EP0663948A1 - Nouvel additif de biogradation - Google Patents

Nouvel additif de biogradation

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EP0663948A1
EP0663948A1 EP93919407A EP93919407A EP0663948A1 EP 0663948 A1 EP0663948 A1 EP 0663948A1 EP 93919407 A EP93919407 A EP 93919407A EP 93919407 A EP93919407 A EP 93919407A EP 0663948 A1 EP0663948 A1 EP 0663948A1
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EP
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additive
flour
acylated
hydrocarbons
biodegradation
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EP93919407A
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Anne Basseres
Patrick Chemin Du Pont-Long Eyraud
Alain Ladousse
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Societe National Elf Aquitaine
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Societe National Elf Aquitaine
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

La présente invention a pour objet un additif de biodégradation caractérisé en ce qu'il consiste en un mélange comprenant: (i) au moins une source d'azote assimilable consistant en au moins un acide aminé, non-substitué ou substitué; (ii) au moins une source de phosphore; selon un rapport N/P compris entre 2 et 100; ledit additif ayant été soumis à un traitement visant à le rendre oléophile. Elle concerne également l'utilisation d'un additif selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la biodégradation d'hydrocarbures.

Description

NOUVEL ADDITIF DE BIODEGRADATION
La présente invention a pour objet un nouvel additif de biodégradation et son application pour le traitement de mi- lieux souillés par des hydrocarbures, par accélération de la biodégradation naturelle.
Il existe de nombreux procédés mettant en oeuvre des cultures de micro-organismes, qui sont développées en condi¬ tions contrôlées (dans des réacteurs par exemple) et ensuite appliquées sur le milieu à traiter. Mais ces procédés ne sont pas efficaces dès qu'il s'agit de travailler en milieu ouvert. On observe en effet des problèmes liés à la dilution des micro-organismes dans le milieu naturel, et des problèmes de compétition avec les micro-organismes indigènes bien mieux adaptés au milieu considéré. C'est pourquoi on s'est orienté vers la solution dans laquelle on stimule les micro-organismes indigènes en leur apportant des éléments nutritifs nécessaires à leur développement et qui sont limitants dans le milieu naturel. Aussi, a-t-on proposé des additifs nutritionnels qui sont additionnés au milieu à traiter. Ces additifs peuvent être des fertilisants du type de ceux utilisés en agriculture, ou des produits protéiques de synthèse, ou encore des lyophi- lisats bactériens avec le nutriment. Ces produits satisfont aux besoins en carbone, azote, phosphore des bactéries. Les besoins particuliers des micro-organismes en azote et phos¬ phore correspondent à un rapport molaire N/P variable dans une large mesure, sans altération sensible de l'efficacité. Outre l'azote et le phosphore, ces additifs comportent du carbone assimilable. Ce carbone assimilable est contenu dans des molé¬ cules hydrocarbonées dont la chaîne est similaire à une chaîne aliphatique que 1'on rencontre dans les hydrocarbures. Par ailleurs, ces produits servent de "starter", c'est-à-dire qu'ils favorisent la réaction dans les premiers instants.
La disponibilité des nutriments est aussi un problème important, puisque celle-ci conditionne la cinétique de dégra¬ dation des hydrocarbures. Afin d'accélérer cette cinétique, on a proposé diverses solutions, qui consistent à mélanger les nutriments avec des additifs divers et à former des suspen¬ sions, et surtout des émulsions. FR-A-2 490 672 décrit des microémulsions dans lesquelles les substances nutritives sont dans une solution aqueuse qui est microémulsionnée dans un liquide lipomiscible. Cependant, cette technique implique 1'étape de formation de la microémulsion et nécessite la pré¬ sence d'additifs tels que des tensio-actifs et autres, qui sont coûteux. FR-A-2 512 057 décrit une amélioration de la solution proposée dans le brevet précédemment cité qui consis¬ te à apporter la source d'azote sous la forme d'un système dual comportant deux sortes chimiquement différentes de compo¬ sés azotés. Un système préféré est un système consistant en urée et acides aminés. Par ailleurs, ce brevet enseigne que les acides aminés seuls ne sont pas aussi efficaces que le système dual. Ce système dual étant aussi une microémulsion, il souffre des mêmes inconvénients que toute (micro)émulsion.
