WO2001088161A1 - Vecteur permettant d'analyser le mecanisme de replication d'un virus a arn et utilisation de ce vecteur - Google Patents

Vecteur permettant d'analyser le mecanisme de replication d'un virus a arn et utilisation de ce vecteur Download PDF

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WO2001088161A1
WO2001088161A1 PCT/JP2001/004033 JP0104033W WO0188161A1 WO 2001088161 A1 WO2001088161 A1 WO 2001088161A1 JP 0104033 W JP0104033 W JP 0104033W WO 0188161 A1 WO0188161 A1 WO 0188161A1
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WO
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rna
vector
reporter gene
rna polymerase
virus
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Application number
PCT/JP2001/004033
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michinori Kohara
Junichi Matsuzaki
Kouichi Okamoto
Asao Katsume
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a vector for analyzing the replication mechanism of an RNA virus.
  • RNA polymerase RNA-dependent RNA polymerase derived from RNA virus
  • this vector is useful for elucidating the mechanism of RNA virus replication and the function of viral gene products, and developing therapeutic agents and therapeutic means.
  • HCV Hepatitis C virus
  • HCV infection after blood transfusion has been achieved. Is almost unrecognizable.
  • the number of people infected with HCV worldwide accounts for a few percent of the total population. It is known that the infection caused by this virus is prolonged and chronic, which causes chronic hepatitis, and is extremely high in the rate of progression to cirrhosis and then liver cancer. The subsequent elimination of HCV has become an important issue.
  • Interferon (IFN) therapy is widely used for the treatment of chronic hepatitis C, but the efficacy rate is about 30%, and side effects such as fever are frequently induced. However, satisfactory results have not been obtained due to problems such as high drug prices.
  • the type and dosage of IFN have been examined, and the effective rate is expected to be improved by the development of consensus IFN.Also, treatment using a combination of IFN and an antiviral agent such as ribavirin has been attempted. Neither of them has reached a reliable treatment.
  • searching for anti-HCV agents based on the life cycle of HCV has been attempted in many research facilities using HCV cDNA.
  • in vitro cell infection systems are useful as Atsei systems for drug screening, but there are several reports of such infection systems, but due to problems such as the low amount of replication. The reality is that no stable and practical system with reproducibility has been created. In addition, the cell infection system is considered to be inconvenient in terms of biohazard, etc., because it involves the production of infectious virus.
  • the present inventors' research shows that the viral protein produced during the replication of the original virus does not exhibit its function alone in the cell, but that a plurality of viral proteins It was thought that the structure of the complex, which functions as a body and could function, and the isolated protein, respectively, did not necessarily agree with each other.
  • the reason that the inhibitor in the Atsushi system using the purified enzyme is not linked to the therapeutic agent is that the structural dissociation between the state of this complex and the state of the purified enzyme is a problem.
  • An object of the present invention is to provide an expression system that reproduces the situation in which a virus protein can function along the original life cycle of a virus, and that can simultaneously evaluate the function of a virus protein with a reporter gene without producing an infectious virus. Is to establish. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, -The activity of the RNA polymerase in the host is evaluated based on the amount of the reporter gene expression product by introducing a vector that expresses the enzyme and a vector that expresses the reporter gene in the antisense direction into the host cell. They have found that they can do this and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following 1 to 19 inventions.
  • a vector for analyzing the replication mechanism of an RNA virus which comprises a DNA encoding an RNA virus-derived RNA-dependent RNA polymerase.
  • a vector for analyzing the replication mechanism of RNA viruses which comprises a reporter gene expressed in the antisense direction.
  • a vector for analyzing the replication mechanism of an RNA virus which comprises a DNA encoding an RNA-dependent RNA polymerase derived from an RNA virus and a reporter gene expressed in an antisense direction.
  • a kit for analyzing the replication mechanism of an RNA virus comprising the vector for analyzing the replication mechanism of an RNA virus according to 4.1 and the vector for analyzing the replication mechanism of an RNA virus according to 2.
  • a vector containing the promoter gene is prepared, these vectors are introduced into a host cell, and the amount of the reporter gene expression product in the cell is measured to evaluate the activity of the RNA polymerase.
  • the DNA encoding the RNA-dependent RNA polymerase derived from the RNA virus, the DNA corresponding to the RNA polymerase entry site, and the DNA corresponding to the entry site are located upstream of the antisense direction.
  • the RNA primer is prepared.
  • a method for evaluating RNA polymerase activity which comprises evaluating the activity of an enzyme. 7.
  • a vector containing a reporter gene expressed in the antisense direction is prepared, and these vectors are introduced into a host cell. Then, a test substance is inoculated into the cell, and the reporter gene in the cell is prepared.
  • a method for screening a therapeutic agent for a viral disease characterized by measuring the amount of an expression product of a virus disease, and selecting a substance having an increased or decreased amount of an expression product of a reporter gene from among test substances.
  • RNA virus-dependent RNA polymerase derived from RNA virus, DNA corresponding to the entry site of the RNA polymerase, and DNA corresponding to the entry site located upstream of the antisense direction.
  • a vector containing the three reporter genes expressed in the above is prepared, and this vector is introduced into a host cell. Then, the test substance is inoculated into the cell, and the amount of the reporter gene expression product in the cell is determined.
  • a method for screening a therapeutic agent for a viral disease comprising measuring and selecting a substance having an increased or decreased amount of a reporter gene expression product from test substances.
  • a cell comprising the vector according to 10.1 and the vector according to 2.
  • Method for evaluating RNA virus replication ability including the following steps:
  • RNA which is arranged such that the reporter gene is not expressed in the absence of RNA polymerase, with the RNA-dependent RNA polymerase derived from the RNA virus,
  • RNA virus replication ability evaluation method including the following steps
  • RNA-dependent RNA polymerase derived from an RNA virus in a host
  • Expression of an RNA encoding a reporter gene in an antisense direction and (3) Reporter gene by the RNA polymerase. Is synthesized in the sense direction,
  • RNA virus replication ability evaluation method including the following steps
  • the reporter gene is coded in the sense direction by the above RNA-dependent RNA polymerase to synthesize RNA
  • a screening method for a virus replication inhibitor which comprises adding a step of bringing a test substance into contact with the evaluation method described in 12 to 14.
  • RNA virus is HCV.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of evaluation of RNA polymerase activity by a trans-acting system vector.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of evaluation of RNA polymerase activity by a cis-acting vector.
  • FIG. 3 is a diagram showing the steps of constructing a pE2 vector (first half).
  • FIG. 4 is a diagram showing the construction process of the pE2 vector (second half).
  • FIG. 5 is a diagram showing a construction process of a pElb vector.
  • FIG. 6 is a diagram showing a construction process of a pEl vector.
  • FIG. 7 is a diagram showing a construction process of a pIFGO vector.
  • FIG. 8 is a diagram showing a construction process of a pRLl vector.
  • FIG. 9 is a diagram showing a construction step of a pRL lb vector.
  • FIG. 10 is a diagram showing a construction process of a pRL2b vector.
  • FIG. 11 is a diagram showing a construction process of a pRL3b vector.
  • FIG. 12 is a diagram showing the construction steps of the pRL4b vector (first half).
  • FIG. 13 is a diagram showing the construction steps of the pRL4b vector (second half).
  • FIG. 14 is a diagram showing a construction process of a pEL2 vector. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the vector for analyzing the replication mechanism of an RNA virus of the present invention includes the following three types of vectors (a) to (c).
  • antisense reporter gene A vector to be introduced into a host cell together with the vector of (a), wherein the reporter gene is expressed in the antisense direction (hereinafter simply referred to as “antisense reporter gene”).
  • the sequence from the start codon to the stop codon of the gene encoding the protein is the sense sequence, and the reverse direction is the antisense sequence.
  • the term “antisense direction” is used. This means that a reporter gene is transcribed in the antisense direction when it is introduced into cells and expressed from the structure of the expression vector. It means that you did. Therefore, a functional reporter protein cannot be obtained from mRNA produced from an expression vector, and a reporter that functions only after complementary mRNA is synthesized by RNA-dependent RNA polymerase by converting the mRNA into type II. Each protein will be made.
  • the vector (a) may be any vector that can express DNA encoding an RNA-dependent RNA polymerase derived from an RNA virus in a host cell. Preferably, however, use plasmid.
  • the RNA polymerase used is not particularly limited, and RNA polymerases derived from various viruses can be used. Specifically, RNA polymerase derived from HCV-derived RNA polymerase (NS5B), RNA polymerase derived from Poliovirus (poliovirus), and RNA polymerase derived from Rotavi rus (rotavirus) can be used. Among them, it is preferable to use RNA polymerase derived from HCV.
  • the promoter used is not particularly limited, and for example, a CAG promoter, a CMV promoter, a T7 promoter, an EFla promoter, an SV40 early promoter, an SV40 late promoter, and the like can be used. Among these, it is preferable to use a T7 promoter, a CAG promoter, or the like that can synthesize a large amount of RNA.
  • a T7 promoter, a CAG promoter, or the like that can synthesize a large amount of RNA.
  • DNA encoding a virus-derived RNA-dependent RNA polymerase only a DNA region corresponding to a protein having enzymatic activity may be incorporated into the vector, but a region contiguous with this DNA region may also be incorporated. It may be incorporated in the kuta.
  • the NS5B protein has RNA polymerase activity, but not only the DNA that encodes it, but also NS5A, NS4, NS3, NS2, E2, El, Core, etc. that are adjacent to the NS5B protein.
  • the DNA encoding the protein may also be incorporated into the vector.
  • the vector may be of the type that starts expression simultaneously with the introduction, but the Cre- ⁇ system (Nat Sternberg et al., J. Molecular Biol ogy 150. p467-486 1981, Nat Sternberg et al., J. Molecular Biology 150. p487-507 1981), or a type that starts expression only by performing a specific operation.
  • the vector (b) may be any vector as long as it can synthesize a transcript of an antisense reporter gene in a host cell, but preferably a plasmid is used.
  • the promoter to be used is not particularly limited, and for example, a CAG promoter, a CMV promoter, a T7 promoter, an EFla promoter, an SV40 early promoter, an SV40 late promoter and the like can be used. Among them, it is preferable to use a T7 promoter, a CAG promoter, or the like that can synthesize a large amount of RNA.
  • the reporter gene measures the amount of its expression product by some means Anything that can be done is acceptable.
  • Such genes include, for example, the luciferase gene, the chloramphenico-l-acetyltransferase gene, and the 3-galactosidase gene. Of these, the luciferase gene is used. Is preferred.
  • the RNA polymerase expressed from the vector (a) will If it does not bind to the correct position, the expression product of the reporter gene will not be synthesized. Therefore, it is usually necessary to insert the DNA corresponding to the entry site of the RNA polymerase expressed from the vector (a) downstream of the antisense reporter gene of the vector (b). There is. However, as described below, these vectors may be used for the purpose of identifying the entry site of the RNA polymerase, and in such a case, there is no need to insert the DNA corresponding to the entry site. .
  • RNA-dependent RNA polymerase refers to a specific site of RNA to which RNA-dependent RNA polymerase derived from RNA virus binds, from which RNA synthesis starts. This refers to the part that is
  • RNA-dependent RNA polymerase is an enzyme that synthesizes RNA complementary to RNA type II, and it is necessary to recognize the starting point when starting RNA synthesis.
  • a method was used in which an appropriate primer was set as an artificial replication origin and RNA was synthesized therefrom.
  • RNA-dependent RNA polymerase derived from RNA virus was used. Binds to the site (sequence) that originally recognizes and initiates RNA synthesis so that it exhibits activity. In the present specification, the sequence is referred to as an entry site of RNA polymerase.
  • IRES Internal Ribosome Entry Site
  • the IRES may be derived from the same virus as the RNA polymerase used, but it is preferable to use an IRES having a higher translation activity.
  • IRES Intracellular Endothelial Growth Factor
  • SP163 Vascular Endothelial Growth Factor
  • EMCV Electromyocardi ti s Vi rus
  • the vector (c) may be any vector as long as it can express a DNA encoding RNA polymerase and synthesize a transcript of an antisense reporter gene in a host cell. However, preferably a plasmid is used. The production of this vector was performed using the vector of (a) and the vector of (b) except that the DNA encoding the RNA polymerase and the antisense reporter gene were contained in the same vector. It can be produced in the same manner as in Vector-1.
  • the RNA virus replication mechanism analysis vector of the present invention is mainly used for evaluating RNA polymerase-derived RNA polymerase activity, and thereby it is possible to analyze the replication mechanism of an RNA virus. It will be possible, but it can also be used for the following purposes.
  • the expression product of the reporter gene is translated in an IRES-dependent manner. Therefore, by incorporating various IRES (or sequences expected to be IRES) into the vector of (b) or (c) and measuring the amount of expression product of the reporter gene, The activity of inducing protein expression can be measured.
  • RNA virus-derived RNA polymerase does not necessarily exert its own activity, but may exhibit its activity only after binding to other factors and forming an enzyme complex. It is also produced as a precursor and processed by proteases. In some cases, the activity will be exerted only after receiving the training.
  • the NS5B protein derived from HCV is thought to form a complex with an adjacent NS protein, and is processed by a protease, NS3.
  • RNA polymerase from an RNA virus binds to a specific site (entry site) of RNA and initiates RNA synthesis. Therefore, by introducing an antisense reporter gene into various sites in the vector of (b) or (c) and examining whether or not an expression product of the reporter gene is generated, the RNA polymerase can be obtained. Entry sites can be identified. For example, NS5B derived from HCV uses the 3 'UTR of HCV genomic RNA as an entry site, so only when an antisense reporter gene is inserted upstream of DNA corresponding to the 3' UTR, An expression product of the reporter gene results. 4) Identification of host factors related to RNA polymerase
  • RNA virus-derived RNA polymerase is thought to form a complex with host factors as well as the virus's own factors. Therefore, the vector of (a) and (b) or the vector of (c) is introduced into various host cells, and it is examined whether or not the expression product of the reporter gene is produced in each cell. By doing so, host factors associated with RNA polymerase can be identified.
  • the present invention also provides a kit for analyzing the replication mechanism of an RNA virus, which comprises the vector (a) or (b).
  • a kit for analyzing the replication mechanism of an RNA virus which comprises the vector (a) or (b).
  • both the vectors (a) and (b) are introduced into a host cell, and the amount of the expression product of the reporter gene in the cell is measured.
  • RNA polymerase activity can be assessed.
  • by inoculating a test substance into cells into which both the vectors (a) and (b) have been introduced, and selecting a substance that increases or decreases the amount of the reporter gene expression product in the cells it becomes a therapeutic agent for viral diseases.
  • the test substances that can be obtained can be screened.
  • the following vectors (a) and (b) ′ or vectors (c) ′ are prepared, and one of these vectors is introduced into a host cell.
  • the present invention is characterized in that the activity of the RNA polymerase is evaluated by measuring the amount of a reporter gene expression product in a cell.
  • the RNA virus capable of evaluating RNA polymerase activity and analyzing its replication mechanism may be a KNA virus having RNA as a genome, and is not limited. HCV, poliovirus, rotavirus, and especially HCV, which are problems as viruses causing the disease, can be mentioned.
  • the vectors (a) and (b) ′ are referred to as “trans-acting vectors”, and the vector (c) ′ is referred to as “cis-acting vectors”.
  • the vectors (b) ′ and (c) ′ can be manufactured in the same manner as the vectors (b) and (c) described above.
  • the host cell primary liver cells such as IMY, HuH-7, HepG2, MOLT-4, MT-2, and Daudi, other hepatocytes, cells derived from hematopoietic cells, and the like can be used. However, it is not limited to these. (If there is a requirement as a host cell, please describe it. For example, regarding the replication, transcription and translation mechanisms.)
  • a technique commonly used in the art such as a calcium phosphate method can be used, and is not particularly limited.
  • the amount of the expression product in the host cell may be measured according to the reporter gene used.
  • the reporter gene used a method for evaluating RNA polymerase activity when the HC5 NS5B protein is used as the RNA polymerase and the luciferase gene is used as the reporter gene will be described with reference to FIGS.
  • Figure 1 shows the outline of the evaluation of RNA polymerase activity using a trans-acting system vector.
  • the NS5B expression vector (left) contains DNA encoding the HCV protein of Core-NS5B or NS3-NS5B. From this vector, precursor proteins are synthesized by cap-dependent translation. The precursor protein is cleaved into multiple proteins (NS proteins) by the protease, NS3 protein and the host protease. The cleaved protein and host factor form an enzyme complex containing NS5B.
