WO2001088115A1 - Modele caenorhabditis elegans transgenique presentant un dysfonctionnement neuronal - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a transgenic nematode having a phenotype of neuronal dysfunction in the apparent absence of neuronal death.
- the invention also relates to the transgene at the origin of said phenotype as well as methods of screening therapeutic targets for the treatment of polyglutamine-expanding diseases.
- the first characteristic of abnormally sized polyglutamines (or polyglutamines) is their pathological effect when they are present in certain proteins, which today determines a class of eight autosomal dominant neurodegenerative diseases.
- the number of units of glutamine (or gin) and the protein context are two elements which intervene in the pathological effect of polygln sequences.
- Huntington's disease (HD, The Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993), spinocerebellar ataxia type 1 (Orr et al, 1993), SCA2 (Imbert et al , 1996), SCA3 or Machado- Joseph's disease (Kawagushi et al, 1994), SCA6 (Ikeuchi et al, 1997), SCA7 (David et al, 1997), Atrophy Dentatro-Rubro Pallidoluysienne DRPLA (Ko ⁇ de et al, 1994) and Spino-Bulbar Muscle Atrophy SBMA (La Spada et al, 1994).
- HD Huntington's disease
- SCA2 Iron et al, 1993
- SCA3 or Machado- Joseph's disease Kawagushi et al, 1994
- SCA6 (Ikeuchi et al, 1997)
- SCA7 (David et al, 1997)
- the SCA6 gene has the particularity of presenting a moderate pathological threshold compared to other diseases, probably due to the position of the polygln (transmembrane) in the calcium channel ⁇ l A.
- the functions of the disease proteins are only known for two of these diseases: ion channel for SCA6, and androgen receptor for SBMA. These neuropathies are rare and incurable.
- Such diseases strongly disrupt the social and family life of the patient because they often appear at the age of 30-40 years. They are very physically debilitating but also difficult to manage by loved ones because the patient has serious psychological and psychiatric disorders.
- the disease progresses over a period of 15 to 20 years. For example, the prevalence of HD in the French population is around 1 / 10,000.
- the HD protein is huntingtin (htt), its expression is ubiquitous, its localization is apparently cytoplasmic, and its molecular weight is 350 kDa.
- the htt is characterized by the presence in its N-terminal part (N-ter) of a polygln sequence followed by two poorly polymorphic polyproline regions.
- the "normal” htt contains a "normal” repetition of glutamine (typically: 15 to 20 gin, mainly: less than 39 gin).
- the mutated htt contains an abnormally high number of glutamine repeats (typically the pathological threshold is around 39 gin, polygln expansion can for example reach up to 180 gin in some cases) which is associated with the appearance of disease (Koshy and Zoghbi, 1997).
- the biochemical and cellular function of htt is still unknown. Immunohistochemistry, electron microscopy and cell fractionation techniques have made it possible to observe that htt is a cytosolic protein associated with vesicles and / or microtubules, which suggests a role in anchoring to the cytoskeleton or in the transport of vesicles (Sathasivam et al, 1999).
- mice - / - for hd the murine counterpart of the human gene IT15
- htt plays an important role during embryogenesis because the death of the embryo occurs at the end only a few days in these mice.
- a team working on embryonic mouse deleted HD cells proposed that htt could have an important role during hematopoiesis (Metzler et al, 2000).
- inclusions consist of fragments of disease proteins but also of ubiquitin.
- the role of inclusions, particularly those that are nuclear, as a cause in these diseases remains very uncertain.
- the polygln sequences also have self-aggregation properties which have been described by Perutz et al. in 1994. In this model, the polygln behave like "polar zippers", where the side chains of the gins form ⁇ sheets via hydrogen bonds, the stacking of the ⁇ sheets of several proteins leading to a phenomenon of 'aggregation. These aggregates seem to be irreversible.
- the size of the protein carrying the polygln also influences the formation of aggregates because the larger the protein and the more the polygln appears to be stabilized in a state where its ability to form aggregates is minimal.
- the expression of the mutated htt, whole or truncated, in a neuroblastoma line showed in the first case a diffuse and cytoplasmic expression and, in the second case, cytoplasmic and nuclear aggregates (Cooper et al, 1998) .
- the aggregates observed in HD consist of N-terminal fragments of htt, ubiquitin, and other proteins.
- proteins are likely to be sequestered in aggregates if they interact in one way or another with the N-terminal part of htt: for example, the SH3GL3 protein with SH3 domain interacts better with htt mutated by l 'intermediate polyproline domains and it is associated with aggregates (Sittler et al, 1998).
- Transglutaminases enzymes which participate in post-transcriptional modifications, could also intervene in the formation of aggregates.
- a protein network would form from polygln proteins entangled with each other by covalent bonds between glutamines and lysines.
- mice The mutated htt leads to cellular dysfunctions which lead to neuronal death whose profile resembles neither that of necrosis nor that corresponding to programmed cell death (Mangiarini et al, 1996). Disturbances in neuronal communication (reduced production of neurotransmitters or their receptors) are likely to be induced in neurons affected before cell death.
- the chronology of events observed in mouse models and invertebrate model organisms will allow a better understanding of the pathological process involved in HD.
- the best characterized mouse model is the transgenic line R6 / 2, which expresses exon 1 of the IT15 gene with 144 gin (Mangiarini et al, 1996). However, as noted above, these mice are sick with diabetes.
- the stages of the pathological process in the R6 / 2 model follow one another as follows: detection of neuronal NIIs at 4 weeks (Davies et al, 1997), appearance of the first symptoms between 9 and 11 weeks (ex: dyskinesia associated with onset loss of brain and body weight), then rapid death of the animal between 10 and 13 weeks (Mangiarini et al, 1996). More recently, two transgenic mouse models expressing the whole mutated htt have been described (Reddy et al, 1999; Hodgson et al, 1999). These models are probably more representative of HD than the R6 / 2 model insofar as the whole htt was used, and insofar as the mice are not sick with diabetes.
- the mutated polygln sizes are roughly the same in both models (approximately 45 gin and 80 gin).
- the neurological phenotypes appear around 28 weeks, the presence of NIIs does not correlate in the two models with the induced neurological phenotype. That of Reddy et al. allows to observe NIIs at 12 weeks, whereas that of Hodgson et al. does not demonstrate the presence of Nile in the affected neurons.
- Neural aggregates are in fact common to several neurodegenerative diseases including diseases other than those associated with polygln such as prion diseases or Alzheimer's disease.
- diseases other than those associated with polygln such as prion diseases or Alzheimer's disease.
- the only factors of variation are the nature of the polygln carrier protein and the location of the sites of neuronal loss.
- the study of pathological mechanisms using animal models suggests that aggregates are an initiator of the disease process because they appear before the onset of symptoms.
- the presence of aggregates seems to correlate with the severity of HD since the study of post-mortem sections shows that the number of NIIs is a function of the size of the polygln (Aronin et al, 1999).
- a loss of function due to the sequestration of proteins essential for neuronal survival is another hypothesis which would involve the aggregates in a more indirect and more strictly coincidental manner.
- the sequestration of a toxic form of the disease protein (protective mechanism) such as the N-terminal fragment of the mutated htt is also likely.
- the presence of polygln causes a conformational modification of the disease protein giving it new interaction properties, in particular with caspase-3 and releases an N-terminal fragment (Goldberg et al, 1996).
- NIIs in HD can be considered toxic, limiting, or even protective of cell death. It is very important to note that while the cause and effect relationship between Nile (a seemingly late form of aggregation) and neuronal death has been widely studied, it remains subject to several criticisms. There is limited data on causal relationships between cytoplasmic aggregates in the cell body (which are thought to be earlier) and those in axons (which are more toxic than smaller), neuronal death and, more interestingly, with dysfunction except apoptosis.
- mice have been carried out in mice. Indeed, several studies of neurodegenerative disease proteins in mice have made it possible to observe the induction of a neuronal phenotype by abnormally sized polyglutamines, for example expression in mice transgenics of exon 1 of the IT15 gene mutated with approximately 144 gins (Mangiarini et al, 1996). In all of these studies, it is observed that the severity of the phenotypes is a function of the size of the polyglutamine sequence.
- mice In order to test the intrinsic properties of the mutated polygln, a study in mice also consisted in introducing a mutated polygln in a foreign context, the protein hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT: enzyme involved in the metabolism of purine). A neurodegenerative phenotype was observed for 146 gins but not for 70 gins (Ordway et al, 1997). However, the mouse models do not make it possible to search, by rapid genetic screening and without a priori on the genes involved, genetic modifiers of the effects of polyglutamines.
- HPRT protein hypoxanthine phosphoribosyltransferase
- WHO simple model organisms
- these models are very easy to handle (superior to the mouse) because of their size and because of the duration of their reproductive cycle.
- nematodes or Drosophila flies.
- the Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster models have a good degree of genetic conservation of several important cellular mechanisms in humans. They have a rudimentary nervous system for C. elegans and more advanced for D. melanogaster, allowing to study neurodegenerative diseases.
- C. elegans has the following advantages: well characterized nervous system, good functional homology with humans in terms of neuronal physiology, numerous normal neurological phenotypes and mutants available for analysis. Compared to other simple model organisms such as Drosophila (Jackson et al, 1998), C. elegans also has the following advantages: completely sequenced genome, faster mutagenesis, transparent organism allowing visualization of all neurons and analysis protein expression in living animals, short reproductive cycle (a few days), knowledge of complete cell phylogeny, ease of use (culture without solid or liquid agar, resistance of larvae to freezing, and possibility of high-throughput screening, for example in 96-well microplates ).
- HSPA1L human counterpart of Hsp70
- ataxine-3 protein of the disease SCA3
- SCA3 protein of the disease SCA3
- co-expression of a protein with a whole and normal polyglutamine domain is sufficient to counteract the effects of the mutated truncated protein in Drosophila.
- the inventors therefore set out to highlight a phenotype of neuronal dysfunction in lines of C. genecans transgenic nematodes which is representative of the supposedly early stages of neurodegenerative diseases (neuronal dysfunction before neurodegeneration) and which has the advantage of having a strong penetrance.
- the present invention therefore relates to a transgenic nematode having a phenotype of neuronal dysfunction in the absence apparent neuronal death at least in the young adult stage, which corresponds to worms 3 to 4 days old.
- This phenotype has the advantage of having, in particular at this stage, a penetration of at least 50% or even at least 70%.
- penetrance is meant the frequency with which the gene manifests its effects.
