WO2001090203A1 - Copolymeres statistiques insolubles presentant une affinite specifique envers un protiste donne, leurs utilisations et leur procede de selection - Google Patents

Copolymeres statistiques insolubles presentant une affinite specifique envers un protiste donne, leurs utilisations et leur procede de selection Download PDF

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WO2001090203A1
WO2001090203A1 PCT/FR2001/001609 FR0101609W WO0190203A1 WO 2001090203 A1 WO2001090203 A1 WO 2001090203A1 FR 0101609 W FR0101609 W FR 0101609W WO 0190203 A1 WO0190203 A1 WO 0190203A1
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WO
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copolymers
protist
copolymer
given
styrene units
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/001609
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English (en)
Inventor
Marcel Jozefowicz
Patrick Gentien
Evelyne Erard
Stéphane LA BARRE
Daniel Muller
Original Assignee
Institut Francais De Recherche Pour L'exploitation De Mer (Ifremer)
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite Paris Xiii
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment

Definitions

  • the present invention relates to insoluble random copolymers having a specific affinity towards a given protist, to their uses, in particular for the selective capture of said protist, and to their selection process.
  • the marine environment depending on the local biotope, temperature and sunshine, may be subject, episodically and seasonally, to efflorescence of planktonic microorganisms which affect the environment and which are sometimes toxic to the local marine fauna and for humans, the end consumer of plankton filtering fish, molluscs and crustaceans.
  • Planktonic control of seawater is therefore essential for reasons of public health.
  • the detection of such microorganisms uses techniques of microscopic observation from water samples, analyzes which are tedious and often approximate, or the use of molecular probes specific to the species to be detected, method too expensive to be used industrially and routinely.
  • no satisfactory method for controlling the efflorescence of planktonic microorganisms has been described. Indeed, a chemical method consisting in pouring into the water flocculating particles of clay or silt, so as to precipitate toxic plankton, is used in Japan and Korea, but this technique is not selective and has a harmful impact on the ecosystem.
  • the object of the invention is therefore to provide means for detecting planktonic microorganisms present in water, such as microalgae, and a process for the selective elimination of these microorganisms, which can be used both for laboratory scale than industrial scale, as well as the natural ecosystem, especially in the marine environment.
  • the inventors had the idea of researching whether copolymers of the type of those described in the article by M. JOZEFOWICZ and
  • J. JOZEFONVICZ published in Biomaterials, 1997, 18, 1633-1644, could be used as a material having an affinity for certain planktonic microorganisms, this affinity being sufficiently large and specific to allow the capture of these microorganisms, whether for their detection, their isolation or their elimination.
  • the subject of the present invention is an insoluble random copolymer comprising a synthetic polymer, the basic monomer units of which are substituted by at least one amino acid or one amino acid derivative, characterized in that it is capable of being obtained by a process which comprises the following stages: a) synthesis of a library of insoluble copolymers by statistical substitution of a synthetic polymer using amino acids or their derivatives, b) preparation of a cell culture of a protist given, c) bringing the copolymers prepared in step a) into contact with a fraction of the cell culture prepared in step b), d) selecting and identifying the copolymers which have a specific affinity for said protist, and e) synthesis of a copolymer identified at the end of step d).
  • Step e) of synthesis of a copolymer can be carried out using the organic chemistry techniques known to those skilled in the art.
  • the synthetic polymer mentioned above is for example selected from the group consisting of vinyl polymers (such as acrylates or polystyrene), diethylenic polymers, polyurethanes and silicones.
  • “Protist” is understood to mean an autotrophic or heterotrophic unicellular eukaryotic microorganism. By way of examples of protists, mention may be made of zooplanktonic or phytoplanktonic microorganisms, such as microalgae, or even protozoa.
  • the copolymer defined above can be used to eliminate said protist, in the case where it presents a risk for the environment or for health.
  • the following harmful taxonomic entities can be mentioned, for example: genera Dinophysis, Alexandrium, Gonyaulax, Protogonyaulax, Gambier disais, Ostreopsis, Ceratium, Prorocentrum, Gymnodinium, Gyrodinhim, Heterosigma, Chatonella and Phaeocystis.
  • the copolymer can also be used to isolate or capture said protist, for example with the aim of recovering substances produced by the latter: certain protists indeed produce metabolites of industrial interest, for example in pharmacology, or in the food and technology.
  • microalgae producing polyunsaturated fatty acids and diatoms producing biomineral silica (Bacillariophyceae).
  • step c) described above an association is formed between said protist and the copolymers which have a specific affinity towards this protist.
  • the copolymer in accordance with the invention mimics the structure of a natural ligand for membrane receptors (such as growth factors, glycopeptides, lipopeptides) of the protist to which it has a specific affinity.
  • a natural ligand for membrane receptors such as growth factors, glycopeptides, lipopeptides
  • the copolymer according to the invention advantageously consists of a mimetic of a peptide or of a peptide derivative.
  • said basic monomeric units of the synthetic polymer are substituted, statistically, by sulfonate groups and by aspartic acid or one of its derivatives, preferably an ester of aspartic acid (for example the dimethyl ester).
  • said amino acid or amino acid derivative is linked to the basic monomeric units of the synthetic polymer ⁇ by an appropriate chemical bond, for example a sulfonamide bond.
  • the latter comprises, in molar percentages:. between 5 and 40% of unsubstituted styrene units, preferably between
  • Such a copolymer has a specific affinity for the Alexandriitm minutum species.
  • the copolymer in accordance with the invention may for example comprise, in molar percentages, approximately 29% o of unsubstituted styrene units, approximately 24% of styrene units substituted by sulfonate groups, and approximately 41% of styrene units substituted by dimethyl esters of aspartic acid.
  • Another subject of the invention is the use of the copolymer defined above for the selective capture of a given protist, with a view to the detection or elimination of this species.
  • Such use is particularly useful for capturing harmful protists.
  • Poisoning acting on the central nervous system, caused by dinoflagellates such as Alexandrium catenella, Alexandrium minutum, Alexandrium acatenella, Alexandrium cohorticula, Alexandrium fundyense, Alexandrium fraterculus, Alexandrium ostenfeldii, Alexandrium tamarense, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium bahamense var. compressum,
  • DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning
  • ASP Amnesia Shellfish
  • Poisoning caused by diatom species like Pseudo-nitzschia multiseries, Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima, Pseudo-nitzschia australis, or dinofiagellate like P ⁇ esteria piscicida,
  • CPP Ciguatera Fish Poisoning
  • neurotoxic intoxication (NSP: "Neurotoxic Shellfish Poisonmg”), caused by species such as brief Gymnodinium and Gymnodinium cf.