  • the luciferase expression vector (right) contains the luciferase gene in the antisense direction, IRES (antisense direction), and DNA corresponding to the 3 'UTR of HCV genomic RNA. From this vector, RNA containing the luciferase transcript, IRES, and 3 'UTR in the antisense direction is synthesized.
  • the enzyme complex containing NS5B binds to the 3' UTR of the RNA derived from the luciferase expression vector, making this RNA a type II and complementary Synthesize RNA
  • This complementary RNA is translated in an IRES-dependent manner, and luciferase is synthesized.
  • the amount of this complementary RNA corresponds to the enzyme activity of the enzyme complex containing NS5B, and the amount of this RNA corresponds to the amount of luciferase synthesized.
  • the enzyme activity of the complex will correspond to the amount of luciferase.
  • FIG. 2 shows an outline of the evaluation of RNA polymerase activity using a cis-acting vector.
  • the NS5B-luciferase expression vector contains DNA corresponding to the 5 'UTR, DNA encoding the Core-NS5B protein, luciferase gene in the antisense direction, IRES (antisense direction), and 3' UTR. It contains the corresponding DNA and the like, and RNA corresponding to these DNAs is synthesized by transcription. This RNA is translated in an IRES-dependent manner, and an enzyme complex containing NS5B is formed as in the case of the trans-acting vector.
  • This enzyme complex binds to the 3 ′ UTR of the aforementioned RNA (ie, the RNA from which the enzyme complex itself is derived) and synthesizes RNA complementary to this RNA.
  • This complementary RNA is translated in an IRES-dependent manner and Elastase is synthesized.
  • the amount of luciferase synthesized corresponds to the activity of the enzyme complex RNA polymerase as in the case of trans-acting vectors.
  • This method for evaluating the activity of RNA polymerase can be used for screening of therapeutic agents for viral diseases.
  • a substance that is a candidate for a therapeutic agent for a viral disease is inoculated into cells into which the above-described vector has been introduced, and the amount of the product expressing the reporter gene in the cells is measured.
  • the present invention can also provide a substance obtained by the above-described method for screening a therapeutic agent for a viral disease.
  • the present invention also provides an RNA virus replication ability evaluation method comprising the following steps:
  • the activity of RNA-dependent RNA polymerase derived from an RNA virus can be evaluated from the expression level of the expression product of the reporter gene, whereby the replication ability of the RNA virus can be evaluated.
  • RNA viruses whose RNA polymerase activity is unknown are compared with RNA viruses whose RNA polymerase activity is known, and mutant viruses are compared with wild-type viruses.
  • the replication ability is relatively increased or decreased.
  • a vector containing the reporter gene so as to be expressed in the antisense direction may be used as a method for arranging the reporter gene so that it is not expressed in the absence of Dragon A polymerase.
  • the RNA encoding the reporter gene is expressed from the vector in the antisense direction using the normal transcription mechanism in the host, and if no RNA-dependent RNA polymerase is present, the reporter Gene is The encoding peptide is not expressed, and only when RNA polymerase is present, the RNA encoding the reporter gene in the sense direction is synthesized, and the peptide encoded by the reporter gene is expressed.
  • the gene encoding RNA polymerase may be incorporated in the sense vector into the same vector as the vector containing the reporter gene so that it is expressed in the antisense direction, or a vector different from the reporter gene. It may be incorporated in the sense direction.
  • the present invention can further provide a method for screening for a virus replication inhibitor. This method can be achieved by adding a step of bringing a test substance into contact with the above-described method for evaluating virus replication ability.
  • pCALN / HCV RBZ (Microorganisms containing this vector were contracted to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary on June 21, 1999, at 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan. No. FERM BP-6763) from which the HCV genomic 5'-terminal untranslated region (5 'UTR), 3'-terminal untranslated region (3' UTR) and ribozyme at both terminals have been removed. Construction of the translation region full-length expression vector pE2 was performed as follows. Construction of ⁇ 5 '-3, ⁇
  • p5′-3 ′ RBZ (This vector was obtained by removing the Cre- ⁇ expression site and poly A site from the above pCALN / HCV RBZ. PCR) was performed using ⁇ as a type II. The base sequence of the used PCR primer is shown below.
  • HCV Fwl 5, -CCG GGT ACC ACC CTT GC-3, (SEQ ID NO: 7)
  • HCV Rvl 5,-AAC TTA AGC TTA TTT AAA TCT AGA TTA TTA TCG GTT GGG GAG CAG G -3 '(SEQ ID NO: 8)
  • PCR reaction solution add 10 ⁇ L of 10X Pyrobest Buffer, 8 L of 25 mM dNTP mixture, and 1 L of 100 iM primer to a tube.
  • 1 L of 1 & 16 ( ⁇ 5 '-3, RBZ) and 0.5 tL of 5 units / tL Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) were added to make 100 L with sterile water.
  • the PCR was first heated at 94 ° C for 5 minutes, and then performed 30 cycles of denaturation at 98 ° C for 10 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute.
  • the amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the PCR product was subjected to 1.5% agarose electrophoresis, and the specifically amplified target fragment was extracted from the gel.
  • the target fragment was extracted using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) as follows. First, the gel was cut out, three times the amount of QG Buffer was added, and the mixture was incubated at 50 ° C for 10 minutes to dissolve the gel. After the incubation, 1 volume of isopropanol was added to the gel and mixed. This was transferred to a QIAquick spin column and centrifuged.
  • the flow-through fraction was removed, 750 L of PE Buffer was added to the QIAquick spin column for washing, centrifugation was performed, the flow-through fraction was removed, and the centrifugation was performed again to completely remove the PE Buffer.
  • the QIAquick spin column was transferred to a 1.5 mL tube, centrifuged by adding sterile water, and the DNA was eluted (hereinafter, the procedure for extracting the DNA fragment from the gel was performed by this method). Next, this DNA fragment was subjected to lini double digestion with HindIII and Kpnl. Also, ⁇ 5′-3′RBZ was similarly subjected to lini double digestion with HindIII and Kpnl.
  • the reaction completed solution was subjected to agarose electrophoresis, and a 0.3 kbp DNA fragment for the PCR product and a 3.7 kbp DNA fragment for ⁇ 5'-3'RBZ were extracted from the gel. Extraction was performed in the same manner as above using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Next, a ligation reaction of these two types of DNA fragments was performed using a Rapid DNA Ligation Kit (Boeheringer Mannheim) as follows.
  • the reaction solution was used to transform competent cells of Escherichia coli DH5a strain. Specifically, the transformation was performed as follows. After completion of the reaction, add 1/10 volume (v / v) to competent cells, place on ice for 30 minutes, and then heat shock at 42 ° C for 45 seconds. After placing on ice again for 2 minutes, a 5-fold amount of S0C medium was added.
  • plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method using QIAprep Spin Plasmids Kits (QIAGEN).
  • the mini-preparation was conducted as follows. First, PI Buffe ⁇ SO ⁇ L was added to the cell pellet, suspended, and then 250 L of P2 Buffer was added and mixed. Next, 350 L of N3 Buffer was added and mixed, followed by centrifugation. The supernatant was transferred to a QIAprep spin column and centrifuged.
  • the flow-through fraction was removed, 750 ⁇ L of PE Buffer was added to the QIAprep spin column for washing, centrifugation was performed, the flow-through fraction was removed, and centrifugation was again performed to completely remove the PE Buffer.
  • the QIAprep spin column was transferred to a 1.5 mL tube, 50 L of sterile water was added, and the mixture was centrifuged to elute plasmid DNA (hereinafter, all minipreparations of plasmid DNA were performed by this method).
  • As a Sequence reaction solution 8 L of Terminator Ready Reaction Mix, 0.1 g / L Template DNA 6 / UL, and lpmol II Primer were mixed and adjusted to 20 L with sterile water. Reaction is 96 ° C for 5 minutes, 96 ° C3
  • reaction-terminated liquid was transferred to a 1.5 mL tube, 50 L of 100% ethanol and 2% of 3M sodium acetate (pH 4.6) were added and mixed, and the mixture was placed on ice for 10 minutes. This was centrifuged, and after removing the supernatant, 250 L of 70% ethanol was added and centrifuged again.
  • the sample was dissolved by adding an electrophoresis buffer, supplied to an automatic sequencer Model 310 (Perkin Elmer), and the nucleotide sequence was analyzed (hereinafter, the sequence reaction and the nucleotide sequence). Were analyzed in this manner.) As a result, since it is an array of expected was confirmed was designated to as P 3'PBM, were used in the following.
  • PCR was performed using p5′-3′RBZ as a ⁇ type. The base sequence of the used PCR primer is shown below.
  • HCV Fw2 5'-GGA ATT CAT TTA AAT CTC GAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GTA G
  • HCV Rv2 5, -GGG TGG TAC CCG GGC T-3, (SEQ ID NO: 10)
  • PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo) in the same manner as above for 25 cycles.
  • the amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the PCR product was subjected to electrophoresis, and the specifically amplified target fragment was extracted from the gel. Next, this DNA fragment was double-digested with Kpnl and EcoRI.
  • the i3'pBM was also subjected to lini double digestion with Kpnl and EcoRI.
  • the reaction completed solution was subjected to agarose electrophoresis, and a 0.3 kbp DNA fragment for the PCR product and a 3.4 kbp DNA fragment for the p5'RBZ were extracted from the gel.
  • a vector that incorporates an 8.5kbp DNA fragment from the Kpnl site on the core gene of the HCV translation region to the Kpnl site on the NS5B gene in the Kpnl site of p5'_3'pBM is as follows: ⁇ 5 '-3' ⁇ / ⁇ CV was built like First, ⁇ 5'-3'pBM and pCALN / HCV RBZ were digested with Kpnl restriction enzyme reaction solution and subjected to agarose gel electrophoresis, and 3.7 kbp linearization plasmid of ⁇ 5'-3'pBM and pCALN / HCV RBZ were used. An 8.5 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • Kpnl annihilated p5 and -3'pBM were treated with alkaline phosphatase using the BAPping Kit (TOYOBO).
  • the treatment was performed according to the protocol attached to the kit (hereinafter, all force rephosphatase treatments were performed in the same manner).
  • perform a ligation reaction This was transformed into E. coli DH5a, seeded on an LB + Amp plate, cultured overnight at 37 ° C, and the colonies that appeared on the plate were shaken overnight at 37 ° C in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium. After culturing, the culture was collected by centrifugation, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method. By treating with an appropriate restriction enzyme, the presence or absence and insertion direction of the DNA fragment were examined to select a plasmid into which the fragment was inserted as expected. This plasmid was named p5, -3 'pBM / HCV.
  • a transcription termination signal was inserted downstream of the HCV translation region of ⁇ 5'-3 'pBM / HCV, and a CAG promoter was inserted upstream of the HCV translation region, leading to pE2 construction.
  • the construction was performed as follows. First, p5, -3, pBM / HCV and pCALN / HCV RBZ were double-digested with Xbal and Hindlll, respectively, and subjected to 7-garose electrophoresis. The 12.2 kbp DNA fragment of ⁇ 5'-3 'pBM / HCV and pCALN A 0.6 kbp DNA fragment of / HCV RBZ was extracted from the gel, and a ligation reaction of these DNA fragments was performed.
  • the cut DNA fragment of 12.7 kbp was extracted from the gel.
  • the extracted DNA fragment was digested with Xhol, subjected to agarose electrophoresis, and a 12.7 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • pCALN / HCV RBZ as an insert DNA fragment was digested with EcoRI and then partially cut with Xhol as follows.
  • the EcoRI-treated linear plasmid DNA lOg was treated with 12 units of Xhol at 37 ° C for 3 minutes, immediately immersed in ice water, stopped for agarose-electrophoresis, and subjected to Xho I at three locations on the vector. 3. Only one site was cut out. 3.
  • the lkbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • pE2 is a vector whose expression is controlled by the Cre-- ⁇ system, and this vector can be used to create an expression system using re-switching expression.
  • PE2b is a vector designed to be used in an expression system that does not use switching expression and designed so that expression occurs in cells simultaneously with gene transfer.
  • pE2b was constructed as follows based on pE2. The above pE2 was digested with Xhol and subjected to agarose gel electrophoresis to extract a 14.5 kbp DNA fragment. This was self-ligated in a ligation reaction solution, transformed into Escherichia coli DH5a, inoculated on an LB + Amp plate, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the emerged colonies were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, thereby preparing the plasmid DNA by the minipreparation method.
  • the size of the plasmid DNA was checked by restriction enzyme treatment, the expected size was obtained.
  • the plasmid DNA was digested with HindIII and subjected to agarose gel electrophoresis, and the 11.4 kbp DNA fragment was separated from the gel. Extracted.
  • PUC19 was digested with Hindlll and subjected to agarose gel electrophoresis to extract a 2.7 kbp linear plasmid DNA.
  • This linear plasmid DNA was treated with alkaline phosphatase.
  • the linear plasmid treated with alkaline phosphatase and the 11.4 kbp DNA fragment were ligated, transformed into E. coli DH5 ⁇ , inoculated on LB + Am plate, and incubated at 37 ° C. Cultured overnight. The colonies that appeared were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the minipreparation method.
  • the insertion direction of the insert was confirmed, and a clone inserted in the opposite direction to the Lac promoter of PUC19 was selected and named pE2b (FIG. 5).
  • NS3 Fwl 5 '-AAA CTC GAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAC CAT GGC TCC CAT C AC GGC CTA TTC-3, (SEQ ID NO: 11)
  • the PCR was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo), preparing the same reaction solution as above, and performing 15 cycles of denaturation at 98 ° C for 10 seconds, annealing at 62 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 30 seconds.
  • the amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • a part of this PCR product was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis, and after confirming that the fragment of the desired size was specifically amplified, PCR was performed using PCR purification kit (QIAGEN) as follows. The product was purified.
  • PB Buffer was added in an amount 5 times that of the PCR reaction solution, mixed well, transferred to a QIAquick spin column, and centrifuged. Remove the flow-through fraction, add 750 ⁇ ] ⁇ of PE Buffer to the QIAquick spin column for washing, centrifuge, remove the flow-through fraction, and centrifuge again to completely remove the PE Buffer .
  • the QIAquick spin column was transferred to a 1.5 mL tube, sterile water was added, and the mixture was centrifuged to elute the DNA (hereinafter, all operations for purifying DNA fragments were performed by this method). This was then double digested with Psh AI and Xhol.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the cells, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method. . After confirming that the bp DNA fragment was incorporated by restriction enzyme treatment, this plasmid DNA was digested with PshAI. After purification using a new PCR purification kit, alkaline phosphatase treatment was performed.
  • pEl is a vector whose expression is controlled by the Cre-loxP system, and this vector can be used to create an expression system using re-switching expression. Construction was performed as follows based on pElb. First, pElb was digested with Xhol in a restriction enzyme solution, and after purifying the DNA, this was treated with alkaline phosphatase, and the DNA was purified again. In addition, pCALN / HCV RBZ was digested with Xhol in a restriction enzyme solution and subjected to agarose gel electrophoresis to extract a 1.2 kbp DNA fragment.
  • DNA fragments were subjected to a ligation reaction, transformed into Escherichia coli DH5a, inoculated on an LB + Amp plate, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were shake-cultured at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and the plasmid was prepared by the minipreparation method. .
  • a clone in which the DNA fragment had been inserted in the forward direction by restriction enzyme treatment was selected and named pEl.
  • a vector pIFGO in which the T7 promoter and HCV IRES were linked upstream of the luciferase gene was constructed as follows. First, PCR was performed using pCALN / HCV RBZ as type III. The base sequence of the used PCR primer is shown below.
  • PCR reaction solution 10 811 «61" 10 / ⁇ 25 mM dNTP mixture 8 L, 10
  • the primers were prepared in 2 AtL each, 100 ng / zL pCALN / HCV RBZ, 15 units / tL AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) 1.0 / L, and adjusted to 100 L with sterile water.
  • the PCR was first heated at 96 ° C for 5 minutes, followed by 25 cycles of denaturation at 96 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 15 seconds, and extension at 72 ° C for 40 seconds.
