WO2001083748A1 - Proteine de recepteur couple a la proteine g et adn correspondant - Google Patents

Proteine de recepteur couple a la proteine g et adn correspondant Download PDF

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WO2001083748A1
WO2001083748A1 PCT/JP2001/003597 JP0103597W WO0183748A1 WO 2001083748 A1 WO2001083748 A1 WO 2001083748A1 JP 0103597 W JP0103597 W JP 0103597W WO 0183748 A1 WO0183748 A1 WO 0183748A1
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receptor protein
salt
coupled receptor
present
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PCT/JP2001/003597
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Takeo Moriya
Takashi Ito
Yasushi Shintani
Hideki Matsui
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from human liver or a salt thereof, and DNA encoding the same.
  • G proteins conjugated guanine nucleotide-binding proteins
  • G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells of living cells and organs, and are physiologically targeted as molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters and bioactive substances. Plays an important role.
  • the receptor transmits a signal into the cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • physiologically active substances are present in various parts of the body, and regulate their physiological functions through their corresponding receptor proteins.
  • hormones, neurotransmitters, and other physiologically active substances have not yet been reported.
  • Clarifying the relationship between substances that regulate complex functions in living organisms and their specific receptor proteins is a very important tool for drug development.
  • it is necessary to elucidate the functions of the receptor protein genes expressed in vivo and to express them in an appropriate expression system. was needed.
  • the G protein-coupled receptor is a new generation that uses its signal transduction as an index. It is useful for searching for a physiologically active substance (that is, a ligand) and for searching for an agonist or an antagonist for the receptor. On the other hand, even if a physiological ligand is not found, an agonist or an agonist for the receptor can be prepared by analyzing the physiological action of the receptor from an inactivation experiment (knockout animal) of the receptor. It is. A ligand, agonist, antagonist or the like for these receptors can be expected to be used as a therapeutic or diagnostic agent for preventing diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptors.
  • a decrease or increase in the function of the receptor in a living organism based on a gene mutation of a G protein-coupled receptor often causes some disease.
  • the nucleotide sequence of the receptor is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation in the gene.
  • the gene of the receptor is used to prevent diseases associated with dysfunction of the receptor. It can also be applied to drugs and diagnostics. Summary of the Invention
  • the present invention provides a novel G protein-coupled receptor protein useful as described above. That is, a novel G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, a polynucleotide containing a polynucleotide (DNA, RNA and a derivative thereof) encoding the G protein-coupled receptor protein or a partial peptide thereof A nucleotide (DNA, RNA and derivatives thereof), a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant carrying the recombinant vector, a method for producing the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, An antibody against a protein-coupled receptor protein or a partial peptide or a salt thereof, a compound that changes the expression level of the G protein-coupled receptor protein, a method for determining a ligand for the G protein-coupled receptor, and a ligand and the G protein-coupled receptor Receptor that changes the binding to one protein (Antago
  • the present inventors have isolated cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein derived from human liver and succeeded in analyzing the entire nucleotide sequence thereof.
  • this base sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot, and the protein encoded by these cDNAs was a seven-transmembrane G protein-coupled receptor. It was confirmed to be a protein.
  • the present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention. That is, the present invention
  • a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • the G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to (1) which can be obtained by using the G protein-coupled receptor protein according to (1) or the partial peptide or salt thereof according to (2).
  • a ligand obtainable by using the screening method according to (15) or the screening kit according to (16) and the G protein according to (1).
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof that changes the binding property to a conjugated receptor protein or a salt thereof,
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of (3) or a part thereof,
  • a medicament comprising a compound or a salt thereof, which alters the expression level of the G protein-coupled receptor protein according to (1), which can be obtained by using the screening method according to (24).
  • a pharmaceutical comprising the compound or a salt thereof, which alters the amount of the G protein-coupled receptor protein according to (1) in the cell membrane obtainable by using the screening method according to (25).
  • central disease inflammatory disease, cardiovascular disease, cancer, characterized by administering an effective amount of a compound or a salt thereof that alters the binding to the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to the above.
  • a compound or a salt thereof that alters the binding to the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to the above.
  • a method for preventing or treating central diseases, inflammatory diseases, cardiovascular diseases, cancer, diabetes or infertility which is obtained by using the screening method according to (25) for producing a therapeutic agent.
  • the present invention relates to the use of a compound or a salt thereof that alters the amount of the G protein-coupled receptor protein described in (1) above in a cell membrane that can be obtained.
  • the protein is: (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30, more preferably 1 to 9) Amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted, and 2 or more (preferably about 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids are added preferably 1 to 5 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids, and 3 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Preferably, an amino acid sequence in which about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5) amino acids have been substituted with another amino acid, or a combination thereof.
  • Protein containing a modified amino acid sequence A certain G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to the above (1),
  • the ligand is, for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokine, gnoretamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, xyxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedinine Yurin, Somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Pasoactive Intestinal polypeptide), Somatostatin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitin Gene-Related Peptide), Leukotorien , Pancreastatin, prostaglandin, stomach boxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and] 3-chemokine (eg, IL-18, GROa, GRO / ?, GROy, NAP-2, ENA-78
  • the compound that activates the G protein-coupled receptor protein according to (1) is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, daltamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine. , Pasopletsusin, oxytocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH,
  • GRP GRP, PTH, VIP (passoactive intestinal polypeptide), somatostatin, donomin, motilin, amylin, pradicun, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, Adrenaline, ⁇ and chemokine (eg IL-8, GRO a, GRO ⁇ , GROT /, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP_2, MCP-1, HC14, MCP— 3, I-309, ⁇ 1 ⁇ , MIP-1 and RANTES), endothelin, enterogastrin, histamine, neutrotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA) or The screening method according to (45) or (46) above, which is sphingosine monomonophosphate. ,
  • a medicament characterized by:
  • the screening kit according to (16) which comprises a membrane fraction of a cell containing the G protein-coupled receptor protein according to (1), (52) the screening kit according to (7).
  • (53) Altering the binding property between the ligand and the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof according to (1), which can be obtained using the screening kit according to (50) to (52).
  • a medicine characterized by containing a salt thereof is characterized by containing a salt thereof
  • the present invention also provides a method for measuring the activity of the G protein-coupled receptor protein described in (1) above, the partial peptide described in (2) above, or a salt thereof in a test solution.
  • FIG. 1 is a hydrophobicity plot of TGR7.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in one-letter code.
  • FIG. 3 is a graph showing the tissue distribution of TGR7 expression.
  • the G protein-coupled receptor protein (hereinafter sometimes abbreviated as receptor protein) of the present invention has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (FIG. 2). Contains receptor protein.
  • the receptor protein of the present invention may be, for example, any of human (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, pig, monkey, etc.) cells (eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, etc.).
  • human eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, pig, monkey, etc.
  • cells eg, spleen cells, nerve cells, glial cells, etc.
  • the brain each part of the brain (e.g., olfactory bulb, nucleus planis, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum, occipital
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein of the present invention having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferred.
  • Examples of substantially the same activity include a ligand binding activity and a signal transduction activity. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 20 times). However, the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and signal transduction can be performed according to a method known per se.
  • the activity can be measured according to a ligand determination method or a screening method described later.
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) one or more or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30; more preferably, about 1 to 10; More preferably, an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been deleted. (2) One or more (preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 , More preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids, and 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide labeling.
  • the receptor proteins of the present invention including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, usually have a C-terminus of a carboxyl group (one CO OH) or a hydroxyl group (one COO—).
  • C-terminal may be an amide (one C ONH 2) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, ⁇ 6 alkyl group such as isopropyl or n- heptyl, for example, Shikuropen Chill, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, - Nafuchinore such.
  • Arinore group for example, Benjinore, such as phenethyl phenylene Lou C i _ 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc. ⁇ - Nafuchiru C - 2 other ⁇ 7 _ 1 4
  • Ararukiru group such as an alkyl group, as an oral ester A commonly used bivaloyloxymethyl group or the like is used.
  • the receptor protein of the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) at a position other than the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the receptor protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the receptor protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups Mechionin residues of ⁇ -terminus (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - such Ashiru group such as 6 Arukanoiru group) protected Glutamyl group generated by cleavage of the N-terminal side in vivo, pyroglutamic acid substituted, Substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, 1OH, 1SH, amino group, imidazole group, indole group, etc.
  • Mechionin residues of ⁇ -terminus e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - such Ashiru group such as 6 Arukanoiru group
  • Mechionin residues of ⁇ -terminus protected Glutamyl group generated by cleavage of the N-terminal side in vivo, pyroglutamic acid substituted
  • Guaejino group appropriate protecting groups (e.g., formyl groups, C E, such as C 2 -6 Al force Noiru groups such Asechiru - those are protected by like 6 Ashiru group), or a sugar It also includes complex proteins such as so-called glycoproteins with linked chains.
  • protecting groups e.g., formyl groups, C E, such as C 2 -6 Al force Noiru groups such Asechiru - those are protected by like 6 Ashiru group
  • C E formyl groups
  • C E such as C 2 -6 Al force Noiru groups such Asechiru - those are protected by like 6 Ashiru group
  • complex proteins such as so-called glycoproteins with linked chains.
  • the receptor protein of the present invention for example, a receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as a partial peptide) may be any peptide as long as it is the partial peptide of the receptor protein of the present invention described above.
  • the receptor protein molecules of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobicity plot analysis. Is a peptide. Also, A peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acids in the amino acid sequence constituting the receptor protein of the present invention. Peptides having a sequence are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence refers to an amino acid sequence of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, and particularly preferably Indicates an amino acid sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • the “substantially equivalent activity” can be measured in the same manner as described above.
  • one or more (preferably about 1 to 10 and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence are deleted.
  • one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence.
  • 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids. May be.
  • the partial peptide of the present invention usually has a carboxyl group (—CO OH) or a carboxylate (one COO) at the C-terminus. It may be NH 2 ) or an ester (one COOR).
  • the partial peptide of the present invention has a N-terminal methionine residue whose amino group is protected with a protective group, and a N-terminal side which is cleaved in vivo as in the receptor protein of the present invention.
  • the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called sugar peptide to which a sugar chain is bonded.
  • the C-terminus is usually a carboxyl group (-COOH) or a carboxylate (one COO-one). It may be NH 2 ) or an ester (one COOR).
  • Examples of the salt of the receptor protein of the present invention or its partial peptide include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, shinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human or mammalian cells or tissues by a method for purifying a receptor protein known per se, or the receptor of the present invention described later. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding a protein. Also, the protein can be produced by the protein synthesis method described later or according to it.
  • the human or mammalian tissues or cells When producing from human or mammalian tissues or cells, the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis For the synthesis of the receptor protein of the present invention, its partial peptide, its salt, or its amide, a commercially available resin for protein synthesis can be used.
  • Such lusters include chloromethinole resin, hydroxymethinole luster, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4, dimethoxyphenyl-1-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2,4,1-dimethoxyphenyl) Fmoc aminoethyl) phenoxy resin, etc.
  • a resin an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • various protecting groups are removed at the same time, and an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carpoimides DCC, N, N'-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N, 1- (3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like are used.