  • NSP Neurotoxic Shellfish Poisonmg
  • Chrysochromulina polylepis Phaeocystis pouchetii, Phaeocystis antartica, Prymnesium parvum and Prymnesium patelliferum, dinoflagellates like Gymnodinium mikimotoi and Gymnodinium corsicum, as well as raphydophytes like Heterosigma carterae, Chattonella antiqua, Chattonella marina and Chattonella verruculosa.
  • a subject of the invention is also the use of the copolymer described above which comprises, in molar percentages, between 5 and 40% of unsubstituted styrene units, between 15 and 51% of styrene units substituted with sulfonate groups, and between 44 and 55%> of styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid, for the selective capture of the species Alexandrium minutum, with a view to the detection or elimination of this species.
  • a subject of the invention is also a water filtration device for selectively eliminating at least one given protist therefrom, characterized in that it comprises at least one copolymer as described above, said copolymer preferably comprising, in molar percentages, between 5 and 40% of unsubstituted styrene units, between 15 and 51% of styrene units substituted by sulfonate groups, and between 44 and 55% of styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid, such as described above, when said protist is the species Alexandrium minutum.
  • the concentration of said given protist is significantly reduced in filtered water (fresh water or sea water for example).
  • Such a water filtration device can for example be in the form of a net or a filter membrane.
  • any material of a given porosity, the surface of which is coated with the copolymer according to the invention, could be used in this device.
  • the present invention also relates to a process for the selection of copolymers having a specific affinity towards a given protist, characterized in that it comprises the following steps: a) synthesis of a library of insoluble copolymers, mimetics of peptides or derivatives of peptides, by statistical substitution of a synthetic polymer with amino acids or their derivatives, b) preparation of a cell culture of a given protist, c) contacting of the copolymers prepared in step a) with a fraction cell culture prepared in step b), and d) selection and identification of the copolymers which have a specific affinity towards said protist.
  • Said protist is as described above. It consists for example of the species Alexandrium minutum.
  • the method according to the invention can comprise, between steps b) and c), a step of radioactive labeling of said protist.
  • step d) is carried out by detecting the copolymer / protist associations which give rise to an emission of radioactivity.
  • the method according to the invention can also comprise, between steps c) and d), a step of removing cells which have not associated with the copolymers, carried out by sieving.
  • FIG. 1 shows the adhesion profile of cells of lexandrium minutum depending on the composition of polystyrene-based copolymers comprising different substitution rates dimethyl ester of aspartic acid.
  • the abscissas represent the degree of substitution of the copolymers with the dimethyl ester of aspartic acid.
  • the ordinate axis on the left of the graph represents the adhesion rate of the cells on the copolymers, expressed in a radioactive signal / background noise ratio (curve - -).
  • the ordinate axis on the right of the graph represents the swelling rate of the copolymers in the medium f / 2 (curve - m -), - Figure 2 represents the adhesion profile of the cells of Heterocapsa triquetra according to the composition of these same copolymers based on polystyrene, comprising different degrees of substitution with dimethyl ester of aspartic acid.
  • the abscissa and ordinate axes have the same meanings as in FIG. 1. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not constitute no way a limitation.
  • EXAMPLE 1 Synthesis of a library of mimetic copolymers of peptide derivatives. 1) Synthetic polymer used.
  • Polystyrene microspheres crosslinked with 3% divinylbenzene are used, sold by Bio-Rad Laboratories (Richmond, California, USA) under the name BioBeads SX3.
  • the polystyrene microspheres are washed successively using 1M sodium hydroxide, demineralized water, 1M hydrochloric acid and again using demineralized water, each washing being performed for 3 hours. At the end of the last washing, the polystyrene microspheres are filtered, then dried under vacuum at 50 ° C.
  • substitutions chosen consist of sulfonamides of the aspartic acid methyl ester of alanine, leucine, or phenylalanine.
  • the following protocol is repeated, for these four families of substituents, so as to obtain eight different degrees of substitution.
  • family I copolymers comprising styrene units substituted with dimethyl esters of aspartic acid
  • family II copolymers comprising styrene units substituted with methyl esters of phenylalanine,
  • family III copolymers comprising styrene units substituted with methyl esters of leucine
  • IN family copolymers comprising styrene units substituted by methyl esters of alanine, the copolymers of these three families each having variable degrees of amino acids in the form of esters, as well as unsubstituted styrene units and substituted styrene units by chlosulfonate groups.
  • the weak hydrolysis makes it possible to obtain copolymers comprising, in addition to unsubstituted styrene units, styrene units substituted by sodium sulfonate groups and styrene units substituted by dimethyl esters of aspartic acid, or methyl esters of l alanine.
  • a strong hydrolysis reaction is carried out using 2M sodium hydroxide.
  • an increasing and then decreasing gradient is used for the concentration of soda (in the order: 10 " , 10 " , 1, 2, 1,
  • Table II summarizes the substitution rates of the four families of copolymers, namely the levels of unsubstituted styrene imitates (“styrene” column in Table II), in styrene imitates substituted by sodium sulfonate groups (“sulfonate” column in Table II), and in styrene units substituted with amino acids, in the form of a methyl ester in the case of copolymers of family I and of the family IN, and in the form of sodium salt in the case of copolymers of families II and III (column "amino acid” in Table II).
  • Table II also mentions the swelling rate of the copolymers, measured by the difference between the volume occupied by a given quantity of copolymer in the dry state (in powder form) and the volume occupied by this same quantity of copolymer placed in Guillard f / 2 medium as described by RRL Guillard (1983) in Culture of Marine Invertebrates, Selected Readings, C.J. Berg Jr. Editor, pages 108-132.
  • This medium consists of sea water in which are added the nutritive salts necessary for the growth of microalgae Alexandrium minutum, Heterocapsa triquetra and Scrippsiella trochoidea. It is noted that the swelling rate is all the more important as the copolymer comprises a rate of substitution with high sodium sulfonate groups (groups of hydrophilic nature).
  • EXAMPLE 2 Culture of microalgae and radioactive labeling of the latter.
  • This medium is sterilized at 120 ° C for 30 minutes, then enriched with group B vitamins in trace amounts.
  • a commercial antibacterial solution (Life Technologies, Eragny, France) comprising a mixture of penicillin (5000 units / ml) and streptomycin (5000 units / ml) is added to this medium, at a rate of 1% by volume, before its inoculation with 10 3 cells? Alexandrium minutum or 'Heterocapsa triquetra.
  • the medium is made up to 100 ml with sterile f / 2 medium, then it is incubated at 17 ° C in an alternation of light (85 ⁇ E.s " '.m “ 2 ) and darkness with 12-hour cycles / 12 hours, gentle agitation being carried out twice a day.
  • the proliferation curve (representation of the number of cells per ml as a function of time) of the Alexandrium minutum strain reveals a latency period of 2 days, followed by an exponential multiplication phase of 21 days, then from a stationary period (plateau) to day 23.