Cependant, ces additifs de synthèse présentent des pro- blêmes de toxicité, du fait de la présence de dérivés, tel par exemple du butoxyéthanol, et autres produits similaires.
Aussi recherche-t-on des produits naturels en tant qu'additifs; mais le problème est que ces produits ne contien¬ nent pas de carbone sous une forme proche d'un groupe alipha- tique du type de ceux présents dans les hydrocarbures et, par là, ne sont pas susceptibles de conduire à un effet starter. Par ailleurs, on recherche des additifs qui puissent s'utili¬ ser sans nécessiter une (micro)émulsion ou l'emploi d'additifs coûteu . O connaît par ailleurs 1'emploi de farines animales en tant que nutrient pour des microorganismes, ceux-ci étant en solution ou suspension aqueuse.
Biosis Previews Databan . Philadelphie, Biosis Number: 83042449, G.A. Kochkina et al.: "Development of a Nutrient Médium for Cultivating Ntomophthora-Thaxteriana" & Biotekhno- logiya, vol. 4, 1986, pages 46-51, décrit l'utilisation de farine de poisson comme nutrient pour la culture d'un micro- organisme, par exemple Entomophthora-Thaxteriana fungi.
Biosis Previews Databank, Philadelphie, Biosis Number: 70050436, M. Rusan et al.: "Influence of Animal Proteins on the Fermentation of Antibiotics" & Bol Soc Broteriana 52, vol. 0, 1978, (Recd. 1979), pages 29-36, décrit l'utilisation de farines de viandes ou de sang comme source d'azote pour la production d'antibiotiques à partir de microorganismes de type fungi.
Biosis Previews Databank, Philadelphie, Biosis Number: 70043472, 0. Yagi et al.: "Dégradation of Poly Chlorinated Bi Phenyls by Microorganisms" & J. ater Pollut Control Fed 52, vol. 5, 1980, pages 1035-1043, décrit l'utilisation de micro¬ organismes pour la lutte contre la pollution, de l'extrait de viande étant additionné au milieu de culture.
Cependant, il n'y a aucune indication que ces mêmes farines puissent aussi être utilisées dans un milieu souillé par un hydrocarbure, c'est-à-dire aussi différent qu'un milieu aqueux simple.
De façon surprenante, la demanderesse a trouvé que l'ad¬ ditif selon la présente invention répond à toutes les exigen- ces énnoncées ci-avant.
Ainsi, la présente invention a pour objet un additif de biodégradation caractérisé en ce qu'il consiste en un mélange comprenant:
(i) au moins une source d'azote assimilable consistant en au moins un acide aminé, non-substitué ou substitué; (ii) au moins une source de phosphore; selon un rapport N/P compris entre 2 et 100; ledit additif ayant été soumis à un traitement visant à le rendre oléophile. P r biodégradation, on entend la dégradation par un micro-organisme, présent in situ ou rapporté. Cette applica¬ tion peut donc être réalisée en milieu ouvert en présence d'une flore bactérienne indigène, ou sur sols en présence d'une flore bactérienne spécifique rajoutée, si celle en pré¬ sence est jugée insuffisante.
Le micro-organisme utilisé peut être une levure, un champignon, une bactérie; en fait tout micro-organisme sus- ceptible de dégrader un hydrocarbure est approprié. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer Pseudomonas, Aciteno- bacter, Flavobacterium, Artrobacter, Corynebacterium.
Par azote assimilable, on entend l'azote effectivement métabolisé par le micro-organisme lors de la dégradation. Ce traitement, visant à rendre oléophile l'additif, peut être un traitement classique. On peut citer, à titre d'exem¬ ple: acylation, estérification, greffage d'un radical long sur différents groupements, transformation par base de Schiff, formation de carbamate. en présence d'isocyanate et autres. De préférence, le traitement consiste en une acylation. La chaîne carbonée du groupe acyle est de préférence une chaîne grasse; avantageusement, on utilise un chlorure d'acide, par¬ ticulièrement l'acide laurylique.