  • These activations involve the addition of a protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB i :, HOOB t) or as a symmetric anhydride or HOB t ester or HOOB t ester. It can be added to the resin after the protected amino acid has been activated in advance.
  • the solvent used for the condensation of the protected amino acid with the activated resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; ditrinoles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof are used. .
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, B oc, tertiary pentyl oxycarbonyl, isoboroxycarbonyl, 4-methoxybenzyl / reoxycanoleponinole, CIZ, Br-Z, and adamantino.
  • Reoxycanoleponinole trifluoromethyl acetyl, phthaloyl, honolemil, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group is, for example, an alkyl ester ester (for example, methyl, ethyl, propyl, pentinole, tertiary pentinole, cyclopentinole, cyclohexinole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl ester ester for example, methyl, ethyl, propyl, pentinole, tertiary pentinole, cyclopentinole, cyclohexinole, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Branched or cyclic alkyl esterification branched or cyclic alkyl esterification
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzinole ester, 4-methoxybenzinole ester, 4-methyl benzyl ester, Benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyloxycarbol hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide amide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbol group, and an ethoxycarbonyl group is used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydroviranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B zl, C l 2 _B zl, 2-- Torobenjiru, Br @ - Z, such as tertiary butyl is used.
  • Examples of the protecting group for imidazole of histidine include, for example, Tos, 4-methoxy-2,
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • anisol for example, anisol, phenone, thioanisone, meta-cresone, terephthalone, dimethino
  • a cation capture agent such as resnosulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, and the like.
  • 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is replaced with 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above.
  • a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length.
  • a protein was prepared by removing only the protecting group of the ⁇ ⁇ -terminal hamino group of the peptide chain, and a protein was obtained by removing only the protecting group of the C-terminal lipoxyl group.
  • a mixed solvent Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • Protected protein obtained by condensation After purification, all the protecting groups are removed by the above method to obtain a desired crude protein. This crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • an ester of a protein for example, after condensing the carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is converted in the same manner as the amide of the protein.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptide.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
  • the target peptide can be produced by condensing the peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protective group, removing the protective group to produce the desired peptide.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, 'distillation', column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc. .
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. be able to.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention. .
  • the polynucleotide is DNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. If single stranded, it may be the sense strand (ie, coding strand) or the antisense strand (ie, non-coding strand).
  • the receptor protein of the present invention can be prepared, for example, by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto. It is possible to quantify the mRNA of this.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cDNA derived from cells and tissues, the above-described cDNA library derived from cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, and phagemid. It is also possible to directly amplify by direct Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention is, for example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a highly stringent DNA with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a DNA encoding a receptor protein having a base sequence that hybridizes under the conditions and having substantially the same activity as the receptor protein of the present invention eg, ligand binding activity, signal transduction action, etc. Any one may be used.
  • DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Most preferably, at least about 95% homology
  • DNA containing a base sequence having Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be done according to. When a commercially available library is used, the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringency conditions.
  • the no-stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C., preferably about 6 to 70 ° C.
  • the condition of 0 to 65 ° C is shown.
  • the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • a polynucleotide comprising a part of the base sequence of the DNA encoding the receptor protein of the present invention or a part of the base sequence complementary to the DNA is defined as the following partial peptide of the present invention. It is used to mean not only encompassing DNA but also encompassing RNA.
  • an antisense 'polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene is cloned, or encodes a determined G protein-coupled receptor protein. It can be designed and synthesized based on DNA base sequence information.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the G protein-coupled receptor protein gene and has the ability to inhibit the synthesis or function of the RNA, or the G protein-coupled receptor protein-related
  • the expression of G protein-coupled receptor protein gene can be regulated and controlled through the interaction with RNA.
  • a polynucleotide complementary to the selected sequence of the G protein-coupled receptor protein-related RNA and a polynucleotide specific to the G protein-coupled receptor-protein-associated RNA.
  • the polynucleotide that can be used is useful for regulating and controlling the expression of a G protein-coupled receptor protein gene in vivo and in vitro, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. Between nucleotides, base sequences or nucleic acids and peptides (proteins)
  • “Corresponding” usually refers to the amino acids of a peptide (protein) as directed by a nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • G protein-coupled receptor protein gene 5'-end hairpin loop, 5, 6-basepair 'repeat, 5, untranslated region, polypeptide translation initiation codon, protein coding region, ORF translation initiation codon, 3, Terminal untranslated region, 3, terminal palindromic region, and
  • the terminal hairpin loop can be selected as a preferred target region, but any region within the G protein-coupled receptor protein gene can be selected as the target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region is as follows: The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide capable of hybridizing with the target is
  • Antisense polynucleotides are 2-deoxy-D-report-containing polydeoxynucleotides, D-ribose-containing polydeoxynucleotides, N-glycosides of purine or pyrimidine bases, and others. Or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special linkages
  • the polymer contains a nucleotide having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and also DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides.
  • oligonucleotides or even those with known modifications, such as those with labels, caps, methylated, one or more of which are known in the art.
  • nucleoside may include not only purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also have modified sugar moieties, e.g., one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens and aliphatic groups, or ethers, amines, etc. May be converted into a functional group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives and thiophosphoate derivatives of nucleic acids, and those that are resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make the toxic life of sense nucleic acids smaller.
  • the antisense nucleic acid of the present invention may contain a modified sugar, a base, or a bond, and may be provided in a special form such as ribosome or microsphere, or may be applied by gene therapy. Or can be given in an added form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( For example, crude water-based substances such as phospholipids and cholesterols can be mentioned.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cornoleic acid, etc.). These are the three ends of nucleic acids or
  • RNA molecules can be attached to the 5 'end, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or 5' end of nucleic acids, which prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNAses. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene dalicol.
  • the inhibitory activity of an antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of a G protein-coupled receptor protein. it can.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • any of a genomic DNA, a genomic DNA library, a cDNA derived from the above-described cells and tissues, a cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and a synthetic DNA can be used.
  • the vector used for the library may be any of batteriophage, brassmid, cosmid, phagemid and the like.
  • reverse transcriptase was prepared directly using the mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above. It can also be amplified by Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method).
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) ) It has a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has substantially the same activity as the receptor protein peptide of the present invention (eg, ligand binding activity, signal signal transduction) DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a receptor protein having an action or the like is used.
  • the DNA capable of hybridizing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 95% or more is used.
  • the partial nucleotide sequence of the receptor protein of the present invention is used.
  • C Selection can be made by hybridization with those labeled. Hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning J 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • Conversion of the DNA base sequence is performed using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -super Express KmG (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the ODA-LA PCR method. , Gupped duplex method, Kunkel method, etc. It can be performed according to a method according to the above.
  • the DNA encoding the cloned receptor protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be digested with a restriction enzyme, if desired, or added with a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on its 5, terminal side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on its 3 'terminal side. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the receptor protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the receptor protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting to Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmid (Eg, pSH19, pSH15), pacteriophage such as phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAlll, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I / Ne, etc. are used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg,
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRo when animal cells are used as host, SRo; promoter, SV40 promoter, LTR open motor, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned. Of these, CMV promoter, SR promoter and the like are preferably used. If the host is Escherichia, trp promoter, lac motor, recA promoter, etc.
  • ⁇ Mouth motor, lpp promoter, etc.
  • SP01 promoter, SP02 promoter motors, such as p en p promoter if the host is yeast, PHO5-flops opening motor, PGK promoter, GAP promoter, an ADH promoter which is preferred.
  • the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) may be used. Can be used.
  • the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Am p r), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G41 8 resistance).
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • MTX metalhotrexate
  • Am p r ampicillin phosphorus resistant gene
  • Ne omycin resistant gene hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G41 8 resistance
  • the target gene can be selected using thymidine-free medium or medium. If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention.
  • the host is a genus Escherichia, the PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, the human amylase 'signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In the case of yeast, the MFa 'signal sequence, SUC2' signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, the insulin signal sequence, interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available for each.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, but are not limited to, Escherichia coli Kl 2 ⁇ DH1 Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research. (Nucleic Acids Research), Vol. 9, 309 (1981)], JA 221 [Journal of Ob ⁇ Molecular ⁇ Biology
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus subtilis MI 114 (Gene, Vol. 24, 255 (1983)), 207-21
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-1, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, and Schizosaccharomyces pombe NC YC 191 3, NCYC2036 And Pichia pastoris.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from egg of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • a silkworm-derived cell line (Bombyx raori N; BmN cell) is used.
  • Sf cell examples include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (Vaughn, J ⁇ et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell), Mouse L cells, mouse AtT_20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells Are used.
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cell
  • Mouse L cells mouse AtT_20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. , 2110 (1972) and Jean
  • Bacillus spp. Can be carried out, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, 11 (1979).
  • a liquid medium is suitable as a culture medium, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, and power.
  • Inorganic or organic substances such as zein, meat extract, soybean meal, and potato extract, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Obseptimen, Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3] 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually carried out at about 15-43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • Burkholder's minimal medium for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., "Procedures of the National 'Academy' Op. Sciences of the U.S.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)]
  • SD medium [Bitter containing 0.5% casamino acid, GA, et al., "Pro sheathing's O blanking the National Academy O Breakfast, Saienshiizu-O-flops-the-Interview one SA (p roc. Natl. Acad. Sci. USA), 81, 5330 (198 4)]
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5 to 8.
  • Culture is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 24 to When culturing insect cells or transformants whose host is insects, use Grace s Insect Medium (Grace, TCC, (Nature), 195, 788 (1962).
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4 V ⁇ . Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • a medium such as about 5
  • the pH is preferably about 6-8.
  • Culture is usually about 30 ° C to 40 ° C. Perform at C for about 15-60 hours, adding aeration and agitation as needed.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced in the transformant, in the cell membrane, or outside the cell. Isolation and purification of the receptor protein of the present invention from the above culture can be performed, for example, by the following method.
  • the receptor protein of the present invention When extracting the receptor protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are disrupted by, for example, centrifugation or filtration, a method of obtaining a crude extract of the receptor protein is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • the receptor protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Method using difference in molecular weight Method using charge difference such as ion-exchange chromatography, Method using specific novelty such as affinity mouth chromatography, Reverse phase high-performance liquid mouth chromatography
  • a method using a difference in hydrophobicity such as a method using an isoelectric point difference method such as an isoelectric focusing method is used.
  • the receptor protein obtained by force When the receptor protein obtained by force is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the receptor protein is obtained in a salt, a method known per se Alternatively, it can be converted into a free form or another salt by a method analogous thereto.
  • the receptor protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the receptor protein of the present invention or a salt thereof produced by force can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzymimnoassay using a specific antibody.
  • the antibody against the receptor protein or its partial peptide or its salt of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the receptor protein or its partial peptide or its salt of the present invention. You may.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof may be a known antibody or a known antibody using the receptor protein or the like of the present invention as an antigen. It can be produced according to the antiserum production method. [Preparation of monoclonal antibody]
  • the receptor protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from the mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting the antiserum with a labeled receptor protein described below and measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, Vol. 256, p. 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP 2/0 and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells used is preferably about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at about 20 to 40 ° C., preferably about 30 to 37 ° C. for about 1 to 10 minutes.
  • Various methods are used for screening hybridomas producing monoclonal antibodies.
