) の製造
(1) 5' -0 - (4, 4'-ジメトキシトリチル)チミジン (5'-DMTr-Thd)
チミジン 1.918g(8.0mmol)を減圧下にて一時乾燥させ、アルゴン雰囲気下、 ピリ ジンを加え撹拌した。 で、 これに 4， 4'-ジメトキシトリチリレクロライド (DMTr - C1)を加え、 2時間程室温に戻しながら撹拌した。 TLCで反応終了を確認して 水でクェンチした。 この溶液を減圧濃縮し、 ジクロロメタンに溶解させ、 飽和硫 酸銅水溶液とブラインで洗浄した。 この有機相を減圧留去し'、 残渣をシリカゲル クロマトグラフィー （MeOH:C¾Cl2=l:9)により精製した。 分取した溶液を減圧留 去し、 少量の酢酸ェチルに溶解させた。 この溶液をへキサンで再沈殿させること により標記の -DMTr-Thdを得た。 収量 3.67g, 収率 82.7%；
"H-NMR (270MHz; DMS0) ： 51.44(s,3H), 2.07-2.32 (m, 2H) , 3.09-3.26 (m, 2H), 3.73(s,6H), 3.91-3.83 (ni, 1H), 4.25-4.36 (m, 1H), 5.34(d, J=4.4Hz, 1H), 6.20 (t, J=6.84Hz,lH), 6.89(d, J=8.3Hz,4H), 7.17-7.42 (m, 9H), 7.51(s，lH)， 11.35 (s， 1H)
(3) 5' - 0 - (4， 4'-ジメトキシトリチル)チミジン 3' -（シァノエチル Ν,Ν -ジイソ プロピルホスフオルアミダイト） （5' - DMTr-3'-CEDIPA-Thd)
上記 (1)で調製した 5'- DMTr- Thd 136mg (0.25MIO1)を減圧下にて一時乾燥させ、 アルゴン雰囲気下でジクロロメタンを加えて撹拌した。 この溶液に DIPA 17mg(0. 5eq)、テトラゾール 9mg(0.5eq)を加え、溶解後、 シァノエチル Ν,Ν'-ビス （ジィ ソプロピル)ホスフォルジァミダイト 83mg (1. leq)を加えて室温で 3時間撹拌し た。 TLCで反応終了を確認後、 メタノールでクェンチした。 この溶液を減圧留 去し、 ジクロロメタンに溶解させ、 5%炭酸水素ナトリウム水溶液とブラインで 洗浄した。 この有機相を減圧留去し、 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (MeO H:CH2C1Z=1:20)により精製した。 分取した溶液を減圧留去した後、 5mlのジクロ ロメタンに溶解させ、 この溶液をへキサンで再沈殿させることにより 5'- DMTr-3' -CEDIPDA-Thd を得た。 当該化合物の生成は、塩基部 5位のメチル基、糖部 Γの水 素、 DMTr基の存在と R f値の一致から確認した。 収量 61.2mg， 収率 32.2% R f (EtOH:CH2Cl2: (Εί)3Ν=50:45:5) 0.49, 0.53
(3) 5' -(4，4'-ジメトキシトリチル)-5'-ァミノ-5'-デォキシチミジン （5'- DMT r-NH-Thd)
参考例 4で調製した 5'-ァミノ- 5' -デォキシチミジン （5， - H2- Thd) 241mg(1.0 mmol) を減圧下にて一時乾燥させ、 アルゴン雰囲気下、 ピリジンを加えて撹拌し た。 0 で、 これに 4， 4'-ジメトキシトリチルクロライド（DMTr- C1) 23.25 mg(l. 25eq)を加え、 2時間程室温に戻しながら撹拌した。 T L Cで反応終了を確認して、 水でクェンチした。 この溶液を減圧濃縮し、 ジクロロメタンに溶解させ、 飽和硫 酸銅水溶液とブラインで洗浄した。 この有機相を減圧留去し、 残渣をシリカゲル クロマトグラフィ一 （MeOH:C¾Cl2=l:9)により精製した。 分取した溶液を、 減圧 留去し、 少量の酢酸ェチルに溶解させた。 この溶液をへキサンで再沈殿させるこ とによって、 標記の 5' - DMTr- - Thdを得た。 当該化合物の生成は、 塩基部 5位の メチル基、 糖部 1'の水素、 DMTr基、 のプロトン比率により確認した。 収量 203fflg， 収率 37.3%