  • the speed of cell division at half of the exponential growth phase (day 14 after inoculation) is 3.4 days, in agreement with what has been described in the article by S. LA BARRE et al. (Ibid). Scrippsiella trochoidea has a generation time of
  • Heterocapsa triquetra has a faster growth cycle than Alexandrium minutum: the latency phase is 1.5 days and that of exponential multiplication is 7 days, the plateau being reached on day 8.5.
  • the cell division speed is 1.7 days, which is twice as fast as that at! Alexandrium minutum.
  • the labeling of Alexandrium minutum, Heterocapsa triquetra or Scrippsiella trochoidea cells is also carried out in accordance with S. LA BARRE et al. (ibid): 100 ml of the culture d : lexandrium minutum (14 days old) of Scrippsiella trochoidea (9 to 10 days old) or the culture of Heterocapsa triquetra (5 days old) is incubated with 250 ⁇ Ci orthophosphate 3j P in 25 ⁇ l of 10 "2 M hydrochloric acid, sold by the company Amersham (France), for 96 hours for Alexandrium minutum, for 67 hours for Scrippsiella trochoidea or for 41 hours for Heterocapsa triquetra.
  • the medium is then reduced to a volume of 20 ml by filtration on a membrane of porosity of 5 micrometers (Durapore ® membrane sold by Millipore), then made up to 100 ml by addition of a new volume of f / 2 medium, these operations being repeated 7 to 8 times until only a negligible radioactivity in the filtrate is detected, measured as indicated in the article by S. LA BARRE et al. (Ibid).
  • EXAMPLE 3 Selection of the copolymers which exhibit a specific affinity towards Alexandrium minutum, Scrippsiella trochoidea or Heterocapsa triquetra. 1) Kinetics of cell adhesion.
  • test copolymer for example a copolymer based on polystyrene substituted up to 81% by sodium sulfonate groups. This copolymer is prepared in accordance with the protocol described in Example 1, by a chlorosulfonation step followed by a hydrolysis reaction.
  • the corresponding sample is filtered through a nylon sieve with a weft equal to 60 ⁇ m, so as to retain the copolymer and to eliminate the cells which have not adhered to the copolymer. Filtration is followed by three washes with 1 ml of f / 2 medium.
  • the radioactivity measurements on each sample are carried out as follows: the nylon filter, with the filtration residue, is placed in a scintillation vial, to which 1 ml of 2M sodium hydroxide is added in order to lyse the cells, then 10 ml of fluid scintillation (sold by Fisher Chemicals under the name Wallac Optiphase Hisafe 2). Furthermore, for control, 200 ⁇ l of the filtrate containing the cells which have not adhered to the copolymer are placed in a scintillation vial containing 1 ml of 2M sodium hydroxide and 2 ml of scintillation fluid.
  • the contents of the vials are homogenized using a vortex and the emission of ⁇ rays is measured on a Wallac LKB 1214 device from the company Rackbeta. Is the same protocol followed with cells? Heterocapsa triquetra and Scrippsiella trochoidea, the incubation time of the cells with the copolymer carrying sodium sulfonate groups being respectively 25, 32, 54, 68 and 72 hours.
  • the kinetics of cell adhesion to the copolymer tested are obtained: as a function of time, the number of cells which adhere to the copolymer is first increasing, then reaching a plateau. This plateau is reached from 55 hours for Alexandrium minutum and from 32 hours for Heterocapsa triquetra.
  • the incubation times of the various copolymers with the cells of Alexandrium minutum or "Heterocapsa triquetra" will be 72 hours and 48 hours respectively.
  • Example III and IV prepared in accordance with the protocol described in Example 1 and suspended in medium f / 2, are placed in the presence of a given quantity (approximately 10 cells) of cells & Alexandrium minutum labeled with 33 P in accordance with Example 2 (14,250 cells / ml, labeled at 15 cpm per cell). After 72 hours of incubation at 17 ° C., the copolymer (to which cells have adhered) is separated from the free cells in solution by means of the filtration step described previously in connection with the measurement of the kinetics of cell adhesion. The radioactivity of the copolymer is then measured, as indicated above.
  • the procedure is carried out in the same way from Scrippsiella trochoidea and Heterocapsa triquetra cells, placed respectively in the presence of the eight copolymers of family I for 48 hours, and of the nine copolymers of the family IN for 24 hours.
  • FIG. 1 represents the adhesion profile of the cells of Alexandrium minutum as a function of the composition of the copolymers of family I.
  • the abscissae represent the rate of substitution of the copolymers of family I for the dimethyl ester of aspartic acid.
  • the ordinate axis on the left of the graph represents the adhesion rate of the cells on the copolymers, expressed by the radioactive signal / background noise ratio (curve - -).
  • the ordinate axis on the right of the graph represents the swelling rate of the copolymers in the medium f / 2 (curve - "-).
  • a non-specific adhesion zone is observed up to a substitution rate of the copolymers of aspartic acid dimethyl ester of approximately 30%>, the surface available for cell adhesion being greater for the copolymers which have a low amino acid substitution rate (copolymers which have the highest swelling rate).
  • the swelling of the copolymers remains stable, allowing comparisons between the adhesion rates of the cells.
  • the peak marked on the graph is indicative of a specific cell adhesion, which takes place for the copolymers which comprise between 44 and 55% of dimethyl ester of aspartic acid.
  • FIG. 2 represents the adhesion profile of the cells of Heterocapsa triquetra as a function of the composition of the copolymers of family I.
  • the axes of the abscissa and the ordinate have the same meanings as those of figure 1.
  • FIG. 3 represents the adhesion profile of the cells of Alexandrium minutum as a function of the composition of the copolymers of the IN family.
  • the abscissas represent the rate of substitution of the copolymers of the IN family into the methyl ester of alanine.
  • the ordinate axis on the left of the graph represents the adhesion rate of the cells on the copolymers, expressed by the signal / background noise ratio (curve - ⁇ -).
  • the ordinate axis on the right of the graph represents the swelling rate of the copolymers in the medium f / 2 (curve - m -).
  • the membership profile corresponds to:
  • FIG. 4 represents the adhesion profile of the cells of Scrippsiella trochoidea as a function of the composition of the copolymers of the IN family.
  • the abscissa and ordinate axes have the same meanings as those in Figure 3.
  • the adhesion profile of the Scrippsiella trochoidea cells on the copolymers of family IV is comparable to that observed for Alexandrium minutum in FIG. 3.
  • These results show that the copolymers of the family IN, having at least 8% and at most 30 % of alanine methyl ester have binding sites to one or more components of the plasma membrane of Alexandrium minutum and of Scrippsiella trochoidea which belong to close taxonomic families, respectively Peridiniaceae and Gonyaulacaceae, but do not have a specific affinity of genus towards Scrippsiella trochoidea and Alexandrium minutum.