Les acides aminés qui peuvent être utilisés dans la cadre de la présente invention peuvent être tout acide aminé, naturel ou les acides de synthèse proches tels que l'ornitine, et autre. Ces acides aminés peuvent être non-substitués ou substitués. Lorsqu'ils sont substitués, le substituant est un groupe alkyle, alkoxy inférieur, hydroxy et autre. De préférence, l'acide aminé est choisi dans le groupe con¬ sistant en: lysine, méthionine, cystine, thréonine, trypto- phane, hydroxylysine, hydroxyproline, et leurs mélanges.
De préférence, la source d'azote assimilable représente au moins 5% en poids du poids total dudit additif de biodégra- dation.
Selon un mode réalisation de la présente invention, la source d'azote assimilable se trouve dans des protéines repré¬ sentant au moins 50% en poids du poids total dudit additif.
Toute source de phosphore, tant naturelle que synthèti- que, est appropriée.
De préférence, la source de phosphore est un sel minéral de phosphore.
Avantageusement, ledit rapport N/P est compris entre 4 et 40, de préférence est égal à environ 16.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, l'addi¬ tif consiste en une farine animale.
Selon une variante, la farine est une farine de poisson. Selon une autre variante, la farine est une farine de viande. Les farines de poisson ou de viande sont obtenues par tout procédé classique de fabrication. A titre d'exemple, on peut citer le procédé suivant pour la farine de viande: dépe¬ çage des cadavres, broyage de ceux-ci, calibrage, préchauf- fage, égouttage, séchage, presse et broyage final. A titre d'exemple pour la farine de poisson, on peut citer le procédé suivant: déchiquetage, cuisson, presse, mélange avec un con¬ centré de jus de presse, séchage, tamisage, et broyage final. La composition de ces farines peut varier dans une large mesure; à titre d'exemple représentatif mais non-limitatif on donne ci-après des compositions pour diverses farines. Farines de poisson: protéines: 60 à 85% dont acides aminés principaux: lysine, méthionine, thréonine. matières grasses: 3 à 25%. matières minérales (phosphore, calcium, chlorures): 5 à 24%, Farines de viande: protéines: 60 à 85% dont acides aminés principaux: lysine, thréonine, hydroxy- proline. matières grasses: 2 à 7%. matières minérales (phosphore, calcium, chlorures): 7 à 28%,
L'utilisation des additifs selon la présente invention, en particulier de farines animales, telles que farines de viande ou poisson, est donc utile pour la biodégradation des hydrocarbures sur sols, sédiments et à la surface de l'eau. Les sédiments souillés par hydrocarbures peuvent provenir de déversements accidentels d'hydrocarbures ou non, tels que nettoyage de bassins, chaussée, sols, ... Cette utilisation est tout aussi adaptée et profitable, dans le cas de traite¬ ment en milieux fermés, tels que réacteurs, bourbier, stockage d'hydrocarbures et autres.
La proportion d'additif par rapport à l'hydrocarbure est variable. Le rapport massique [additif]/[hydrocarbures] est généralement comprise entre 3 et 30. De préférence, le rapport massique est égal à environ 10.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation 5 des présents additifs pour la biodégradation d'hydrocarbures. Les exemples suivants illustrent l'invention plus en détail. EXEMPLES COMPOSITION DES ADDITIFS
La composition des additifs de biodégradation est donnée ° dans le tableau ci-après.
Produits % Azote % Phosphore N/P % Carbone (P)
. farine de poisson 5 (Solatlante G)
. farine de viande 60 % .... (d'extraction Viandor)
. farine de viande 70%
(Creton d'extraction Viandor
. farine de viande 80% Q (Creton d'extraction Viandor)
Ces farines présentent les caractéristiques analytiques moyennes suivantes.
5
0
5
La présente invention est illustrée plus en détail dans les exemples suivants donnés à titre illustratif mais non limitatif.
Les figures 1 et 2 représentent 1'évolution des teneurs en azote ammoniacal dans les réservoirs et les réacteurs avec de la farine acylée ou non.
Les figures 3 et 4 représentent 1'évolution des teneurs en orthophosphate dans les réservoirs et les réacteurs avec de la farine acylée ou non. Les figures 5 et 6 représentent le relargage de 1'azote dans les réacteurs avec de la farine acylée ou non.
Les figures 7 et 8 représentent le relargage du phos¬ phore dans les réacteurs avec de la farine acylée ou non.