(4) 5' -N- (4, 4' -ジメトキシトリチル) -5' -アミノ- 5' -デォキシチミジン - 3' - (シァノエチル N，N -ジイソプロピルホスフオルアミダイト） （5' - DMTr-NH-3'-C EDIPA-Thd)
(3)で調製した 5' -DMTr - NH - Thd 393mg (0.72mmol) を減圧下にて一時乾燥させ、 アルゴン雰囲気下、 ジクロロメタンを加え撹拌した。 この溶液に DIEA 187mg(2. Oeq)を加え、 溶解後シァノエチル Ν，Ν'-ジイソプロピルクロロホスフオルジアミ ダイト 188mg(l.leq)を加え、室温で 3時間撹拌した。 TLCで反応終了を確認し て、 メタノールでクェンチした。 この溶液を減圧留去し、 ジクロロメタンに溶解 させ、 5%炭酸水素ナトリウム水溶液とブラインで洗浄した。 この有機相を減圧 留去し、 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （MeOH:CH2Cl2=l:20)により精製し た。分取した溶液を、減圧留去し、 5mlのジクロロメタンに溶解させた。 この溶液 をへキサンで再沈殿させることによって、 標記の 5'- DMTr- H- 3'-CEDIM- Thdを得 た。当該化合物の生成は、 NMRと R ί値から確認した。収量 293mg， 収率 54.6%; Rf (EtOH:CH2Cl2： (Et)3N=50:45:5) 0.49, 0.53
(4) キメラ分子 (PRNA(Urd)8-DNA(Thd)4) の製造
下記のスキームに従って、 キメラ分子 (PR A(Urd)8-DNA(Thd)4) を合成した。
Figure imgf000062_0001
Boc-Gln(5'U)-OH Boc-Gln(5*U)e-OH
Figure imgf000062_0002
(0 DN Aオリゴマーの固相合成
まず、 上記 (1)に記載する方法に従ってチミジンの 5'水酸基を 4, 4' -ジメトキシ トリチルクロライド（DMTr- C1) 基で保護して 5，- DMTr-Thdを生成し、 次いで（2)に 記載するように、 これを DIPA及びテトラゾールの存在下で、 シァノエチル Ν, Ν' - ビス （ジイソプロピル） クロロホスフオルジアミダイト （CEDIPA) と反応させて、 チミジンの 3' -アミダイト誘導体を得た (5'-DMTr-3'-CEDIPA-Thd) 。 固相担体と して C P G (コント口一ルド ポアード グラス）を用い、 DIPA及びテトラゾ一ルで 活性化ながら、 順次上記のチミジンの 3' -アミダイト誘導体（5'- DMTr- 3，- CEDIPA - Thd)を導入していくことによって、固相上にチミジンを伸長させて 3量体を合成 した。 次いで、 TCAを用いてァミノ末端の DMTr- CI基を脱保護した後、 当該固相上 に形成したチミジンの 3量体に、上記 (3)及び (4)に記載するようにして合成した 5 ' -ァミノチミジンの 3' -アミダイト誘導体 (5'-DMTr-NH-3'-CEDIPA-Thd) を、 DIPA 及びテトラゾ一ルで活性化することによつて縮合し、再び TCAで脱保護することに より 5 ' 末端にアミノ基を有するチミジンの 4量体を合成した。
(i i) P RN Aオリゴマーの液相合成
PRNA (Urd) 8量体 (Boc-isoGln(5'U) 8-0H) を実施例 2 (11)の方法に従って製 造した （化合物 15) 。
(i i i) DN Aオリゴマーと P RN Aオリゴマーの縮合反応