  • the amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • T / A cloning ie, a ligation reaction to a T-vector
  • T / A cloning was performed as follows. Add pGEM-T Easy Vector (Promega) 1 // L, 2X Buffer 5 / L, T4 DNA ligase 1 L, and sterile water 2 L to the above reaction solution IL to make a total volume of 10 L, and add 1 L at room temperature. Incubated for hours. This is transformed into E.
  • coli DH5a inoculated on an LB + Amp plate, cultured at 37 ° C overnight, and the colonies appearing on the plate are shaken overnight at 37 ° C in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium. After culturing, the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method. After checking that the insert DNA was inserted by appropriate restriction enzyme treatment, the base sequence of the insert was analyzed, and the plasmid, which was confirmed to be the correct sequence, was used below. This plasmid DNA was lini-double digested with Narl and Hindlll.
  • the pGL3 Basic vector (Promega) was also subjected to lini double digestion with Narl and Hindlll. Agarose electrophoresis was performed on the reaction completed solution, and a 0.4 kbp DNA fragment was extracted from the PCR product and a 4.8 kbp DNA fragment was extracted from the pGL3 Basic vector. Next, these two types of DNA fragments were subjected to a ligation reaction, transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ strain, seeded on an LB + Amp plate, and cultured overnight at 37 ° C.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium with shaking at 37 ° C overnight, and the culture was centrifuged to collect the cells, and plasmid DNA was prepared by the minipreparation method. The presence or absence of the introduction of the DNA fragment into the vector was examined by restriction enzyme treatment, and it was confirmed that the DNA fragment had been introduced. This was named pIFGO.
  • pRLl Construction of pRLl was performed as follows. The above ⁇ 00 was double digested with 8 & 111111-1 ⁇ 11 (1111 and subjected to agarose electrophoresis to extract a 2.3 kbp DNA fragment from the gel. PcDNA3.1 / Hygro (-) (Invitrogen) was replaced with BamHI -Double digested with Hindlll and subjected to agarose electrophoresis to extract the kbp DNA fragments from the gel. E. coli DH5a was transformed, seeded on LB + Amp plates, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the minipreparation method. After confirming that the DNA fragment was inserted by restriction enzyme treatment, this plasmid was digested with Hindlll, purified, and subjected to a blunt end reaction using Klenow Fragment (Takara Shuzo) as follows. To an appropriate amount of the DNA solution, 2.5 L of 10X buffer, 2.5 L of 2.0 raM dNTP, and Klenow Fragment I.OL were added, and sterile water was added to make 25 L.
  • DNA blunting reaction of this DNA fragment was performed by DNA blunting kit (Takara Shuzo) as follows. Mix the DNA solution and the 10X buffer supplied with the kit, incubate at 70 ° C for 5 minutes and 37 ° C for 1 minute, add T4 DNA polymerase 1 and incubate at 37 ° C for 5 minutes. The fragment was purified.
  • DNA fragment was treated with alkaline phosphatase, and the DNA fragment was purified again.
  • a ligation reaction of these DNA fragments was performed, transformed into Escherichia coli DH5, seeded on an LB + Amp plate, and cultured overnight at 37 ° C.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium with shaking at 37 ° C overnight, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method.
  • the nucleotide sequence of the ligated junction was analyzed.As a result, it was confirmed that the sequence was as expected.
  • This constructed plasmid was named pRLl.
  • pRLl since the SV40 origin is present in the full length downstream of the reporter expression unit, it is expected that transcription may occur upstream of the SV40 late promoter in that part, and this is the reporter-gene replication system. It was concerned that this would be the background at Atsushi. Therefore, an improved vector pRLlb without this SV40 origin was constructed. Construction was performed as follows. First, PRL1 was double digested with PshAI and Xbal to extract a 4.4 kbp DNA fragment. In addition, pcDNA3.l / -Hygro (-) was converted to PvuI I and Xbal. After double digestion, a 0.4 kbp DNA fragment was extracted.
  • pRLl was digested with Xbal, subjected to agarose electrophoresis, and a 2.6 kbp DNA fragment was gel-extracted.
  • This DNA fragment was subjected to a ligation reaction of Xbal-digested plasmid DNA, transformed into Escherichia coli DH5, seeded on an LB + Amp plate, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and ribulamide DNA was prepared by the mini-preparation method.
  • the direction of insertion of the DNA fragment was checked by appropriate restriction enzyme treatment.
  • the plasmid inserted in the desired direction was selected and named pRL lb.
  • This pRL lb excludes the SV40 origin and, at the same time, removes the SV40 late polyA signal downstream of the reverse luciferase gene.
  • T7VV vaccinia virus
  • the T7 promoter is arranged on both sides of ⁇ HCV 5, UTR-luciferase> inserted in the reverse direction downstream of the CMV promoter. Therefore, when the antisense strand RNA of the luciferase gene (hereinafter referred to as “(+) strand RNAJ) is excessively synthesized by T7 RNA polymerase, the sense strand RNA of the luciferase gene ( Hereafter, “(-) strand RNA” is also synthesized, and luciferase is translated based on the RNA, which is inappropriate for evaluating the synthesis of (-) strand RNA by NS5B.
  • pRL2b is the vector reconstructed to remove the T7 promoter downstream of HCV 5 'UTR-luciferase> downstream, leaving the T7 promoter immediately downstream of the CMV promoter. Construction of pRL2b was performed as follows. First, T7 PCR was carried out using pIFGO as a type II in order to remove DNA. The base sequence of the primer used for PCR is shown below. The reverse primer used the above IFRR.
  • the PCR reaction solution contains 10 L of lOXBuffer, 8 L of 25 mM dNTP mixture, 2 yL of 10 primers, 1 L of 100 ng / ⁇ L pIFGO, 5 units / L of AmliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) in a tube. It was adjusted to 100 L with 1.0 L and sterile water. The PCR was first heated at 96 ° C for 5 minutes, followed by 25 cycles of denaturation at 96 ° C for 30 seconds, annealing at 60 ° C for 15 seconds, and extension at 72 ° C for 40 seconds. The amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the PCR product was subjected to electrophoresis, and the specifically amplified target fragment was extracted from the gel.
  • l ⁇ cL was used for T / A cloning, that is, ligation reaction to T-vector.
  • T / A cloning was performed as described above.
  • the ligated reaction solution was transformed into E. coli DH5a, inoculated on an LB + Amp plate, cultured at 37 ° C overnight, and the colonies appearing on the plate were placed in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium at 37 ° C.
  • the cells were cultured overnight with shaking at C, and the culture was centrifuged to collect the cells, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method.
  • the base sequence of the insert was analyzed, and the plasmid confirmed to be the correct sequence was used below.
  • This plasmid was subjected to lini double digestion with Xbal-Stul, and a 0.3 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • pRLlb was partially cut with Xbal as follows. 2 g of pRLlb was treated with 3un of Xbal at 37 ° C for 20 seconds, immediately immersed in ice water to stop the reaction, and subjected to agarose gel electrophoresis.Only one of the two Xba I sites on the vector was cut.7.4 kbp Was extracted from the gel.
  • pcLI was double digested with Kpnl and Hindlll and subjected to agarose electrophoresis, and a 6.7 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • the ⁇ 5'-3 'RBZ was double digested with Kpnl and Hindlll and subjected to agarose electrophoresis, and a 0.6 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • a ligation reaction of these DNA fragments was carried out, E. coli DH5a was transformed, seeded on an LB + Amp plate, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were inoculated into LB + Amp medium, cultured at 37 ° C overnight, and the plasmid was prepared by the mini-preparation method.
  • a plasmid into which the insert DNA had been incorporated as expected by double digestion of Kpnl and HindIIl was selected and named pRL2b.
  • pRL2b HCV is used as the IRES for luciferase protein translation, but this HCV IRES was converted to EMCV IRES in order to increase the translation efficiency and increase the detection sensitivity of luciferase activity.
  • One pRL3b was constructed as follows. First, pRL2b was subjected to lini double digestion with Xhol and NspV and subjected to electrophoresis, and a 6.8 kbp DNA fragment was extracted from a gel. Next, the pGL3 Basic vector (Promega) was double digested with Ncol and NspV and subjected to electrophoresis, and a 0.2 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • pEIRES2-EGFP (CL0NTEC H) was subjected to lini double digestion with Xhol and Ncol and subjected to electrophoresis, and a 0.6 bp DNA fragment was extracted from the gel.
  • a ligation reaction of these three extracted DNA fragments was performed, transformed into Escherichia coli DH5, inoculated on LB + Amp, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the cells, and plasmid DNA was prepared by the minipreparation method.
  • (+) strand RNA molecule synthesized from pRL3b By designing the (+) strand RNA molecule synthesized from pRL3b to have HCV5 and UTR added to the 5 'end, it has a structure closer to the original HCV genome, resulting in improved replication efficiency and reporter activity Was expected to rise. This is because not only the 5 'UTR but also the 3' UTR are cooperatively involved in the function of HCV IRES (J. Virol. 72; 8789-8796 (1998)). This is because the 'UTR and 3' UTR may have been acting in concert. Therefore, a reporter with a design in which the HCV 5 'UTR and the base sequence of the N-terminal 16 amino acids of the core protein are added to the 5' end of the (+) strand RNA The expression vector pRL4b was constructed.
  • cloned RNA molecule that has transfected is replicated by the HCV-derived protein, and as a result, clones that have acquired neomycin resistance can be selected. I thought I might have sex.
  • PCR was performed using pCALN / HCV RBZ as type III to obtain a DNA fragment in which the 5 'UTR and the portion from the base sequence for the 16 amino acids at the N-terminal to the end of the neomycin resistance gene were ligated.
  • the base sequence of the PCR primer used is shown below.
  • neo Fw 5 '-GTA GAC CGT GCA TCA TGA GCA CAA ATC CTA AAC CCC AAA GAA AAA CC A AAC GTA ACA CCA ACA TTG AAC AAG ATG GAT TGC ACG C-3, (SEQ ID NO: 16) neo v: 5' -TCT AGA TTA TCA GAA GAA CTG GTC AAG AAG GCG-3, (SEQ ID NO: 1)
  • a PCR reaction solution was prepared in the same manner as above using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo).
  • the PGR reaction was first heated at 94 ° C for 5 minutes, and then performed 20 cycles of denaturation at 98 ° C for 10 seconds, annealing at 60 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute and 20 seconds.
  • the amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • this PCR product was subjected to 1.0% agarose electrophoresis, and a DNA fragment of the desired size was extracted from the gel.
  • an addition reaction of A to the 3 ′ end of this fragment was performed as follows.
  • Recombinant Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) lzL, 10x buffer 1L, 2.5raM dATP 0.8 ⁇ , 25mM MgC12l ⁇ L was added to an appropriate amount of DNA solution, and sterile water was added to make a total volume of 10xL. This was incubated at 70 ° C for 30 minutes. From this reaction solution, IL was used for T / A cloning. T / A cloning was performed as described above. Transform the ligation reaction solution into E.
  • coli DH5a inoculate on LB + Amp plate, incubate at 37 ° C overnight, and colonies appearing on the plate in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium at 37 ° C overnight Shake
  • the culture was collected by centrifugation, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method. After re-checking that the insert DNA was inserted by appropriate restriction enzyme treatment, the base sequence of the insert portion was analyzed, and the plasmid, which was confirmed to be correct, was used below. First, this plasmid was double-digested with Accl and Xbal, and the obtained 0.9 kbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • ⁇ 5′-3 ′ RBZ was separately double-digested with Xhol and Accl, and Xhol and Xbal, respectively.
  • the former extracted a 0.4 kbp DNA fragment and the latter extracted a 3. Ikbp DNA fragment from a gel.
  • a ligation reaction of these three extracted DNA fragments was carried out, transformed into E. coli DH5a, inoculated on an LB + Amp plate, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method.
  • Plasmid DNA incorporating the insert DNA was selected by appropriate restriction enzyme treatment. Next, this plasmid DNA was digested with Xbal, purified, and subjected to a terminal smoothing reaction using Klenow Frgment (the method is the same as described above), followed by alkaline phosphatase treatment. On the other hand, as an insert, the above pRL3b was cut with Xbal, subjected to agarose gel electrophoresis, and a 3.0 kbp DNA fragment was extracted. This was subjected to terminal blunting reaction using Klenow Frgment (the method was the same ).
  • the plasmid obtained from this clone was subjected to lini double digestion with Xhol and Xbal, agarose electrophoresis was performed, and a 4. Ikbp DNA fragment was extracted from the gel.
  • pBR322 was double-digested with Ndel and Hindlll and subjected to electrophoresis. 2.
  • the DNA fragment of Ikbp was extracted from the gel, and after blunting with Klenow Frgment (the method is the same as above), The mixture was self-ligated in a reaction solution, transformed into Escherichia coli DH5a, inoculated on an LB + Amp plate, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the colonies appearing on the plate are cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture is centrifuged to collect the cells. Then, plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method. This vector was double-digested with EcoRI and Hindlll, subjected to agarose electrophoresis, and extracted from a gel. A 2. Ik bp DNA fragment was used as a vector.
  • pCALN / HCV RBZ was double-digested with Xbal and Hindlll, subjected to agarose electrophoresis and extracted from the gel, and a 0.6 kbp DNA fragment and pCALN / HCV RBZ were double-digested with EcoRI and Xhol.
  • a 1.8 kbp DNA fragment that had been digested, subjected to agarose electrophoresis, and extracted from the gel was used. Perform the ligation reaction of the above 4.1kbp, 0.6kbp, 1.8kbp insert with the above 2.lkbp vector, transform into E.
  • coli DH5a inoculate on LB + Amp plate and incubate at 37 ° C overnight.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium with shaking at 37 ° C overnight, and the culture was collected by centrifugation to prepare plasmid DNA by the mini-preparation method.
  • the clone which was confirmed to have three inserts inserted as intended by appropriate restriction enzyme treatment, was named pRL4b.
  • the cis-acting expression vector PEL2 was constructed as follows. First, pCALN / HCV RBZ is digested with Xhol, electrophoresed, a 16.5 kbp DNA fragment is extracted, self-ligated in a Ligation reaction solution, transformed into E. coli DH5a, and LB + The cells were seeded on an Am P plate and cultured at 37 ° C overnight. The colonies that appeared on the plate were shake-cultured at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the cells, and the plasmid DNA was prepared by the minipreparation method.
  • pCAG / HCV RBZ The size was checked and the one confirmed to be correct was named pCAG / HCV RBZ.
  • this pCAG / HCV RBZ was double-digested with Clal and Xbal and subjected to electrophoresis to extract a 4.9 kbp DNA fragment, which was used as a vector DNA.
  • pE2 was double-digested with Clal and Xbal, electrophoresed, and a 8.7 kbp DNA fragment was extracted and used. These DNA fragments were subjected to a ligation reaction and transformed into E. coli.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the mini-preparation method. Next, this was digested with Xbal, purified by PCR purification cat ion kit, and then subjected to BAP treatment. On the other hand, as an insert, the above pRL3b was treated with Xbal, electrophoresed, and a 3.0 kbp DNA The extracted fragment was used. These DNA fragments were subjected to a ligation reaction, transformed into Escherichia coli DH5a, and cultured overnight at 37 ° C.
  • Some of the obtained colonies were inoculated into LB + Amp medium, cultured at 37 ° C overnight with shaking, and then plasmids were prepared by the mini-preparation method. Check the insertion direction of the insert by appropriate restriction enzyme treatment, digest the plasmid confirmed to be incorporated in the expected direction with Clal, purify with the PGR purification kit, and perform BAP treatment. I got it. On the other hand, as an insert, the above pCAG / HCV RBZ was digested with Clal to extract a 2.6 kbp DNA fragment. These ligation reactions were performed to transform Escherichia coli.
  • the colonies that appeared on the plate were cultured with shaking at 37 ° C overnight in a tube containing 3 mL of LB + Amp medium, and the culture was centrifuged to collect the bacteria, and plasmid DNA was prepared by the minipreparation method.
  • the plasmid was confirmed to be inserted in the expected direction by checking the insert direction by appropriate restriction enzyme treatment, and the plasmid was named PEL2.
  • each vector was performed by the calcium phosphate method. Mix each DNA solution and 0.2M chloride solution, add an equal volume of 2X HBS solution, leave at room temperature for 10 minutes, add culture solution, and the day before, add 1.5 to 2.0 ⁇ 10 5 cells / ml. Added to the seeded IMY cells. The input amount of each vector was 4 g / gl. 37 ° C, 5% C0 After 4 hours at 2 conditions, washed several times culture, if not induce transcription in vaccinia virus (T7VV) expressing T7 RNA polymerase, as it is fresh culture medium was added to 2 days Cultured.