  • an anti-immunoimmunoassay is performed by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen such as a receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like.
  • a solid phase eg, a microplate
  • an antigen such as a receptor protein is directly or adsorbed together with a carrier, and then labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like.
  • a globulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice
  • protein A anti-immunoglutin antibody
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • RPM 1 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, 1 to: GIT medium containing 0% L fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Co., Ltd.) or serum-free medium for hybridoma cultivation (SFM—101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies, such as immunoglobulin separation and purification [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (ex. , DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific antibody that is collected by using an active adsorbent such as protein A or protein G to dissociate the bond and obtain the antibody. Purification method].
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (ex. , DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific antibody that is collected by using an active adsorbent such as protein A or protein G to dissociate the bond and obtain the antibody. Purification method].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a receptor protein) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting the antibody content and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten depend on the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. If possible, any kind of crosslinking may be used in any ratio.For example, serum albumin, thyroglobulin, keyhole, lindet, hemocyanin, etc. are converted into hapten 1 by weight. On the other hand, about 0.:! A method of coupling at a rate of about 20 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • glutaraldehyde-carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide thereof or a salt thereof, and a DNA encoding the receptor protein or a partial peptide thereof may be (1) Determination of ligand (agonist) for G protein-coupled receptor protein of the present invention, (2) prevention and / or therapeutic agent for disease associated with dysfunction of G protein-coupled receptor protein of the present invention, (3) Gene diagnosis (4) a method for screening a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof, (5) a compound that changes the expression level of the receptor protein or a partial peptide thereof of the present invention A preventive and / or therapeutic agent for various diseases, comprising (6) a method for quantifying a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, and (7) a binding between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand.
  • G protein-coupled receptor proteins of the present invention A prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, antagosto) that changes the binding property to a ligand, (9) quantification of the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt (10) a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane; (11) changing the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane (12) Neutralization by an antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, (13) G protein-coupled receptor of the present invention It can be used for producing non-human animals having a DNA encoding a protein.
  • the binding of a ligand to a G protein-coupled receptor specific to humans and mammals can be improved.
  • the compound to be changed eg, agonist, antagonist, etc.
  • the agonist or antagonist can be used as an agent for preventing or treating various diseases.
  • a DNA encoding the receptor protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention
  • a DNA encoding the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof hereinafter referred to as the present invention.
  • DNA) and antibodies against the receptor protein of the present invention hereinafter referred to as the antibody of the present invention
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide or a salt thereof of the present invention is useful as a reagent for searching for or determining a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or a salt thereof. It is.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, which comprises contacting the receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , opioid, purine, vasoprescin, oxitocin, ⁇ ACAP, secretin, gnoretin) Gon, canolecithinin, adrenomedullin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (basoactive intestinal and related polypeptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcito) Ningene relayed peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and] 3—chemokine (eg, IL-8, GROa, GROj3, G
  • Tissue extracts of humans or mammals for example, mice, rats, pigs, porches, sheep, monkeys, etc.
  • cell culture supernatants and the like are used.
  • the tissue extract, cell culture supernatant, or the like is added to the receptor protein of the present invention, and fractionation is performed while measuring cell stimulating activity and the like, so that a single ligand can be finally obtained.
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and by using the receptor conjoining Assi system using, bound to cell stimulating activity to the receptor protein of the present invention (e.g., Araki Don acid release, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP generation, cell C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc. Protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or a salt thereof.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and by using the receptor conjoining Assi system using, bound to cell stimulating activity to the receptor protein of the present invention (e.g., Araki
  • the test compound when the test compound is brought into contact with the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof, for example, the binding amount of the test compound to the receptor protein or the partial peptide, the cell stimulating activity, It is characterized by measuring such as
  • the present invention provides:
  • a method for determining a ligand for a receptor protein or a salt thereof of the present invention which comprises measuring the amount of binding to a peptide or a salt thereof;
  • the labeled test compound When the labeled test compound is brought into contact with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention, the labeled test compound
  • the receptor protein of the present invention is characterized by measuring the amount of binding to the receptor protein or a salt thereof. How to determine the ligand for,
  • ⁇ Cellular stimulatory activity via the receptor protein when the test compound is brought into contact with cells containing the receptor protein of the present invention eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AMP generation, intracellular c GM
  • Receptor protein-mediated cell stimulation when a test compound is brought into contact with a receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • activity e.g., Arakido phosphate free, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P generation, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins Activating or inhibiting c-fos, lowering pH, etc.
  • activity e.g., Arakido phosphate free, Asechirukorin release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P generation, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins Activating or inhibiting c-fos, lowering pH, etc.
  • the receptor protein used in the ligand determination method may be any one containing the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention.
  • the expressed receptor protein is suitable.
  • the above-mentioned expression method is used to produce the receptor protein of the present invention, but it is preferable to express the DNA encoding the receptor protein in mammalian cells ⁇ insect cells.
  • Complementary DNA is usually used as the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the receptor protein of the present invention In order to introduce DNA fragments encoding the protein into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragments must be expressed by nuclear polyhedrosis virus; a baculovirus belonging to an insect host.
  • NMV polyhedrin promoter
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retrovirus promoter metallothionein promoter
  • human heat shock promoter cytomegaloinores promoter
  • SRa promoter SRa promoter
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method is performed according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological 'Chemistry, 267, 19555-19559, 1992]. be able to.
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof may be a receptor protein or a partial peptide thereof or a salt thereof purified according to a method known per se.
  • a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
  • the cell When a cell containing the receptor protein of the present invention is used in the method for determining a ligand of the present invention, the cell may be fixed with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell expressing the receptor protein of the present invention.
  • a host cell Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like are used.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Warlinda blender Polytron (manufactured by Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, pressing the cells from a thin nozzle while pressing with a French press, etc. Fragmentation caused by shaking is included.
  • a fractionation method using a centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is kept at low speed (500 rpm ⁇ 3 000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes).
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor protein in the cell containing the receptor protein or in the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • the higher the expression level the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
  • receptor protein fraction a naturally occurring receptor protein fraction or a recombinant receptor fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention first, cells or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein of the present invention are suspended in a buffer suitable for the determination method.
  • a buffer suitable for the determination method such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) and a buffer of Tris-monohydrochloride.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao Ichi Atlas), digitonin, and deoxycholate are used to reduce non-specific binding.
  • Various proteins such as serum albumin and gelatin are buffered.
  • protease inhibitors such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and papstatin can be added to suppress the degradation of receptors and ligands by proteases.
  • the reaction is performed at about 0 ° C. to 50 ° C., preferably about 4 ° C. to 37 ° C., for about 20 minutes to 24 hours, preferably about 30 minutes.
  • a test compound having a count (B-NSB) exceeding 0 cpm obtained by subtracting the nonspecific binding amount ( ⁇ SB) from the total binding amount ( ⁇ ) is a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or a salt thereof.
  • a cell stimulating activity through the receptor protein eg, Eg to Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, of c- fos activity Activity or activity that promotes or suppresses pH reduction, etc.
  • a cell stimulating activity through the receptor protein eg, Eg to Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP production, intracellular c GMP product, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, of c- fos activity Activity or activity that promotes or suppresses pH reduction, etc.
  • a known method or a commercially available measurement kit Specifically, first, cells containing the receptor protein are cultured on a multiwell plate or the like.
  • the cells Before determining the ligand, replace the cells with a fresh medium or one that is not toxic to cells, replace with an appropriate buffer, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, then extract the cells or recycle the supernatant. And quantitate the product produced according to each method. If the production of a substance that serves as an indicator of cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) is difficult to perform due to the presence of a degrading enzyme contained in cells, an assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. Les ,. In addition, active 1 "activity such as inhibition of cAMP production can be detected as a production inhibitory effect on cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • an assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. Les ,.
  • active 1 activity such as inhibition of cAMP production can be detected as a production inhibitory effect on cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • a kit for determining a ligand that binds to a salt thereof contains the receptor protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, a cell containing the receptor protein of the present invention, or a receptor protein of the present invention. It contains the membrane fraction of the cells to be treated.
  • kits for determining a ligand of the present invention include the following.
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 ⁇ pore size filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 Z holes, and cultured at 37 ° C., 5% CO, and 95% air for 2 days. did thing.
  • Test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethyl honoleamide, DMSO, methanol, etc.
  • the ligand capable of binding to the receptor protein of the present invention or a salt thereof includes, for example, substances specifically present in the brain, pituitary gland, knee, and the like. Specifically, angiotensin, bomb, etc.
  • GCP-2 GCP-2, MCP_1, HC14, MCP-3, 1-309, MIP1 ⁇ , MIP-1j8, RANTES, etc.
  • endothelin enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, Pancreatic polypeptide, galanin, lysophosphatidic acid (LPA), sphingosine monomonophosphate, etc. are used.
  • the receptor protein of the present invention when the ligand for the receptor protein of the present invention becomes apparent, depending on the action of the ligand, (1) the receptor protein of the present invention or (2) DNA encoding the receptor protein It can be used as a medicament such as a preventive and / or therapeutic agent for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention when there is a patient in whom the physiological activity of ligand cannot be expected because the receptor protein of the present invention is reduced in a living body (deficiency of the receptor protein), (1) administering the receptor protein of the present invention to the patient; (2) administering the receptor protein of the present invention to a patient by expressing the receptor protein of the present invention, and (2) administering the receptor of the present invention to target cells.
  • the cells After inserting and expressing the DNA encoding the protein, the cells can be transplanted into the patient, for example, to increase the amount of the receptor protein in the patient's body and sufficiently exert the action of the ligand. That is, the DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic agent for preventing and / or treating diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is a rat protein which is a G protein-coupled receptor protein. About 36% and about 3%, respectively, at the amino acid sequence level in
  • the receptor protein of the present invention may be used for central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (eg, allergy, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina) Disease, arteriosclerosis, etc.), cancer (eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.), prevention of diabetes, etc. and Z or Useful for treatment.
  • central diseases eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.
  • inflammatory diseases eg, allergy, asthma, rheumatism, etc.
  • cardiovascular diseases eg, hypertension, cardiac hypertrophy, angina) Disease, arteriosclerosis, etc.
  • cancer eg, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.
  • prevention of diabetes etc. and Z
  • the receptor protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention when used as the above-mentioned preventive or therapeutic agent, the DNA of the present invention may be used alone or as a retrovirus. After insertion into a suitable vector such as a vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc., it can be carried out according to a conventional method.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting uptake, by a force gun such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • the receptor protein of the present invention or (2) DNA encoding the receptor protein may be orally or as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., coated with bran, if necessary. Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a sterile solution with another pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • the receptor protein of the present invention or (2) DNA encoding the receptor protein is generally used together with known physiologically recognized carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like. It can be manufactured by admixing it in the unit dosage form required for the approved formulation.
  • Excipients that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, anoregic acid Moon Peng like Lubricants such as dandruff, magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, anoregic acid Moon Peng like
  • Lubricants such as dandruff, magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mantol, sodium salt, etc.) and the like are used.
  • appropriate dissolution aid such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 8 0 TM, HCO- 5 0) such as in combination May be.