Les figures 9 et 10 représentent 1'évolution temporelle de la flore bactérienne totale et spécifique hydrocarbure en présence de farine non acylée et farine acylée.
La figure 11 représente l'évolution des indices de bio¬ dégradation des alcanes pour les deux expérimentations: en présence de farine acylée ou non. Les figures 12 et 13 représentent l'évolution temporelle des flores bactériennes totales et spécifiques hydrocarbures dans les trois bassins: témoin, avec farine non acylée et avec farine acylée.
La figure 14 représente la composition des échantillons de brut récupérés sur les 3 bassins, à TO, et à 42 jours: fraction alcane, aromatique, asphaltène et résine.
Les figures 15 à 18 sont les chromatogrammes de la fraction alcane pour, respectivement, le BAL 150 à 0 jour, le bassin témoin à 42 jours, le bassin traité avec de la farine non-acylée à 42 jours, le bassin traité avec de la farine cylée à 42 jours. EXEMPLE 1
Biodégradation des hydrocarbures en présence de farines ani¬ males acylées Afin de rendre plus oléophiles les farines animales, on a fait subir une réaction d'acylation aux farines brutes. Synthèse de la farine acylée
La synthèse de la farine acylée a été obtenue dans les conditions décrites ci-dessous.
Cette synthèse est réalisée en milieu solvant. Le principe de la réaction est de mettre en contact la farine animale (farine de poisson) avec un chlorure d'acide (chlorure de lauroyle C12H23C10) en présence de solvant (di- chlorométhane CH C1~)• On ajoute au milieu un capteur de pro¬ ton qui est de la triéthylamine [C^H-J^N], Dans un réacteur, on agite (agitateur mécanique) le mélange [chlorure de lauroyle + farine de poisson + dichloro- méthane + triéthylamine] pendant 24 heures à 30°C.
La quantité de chlorure d'acide est mise en excès (+20%) par rapport à celle nécessaire pour réagir sur les groupements aminé de la lysine. La lysine représente de l'or¬ dre de 5% des protéines de la farine de poisson. La quantité de triéthylamine est ajoutée dans les mêmes proportions.
Après 24 heures de réaction, la farine acylée est lavée sur filtre au solvant (dichlorométhane) pour éliminer l'excès de chlorure d'acide. Le gâteau est alors repris dans de l'eau, puis filtré pour éliminer 1'excès de triéthylamine et le sel formé. Le gâteau consistant en la farine acylée est alors séché à 1'étuve. Premier test (degré d'oléophilie de la farine acylée) Le degré d'oléophilie de la farine brute ou farine acy¬ lée est mesurée grâce à un test de coefficient de partage.
On agite pendant 5 minutes dans une ampoule à décanter un mélange eau de mer artificielle sans azote (700 ml) + hy¬ drocarbures (BAL 150: 28 g) et une quantité connue de farine animale à la surface des hydrocarbures. Après agitation, on laisse décanter pendant 12 heures et 1'on dose la teneur en azote de la phase aqueuse. Cette teneur en azote est repré¬ sentative d'un passage de l'azote contenu dans la farine à la phase aqueuse. On peut ainsi calculer le degré d'oléophilie. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau I. TABLEAU I
Degré d'oléophilie des farines animales
(HC: hydrocarbures, N: azote)
Quantité Quantité
Farine % poids % N dans d'azote d'azote % d'azote animale Farine/HC la farine introduite dans l'eau dans 1'eau
Farine brute 3,54% 12,1% 120 mg 123,9 mg 100,0% Farine acylée 3,54% 12,1% 120 mg 3,5 mg 2,(
On s'aperçoit donc que le traitement de la farine ani¬ male par acylation rend la farine oléophile et que le relar¬ gage d'azote diminue nettement quand la farine a été acylée. Second test (biodégradation des hydrocarbures en présence de farine acylée ou non acylée)
Pour tester l'efficacité des farines animales dans la biodégradation des hydrocarbures, nous utilisons une technique en scintillométrie dans laquelle un modèle d'hydrocarbure
(1'hexadécane) est radioactif. Sa biodégradation est suivie par le relargage de 14CO- selon le principe suivant:
Afin de suivre la cinétique de dégradation du substrat marqué, on observe le 14C0~ dégagé par une culture bactérienne. Pour cela, on utilise une technique dans laquelle un mini-réacteur (5 ml) contenant une culture bactérienne (milieu nutritif: 1 ml et inoculum: 0,1 ml) est enfermé dans une fiole à scin¬ tillation contenant 2,5 ml de soude molaire. Après incubation à 20°C à l'obscurité et sans agitation, le 14C0- piégé dans la soude est analysé après acidification du milieu de culture et après ajout du liquide à scintillation (Hionic fluor). Il en est de même pour le substrat marqué restant dans la fiole. La radioactivité est lue dans un compteur à scintillation BECMANN
LS 3801.