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Abstract

L'invention se rapporte à un copolymère statistique insoluble comprenant un polymère synthétique dont les unités monomériques de base sont substituées par au moins un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes: a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles par substitution statistique d'un polymère synthétique à l'aide d'acides aminés ou de leurs dérivés; b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné; c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b); d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste, et e) synthèse d'un copolymère identifié à l'issue de l'étape d). L'invention se rapporte également aux utilisations de ce copolymère et à un procédé de sélection de copolymères présentant une affinité spécifique envers un protiste donné.

Description

COPOLYMERES STATISTIQUES INSOLUBLES PRESENTANT UNE AFFINITE SPECIFIQUE ENVERS UN PROTISTE DONNE, LEURS UTILISATIONS ET LEUR PROCEDE DE SELECTION
La présente invention se rapporte à des copolymères statistiques insolubles présentant une affinité spécifique envers un protiste donné, à leurs utilisations, notamment pour la capture sélective dudit protiste, et à leur procédé de sélection.
Le milieu marin, en fonction du biotope local, de la température et de l'ensoleillement, peut être sujet, de façon épisodique et saisonnière, à des efflorescences de microorganismes planctoniques qui affectent l'environnement et qui sont parfois toxiques pour la faune marine locale et pour l'homme, consommateur final de poissons, mollusques et crustacés filtreurs de plancton.
On connaît par exemple les efflorescences de Phaeocystis, dont les métabolites soufrés corrompent l'eau, la rendent malodorante et la colorent, faisant fuir les bancs de poissons, ou encore les efflorescences d'Alexandrium minutum, dinoflagellé producteur de toxines paralysantes qui se concentrent dans les moules et les huîtres, et de Dinophysis, à l'origine de toxines diarrhéiques.
Le contrôle planctonique des eaux de mer s'impose donc pour des raisons de santé publique. Actuellement, la détection de tels microorganismes fait appel à des techniques d'observation microscopique à partir d'échantillons d'eau, analyses qui sont fastidieuses et souvent approximatives, ou à l'utilisation de sondes moléculaires spécifiques de l'espèce à détecter, méthode trop coûteuse pour pouvoir être utilisée industriellement et de façon routinière. D'autre part, aucun procédé satisfaisant pour le contrôle des efflorescences de microorganismes planctoniques n'a été décrit. En effet, une méthode chimique consistant à déverser dans l'eau des particules floculantes d'argile ou de limon, de façon à faire précipiter le plancton toxique, est utilisée au Japon et en Corée, mais cette technique n'est pas sélective et a un impact néfaste sur l'écosystème. Le but de l'invention est donc de pourvoir à des moyens de détection de microorganismes planctoniques présents dans de l'eau, tels que des microalgues, et à un procédé d'élimination sélective de ces microorganismes, qui soient utilisables aussi bien à l'échelle du laboratoire qu'à l'échelle industrielle, ainsi qu'au niveau de l'écosystème naturel, en milieu marin notamment. A cette fin, les Inventeurs ont eu l'idée de rechercher si des copolymères du type de ceux décrits dans l'article de M. JOZEFOWICZ et
J. JOZEFONVICZ, paru dans Biomaterials, 1997, 18, 1633-1644, pouvaient être utilisés en tant que matériau présentant une affinité envers certains microorganismes planctoniques, cette affinité étant suffisamment importante et spécifique pour permettre la capture de ces microorganismes, que ce soit en vue de leur détection, de leur isolement ou de leur élimination. La présente invention a pour objet un copolymère statistique insoluble comprenant un polymère synthétique dont les unités monomériques de base sont substituées par au moins un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles par substitution statistique d'un polymère synthétique à l'aide d'acides aminés ou de leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste, et e) synthèse d'un copolymère identifié à l'issue de l'étape d). L'étape e) de synthèse d'un copolymère peut être effectuée en utilisant les techniques de chimie organique connues de l'Homme de l'art.
Le polymère synthétique mentionné ci-dessus est par exemple sélectionné dans le groupe constitué par les polymères vinyliques (tels que les acrylates ou le polystyrène), les polymères diéthyléniques, les polyuréthannes et les silicones. On entend par « protiste » un microorganisme eucaryote unicellulaire autotrophe ou hétérotrophe. A titre d'exemples de protistes, on peut citer les microorganismes zooplanctoniques ou phytoplanctoniques, tels que les microalgues, ou encore les protozoaires.
Le copolymère défini ci-dessus peut être utilisé pour éliminer ledit protiste, dans le cas où il présente un risque pour l'environnement ou pour la santé. On peut citer par exemple les entités taxonomiques nuisibles suivantes : genres Dinophysis, Alexandrium, Gonyaulax, Protogonyaulax, Gambier disais, Ostreopsis, Ceratium, Prorocentrum, Gymnodinium, Gyrodinhim, Heterosigma, Chatonella et Phaeocystis. Le copolymère peut également être utilisé pour isoler ou capturer ledit protiste, par exemple dans le but de récupérer des substances produites par ce dernier : certains protistes produisent en effet des métabolites d'intérêt industriel, par exemple en pharmacologie, ou dans les domaines alimentaire et technologique. A titre d'exemples, on peut citer les microalgues productrices d'acides gras polyinsaturés et les diatomées productrices de silice biominérale (Bacillariophycées).
Au cours de l'étape c) décrite ci-dessus, une association se forme entre ledit protiste et les copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ce protiste. Les copolymères conformés à l'invention, sélectionnés par le procédé défini ci-dessus, présentent donc une affinité spécifique envers un protiste donné. Ce caractère biospécifique est dû à la fonctionnalisation statistique du copolymère, et provient également du procédé par lequel le copolymère est sélectionné.
De par sa fonctionnalisation statistique, le copolymère conforme à l'invention mime la structure d'un ligand naturel des récepteurs membranaires (tels que des facteurs de croissance, des glycopeptides, des lipopeptides) du protiste envers lequel il présente une affinité spécifique. Ainsi, le copolymère conforme à l'invention consiste avantageusement en un mimétique d'un peptide ou d'un dérivé de peptide.
Selon un mode de réalisation avantageux du copolymère conforme à l'invention, lesdites unités monomériques de base du polymère synthétique sont substituées, de façon statistique, par des groupements sulfonates et par de l'acide aspartique ou l'un de ses dérivés, de préférence un ester de l'acide aspartique (par exemple l'ester diméthylique).
Selon un autre mode de réalisation du copolymère conforme à l'invention, ledit acide aminé ou dérivé d'acide aminé est relié aux unités monomériques de base du polymère synthétique σ par une liaison chimique appropriée, par exemple une liaison sulfamide.
Selon un autre mode de réalisation du copolymère conforme à l'invention, ce dernier comprend, en pourcentages molaires : . entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, de préférence entre
25 et 31%,
. entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, de préférence entre 21 et 25%, et
. entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, reliées auxdites unités styrène par une liaison sulfamide.
Un tel copolymère présente une affinité spécifique envers l'espèce Alexandriitm minutum.