  • sesame oil, soybean oil, and the like are used as the oily juice, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalcodium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, , Human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dose of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a patient with cancer (assuming 60 kg) per day, About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, and more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • injection it is usually used for cancer patients (as 60 kg).
  • the dose can be administered in terms of .60 kg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, the target organ, the condition, the administration method, and the like. It is about 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, usually in the form of injection, for example, in cancer patients (60 kg). It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to about 0 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce the receptor protein of the present invention in humans or mammals (for example, rat, mouse, rabbit, sheep, sheep, pig, pig, cat, dog, monkey, etc.) or its receptor protein. Since abnormalities (gene abnormalities) in DNA or mRNA encoding partial peptides can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, increase in the DNA or mRNA or It is useful as a diagnostic agent for genes such as overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), The Seatings of Ob * The National Academy of Obs. )).
  • the DNA of the present invention when used as a probe, can be used for screening for a compound that changes the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide.
  • the present invention provides, for example, (i) a non-human mammal's (2) blood, (2) a specific organ, (3) a tissue or cell isolated from an organ, or (ii) a receptor protein of the present invention contained in a transformant or the like.
  • the present invention provides a method for screening a compound that alters the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention by measuring the mRNA level of its partial peptide.
  • the measurement of the mRNA amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide is specifically carried out as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, higgins, puta, rabbits, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark)
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark
  • blood or specific organs eg, brain, liver, kidney, etc.
  • tissues or cells isolated from the organs are obtained.
  • the mRNA of the receptor protein or its partial peptide of the present invention contained in the obtained cells can be quantified by, for example, extracting mRNA from cells or the like by a usual method and using, for example, a technique such as TaqManPCR.
  • the angle analysis can also be performed by performing Northern blotting by a means known per se.
  • a transformant that expresses the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above-described method, and the mRNA of the receptor protein of the present invention or the partial peptide thereof contained in the transformant is similarly prepared. It can be quantified and analyzed.
  • the present invention changes the expression level of the receptor protein or its partial peptide of the present invention. Screening of things
  • a given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered at the same time as the target stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cells (Ii) quantifying and analyzing the amount of mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in (i).
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the transformant This can be done by quantifying and analyzing the amount.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is a compound having an action of changing the expression level of the receptor protein or a partial peptide thereof of the present invention.
  • G protein-coupled receptor e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP produced , intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c one fos, enhances like activity or inhibiting activity
  • G protein-coupled receptor e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AMP produced , intracellular c GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c one fos, enhances like activity or inhibiting activity
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the physiological activity of the receptor protein or the like of the present invention.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be performed according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egrets, sheep, stags, dogs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, egrets, sheep, stags, dogs, cats, dogs, dogs, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in a cancer patient (as 6 O kg), About 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that alters the expression level of the receptor protein or a partial peptide thereof of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, the compound that alters the expression level of the receptor protein of the present invention or its partial peptide can be used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the compound is used for preventing a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • a therapeutic agent it can be formulated according to conventional means.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid, if necessary. It can be used parenterally or in the form of injections, such as suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, S-shaped agents, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form generally required for the practice of the formulation. By doing so, it can be manufactured.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained. Examples of additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mantol, sodium chloride, etc.).
  • Solubilizing agents for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM , HCO-5)
  • the oily raw liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agent include a buffer (for example, a phosphate buffer and a sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, Shiridani benzalkonium, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (for example, It may be combined with human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dosage of the compound or its salt varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (as 60 kg), Is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • a cancer patient (as 6 O kg) Of about 0.01 to 3 O mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient.
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the subject can be measured by bringing the subject into contact with the receptor protein or the like of the present invention. Specifically, for example, it can be used according to the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • Such compounds, (I) via the G protein-coupled receptor-mediated cell-stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + free, intracellular c AM P generation, intracellular c Compounds that have GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, etc.
  • Agonists for the receptor protein of the present invention (Agonists for the receptor protein of the present invention), (mouth) compounds having no cell stimulating activity (so-called antagonists to the receptor protein of the present invention), (c) ligands and the G protein-coupled receptor protein of the present invention
  • a compound that enhances the binding force or (ii) a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention Include (The compound of the above (I) is preferably screened by the ligand determination methods described above).
  • the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is contacted with a ligand; and (ii) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is contacted. And a compound which changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, or a salt thereof, which is compared with a case where the ligand and the test compound are brought into contact with each other.
  • a screening method is provided.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of a ligand bound to the receptor protein and the like, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared. More specifically, the present invention provides (1) When the labeled ligand is brought into contact with the receptor protein or the like of the present invention, or when the labeled ligand or test compound is brought into contact with the receptor protein or the like of the present invention, the receptor of the labeled ligand is A method of measuring and comparing the amount of binding to a protein or the like, and a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding between the ligand and the receptor protein or the like of the present invention;
  • a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention for example, a ligand for the receptor protein or the like of the present invention
  • a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • a cell obtained by contacting the receptor protein or the like of the present invention with a receptor protein of the present invention or a test compound and a transformant containing the DNA of the present invention on a cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • Cell contact stimulating activity through the receptor for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, Inhibits or promotes inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc.
  • a method for screening a compound or a salt thereof, which alters the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention which are characterized by measuring and comparing the activities thereof.
  • a candidate such as a rat or the like containing cells, tissues or cell membrane fractions containing the G protein-coupled receptor protein is used.
  • a compound was obtained (primary screening), and then a test (secondary screening) was required to confirm whether the candidate compound was capable of actually inhibiting the binding between human G protein-coupled receptor protein and ligand. . If the cell, tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, so that it was difficult to actually screen for an agonist or antagonist against the target receptor protein.
  • the human-derived receptor protein of the present invention by using the human-derived receptor protein of the present invention, primary screening is not required, and a compound that inhibits binding between a ligand and a G protein-coupled receptor protein can be efficiently screened. . Furthermore, it is possible to easily evaluate whether the screened compound is an agonist or an antagonist.
  • the receptor protein and the like of the present invention used in the screening method of the present invention Any protein may be used as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention, but a cell membrane fraction of a mammalian organ containing the receptor protein, etc. of the present invention is preferable. is there. Since human-derived organs are particularly difficult to obtain, it is suitable for screening to use human-derived receptor proteins, etc., which are expressed in large amounts using recombinants.
  • the above-mentioned method is used for producing the receptor protein and the like of the present invention, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells. Complementary DNA is used for the DNA fragment encoding the target protein portion, but is not necessarily limited thereto.
  • gene fragments or synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment In order to introduce a DNA fragment encoding the receptor protein of the present invention into a host animal cell and express them efficiently, the DNA fragment must be transformed into a nuclear polyhedrosis virus belonging to a paculovirus using an insect as a host. Incorporate into the downstream of the polyhedrin promoter of nuclear polyhedrosis virus (NPV), SV40-derived promoter, retrovirus promoter, meta-oral thionine promoter, human heat shock promoter, cytomegaloinores promoter, SRa promoter, etc. Is preferred.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the method can be carried out according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal Off, Biological 'Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 19555-19559, 1992]. it can.
  • the protein containing the receptor protein or the like of the present invention may be a receptor protein or the like purified according to a method known per se, or a cell containing the receptor protein or the like. Alternatively, a membrane fraction of a cell containing the receptor protein or the like may be used.
  • the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin, or the like. The fixing method can be performed according to a method known per se.
  • Cells containing the receptor protein of the present invention include the receptor protein and the like.
  • the host cell is preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se. Potter—
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 r ⁇ ! ⁇ 3000 rpm) for a short time (usually about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further accelerated.
  • the membrane fraction is rich in expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor protein in a cell or membrane fraction containing the receptor protein or the like is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • an appropriate receptor protein fraction and a labeled ligand are required. It is.
  • the receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having the same activity as the fraction.
  • “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction activity and the like.
  • the labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a receptor protein preparation is prepared by suspending a cell or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein or the like of the present invention in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein, such as a tris-monohydrochloride buffer.
  • CHAPS, Tween- 80 ⁇ ⁇ (Kao one Atlas Co.), digitonin also be added to the server Ffa a surfactant such as Dokishikoreto.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), or papstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor and the ligand by the protease.
  • PMS F, leptin, E-64 manufactured by Peptide Research Institute
  • papstatin can be added for the purpose of suppressing the degradation of the receptor and the ligand by the protease.
  • NBS non-specific binding
  • the reaction is carried out at about 0 ° C. to 50 ° C., preferably about 4 ° C. to 37 ° C., for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the mixture is filtered with a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a 0_ counter.
  • Count (B.) force when there is no antagonistic substance ⁇ Specific binding amount (B-NSB) force when the count (B.-one NSB) minus the non-specific binding amount (NSB) is 100%
  • B-NSB Specific binding amount
  • a test compound having 50% or less can be selected as a candidate substance having a competitive inhibitory ability.
  • a cell stimulating activity via a receptor protein for example, arachidonic acid release
  • Acetylcholine release for example, arachidonic acid release
  • intracellular Ca release for example, a cell stimulating activity via a receptor protein (for example, arachidonic acid release) Acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc.
  • Activity or inhibitory activity can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the receptor protein or the like of the present invention are cultured on a multi-well plate or the like.
  • cells expressing the appropriate receptor protein are required.
  • the cells expressing the receptor protein of the present invention cell lines having the natural receptor protein of the present invention, cell lines expressing the above-mentioned recombinant receptor protein, etc. are desirable.
  • test compounds for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. are used. Or a known compound.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding between the ligand and the receptor protein of the present invention includes cells containing the receptor protein of the present invention, the receptor protein of the present invention, or the present invention. And those containing the membrane fraction of cells containing receptor proteins and the like.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air for 2 days.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound having an action of changing the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention.
  • G protein coupled receptions coater through a cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GMP, production of inositol phosphate,
  • a cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GMP, production of inositol phosphate,
  • Examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the agonist against the receptor protein or the like of the present invention has the same activity as the physiological activity of the ligand for the receptor protein or the like of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the ligand activity. is there.
  • the antagonist to the receptor protein or the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand to the receptor protein or the like of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the ligand activity.
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like. .
  • the compound that reduces the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the ligand for the receptor protein or the like of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-mentioned drug containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dosage of the compound or its salt varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cancer patient (as 60 kg), Is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. Is about 0.01 to 3 O mg per day, preferably about 0.1 to about 20 mg, and more preferably about 0.1 to about 0 mg by intravenous injection. It is convenient. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, antagonist) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein and the ligand of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention is considered to play some important role in vivo such as central function. Therefore, the conjugate (agonist, antagonist) of the present invention that alters the binding property between the receptor protein and the ligand is an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. Can be used as
  • the compound when used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc., orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid, if necessary. It can be used parenterally or in the form of injections, such as suspensions.
  • the compound can be used together with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, P-preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of preparations. It can be manufactured by mixing.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. And sucrose, lactose or saccharine, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing pudose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mantol, chlorinated sodium) and the like are used.
  • Do dissolution aid such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 8 0 TM, HCO - 5 0 ) , such as a combination You may.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, Shiridani benzalkonium, procaine hydrochloride). ), Stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • the daily dose is generally one day.