- the transgenic nematode according to the invention comprises a construction allowing the expression of a protein having a polyglutamine domain under the control of a promoter specific for neurons.
- the above promoter is specific for touch receptor neurons.
- the inventors have in fact carried out mechanosensory analyzes on transgenic nematodes expressing polyglutamine expansions of different lengths. To do this, they used the promoter from the mec-3 (mec-3p) gene (Chalfie and Au, 1989) to direct the expression of the transgene in 10 of the 302 worm neurons, including the 6 receptor neurons. sensation (or touch): AVM, ALML, ALMR, PVM, PLML and PLMR.
- the inventors therefore set out to detect a posterior or anterior mechanosensory phenotype (MEC) in transgenic nematodes in which they induced neuronal dysfunction by causing some of these animals to express, at the level of target neurons, of a mutated polyglutamine domain protein.
- MEC mechanosensory phenotype
- This phenotype is expressed by the loss of sensitivity to touch due to an alteration of the neurons mentioned above.
- the inventors sought to detect the transgenic nematodes in which the mutated polyglutamine domain protein was expressed and this expression is detectable by observing the response of the worms or transgenic nematodes to the touch.
- the polyglutamine domain protein used by the inventors is huntingtin which, when mutated, contains, as indicated above, an abnormally high number of polyglutamine repeats which are conventionally around at least 39 glutamine residues.
- the polyglutamine domain comprises from 39 to 128 glutamine residues, preferably between 88 and 128 glutamine residues and more preferably 128 glutamine residues.
- the above-mentioned construction therefore notably includes the nucleic sequence coding for the first 29 amino acids of the mec-3 protein. However, it is possible that this construction works with less than 29 amino acids or even no amino acid of the mec-3 protein.
- the inventors show that the expression of a polyglutamine under the control of the mec-3 promoter at the level of the PLM neurons indicates an insensitivity to touch at the level of the tail of the animals with a penetrance of at least at least 50% or even at least 60% and even at least 70%.
- the tests were carried out on 5 independent stable transgenic lines.
- the promoter of the mec-3 gene codes for a transcription factor expressed, as indicated above, in 10 target neurons including the 2 PLM neurons which exclusively control the response to touch at the tail.
- This phenotype is apparently not accompanied by the death of neurons targets (based on observations by NOMARKSI microscopy and on the absence of nuclear labeling with acridine orange), or at the time of measurement of the transgenic phenotype in animals in the young adult stage (3 to 4 days after birth ), or later in the same older animals (7 to 8 days after birth).
- the inventors have produced a transgene comprising in particular a construct which itself comprises a nucleic sequence coding for the first 29 amino acids of the protein Mec-3, then coding for the first 17 amino acids of huntingtin, then coding for the domain polyglutamine comprising from 39 to 128, preferably from 88 to 128, more preferably 128 glutamine residues, then coding for the 17 amino acids of huntingtin according to the polyglutamine domain, the whole being preceded by the nucleic sequence of the promoter of the gene mec- 3.
- nucleic sequence of a promoter it is necessary to understand any nucleic sequence corresponding to the entirety of said promoter but also to any functional part of this promoter, that is to say capable of fulfilling a function similar to that of the promoter whole.
- the transgene according to the invention comprises the construction as defined above, the nucleic sequence of which codes, following the protein with a polyglutamine domain, for a protein allowing the visualization of the resulting fusion protein.
- the protein allowing the expression of said fusion protein to be visualized is the Green Fluorescent Protein (GFP).
- GFP Green Fluorescent Protein
- mec-3p mec-3p :: Httl-57 (84Q) :: GFP.
- Nematodes transformed with this transgene express, under the control of the promoter of the mec-3 gene, 57 amino acids of huntingtin (Htt) (i.e. the first 17 amino acids, 23 glutamine residues and the 17 amino acids according to the polyglutamine domain) with a polyglutamine expansion of 84 (84Q) fused to the green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein or GFP).
- Htt huntingtin
- GFP green fluorescent protein
- the animals have a posterior MEC phenotype (insensitivity to touch) of around 35% at the young adult stage (3 to 4 days after birth), which increases to around 50% when the worms are 7 days old, without evidence of death. cellular. From these first results, the inventors sought to develop this system and they showed in particular that the expression under the control of the mec-3 promoter of a polyglutamine of 128 gin in a fusion protein MEC3 :: Htt :: GFP in PLM neurons induces insensitivity to touch in the tail of animals expressing the above protein in 60 to 80% of cases.
- the transgenic nematode according to the present invention constitutes an extremely useful animal model for genetic screening and the search for suppressive mutations in genes effectors, a model which seems more particularly representative of the effects of mutated polyglutamines on neuronal dysfunction "before neuronal death".
- the transgenic nematode according to the invention is Caenorhabditis elegans. The characteristics of this model are interesting for several reasons:
- point 1 it may be a question of seeking, after mutagenesis of the transgenic nematodes expressing the mutated htt, a partial or total recovery of the loss of neuronal function induced by the mutated htt (to the F2 or F3 generations).
- These screenings will be carried out according to conventional techniques (mutagenesis with EMS, majority of nonsense mutations) from a line whose transgene is in the form of extra-chromosomal copies (stable line “not integrated”).
- the suppressor mutants will be selected on the basis of a normal progression of Mec phenotype (10% in 3 days) and on the basis of a minimum frequency of 10 "5 / gamete mutated.
- the selected suppressor mutants will be crossed several times with a wild line and analyzed in the heterozygous state. It may also be possible to cross the transgenic nematodes expressing a polyglutamine mutated with a collection of mutant lines for which the mutated gene is identified by a nucleotide sequence. These are classic crosses between male animals and hermaphrodite animals. This type of collection is being developed in several public and private laboratories, in particular at within EXELIXIS in San Francisco in the United States.
- the present invention therefore also relates to a method for screening therapeutic targets for the treatment of polyglutamine-expanding diseases comprising: determining the mutation allowing the reversal of the neuronal dysfunction presented by the transgenic nematodes in accordance with the invention,
- the existence of a human counterpart expressed in the brain will be one of the essential selection criteria for a therapeutic target.
- the next step will be to transpose the data obtained in the nematode into HD models adapted to pre-clinical pharmacology, then possibly to humans.
- the present invention therefore also relates to the use of a transgenic nematode in accordance with the present invention for the screening of therapeutic targets for the treatment and / or prevention of polyglutamine-expanding diseases.
- the determining step of the above screening will be the determination of the mutation allowing the reversal of the neuronal dysfunction as indicated above.
- a subject of the invention is also the use of the gene or the product of the gene in which the mutation has been determined for the preparation of a medicament intended for the treatment and / or prevention of polyglutamine-expanding diseases.
- the present invention also relates to the use of a transgenic nematode in accordance with the invention for the identification of compounds having an inhibiting activity on the abnormal phenotype presented by said nematode.
- This involves, for example, subjecting said nematode to, or bringing it into contact with, at least one compound capable of having the said inhibition activity and of regularly monitoring the effect of this contact and of this exposure on the phenotype. abnormal presented by the nematode.
- the compounds giving rise to a partial or total reversion of the abnormal phenotype in question will then be characterized and will be the subject of in-depth studies and analyzes with a view to preparing a medicament intended for the treatment and / or prevention of polyglutamine expanding diseases.
- the constructions used allow the expression of fusion proteins containing from the N-terminal side to the C-terminal side: a fragment of the mec-3 protein of 29 amino acids, the first 17 amino acids of the htt, the polyglutamine domain of variable length (18, 88, or 128 Gin), the 17 amino acids of the htt according to the polyglutamine domain, and GFP (Green fluorecent protein).
- the expression vector used is Tu482 (Martin Chalfie, Columbia University, New York, NY, USA), a derivative of pPD95.65 (public access; Andrew Fire, Carnegie Institute of Washington, USA).
- the fragments of the htt containing 18 gin come from the Laboratory of Genomic Biology (CEPH, Paris), those containing 88 gin were obtained from plasmids coming from the laboratory of Christopher Ross (Johns Hopkins University, Baltimore USA), and those containing 128 gin were obtained from plasmids from the laboratory of Michael Hayden (University of British Columbia, Vancouver, Canada).
- aa Amino acids
- Polygln polyglutamine domain.
- FIGs 2C and 2D 10 consecutive mechanosensory responses, 5 anterior and 5 posterior were recorded in 50 animals of each genotype. Thus, each animal received a score from 0 (for 10 consecutive positive responses) to 10 (for no positive response).
- Figure 2A posterior MEC phenotypes as a percentage for each line of worms, with error bars indicating standard error the average for each plate test tested. At least 5 independent transgenic lines for a given construct have been tested. The wild type N2 shows some MEC responses, such as transgenic worms for mec-3p :: GFP [GFP] and mec-3p:: Httl-57 (19Q) :: GFP [19-GFP].
- Figure 3 Representative patterns of GFP expression of transgenic fusion proteins in PLM mechanosensation neurons
- transgenic animals were washed from the food plates in M9 buffer, immobilized by incubation in levamisole, installed on 3% agarose supports on microscope slides and placed under a glass slide.
- cellular GFP distributions were established in PLM posterior mechanosensory neurons under a set of FITC filters. Observations were made under an XI 00 objective.
- the images were generated with a CCD camera using Photoshop Adobe software. The “posterior” aspect is on the right in all cases.
- GFP is diffusely expressed throughout the nucleus, cell body and axons. Rarely, bright spots of fluorescence are observed along the axonal projections.
- FIG. 3B mec-3p :: Httl-57 (19Q) :: GFP.
- GFP accumulates in two large sets, apparently around the nucleus. Diffuse expression is detected along the axons with certain cytoplasmic aggregations (arrow). The GFP signal outside the image in the lower right corner of the diagram comes from the cell body of another PLM of the animal.
- Figure 3C mec-3p :: Httl-57 (88Q) :: GFP. GFP forms important perinuclear aggregates as visualized by two bright signals around the nucleus.
- Intense GFP signals are observed around the nucleus, with two typical bright signals, such as in ec-3p :: Httl-57 (88Q) :: GFP.
- the PLM neurons of this genotype do not have a greater number of aggregates along the axons (arrows) than those in mec-3p :: Httl-57 (88Q) :: GFP.
- the GFP signal outside the image in the lower left corner of the diagram comes from the cell body of the animal's other PLM.
- Figure 4 Representative image by confocal analysis of GFP fusion proteins in PLM neurons of transgenic lines
- Figure 4A mec-3p :: GFP.