Les résultats obtenus sont portés dans le tableau II. TABLEAU I I
Biodégradation (%) de 1'hexadécane en présence ou non de farine animale acylée ou non
Le taux de biodégradation de 1'hexadécane seul reste nul. Les bactéries en présence ne sont donc pas capables de dégrader tel quel 1'hexadécane. Par contre, en présence de farine animale, on observe une accélération de la biodégra- dation de 1'hexadécane. Cette accélération est d'autant plus forte que la farine est acylée. EXEMPLE 2
Biodégradation des hydrocarbures en présence de farine animale acylée ou non, en milieu ouvert Dans le but de démontrer 1'intérêt de rendre les farines animales oléophiles, une expérience a été réalisée en milieu ouvert, ceci afin de vérifier si l'oléophilie de la farine permet de maintenir les éléments nutritifs (azote et phos¬ phore) au contact des hydrocarbures et ainsi rendre la biodé- gradation plus rapide.
Acylation de la farine de poisson
Les farines animales utilisées pour les exemples 2 et 3 sont des farines de poisson. Les modifications apportées à la synthèse chimique, par rapport à celle décrite précédemment dans 1'exemple 1, sont:
- la température de réaction, qui est de l'ordre de 50°C, qui correspond à la température du reflux du solvant,
- la durée de la réaction est de 17 heures,
- le chlorure d'acide est en excès de 300%, ce qui corres- pond au paramètre qui a sube la modification la plus importante par rapport à le synthèse selon 1'exemple 1. Les autres paramètres et protocoles sont inchangés. Test :
Le pilote servant à cette expérimentation est composé d'un réacteur contenant 100 ml d'eau de mer polluée par hydro¬ carbures (2,5 ml d'arabe léger). La farine animale, acylée ou non acylée a été appliquée à la surface des hydrocarbures à raison de 10% en poids par rapport aux hydrocarbures présents. Ce réacteur est agité et aéré en continu. L'eau du réacteur est renouvellée en continu pendant 15 jours avec de l'eau de mer, contenue dans un réservoir, à raison de 8 renouvellements par jour. L'effluent est recueilli à la sortie du réacteur,
3_ dans lequel des analyses physico-chimiques (NH., NO,-,, PO. , hydrocarbures) et bactériologiques (bactéries totales et spé¬ cifiques) sont effectuées. Les mêmes analyses sont effectuées dans l'eau du réservoir. A la fin du test, tout le réacteur est sacrifié et les hydrocarbures restant sont extraits au chloroforme.
Les analyses physico-chimiques sont effectuées selon les normes en vigueur: azote ammoniacal: AFNOR NF T90-015; azote sous forme nitrate: Standard methods 4500-NO3-E; orthophos- phate: standard method 4500-PC-Vn Acid Col. Meth.
Les bactéries totales sont dénombrées selon la technique du nombre le plus probable, en milieu liquide (Marine Broth 2216). Les bactéries spécifiques hydrocarbures sont dénombrées également par la technique du nombre le plus probable, en milieu liquide, dans lequel les hydrocarbures représentent la seule source de carbone. Les hydrocarbures sont analysés par chromatographie en phase gazeuse.
Deux expériences ont été réalisées : une avec une farine animale non acylée, l'autre avec la même farine animale acy- lée. Chaque expérimentation dure 15 jours.
Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous. L'évolution
3_ des éléments minéraux (NH. ; PO. ) est donnée dans les ta¬ bleaux III et IV et les figures 1, 2, 3 et 4. TABLEAU III Evolution des teneurs en azote ammoniacal dans les deux expérimentations: avec farine acylée ou non
TABLEAU IV Evolution des teneurs en orthophosphate dans les deux expérimentations: avec farine acylée ou non
Les résultats obtenus sont différents pour la farine acylée de la non acylée. On observe que la farine acylée pro¬ voque un relargage moins important de 1 ' azote et du phosphore. Il faut tenir compte de la comparaison avec les concentrations en azote et phosphore de l'eau du réservoir, qui évoluent, car il s'agit d'eau de mer vivante (plancton, bactéries...). L'ob¬ tention de ces résultats a donc permis d'estimer quelle était la quantité de nutriments qui était lessivée par soustraction avec les concentrations mesurées dans les réservoirs. Les ré¬ sultats sont donnés tableau V et aux figures 5, 6, 7 et 8.
TABLEAU V Relargage de nutriments: azote et phosore dans chaque réacteur: avec farine acylée ou non.
Ces résultats montrent clairement que le relargage est bien moins important pour la farine rendue oléophile par acylation. Ce traitement permet donc d'obtenir un produit qui reste plus longtemps en contact avec les hydrocarbures. Ainsi les nutriments: azote et phosphore, indispensables au dévelop¬ pement des bactéries spécifiques hydrocarbures sont présents à l'endroit de la biodégradation: à l'interface eau-hydrocar¬ bures.
Les résultats concernant l'évolution des flores bactériennes sont présentés tableaux VI et VII et dans les figures 9 et 10. TABLEAU VI Evolution de la flore bactérienne totale et spécifique hydrocarbure dans le réacteur avec la farine non acylée
Evolution de la flore bactérienne totale et spécifique hydrocarbure dans le réacteur avec la farine non acylée
Les dénombrements bactériens effectués pendant les deux expériences permettent de mettre en évidence que dans le cas de 1a farine acylée, le développement bactérien est plus rapi¬ de, mais surtout, que la différence entre les bactéries du réservoir (qui entre dans le réacteur tous les jours), est plus importante en présence de cette farine. Elle stimule donc plus favorablement les bactéries totales et spécifiques hydro¬ carbures, puisque les nutriments sont plus disponibles.
La quantification de la biodégradation des hydrocarbures est effectuée par 1'estimation d' indices de biodégradation calculés à partir de chromatographie en phase gazeuse. Ces indices sont les rapports C17/pristane et C18/phytane. La diminution de ces rapports est corrélée à la biodégradation des hydrocarbures alphatiques. Ils sont reportés dans le ta¬ bleau VIII.
TABLEAU VIII Indices de biodégradation obtenus après 15 jours d'expérimentation
Les résultats, en particulier, l'évolution des indices de biodégradation, montrent que la farine acylée donne de meilleurs résultats que la farine non acylée.
Les résultats permettent de constater que 1 ' acylation de la farine animale conduit à un produit qui reste au contact avec les hydrocarbures: il y a présence d'azote et phosphore à l'interface eau-hydrocarbure, cela stimule donc la flore bac¬ térienne, autant spécifique que totale, et la biodégradation des hydrocarbures qui en résulte est également stimulée.
La farine animale acylée présente donc plus d' avantages que la farine non acylée pour 1'accélération des hydrocar¬ bures. le
EXEMPLE 3
Biodégradation des hydrocarbures en présence de farine animale acylée pu non, en milieu ouvert, à grande échelle
Compte tenu des résultats obtenus en laboratoire, qui montrent l'intérêt d'utiliser une farine animale acylée, un test à plus grande échelle a été réalisé. Cette expérimenta¬ tion a été faite dans 3 bacs de 400 litres alimentés en conti¬ nu par de l'eau de mer fraîche, pompée dans la lagune située à côté des bacs. Le taux de renouvellement de ces bacs est de 4 fois le volume du bassin par jour. Du pétrole (arabian light étêté à 150°C) a été mis dans chaque bac (1 litre). Un bac, dans lequel il n'y a pas eu d'ajout a servi de témoin; de la farine non acylée (5%/brut) a été rajoutée dans le deuxième bac; de la farine acylée (5%/brut) a été rajoutée dans le troisième bac. La farine non-acylée et la farine acylée sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 2.