上記で調製した PRNA (Urd) 8量体 (Boc-isoGln (5'U) 8-0H) 73. 8mg(3eq) , BOP 試薬 l l. lmg(3eq)， および加 Bt 3.4mg(3eq)を DMF (1. 5ml) に溶解して、 チミジ ンの 4量体が結合した固相に付し、該固相に DIEA 2. 1mg (3. 3eq) を 5回に分けて 加えて 3分間放置した。これを 5回繰り返した後、 7 mlの DMFで固相を洗浄し、 さらにジクロロメタン 7 mlで洗浄した。次いで、 28%アンモニア水 0. 5mlを固相に 加えて 15分間放置することによって、 縮合物を固相から切り出し、 キメラ分子 12 量体 (PRNA(U) 8-DNA(T) 4 ) を得た。 収率約 50%； m/z (T0P) 4131 (M +2Na) 2 + 産業上の利用可能性
本発明のヌクレオシド誘導体は、 ェキソヌクレア一ゼに対してばかりでなく、 エンドヌクレアーゼに対しても分解されにくく、 生体への投与後、 長く生体内に 存在することができる。 また、 本発明のヌクレオシド誘導体は、 核酸 （R NA、 D NA) との親和性に優れるものである。 従って、 本発明のヌクレオシド誘導体 はそのままでアンチセンス分子として、 または DNA、 RN Aまたはそれらの誘 導体などといった他の分子に導入することによってアンチセンス分子として調製 することができる。 更に、 本発明のヌクレオチド誘導体は、 その生体内分解物が ヌクレオチドゃアミノ酸誘導体であって生体毒性がないか、 あっても極めて低い ものであるため、 この意味でもアンチセンス分子として有用である。
かかるァンチセンス分子はァンチセンス法に用いられて遺伝子の発現を制御す ることができる。 具体的には、 例えばセンス鎖 RNAと二重鎖と形成して病因と なる生体内成分 （タンパク質） の形成 （翻訳） を阻害したり、 二重鎖 D NAとの 間で三重鎖を形成して mRN Aへの転写を阻害することができる。このこと力ゝら、 本発明のヌクレオシド誘導体は、 これをアンチセンス分子として使用することに よって、 ターゲットの遺伝子の働きを阻害でき、 癌や遺伝病等の遺伝子疾患の治 療に有効である。
また、 本発明のヌクレオチド誘導体は、 その塩基部がホウ酸類、 アルカリ土類 金属、 遷移金属、 糖の存在及びその濃度の影響によって、 また p H、 光、 温度等 の影響によって、 anti配向から syn配向へ、 また syn配向から ant i配向へとスイツ チングできる特性を有する。 従って、 かかる条件を制御することによって遺伝子 の塩基配列への結合能を制御することが可能であり、 アンチセンス法において遺 伝子の機能発現の on-offを可逆的に制御できる新しいアンチセンス分子として期 待される。

Claims

請求の範囲 一般式 ( 1 ) で表されるヌクレオシド誘導体。
Figure imgf000065_0001
(式中、 Xは同一または異なってピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 γ及び Y ' は同一または異なってセリン、 トレオニン、 オル 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 0—ヒドロキシリシン、 Ν—アミノエチルダリシン、 Ν—アミノエチ ルセリン、 Ν—アミノエチルリシン、 Ν—アミノエチルオル二チン、 Ν—ァミノ ェチルァスパラギン酸、 Ν—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β ーチォカルボ二ルァスパラギン酸、 アーチォカルボニルグルタミン酸、 及び δ _ チォカルポニルホモダル夕ミン酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも 1種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 また Αはシングルボンド、 力ルポニル基若しくはチォカルポニル基のいずれかで ある。 また、 Uま 0〜5の整数であり、 nは 1〜100の整数である。 ）
2. 一般式 ( 1 ) で示される Xが、 式 ( 2 ) で示されるゥラシルまたはその誘 導体である請求項 1記載のヌクレオシド誘導体。
Figure imgf000065_0002
(式中、 R 2及び R 3は、 同一または異なって、 酸素原子または硫黄原子であり、 R4は水素原子、 ハロゲン、 アルキル基、 アルケニル基またはアルキニル基であ る。 ）