  • T7VV vaccinia virus
  • the virus When transcription was induced with T7VV, the virus was added with M0I10, and after adsorption for 1 hour, a new culture solution was added, followed by culturing for 10 hours. After culturing, the cells were washed with PBS (-), the cells were detached using a cell scraper, placed in a 1.5 mL tube, and stored at -80 ° C until used for Lucifera zetasii.
  • Control 1 shows the case where transcription was induced with T7VV without introducing the vector
  • Control 2 shows the case where transcription was not induced with T7VV without introducing the vector.
  • Table 1 shows the overlap between the trans-acting vector pRL2b or pRL3b and pElb or pE2b. This shows the results of transfection, and the results of transfection using a reporter gene expression vector alone are used as background levels, and changes in luciferase activity in the presence of an enzyme expression vector are examined. .
  • Table 2 shows the results of the double transfection of the transacting vector pRL3b or pRL4b with pElb or pE2bb. The cis-acting vector pEL2 was also examined.
  • Tables 1 and 2 show the following.
  • the present invention provides a novel RNA virus replication mechanism analysis vector.
  • the activity of RNA-dependent RNA polymerase derived from RNA virus can be adjusted to the level of reporter gene expression, taking into account the interaction of viral proteins and host factors based on the virus's natural life cycle. It becomes possible to evaluate again.

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Description

明 細 書
RNAウィルスの複製機構解析用ベクター及びその用途 技術分野
本発明は、 RNAウィルスの複製機構解析用べクタ一に関する。 このべクタ一に より、 RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラーゼ （以下、 単に 「RNAポリメラ —ゼ」 という場合がある） の活性を、 ウィルス本来の生活環に基づいたウィルス 蛋白質や宿主因子の相互作用を考慮して、 レポ一ター遺伝子の発現量にょリ評価 することが可能になる。 従って、 このべクタ一は、 RNAウィルスの複製の機構お よびウィルス遺伝子産物の機能の解明、 治療薬および治療手段の開発等に有用で ある。 背景技術
C型肝炎ウィルス （以下 「HCV」 という） は、 輸血後の非 A非 B型肝炎の主要な原 因ウィルスであり、 その遺伝子の cDNAは 1989年にクロ一ニングされた。 これまで にクロ一ニングされた遺伝子 cDNAを用いて HCVに関する多くの研究がおこなわれ ており、 特に感染予防ならびに診断法の確立など社会的に重要な成果が達成され、 現在では輸血後の HCV感染はほとんど認められない状況に至っている。 しかしな がら、 世界中の HCV感染者数は全人口の数％にもおよぶとされている。 このウィル スに起因する感染は長期慢性化する特徴があり、 これに伴い慢性肝炎を引き起こ し、 その後肝硬変、 さらに肝がんに移行する割合が非常に高いことが知られてお リ、 感染後の HCVの確実な排除が重要な課題となっている。
C型慢性肝炎の治療法については、 インターフェロン （I FN) 療法が広く施行さ れているが、 有効率は約 30%程度であり、 また、 高頻度に発熱などの副作用が誘 導されること、 高薬価の問題などから、 満足のいく結果は得られていない。 IFN の種類、 用法 '用量の検討もなされ、 コンセンサス IFNの開発などにより有効率 の向上は期待され、 また、 I FNとリバビリンなどの抗ウィルス剤の併用による治 療も試みられてはいるが、 いずれも確実な治療法には至っていない。 一方、 HCVの生活環に基づいた、 抗 HCV剤の探索は HCV cDNAを用いて多くの研究 施設で試みられてきた。 特に、 選択的なウィルス蛋白質の機能阻害による薬剤探 索は、 非構造領域にコードされたプロテア一ゼ （NS3) と RNA依存性 RNAポリメラ —ゼ （NS5B) などを標的として、 それらのリコンビナント蛋白質を調製し、 その 酵素活性阻害を評価する手法により行われてきた。 しかしながら、 これらの研究 から見い出された阻害剤から、 現在のところ HCV治療薬が開発されるに至ってい ない。
また、 薬剤スクリーニングのためのアツセィ系として、 in vi troの細胞感染系 が有用であるが、 そのような感染系については、 いくつかの報告があるが、 その 複製量の低さ等の問題から再現性のある安定で実用的な系はできていないのが実 情である。 また、 細胞感染系においては、 感染性ウィルスの生成を伴うことから、 バイオハザード等の点で、 簡便性に欠けると考えられる。
本発明者らのこれまでの研究により、 本来のウィルスの複製において生成する ウィルス蛋白質は細胞内において単独でその機能を発揮しているのではなく、 複 数のウィルス蛋白質が宿主因子を含めた複合体として機能しており、 機能しうる 複合体とそれぞれ単離された蛋白質では、 かなずしもその構造が一致しないと考 えられた。 HCVの場合、 精製酵素を用いたアツセィ系における阻害剤が治療薬に 結びついていない理由として、 この複合体の状態と精製酵素の状態での構造的な 乖離が問題であると考え、 よリ実際のウィルス複製の状態を模した細胞複製系を 構築することが重要であると考えた。 また、 その際、 感染性ウィルスを生成せず、 レポ一ター遺伝子により、 ウィルス蛋白質の機能を感知できる細胞アツセィ系が あれば、 ウィルスの複製の機構およびウィルス遺伝子産物の機能の解明、 治療薬 および治療手段の開発等に有用である。
本発明の目的は、 ウィルス本来の生活環に沿って、 ウィルス蛋白質が機能でき る状況を再現し、 同時に感染性ウィルスを生成せず、 レポ一ター遺伝子でウィル ス蛋白質の機能を評価できる発現系を確立することである。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 RNAポリメラ —ゼを発現するベクターとレポーター遺伝子をアンチセンス方向で発現するべク ターを宿主細胞に導入することにより、 レポーター遺伝子の発現産物の量から、 前記 RNAポリメラ一ゼの宿主内での活性を評価できることを見出し、 本発明を完 成した。
即ち、 本発明は、 以下の 1 ~ 1 9の発明を包含する。
1 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むことを 特徴とする RNAウィルスの複製機構解析用ベクター。
2 . アンチセンス方向で発現するレポーター遺伝子を含むことを特徴とする RNA ゥィルスの複製機構解析用ベクタ一。
3 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNA、 及びアンチ センス方向で発現するレポーター遺伝子を含むことを特徴とする RNAウィルスの 複製機構解析用べクタ一。
4 . 1に記載の RNAウィルスの複製機構解析用べクタ一及び 2に記載の RNAウィル スの複製機構解析用ベクターとを含むことを特徴とする RNAウイルスの複製機構 解析用キット。
5 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むベクタ —と、 前記 RNAポリメラーゼのエントリ一サイトに対応する DNA及びその上流に配 置され、 アンチセンス方向で発現するレポ一ター遺伝子を含むベクタ一とを作製 し、 これらのベクターを宿主となる細胞に導入し、 その細胞におけるレポーター 遺伝子の発現産物の量を測定することにより、 前記 RNAポリメラ一ゼの活性を評 価することを特徴とする RNAポリメラ一ゼ活性の評価方法。
6 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラーゼをコードする DNA、 前記 RNAポ リメラ一ゼのェントリーサイ トに対応する DNA、 及びそのェントリ一サイ トに対 応する DNAの上流に配置され、 アンチセンス方向で発現するレポ一ター遺伝子の 三者を含むベクターを作製し、 このベクターを宿主となる細胞に導入し、 その細 胞におけるレポータ一遺伝子の発現産物の量を測定することにより、 前記 RNAポ リメラ一ゼの活性を評価することを特徴とする RNAポリメラーゼ活性の評価方法。 7 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むベクタ 一と、 前記 RNAポリメラ一ゼのエントリーサイトに対応する DNA及びその上流に配 置され、 アンチセンス方向で発現するレポーター遺伝子を含むベクターとを作製 し、 これらのベクターを宿主となる細胞に導入した後、 この細胞に被検物質を接 種し、 その細胞におけるレポ一ター遺伝子の発現産物の量を測定し、 被検物質の 中からレポ一ター遺伝子の発現産物の量を増減させた物質を選択することを特徴 とするウイルス疾患治療剤のスクリーニング方法。
8 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNA、 前記 RNAポ リメラーゼのェントリ一サイトに対応する DNA、 及びそのェントリ一サイトに対 応する DNAの上流に配置され、 アンチセンス方向で発現するレポーター遺伝子の 三者を含むベクタ一を作製し、 このベクターを宿主となる細胞に導入した後、 こ の細胞に被検物質を接種し、 その細胞におけるレポーター遺伝子の発現産物の量 を測定し、 被検物質の中からレポ一ター遺伝子の発現産物の量を増減させた物質 を選択することを特徴とするウイルス疾患治療剤のスクリ一ニング方法。
9 . 7又は 8に記載のウイルス疾患治療剤のスクリーニング方法により得られた
1 0 . 1に記載のベクター及び 2に記載のベクターとを含む細胞。
1 1 . 3に記載のベクタ一を含む細胞。
1 2 . 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法
( 1 ) 宿主中で RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを発現させ、
( 2 ) レポ一タ一遺伝子を RNAポリメラ一ゼ非存在下においては発現しないよう に配置した RNAと上記 RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを接触させ、
( 3 ) レポーター遺伝子の発現産物の発現量を測定する。
1 3 . 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法
( 1 ) 宿主中で RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを発現させ、 ( 2 ) レポーター遺伝子をアンチセンス方向でコードした RNAを発現させ、 ( 3 ) 上記 RNAポリメラ一ゼによりレポータ一遺伝子をセンス方向でコードした R NAを合成し、
( 4 ) レポ一タ一遺伝子の発現産物の量を測定する。 14. 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法
( 1 ) ベクター中にアンチセンス方向に組み込まれたレポ一タ一遺伝子と、 該べ クタ一と同一または異なるベクター中にセンス方向に組み込まれた RNA依存性 RNA ポリメラーゼ遺伝子をコードした RNAを宿主中で発現させ、
(2) 上記 RNAから RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを発現させ、
(3) 上記 RNA依存性 RNAポリメラーゼによリレポーター遺伝子をセンス方向でコ —ドした RNAを合成し、
(4) レポーター遺伝子の発現産物の量を測定する。
1 5. 1 2〜1 4の評価法に、 被検物質を接触させる工程を追加することからな る、 ウィルス複製阻害物質のスクリーニング法。
1 6. RNAウィルスが HCVである 1〜 3のべクタ一。
1 7. RNAウィルスカ¾(^である 5〜6及び 1 2〜1 4に記載の評価方法。
1 8. RNAウィルスが HCVである 7〜 8及び 1 5に記載のスクリーニング法。
1 9. RNAウィルスが HCVである 1 0〜 1 1に記載の細胞。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第 2000- 142451号の明細 書及びノ又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 トランス作用系べクタ一による RNAポリメラ一ゼ活性の評価の概要を 示す図である。
図 2は、 シス作用系べクタ一による RNAポリメラ一ゼ活性の評価の概要を示す 図である。
図 3は、 pE2ベクターの構築工程を示す図である （前半)。
図 4は、 pE2ベクタ一の構築工程を示す図である （後半)。
図 5は、 pElbベクターの構築工程を示す図である。
図 6は、 pElベクターの構築工程を示す図である。
図 7は、 pIFGOベクタ一の構築工程を示す図である。
図 8は、 pRLlベクタ一の構築工程を示す図である。 図 9は、 pRL lbベクターの構築工程を示す図である。
図 1 0は、 pRL2bベクタ一の構築工程を示す図である。
図 1 1は、 pRL3bベクタ一の構築工程を示す図である。
図 1 2は、 pRL4bベクタ一の構築工程を示す図である （前半）。
図 1 3は、 pRL4bベクターの構築工程を示す図である （後半）。
図 1 4は、 pEL2ベクタ一の構築工程を示す図である。 発明を実施するための形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
( 1 ) RNAウィルスの複製機構解析用ベクター
本発明の RNAウィルスの複製機構解析用べクタ一は、 以下の（a)〜（c)の 3種類 のベクターを包含する。
(a) 下記（b)のべクタ一とともに宿主となる細胞に導入するべクタ一であって、 ウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラーゼをコードする DNAを含むベクタ一
(b) 上記（a)のべクタ一とともに宿主となる細胞に導入するべクタ一であって、 アンチセンス方向で発現するレポ一タ一遺伝子 （以下、 単に 「アンチセンスレポ 一ター遺伝子」 という場合がある） を含むベクタ一
(c) ウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNA及びアンチセン ス方向で発現するレポーター遺伝子を含むベクタ一
一般に、 タンパク質をコードしている遺伝子の開始コドンから終止コドンに向. かう方向の配列がセンス配列であり、 その逆向きがアンチセンス配列であるが、 本明細書においては、 「アンチセンス方向」 とは、 発現べクタ一の構造から、 細 胞に導入して発現させた際にアンチセンス方向で転写される、 すなわち始めに逆 向きの mRNAが合成される方向でレポ一ター遺伝子を揷入したことをいう。 従って、 発現べクタ一から作られた mRNAでは機能するレポ一タ一タンパク質はできず、 そ の mRNAを錡型にして RNA依存性 RNAポリメラ一ゼによって相補的 RNAが合成されて 初めて機能するレポ一タ一タンパク質が作られることになる。
( a)のべクタ一は、 RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコ一ドす る DNAを宿主細胞内で発現することのできるものであればどのようなものでもよ いが、 好ましくはプラスミ ドを使用する。 使用する RNAポリメラーゼは、 特に限 定されず、 各種ウィルス由来の RNAポリメラ一ゼを使用することができる。 具体 的には、 HCV由来の RNAポリメラ一ゼ （NS5B)、 Po l i ovi rus (ポリオウイルス） 由 来の RNAポリメラーゼ、 Rotavi rus (ロタウィルス） 由来の RNAポリメラ一ゼなど を使用することができるが、 これらの中でも HCV由来の RNAポリメラ一ゼを使用す るのが好ましい。 使用するプロモータ一は特に限定されず、 例えば、 CAGプロモ 一タ一、 CMVプロモーター、 T7プロモータ一、 EFl aプロモータ一、 SV40初期プロ モーター、 SV40後期プロモータ一などを使用することができる。 これらの中でも 大量の RNAを合成させることのできる T7プロモーター、 CAGプロモータ一などを使 用するのが好ましい。 ウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DN Aは、 酵素活性を有する蛋白質に対応する DNA領域のみをべクタ一に組みこんでも よいが、 この DNA領域に連続する領域も併せてべクタ一に組みこんでもよい。 例 えば、 HCVの場合、 RNAポリメラ一ゼ活性を持つのは NS5B蛋白質であるが、 これを コードする DNAのみならず、 NS5B蛋白質に隣接する NS5A、 NS4、 NS3、 NS2、 E2、 El、 Coreなどの蛋白質をコードする DNAを併せてべクタ一に組みこんでもよい。 この ように RNAポリメラ一ゼをコードする領域以外の領域をべクタ一内に組みこむこ とにより、 RNAポリメラーゼと他の因子との相互作用をも考慮できる環境下で RNA ポリメラーゼ活性を評価することが可能になる。 ベクタ一は、 導入と同時に発現 を開始するタイプのものでもよいが、 Cre- ΙοχΡシステム （Nat Sternbergら J. Mo lecul ar B i o l ogy 150. p467-486 1981、 Nat Sternbergら J. Mo l ecul ar B i o l ogy 150. p487-507 1981) などのように特定の操作を行うことによって初めて発現を 開始するタイプのものであってもよい。