  • About 0.1 to 10 Omg preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.:! To 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof Since the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention, the receptor of the present invention in a test solution It can be used for quantification of proteins and the like, particularly for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention provides, for example,
  • the present invention provides a method for quantifying the receptor protein of the present invention in a test solution.
  • one of the antibodies binds to the N-terminal of the receptor protein or the like of the present invention. It is preferable that the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the receptor protein or the like of the present invention.
  • the receptor protein and the like of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the receptor protein and the like of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining and the like. .
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen corresponding to the antigen amount (for example, the amount of the receptor protein) in the test solution. Any measurement method may be used as long as the amount of the complex is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. .
  • nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, and in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use the San Germanti method described later.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme is preferably a stable enzyme having a large specific activity. For example, ⁇ -galactosidase, ⁇ -darcosidase, anorecaliphosphatase, peroxidase, and lignoic acid dehydrogenase are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescein, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier include agarose, dextran, and cellulose. Any insoluble polysaccharide, polystyrene, polyacrylamide, synthetic resin such as silicon, or glass is used.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • the amount of the receptor protein of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the receptor protein or the like. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably used, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is preferably used. Is an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. Then (B / F separation), measure the amount of B or F label, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • B / F separation is performed using a polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody and the ability to use an immobilized antibody as the first antibody.
  • an immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • Anti The raw material is reacted with an excessive amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and a small amount of sediment cannot be applied, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the measurement system for the receptor protein or its salt of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, you can refer to reviews, written books, etc.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the dysfunction of the receptor protein of the present invention is Diagnosis of various diseases can be made.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and behavior of the receptor protein of the present invention in test cells It can be used for analysis and the like.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor protein of the present invention or its partial peptide or its salt, screening for a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane It can be used for
  • Non-human mammal 1) Blood, 2) Specific organs, 3) Tissues or cells isolated from the organs are destroyed, the cell membrane fraction is isolated, and the receptor of the present invention contained in the cell membrane fraction
  • a method for screening a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in a cell membrane by confirming the protein on the cell membrane is specifically determined as follows.
  • non-human mammals eg, mice, rats, rabbits, sheep, sheep, pigs, horses, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, Drugs (eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.) or physical stress (eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature)
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature
  • the obtained organ, tissue or cell is suspended in, for example, an appropriate buffer (for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, or Hase buffer) to destroy the organ, tissue or cell.
  • an appropriate buffer for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, or Hase buffer
  • a cell membrane fraction is obtained by using a surfactant (for example, Triton X100 TM , Tween 20 TM, etc.), and further using a method such as centrifugation, filtration and column fractionation.
  • a surfactant for example, Triton X100 TM , Tween 20 TM, etc.
  • a fractionation method using a centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (typically about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged (150 rpm to 1000 rpm).
  • the membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof contained in the cell membrane fraction can be quantified by, for example, using the antibody of the present invention, a sandwich immunoassay, western blot analysis, or the like.
  • a transformant expressing the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is prepared according to the above method, and the receptor protein of the present invention or its partial peptide contained in the cell membrane fraction can be quantified. Screening of a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane,
  • a given time before drug or physical stress is applied to a normal or disease model non-human mammal (30 minutes to 24 hours before, preferably 30 minutes to 12 hours before, Preferably 1 hour to 6 hours before) or after a certain time (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), or drug or physical
  • the test compound is administered at the same time as the target stress, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 24 hours), the cell membrane
  • test compound When culturing the transformant according to a conventional method, the test compound is mixed in the medium, and after culturing for a certain period of time (1 day to 7 days, preferably 1 day to 3 days, more preferably
  • non-human mammals for example, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc .; more specifically, dementia rats, obese mice, arteriosclerotic rabbits
  • Drugs eg, anti-dementia drugs, antihypertensive drugs, anti-cancer drugs, anti-obesity drugs, etc.
  • physical stress eg, flooding stress, electric shock, light / dark, low temperature, etc.
  • the obtained organ, tissue or cell is cut into a tissue section according to a conventional method, and immunostained with the antibody of the present invention.
  • the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be quantitatively or qualitatively determined. Can be confirmed.
  • the conjugate or a salt thereof obtained by the screening method of the present invention is a compound having an effect of changing the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane, and specifically, (A) By increasing the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane, the cell stimulating activity via a G protein-coupled receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca) 2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol tonoleric acid production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c_fos, decrease in pH, etc.
  • G protein-coupled receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca
  • (Mouth) to decrease the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane.
  • a compound that decrease the cell-stimulating activity examples include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the compound that enhances the cell stimulating activity may be a physiological activity such as the receptor protein of the present invention. It is useful as a safe and low toxic drug for enhancing the property.
  • the compound that attenuates the cell stimulating activity is useful as a safe and low toxic drug for reducing the physiological activity of the receptor protein of the present invention.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned pharmaceuticals containing the receptor protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like. However, in the case of oral administration, for example, in a cancer patient (assuming 60 kg), one dose is required. From about 0.1 to: 10 Omg per day, preferably from about 1.0 to 50 mg, more preferably from about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the subject, target organ, symptoms, administration method, etc., for example, in the form of injection, usually, for example, cancer patients (6 O kg) About -0.1 to 30 mg / day, preferably about 0.1 to 20 mg / day, more preferably about 0.1 to 10 mg / day by intravenous injection. It is. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • a preventive and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound that changes the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane
  • the receptor protein of this effort is considered to play some important role in vivo, such as central function. Therefore, a compound that alters the amount of the receptor protein of the present invention or its partial peptide in the cell membrane can be used as a prophylactic and / or therapeutic method for diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the compound when used as a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to a conventional method.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, if necessary, orally, or with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions or suspensions.
  • the compound can be used together with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a generally accepted unit dosage form required for practice of the formulation. It can be manufactured by mixing with. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained. Excipients that can be incorporated into tablets, forceps, etc.
  • Lubricant such as acid, etc., lubricant such as magnesium stearate, sucrose,? Sweetening agents such as sucrose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry may be used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous solution for injection examples include physiological saline, isotonic solution containing pudose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) aid such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 8 0 TM, HCO - 5 0 ) be used in combination with such Good.
  • auxiliary agents eg., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • aid such as an alcohol (e.g., ethanol), polyalcohol (e.g., propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 8 0 TM, HCO - 5 0 ) be used in combination with such Good.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • polyalcohol e.g., propy
  • the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum It may be blended with albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg.g, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like.
  • the daily dose is generally one day.
  • About 0.1 to 10 Omg preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • it is usually used, for example, in cancer patients (60 kg).
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the neutralizing activity of an antibody against the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof against the receptor protein or the like means an activity to inactivate a signal transduction function involving the receptor protein. I do. Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signal transduction involving the receptor protein, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release) , Intracellular cAMP production, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Activity to promote or suppress the decrease of pH, etc. ) Can be deactivated. Therefore, it can be used for prevention and / or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein and the like.
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release
  • a transgenic animal that expresses the receptor protein of the present invention or the like can be prepared.
  • Animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter sometimes abbreviated as animals). Mice, egrets and the like are preferred.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a promoter capable of being expressed in animal cells For example, in the case of transferring the DNA of the present invention derived from egret, the homology is high, and a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention derived from an animal in animal cells may be used.
  • a DNA-transferred animal that highly produces the receptor protein of the present invention can be produced by microinjection into a fertilized egg of egret.
  • this promoter for example, a virus-derived promoter, a ubiquitous expression promoter such as meta-mouth thionein, etc.
  • NGF gene promoter / genolase gene promoter specifically expressed in the brain is preferably used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the receptor protein or the like of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the receptor protein or the like of the present invention in all of the germ cells and somatic cells. I do.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the gene has the receptor protein of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by mating, it can be reared in an ordinary breeding environment as the DNA-bearing animal. Sa Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all progeny have the DNA. Breeding can be subcultured. Since the animal into which the DNA of the present invention has been transferred expresses the receptor protein of the present invention at a high level, it is useful as an animal for screening an agonist or an antagonist for the receptor protein of the present invention.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • the present invention can be performed. It can analyze receptor proteins and the like.
  • Cells of a tissue having the receptor protein or the like of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and the functions of cells from tissues that are generally difficult to culture such as those derived from the brain or peripheral tissues are used by these techniques. Can study.
  • the receptor protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases and amino acids are indicated by abbreviations, the abbreviations by the IUPA IUB Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviations used in the art are based on the abbreviations. .
  • optical isomer with respect to the amino acid the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • HONB 1-Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
  • DCC N, N'-Dicyclohexylcarposimid
  • FIG. 1 shows an amino acid sequence of a novel human-derived G protein-coupled receptor protein TGR7 of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human-derived G protein-coupled receptor protein TGR7 of the present invention.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of primer 1 used in the PCR reaction in Example 1 below.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of primer 2 used in the PCR reaction in Example 1 below.
  • Example 1 in the resulting transformant Esherihia coli (Escherichia coli) T0P10 / P CR2.1- TGR7 is, from May 1, 2000, under the Butape strike treaty, Ibaraki Prefecture, Tsukuba ⁇ 1 1-chome No. 1 At the 6th Independent Administrative Agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (I POD), accession number FERM BP-7151, and from April 2, 2000, Yodogawa, Osaka, Osaka Deposit number IFO 16422 has been deposited with the Institute for Fermentation (IFO) at 2-17-85, Jusanhoncho, Ward.
  • IFO Institute for Fermentation
  • PCR reaction was performed using two primers, Primer 1 (SEQ ID NO: 3) and Primer 2 (SEQ ID NO: 4).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was as follows, using the above cDNA as a 3 ⁇ l ⁇ type, Advantage-2 Polymerase Mix (CL0NTECH) ⁇ , Primer 1 (SEQ ID NO: 3) and Primer 2 (SEQ ID NO: 4) was added to each of 0.2 ⁇ l, dNTPmix to 200 ⁇ l, and the buffer attached to the enzyme to 5 ⁇ l to make a 50 il solution.
  • PCR reactions are performed at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds, 68 ° C 5 cycles of 2 minutes, 95 ° C30 seconds ⁇ .64 ° C30 seconds, 68 ° C30 cycles of 2 minutes 30 times, followed by extension reaction at 68 ° C for 7 minutes .
  • the PCR reaction product was cloned into a plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen) according to the prescription of TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli TOP10, and clones having cDNA were selected in LB agar medium containing ampicillin.
  • a cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein was obtained (SEQ ID NO: 2).
  • a novel G protein-coupled receptor protein having an amino acid sequence derived from the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 was named TGR7.
  • a transformant transformed with DNA containing DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 was transformed into Escherichia coli.
  • primers and probes are designed using Primer Express ver. 1.0 (PE Biosystems Japan), and the forward primer TGR7TQF (5 '-TTCGA ATGCA CAGGA ACCC-13, (SEQ ID NO: 5)), 5′-GGAAG CCATG CTGAA GAGGA A-3 ′ (SEQ ID NO: 6)) and TRP7TQP (5, ⁇ TTCTG CATCT ATATC CTCAA CCTGG CGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)) were prepared.
  • the reporter dye of the probe was applied with FAM (6-carboxyfluorescein).