Tout au long de l'expérimentation qui a durée 2 mois, il y a eu un suivi de la flore bactérienne totale et spécifique hydrocarbures selon le même protocole que celui décrit dans 1'exemple 2. Un suivi des hydrocarbures a également a été fait.
Les résultats du suivi bactériologique sont donnés dans le tableau IX et les figures 12 et 13.
TABLEAU IX Dénombrement des bactéries totales et spécifiques d'hydrocarbures
Dans les bassins traités avec la farine acylée ou non acylée, le développement de la flore bactérienne est 'plus important que dans le témoin. Les farines animales permettent donc de stimuler les flores bactériennes indigènes. On observe que le développement est plus important dans le bassin traité avec la farine acylée qu'avec la farine non acylée. L'acylation de la farine permet de maintenir le pro¬ duit près de la nappe d'hydrocarbures et favorise ainsi le développement de la flore bactérienne. Les résultats obtenus sur les analyses des hydrocarbures sont présentés sur la figure 14 et dans les chromatogrammes donnés dans les figures 15 à 18.
L'interprétation de l'évolution des différentes frac¬ tions du brut permet d'estimer s'il y a eu biodégradation. Ainsi, dans le cas où le pétrole a été biodégradé, on observe une diminution de la fraction alcane et aromatique et une augmentation des fractions asphaltene et résine.
Sur la figure 14, on observe qu'il y a eu diminution des fractions alcanes dans les 3 bassins après 42 jours, mais 1'augmentation de la fraction asphaltene + résine est la plus importante dans le bassin traité avec la farine acylée. Ce résultat qui montre que la biodégradation est la plus impor¬ tante dans le bassin traité avec la farine acylée, est corro¬ boré par les chromatogrammes présentés ci-dessous. En effet, on observe une diminution nette de la fraction alcane entre 0 et 42 jours; cette diminution est plus importante pour le bassin traité avec la farine acuylée.
L'ensemble de ces résultats obtenus à 42 jours montre que la présence de farine acylée favorise la biodégradation des hydrocarbures. Les résultats sont encore plus significa¬ tifs après une plus longue période, 42 jours étant une période de temps assez courte pour observer la biodégradation des hydrocarbures.
De plus, des observations visuelles permettent de dire que la farine acylée ne provoque pas le coulage des hydrocar¬ bures dans le fond du bassin. Cette expérience permet de mettre en évidence 1'intérêt de traiter une nappe d'hydrocarbures avec de la farine animale acylée. Ceci est d'autant plus intéressant qu'il n'existe pas ou peu d'additifs de biodégradation pour traiter les nappes flottantes d'hydrocarbures.

Claims

REVENDICATIONS
1.- Additif de biodégradation caractérisé en ce qu'il consiste en un mélange comprenant:
(i) au moins une source d'azote assimilable consistant en au moins un acide aminé, non-substitué ou substitué; (ii) au moins une source de phosphore; selon un rapport N/P compris entre 2 et 100; ledit additif ayant été soumis à un traitement visant à le rendre oléophile. 2.- Additif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit traitement consiste en une acylation.
3.- Additif selon la revendication 2, caractérisé en ce que 1 ' acylation est mise en oeuvre avec un chlorure d'acide laurylique. A . - Additif selon la revendication 1, 2 ou 3, caracté¬ risé en ce que 1'acide aminé est choisi dans le groupe consis¬ tant en: lysine, méthionine, cystine, thréonine, tryptophane, hydroxylysine, hydroxyproline, et leurs mélanges.
I. . - Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la source d'azote assimilable re¬ présente au moins 5% en poids du poids total dudit additif.
6.- Additif selon 1'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la source d'azote assimilable se trouve dans des protéines représentant au moins 50% en poids du poids total dudit additif.
7.- Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la source de phosphore est un sel minéral de phosphore.
8.- Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit rapport N/P est compris entre 4 et 40, de préférence est égal à environ 16.
9.- Additif selon 1 'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit additif est présent selon un rapport massique [additif]/[hydrocarbures] compris entre 3 et 30, et de préférence égal à environ 10.
10.- Additif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste en une farine animale. 11.- Additif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite farine est une farine de poisson.
12.- Additif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite farine est une farine de viande. 13.- Utilisation d'un additif selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la biodégradation d'hydrocar¬ bures.
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