(b)のベクターは、 宿主細胞内でアンチセンスレポーター遺伝子の転写産物を 合成できるものであればどのようなものでもよいが、 好ましくはプラスミ ドを使 用する。 使用するプロモータ一は特に限定されず、 例えば、 CAGプロモ一タ一、 C MVプロモータ一、 T7プロモータ一、 EFl aプロモータ一、 SV40初期プロモータ一、 SV40後期プロモータ一などを使用することができる。 これらの中でも大量の RNA を合成させることのできる T7プロモータ一、 CAGプロモータ一などを使用するの が好ましい。 レポ一ター遺伝子は、 何らかの手段によりその発現産物の量を測定 できるものであればどのようなものでよい。 このような遺伝子としては、 例えば、 ルシフェラ一ゼ遺伝子、 クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝 子、 3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子などを挙げることができ、 これらの中でもルシ フェラ一ゼ遺伝子を使用するのが好ましい。
(a)のベクターと（b)のべクタ一を共に宿主となる細胞に導入したとしても、 （a )のベクタ一から発現した RNAポリメラ一ゼが、 ）のべクタ一の転写産物の適当 な位置に結合しなければ、 レポーター遺伝子の発現産物は合成されない。 従って、 通常は、 （a)のベクターから発現する RNAポリメラ一ゼのェントリ一サイトに対応 する DNAを（b)のべクタ一のアンチセンスレポ一タ一遺伝子の下流に揷入しておく 必要がある。 但し、 後述するように、 これらのベクタ一を RNAポリメラ一ゼのェ ントリ一サイトを特定する目的で使用する場合もあるので、 その場合はエントリ —サイトに対応する DNAを揷入する必要はない。 尚、 本明細書において、 「RNAポ リメラーゼのェントリ一サイト」 とは、 RNAウイルス由来の RNA依存性 RNAポリメ ラ一ゼが結合する RNAの特定の部位であって、 ここから RNAの合成が開始される部 位のことをいう。
一般に、 RNA依存性 RNAポリメラ一ゼは、 RNAを錡型に相補的 RNAを合成す る酵素であり、 RNA合成を開始するにあたって、 開始点を認識する必要がある。 従来の方法では、 人工的な複製開始点として適当なプライマーを設定してそこか ら RNAを合成させるという手法を用いていたが、 本発明では、 RNAウィルス由 来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼが本来認識して RNA合成を開始する場所 (配 列）に結合して、 活性を表すようにしている。 本明細書においてはその配列のこ とを RNAポリメラ一ゼのェントリ一サイトという。
また、 IRES( Internal Ribosome Entry Si te)依存的な翻訳を可能にするため、 レポーター遺伝子の下流には、 IRESに対応する DNAを揷入しておくことが望まし い。 IRESは、 使用する RNAポリメラーゼと同一のウィルス由来のものでもよいが、 より翻訳活性の高い IRESを使用するのが好ましい。 このような IRESとしては、 VE GF (Vascul ar Endothel ial Growth Factor) IRES (SP163) (Mi l l er, D. L.ら， F EBS Lett 1998 Sep 4;434(3) : 417-20)、 EMCV (Encephalomyocardi ti s Vi rus) IR ES (Jang, S. K.ら， Journal of Vi rology, 62(8) : 2636-43, 1988 Aug. Pol i ov irus IRES (Ishii, T.ら， J. Gen. Virol. (1999)， 80(4), 917-920; Ehrenfeld, E.及び Semler, B. L. , Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995)， 203, 65-83; Klinck, R.ら， Nucleic. Acids Res. (1997), 25(11)， 2129-2137; Johansen, L. K.及び Morrow, CD., Virology (2000), 273(2), 391-399) などを例示すること ができる。 このベクター内のレポ一タ一遺伝子はアンチセンス方向で発現するよ うに揷入されているので、 本来センス方向のレポーター遺伝子の転写産物は生じ ないはずであるが、 実際には下流から上流方向へ非特異な転写産物が合成される。 センス方向の転写産物は、 本評価法のバックダラゥンド値を上昇させてしまう。 従って、 このようなセンス方向の転写産物の合成を防ぐため、 エントリーサイト に対応する DNAの下流に逆向きポリ Aシグナルを揷入することが好ましい。
(c)のベクターは、 宿主細胞内で、 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを発現で き、 アンチセンスレポ一タ一遺伝子の転写産物を合成できることのできるもので あればどのようなものでもよいが、 好ましくはプラスミドを使用する。 このべク タ一の作製は、 RNAポリメラ一ゼをコードする DNA、 及びアンチセンスレポーター 遺伝子が同一のベクタ一内に含まれることを除いては、 （a)のべクタ一及び（b)の ベクタ一と同様にして作製することができる。
本発明の RNAウィルスの複製機構解析用べクタ一は、 後述するように、 主に RNA ウィルス由来の RNAポリメラ一ゼ活性の評価に用い、 これによつて RNAウィルスの 複製機構を解析することが可能となるが、 これ以外にも以下のような用途に利用 可能である。
1 ) IRESの翻訳活性の測定
レポーター遺伝子の発現産物は、 IRES依存的に翻訳される。 従って、 （b)又は（ c)のべクタ一内に種々の IRES (あるいは IRESと予想される配列） を組み込み、 レ ポ―タ—遺伝子の発現産物の量を測定することにより、 各 IRESのタンパク質発現 誘起活性を測定することができる。
2) RNAポリメラ一ゼと関連するウィルス蛋白質の特定
RNAウィルス由来の RNAポリメラ一ゼは、 必ずしもそれ単独で活性を発揮するわ けではなく、 他の因子と結合し、 酵素複合体を形成して初めてその活性を発揮す る場合がある。 また、 前駆体として生産され、 プロテア一ゼ等によるプロセッシ ングを受けて初めて活性を発揮する場合もある。 例えば、 HCV由来の NS5B蛋白質 は、 隣接する NS蛋白質と複合体を形成すると考えられており、 また、 プロテア一 ゼである N S 3によるプロセッシングを受ける。
以上のことから （a)または（c)のべクタ一内に RNAポリメラ一ゼ以外の種々のゥ ィルス蛋白質をコードする DNAを組み込み、 レポ一ター遺伝子の発現産物が生じ るかどうかを調べることにより、 RNAポリメラ一ゼと関連する因子を特定するこ とができる。
3 ) RNAポリメラ一ゼのェントリ一サイトの特定
RNAウィルス由来の RNAポリメラ一ゼは、 RNAの特定の部位 （エントリ一サイ ト ) に結合し、 RNAの合成を開始する。 従って、 （b)または（c)のべクタ一内の様々 な部位にアンチセンスレポータ一遺伝子を揷入し、 レポ一タ一遺伝子の発現産物 が生じるかどうかを調べることにより、 RNAポリメラ一ゼのェントリ一サイトを 特定することができる。 例えば、 HCV由来の NS5Bは、 HCVゲノム RNAの 3' UTRをェン トリ一サイトとしているので、 3' UTRに対応する DNAの上流にアンチセンスレポ一 タ一遺伝子を揷入した場合にのみ、 レポ一タ一遺伝子の発現産物が生じる。 4 ) RNAポリメラ一ゼと関連する宿主因子の特定
RNAウィルス由来の RNAポリメラ一ゼは、 そのウィルス自体の因子だけでなく、 宿主因子とも複合体を形成すると考えられる。 従って、 （a)及び (b)のべクタ一、 または（c)のべクタ一を種々の宿主細胞に導入し、 各細胞においてレポ一タ一遺 伝子の発現産物が生じるかどうかを調べることにより、 RNAポリメラーゼと関連 する宿主因子を特定することができる。
本発明はまた、 上記（a)及び（b)のべクタ一を含むことを特徴とする RNAウィル スの複製機構解析用キットを提供する。 本発明のキットを使用することにより、 (a)及び（b)のべクタ一を共に宿主となる細胞に導入し、 その細胞におけるレポ一 タ一遺伝子の発現産物の量を測定することにより、 RNAポリメラーゼ活性を評価 することができる。 また、 （a)及び (b)のベクターを共に導入した細胞に被検物質 を接種し、 その細胞におけるレポーター遺伝子の発現産物の量を増減させる物質 を選択することにより、 ウイルス疾患治療剤となリ得る被検物質をスクリーニン グすることができる。 ( 2 ) RNAポリメラーゼ活性の評価方法
本発明の RNAポリメラーゼ活性の評価方法は、 以下の（a)と（b) 'のベクター、 又 は（c) 'のベクターを作製し、 これらのベクタ一を宿主となる細胞に導入し、 その 細胞におけるレポーター遺伝子の発現産物の量を測定することにより、 前記 RNA ポリメラ一ゼの活性を評価することを特徴とするものである。 本発明において、 RNAポリメラーゼ活性を評価してその複製機構を解析することができる RNAウィル スとしては、 RNAをゲノムとして有する KNAウィルスであれば良く、 限定されるも のではないが、 ウィルス性疾患の原因ウィルスとして問題となる HCV、 ポリオゥ ィルス、 ロタウィルス、 特に HCVを挙げることができる。 なお、 以下、 （a)と（b) ' のべクタ一を 「トランス作用系ベクター」、 （c) 'のベクターを 「シス作用系べク ター」 という。
( a) RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むベクタ ）'前記 RNAポリメラ一ゼのェントリ一サイトに対応する DNA及びその上流に配置 され、 アンチセンス方向で発現するレポーター遺伝子を含むベクタ一
(c) 'ウイルス由来の RNA依存性 RNAポリメラーゼをコ一ドする DNA、 前記 RNAポリメ ラ一ゼのエントリ一サイトに対応する DNA、 及びそのエントリ一サイトに対応す る丽 Aの上流に配置され、 アンチセンス方向で発現するレポ一ター遺伝子の三者 を含むベクター
(b) '及び（c) 'のべクタ一は、 上述した（b)及び（c)のべクタ一と同様にして作製 することができる。
宿主とする細胞としては、 IMY、 HuH- 7、 HepG2、 MOLT- 4、 MT-2、 Daud iなどの肝 プライマリ一細胞、 その他の肝細胞、 血球系細胞由来の細胞などを使用すること ができるが、 これらに限定される訳ではない （宿主細胞としての必須要件があれ ば記載をお願いします。 例えば複製、 転写及び翻訳機構に関して）。 ベクタ一を 宿主内に移入する方法としては、 リン酸カルシウム法などの当分野において通常 行われる技術を用いることができ、 特に限定される訳ではない。
宿主細胞内における発現産物の量の測定は、 使用したレポ一タ一遺伝子に応じ て行えばよい。 以下、 RNAポリメラーゼとして HCVの NS5B蛋白質、 レポ一タ一遺伝子としてルシ フェラーゼ遺伝子を用いた場合の RNAポリメラ一ゼ活性の評価方法を、 図 1及び 図 2を用いて説明する。
図 1は、 トランス作用系べクタ一による RNAポリメラーゼの活性評価の概要を 示す。
NS5B発現ベクター （図左） には、 Core-NS5B又は NS3- NS5Bの HCV蛋白質をコード する DNAが含まれている。 このべクタ一からは、 キャップ依存的な翻訳により前 駆体蛋白質が合成される。 前駆体蛋白質は、 プロテア一ゼである NS3蛋白質と宿 主のプロテアーゼによって複数の蛋白質 （NS蛋白質） に切断される。 切断された 蛋白質と宿主因子は、 NS5Bを含む酵素複合体を形成する。
一方、 ルシフェラ一ゼ発現べクタ一 （図右） には、 アンチセンス方向のルシフ エラーゼ遺伝子、 IRES (アンチセンス方向）、 HCVゲノム RNAの 3' UTRに対応する DN Aなどが含まれている。 このべクタ一からは、 アンチセンス方向のルシフェラ一 ゼ転写産物、 IRES、 3' UTRを含む RNAが合成されてくる。
NS5Bのェントリ一サイトは HCVゲノム RNAの 3' UTRなので、 NS5Bを含む酵素複合 体は、 ルシフェラ一ゼ発現べクタ一由来の RNAの 3' UTRに結合し、 この RNAを錡型 とし、 相補的な RNAを合成する。 この相補的な RNAが IRES依存的に翻訳され、 ルシ フェラ一ゼが合成される。 この相補的な RNAの量は、 NS5Bを含む酵素複合体の酵 素活性と対応し、 また、 この RNAの量は合成されたルシフェラ一ゼの量と対応す るので、 結局、 NS5Bを含む酵素複合体の酵素活性はルシフェラ一ゼの量と対応す ることになる。
図 2は、 シス作用系べクタ一による RNAポリメラーゼの活性評価の概要を示す。 NS5B-ルシフェラ一ゼ発現べクタ一には、 5' UTRに対応する DNA、 Core-NS5B蛋白 質をコードする DNA、 アンチセンス方向のルシフェラ一ゼ遺伝子、 IRES (アンチ センス方向）、 3' UTRに対応する DNAなどが含まれており、 転写によりこれらの DNA に対応する RNAが合成される。 この RNAは、 IRES依存的に翻訳され、 トランス作用 系べクタ一の場合と同様に NS5Bを含む酵素複合体が形成される。 この酵素複合体 は、 前述の RNA (即ち、 酵素複合体自身の元となる RNA) の 3' UTRに結合し、 この R NAと相補的な RNAを合成する。 この相補的な RNAが IRES依存的に翻訳され、 ルシフ エラ一ゼが合成される。 合成されたルシフェラーゼの量が、 酵素複合体の RNAポ リメラ一ゼの活性と対応するのは、 トランス作用系ベクターの場合と同様である。 この RNAポリメラ一ゼの活性評価方法は、 ウィルス疾患治療剤のスクリ一ニン グに利用することができる。 ウイルス疾患治療剤の候補となる物質を上述したベ クタ一が導入された細胞に接種し、 その細胞におけるレポ一タ一遺伝子の発現産 物の量を測定することにより、 接種した物質がウィルス由来の RNAポリメラ一ゼ 活性を阻害するかどうか判断することができる。 すなわち、 本発明の方法によつ てウィルス由来 RNAポリメラ一ゼ活性を阻害する物質は、 有効な新規ウィルス疾 患治療剤としての可能性を有する。
従って本発明はまた、 上記ウィルス疾患治療剤のスクリーニング方法によって 得られた物質を提供することができる。
本発明はまた、 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法：
( 1 ) 宿主中で RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラーゼを発現させ、
( 2 ) レポ一ター遺伝子を RNAポリメラ一ゼ非存在下においては発現しないよう に配置した RNAと上記 RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを接触させ、
( 3 ) レポ一ター遺伝子の発現産物の発現量を測定する、
を提供する。
上記方法によって、 レポ一タ一遺伝子の発現産物の発現量から RNAウィルス由 来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼの活性を評価することができ、 それによつて RNA ウィルスの複製能を評価することができる。 例えば、 従来 RNAポリメラ一ゼ活性 が未知である RNAウィルスについて、 RNAポリメラ一ゼ活性が既知である RNAウイ ルスとの比較を行ったリ、 突然変異型ウィルスについて野生型ウィルスとの比較 を行ったりして、 その複製能が相対的に上昇または低下していることを知ること ができる。
レポ一タ一遺伝子を龍 Aポリメラーゼ非存在下においては発現しないように配 置する方法としては、 例えばレポ一タ一遺伝子をアンチセンス方向で発現するよ うに含むベクターを用いれば良い。 この場合、 該ベクターから宿主内の通常の転 写機構を利用してアンチセンス方向でレポーター遺伝子をコードする RNAが発現 するので、 RNA依存性 RNAポリメラーゼが存在しな 、場合にはレポ一タ一遺伝子が コードするぺプチドは発現せず、 RNAポリメラーゼが存在する場合にのみ、 レポ ータ一遺伝子をセンス方向でコードした RNAが合成され、 レポ一ター遺伝子がコ ードするペプチドが発現する。 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、 レポ一 タ一遺伝子をアンチセンス方向で発現するように含むベクタ一と同一のベクター にセンス方向に組み込まれていても良く、 またレポーター遺伝子とは異なるべク タ一中にセンス方向に組み込まれていても良い。
上記のウィルス複製能評価方法を用い、 本発明によって更にウィルス複製阻害 物質のスクリーニング方法を提供することができる。 該方法は、 上記ウィルス複 製能評価方法に、 更に被検物質を接触させる工程を追加することによって達成す ることができる。 実施例
以下、 実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。 但し、 本発明の技術的範 囲は、 実施例により限定されるものではない。
〔実施例 1〕
( 1 ) 酵素発現べクタ一の構築
1 ) pE2 (図 3及び図 4 ) 及び pE2bの構築
pCALN/HCV RBZ (このベクターを含む微生物は、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に 1999 年 6月 2 1日付けで受託番号 FERM BP- 6763として寄託されている） より HCVゲノ ム 5'末端側非翻訳領域 （5' UTR)、 3'末端側非翻訳領域 （3' UTR) 及び両末端のリ ボザィムを除去した HCV翻訳領域全長発現べクタ一 pE2の構築を以下の様に行つた。 ρ5' -3， ρΒΜの構築
まず、 3' UTR及び 3'末端側のリボザィムを除去するため、 p5' - 3' RBZ (このべク ターは、 上記 pCALN/HCV RBZから Cre- ΙοχΡ発現部位及びポリ A部位を除去したもの である） を錄型として PCRを行った。 以下に使用した PCRプライマ一の塩基配列を 示す。
HCV Fwl : 5，- CCG GGT ACC ACC CTT GC- 3， (配列番号 7 )
HCV Rvl : 5，- AAC TTA AGC TTA TTT AAA TCT AGA TTA TTA TCG GTT GGG GAG CAG G -3' (配列番号 8 )
PCR反応液は、 チューブに 10X Pyrobest Bufferを 10μ L、 25mM dNTP mixture を 8 L、 100 iMのプライマ一を 1 Lずつ、
Figure imgf000017_0001