- a diffuse GFP signal is apparent along the axonal projections, throughout the cell body and in the nucleus (arrow).
- Figure 4B mec-3p :: Httl-57 (19Q) :: GFP.
- the GFP signal shows an accumulation near the nucleus, with protein deposits also present within the nucleus (arrow).
- Figure 4C mec-3p :: Httl- 57 (88Q) :: GFP.
- the worms gave rise to a GFP signal in the form of a ring around the nucleus, with also a signal detected inside the nucleus (arrow).
- Figure 4D mec-3p :: Httl-57 (128Q) :: GFP.
- the two PLM cores are visible. On the left, the signal is detected in the nucleus (arrow), but not in the nucleus on the right.
- the worms showed a significant accumulation of GFP on one side of the nucleus with numerous point deposits around the nuclear surface.
- Figure 5 Diagram of the stages of the reversion tests in the C. elegans worm
- Figure 5A by random mutagenesis
- the original transgenic lines were all obtained from a dpy-20 mutant. However, in order to improve the efficiency of the transformation, the inventors also injected the lin-15 mutant (phenotype: several vulvaes). From there, new DNA constructs, as well as the above transgenes have transformed these strains to control any potential effects of the genetic background. The sequence of all transgenes was checked before injection. During the resequencing of the original construction mec-3p :: Httl-57 (84Q) :: GFP injected with COLUMBIA, it was discovered that this transgene actually coded for a protein containing 88 contiguous glutamines and not 84 as previously postponed. The Inventors have generated new constructions including:
- GFP may be present in PLM neurons acting as an sensitizing agent for the effects of polyglutamine expansion on MEC to be detected. This can be tested by co-injecting mec-3p :: GFP with this construction of mec-3p :: Httl-57 (128Q) MINUSGFP.
- the inventors examined the patterns of GFP expression of the fusion proteins in the PLM neurons (FIGS. 3 and 4).
- the mec-3p :: GFP transgenic lines showed a diffuse signal within the nucleus, the body and the cellular machinery without significant or obvious accumulation at the level of a specific cellular localization ( Figures 3A and 4A).
- the control transgenics, mec-3p :: Httl-57 (19Q) :: GFP have shown an intense accumulation of the GFP signal, typically visible as two diametrically opposite sets, apparently around the nucleus. Diffuse expression was observed in the nucleus (see Figure 4B).
- the mec-3p :: Httl-57 (128Q) :: GFP transgene also showed significant accumulations near or around the nucleus. These signals had a more fragmented appearance than in other genotypes. In addition, GFP nuclear signals appeared less common than in other lines ( Figure 4D). As was the case with mec-3p :: Httl-57 (88Q) :: GFP, a diffuse signal was not detected along the axonal projections. However, there appeared to be a greater number of aggregates along the axons of mec-3p :: Httl-57 (128Q) :: GFP ( Figure 3D).
- Bonini NM A genetic model for human polyglutamine-repeat disease in
- Caenorhabditis elegans is expressed primarily in the touch receptor neurons.
- Li SH Li XJ. Aggregation of N-terminal huntingtin is depend on the length of its glutamine repeats. Hum Mol Genêt (1998) May; 7 (5): 777-82. Li XJ, Li SH, Sharp AH, Nucifora FC Jr, Schilling G, Lanahan A, Worley P, Snyder SH, Ross CA. A huntingtin-associated protein enriched in brain with implications for pathology. Nature 378: 398-402 (1995, c). .
- Lione LA Carter RJ, Hunt MJ, Bâtes GP, Morton AJ, Dunnett SB. Selective discrimination learning impairments in mice expressing the human Huntington's disease mutation. JNeurosci (1999) Dec l; 19 (23): 10428-37. .
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Abstract
La présente invention a pour objet un nématode trangénique présentant un phénotype de dysfonctionnement neuronal en absence apparente de mort neuronale. L'invention concerne également le transgène à l'origine dudit phénotype ainsi que des procédés de criblage de cibles thérapeutiques et de composés actifs pour le traitement de maladies à expansion polyglutamine.
Description
MODELE CAENORHABDITIS ELEGANS TRANSGENIQUE
PRESENTANT UN DYSFONCTIONNEMENT NEURONAL
La présente invention a pour objet un nematode transgénique présentant un phénotype de dysfonctionnement neuronal en absence apparente de mort neuronale. L'invention concerne également le transgène à l'origine dudit phénotype ainsi que des procédés de criblage de cibles thérapeutiques pour le traitement de maladies à expansion de polyglutamine. La première caractéristique des polyglutamines (ou polygln) de taille anormale est leur effet pathologique lorsqu'elles sont présentes dans certaines protéines, ce qui détermine aujourd'hui une classe de huit maladies neurodégénératives autosomales dominantes. Le nombre d'unité de glutamine (ou gin) et le contexte protéique sont deux éléments qui interviennent dans l'effet pathologique des séquences de polygln.
Ces huit maladies neurodégénératives à expansion de polygln sont : la maladie de Huntington (HD, The Huntington's Disease Collaborative Research Group, 1993), l'ataxie spinocérébelleuse (SCA) de type 1 (Orr et al, 1993), SCA2 (Imbert et al, 1996), SCA3 ou maladie de Machado- Joseph (Kawagushi et al, 1994), SCA6 (Ikeuchi et al, 1997), SCA7 (David et al, 1997), l'Atrophie Dentatro-Rubro Pallidoluysienne DRPLA (Koïde et al, 1994) et l'Atrophie Musculaire Spino-Bulbaire SBMA (La Spada et al, 1994). Le gène de SCA6 a la particularité de présenter un seuil pathologique modéré par rapport aux autres maladies, sans doute du fait de la position de la polygln (transmembranaire) dans le canal calcium αl A. Les fonctions des protéines de maladie ne sont connues que pour deux de ces maladies : canal ionique pour SCA6, et récepteur des androgènes pour SBMA. Ces neuropathies sont rares et incurables. De telles maladies perturbent fortement la vie sociale et familiale du patient car elles apparaissent souvent
à l'âge de 30-40 ans. Elles sont très invalidantes physiquement mais aussi difficiles à gérer par les proches car le patient présente de graves troubles psychologiques et psychiatriques. La maladie progresse sur une période de 15 à 20 ans. A titre d'exemple, la prévalence de HD dans la population française est d'environ 1/10 000. La protéine de HD est la huntingtine (htt), son expression est ubiquitaire, sa localisation est apparemment cytoplasmique, et son poids moléculaire est de 350 kDa. La htt est caractérisée par la présence dans sa partie N-terminale (N-ter) d'une séquence polygln suivie de deux régions polyprolines peu polymorphiques. La htt « normale » contient un nombre « normal » de répétition glutamine (typiquement : 15 à 20 gin, principalement : moins de 39 gin). La htt mutée contient un nombre anormalement élevé de répétition glutamine (typiquement le seuil pathologique est d'environ 39 gin, l'expansion de polygln pouvant par exemple atteindre jusqu'à 180 gin dans certains cas) qui est associé à l'apparition de la maladie (Koshy et Zoghbi, 1997). La fonction biochimique et cellulaire de la htt est encore inconnue. Des techniques d'immunohistochimie, de microscopie électronique et de fractionnement cellulaire ont permis d'observer que la htt est une protéine cytosolique associée aux vésicules et/ou aux microtubules, ce qui suggère un rôle dans l'ancrage au cytosquelette ou dans le transport des vésicules (Sathasivam et al, 1999). Des études à l'aide de souris homozygotes -/- pour hd (l'homologue murin du gène humain IT15) ont permis de supposer que la htt a un rôle important lors de l'embryogenèse car la mort de l'embryon survient au bout de quelques jours seulement dans ces souris (Zeitlin et al, 1995). Très récemment, une équipe travaillant sur des cellules embryonnaires de souris délétées pour hd a proposé que la htt pourrait avoir un rôle important lors de l'hématopoïèse (Metzler et al, 2000). Ces trois observations permettent d'esquisser un schéma de fonctionnement de la htt où cette protéine est importante dans plusieurs étapes du développement.
De façon générale, les profils de neurodégénérescence du cerveau sont spécifiques de la maladie alors que l'expression des protéines de maladie est ubiquitaire. Le mécanisme de cette sélectivité neuronale n'est toujours pas élucidé (Koshy et al, 1997). Les maladies neurodégénératives à expansion de polygln ont en commun la présence d'inclusions intranucléaires (Nil) voire cytoplasmiques. Ces inclusions ont été mises en évidence par immunohistochimie sur des coupes de cerveau post-mortem pour HD (DiFiglia et al, 1997), SCA1 (Skinner et al, 1997), SCA3 (Paulson et al, 1997), SCA6 (Ishikawa et al, 1999), SCA7 (Holmberg et al, 1998), DRPLA (Igarashi et al, 1998) et SBMA (Li et al, 1998a). Ces études ont montré que les inclusions étaient constituées de fragments de protéines de maladie mais aussi d'ubiquitine. Le rôle des inclusions, en particulier celles qui sont nucléaires, comme cause dans ces maladies reste très incertain. Les séquences de polygln possèdent aussi des propriétés d'auto- agrégation qui ont été décrites par Perutz et al. en 1994. Dans ce modèle, les polygln se comportent comme des « polar zipper », où les chaînes latérales des gin forment des feuillets β par l'intermédiaire de liaisons hydrogènes, l'empilement des feuillets β de plusieurs protéines conduisant à un phénomène d'agrégation. Ces agrégats semblent être irréversibles. L'observation d'un important retard de migration sur gel de polyacrylamide de protéines de fusion [GST-fragment N-ter de la htt avec 30, 51 ou 83 gin] montre la capacité que possèdent les protéines à polygln à s'auto-agréger et la grande difficulté à les dissocier par chauffage et utilisation du SDS (Wanker et al, 1999; Hollenbach et al, 1999). Il semblerait que la formation d'agrégats, du moins in vitro, suit une cinétique qui est fonction de la taille de la polygln et de sa concentration (Scherzinger et al, 1999). De plus, la taille de la protéine porteuse de la polygln influe aussi sur la formation des agrégats car plus la protéine est grande et plus la polygln
semble être stabilisée dans un état où sa capacité à former des agrégats est minime. En effet, l'expression de la htt mutée, entière ou tronquée, dans une lignée de neuroblastome a montré dans le premier cas une expression diffuse et cytoplasmique et, dans le second cas, des agrégats cytoplasmiques et nucléaires (Cooper et al, 1998).