Le copolymère conforme à l'invention peut par exemple comprendre, en pourcentages molaires, environ 29%o d'unités styrène non substituées, environ 24% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et environ 41% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique. L'invention a également pour objet l'utilisation du copolymère défini ci-dessus pour la capture sélective d'un protiste donné, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce.
Une telle utilisation est particulièrement utile pour capturer des protistes nuisibles.
A titre d'exemples, on peut citer des espèces produisant des toxines endocellulaires qui se concentrent dans les produits de la mer au cours de la chaîne alimentaire et qui causent chez le consommateur humain divers désordres et intoxications de type gastrointestinal ou neurologique tels que : . des intoxications de type paralytique (PSP : « Paralytic Shellfish
Poisoning ») agissant sur le système nerveux central, occasionnées par des dinoflagellés comme Alexandrium catenella, Alexandrium minutum, Alexandrium acatenella, Alexandrium cohorticula, Alexandrium fundyense, Alexandrium fraterculus, Alexandrium ostenfeldii, Alexandrium tamarense, Gymnodinium catenatum, Pyrodinium bahamense var. compressum,
. des intoxications de type diarrhéique (DSP : « Diarrhetic Shellfish Poisoning »), occasionnées par des espèces comme Dinophysis acuta, Dinophysis acuminata, Dinophysis norvegica, Dinophysis mitra, Dinophysis rotundata, Prorocentrum lima, Prorocentrum mexicanum, . des intoxications de type amnésique (ASP : « Amnésie Shellfish
Poisoning »), occasionnées par des espèces de diatomées comme Pseudo-nitzschia multiseries, Pseudo-nitzschia pseudodelicatissima, Pseudo-nitzschia australis, ou de dinofiagellé comme Pβesteria piscicida,
. des intoxications de type ciguaterique (CFP : « Ciguatera Fish Poisoning »), occasionnées par des espèces comme Gambierdiscus toxiciis, Ostreopsis spp., Prorocentrum spp.,
. des intoxications de type neurotoxique (NSP : « Neurotoxic Shellfish Poisonmg »), occasionnées par des espèces comme Gymnodinium brève et Gymnodinium cf. breve, On peut également citer les protozoaires dont une partie du cycle de vie comporte une ou plusieurs phases aquatiques (amibes, paramécies, trypanosomes, plasmodium, ...), dont l'ingestion entraîne une intoxication ou une parasitose.
On peut également citer des espèces qui ne sont pas toxiques pour le consommateur humain, mais qui occasionnent des pertes de cheptel aquacole importantes et induisent des perturbations considérables des écosystèmes côtiers, telles que la diatomée Chaetoceros convultus, les haptophycées comme
Chrysochromulina polylepis, Phaeocystis pouchetii, Phaeocystis antartica, Prymnesium parvum et Prymnesium patelliferum, les dinoflagellés comme Gymnodinium mikimotoi et Gymnodinium corsicum, ainsi que les raphydophytes comme Heterosigma carterae, Chattonella antiqua, Chattonella marina et Chattonella verruculosa. L'invention a également pour objet l'utilisation du copolymère décrit ci-dessus qui comprend, en pourcentages molaires, entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et entre 44 et 55%> d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, pour la capture sélective de l' espèce Alexandrium minutum, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce.
L'invention a également pour objet un dispositif de filtration d'eau pour en éliminer sélectivement au moins un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un copolymère tel que décrit précédemment, ledit copolymère comprenant de préférence, en pourcentages molaires, entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, tel que décrit ci-dessus, lorsque ledit protiste est l'espèce Alexandrium minutum.
Grâce à ce dispositif, la concentration dudit protiste donné est diminuée de manière significative dans l'eau filtrée (eau douce ou eau de mer par exemple).
Un tel dispositif de filtration d'eau peut par exemple se présenter sous la forme d'un filet ou d'une membrane filtrante. De manière générale, il est bien entendu que tout matériau d'une porosité donnée, dont la surface est revêtue du copolymère selon l'invention, pourrait être utilisée dans ce dispositif.
On pourrait également envisager l'utilisation des copolymères décrits ci-dessus en tant que phase stationnaire en chromatographie d'affinité sur colonne, toujours dans le but d'éliminer un protiste donné d'une source d'eau.
La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de copolymères présentant une affinité spécifique envers un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles, mimétiques de peptides ou de dérivés de peptides, par substitution statistique d'un polymère synthétique par des acides aminés ou leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), et d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste.
Ledit protiste est tel que décrit précédemment. Il consiste par exemple en l' espèce Alexandrium minutum. Le procédé selon l'invention peut comprendre, entre les étapes b) et c), une étape de marquage radioactif dudit protiste. Auquel cas, l'étape d) est effectuée par la détection des associations copolymère/protiste qui donnent lieu à une émission de radioactivité.
Le procédé selon l'invention peut également comprendre, entre les étapes c) et d), une étape d'élimination des cellules qui ne se sont pas associées aux copolymères, réalisée par tamisage.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de procédés de synthèse et de sélection de copolymères conformes à l'invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente le profil d'adhésion des cellules d' lexandrium minutum en fonction de la composition de copolymères à base de polystyrène, comprenant différents taux de substitution en ester diméthylique de l'acide aspartique. Les abscisses représentent le taux de substitution des copolymères en ester diméthylique de l'acide aspartique. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé en un rapport signal radioactif/bruit de fond (courbe - -). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe - m -), - la figure 2 représente le profil d'adhésion des cellules d' Heterocapsa triquetra en fonction de la composition de ces mêmes copolymères à base de polystyrène, comprenant différents taux de substitution en ester diméthylique de l'acide aspartique. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes significations que dans la figure 1. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Synthèse d'une librairie de copolymères mimétiques de dérivés de peptides. 1) Polymère synthétique utilisé.
On utilise des microsphères de polystyrène réticulées avec 3% de divinylbenzène, commercialisées par Bio-Rad Laboratories (Richmond, Californie, USA) sous la dénomination BioBeads SX3.
Afin d'en éliminer toute impureté résiduelle, ,εes microsphères de polystyrène sont lavées successivement à l'aide de soude 1M, d'eau déminéralisée, d'acide chlorhydrique 1M et de nouveau à l'aide d'eau déminéralisée, chaque lavage étant effectué pendant 3 heures. A l'issue du dernier lavage, les microsphères de polystyrène sont filtrées, puis séchées sous vide à 50°C.
2) Protocole de substitution statistique du polystyrène.
Les substitutions choisies consistent en des sulfamides de l'ester méthylique de l'acide aspartique de l'alanine, de la leucine, ou de la phénylalanine. Le protocole qui suit est répété, pour ces quatre familles de substituants, de façon à obtenir huit degrés de substitution différents.
• Chlorosulfonation.