1&16 (ρ5' -3， RBZ) を 1 L、 5 units/ tLの Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造） を 0.5 tL加え滅菌水で 1 OO Lに調製した。 PCRはまず 94°Cで 5分間加熱した後、 変性 98°C10秒間、 ァニー リング 60°C30秒間、 伸長 72°C1分間の条件で 30サイクル行った。 増幅された配列 を配列番号 1に示す。 次にこの PCR産物を 1.5%ァガロース電気泳動に供し、 特異 的に増幅した目的の断片をゲルから抽出した。 目的の断片の抽出は、 QIAquick G el Extraction Kit (QIAGEN) を用いて以下のように行った。 まずゲルを切り出 し、 その 3倍量の QG Bufferを添加し、 50°Cで 10分間インキュベーションしゲルを 溶解させた。 インキュベーション後、 ゲルの 1倍量のイソプロパノールを添加、 混合した。 これを QIAquick spin columnに移し遠心を行った。 flow— through fra ctionを除去し、 洗浄のため 750 Lの PE Buffer ¾ QIAquick spin columnに添加し 遠心を行い、 flow-through fractionを除去し、 再度遠心を行い完全に PE Buffer を除去した。 QIAquick spin columnを 1.5mLチューブに移し、 滅菌水を加えて遠 心し、 DNAを溶出させた （以下、 ゲルからの DNA断片の抽出操作は全てこの方法に より行った。）。 次にこの DNA断片を HindIII、 Kpnlによリニ重消化した。 また、 ρ5 '- 3'RBZについても同様に HindIII、 Kpnlによリニ重消化を行った。 反応終了液を ァガロース電気泳動に供し、 上記 PCR産物については 0.3kbpの DNA断片を、 ρ5' - 3' RBZについては 3.7kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 抽出は QIAquick Gel Extra ction Kit (QIAGEN) を用いて上記と同様に行った。 次にこれら 2種類の DNA断片 のライケ一シヨン反応を、 Rapid DNA Ligation Kit (Boeheringer Mannheim) を 用いて以下のように行った。 p5'-3'RBZ DNA断片 3.7 L、 上記 PCR産物 DNA断片 0. 3 L、 5X DNA dilution buffer 1 L、 2X DNA ligation buffer 5//L、 5units/ ΐ T4 DNA Ligase 0.5 Lを混合し、 室温で 30分間ライゲ一シヨン反応を行った
(以下、 ライゲーシヨン反応は全てこのキットを用いて同様に行った。）。 この反 応終了後、 反応液を用いて大腸菌 DH5a株の competent細胞に形質転換した。 具体 的には形質転換は以下の様に行つた。 反応終了後の液を competent細胞に 10分の 1 量 （v/v) 添加し、 氷上に 30分間置いた後、 42°Cで 45秒間のヒートショックを行 い、 再度氷上に 2分間置いた後、 5倍量の S0C培地を加えた。 これを全量 LB+Ampプ レート （1%パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1.5%寒天、 lOO^g/mLアンピシリン） に播種し 37°Cで終夜培養した （以下、 形質転換の操作 は全てこの方法で行った。）。 翌日、 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 （ 1%パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 75 tg/mLアンピシリ ン） 3mLの入ったチューブで 37°Cで終夜振とう培養した後に、 培養液を遠心して 集菌し、 QIAprep Spin Plasmids Kits (QIAGEN) を用いたミニプレパレ一シヨン 法によりプラスミ ド DNAを調製した。 ミニプレパレ一シヨンは以下のように行つ た。 まず、 菌体ペレットに PI Buffe^SO^Lを加えて懸濁し、 次に P2 Buffer 250 Lを添加し混合した。 次に N3 Buffer 350 Lを加え混合した後に遠心を行い、 上清を QIAprep spin columnに移し遠心した。 flow - through fractionを除去し、 洗浄のため 750^ Lの PE Bufferを QIAprep spin columnに加え、 遠心を行い、 flow -through fractionを除去し、 再度遠心を行い完全に PE Bufferを除去した。 QIAp rep spin columnを 1.5mLチューブに移し、 滅菌水 50 Lを加えて遠心し、 プラス ミド DNAを溶出させた （以下、 プラスミド DNAのミニプレパレ一シヨンは全てこの 方法で行った。）。 このプラスミ ド DNAについて配列番号 1に相当する揷入断片の 塩基酉己歹1 Jを、 Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perki n Elmer) を用い、 キット添付のプロトコ一ルに従いシークェンス反応を行った 後に配列の解析を行った。 以下にその手順を示す。 Sequence反応溶液として、 Te rminator Ready Reaction Mix 8 L、 0.1 g/ L Template DNA 6/U.L 、 lpmol ΐ Primer を混ぜ、 滅菌水で 20 Lに調製した。 反応は 96°C5分間、 96°C3
0秒間、 50°C15秒間、 60°C4分間の条件で 25サイクル行った。 次に反応終了液を 1. 5mLチューブに移し、 100%エタノール 50 Lと 3M酢酸ナトリウム （pH4.6) 2 Ι を加えて混合し、 氷上に 10分間置いた。 これを遠心し、 上清を除去後、 70%エタ ノール 250 Lを加えて再び遠心した。 上清を除去し、 風乾後、 泳動用バッファー を加えてサンプルを溶解し、 ォ一トシ一クェンサー Model 310 (Perkin E lmer) に供し、 塩基配列の解析を行った （以下、 シークェンス反応及び塩基配列 の解析は全てこの方法で行った。）。 その結果、 予想通りの配列であることが確認 されたのでこれを P3'pBMと命名し、 以下に用いた。 次に ρ3' ρΒΜから 5' UTR及び 5'末端側のリボザィムを除去したベクタ一を構築す るため、 p5'- 3'RBZを錡型として PCRを行った。 以下に使用した PCRプライマーの 塩基配列を示す。
HCV Fw2:5'-GGA ATT CAT TTA AAT CTC GAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GTA G
AC CGT GCA TCA TGA-3' (配列番号 9 )
HCV Rv2:5，- GGG TGG TAC CCG GGC T- 3， (配列番号 1 0)
PCRは、 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造） を用いて上記と同様な反応を 25サ ィクル行った。 増幅された配列を配列番号 2に示す。 PCR産物を電気泳動に供し、 特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出した。 次に、 この DNA断片を Kpnlと E coRIによリニ重消化した。 また、 i3'pBMについて、 同様 Kpnlと EcoRIによリニ重 消化した。 反応終了液をァガロース電気泳動し、 PCR産物については 0.3kbpの DNA 断片を、 p5'RBZについては 3.4kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 次にこれら 2種 類の DNA断片のライゲ一ション反応を行い、 これを大腸菌 DH5 株に形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB +Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して 集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミド DNAを調製した。 制限酵素処 理により DNA断片のベクタ一への挿入の有無を調べ、 揷入されていることを確認 したプラスミ ド DNAについて、 配列番号 2に相当する部分、 すなわち揷入断片の 塩基配列を解析した。 その結果、 予想通りの配列であることが確認されたのでこ れを ρ5' - 3' ρΒΜと命名し以下の実験に用いた。
ρ5' -3' pBM/HCVの構築
p5'_3'pBMの Kpnlサイトに、 HCV翻訳領域のコア遺伝子上の Kpnlサイトから NS5B 遺伝子上の Kpnlサイトまでの 8.5kbpの DNA断片を組み込んだベクタ一 ρ5' -3' ρΒΜ/Η CVを以下のように構築した。 まず、 ρ5'- 3'pBM及び pCALN/HCV RBZを制限酵素反応 液 Kpnlにより消化し、 ァガロース電気泳動に供し、 ρ5'- 3'pBMの 3.7kbpの線状化 プラスミ ドと pCALN/HCV RBZの 8.5kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 次に Kpnl消 化した p5，-3'pBMについて、 BAPping Kit (TOYOBO) を用いてアルカリフォスファ タ一ゼ処理を行った。 処理はキット添付のプロトコ一ルに従った （以下、 アル力 リフォスファターゼ処理は全て同様に行った。）。 次にライゲーション反応を行い、 これを大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養し、 プレ一トに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜 振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレーシヨン法によりプラス ミド DNAを調製した。 適当な制限酵素で処理することによリ DNA断片挿入の有無及 び揷入方向を調べ予想通りに断片が組み込まれたプラスミドを選択した。 このプ ラスミ ドを p5，- 3' pBM/HCVと命名した。
PE2の構築
ρ5' -3' pBM/HCVの HCV翻訳領域の下流に転写終結シグナルを揷入し、 HCV翻訳領 域の上流に CAGプロモータ一を揷入して pE2構築に至った。 構築は以下のように行 つた。 まず、 p5，- 3，pBM/HCVと pCALN/HCV RBZをそれぞれ Xbalと Hindl l lにより二 重消化し 7ガロース電気泳動に供し、 ρ5' -3' pBM/HCVの 12. 2kbpの DNA断片と pCALN /HCV RBZの 0.6kbpの DNA断片をゲルより抽出し、 これらの DNA断片のライゲ一ショ ン反応を行った。 これを大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37 °Cで終夜培養した。 出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入つたチューブで 37°C で終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法により プラスミ ド DNAを調製した。 次に、 このプラスミ ド DNAを EcoRIにより以下の様に 部分切断した。 プラスミド DNA 2. 2 _i gを 2. 0uni tの EcoRIにより 37°Cで 3分間処理 し、 直ぐに氷水につけて反応を止めァガロース電気泳動に供し、 ベクター上に 2 ケ所ある EcoRIサイトのうち 1ケ所のみを切断した 12. 7kbpの DNA断片をゲルよリ抽 出した。 次に、 抽出した DNA断片を Xholにより消化しァガロース電気泳動に供し、 12. 7kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 また、 インサート DNA断片として、 pCALN /HCV RBZを EcoRI消化した後に、 Xholにより以下の様に部分切断した。 EcoRI処理 した線状プラスミ ド DNA lO gを 12unitの Xholにより 37°Cで 3分間処理し、 直ぐに 氷水につけて反応を止めァガ口一ス電気泳動に供し、 ベクタ一上に 3ケ所ある Xho Iサイトのうち 1ケ所のみを切断した 3. lkbpの DNA断片をゲルより抽出した。 次に の上記 12. 7kbpと 3. lkbpの DNA断片のライゲーシヨン反応を行い、 これを大腸菌 DH 5 αに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 出現したコロ ニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を 遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミ ド DNAを調製した。 制 限酵素処理によりプラスミドのサイズをチェックしたところ、 期待通リの構造を したプラスミドが得られていたので、 これを pE2と命名した。
pE2は pCALN/HCV RBZ同様、 Cre- Ι οχΡシステムにより発現制御されるべクタ一で あり、 このベクターによリスイッチング発現を用いた発現系を作製することがで きる。
pE2bの構築
スィッチング発現を用いない発現系での使用を想定し、 遺伝子導入と同時に細 胞内で発現が起こるようにデザィンしたベクターが pE2bである。 pE2bは pE2をも とに以下のように構築した。 上記 pE2を Xho lで消化しァガロース電気泳動を行い、 14. 5kbpの DNA断片を抽出した。 これをライゲーション反応溶液中でセルフライゲ —シヨンさせ、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜 培養した。 出現したコロ二一を LB+Amp培地 3mLの入つたチューブ中で 37°Cで終夜 振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法にょリプラス ミ ド DNAを調製した。 制限酵素処理によりプラスミド DNAのサイズをチェックした ところ、 期待通りのものが得られていたので、 次にこのプラスミド DNAを Hindl l l により消化しァガロース電気泳動を行い、 11. 4kbpの DNA断片をゲルから抽出した。 また、 PUC19を Hindl l lにより消化しァガロース電気泳動を行い、 2. 7kbpの線状プ ラスミ ド DNAを抽出した。 この線状プラスミ ド DNAについてアル力リフォスファタ —ゼ処理を行った。 このアルカリフォスファタ一ゼ処理を行った線状プラスミド と 11. 4kbpの DNA断片のライゲ一シヨンを行い、 これを大腸菌 DH5 αに形質転換し、 LB+Am プレ一トに播種し 37°Cで終夜培養した。 出現したコロニ一を LB+Amp培地 3m Lの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミ ニプレパレ一シヨン法によりプラスミド DNAを調製した。 適当な制限酵素処理に より、 インサートの揷入方向を確認し、 PUC19の Lacプロモーターに対して逆向き に揷入されているクロ一ンを選び、 これを pE2bと命名した （図 5 )。
2) pElb (図 5 ) 及び pEl (図 6 ) の構築
pElbの構築
細胞内における HCVゲノム RNAの複製は、 NS3から NS5Bまでの非構造蛋白質の部 分のみでも行われることが示されている （Sci ence 285 ; 1 10-1 13 ( 1999) ) ことか ら、 HCV翻訳領域全長発現べクタ一 pE2、 PE2bの構築と並行して、 NS3から NS5Bま での HCV翻訳領域の発現べクタ一 pEl、 pElbの構築を行った。 pElbは pE2bと同様に スィツチング発現を用いない発現系での使用を想定して構築し、 pElは pE2と同様 にスィツチング発現を用いた発現系作製のために構築した。 pElbの構築の手順を 以下に示す。 まず、 pE2を錡型として PCRを行った。 PCRプライマーの配列を以下 に示す。
NS3 Fwl : 5' - AAA CTC GAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAC CAT GGC TCC CAT C AC GGC CTA TTC - 3， (配列番号 1 1 )
NS3 Revl : 5' -CCA TTG ACG GAG GTC GCC AG- 3， (配列番号 1 2 )
PCRは、 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造） を用い、 上記と同様な反応液を調 製して、 変性 98°C 10秒間、 アニーリング 62°C30秒間、 伸長 72°C30秒間の条件で 15 サイクル行った。 増幅された配列を配列番号 3に示す。 この PCR産物の一部を 1. 5 %ァガロース電気泳動に供し、 目的のサイズの断片が特異的に増幅していること を確認した上で PCR purifi cation ki t (QIAGEN) により以下の様に PCR産物を精 製した。 まず、 PCR反応終了液の 5倍量の PB Bufferを添加し、 よく混合した後に Q IAqui ck spin columnに移し遠心を行った。 f low— through fractionを除去し、 洗 浄のため 750 ^ ]^の PE Bufferを QIAquick spin columnに添加し遠心を行い、 flow- through fractionを除去し、 再度遠心を行い完全に PE Bufferを除去した。 QIAqu i ck spin co l丽 nを 1. 5mLチューブに移し、 滅菌水を加えて遠心し、 DNAを溶出さ せた （以下、 DNA断片の精製操作は全てこの方法により行った。）。 次にこれを Psh AIと Xho lにより二重消化した。 これを 2. 0%ァガロース電気泳動に供し、 0. 2kbp の DNA断片をゲルから抽出した。 また、 pE2bを制限酵素反応溶液中で PshAI、 Xhol によリニ重消化し、 ァガロース電気泳動に供し、 7. lkbpと 3. 8kbpの DNA断片をゲ ルから抽出した。 このうち 7072bpの DNA断片と上記の二重消化を行った PCR産物の ライゲ一ション反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し LB+Ampプレートに播種し 3 7°Cで終夜培養じた。 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入つたチュ —ブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレーシ ョン法によりプラスミド DNAを調製した。 制限酵素処理により bpの DNA断片が組 み込まれていることを確認した後に、 このプラスミ ド DNAを PshAIにより消化を行 い PCR purification kitにより精製後、 アルカリフォスファターゼ処理を行った。 これを再度 PCR purification kitにより精製し、 上記 3780bpの DNA断片とのライ ゲ一シヨン反応を行い、 大腸菌 DH5aに形質転換し LB+Ampプレートに播種し 37°C で終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチュー ブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレーショ ン法によりプラスミド DNAを調製した。 これを pElbと命名した。
pElの構築
pElは pE2同様、 Cre-loxPシステムにより発現制御されるべクタ一であり、 この ベクタ一によリスイツチング発現を用いた発現系を作製することができる。 構築 は、 pElbを基に以下のように行った。 まず、 pElbを制限酵素溶液中で Xholで消化 し、 DNAの精製後、 これをアルカリフォスファタ一ゼ処理し、 再度 DNAを精製した。 また、 pCALN/HCV RBZを制限酵素溶液中で Xholで消化しァガロース電気泳動を行 い、 1.2kbpの DNA断片を抽出した。 これらの DNA断片のライゲ一シヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレー トに出現したコロニ一を LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう 培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法にょリプラスミ ド DN Aを調製した。 制限酵素処理によリ DNA断片が正方向で揷入されているクローンを 選択し、 これを pElと命名した。