Donc non seulement, la présence d'une polygln d'une certaine taille dans une protéine de maladie génère la formation d'agrégats ce qui modifie la conformation de la protéine, mais il est probable que ceci a pour conséquence la modification des interactions avec d'autres protéines. Ainsi, la htt subit un clivage accru par la caspase-3 lorsque la protéine est mutée. Cette protéolyse libère un fragment N-ter apparemment très toxique contenant la polygln et les deux domaines polyprolines (Goldberg et al, 1996).
Les agrégats observés dans HD sont constitués de fragments N- terminaux de la htt, d'ubiquitine, et d'autres protéines. Plusieurs protéines sont susceptibles d'être séquestrées dans les agrégats si elles interagissent d'une façon ou d'une autre avec la partie N-terminale de la htt : par exemple, la protéine SH3GL3 à domaine SH3 interagit mieux avec la htt mutée par l'intermédiaire des domaines polyprolines et elle est associée aux agrégats (Sittler et al, 1998). Les transglutaminases, enzymes qui participent aux modifications post-transcriptionnelles, pourraient aussi intervenir dans la formation des agrégats. Un réseau de protéines se formerait à partir de protéines à polygln enchevêtrées les unes avec les autres par des liaisons covalentes entre glutamines et lysines. En présence de transglutaminases, un peptide synthétique de 18 polygln montre la capacité à former des agrégats in vitro (Kahlem et al, 1996). Néammoins, il est probable que la capacité des polygln à former des « polar zipper » est plus fortement déterminante dans la formation des agrégats. Il est intéressant de noter que la co-agrégation de la htt mutée avec d'autres protéines à polygln a été mise en évidence, par exemple dans des cellules COS avec la
protéine CBP (CREB-Binding-Protein) qui contient 19 gin (Kazantsev et al, 1999).
Les agrégats dans HD sont présents à différents niveaux dans les neurones : inclusions intranucléaires (NU), agrégats cytoplasmiques et agrégats aux extrémités axoniques (Ross et al, 1999). Ce dernier type d'agrégat est un peu particulier car sa taille est inférieure à celle des autres et il ne contient pas d'ubiquitine (Li et al, 1999). De plus, il existe chez la souris transgénique une meilleure corrélation entre le développement des symptômes neurodégénératifs et les agrégats axoniques qu'avec les NIIs. Ils sont détectés plus tôt et sont plus nombreux que les NIIs, et leur nombre continue d'augmenter avec l'avancement de la pathologie. Les agrégats axoniques pourraient être responsables de déficits de transmission et de communication neuronale (Li et al, 1999). Après avoir été focalisée sur le système nerveux central, la recherche des agrégats a été étendue aux autres tissus. A l'aide de l'anticorps CAG53b dirigé contre la partie N-terminale de la htt et d'un anticorps dirigé contre l'ubiquitine, des agrégats ont été détectés dans les fibres musculaires, le muscle cardiaque, les cellules hépatocytaires, et les cellules de Langerhans de la lignée transgénique murine R6/2 exprimant l'exon 1 du gène IT15. De plus, la présence d'agrégats dans les organes corrèle avec la diminution de leur taille (Sathasivam et al, 1999). Dans ce modèle transgénique, les souris sont diabétiques avec une glycémie deux fois supérieure à la normale (Hurlbert et al, 1999). Le fait que ces souris soient diabétiques à cause de la htt mutée n'est cependant pas clairement établi. La htt mutée entraîne des dysfonctionnements cellulaires qui aboutissent à une mort neuronale dont le profil ne ressemble ni à celui d'une nécrose ni à celui correspondant à la mort cellulaire programmée (Mangiarini et al, 1996). Des perturbations au niveau de la communication neuronale (diminution de la production de neurotransmetteurs ou de leurs récepteurs) sont susceptibles d'être induites dans les neurones touchés avant
la mort cellulaire. La chronologie des événements observés dans les modèle de souris et les organismes modèles invertébrés permettra de mieux comprendre le processus pathologique en jeu dans HD. Le modèle murin le mieux caractérisé est la lignée transgénique R6/2, qui exprime l'exon 1 du gène IT15 avec 144 gin (Mangiarini et al, 1996). Cependant, comme indiqué plus haut, ces souris sont malades du diabète. Les étapes du processus pathologique dans le modèle R6/2 se succèdent de la façon suivante : détection des NIIs neuronales à 4 semaines (Davies et al, 1997), apparition des premiers symptômes entre 9 et 11 semaines (ex : dyskinésie associée à un début de perte de poids du cerveau et corporelle), puis mort rapide de l'animal entre 10 et 13 semaines (Mangiarini et al, 1996). Plus récemment, deux modèles de souris transgéniques exprimant la htt entière mutée ont été décrits (Reddy et al, 1999 ; Hodgson et al, 1999). Ces modèles sont sans doute plus représentatifs de HD que le modèle R6/2 dans la mesure où la htt entière a été utilisée, et dans la mesure où les souris ne sont pas malades de diabète. Les tailles de polygln mutée sont sensiblement les mêmes dans les deux modèles (environ 45 gin et 80 gin). Bien que les phénotypes neurologiques apparaissent vers 28 semaines, la présence des NIIs ne corrèle pas dans les deux modèles avec le phénotype neurologique induit. Celui de Reddy et al. permet d'observer des NIIs à 12 semaines, alors que celui de Hodgson et al. ne met pas en évidence la présence de Nil dans les neurones atteints.
Les agrégats neuronaux sont en fait communs à plusieurs maladies neurodégénératives y compris des maladies autres que celles associées aux polygln comme les maladies à prions ou la maladie d'Alzheimer. Dans le groupe des maladies à polygln, les seuls facteurs de variation sont la nature de la protéine porteuse de la polygln et la localisation des sites de perte neuronale. L'étude des mécanismes pathologiques à l'aide de modèles animaux suggère que les agrégats sont un élément initiateur du processus de la maladie car ils apparaissent avant le début des symptômes. Chez
l'homme, la présence d'agrégats semble corréler avec la sévérité de HD puisque l'étude de coupes post-mortem montre que le nombre de NIIs est fonction de la taille de la polygln (Aronin et al, 1999). Cependant, une étude récente conteste la corrélation entre distribution des agrégats et sévérité de la pathologie, car l'utilisation de techniques d'immunohistochimie sur coupes de cerveau post-mortem de patients atteints par HD a montré une distribution des agrégats qui ne correspondait pas à la sévérité de la neurodégénérescence. La zone primaire de dégénérescence dans HD est le striatum puis le cortex, alors que la distribution des agrégats est plus importante dans le cortex (Kuemmerle et al, 1999). Les agrégats peuvent avoir un rôle toxique dans le processus pathologique en séquestrant des protéines ayant une fonction importante pour la cellule.
Une perte de fonction due à la séquestration de protéines essentielles à la survie neuronale est une autre des hypothèses qui impliquerait les agrégats de façon plus indirecte et plus proprement fortuite. Dans le même ordre d'idées, la séquestration d'une forme toxique de la protéine de maladie (mécanisme de protection) comme le fragment N- terminal de la htt mutée est aussi vraisemblable. La présence de la polygln entraîne une modification conformationnelle de la protéine de maladie lui donnant de nouvelles propriétés d'interaction, notamment avec la caspase-3 et libère un fragment N-terminal (Goldberg et al, 1996). La htt normale est localisée dans le cytoplasme sous forme libre alors que le fragment N- terminal est localisé dans le noyau sous forme de NIL Du fait de sa petite taille (moins de 50-70 kDa), cette protéine tronquée et mutée pourrait diffuser passivement dans le noyau et interagir anormalement avec des protéines nucléaires, de TARN et de l'ADN. Ces nouvelles propriétés lui conféreraient un rôle potentiellement toxique. La formation d'agrégats principalement par ce fragment N-terminal de la htt permettrait de limiter sa toxicité. Cette hypothèse est confortée par l'inhibition de la caspase-1,
agissant en amont de la caspase-3, et qui chez R6/2 prolonge la vie de la souris et retarde l'apparition des corps d'inclusions ainsi que des altérations de récepteurs de neurotransmetteurs et le début des symptômes (Ona et al, 1999). De même, l'utilisation de composés anti-apoptotiques ou de facteurs neurotrophiques dans les lignées de neurones striataux et le blocage de la localisation nucléaire du fragment N-terminal protègent de la mort cellulaire et diminuent le nombre d'agrégat (Saudou et al, 1998).
Il apparaît donc que les NIIs dans HD peuvent être considérés comme toxiques, limitants, voire protecteurs de la mort cellulaire. Il est très important de noter que si la relation de cause à effet entre Nil (une forme d'agrégation apparemment tardive) et mort neuronale a été largement étudiée, elle reste sujette à plusieurs critiques. Il existe peu de données sur les relations de cause à effet entre agrégats cytoplasmiques du corps cellulaire (qui seraient plus précoces) et ceux des axones (qui seraient plus toxiques bien que plus petits), la mort neuronale et, de façon plus intéressante, avec le dysfonctionnement hors apoptose. Les mécanismes pathologiques de HD et de l'ensemble des maladies neurodégénératives à polygln ne sont donc pas élucidés, et les connaissances actuelles ne permettent pas de privilégier l'une ou l'autre des hypothèses selon lesquelles les agrégats (au sens large et quelle que soit leur localisation) causent ou protègent contre les déficits neuronaux.
Il existe par conséquent un réel besoin de disposer de modèles animaux fiables non seulement pour l'étude des mécanismes d'initiation et de développement des maladies neurodégénératives mais également pour la détermination de composés susceptibles d'être utilisés pour le traitement et/ou la prévention de ces maladies.
Des travaux ont ainsi été conduits chez les souris. En effet, plusieurs études de protéines de maladies neurodégénératives chez la souris ont permis d'observer l'induction d'un phénotype neuronal par les polyglutamines de taille anormale, par exemple l'expression dans des souris
transgéniques de l'exon 1 du gène IT15 muté avec environ 144 gin (Mangiarini et al, 1996). Dans l'ensemble de ces études, on observe que la sévérité des phénotypes est fonction de la taille de la séquence polyglutaminique. Afin de tester les propriétés intrinsèques des polygln mutées, une étude chez la souris a aussi consisté à introduire une polygln de type mutée dans un contexte étranger, la protéine hypoxanthine phosphoribosyltransférase (HPRT : enzyme intervenant dans le métabolisme de la purine). Un phénotype neurodégénératif a été observé pour 146 gin mais pas pour 70 gin (Ordway et al, 1997). Néanmoins, les modèles souris ne permettent pas de rechercher, par criblage génétique rapide et sans a priori sur les gènes impliqués, des modificateurs génétiques des effets des polyglutamines.