  • PCR fragment obtained by amplifying pCR2.1-TGR7 into type I using primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4) was applied to the QIAquick PCR Purification Kit [QIAGEN (Germany)]. purification Te, were used to prepare the 10 o one 106 copies / ⁇ ⁇ .
  • the cDNA source for each tissue is Human Tissue cDNA Panel I and Panel II
  • TaqMan PCR was performed using Aq PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Biosystems Japan) using the reagent of TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems Japan) according to the attached instructions. The results are shown in Figure 3 and Table 1. TGR7 was highly expressed in testis.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof, and the polynucleotide encoding the receptor protein or its partial peptide are as follows: Determination of ligand (Agoest), (2) Acquisition of antibody and antiserum, (3) Construction of expression system for recombinant receptor protein, (4) Development of receptor binding assay system using the expression system and screening of drug candidate compounds, (5) Conduct drug design based on comparison with structurally similar ligands' receptors, ⁇ ⁇ Reagents for the preparation of probes and PCR primers in genetic diagnosis, ⁇ ⁇ Preparation of transgenic animals or 8 Gene prevention It can be used as a medicament for treatment ⁇ 3 ⁇ 4 etc. Sequence listing free text

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Description

明 細 書 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質およびその D NA 技術分野
本発明は、 ヒト肝臓由来の新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩 およびそれをコードする D N Aに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異 的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプター 蛋白質のうち多くは共役している guanine nucleotide- binding protein (以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行な レ、、 また、 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋 白質共役型レセプター蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプター蛋白質 （7 TM R) と ^称される。
G蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在 し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えば、 ホルモン、 神経伝達物質 および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプタ 一は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグナルに より細胞の賦活ゃ抑制といつた種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ ター蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにするこ とは、 各種生体の細胞や βの機能を解明し、 それら機能と密接に関連した医薬 品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達 物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれて いる。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応する レセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内には未だ未 知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらのレセプター 蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知 のレセプター蛋白質においてもサブタイプが存在するかどうかについても分かつ ていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプター蛋白質との 関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセ プター蛋白質に対するァゴニスト、 アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の 機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 c D NAの配列を ランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expressed Sequence Tag ( E S T) としてデータベースに登録 され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能 を推定することは困難である。 従来、 G蛋白質共役型レセプターと生理活性物質 （すなわち、 リガンド） との 結合を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （すなわち、 リガンド） と同様な シグナル伝達を引き起こす物質は、 これらレセプターの特異的なアンタゴニスト またはァゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従 つて、 このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品 開発の標的ともなりうる G蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、 その 遺伝子 （例えば c D NA) をクローニングすることは、 新規 G蛋白質共役型レセ プター蛋白質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アンタゴニストを見出す際に、 非常に重要な手段となる。
し力 し、 G蛋白質共役型レセプターはその全てが見出されているわけではなく、 現時点でもなお、 未知の G蛋白質共役型レセプター、 また対応するリガンドが同 定されていない、 いわゆるォーファンレセプターが多数存在しており、 新たな G 蛋白質共役型レセプターの探索およぴ機能解明が切望されている。
G蛋白質共役型レセプターは、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新たな生 理活性物質 （すなわち、 リガンド） の探索、 また、 該レセプターに対するァゴニ ストまたはアンタゴ-スト） の探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見 出されなくても、 該レセプターの不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセプ ターの生理作用を解析することにより、 該レセプターに対するァゴニストまたは アン ゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプターに対するリガ ンド、 ァゴニストまたはアンタゴニストなどは、 G蛋白質共役型レセプターの機 能不全に関連する疾患の予防 Z治療薬や診断薬として活用することが期待できる。 さらにまた、 G蛋白質共役型レセプターの遺伝子変異に基づく、 生体での該レ セプタ一の機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合も多 い。 この場合には、 該レセプターに対するアンタゴニストやァゴニストの投与だ けでなく、 該レセプター遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への導入や、 該レセプタ一遺伝子に対するァンチセンス核酸.の導入による、 遺伝子治療に応用 することもできる。 この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変 異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプターの遺伝子は、 該 レセプターの機能不全に関与する疾患の予防 Z治療薬や診断薬に応用することも できる。 発明の概要
本発明は、 上記のように有用な新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質を提供す るものである。 すなわち、 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部 分ぺプチドまたはその塩、 該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその部分べ プチドをコードするポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） を含有するポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） 、 該ポリ ヌクレオチドを含有する組換えベクター、 該組換えべクターを保持する形質転換 体、 該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、 該 G蛋白質共役 型レセプター蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体、 該 G 蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物、 該 G蛋白質共役型 レセプターに対するリガンドの決定方法、 リガンドと該 G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質との結合性を変化させるィ匕合物 （アンタゴ-スト、 ァゴニスト） または その塩のスクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方 法もしくはスクリ一ニングキットを用いて得られうるリガンドと該 G蛋白質共役 型レセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アンタゴ-スト、 ァゴニス ト） またはその塩、 およびリガンドと該 G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結 合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニスト） もしくは該 G蛋白質共 役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる 医薬などを提供する。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒト肝臓由来の新規な G蛋白質共役型 レセプター蛋白質をコードする c DNAを単離し、 その全塩基配列を解析するこ とに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1〜 第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの cDNAにコードされ る蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプター蛋白質であることを確認し た。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本発明 を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプター蛋白質また はその塩、
(2) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまた はその塩、
(3) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(4) DN Aである上記 (3) 記載のポリヌクレオチド、
(5) 配列番号： 2で表される塩基配列を有する上記 （3) 記載のポリヌクレ ォチド、
(6) 上記 (3) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(7) 上記 (6) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
(8) 上記 (7) 記載の形質転換体を培養し、 上記 (1) 記載の G蛋白質共役 型レセプター蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記 (1) 記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、
(9) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分べプチドまたはその塩に対する抗体、
(10) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を 不活性化する中和抗体である上記 (9) 記載の抗体、
(11) 上記 （9) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(12) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 ( 2 ) 記載の部分べプチドまたはその塩を用いることにより得られうる上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド、
(13) 上記 （12) 記載の G蛋白質共役型レセプターのリガンドを含有して なる医薬、
(14) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする上記 (1) 記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、 ' (15) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと上 記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変ィ匕 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(16) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記
(2) 記載の部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーエング用キット、
(17) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその
^ 、
(18) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法または上記 （16) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質 共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその 塩を含有してなる医薬、
(19) 上記 (3) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下 でハイプリダイズするポリヌクレオチド、
( 20 ) 上記 （ 3 ) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一 部を含有してなるポリヌクレオチド、
(21) 上記 (3) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特 徴とする上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の mRNAの定量方 法、
(22) 上記 (9) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 (1) 記載の G 蛋白質共役型レセプター蛋白質の定量方法、
(23) 上記 （21) または上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴 とする上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断 方法、
(24) 上記 （21) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 (1) 記 載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩 のスクリーニング方法、
(25) 上記 （22) 記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜におけ る上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物また はその塩のスクリーニング方法、
(26) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物また はその塩、
(27) 上記 (25) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜に おける上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物 またはその塩、
(28) 上記 (24) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物また はその塩を含有してなる医薬、 (29) 上記 （25) 記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜に おける上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物 またはその塩を含有してなる医薬、
(30) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予 防'治療剤である上記 （18) 、 （28) または （29) 記載の医薬、
(31) 哺乳動物に対して、 上記 (15) 記載のスクリーニング方法または上 記 （16) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと上記
(1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性 疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治療方法、
(32) 哺乳動物に対して、 上記 （24) 記載のスクリーニング方法を用いて 得られうる上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化さ せる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性 疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防，治療方法、
(33) 哺乳動物に対して、 上記 （25) 記載のスクリーニング方法を用いて 得られうる細胞膜における上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量 を変ィ匕させる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治療方法、
(34) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予 防'治療剤を製造するための上記 (15) 記載のスクリーニング方法または上記 (16) 記載のスクリーエング用キットを用いて得られうるリガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩の使用、
(35) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予 防 ·治療剤を製造するための上記 (24) 記載のスクリーニング方法を用いて得 られうる上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させ る化合物またはその塩の使用、
(36) 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予 防'治療剤を製造するための上記 （25) 記載のスクリーニング方法を用いて得 られうる細胞膜における上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を 変化させる化合物またはその塩の使用等に関する。
さらには、
(37) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸 が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さら に好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のァミノ酸が付加したァミノ酸配列、 ③配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30 個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合 わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質である上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レ セプター蛋白質またはその塩、
(38) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま たは上記 (2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させ ることを特徴とする上記 （14) 記載のリガンドの決定方法、
(39) リガンドが、 例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキュン、 グノレタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 才キシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジユリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (パソアクティブ インテスティナ ル ポリペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラ ジキニン、 CGRP (カルシト-ンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコト リエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 ト口ンボキサン、 アデノシ ン、 アドレナリン、 αおよび] 3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 GROa、 GRO/?、 GROy、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC14、 MCP_3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P_ 1 β RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタ ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイ ド、 ガラニ ン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) またはスフインゴシン 1一リン酸である上 記 （38) 記載のリガンドの決定方法、
(40) ( i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはそ の塩または上記 (2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触 させた場合と、 （ii) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしく はその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドおよ ぴ試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記 (1 5 ) 記載のスクリ一ユング方法、
(41) (i) 標識したリガンドを上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質もしくはその塩または上記 （2) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に 接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験ィ匕合物を上記 (1) 記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 (2) 記載の部分 ぺプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンドの上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 (2) 記載の部分ぺプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特 徴とするリガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ユング方法、
(42) (i) 標識したリガンドを上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ —蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試 験化合物を上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に 接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(43) ( i) 標識したリガンドを上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンド および試験化合物を上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す る細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞の膜画分 に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 (1) 記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング方法、
(44) ( i ) 標識したリガンドを上記 ( 7 ) 記載の形質転換体を培養するこ とによって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に 接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 (7) 記載 の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質 共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、 標識したリガンドの該 G蛋 白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、
(45) (i) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその 塩を活性化する化合物を上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含 有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプ ター蛋白質またはその塩を活性ィヒする化合物および試験化合物を上記 （1) 記载 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較すること を特徴とするリガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質また はその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (46) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を活 性化する化合物を上記 ( 7 ) 記載の形質転換体を培養することによつて該形質転 換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩を活性化する化 合物おょぴ試験化合物を上記 (7) 記載の形質転換体を培養することによって該 形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場 合における、 G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーェ ング方法、 (47) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性ィ匕する化合 物が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 ダル タミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 パソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシ トニン、 アドレノメジユリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、
GRP、 PTH、 V I P (パソアクティブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーノ ミン、 モチリン、 アミリン、 プラジキュン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドぺプチド) 、 ロイコトリェン、 パンクレア スタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび 一ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L—8、 GRO a, GRO β、 GROT/、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP_2、 M CP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P— 1 、 R ANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ュユーロ テンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホスフ ァチジン酸 （LPA) またはスフインゴシン 1一リン酸である上記 （45) また は （46) 記載のスクリーニング方法、
(48) 上記 （40) 〜 （47) 記載のスクリーニング方法で得られうるリガ ンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合 性を変化させる化合物またはその塩、
(49) 上記 （40) 〜上記 （47) 記載のスクリーニング方法で得られうる リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(50) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を 含有することを特徴とする上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、