(2) レポーター遺伝子発現べクタ一の構築
1 ) pRL2bの構築 （pIFGO：図 7、 pRLl：図 8、 pRLlb：図 9、 pRL2b：図 1 0 ) pIFGOの構築
まず、 ルシフェラーゼ遺伝子の上流に T7プロモーター及び HCV IRESを繋げたベ クタ一 pIFGOを以下の様に構築した。 まず、 pCALN/HCV RBZを錄型として PCRを行 つた。 以下に使用した PCRプライマーの塩基配列を示す。
IFG0:5，- AAC TGC AGA AGC TTT AAT ACG ACT CAC TAT AGC GAG CCC CCG ATT GGG G-3' (配列番号 1 3 )
IFRR:5' -ATG GCG CCG GGC CTT TCT TTA TGT TTT TGG CGT CTT CCA TGA TGC ACG GTC TAC GAG - 3， (配列番号 1 4 )
PCR反応液は、 チュ一ブに10 811«61"を10/½ 25mM dNTP mixtureを 8 L、 10 のプライマーを 2AtLずつ、 100 ng/z L pCALN/HCV RBZを 1 5 units/ tL A mpliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) を 1.0 / L加え滅菌水で lOO^Lに調製し た。 PCRはまず 96°Cで 5分間加熱した後、 変性 96°C30秒間、 アニーリング 60°C15秒 間、 伸長 72°C40秒間の条件で 25サイクル行った。 増幅された配列を配列番号 4に 示す。 PCR産物を電気泳動に供し、 特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出 した。 このうち を T/Aクロ一ニング、 すなわち T-ベクターへのライゲ一ショ ン反応に用いた。 T/Aクロ一ニングは以下のように行った。 上記反応液 I Lに、 pGEM-T Easy Vector (Promega) 1//L、 2 Xノ ッファー 5/ L、 T4 DNAリガ一ゼ 1 L、 滅菌水 2 Lを加え、 総量 10 Lとし、 室温で 1時間インキュベートした。 こ れを大腸菌 DH5aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養し、 プ レートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振 とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミ ド DNAを調製した。 インサート DNAが揷入されていることを適当な制限酵素処理に よりチェックした後にインサート部分の塩基配列を解析し、 正しい配列であるこ とを確認したプラスミ ドを以下に用いた。 このプラスミド DNAを Narlと Hindlllに よリニ重消化した。 また、 pGL3 Basic vector (Promega) について、 同様に Narl と Hindlllよリニ重消化した。 反応終了液をァガロース電気泳動し、 PCR産物につ いては 0.4kbpの DNA断片を、 pGL3 Basic vectorについては 4.8kbpの DNA断片をゲ ルょリ抽出した。 次にこれら 2種類の DNA断片のライゲ一シヨン反応を行い、 これ を大腸菌 DH5 α株に形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレ一トに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜 振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラス ミド DNAを調製した。 制限酵素処理により DNA断片のベクターへの揷入の有無を調 ベ、 揷入されていることを確認し、 これを pIFGOと命名した。
pRLlの構築
pRLlの構築は以下のように行った。 上記 ^00を8&111111-1^11(1111でニ重消化しァ ガロース電気泳動に供し、 2.3kbpの DNA断片をゲルから抽出した。 また、 pcDNA 3. 1/Hygro (-) (Invitrogen) を BamHI- Hindlllで二重消化しァガロース電気泳 動に供し、 kbpの DNA断片をゲルから抽出した。 次にこれらの DNA断片のライゲ ーション反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し LB+Ampプレ一トに播種し 37°Cで 終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ 中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン 法によりプラスミ ド DNAを調製した。 制限酵素処理により DNA断片が挿入されてい ることを確認した後に、 このプラスミ ドを Hindl l lで切断し、 精製後、 Klenow Fragment (宝酒造） による末端平滑化反応を以下の様に行った。 適当量の DNA溶 液に 10 Xバッファ一 2. 5 L、 2. 0raM dNTP 2. 5 L、 Kl enow Fragment I . O Lを添 加し、 滅菌水を加えて 25 Lとした。 これを室温で 30分間インキュベートした後 に、 DNA断片を精製した。 また、 インサートとして上記 p5' -3' RBZを Kpnlと Hindl l Iによリニ重消化し、 ァガロース電気泳動に供し、 0. 6kbpの DNA断片をゲルより.抽 出した。 次にこの DNA断片の末端平滑化反応を DNA blunting ki t (宝酒造） によ リ以下の様に行った。 DNA溶液 とキット添付の 10 Xバッファ一 を混合し、 70°Cで 5分間、 37°Cで 1分間インキュベートした後に、 T4 DNAポリメラ一ゼ 1 を 加え 37°Cで 5分間インキュベートした後に、 DNA断片を精製した。 次に、 この DNA 断片についてアルカリフォスファタ一ゼ処理を行い、 再び DNA断片を精製した。 次にこれらの DNA断片のラィゲ一ション反応を行い、 大腸菌 DH5 に形質転換し LB +Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB+A mp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集 菌し、 ミニプレパレーシヨン法によりプラスミ ド DNAを調製した。 適当な制限酵 素処理によリ DNA断片が揷入されていることを確認した後に、 ライゲ一シヨンし た連結部分の塩基配列を解析した結果、 予想通りの配列であることが確認出来た ので、 この構築したプラスミドを pRLlと命名した。
pRLlbの構築
上記 pRLlは、 レポ一ター発現ュニットの下流に SV40オリジンが全長で存在する ため、 その部分の SV40後期プロモーターよリ上流方向に転写が起こる可能性が予 想され、 それが本レポータ一遺伝子複製系のアツセィにおいてバックグラウンド となることが懸念された。 そこでこの SV40オリジンを除いた改良型ベクター pRLl bを構築した。 構築は以下のように行った。 まず、 PRL1を PshAIと Xbalで二重消化 し、 4.4kbpの DNA断片を抽出した。 また、 pcDNA3. l /-Hygro (-) を PvuI Iと Xbalで 二重消化し、 0. 4kbpの DNA断片を抽出した。 これらの抽出した DNA断片のライゲ一 シヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 に形質転換し LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終 夜培養した。 プレートに出現したコロニ一を LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中 で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法 によりプラスミ ド DNAを調製した。 適当な制限酵素処理により DNA断片が揷入され ていることを確認した後に、 このプラスミドを Xbalで消化し、 精製後、 アルカリ フォスファタ一ゼ処理を行った。 これを再び精製した。 また、 インサート DNAと して、 pRL lを Xbalで消化し、 ァガロース電気泳動に供し、 2. 6kbpの DNA断片をゲ ルょリ抽出した。 この DNA断片と Xbal消化したプラスミド DNAのライゲ一シヨン反 応を行い、 大腸菌 DH5 に形質転換し LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養し た。 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで 終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレーシヨン法によリブ ラスミド DNAを調製した。 適当な制限酵素処理にょリ DNA断片の揷入方向をチエツ クした。 狙い通りの方向に揷入されているプラスミ ドを選択し、 pRL lbと命名し た。 この pRL lbは SV40オリジンを除くと同時に、 逆向きルシフェラ一ゼ遺伝子下 流の SV40 l ate po lyAシグナルが除去されている。
pRL2bの構築
T7 RNAポリメラ一ゼをコードするワクシニアウィルス （T7VV) を用いた過剰発 現系で検討を行うために、 pRLlb上の逆向き 5' UTRの配列の直前にある T7プロモ一 タ一を除去したベクタ一 pRL2bを構築した。
pRLlbは CMVプロモーター下流に逆方向に揷入されている <HCV 5，UTR-ルシフエ ラ一ゼ>に対し T7プロモータ一が両側に配置されている。 その為、 T7 RNAポリメ ラ一ゼによリルシフェラーゼ遺伝子のアンチセンス鎖 RNA (以下、 「（+)鎖 RNAJ と いう） を過剰に合成させようとする際に、 同時にルシフェラーゼ遺伝子のセンス 鎖 RNA (以下、 「（-）鎖 RNA」 という） も合成され、 その RNAを基にルシフェラ一ゼ が翻訳されてしまうので、 NS5Bによる（-)鎖 RNA合成について評価するのに不適当 である。 そこで、 CMVプロモ一ターの直ぐ下流にある T7プロモータ一は残し、 逆 向きく HCV 5' UTR-ルシフェラーゼ>下流の T7プロモータ一を除去する為に再構築 して出来たベクタ一が pRL2bである。 pRL2bの構築は以下の様に行った。 まず、 T7 を除去するために、 pIFGOを錶型として PCRを行った。 以下に PCRに使用した Forwa rdプライマーの塩基配列を示す。 Reverseプライマ一は上記 IFRRを用いた。
DLIR1:5，-GCT CTA GAC AGG GCC AGC CCC CGA TTG-3' (配列番号 1 5)
PCR反応液は、 チューブに lOXBufferを 10 L、 25mM dNTP mixtureを 8 L、 10 のプライマーを 2y Lずつ、 100 ng/^L pIFGOを 1 L、 5 units/ L Am liTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer) を 1.0 L加え滅菌水で 100 Lに調製した。 PCR はまず 96°Cで 5分間加熱した後、 変性 96°C30秒間、 アニーリング 60°C 15秒間、 伸 長 72°C40秒間の条件で 25サイクル行った。 増幅された配列を配列番号 5に示す。
PCR産物を電気泳動に供し、 特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出した。 このうち l^cLを T/Aクロ一ニング、 すなわち T-ベクターへのライゲーシヨン反応 に用いた。 T/Aクロ一ニングは上記と同様に行った。 ライゲ一シヨン反応終了液 を大腸菌 DH5aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養し、 プレ —トに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入つたチューブ中で 37°Cで終夜振と う培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミド DNAを調製した。 ィンサ一ト DNAが挿入されていることを適当な制限酵素処理によ リチェックした後にインサート部分の塩基配列を解析し、 正しい配列であること を確認したプラスミドを以下に用いた。 このプラスミドを Xbal-Stulによリニ重 消化し、 0.3kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 また、 pRLlbを Xbalにより以下の 様に部分切断した。 pRLlb 2 gを 3un の Xbalにより 37°Cで 20秒処理し、 直ぐに 氷水につけて反応を止めァガロース電気泳動に供し、 ベクタ一上に 2ケ所ある Xba Iサイトのうち 1ケ所のみを切断した 7.4kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 次に これを Stulにより消化した。 そして、 6.5kbpの DNA断片をゲルよリ抽出した。 こ れらの DNA断片のライゲ一ション反応を行い、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終 夜培養した。 プレートに出現したコロニ一を LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中 で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法 によりプラスミド DNAを調製した。 適当な制限酵素処理により DNA断片の揷入方向 をチェックした。 狙い通りの方向に揷入されているプラスミドを選択し pcLIと命 名し、 以下の操作に用いた。 pcLIを Kpnlと Hindlllで二重消化してァガロース電 気泳動に供し、 6.7kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 また、 インサートとして、 ρ5' - 3' RBZを Kpnlと Hindl l lで二重消化してァガロース電気泳動に供し、 0. 6kbpの DNA断片をゲルよリ抽出した。 次にこれらの DNA断片のライゲーシヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレー トに出現したコロニーを LB+Amp培地に植菌し、 37°Cで終夜培養後、 プラスミドを ミニプレパレ一シヨン法により調製した。 Kpnlと Hind l l lの二重消化により予想 通りにインサート DNAが組み込まれていたプラスミドを選択し、 これを pRL2bと命 名した。
pRL3bの構築 （図 1 1 )
pRL2bにおいて、 ルシフェラ一ゼ蛋白質翻訳用の IRESとして HCVのものを用いて いるが、 翻訳効率を上げてルシフェラ一ゼ活性の検出感度を上げることを目的に、 この HCV IRESを EMCV IRESに変換したベクタ一 pRL3bを以下の様に構築した。 まず、 pRL2bを Xholと NspVによリニ重消化し電気泳動に供し、 6. 8kbpの DNA断片をゲルよ リ抽出した。 次に pGL3 Bas i c vector (Promega) を Nco lと NspVで二重消化し電気 泳動に供し、 0. 2kbpの DNA断片をゲルよリ抽出した。 次に pEIRES2- EGFP (CL0NTEC H) を Xholと Ncolによリニ重消化し電気泳動に供し、 0. 6bpの DNA断片をゲルより 抽出した。 これらの抽出した 3つの DNA断片のライゲ一シヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 に形質転換し LB+Ampに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコ ロニ一を LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液 を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミド DNAを調製した。 X ho I、 Ncol , Xbalの三重消化によりインサート DNAが組み込まれたかどうかをチェ ックし、 予想通りにィンサ一ト DNAが組み込まれていたものを pRL3bと命名した。 pRL4bの構築 （図 1 2及び図 1 3 )
pRL3bより合成される （+) 鎖 RNA分子の 5'末端に HCV 5， UTRを付加したデザイン にすることにより、 本来の HCVゲノムにより近い構造となり、 結果として複製効 率が向上しレポ一ター活性が上昇することが期待された。 これは、 HCV IRESの機 能において 5' UTRのみならず 3' UTRも協調的に関わっていること （J. Vi ro l . 72 ; 87 89-8796 ( 1998) ) から、 RNA合成においても 5' UTRと 3' UTRが協調的に作用してい る可能性が考えられたためである。 そこで、 （+) 鎖 RNA分子の 5'末端に HCV 5' UTR 及びコア蛋白質の N末 16アミノ酸分の塩基配列を付加したデザインのレポーター 発現ベクター pRL4bを構築した。 デザインはサイエンス誌の報告 （Science 285; 1 10-113 (1999)) を参考にし、 N末 16アミノ酸分の塩基配列にネオマイシン耐性遺 伝子を繋げることにした。 これは、 後々に以下の様な検討を行うことを想定した ためである。 例えばこのサイエンス誌の報告と同様な RNAトランスフエクシヨン を亍う場合、 すなわち pRL4bを錡型として T7RNAポリメラーゼを用いて in vitroで 合成した RNAを、 上記 pElもしくは pE2の安定導入株にトランスフエクトした場合 に、 HCV由来蛋白質発現誘導下において、 ネオマイシン存在下での培養を継続す ることにより、 トランスフエクトした RNA分子が HCV由来蛋白質によリ複製され、 結果としてネオマイシン耐性を獲得したクローンを選別出来る可能性があるかも しれないと考えたことによる。
pRL4bの構築の手順を以下に示す。 まず、 5' UTR及び N末 16アミノ酸分の塩基配 列からネオマイシン耐性遺伝子末端までの部分を連結した DNA断片を得るため、 p CALN/HCV RBZを錡型として PCRを行った。 以下に使用した PCRプライマ一の塩基配 列を示す。