A ce titre, l'emploi des organismes modèles simples (OMS) présente de nombreux avantages. En effet, ces modèles sont d'une grande maniabilité (supérieure à la souris) de part leur taille et de part la durée de leur cycle de reproduction. Il s'agit par exemple des nématodes ou des mouches drosophile. De plus, les modèles Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster ont un bon degré de conservation génétique de plusieurs mécanismes cellulaires importants chez l'homme. Ils possèdent un système nerveux rudimentaire pour C. elegans et plus évolué pour D. melanogaster, permettant d'étudier les maladies neurodégénératives.
Mais sur un plan de thérapeutique prospective en neurobiologie, C. elegans présente les avantages suivants : système nerveux bien caractérisé, bonne homologie fonctionnelle avec l'humain en terme de physiologie neuronale, nombreux phénotypes neurologiques normaux et mutants disponibles à l'analyse. Par rapport à d'autres organismes modèles simples comme la drosophile (Jackson et al, 1998), C. elegans a de plus les avantages suivants : génome complètement séquence, mutagenèse plus rapide, organisme transparent permettant une visualisation de tous les neurones et une analyse de l'expression des protéines chez l'animal vivant,
court cycle de reproduction (quelques jours), connaissance de la phylogénie cellulaire complète, facilité d'utilisation (culture sans agar solide ou liquide, résistance des larves à la congélation, et possibilité de criblage à haut débit, par exemple en microplaques à 96 puits). Du fait de la forte conservation de plusieurs voies de signalisation intracellulaires entre le nematode et d'autres espèces incluant l'homme, notamment en terme de physiologie neuronale, l'étude des mécanismes de maladies humaines dans C. elegans est reconnue comme un outil d'étude puissant pour l'identification et la validation (au niveau cellulaire, et avant étude pharmacologique anatomo-fonctionnelle dans des modèles plus complexes comme la souris ou le primate) de cibles thérapeutiques.
Ces modèles animaux sont utilisés dans le domaine de l'invention dans une optique thérapeutique car leur utilisation se prête à la recherche "rapide" de mécanismes suppresseurs. Après avoir modélisé une maladie dans un OMS, le criblage d'une population malade soumise à un agent mutagène peut être entrepris afin de sélectionner les individus présentant une réversion du phénotype malade. Les OMS comme le nematode ou la drosophile sont dépourvus de la plupart des protéines de maladie à polygln, et la recherche de mécanismes suppresseurs par l'utilisation d'OMS transgéniques exprimant des gènes de maladies humaines est novatrice (Jackson et al, 1998, Faber et al, 1999 ; Marsh et al, 2000).
Chacun de ces modèles a cependant ses limites et/ou ses spécificités. En effet, chez la drosophile, les phénotypes induits par les polyglutamines mutées sont du type mort neuronale (neurodégénérescence) et chez le nematode C. elegans, les phénotypes induits par les polyglutamines mutées ont jusqu'à là été faiblement pénétrants ce qui ne permettait pas la recherche de mutations suppressives dans des effecteurs de ces phénotypes.
Cependant, sur la base des phénotypes fortement pénétrants de quelques mutations suppressives, des effets des polygln mutées sur la mort
neuronale ont été identifiés récemment chez la drosophile. Ainsi, la co- expression du gène candidat p35, inhibiteur de caspases, a montré un effet bénéfique sur la dégénérescence neuronale dans des mouches trangéniques pour "SCA3" (Bonini 1999), mais n'entraîne aucune diminution du phénotype neurodégénératif dans des mouches transgéniques pour "HD" (Jackson et al, 1998). Les voies de signalisation impliquées ne sont peut- être pas les mêmes dans SCA3 et HD. Une autre étude concerne la chaperonne Hsp70 (Heat shock protein) de D. melanogaster qui a été détectée dans les inclusions nucléaires chez les mouches trangéniques "SCA3". La co-expression de l'homologue humain de Hsp70 (HSPA1L) et de l'ataxine-3 (protéine de la maladie SCA3) contenant 78 gin a permis d'inhiber aussi le phénotype de neurodégénérescence sans diminuer le nombre d'inclusions nucléaires (Warrick et al, 1999). Il se pourrait aussi que la co-expression d'une protéine à domaine polyglutamine entière et normale suffise à contrecarrer les effets de la protéine tronquée mutée chez la drosophile.
A l'aide de C. elegans, un groupe aux Etats-Unis a pu mettre en évidence des phénotypes peu pénétrants induits par les polyglutamines mutées dans des animaux transgéniques (WO 99/02652 et Faber et al, 1999). Ce modèle ne permet pas de procéder à la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques par réversion des phénotypes transgéniques induits par les polyglutamines mutées du fait de leur faible pénétrance.
Les Inventeurs se sont donc attachés à mettre en évidence un phénotype de dysfonctionnement neuronal dans des lignées de nématodes transgéniques C. elegans qui soit représentatif des phases supposées précoces de maladies neurodégénératives (dysfonctionnement neuronal avant neurodégénérescence) et qui présente l'avantage de présenter une forte pénétrance.
La présente invention a donc pour objet un nematode transgénique présentant un phénotype de dysfonctionnement neuronal en absence
apparente de mort neuronale au moins au stade jeune adulte, qui correspond à des vers âgés de 3 à 4 jours. Ce phénotype présente l'avantage de présenter, notamment à ce stade, une pénétrance d'au moins 50 % voire même d'au moins 70 %. Par « pénétrance », on entend la fréquence avec laquelle le gène manifeste ses effets.
Plus particulièrement, le nematode transgénique conforme à l'invention comprend une construction permettant l'expression d'une protéine présentant un domaine polyglutamine sous le contrôle d'un promoteur spécifique des neurones. Selon un mode de réalisation avantageux, le susdit promoteur est spécifique de neurones récepteurs du toucher. Les Inventeurs ont en fait réalisé des analyses mécanosensorielles sur des nématodes transgéniques exprimant des expansions de polyglutamine de différentes longueurs. Pour ce faire, ils ont utilisé le promoteur issu du gène mec-3 (mec-3p) (Chalfie et Au, 1989) pour diriger l'expression du transgène dans 10 des 302 neurones des vers, y compris les 6 neurones de récepteurs de la sensation (ou du toucher) : AVM, ALML, ALMR, PVM, PLML et PLMR. Ces neurones sont à l'origine de réponses chez le vers dans le cas d'un stimuli doux par toucher (Driscoll M., Kaplan J, 1997). Les travaux des Inventeurs ont principalement porté sur une protéine à domaine polyglutamine représentative des maladies neurodégénératives qu'est la huntingtine, et en particulier sur un fragment N-terminal de la huntingtine. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, par « protéine à domaine polyglutamine », il faut entendre indifféremment « protéine à domaine polyglutamine » ou « peptide issu d'une protéine à domaine polyglutamine présentant l'expansion de polyglutamine ».
Les Inventeurs se sont donc attachés à détecter un phénotype mécanosensoriel (MEC) postérieur ou antérieur chez des nématodes transgéniques chez lesquels ils ont induit un dysfonctionnement neuronal en faisant exprimer chez ces animaux, au niveau de neurones cibles, une partie
d'une protéine à domaine polyglutamine mutée. Ce phénotype s'exprime par la perte de la sensibilité au toucher due à une altération des neurones ci- dessus mentionnés. Ainsi, les Inventeurs ont cherché à détecter les nématodes transgéniques chez qui la protéine à domaine polyglutamine mutée s'est exprimée et cette expression est détectable par l'observation de la réponse des vers ou des nématodes transgéniques au toucher. En effet, l'expression d'une protéine à domaine polyglutamine mutée au niveau des susdits neurones entraîne un dysfonctionnement de ces neurones. La protéine à domaine polyglutamine mise en œuvre par les Inventeurs est la huntingtine laquelle, lorsqu'elle est mutée, contient comme indiqué précédemment, un nombre anormalement élevé de répétitions polyglutamines qui se situent classiquement aux environs d'au moins 39 résidus glutamine. Dans le cadre de la présente invention, le domaine polyglutamine comprend de 39 à 128 résidus glutamine, de préférence entre 88 et 128 résidus glutamine et plus préférentiellement 128 résidus glutamine.
La susdite construction comprend donc notamment la séquence nucléique codant pour les 29 premiers acides aminés de la protéine mec-3. Il est cependant possible que cette construction fonctionne avec moins de 29 acides aminés voire aucun acide aminé de la protéine mec-3.
Dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs montrent que l'expression d'une polyglutamine sous le contrôle du promoteur mec-3 au niveau des neurones PLM indique une insensibilité au toucher au niveau de la queue des animaux avec une pénétrance d'au moins 50 % voire d'au moins 60 % et même d'au moins 70 %. Dans le cas présent, les tests ont été effectués sur 5 lignées transgéniques stables indépendantes. Le promoteur du gène mec-3 code pour un facteur de transcription exprimé, comme indiqué plus haut, dans 10 neurones cibles dont les 2 neurones PLM qui contrôlent exclusivement la réponse au toucher au niveau de la queue. Ce phénotype ne s'accompagne apparemment pas de la mort des neurones
cibles (sur la base d'observations en microscopie NOMARKSI et sur l'absence de marquage nucléaire par l'acridine orange), ni au moment de la mesure du phénotype transgénique chez des animaux au stade jeune adulte (3 à 4 jours après la naissance), ni plus tard chez les mêmes animaux plus âgés (7 à 8 jours après la naissance).
Ainsi, les Inventeurs ont réalisé un transgène comprenant notamment une construction qui elle-même comprend une séquence nucléique codant pour les 29 premiers acides aminés de la protéine Mec-3, puis codant pour les 17 premiers acides aminés de huntingtine, puis codant pour le domaine polyglutamine comprenant de 39 à 128, de préférence de 88 à 128, plus préférentiellement 128 résidus glutamine, puis codant pour les 17 acides aminés de la huntingtine suivant le domaine polyglutamine, l'ensemble étant précédé de la séquence nucléique du promoteur du gène mec-3. Par « séquence nucléique d'un promoteur », il faut comprendre toute séquence nucléique correspondant à l'intégralité dudit promoteur mais également à toute partie fonctionnelle de ce promoteur, c'est-à-dire susceptible de remplir une fonction similaire à celle du promoteur entier.