2,5 g de microsphères de polystyrène sèches sont gonflées dans 75 ml de dichlorométhane, pendant une nuit. On procède ensuite à une réaction de chlorosulfonation : les microsphères de polystyrène sont mises en contact avec un excès d'acide chlorosulfonique (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), pendant 60 minutes, à 40°C, sous agitation et sous reflux. Les microsphères de polystyrène chlorosulfonées sont lavées sous vide à l'aide, successivement, de dichlorométhane distillé, d'acétone distillé et de nouveau de dichlorométhane distillé, puis dispersées dans 100 ml de dichlorométhane.
• Sulfamidation.
Pour obtenir environ 10% de substitution du polystyrène, 0,11 moles d'acide aminé, sous forme de chlorhydrate d'ester monométhylique (dans le cas de la leucine et de la phénylalanine) ou diméthylique (dans le cas de l'acide aspartique), sont introduits par mole de polystyrène sec. La réaction est initiée par l'ajout de 2 équivalents molaires de triéthylamine, suivie d'une agitation douce du mélange pendant 48 heures, puis de nouveau par l'ajout d' 1 équivalent de triéthylamine, le milieu réactionnel étant maintenu sous agitation pendant 12 heures. Une fois la réaction de sulfamidation effectuée, les copolymères sont filtrés et lavés trois heures dans de l'éthanol pour éliminer les traces de dichlorométhane.
A ce stade, on obtient donc quatre familles de copolymères :
. famille I : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique,
. famille II : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de la phénylalanine,
. famille III : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de la leucine, . famille IN : copolymères comprenant des unités styrène substituées par des esters méthyliques de l'alanine, les copolymères de ces trois familles présentant chacun des degrés variables en acides aminés sous forme d'esters, ainsi que des unités styrène non substituées et des unités styrène substituées par des groupements chlosulfonates.
Dans le tableau I ci-après sont rassemblées, pour les familles de copolymères I à IN, les quantités d'acide aminé sous forme d'ester utilisées lors de la réaction de sulfamidation (quantités exprimées en grammes pour 2,5 grammes de polystyrène sous foπne sèche, et en pourcentage molaire pour 100 moles de polystyrène), ainsi que les quantités de triéthylamine utilisées (en millilitres) lors du premier ajout (2 équivalents) et du second ajout (1 équivalent). • Hydrolyse.
Pour les familles de copolymères I et IV, on procède ensuite à une réaction d'hydrolyse faible, au moyen de six lavages par de la soude 10"" M, suivis de lavages à l'eau déminéralisée jusqu'à ce que le pH des bains de lavage reste constant.
L'hydrolyse faible permet d'obtenir des copolymères comprenant, outre des unités styrène non substituées, des unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium et des unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, ou des esters méthyliques de l'alanine. Pour les familles de copolymères II et III, on procède à une réaction d'hydrolyse forte à l'aide de soude 2M. Afin de minimiser le choc osmotique et de ne pas endommager les microsphères de polystyrène, on utilise un gradient croissant, puis décroissant pour la concentration de la soude (dans l'ordre : 10" , 10" , 1, 2, 1,
10"', puis 10"2M). L'hydrolyse forte permet d'obtenir des copolymères comprenant, outre des unités styrène non substituées, des unités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium et des unités styrène substituées par le sel sodé de la phénylalanine ou de la leucine.
3) Caractérisation chimique des copolymères synthétisés.
Le tableau II résume les taux de substitution des quatre familles de copolymères, à savoir les taux en imités styrène non substituées (colonne « styrène » dans le tableau II), en imités styrène substituées par des groupements sulfonates de sodium (colonne « sulfonate » dans le tableau II), et en unités styrène substituées par des acides aminés, sous forme d'ester méthylique dans le cas des copolymères de la famille I et de la famille IN, et sous forme de sel sodé dans le cas des copolymères des familles II et III (colonne « acide aminé » dans le tableau II).
Ces taux de substitution sont déduits de l'analyse élémentaire des copolymères en azote (analyseur Perkin-Elmer 2400 CHΝ), en soufre (analyseur o so
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coulométrique Tacussel de type Coulomatic S-Cl) et en chlore (analyseur Titrator DL 55 de Mettler Toledo), mesurée après passage des copolymères dans un four à 50°C, pendant un temps suffisant pour rester à poids constant. Dans le tableau I, l'analyse élémentaire en azote (N), en soufre (S) et en chlore (Cl) est donnée en pourcentage pondéral (c'est-à-dire en grammes pour 100 grammes de polystyrène sous forme sèche).
Le tableau II mentionne également le taux de gonflement des copolymères, mesuré par la différence entre le volume occupé par une quantité donnée de copolymère à l'état sec (sous forme de poudre) et le volume occupé par cette même quantité de copolymère placé dans du milieu Guillard f/2 tel que décrit par R.R.L. Guillard (1983) dans l'ouvrage Culture of Marine Invertebrates, Selected Readings, C.J. Berg Jr. Editor, pages 108-132. Ce milieu consiste en de l'eau de mer dans laquelle sont additionnés les sels nutritifs nécessaires à la croissance des microalgues Alexandrium minutum, Heterocapsa triquetra et Scrippsiella trochoidea. On constate que le taux de gonflement est d'autant plus important que le copolymère comprend un taux de substitution en groupements sulfonates de sodium élevé (groupements de nature hydrophile).
EXEMPLE 2 : Culture de microalgues et marquage radioactif de ces dernières. 1) Culture des microalgues. Des souches à Alexandrium minutum (souche AM89BM fournie par l'IFREMER) et ' Heterocapsa triquetra (souche CCMP 449 fournie par la société CCMP, West Boothbay Harbour, USA) sont cultivées dans des conditions similaires à celles décrites par S. La Barre ét al, dans Journal of Biotechnology, 1999, 70, 207-212 : le milieu de culture consiste en 80 ml d'eau de mer (qui a été filtrée de façon à en éliminer les bactéries) enrichie de 3 ml de solution de Guillard f/2 exempte de silicium. Ce milieu est stérilisé à 120°C pendant 30 minutes, puis enrichi par des vitamines du groupe B à l'état de traces. Une solution antibactérienne commerciale (Life Technologies, Eragny, France) comprenant un mélange de pénicilline (5000 unités/ml) et de streptomycine (5000 unités/ml) est ajoutée à ce milieu, à raison de 1% en volume, avant son inoculation avec 103 cellules ? Alexandrium minutum ou ' Heterocapsa triquetra. Le milieu est complété à 100 ml par du milieu f/2 stérilisé, puis il est incubé à 17°C sous une alternance de lumière (85 μE.s"'.m"2) et d'obscurité avec des cycles 12 heures / 12 heures, une agitation douce étant effectuée deux fois par jour. La courbe de prolifération (représentation du nombre de cellules par ml en fonction du temps) de la souche Alexandrium minutum révèle une période de latence de 2 jours, suivie d'une phase de multiplication exponentielle de 21 jours, puis d'une période stationnaire (plateau) au jour 23. La vitesse de division cellulaire à la moitié de la phase exponentielle de croissance (jour 14 après l'inoculation) est de 3,4 jours, en accord avec ce qui a été décrit dans l'article de S. LA BARRE et al. (ibid). Scrippsiella trochoidea possède un temps de génération de
4,35 jours à la moitié de la phase exponentielle de croissance (jour 9 après l'inoculation), le début de la phase stationnaire (plateau) étant observé au jour 14.