3. —般式 ( 1 ) で示される が、 5—フルォロウラシル、 5—プロモウラシ ル、 5—ョードウラシル、 2—チォゥラシル、 4一チォゥラシル、 2， 4-ジチォゥ ラシル、 5—メチルゥラシル、 5—ビニルゥラシル、 5 _ェチニルゥラシル、 5 一フルォロシトシン、 5—ブロモシトシン、 5—ョ一ドシトシン、 5—ェチルシ トシン、 ヒポキサンチン、 8—フルォログァニン、 8—ブロモグァニン、 8—ョ 一ドグァニン、 1，N6-ェテノアデニン、 8—フルォロアデニン、 8—ブロモアデニ ン及び 8—ョードアデニンよりなる群から選択される少なくとも 1種である請求 項 1記載のヌクレオチド誘導体。
4. 一般式（1 ) 中、 Yが式（i)で表されるものである請求項 1記載のヌクレオ シド誘導体。
Figure imgf000066_0001
(式中、 mは 1〜3の整数であり、 R 5は酸素原子または硫黄原子であり、 *は 一般式 ( 1 )で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部位を意味する。尚、 ここで Aはシングルポンドである。 ）
5. 一般式 （1 ) 中、 Yが式（i i)で表されるものである請求項 1記載のヌクレ オシド誘導体。
Figure imgf000066_0002
(式中、 mは 1〜3の整数であり、 R 6は酸素原子または硫黄原子であり、 *は 一般式（1 )で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部位を意味する。尚、 ここで Aはシングルボンドである。 ）
6. 一般式 ( 1 ) 中、 Yが式 (i i i)で表されるものである請求項 1記載のヌクレオ シド誘導体。
Figure imgf000067_0001
(式中、 R 7は水素原子、 カルポキシメチル基、 カルポキシェチル基、 ヒドロキ シメチル基、 アミノブチル基若しくはァミノプロピル基であり、 *は一般式（1 ) で示されるヌクレオシド誘導体中の Aとの結合部を意味する。 尚、 ここで Aは力 ルポニル基またはチォカルボニル基である。 ）
7 . ヌクレオシドまたはその誘導体の 5' - 7K酸基をァミノ化して 5' -ァミノ-ヌク レオシド誘導体を製造する工程 1、 下式
Figure imgf000067_0002
(式中、 R 5は酸素原子または硫黄原子であり、 mは 1〜3の整数であり、 nは 1〜100の整数である。）で示されるアミノ酸またはその誘導体をペンタクロロフ ェニルトリクロロアセテ一トと反応させてアミノ酸- ω-ペンタクロロフエニルェ ステル誘導体を製造する工程 2、及び工程 1と工程 2でそれぞれ得られた 5' -ァミ ノ-ヌクレオシド誘導体とアミノ酸 - ω-ペン夕クロ口フエニルエステル誘導体と を結合反応させる工程 3を有する、 請求項 4記載のヌクレオシド誘導体を製造す る方法。 '
8 . 5' -ァミノ-ヌクレオシド誘導体と Ν末端と C末端が保護された下式 / E
Figure imgf000068_0001
(式中、 R 6は酸素原子または硫黄原子であり、 mは 1〜3の整数である。 Dは 力ルポキシル保護基、 Eはァミノ保護基を意味する。 ） で示されるアミノ酸また はその誘導体とを反応させてヌクレオシド誘導体のモノマ一 （n = l)を製造する 工程 1、 該モノマーの C末端を脱保護する工程 2、 該モノマーの N末端を脱保護 する工程 3、 工程 2で得られた C末端脱保護物と工程 3で得られる N末端脱保護 物を縮合反応する工程 4、 さらに必要に応じて工程 2〜4を反復する工程を有す る、請求項 5記載のヌクレオシド誘導体のオリゴマーまたはポリマー（n = 2〜l 00) を製造する方法。
9. 5' -ァミノ-ヌクレオシド誘導体と N末端と C末端が保護された下式
HN
NH
7 /
R7— CH