De plus, de façon à permettre la visualisation de l'expression de la protéine mutée chez le nematode transgénique, les Inventeurs ont, dans un mode de réalisation préférée de la présente invention, fait en sorte que ladite protéine soit exprimée en fusion avec une protéine permettant sa visualisation. Ainsi, le transgène conforme à l'invention comprend la construction telle que définie plus haut dont la séquence nucléique code, à la suite de la protéine à domaine polyglutamine, pour une protéine permettant la visualisation de la protéine de fusion résultante. Avantageusement, la protéine permettant la visualisation de l'expression de ladite protéine de fusion est la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein ou GFP). La présente invention a donc également pour objet ce type de
transgène mais également les nématodes transgéniques ayant été transformés par ce type de transgène.
Les procédés de transformation de nématodes ne sont pas décrits dans le cadre de la présente invention car ils sont à présent tout à fait à la portée des connaissances normales de l'homme du métier. En effet, comme indiqué plus haut, des nématodes transgéniques ont déjà été réalisés et, sur ce point, la présente invention ne se distingue pas de l'art antérieur. En effet, il ressort clairement de la présente demande que l'invention réside notamment dans le choix des éléments constitutifs de la construction correspondant au trangène conforme à l'invention, et en particulier, dans le promoteur choisi par les Inventeurs.
Dans un premier temps, les Inventeurs ont en fait réalisé la construction suivante : mec-3p::Httl-57(84Q)::GFP. Les nématodes transformés avec ce transgène expriment, sous le contrôle du promoteur du gène mec-3, 57 acides aminés de la huntingtine (Htt) (c'est-à-dire les 17 premiers acides aminés, 23 résidus glutamines et les 17 acides aminés suivant le domaine polyglutamine) avec une expansion de polyglutamine de 84 (84Q) fusionnée à la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein ou GFP). Les animaux ont un phénotype MEC (insensibilité au toucher) postérieur d'environ 35 % au stade jeune adulte (3 à 4 jours après la naissance), qui passe à environ 50 % quand les vers ont 7 jours, sans mise en évidence de mort cellulaire. A partir de ces premiers résultats, les Inventeurs ont cherché à développer ce système et ils ont notamment montré que l'expression sous le contrôle du promoteur mec-3 d'une polyglutamine de 128 gin dans une protéine de fusion MEC3::Htt::GFP au niveau des neurones PLM induit une insensibilité au toucher au niveau de la queue des animaux exprimant la susdite protéine dans 60 à 80 % des cas.
Par conséquent, le nematode transgénique conforme à la présente invention constitue un modèle animal extrêmement utile pour les criblages génétiques et la recherche de mutations suppressives dans des gènes
effecteurs, modèle qui semble plus particulièrement représentatif des effets des polyglutamines mutées sur le dysfonctionnement neuronal « avant mort neuronale ». De préférence, le nematode transgénique conforme à l'invention est Caenorhabditis elegans. Les caractéristiques de ce modèle sont intéressantes à plusieurs titres:
1) la force du phénotype Mec permet de rechercher des mutations suppressives dans les lignées transgéniques exprimant un grand nombre de gin, 2) plusieurs études suggèrent fortement que la dysfonction neuronale « avant apoptose neuronale » provoque l'apparition des symptômes chez les malades,
3) la mauvaise corrélation observée par les inventeurs entre d'une part la formation d'agrégats nucléaires ou périnucléaires (visibles en microscopie à fluorescence GFP et en microscopie confocale) et, d'autre part, les anomalies du phénotype Mec, suggère qu'il n'y a pas de relation de cause à effet entre agrégats nucléaires ou périnucléaires et dysfonctionnement neuronal.
Cette nouvelle observation complète des données récentes de la littérature où formation d'agrégats et apoptose neuronale ne sont pas en corrélation parfaite (Kuemmerle et al, 1999 ; Reddy et al, 1999). De plus, les inventeurs ont observé que le nombre d'agrégats dans les axones des neurones cibles (neurones PLM) augmentent avec la taille de la polyglutamine, ce qui pourrait suggérer un nouveau mécanisme (déficiences axonales et par voie de conséquence synaptiques) pour le dysfonctionnement de ces neurones en terme de réponse au touché au niveau de la queue.
Sur la base du point 1), il pourra s'agir de rechercher, après mutagenèse des nématodes transgéniques exprimant la htt mutée, une récupération partielle ou totale de la perte de fonction neuronale induite par
la htt mutée (aux générations F2 ou F3). Ces criblages seront effectués selon les techniques classiques (mutagenèse avec l'EMS, majorité de mutations non sens) à partir d'une lignée dont le transgène est sous forme de copies extra-chromosomales (lignée stable « non intégrée »). Les mutants suppresseurs seront sélectionnés sur la base d'une progression normale du phénotype Mec (10% à 3 jours) et sur la base d'une fréquence minimum de 10"5/gamète muté. En deçà de cette fréquence, il existe un risque important que le phénotype révertant soit multi-allélique. Afin d'éliminer ces mutations surnuméraires, les mutants suppresseurs sélectionnés seront croisés plusieurs fois avec une lignée sauvage et analysés à l'état hétérozygote. Il peut aussi être envisagé de croiser les nématodes transgéniques exprimant une polyglutamine mutée avec une collection de lignées mutantes pour lesquelles le gène muté est identifié par une séquence nucléotidique. Il s'agit de croisements classiques entre animaux mâles et animaux hermaphrodites. Ce type de collections est en développement dans plusieurs laboratoires publics et privés, notamment au sein de la société EXELIXIS à San Francisco aux Etats-Unis.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de criblage de cibles thérapeutiques pour le traitement de maladies à expansion de polyglutamine comprenant : la détermination de la mutation permettant la réversion du dysfonctionnement neuronal présentée par les nématodes transgéniques conformes à l'invention,
- l'identification du gène comprenant cette mutation, - la recherche d'homologie de séquences avec un gène humain,
- la détermination de la fonction de la protéine codée par ce gène. La détermination de la mutation permettant la réversion du dysfonctionnement neuronal peut être réalisée :
- dans un premier mode de réalisation par :
- la mutagenèse aléatoire de tous les gènes de nématodes transgéniques conformes à la présente invention, et
- l'isolement desdits nématodes présentant une réversion du phénotype de dysfonctionnement neuronal, ou - dans un deuxième mode de réalisation par :
- le croisement de nématodes transgéniques conformes à l'invention avec des nématodes appartenant à des lignées mutantes pour lesquelles le gène muté est identifié par une séquence nucléotidique, et - l'isolement des nématodes issus du susdit croisement présentant une réversion du phénotype du dysfonctionnement neuronal.
Il s'agira ensuite de caractériser ces suppresseurs génétiques afin de sélectionner ceux qui constituent de bonnes cibles thérapeutiques (critères : pertinence des données « nématodes » chez l'homme, plus faisabilité in vivo d'une modulation d'activité des protéines cibles). Le détail des recherches à ce niveau ne pourra être défini qu'après identification des gènes contenant les mutations suppressives. Néanmoins, la recherche d'homologies de séquence pour les gènes en question chez l'homme (pour analyse des profils d'expression tissulaire) et dans d'autres organismes (pour analyse éventuelle de la fonction biologique) sera effectuée dans tous les cas. Isolation ou clonage des ADNc humains homologues et obtention d'anticorps seront accomplis afin de déterminer le profil d'expression de ces gènes aux niveaux ARNm et protéine. L'existence d'un homologue chez l'homme exprimé dans le cerveau (éventuellement à des niveaux variables dans les neurones cibles de HD : caudate, cortex) consistera un des critères de sélection essentiels d'une cible thérapeutique. L'étape suivante consistera à transposer les données obtenues dans le nematode dans des modèles de HD adaptés à la pharmacologie pré-clinique, puis éventuellement à l'homme.
La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'un nematode transgénique conforme à la présente invention pour le criblage de cibles thérapeutiques pour le traitement et/ou la prévention de maladies à expansion de polyglutamine. En particulier, l'étape déterminante du susdit criblage sera la détermination de la mutation permettant la réversion du dysfonctionnement neuronal comme indiqué plus haut.
L'invention a également pour objet l'utilisation du gène ou du produit du gène dans lequel la mutation a été déterminée pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de maladies à expansion de polyglutamine.
Enfin, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un nematode transgénique conforme à l'invention pour l'identification de composés ayant une activité d'inhibition sur le phénotype anormal présenté par ledit nematode. Il s'agit par exemple de soumettre ledit nematode à, ou le mettre en contact avec, au moins un composé susceptible d'avoir la susdite activité d'inhibition et de contrôler régulièrement l'effet de ce contact et de cette exposition sur le phénotype anormal présenté par le nematode. Bien évidemment, les composés donnant lieu à une réversion partielle ou totale du phénotype anormal en question seront ensuite caractérisés et feront l'objet d'études et analyses approfondies à des fins de préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention de maladies à expansion de polyglutamine.
PRESENTATION DES FIGURES
Figure 1. Schéma des transgènes
Les constructions utilisées permettent l'expression de protéines de fusion contenant du coté N-terminal vers le coté C-terminal : un fragment de la protéine mec-3 de 29 aminoacides, les 17 premiers aminoacides de la htt,
le domaine polyglutaminique de longueur variable (18, 88, ou 128 Gin), les 17 aminoacides de la htt suivant le domaine polyglutaminique, et la GFP (Green fluorecent protein). Le vecteur d'expression utilisé est Tu482 (Martin Chalfie, Columbia University, New- York, NY, USA), un dérivé de pPD95.65 (accès public ; Andrew Fire, Carnegie Institute of Washington,USA). Les fragments de la htt contenant 18 gin proviennent du Laboratoire de Biologie Génomique (CEPH, Paris), ceux contenant 88 gin ont été obtenus à partir de plasmides provenant du laboratoire de Christopher Ross (Johns Hopkins University, Baltimore USA), et ceux contenant 128 gin ont été obtenus à partir de plasmides provenant du laboratoire de Michael Hayden (University of British Columbia, Vancouver, Canada). Légende : aa : Aminoacides ; Polygln : domaine polyglutaminique.