(51) 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の 膜画分を含有することを特徴とする上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、 (52) 上記 (7) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の 細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有することを特徴とする 上記 （16) 記載のスクリーニング用キット、 (53) 上記 （50) 〜 （52) 記載のスクリーエング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(54) 上記 （50) 〜 （52) 記載のスクリーニング用キットを用いて得ら れうる、 リガンドと上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医
(55) 上記 (9) 記載の抗体と、 上記 (1) 記載の G蛋白質共役型レセプタ 一蛋白質もしくは上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはその塩とを接触させるこ とを特徴とする上記 (1) の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
' (56) 上記 （9) 記載の抗体と、 被検液および標識化された上記 (1) 記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分ペプチドまた はその塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 (1) 記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分ペプチドまた はその塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の上記 (1) 記載の G蛋白 質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分ペプチドまたはその塩 の定量法、 および
(57) 被検液と担体上に不溶化した上記 (9) 記載の抗体および標識化され た上記 (9) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体 上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 (1) 記載の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 (2) 記載の部分ペプチドまたはその 塩の定量法等を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 T G R 7の疎水性プロット図である。
図 2は、 一文字表記による配列番号： 1のアミノ酸配列を示す図である。 図 3は、 TGR 7の発現組織分布を示すグラフである。 発明の実施の形態
本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 レセプター蛋白質と略記す る場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列（図 2 ) と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質である。
本発明のレセプター蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例 えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 脖臓 j8細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細 胞、 ランゲノレハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細 胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチ ュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑 膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間 質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系 の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由 来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましく は約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有す るアミノ酸配列などが拳げられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の 分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガンドの決定方法や スクリ一ユング方法に従って測定することができる。 また、 本発明のレセプター蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付カ卩したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わ されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァミノ 酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。 本明細書におけるレセプター蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って、 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質をはじめとする、 本発 明のレセプター蛋白質は、 C末端が通常カルボキシル基 （一 C O OH) または力 ルポキシレート（一 C O O— ) であるが、 C末端がアミド （一 C ONH 2) または エステル （一C O O R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—プチルなどの〇 6アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 — ナフチノレなどの 。ァリーノレ基、 例えば、 ベンジノレ、 フエネチルなどのフエ 二ルー C i _ 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C ― 2アルキル基などの〇7_ 1 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用され るビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシ レート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステルイ匕されて いるものも本発明のレセプター蛋白質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセプター蛋白質には、 上記した蛋白質において、 Ν末端の メチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2 —6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が 生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾー ル基、 インドール基、 グァェジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2ー6アル力ノィル基などの Cェ— 6ァシル基など） で保護されて いるもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含 まれる。
本発明のレセプター蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質などが用いられる。 本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場 合がある） としては、 上記した本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチドであれ ば何れのものであってもよいが、 例えば、 本発明のレセプター蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプター結合活性を有するものなど が用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプター蛋白 質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロット解析において細胞外領域 （親水性 (Hydrophilic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 (Hydrophobic) 部位を一部に含むぺプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含 む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 上記した本発明のレセプター蛋白質 の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上のァミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 % 以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性, を有するァミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。 また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 (- C O OH) ま たはカルボキシレート (一 C O O一） であるが、 上記した本発明の蛋白質のごと く、 C末端がアミド （一 C O NH 2) またはエステル （一C O O R) であっても よい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明のレセプター蛋白質と同 様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端 側が生体内で切断され生成した Ginがピログルタミン酸ィ匕したもの、 分子内のァ ミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が 結合したいわゆる糖ぺプチドなどの複合べプチドなども含まれる。 また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 (- C O OH) ま たはカルボキシレート（一C O O一） であるが、 上記した本発明の蛋白質のごと く、 C末端がアミド （_ C O NH 2) またはエステル （一C O O R) であっても よい。
本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの塩としては、 酸または塩 基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン 酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 篠酸、 安 息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。 本発明のレセプター蛋白質またはその塩は、 上記したヒトゃ哺乳動物の細胞ま たは組織から自体公知のレセプタ一蛋白質の精製方法によつて製造することもで きるし、 後に記載する本発明のレセプター蛋白質をコードする D NAを含有する 形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後に記載す る蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはその アミド体の合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。 その ような樹月旨としては、 例えば、 クロロメチノレ樹脂、 ヒドロキシメチノレ樹月旨、 ベン ズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコ ール樹脂、 4ーメチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメ チルメチルフエ二ルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 ( 2 ' , 4， ージメ トキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2， , 4， 一ジメ トキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂など を挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適 当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質の配列通りに、 自体公知の各種縮合 方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同 時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反 応を実施し、 目的の蛋白質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性ィ匕 試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N, N ' ージイソプロピルカルボジイミド、 N—ェチルー N， 一 （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B i：、 H O O B t)とと もに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するカ または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性ィ匕を 行なった後に樹脂に添加することができる。 保護アミノ酸の活性ィ匕ゃ樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 蛋白質縮合 反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリ ドンなどの酸アミド類、 塩ィ匕メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素 類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどの スルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリノレ類、 酢酸メチル， 酢酸ェチル などのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は 蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られてレヽる範囲から適宜選択され、 通常約ー2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導 体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結 果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すこ とにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得 られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ 酸をァセチノレ化することができる。 原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B oc、 ターシャリーペンチル ォキシ力ルポニル、 イソボル-ルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジ/レオキ シカノレポ二ノレ、 C I- Z、 Br- Z、 ァダマンチノレオキシカノレポ二ノレ、 トリフノレオ口 ァセチル、 フタロイル、 ホノレミル、 2 _ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ二 ルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステルイ匕 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチノレ、 ターシャリープチノレ、 シク口ペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステルイ匕 （例えば、 ベンジルエステ ノレ、 4 _ニトロべンジノレエステノレ、 4—メ トキシベンジノレエステノレ、 4一クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒ ドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボ-ルヒドラジド化、 ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジドィ匕などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステルイ匕またはエーテルィ匕によって保護するこ とができる。 このエステルイ匕に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボ-ル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B zl、 C l 2_B zl、 2—-トロベンジル、 Br- Z、 ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 Tos、 4 -メ トキシ - 2，
3 , 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 B oc、 Trt、 Fmocなどが用いられる。 原料のカルボキシル基の活性ィ匕されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2，
4 , 5 _トリクロ口フエノール、 2 , 4ージニトロフエノール、 シァノメチノレア ルコール、 パラニトロフエノール、 HON B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N— ヒドロキシフタルイミド、 HO Bt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d -黒あるいは Pd-炭素などの 触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの 混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約 _ 2 0 °C 〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエ ノーノレ、 チオアニソーノレ、 メタクレゾーノレ、 ハ°ラタレゾーノレ、 ジメチノレスノレフィ ド、 1 , 4一ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオールなどのようなカチォ ン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用 いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチオフヱノール処理により除去され、 ト リプトフアンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2— エタンジチオール、 1 , 4ーブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保 護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によ つても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端ァ ミノ酸の α—カルボキシル基をァミド化して保護した後、 ァミノ基側にぺプチド (蛋白質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端のひーァミノ 基の保護基のみを除いた蛋白質と C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去し た蛋白質とを製造し、 この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護蛋白質を 精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質を得るこ とができる。 この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を 凍結乾燥することで所望の蛋白質のァミド体を得ることができる。
蛋白質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸のひ一カル ボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 蛋白質の アミド体と同様にして、 所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。 本発明の蛋白質の部分べプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチドの合成法 に従って、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダ一ゼで切断することによつ て製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液 相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の蛋白質を構成し得る部分 ぺプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場 合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。 公知 の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が 挙げられる。
ΦΜ. Bodanszkyおよび M. A. 0ndetti、 ペプチド シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York (1966年)
② Schroederおよぴ Luebke、 ザぺプナド (The Peptide) , Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 '蒸留'カラムクロマトダラ フィ一'液体ク口マトグラフィ一'再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で 得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。 本発明のレセプター蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記した 本発明のレセプター蛋白質をコードする塩基配列 （DNAまたは RNA、 好まし くは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポリヌク レオチドとしては、 本発明のレセプター蛋白質をコードする DNA、 mRNA等 の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイプリッドでもよい。 一 本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 (すなわち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプター蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 15(7)、 1997記載の方法またはそれ に準じた方法により、 本発明のレセプター蛋白質の mRNAを定量することがで さる。
本発明のレセプター蛋白質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノ ム D N Aライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来の c D N A、 上記した細胞 ·組 織由来の cDNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ライブラリーに 使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コスミ ド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細胞 ·組織より totalRNAまた は mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT- P CR法と略称する） によって増幅することもで さる。
具体的には、 本発明のレセプター蛋白質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2で表 わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配 列を有し、 本発明のレセプター蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合 活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプター蛋白質をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性 を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クローユング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なう ことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に 記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン トな条件に従って行なうことができる。
該ノヽィストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6
0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °C の場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列を含有するレセプタ 一蛋白質をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含 有する D N Aなどが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質をコードする D N Aの塩基配列の一部、 または該 D N Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本 発明の部分べプチドをコ一ドする D N Aを包含するだけではなく、 R NAをも包 含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質遺伝子の複製または発現を 阻害することのできるアンチセンス 'ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローンィ匕 した、 あるいは決定された G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする D NA の塩基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核 酸） は、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質遺伝子の R NAとハイプリダイズする ことができ、 該 R NAの合成または機能を阻害することができる力、 あるいは G 蛋白質共役型レセプター蛋白質関連 R NAとの相互作用を介して G蛋白質共役型 レセプター蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白質共役型 レセプター蛋白質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 お よび G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質関連 R N Aと特異的にハ ことができるポリヌクレオチドは、 生体内および生体外で G蛋白質共役型レセプ ター蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療 または診断に有用である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを 意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で
「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導され る指令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型 レセプター蛋白質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア ' リピ ート、 5， 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳開始コドン、 3， 端非翻訳領域、 3， 端パリンドローム領域、 および
3， 端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 G蛋白質共役型 レセプター蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 は、 対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、
「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチド は、 2—デォキシ一 D—リポースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D —リボースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン 塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌ クレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸および合 成配列特異的な核酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマー
(但し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや 塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎮 D NA、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA： R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド
(または非修飾ォリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付カ卩されたもの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化さ れたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌク レオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電 荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジ チォエートなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ 'ィ ンヒビター、 トキシン、 抗体、 シグナルぺプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 (例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インター力 レント化合物 （例えば、 アタリジン、 プソラレン ¾ど） を持つもの、 キレート化 合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有 するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌタレ ォチド J および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでな く、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こう した修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリン およびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾され たヌクレオチドおよぴ修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよ く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとカ 脂肪族基などで置換されていた り、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。 本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒十生 をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8， pp. 247, 1992； Vol. 8, pp. 395, 1992; S. T.