neo Fw:5' -GTA GAC CGT GCA TCA TGA GCA CAA ATC CTA AAC CCC AAA GAA AAA CC A AAC GTA ACA CCA ACA TTG AAC AAG ATG GAT TGC ACG C- 3， （配列番号 1 6 ) neo v:5' -TCT AGA TTA TCA GAA GAA CTG GTC AAG AAG GCG -3， （配列番号 1 Ί ) PCR反応液は、 Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造） を用いて上記と同様に調製 した。 PGR反応は、 まず 94°Cで 5分間加熱した後、 変性 98°C10秒間、 アニーリング 60°C30秒間、 伸長 72°C1分 20秒間の条件で 20サイクル行った。 増幅された配列を 配列番号 6に示す。 次にこの PCR産物を 1.0%ァガロース電気泳動に供し、 目的サ ィズの DNA断片をゲルから抽出した。 次に、 T/Aクローニングを行うため、 この断 片の 3'末端に Aの付加反応を以下の様に行った。 適当量の DNA溶液に recombinant Taq DNAポリメラ一ゼ （宝酒造） l zL、 10xバッファー 1 L、 2.5raM dATP 0.8 βΐ, 25mM MgC12 l^ Lを加え、 滅菌水を加えることにより総量 10 xLとした。 こ れを 70°Cで 30分間インキュベートした。 この反応液のうち I Lを T/Aクローニン グに用いた。 T/Aクロ一ニングは上記と同様に行った。 ライゲーシヨン反応終了 液を大腸菌 DH5aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養し、 プ レートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入つたチューブ中で 37°Cで終夜振 とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレーシヨン法によりプラスミ ド DNAを調製した。 インサート DNAが揷入されていることを適当な制限酵素処理に よリチェックした後にィンサ一ト部分の塩基配列を解析し、 正しい配列であるこ とを確認したプラスミドを以下に用いた。 まず、 このプラスミ ドを Acclと Xbalで 二重消化し、 得られた 0. 9kbpの DNA断片をゲルより抽出した。 また、 ρ5' - 3' RBZを Xho lと Accl、 Xholと Xbalによりそれぞれ別々に二重消化し、 前者は 0. 4kbpの DNA 断片を、 後者は 3. Ikbpの DNA断片をゲルより抽出した。 そして、 これらの抽出し た 3種類の DNA断片のライゲーシヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+ Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB+Am p培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌 し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミ ド DNAを調製した。 適当な制限酵素 処理により、 インサート DNAの組み込まれているプラスミド DNAを選択した。 次に、 このプラスミド DNAを Xbalにより切断し、 精製後、 Klenow Frgmentによる末端平 滑化反応 （方法は上記と同じ） を行い、 その後にアルカリフォスファターゼ処理 を行った。 一方、 インサートとして、 上記 pRL3bを Xbalにより切断し、 ァガ口一 ス電気泳動に供し、 3. 0kbpの DNA断片を抽出し、 これについて Kl enow Frgmentに よる末端平滑化反応 （方法は上記と同じ） を行った。 次にこれらの DNA断片のラ ィゲ一シヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 3 7°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入つたチュ —ブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シ ヨン法にょリプラスミ ド DNAを調製した。 適当な制限酵素処理により、 揷入され た DNA断片の揷入方向をチエツクし、 狙い通りに揷入されているクロ一ンを以下 に用いた。 このクローンより得たプラスミドを Xholと Xbalによリニ重消化し、 ァ ガロース電気泳動を行い、 4. Ikbpの DNA断片をゲルより抽出した。 一方、 pBR322 を Ndelと Hindl l lで二重消化し、 電気泳動に供し、 2. Ikbpの DNA断片をゲルよリ抽 出し、 Klenow Frgmentによる末端平滑化反応 （方法は上記と同じ） 後、 ライゲ一 シヨン反応溶液中でセルフライゲーシヨンさせ、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+ Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコロニーを LB+Am p培地 3mLの入つたチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌 し、 ミニプレパレーシヨン法によりプラスミド DNAを調製した。 このべクタ一を E coRIと Hindl l lで 2重消化し、 ァガロース電気泳動に供してゲルよリ抽出した 2. Ik bpの DNA断片をベクターとして用いた。 また、 インサートとして、 pCALN/HCV RBZ を Xbalと Hindl l lで二重消化してァガロース電気泳動に供しゲルより抽出した 0. 6 kbpの DNA断片と、 pCALN/HCV RBZを EcoRIと Xho lで二重消化してァガロース電気泳 動に供しゲルより抽出した 1. 8kbpの DNA断片を用いた。 以上の 4. 1kbp、 0. 6kbp、 1. 8kbpのィンサ一トと上記 2. lkbpのべクタ一のライゲーシヨン反応を行い、 大腸 菌 DH5 aに形質転換し、 LB+Ampプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレート に出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入つたチューブ中で 37°Cで終夜振とう培 養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミ ド DNA を調製した。 適当な制限酵素処理により、 狙い通りに 3種類のインサートが揷入 されていることを確認したクロ一ンを pRL4bと命名した。
( 3 ) シス作用系発現べクタ一の構築
1) pEL2の構築 （図 1 4 )
シス作用系発現べクタ一 PEL2の構築は以下のように行った。 まず、 pCALN/HCV RBZを Xholで消化し、 電気泳動を行い、 16. 5kbpの DNA断片を抽出し、 ライゲ一シ ヨン反応溶液中でセルフライゲ一シヨンさせ、 大腸菌 DH5 aに形質転換し、 LB+Am Pプレートに播種し 37°Cで終夜培養した。 プレートに出現したコロニ一を LB+Amp 培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心して集菌 し、 ミニプレパレ一シヨン法にょリプラスミ ド DNAを調製した。 サイズをチエツ クし、 正しいことを確認したものを pCAG/HCV RBZと命名した。 次にこの pCAG/HCV RBZを Cl alと Xbalで二重消化し電気泳動を行い、 4. 9kbpの DNA断片を抽出し、 これ をベクター DNAとした。 インサート DNAとしては、 pE2を Cl alと Xbalで二重消化し 電気泳動を行い、 8. 7kbpの DNA断片を抽出しこれを用いた。 これらの DNA断片のラ ィゲーシヨン反応を行い、 大腸菌に形質転換した。 プレートに出現したコロニー を LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜振とう培養し、 培養液を遠心 して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラスミ ド DNAを調製した。 次にこ れを Xbalで消化し、 PCR puri f i cat i on ki tによる精製後、 BAP処理を行った。 一 方、 インサートとして、 上記 pRL3bを Xbal処理し、 電気泳動を行い、 3. 0kbpの DNA 断片を抽出したものを用いた。 これらの DNA断片のライゲ一シヨン反応を行い、 大腸菌 DH5 aに形質転換し 37°Cで終夜培養した。 得られたコロニ一のうちのいく つかを LB+Amp培地に植菌し、 37°Cで終夜振とう培養後、 プラスミドをミニプレパ レ一シヨン法により調製した。 適当な制限酵素処理によるチェックで、 インサー トの揷入方向をチェックし、 期待した方向に組み込まれていることを確認したプ ラスミドを Clalで消化し、 PGR purification kitによる精製後、 BAP処理を行つ た。 一方、 インサートとして、 上記 pCAG/HCV RBZを Clalで消化し、 2.6kbpの DNA 断片を抽出した。 これらのライゲ一シヨン反応を行い、 大腸菌に形質転換した。 プレートに出現したコロニーを LB+Amp培地 3mLの入ったチューブ中で 37°Cで終夜 振とう培養し、 培養液を遠心して集菌し、 ミニプレパレ一シヨン法によりプラス ミ ド DNAを調製した。 適当な制限酵素処理によるチェックで、 インサートの揷入 方向をチェックし、 期待した方向に組み込まれていることを確認したプラスミ ド を PEL2と命名した。
〔実施例 2〕
( 1) 細胞へのトランスフエクシヨン
各べクタ一の細胞へのトランスフエクシヨンは、 リン酸カルシウム法で行った。 各 DNA溶液と 0.2M塩化力ルシゥム溶液を混和し、 等量の 2 X HBS溶液を加えて室温 で 10分間放置した後、 培養液を加え、 前日に 1.5〜2.0X105個/ mlの濃度でまいた IMY細胞に添加した。 それぞれのベクタ一のィンプット量は 4 g/ゥエルとした。 37°C、 5% C02条件下で 4時間培養後、 数回培養液で洗浄し、 T7RNA polymeraseを 発現するワクシニアウィルス （T7VV) で転写誘導しない場合は、 そのまま新しい 培養液を加えて 2日間培養した。 T7VVで転写誘導する場合は、 ウィルスを M0I 10 で加え、 1時間吸着後新しい培養液を添加して 10時間培養した。 培養後、 PBS (- ) で洗浄した後にセルスクレ一パ一を用いて細胞をはがし 1.5mLチューブに入れ、 ルシフェラ一ゼアツセィに供するまでの間- 80 °Cで保存した。
(2) ルシフェラ一ゼアツセィ
ノレシフェラ一セ 7ッセィ（ま、 Luciferase Assay systems (Promega) を用 ヽて 下の様に行った。 5XCell Culture Lysis Reagentを滅菌水により 5倍希釈し、 上 記の細胞を入れた 1.5mLチュ一ブに 250 β L分注して細胞を懸濁した。 細胞の debr i sを除くため遠心を行い、 上清を lysateとしてルシフェラーゼアツセィに供した。 アツセィは lysate 20 Lを 96-穴プレート （OPAQUE PLATE (C0STAR) ) に分注し、 基質溶液 100 Lを加え、 MICROLUMAT LB96P (Bertho ld) を用いて各ゥエルにつき 10秒ずつ測定した。 測定結果を表 1及び表 2に示す。
Figure imgf000033_0001
*)対照 1はベクターを導入せず、 T7VVで転写誘導した場合、 対照 2はベクターを 導入せず、 T7VVで転写誘導しない場合を示す。
**)レポーター遺伝子発現べクタ一のみを導入した場合のルシフェラーゼ活性を 1. 0とした場合の相対値を示す。
表 2
Figure imgf000033_0002
*)ベクターを導入しない場合を示す。
**)レポーター遺伝子発現べクタ一のみを導入した場合のルシフェラ一ゼ活性を 1. 0とした場合の相対値を示す。
表 1は、 トランス作用系ベクターである pRL2b又は pRL3bと pElb又は pE2bとの重 トランスフエクシヨンの結果を示したものであり、 レポーター遺伝子発現べクタ —単独でトランスフエクシヨンした時の結果をバックグラウンドレベルとし、 酵 素発現ベクターの共存下でのルシフェラーゼ活性の変化を調べている。 表 2はト ランス作用系ベクターである pRL3b又は pRL4bと pElb又は pE2bbとの重トランスフ ェクシヨンの結果を示したものである。 また、 シス作用系ベクター pEL2について も同時に調べた。
表 1及び表 2より以下のことがわかる。
a) pRL2b、 pRL3b、 pRL4b共に酵秦発現ベクターを共発現させることでレポ一タ —活性が上昇していることから、 （-）鎮 RNAは NS5Bにより合成されたものであると 考えられる。 レポーター遺伝子発現ベクターのみを細胞に導入した場合にも活性 が認められたが、 これはルシフェラーゼ遺伝子下流のプロモータ一様の配列から 合成された（-）鎖 RNAに由来するリークであると思われる。
b) pRL2b、 pRL3bより合成された（-）鎖 RNA量が同じであると仮定すると、 ルシフ エラ一ゼ活性の差は HCV IRESと EMCV IRESの翻訳活性の差を反映したものである と思われる。
c) シス作用系ベクター pEL2について、 ルシフェラーゼ活性の上昇が認められ、 N S5Bによる（-）鎖 RN A合成が起こっていることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明は、 新規な RNAウィルスの複製機構解析用ベクターを提供する。 このべ クタ一により、 RNAウイルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼの活性を、 ウィル ス本来の生活環に基づいたウィルス蛋白質や宿主因子の相互作用を考慮して、 レ ポーター遺伝子の発現量によリ評価することが可能になる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとリ入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むこと を特徴とする RNAウイルスの複製機構解析用ベクタ一。
2 . アンチセンス方向で発現するレポ一タ一遺伝子を含むことを特徴とする RN Aウィルスの複製機構解析用ベクター。
3 . RNAウイルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコ一ドする DNA、 及びァン チセンス方向で発現するレポーター遺伝子を含むことを特徴とする RNAウィルス の複製機構解析用べクタ一。
4 . 請求項 1記載の RNAウィルスの複製機構解析用ベクター及び請求項 2記載 の RNAウイルスの複製機構解析用ベクタ一を含むことを特徴とする RNAウィルスの 複製機構解析用キット。
5 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むべク ターと、 前記 RNAポリメラ一ゼのエントリーサイトに対応する DNA及びその上流に 配置され、 アンチセンス方向で発現するレポータ一遺伝子を含むベクタ一とを作 製し、 これらのベクターを宿主となる細胞に導入し、 その細胞におけるレポ一タ 一遺伝子の発現産物の量を測定することによリ、 前記 RNAポリメラ一ゼの活性を 評価することを特徴とする RNAポリメラーゼ活性の評価方法。
6 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNA、 前記 RNA ポリメラ一ゼのェントリ一サイ トに対応する DNA、 及びそのェントリ一サイ トに 対応する DNAの上流に配置され、 アンチセンス方向で発現するレポーター遺伝子 の三者を含むベクターを作製し、 このベクターを宿主となる細胞に導入し、 その 細胞におけるレポーター遺伝子の発現産物の量を測定することにより、 前記 RNA ポリメラ一ゼの活性を評価することを特徴とする RNAポリメラ一ゼ活性の評価方 法。
7 . RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコードする DNAを含むべク ターと、 前記 RNAポリメラ一ゼのェントリ一サイトに対応する DNA及びその上流に 配置され、 アンチセンス方向で発現するレポーター遺伝子を含むベクタ一とを作 製し、 これらのベクタ一を宿主となる細胞に導入した後、 この細胞に被検物質を 接種し、 その細胞におけるレポ一ター遺伝子の発現産物の量を測定し、 被検物質 の中からレポ一ター遺伝子の発現産物の量を増減させた物質を選択することを特 徴とするウイルス疾患治療剤のスクリーニング方法。
8 . RNAウイルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼをコ一ドする DNA、 前記 RNA ポリメラーゼのェントリ一サイトに対応する DNA、 及びそのェントリ一サイトに 対応する DNAの上流に配置され、 アンチセンス方向で発現するレポ一タ一遺伝子 の三者を含むベクターを作製し、 このベクターを宿主となる細胞に導入した後、 この細胞に被検物質を接種し、 その細胞におけるレポータ一遺伝子の発現産物の 量を測定し、 被検物質の中からレポーター遺伝子の発現産物の量を増減させた物 質を選択することを特徴とするウイルス疾患治療剤のスクリ一ニング方法。
9 . 請求項 7または 8に記載のウイルス疾患治療剤のスクリーニング方法によ リ得られた物質。
1 0 . 請求項 1記載のベクタ一及び請求項 2記載のベクターを含む細胞。
1 1 . 請求項 3記載のベクターを含む細胞。
1 2 . 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法
( 1 ) 宿主中で RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを発現させ、
( 2 ) レポ一ター遺伝子を RNAポリメラ一ゼ非存在下においては発現しないよう に配置した RNAと上記 RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを接触させ、 (3) レポ一ター遺伝子の発現産物の発現量を測定する。
1 3. 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法
( 1 ) 宿主中で RNAウィルス由来の RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを発現させ、
(2) レポ一タ一遺伝子をアンチセンス方向でコードした RN Aを発現させ、
(3) 上記 RNAポリメラーゼによりレポーター遺伝子をセンス方向でコードした R NAを合成し、
(4) レポーター遺伝子の発現産物の量を測定する。
1 . 以下の工程を含む RNAウィルス複製能評価方法
( 1 ) ベクタ一中にアンチセンス方向に組み込まれたレポ一タ一遺伝子と、 該べ クタ一と同一または異なるベクター中にセンス方向に組み込まれた RNA依存性 RNA ポリメラーゼ遺伝子をコードした RNAを宿主中で発現させ、
( 2 ) 上記 RNAから RNA依存性 RNAポリメラ一ゼを発現させ、
( 3 ) 上記 RNA依存性 RNAポリメラ一ゼにょリレポ一タ一遺伝子をセンス方向でコ ―ドした RNAを合成し、
(4) レポ一ター遺伝子の発現産物の量を測定する。
1 5. 請求項 1 2〜 1 4のいずれか 1項に記載の評価方法に、 被検物質を接触 させる工程を追加することからなる、 ウィルス複製阻害物質のスクリーニング方 法。
1 6. RNAウィルスが HCVである請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のベクタ一。
1 7. RNAウィルスが HCVである請求項 5、 6、 1 2〜 1 4のいずれか 1項に記 載の評価方法。
1 8. RNAウィルスが HCVである請求項 7、 8及び 1 5のいずれか 1項に記載の スクリ一ニング方法。
9. RNAウィルスが HCVである請求項 1 0または 1 1に記載の細胞。
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