Figure 2 : L'expansion de polyglutamine dans les neurones de C. elegans altère la mécanosensation
La mécanosensation a été mesurée chez des nématodes âgés de trois jours en stimulant leur corps par contact au moyen d'un cil. 20 à 30 animaux ont été placés sur des plaques alimentaires standards ensemencées avec une source alimentaire OP50 et ont été maintenus ainsi. Les animaux ont été transférés vers des plaques fraîches 24 h avant le test pour minimiser les effets adaptatifs de réponse au toucher. Les réponses défectives pour la mécanosensation (MEC) ont été enregistrées pour chaque plaque de vers (N=4). Un phénotype MEC postérieur est défini par une insensibilité au toucher au niveau de la queue. Un phénotype MEC antérieur est défini par une insensibilité au toucher au niveau de la tête. Au niveau des figures 2A et 2B, une simple réponse mécanosensorielle a été enregistrée par animal. Au niveau des figures 2C et 2D, 10 réponses mécanosensorielles consécutives, 5 antérieures et 5 postérieures ont été enregistrées chez 50 animaux de chaque génotype. Ainsi, chaque animal a reçu une notation de 0 (pour 10 réponses positives consécutives) à 10 (pour aucune réponse positive). Figure 2A : phénotypes MEC postérieurs sous forme d'un pourcentage pour chaque lignée de vers, avec des barres d'erreurs indiquant l'erreur standard
à la moyenne pour chaque essai de plaque testée. Au moins 5 lignées transgéniques indépendantes pour un construit donné ont été testées. Le type sauvage N2 montre quelques réponses MEC, comme les vers transgéniques pour mec-3p::GFP [GFP] et mec-3p : :Httl-57(19Q)::GFP [19-GFP]. Les lignées de mec-3p::Httl-57(88Q)::GFP [88Q-GFP] ont montré des altérations significatives dans la réponse MEC postérieur comprise entre 27 et 63 %. Des lignées du génotype mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP [128Q- GFP] en général ont même montré des réponses MEC postérieures plus nombreuses, entre 62 et 77 %. Chez les lignées de génotype mec-3p::Httl- 57STOP(128Q)::GFP [STOP-128Q], les réponses n'ont pas été significativement différentes des valeurs de contrôle. Les lignées mec- 3p::Httl-57(128QjMINUSGFP [128Q MINUS GFP] ont montré des réponses MEC similaires aux lignées contrôle. Figure 2B : pourcentage des phénotypes MEC antérieurs pour le type sauvage N2 et mec-3p::Httl- 57(128Q)::GFP (lignée A) [128Q-GFP], avec les barres d'erreurs indiquant l'erreur standard à la moyenne pour chaque essai de plaque testée. Figure 2C : réponses MEC des animaux N2 et mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP (lignée A) [128Q-GFP], avec les barres d'erreur indiquant l'erreur standard à la moyenne pour chaque réponse. Figure 2D : marquage diffus de la réponse en points de MEC individuel de graphe C, indiquant le degré de chevauchement entre les données individuelles de N2 (carrés vides) et mec- 3p::Httl-57(128Q)::GFP (lignée A) ]Htt(128Q)-GFP] (cercles pleins).
Figure 3 : Schémas représentatifs d'expression de GFP de protéines de fusion transgéniques dans des neurones de mécanosensation PLM
Les animaux transgéniques ont été lavés à partir des plaques alimentaires dans du tampon M9, immobilisés par incubation dans du lévamisole, installés sur des supports d'agarose à 3 % sur des lames de microscopes et placés sous une lame de verre. Dans tous les cas, les distributions cellulaires de GFP ont été établies dans des neurones mécanosensoriels postérieurs PLM sous un jeu de filtre FITC. Des observations ont été faites sous un objectif XI 00. Les images ont été générées avec une caméra CCD utilisant le logiciel Photoshop Adobe.
L'aspect « postérieur » est à droite dans tous les cas. Figure 3A : mec- 3p::GFP. GFP est exprimé de façon diffuse dans l'ensemble du noyau, le corps cellulaire et des axones. Rarement, des spots brillants de fluorescence sont observés le long des projections axonales. Ceci peut représenter des déficiences au niveau des axones eux-mêmes ou une accumulation de protéines à des sites spécifiques. Figure 3B : mec-3p::Httl-57(19Q)::GFP. Le GFP s'accumule en deux grands ensembles, apparemment autour du noyau. L'expression diffuse est détectée le long des axones avec certaines agrégations cytoplasmiques (flèche). Le signal GFP en dehors de l'image dans le coin droit inférieur du schéma provient du corps cellulaire d'un autre PLM de l'animal. Figure 3C : mec-3p::Httl-57(88Q)::GFP. La GFP forme d'importants agrégats périnucléaires comme visualisé par deux signaux brillants autour du noyau. A la différence des PLM dans les animaux mec- 3p::GFP ou mec-3p::Httl-57(19Q), les agrégats cytoplasmiques le long des axones sont communément observés (flèches). Ceux-ci peuvent être considérablement plus importants que ceux observés dans les neurones mec- 3p::Httl-57(19Q)::GFP (flèche en bas à droite). Le signal GFP en dehors de l'image dans le coin supérieur droit du schéma provient du corps cellulaire de l'autre PLM de l'animal. Figure 3D : mec-3p::Httl- 57(128Q)::GFP. Des signaux GFP intenses sont observés autour du noyau, avec deux signaux brillants typiques, tel que dans ec-3p::Httl- 57(88Q)::GFP. En général, les neurones PLM de ce génotype n'ont pas un plus grand nombre d'agrégats le long des axones (flèches) que ceux dans mec-3p::Httl-57(88Q)::GFP. Le signal GFP en dehors de l'image dans le coin gauche inférieur du schéma provient du corps cellulaire de l'autre PLM de l'animal.
Figure 4 : Image représentative par analyse confocale de protéines de fusion GFP dans les neurones PLM des lignées transgéniques
Des animaux ont été incubés dans 150 ng/ml de DAPI dans l'éthanol pendant 30 mn, suivi par 30 mn de réhydratation dans du tampon M9. Les vers ont ensuite été brièvement incubés dans du lévamisole et installés sur des lames contenant des supports solidifiés d'agarose à 3 % de
façon à empêcher les mouvements pendant l'acquisition de l'image. Des sections confocales de 0,4 microns ont été prises de signaux autour du noyau, comme détecté par le marquage DAPI, utilisant des filtres UV et FITC pour DAPI et GFP, respectivement. Le marquage DAPI est pseudocoloré en rouge, avec GFP en vert. Des reconstructions de séries z sont montrées ici, où le jaune indique une co-localisation des signaux DAPI et GFP. L'aspect « postérieur » est à droite dans tous les cas. L'échelle : 5 microns. Figure 4A : mec-3p::GFP. Un signal GFP diffus est apparent le long des projections axonales, dans tout le corps cellulaire et dans le noyau (flèche). Figure 4B : mec-3p::Httl-57(19Q)::GFP. Le signal GFP montre une accumulation à proximité du noyau, avec des dépôts de protéines également présents au sein du noyau (flèche). Figure 4C : mec-3p::Httl- 57(88Q)::GFP. Les vers ont donné lieu à un signal GFP sous la forme d'un anneau autour du noyau, avec également un signal détecté à l'intérieur du noyau (flèche). Figure 4D : mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP. Les deux noyaux PLM sont visibles. Sur la gauche, le signal est détecté dans le noyau (flèche), mais pas dans le noyau sur la droite. Les vers ont montré une accumulation importante de GFP d'un côté du noyau avec des dépôts ponctuels nombreux autour de la surface nucléaire.
Figure 5 : Schématisation des étapes des tests de réversion dans le ver C. elegans
Figure 5A : par mutagenèse aléatoire
Figure 5B : par utilisation de collections de mutants.
La présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus mais au contraire en englobe toutes les variantes. Les expérimentations et résultats reportés ci-après servent à mieux comprendre l'invention mais ne sont mentionnés qu'à titre purement illustratif
EXPERIMENTATIONS ET RESULTATS
A. Génération de nouvelles lignées transgéniques mec3
Les lignées transgéniques originales ont toutes été obtenues à partir d'un mutant dpy-20. Cependant, dans le but d'améliorer l'efficacité de la transformation, les Inventeurs ont procédé également à des injections dans le mutant lin-15 (phénotype : plusieurs vulves,). A partir de là, de nouvelles constructions d'ADN, ainsi que les transgènes ci-dessus ont transformé ces souches pour contrôler tout effet potentiel de l' arrière-plan génétique. La séquence de tous les transgènes a été vérifiée avant l'injection. Au cours du reséquençage de la construction d'origine mec-3p::Httl-57(84Q)::GFP injecté à COLUMBIA, il a été découvert que ce transgène en fait codait pour une protéine contenant 88 glutamines contiguës et pas 84 comme précédemment reporté. Les Inventeurs ont généré de nouvelles constructions comprenant :
128 glutamines : mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP, 128 glutamines non fusionnées à GFP, pour contrôler les effets GFP : mec-3p::HttI-57(128QJMINUSGFP, deux codons stop juste avant la séquence codant pour l'expansion de 128 glutamines : mec-3p::Httl-57STOP(128Q)::GFP, pour contrôler les effets de l'ARN messager.
Ces trois constructions ainsi que la GFP seule, des variants 19Q et 88Q, tous sous le contrôle du promoteur mec-3, ont été injectés avec l'ADN de type sauvage lin- 15 (marqueur phénotypique de sélection restaurant un phénotype sauvage lin-15). Dans chaque cas, un minimum de 5 lignées transgéniques indépendantes, ont été sélectionnées pour les analyses suivantes.
B. Les analyses de mécanosensation Les Inventeurs se sont intéressés à déterminer s'ils pouvaient ou pas renforcer le phénotype MEC observé à l'origine pour utiliser un criblage suppresseur et ils ont examiné les réponses MEC chez des animaux âgés de 3 jours (après cet âge, les animaux ont significativement moins de progéniture). Il a été trouvé que, comme précédemment, les animaux
transgéniques exprimant GFP seule ou GFP-19Q montraient un niveau de mécanosensation proche du type sauvage (Figure 2A). Cependant, dans 5 lignées de GFP-88Q examinées, 2 ont montré un niveau significativement supérieur de MEC par rapport à celui observé antérieurement tandis que les 3 lignées restantes ont montré des phénotypes MEC postérieures similaires à ceux observés antérieurement. Par contraste de variabilité dans les effets de 88Q dans le transgène, toutes les lignées de 128Q examinées ont montré un fort phénotype MEC postérieur aux environs de 70 %. Les animaux transgènes contrôle exprimant 128Q avec 2 codons stop en amont de l'expansion de polyglutamine ont montré un niveau de MEC proche du type sauvage. 8 lignées transgéniques de 128Q MINUS GFP ont montré un niveau de MEC proche du type sauvage. Bien que les Inventeurs savent à partir du signal fluorescent que les protéines de fusion GFP ont été exprimées, il est possible qu'il n'y ait pas d'expression détectable de protéines 128Q dans ces lignées. Les Inventeurs examinent couramment cette notion d'immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre l'extrémité N-terminale de la huntingtine. Il est également possible que la GFP puisse être présente dans les neurones PLM agissant comme un agent de sensibilisation pour les effets de l'expansion de polyglutamine sur MEC à détecter. Ceci peut être testé en co-injectant mec-3p::GFP avec cette construction de mec-3p::Httl-57(128Q)MINUSGFP.