D (式中、 R 7は水素原子、 カルボキシメチル基、 カルボキシェチル基、 ヒドロキ シメチル基、 アミノブチル基若しくはァミノプロピル基であり、 Dはカルポキシ ル保護基、 Eはァミノ保護基を意味する。 ) で示されるアミノ酸またはその誘導 体とを反応させてヌクレオシド誘導体のモノマー （η =ί)を製造する工程 1、 該 モノマーの C末端を脱保護する工程 2、該モノマーの Ν末端を脱保護する工程 3、 工程 2で得られた C末端脱保護物と工程 3で得られる Ν末端脱保護物を縮合反応 する工程 4、 さらに必要に応じて工程 2〜4を反復する工程を有する、 請求項 6 記載のヌクレオシド誘導体のオリゴマーまたはポリマー（η = 2〜100)を製造す る方法。
1 0. 工程 1の反応を、 N， N' -力ルポ二ルイミダゾール、 ホスゲン、 N， N' -チォ 力ルポ二ルイミダゾ一ルまたはチォホスゲンの存在下で行うことを特徴とする請 求項 8記載の製造方法。
1 1 . 下記一般式で表される Ν保護-ヌクレオシド誘導体。
Figure imgf000069_0001
(式中、 Xは同一または異なってピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 γ及び Y' は同一または異なってセリン、 トレオニン、 オル 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 （5—ヒドロキシリシン、 Ν—アミノエチルダリシン、 Ν—アミノエチ ルセリン、 N—アミノエチルリシン、 N—アミノエチルオル二チン、 N—ァミノ ェチルァスパラギン酸、 N—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β —チォ力ルポ二ルァスパラギン酸、 アーチ才力ルポニルグルタミン酸、 及び δ— チォカルボニルホモグルタミン酸よりなる群から選択されるいずれか少なくとも 1種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 Αはシングルボンド、カルボニル基若しくはチォカルポニル基のいずれかである。 また Fは 9-フルォレニルカルポニル基であり、 Gは水酸基またはべンジルエステ ル基である。 1は 0〜5の整数である。 ） 1 2. 請求項 1 1のヌクレオシド誘導体を単量体原料として用いる、 オリゴま たはポリヌクレオシド誘導体の固相製造法。
1 3 . 請求項 1 1に記載する N保護-ヌクレオシド誘導体を固相に結合するェ 程、 固相に結合したヌクレオシド誘導体から N保護基を脱離する工程、 及び該ヌ クレオシド誘導体に請求項 1 2に記載する N保護-ヌクレオシド誘導体を結合す る工程を含む、 請求項 1 2記載のオリゴまたはポリヌクレオシド誘導体の固相製 造法。
1 4. 下記一般式で表されるヌクレオシド誘導体：
Figure imgf000070_0001
(式中、 Xは同一または異なってピリミジン若しくはプリン核酸塩基またはそれ らの誘導体であり、 γ及び Y ' は同一または異なってセリン、 卜レオニン、 オル 二チン、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 リシン、 アルギニン、 システィン、 メ チォニン、 <5—ヒドロキシリシン、 N—アミノエチルダリシン、 N—アミノエチ ルセリン、 N—アミノエチルリシン、 N—アミノエチルオリレニチン、 N—ァミノ ェチルァスパラギン酸、 N—アミノエチルグルタミン酸、 ホモグルタミン酸、 β 一チォカルポ二ルァスパラギン酸、 r—チォカルポニルグルタミン酸、 及び δ— チォカルボニルホモグルタミン酸
よりなる群から選択されるいずれか少なくとも 1種のアミノ酸又はアミノ酸誘導 体であり、 R 1は水素原子または水酸基であり、 また Αはシングルポンド、 カル ポニル基若しくはチォカルポニル基のいずれかである。 また、 1は 0〜5の整数 であり、 nは 2〜100の整数である。 ）
の製造における、原料としての請求項 1 1に記載の N保護-ヌクレオシド誘導体の 使用。
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