Heterocapsa triquetra présente un cycle de croissance plus rapide qu' Alexandrium minutum : la phase de latence est de 1,5 jours et celle de multiplication exponentielle est de 7 jours, le plateau étant atteint au jour 8,5. La vitesse de division cellulaire est de 1,7 jours, c'est-à-dire deux fois plus rapide que celle à! Alexandrium minutum.
2) Marquage radioactif des microalgues.
Le marquage des cellules d' Alexandrium minutum, d Heterocapsa triquetra ou de Scrippsiella trochoidea est également effectué conformément à S. LA BARRE et al. (ibid) : 100 ml de la culture d: lexandrium minutum (âgée de 14 jours) de Scrippsiella trochoidea (âgée de 9 à 10 jours) ou la culture d' Heterocapsa triquetra (âgée de 5 jours) est incubée avec 250 μCi d' orthophosphate 3jP dans 25 μl d'acide chlorhydrique 10"2 M, commercialisé par la société Amersham (France), pendant 96 heures pour Alexandrium minutum, pendant 67 heures pour Scrippsiella trochoidea ou pendant 41 heures pour Heterocapsa triquetra.
Le milieu est ensuite réduit à un volume de 20 ml par filtration sur une membrane de porosité égale à 5 micromètres (membrane Durapore® commercialisée par Millipore), puis complété à 100 ml par ajout d'un nouveau volume de milieu f/2, ces opérations étant répétées 7 à 8 fois jusqu'à ce que l'on ne détecte plus qu'une radioactivité négligeable dans le filtrat, mesurée comme indiqué dans l'article de S. LA BARRE et al. (ibid).
EXEMPLE 3 : Sélection des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers Alexandrium minutum, Scrippsiella trochoidea ou Heterocapsa triquetra. 1) Cinétique d'adhésion cellulaire.
La mesure de la cinétique d'adhésion cellulaire permet d'évaluer le temps de contact optimal pour l'adhésion des cellules aux copolymères. Pour cette mesure, on utilise un copolymère test, par exemple un copolymère à base de polystyrène substitué à hauteur de 81%ι par des groupements sulfonates de sodium. Ce copolymère est préparé conformément au protocole décrit dans l'exemple 1, par une étape de chlorosulfonation suivie d'une réaction d'hydrolyse.
20 mg (poids sec) de ce copolymère test sont mis en suspension dans 200 μl de milieu f/2. On y ajoute une quantité donnée (environ 10 cellules) de cellules à? Alexandrium minutum marquées au 33P conformément à l'exemple 2, le mélange étant ensuite complété jusqu'à 7 ml par du milieu f/2. On prépare 7 échantillons de ce mélange. Les sept échantillons sont placés sous agitation, à la vitesse de lO rpm, pour des durées respectives de 4, 8, 24, 30, 50, 56 et 72 heures et à la température de 17°C. A l'issue de chacun de ces sept temps respectifs d'incubation, l'échantillon correspondant est filtré sur un tamis de nylon de trame égale à 60 μm, de façon à retenir le copolymère et à éliminer les cellules qui n'ont pas adhéré au copolymère. La filtration est suivie de trois lavages par 1 ml de milieu f/2.
Les mesures de radioactivité sur chaque échantillon sont réalisées comme suit : le filtre de nylon, avec le résidu de filtration, est placé dans une fiole de scintillation, auquel on ajoute 1 ml de soude 2M afin de lyser les cellules, puis 10 ml de fluide de scintillation (commercialisé par la société Fisher Chemicals sous la dénomination Wallac Optiphase Hisafe 2). Par ailleurs, pour contrôle, 200 μl du filtrat contenant les cellules qui n'ont pas adhéré au copolymère sont placés dans une fiole de scintillation contenant 1 ml de soude 2M et 2 ml de fluide de scintillation. Le contenu des fioles est homogénéisé au vortex et l'émission de rayons β est mesurée sur un appareil Wallac LKB 1214 de la société Rackbeta. Le même protocole est suivi avec les cellules ? Heterocapsa triquetra et de Scrippsiella trochoidea, le temps d'incubation des cellules avec le copolymère porteur de groupements sulfonate de sodium étant respectivement de 25, 32, 54, 68 et 72 heures.
Pour chaque type de cellules, on obtient la cinétique d'adhésion cellulaire au copolymère testé : en fonction du temps, le nombre de cellules qui adhèrent au copolymère est d'abord croissant, puis atteint un plateau. Ce plateau est atteint à partir de 55 heures pour Alexandrium minutum et à partir de 32 heures pour Heterocapsa triquetra. Dans les expériences d'adhésion cellulaire qui suivent, dans le but de conserver une marge de sécurité, les temps d'incubation des différents copolymères avec les cellules d' Alexandrium minutum ou à" Heterocapsa triquetra seront respectivement de 72 heures et de 48 heures.
2) Adhésion cellulaire en fonction de la composition du copolymère.
20 mg (poids sec) de chacun des huit copolymères des familles I, II,
III et IV, préparés conformément au protocole décrit dans l'exemple 1 et mis en suspension dans du milieu f/2, sont mis en présence d'une quantité donnée (environ 10 cellules) de cellules & Alexandrium minutum marquées au 33P conformément à l'exemple 2 (14250 cellules/ml, marquées à 15 cpm par cellule). A l'issue de 72 heures d'incubation à 17°C, on sépare le copolymère (auquel ont adhéré des cellules) des cellules libres en solution au moyen de l'étape de filtration décrite précédemment en rapport avec la mesure de la cinétique d'adhésion cellulaire. On mesure ensuite la radioactivité du copolymère, comme indiqué ci-dessus. On procède de la même façon à partir de cellules Scrippsiella trochoidea et d Heterocapsa triquetra, mises en présence respectivement des huit copolymères de la famille I pendant 48 heures, et des neuf copolymères de la famille IN pendant 24 heures.
La figure 1 représente le profil d'adhésion des cellules d' Alexandrium minutum en fonction de la composition des copolymères de la famille I. Les abscisses représentent le taux de substitution des copolymères de la famille I en ester diméthylique de l'acide aspartique. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé par le rapport signal radioactif/bruit de fond (courbe - -). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe -«-).
On observe une zone d'adhésion non spécifique jusqu'à un taux de substitution des copolymères en ester diméthylique de l'acide aspartique d'environ 30%>, la surface disponible pour l'adhésion des cellules étant plus importante pour les copolymères qui présentent un taux de substitution en acide aminé faible (copolymères qui présentent le taux de gonflement le plus important).