La mécanosensation antérieure a été testée chez des vers de type sauvage et des vers transgéniques 128Q âgés de 3 jours. Un phénotype MEC modéré mais significatif a été détecté (Figure 2B). Les Inventeurs se demandent s'il pourrait être possible de détecter des différences plus importantes de mécanosensation entre les vers de type sauvage N2 et les vers 128Q en testant les animaux avec des stimuli multiples. Ils ont soumis les vers à 10 stimuli mécanosensoriels, 5 au niveau de la tête et 5 au niveau de la queue et ont mesuré les réponses chez N2 et 128Q. Un phénotype MEC maximal donnerait donc une notation de 10 tandis que 10 réponses positives consécutives donneraient une notation de 0. Dans ce cas particulier, les animaux N2 ont été notés 1,3 tandis que les animaux 128Q ont été notés 5,1 (Figure 2C). L'examen des données en points individuels à partir de ces tests révèle un léger chevauchement entre N2 et 128Q (Figure
2D), ce qui donne lieu à penser qu'il existerait une voie potentiellement intéressante pour cribler les suppresseurs F2 du phénotype MEC 128Q.
C. Répartition des schémas d'agrégation des polyglutamines Les Inventeurs ont examiné les schémas d'expression de GFP des protéines de fusion dans les neurones PLM (Figures 3 et 4). Les lignées transgéniques mec-3p::GFP ont montré un signal diffus au sein du noyau, du corps et de la machinerie cellulaire sans accumulation significative ou évidente au niveau d'une localisation cellulaire spécifique (Figures 3A et 4A). Les transgéniques contrôle, mec-3p::Httl-57(19Q)::GFP, ont montré une accumulation intense du signal GFP, de façon typique visible sous forme de deux ensembles diamétralement opposés, apparemment autour du noyau. L'expression diffuse a été observée dans le noyau (voir Figure 4B). De la même façon, un signal diffus était évident le long des projections axonales avec un nombre petit mais significatif d'agrégats de protéines de fusion (Figure 3B). Chez les transgènes mec-3p::Httl-57(88Q)::GFP, l'accumulation de protéines autour du noyau était plus intense. Comme les deux grands ensembles observés dans les lignées mec-3p::Httl- 57(19Q)::GFP, de plus petites accumulations ponctuelles sont apparues autour ou près du noyau (Figures 3C et 4C). Un signal a également été détecté dans le noyau. Le long des projections axonales, plusieurs agrégats étaient généralement visibles. Une expression diffuse n'a pas été détectée (Figure 3C). Le transgène mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP a également montré des accumulations importantes proches ou autour du noyau. Ces signaux avaient une apparence plus fragmentée que dans d'autres génotypes. De plus, des signaux nucléaires de GFP sont apparus moins ordinaires que dans d'autres lignées (Figure 4D). Comme cela était le cas de mec-3p::Httl-57(88Q)::GFP, un signal diffus n'a pas été détecté le long des projections axonales. Cependant, il semblait y avoir un nombre plus important d'agrégats le long des axones de mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP (Figure 3D). Sous microscope à confocale, des schémas d'agrégation autour ou proches du noyau dans les transgènes mec-3p: :Httl-57(88Q) : :GFP et mec-3p::Httl-57(128Q)::GFP sont réminiscents avec l'apparition de l'appareil de Golgi. Il a été récemment montré que la protéine huntingtine
était localisée à proximité de cette structure (Nélier J et al., 1998). Le transport via l'appareil de Golgi pourrait être une source de désorganisation cellulaire dans le système des Inventeurs.
A partir des analyses de la distribution cellulaire de GFP, les Inventeurs ont conclu que les protéines de fusion à expansion de polyglutamine formaient des agrégats, comme dans d'autres systèmes modèles (Davies SW et al., 1997 ; Scherzinger E et al., 1997 ; Martindale D et al., 1998 ; Cooper JK et al., 1998 ; LI SH & Li XJ, 1998) et de maladies humaines (DiFiglia M et al., 1997 ; Maat-Schieman ML et al., 1999 ; Sapp E et al., 1999). Quoiqu'il en soit, il semble qu'il y ait une corrélation inverse entre la longueur de l'expansion de polyglutamine et la présence de protéines nucléaires. Cependant, il semble qu'il y a une relation modérément bien corrélée entre le nombre d'agrégats cytoplasmiques et la taille de l'expansion de polyglutamine. Ainsi, la relation entre l'agrégation et la pathologie reste une question ouverte (Kuemmerle S et al., 1999).
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Claims
1. Nematode transgénique présentant un phénotype de dysfonctionnement neuronal en absence de mort neuronale au stade jeune adulte.
2. Nematode transgénique selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le phénotype de dysfonctionnement neuronal présente une pénétrance d'au moins 50 %, de préférence d'au moins 70 %.
3. Nematode transgénique selon la revendication 1 ou 2 comprenant une construction permettant l'expression d'une protéine présentant un domaine polyglutamine sous le contrôle d'un promoteur spécifique des neurones.
4. Nematode transgénique selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur est spécifique de neurones récepteur du toucher.
5. Nematode transgénique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du promoteur du gène mec-3.
6. Nematode transgénique selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait que la protéine présentant un domaine polyglutamine est un fragment N-terminal de la huntingtine.
7. Nematode transgénique selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le domaine polyglutamine comprend entre 39 et 128 résidus glutamine, de préférence entre 88 et 128 résidus glutamine et plus préférentiellement 128 résidus glutamine.
8. Nematode transgénique selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé par le fait que la protéine est une protéine de fusion.
9. Nematode transgénique selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la protéine de fusion comprend une protéine présentant un domaine polyglutamine et une protéine permettant la visualisation de l'expression de la protéine de fusion.
10. Nematode transgénique selon la revendication 9, caractérisé par le fait que la protéine permettant la visualisation de l'expression de la protéine de fusion est la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein ou GFP).
11. Nematode transgénique selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la construction comprend une séquence nucléique codant pour les 29 premiers acides aminés de la protéine Mec-3, puis codant pour les 17 premiers acides aminés de la huntingtine, puis codant pour le domaine polyglutamique comprenant de 39 à 128, de préférence 88 à 128, plus préférentiellement 128 résidus glutamine, puis codant pour les 17 acides aminés de la huntingtine suivant le domaine polyglutamine, puis pour la GFP, sous le contrôle du promoteur du gène mec-3.
12. Nematode transgénique selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait qu'il s'agit de Caenorhabditis elegans.
13. Transgène comprenant une séquence nucléique comprenant la séquence nucléique d'un promoteur spécifique de neurones récepteur du touché liée de façon opérationnelle à la séquence nucléique d'un gène codant pour une protéine présentant un domaine polyglutamine.
14. Transgène selon la revendication 13, caractérisé par le fait que le promoteur est le promoteur du gène mec-3.
15. Transgène selon la revendication 13 ou 14, caractérisé par le fait que la séquence nucléique du gène codant pour la protéine est elle-même liée de façon opérationnelle à la séquence nucléique d'une protéine permettant la visualisation de la protéine de fusion résultante.
16. Transgène selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé par le fait que la protéine présentant un domaine polyglutamine est la huntingtine.
17. Transgène selon la revendication 16, caractérisé par le fait que le domaine polyglutamine comprend entre 39 et 128 résidus glutamine, de préférence entre 88 et 128 résidus glutamine et plus préférentiellement 128 résidus glutamine.
18. Transgène selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'il comprend une séquence nucléique codant pour les 29 premiers acides aminés de la protéine Mec-3, puis pour les 17 premiers acides aminés de la huntingtine puis codant pour le domaine polyglutamine comprenant de 39 à 128, de préférence 88 à 128, plus préférentiellement 128 résidus glutamine, puis pour les 17 acides aminés de la huntingtine suivant le domaine polyglutamine, puis pour la GFP, sous le contrôle du promoteur du gène mec-3.
19. Utilisation d'un transgène selon l'une des revendications 13 à 18 pour transformer un nematode, de préférence C. elegans.
20. Procédé de criblage de cibles thérapeutiques pour le traitement de maladies à expansion de polyglutamine comprenant :
- la détermination de la mutation permettant la réversion du dysfonctionnement neuronal présenté par les nématodes transgéniques selon l'une des revendications 1 à 12,
- l'identification du gène comprenant cette mutation,
- la recherche d'homologie de séquence avec un gène humain,
- la détermination de la fonction de la protéine codée par ce gène.
21. Procédé de criblage selon la revendication 20, caractérisé par le fait que la détermination de ladite mutation comprend : - la mutagenèse aléatoire de tous les gènes de nématodes transgéniques selon l'une des revendications 1 à 12, et
- l'isolement desdits nématodes présentant une réversion du phénotype de dysfonctionnement neuronal.
22. Procédé de criblage selon la revendication 20, caractérisé par le fait que la détermination de ladite mutation comprend : le croisement de nématodes transgéniques selon l'une des revendications 1 à 12 avec des nématodes appartenant à des lignées mutantes pour lesquelles le gène muté est identifié par une séquence nucléotidique, - l'isolement des nématodes issus du susdit croisement présentant une réversion du phénotype de dysfonctionnement neuronal.
23. Utilisation d'un nematode transgénique selon l'une des revendications 1 à 12 pour le criblage de cibles thérapeutiques pour le traitement et/ou la prévention de maladies à expansion de polyglutamine.
24. Utilisation selon la revendication 23 comprenant la détermination de la mutation permettant la réversion du dysfonctionnement neuronal.
25. Utilisation du gène ou produit du gène dans lequel la mutation a été déterminée selon la revendication 24 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de maladies à expansion de polyglutamine.
26. Utilisation d'un nematode transgénique selon l'une des revendications 1 à 12 pour l'identification de composés ayant une activité d'inhibition sur le phénotype anormal présenté par ledit nematode.
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