Au-delà de 30% de substitution, le gonflement des copolymères reste stable, permettant des comparaisons entre les taux d'adhésion des cellules. Le pic marqué sur le graphique est significatif d'une adhésion cellulaire spécifique, qui a lieu pour les copolymères qui comprennent entre 44 et 55% d'ester diméthylique de l'acide aspartique.
D'autre part, les profils d'adhésion réalisés à partir des copolymères des familles II et III, en présence des cellules d' Alexandrium minutum, n'ont révélé aucune affinité spécifique entre ces copolymères et ces cellules. La spécificité des copolymères envers les cellules d Alexandrium minutum apparaît donc dépendante de la composition du copolymère. Cette spécificité pourrait s'expliquer par le fait que les copolymères, de par l'arrangement statistique des différentes unités styrène, sulfonates et ester diméthylique de l'acide aspartique, présentent des sites de liaison spécifiques envers un ou plusieurs composants de la membrane plasmique des cellules. La figure 2 représente le profil d'adhésion des cellules d' Heterocapsa triquetra en fonction de la composition des copolymères de la famille I. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes significations que ceux de la figure 1.
En présence des cellules d' Heterocapsa triquetra, contrairement à ce qui est observé avec Alexandrium minutum, les copolymères de la famille I ne donnent pas lieu à une interaction spécifique, bien que Heterocapsa triquetra soit également un dinoflagellé autotrophe, qui appartient à une famille taxonomique (Peridiniaceae) proche de celle d' Alexandrium minutum (Gonyaulacaceae). Ces résultats montrent que l'affinité des copolymères de la famille I envers les cellules testées est spécifique de l'espèce Alexandrium minutum.
La figure 3 représente le profil d'adhésion des cellules d' Alexandrium minutum en fonction de la composition des copolymères de la famille IN. Les abscisses représentent le taux de subsitution des copolymères de la famille IN en ester méthylique de l'alanine. L'axe des ordonnées situé à gauche du graphique représente le taux d'adhésion des cellules sur les copolymères, exprimé par le rapport signal/bruit de fond (courbe -Φ-). L'axe des ordonnées situé à droite du graphique représente le taux de gonflement des copolymères dans le milieu f/2 (courbe - m -).
Le profil d'adhésion correspond :
- d'une part à l'augmentation de l'adhésion des cellules, de caractère non spécifique de la composition des copolymères, dès que cette dernière est inférieure à 30%> en ester méthylique de l'alanine. Cette augmentation du bruit de fond est monotone et n'excède pas 0,5% des cellules adhérées pour la composition la plus faible en ester méthylique de l'alanine (8%),
- d'autre part à la présence d'un pic significatif d'une adhésion cellulaire spécifique des copolymères comprenant au moins 8% d'ester méthylique de l'alanine, et au plus 30%o. Au delà de 30%> de substitution, le gonflement des copolymères reste stable et le profil d'adhésion est monotone, ne présentant aucune indication d'adhésion cellulaire excédant le bruit de fond de manière significative.
La figure 4 représente le profil d'adhésion des cellules de Scrippsiella trochoidea en fonction de la composition des copolymères de la famille IN. Les axes des abscisses et des ordonnées ont les mêmes signification que ceux de la figure 3.
Le profil d'adhésion des cellules de Scrippsiella trochoidea sur les copolymères de la famille IV est comparable à celui observé pour Alexandrium minutum sur la figure 3. Ces résultats montrent que les copolymères de la famille IN, possédant au moins 8% et au plus 30% d'ester méthylique de l'alanine présentent des sites de liaison envers un ou plusieurs composants de la membrane plasmique d' Alexandrium minutum et de Scrippsiella trochoidea qui appartiennent à des familles taxonomiques proches, respectivement Peridiniaceae et Gonyaulacaceae, mais ne possèdent pas d'affinité spécifique de genre vis-à-vis de Scrippsiella trochoidea et Alexandrium minutum.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Copolymère statistique insoluble comprenant un polymère synthétique dont les unités monomériques de base sont substituées par au moins un acide aminé ou un dérivé d'acide aminé, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles par substitution statistique d'un polymère synthétique à l'aide d'acides aminés ou de leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste, et e) synthèse d'un copolymère identifié à l'issue de l'étape d). 2°) Copolymère selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit polymère synthétique est sélectionné dans le groupe constitué par les polymères vinyliques, les polymères diéthyléniques, les polyuréthannes et les silicones.
3°) Copolymère selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste en un mimétique d'un peptide ou d'un dérivé de peptide.
4°) Copolymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites unités monomériques de base du polymère synthétique sont substituées, de façon statistique, par des groupements sulfonates et par de l'acide aspartique ou l'un de ses dérivés. 5°) Copolymère selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit dérivé de l'acide aspartique est un ester de l'acide aspartique.
6°) Copolymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérise en ce que ledit acide aminé ou dérivé d'acide aminé est relié aux unités monomériques de base du polymère synthétique par une liaison chimique appropriée.
7°) Copolymère selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite liaison chimique est une liaison sulfamide.
8°) Copolymère selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, en pourcentages molaires : . entre 5 et 40% d'unités styrène non substituées, de préférence entre
25 et 31%,
. entre 15 et 51% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, de préférence entre 21 et 25%, et
. entre 44 et 55% d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique, reliées auxdites unités styrène par une liaison sulfamide.
9°) Copolymère selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend, en pourcentages molaires, environ 29% d'unités styrène non substituées, environ 24% d'unités styrène substituées par des groupements sulfonates, et environ 47%) d'unités styrène substituées par des esters diméthyliques de l'acide aspartique. 10°) Utilisation du copolymère selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la capture sélective d'un protiste donné, en vue de la détection ou de l'élimination de cette espèce.
11°) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit copolymère est tel que défini dans la revendication 8 ou la revendication 9 et en ce que ledit protiste consiste en l'espèce Alexandrium minutum.
12°) Dispositif de filtration d'eau pour en éliminer sélectivement au moins un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
13°) Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit protiste consiste en l'espèce Alexandrium minutum et en ce que ledit copolymère est tel que défini dans la revendication 8 ou la revendication 9.
14°) Dispositif selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un filet ou d'une membrane filtrante. 15°) Procédé de sélection de copolymères présentant une affinité spécifique envers un protiste donné, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) synthèse d'une librairie de copolymères insolubles, mimétiques de peptides ou de dérivés de peptides, par substitution statistique d'un polymère synthétique par des acides aminés ou leurs dérivés, b) préparation d'une culture cellulaire d'un protiste donné, c) mise en contact des copolymères préparés à l'étape a) avec une fraction de la culture cellulaire préparée à l'étape b), et d) sélection et identification des copolymères qui présentent une affinité spécifique envers ledit protiste.
16°) Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit protiste est V espèce Alexandrium minutum.
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