Crooke et al. ed. , Ant is ens e Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変ィ匕せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロ一ノレなど） といった粗水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コーノレ酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3， 端あるいは
5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に 特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどの ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ 用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型レセプター蛋白質の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞 に適用できる。 本発明の部分ぺプチドをコ一ドする D N Aとしては、 上記した本発明の部分べ プチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればレ、かなるものであってもよ い。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム D NAライブラリー、 上記した細胞'組織由来 の c D NA、 上記した細胞 ·組織由来の c D NAライブラリー、 合成 D NAのい ずれでもよレ、。 ライブラリーに使用するベクターは、 バタテリオファージ、 ブラ スミ ド、 コスミ ド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 上記した細 胞 ·組織より mR N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅す ることもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 ( 1 ) 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する D NAの部分塩基配列を有す る D NA、 または （2 ) 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のレセプター蛋白質 ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用 など） を有するレセプター蛋白質をコードする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 2で表わされる塩基配列ハイブリダイズできる D N Aとしては、 例 えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 % 以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセプタ 一蛋白質と略記する場合がある） を完全にコードする D NAのクローユングの手 段としては、 本発明のレセプター蛋白質の部分塩基配列を有する合成 D NAブラ イマ一を用いて P C R法によつて増幅するか、 または適当なベクターに組み込ん だ D N Aを本発明のレセプター蛋白質の一部あるいは全領域をコードする D NA 断片もしくは合成 D N Aを用レ、て標識したものとのハイプリダイゼーシヨンによ つて選別することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 モレキ ユラ一 ·クローユング (Molecular CloningJ 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法 に従って行なうことができる。
D NAの塩基配列の変換は、 P C Rや公知のキット、 例えば、 MutanTM- super Express KmG (宝酒造 （株） ) 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ) などを用いて、 ODA-LA PCR法、 Gupped duplex法、 Kunkel法などの自体公知の方法あるいはそれ らに準じる方法に従って行なうことができる。 クローン化されたレセプター蛋白質をコードする DNAは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付カ卩したりして使用するこ とができる。 該 DNAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプターを用いて付加することもできる。
本発明のレセプター蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のレセプ ター蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。 ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR322、 p BR 32 5、 pUC 12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 pUB 1 10、 pTP 5、 p C 194) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH 19、 p SH 15) 、 えファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— l l、 pXTl、 p R c/CMV、 pRc/RSV、 p cDNA I/Ne oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRo;プロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモーター、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。 これらのうち、 CMVプロモーター、 SRひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプ 口モーター、 r e cAプロモーター、 え Ρτ: 口モーター、 l p pプロモーター などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プ 口モーター、 p e npプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PHO5プ 口モーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターな どが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Am p rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne o rと略称する場合がある、 G41 8耐性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (d h f r— ) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカーとして 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まなレ、培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプター蛋白 質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグ ナル配列、 Omp A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ 一アミラーゼ'シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母 である場合は、 MF a 'シグナル配列、 SUC 2 'シグナル配列など、 宿主が動 物細胞である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 ーィンターフェロン · シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のレセプター蛋白質をコードする DNAを含 有するべクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。 宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒァ属菌の具体例としては、 ェシェリヒア 'コリ （Escherichia coli) Kl 2 · DH1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ 一 'ォブ 'サイ ンシィズ ·ォブ'ザ 'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60卷， 1 60 (1 968)〕 ， JM1 03 〔ヌクイレック 'ァシッ ズ . リサーチ， （Nucleic Acids Research) , 9卷， 309 (1 98 1)〕 ， J A 221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of
Molecular Biology) 〕 ， 120卷， 517 (1978)〕 , HB 101 〔ジャー ナル'ォプ'モレキュラー'バイオロジー， 41卷， 459 (1969)〕 ， C 6 00 〔ジヱネテイツタス （Genetics) , 39卷， 440 (1954)〕 などが用い られる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'ズブチルス （Bacillus subtilis) MI 1 14 〔ジーン， 24卷， 255 (1983)〕 , 207— 21
〔ジャーナル ·ォブ ·パイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95 卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH 22 R一， NA87 - 1 1 A, DKD— 5D、 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC YC 191 3, NCYC2036、 ピキア ノ ストリス （Pichia pastoris) な どが用いられる。 昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx raori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J丄ら、 イン'ヴイボ (In Vivo) ，13， 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Vero, チャイニーズハムス ター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r-) 細胞と略記） 、 マウス L細 胞， マウス AtT_20、 マウスミエローマ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL細胞 などが用いられる。 ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル .アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ .ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 2110 (1972)やジーン
(Gene) , 17卷， 107(1982)などに記載の方法に従つて行なうことがで さる。
バチルス属菌を形質転換ずるには、 例えば、 モレキュラー ·アンド'ジエネラ ノレ ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168卷， 1 1 1 ( 1979 )などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ'イン ·ェンザィモロジ一
(Methods in Enzymology) ， 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシ 一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォ ブ.ザ.ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. sci. USA) , 75卷， 1929 ( 1978 ) などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 パイォ Ζテクノロジー
(Bio/Technology) ,6, 47-55(1988)) などに記載の方法に従って行なうことが できる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー
(Virology) , 52卷， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことがで さる。
このようにして、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする DNAを含有 する発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸ニ水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添 加してもよレ、。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。 ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M9培地 〔ミラー （Miller) ， ジャーナル'ォブ'ェクスペリメン ッ 'イン ·モレキュラー ·シエネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働力、せ るために、 例えば、 3 ]3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることが できる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 15-43 °Cで約 3〜 24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30-40 °Cで約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ノレダー （Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 「プロシージングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77卷， 4505 (1980)〕 や
0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシージング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォプ ·ザ ·ュ 一エスエー （proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (198 4) 〕 が拳げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通 常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加え る。 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace s Insect Medium (Grace, T. C. C.，ネィチヤ■ ~ (Nature) ， 195, 788 (1962) ) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜カロえ たものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好まし Vヽ。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加え る。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5
〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122卷， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8卷， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル.ォブ ·ザ ·アメリカン · メディカル ·ァソシエーンョン (The Journal of the American Medical
Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング · ォブ ·ザ · ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン
(Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73 , 1 丄 950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましレ、。 培養は通常 約 30 °C〜 40。Cで約 15〜 60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質を生成せしめることができる。 上記培養物から本発明のレセプター蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記 の方法により行なうことができる。
本発明のレセプター蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壌したのち、 遠心分離やろ過によりレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法など が適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァ-ジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 100™などの界面活性剤が含まれていてもよレ、。 培養液中にレ セプター蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体 あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプター蛋 白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルァ ミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一などの特異的新和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィーなど の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。 力べして得られるレセプター蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するレセプター蛋白質を、 精製前または精製後に適当な 蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコ シダーゼなどが用いられる。
力べして生成する本発明のレセプター蛋白質またはその塩の活性は、 標識した リガンドとの結合実験およぴ特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどに より測定することができる。 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。
本宪明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本 発明のレセプター蛋白質等と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明のレ セプター蛋白質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従 つて製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のレセプター蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体 産生能を高めるため、 完全フロイントアジュパントゃ不完全フロイントアジュパ ントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行 なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識ィ匕レセプター蛋白質等と 抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより 行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルスタイン の方法 〔ネイチヤー （Nature)、 256卷、 495頁 （1975年） 〕 に従い実 施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いら れる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 S P 2/0などが挙げら れるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好まし 、比率は 1 ： 1〜 20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37°Cで約 1〜 10分間ィンキュベ —トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマのスクリ一エングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプター蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸 着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次 に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いられ る細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロ ティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グ 口プリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を 添加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプター蛋白質等を加え、 固相に結 合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培 地としては、 ハイブリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R PM 1 1 6 4 0培地、 1〜： L 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 (株） ） またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S FM— 1 0 1、 日水製薬
(株） ) などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましく は約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間 である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培 養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 ズ b ) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロプリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕 本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （レセプター蛋白質等の抗 原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造 法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプター蛋白質 等に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造でき る。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンぺット ·へモシァニン等を重量比でハ プテン 1に対し、 約 0. ：！〜 2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方 法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 グルタルアルデヒドゃカルボジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュパントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。 本発明のレセプター蛋白質またはその塩、 その部分ペプチドまたはその塩、 お よぴ該レセプター蛋白質またはその部分べプチドをコードする D N Aは、 （ 1 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド （ァゴェスト） の決 定、 （2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患 の予防および Zまたは治療剤、 ( 3 ) 遺伝子診断剤、 （4 ) 本発明のレセプター 蛋白質またはその部分べプチドの発現量を変化させる化合物のスクリ一二ング方 法、 （5 ) 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化さ せる化合物を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、 ( 6 ) 本発明の G 蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの定量法、 ( 7 ) 本発明の G蛋 白質共役型レセプタ一蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二 スト、 アンタゴニストなど） のスクリーニング方法、 （8 ) 本発明の G蛋白質共 役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴ-スト） を含有する各種疾病の予防および Zまたは治療剤、 （9 ) 本発 明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定量、 ( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化さ せる化合物のスクリ一ユング方法、 （1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプター 蛋白質またはその部分べプチドの量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予 防および/または、冶療剤、 （1 2 ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する抗体による中和、 （1 3 ) 本発明の G蛋白質共役 型レセプター蛋白質をコードする D NAを有する非ヒト動物の作製などに用いる ことができる。
特に、 本発明の組換え型 G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレ セプター結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋 白質共役型レセプターに対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴ 二スト、 アンタゴニストなど） をスクリーユングすることができ、 該ァゴ二スト またはアンタゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができ る。
本発明のレセプター蛋白質もしくは部分ぺプチドまたはその塩 （以下、 本発明 のレセプター蛋白質等と略記する場合がある） 、 本発明のレセプター蛋白質また はその部分ペプチドをコードする D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合 がある） および本発明のレセプター蛋白質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体 と略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド （ァゴニス ト） の決定
本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ぺプチドもしく はその塩は、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二 スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明 の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシ ン、 カナビノイド、 コレシストキニン、 グ タミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Υ、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 Ρ ACAP、 セクレチン、 グノレ力ゴン、 カノレシトニン、 アドレノメジユリン、 ソマ トスタチン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VI P (バソァク ティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス タチン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシト ニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび ]3 —ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROa、 GROj3、 GRO γ、 NAP— 2、 ENA- 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP—1、 HC 14、 MCP— 3、 I一 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P— l j3、 R ANTES など） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 (LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸など） の他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳 動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本 発明のレセプター蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最 終的に単一のリガンドを得ることができる。 具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプター蛋白質もしく はその部分べプチドもしくはその塩を用いるか、 または組換え型レセプター蛋白 質の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプタ一結合ァッセィ系を用いること によって、 本発明のレセプター蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c一 f o s活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する 活性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプター蛋白質またはその 部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプター蛋白質 または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性などを測定 することを特徴とする。
. より具体的には、 本発明は、 .
①標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩または本 発明の部分べプチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した試験ィ匕 合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分ぺプチドもしくはその塩に対する 結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対 するリガンドの決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または該 膜画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質ま たはその塩に対するリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D NAを含 有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質 に接触させた場合における、 標識した試験ィ匕合物の該レセプター蛋白質またはそ の塩に対する結合量を測定しすることを特徴とする本発明のレセプター蛋白質に 対するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合 における、 レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM
P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリ ガンドの決定方法、 および
⑤試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D N Aを含有する形 質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現したレセプタ一蛋白質に接触さ せた場合における、 レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキド ン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細 胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質の リン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する 活性など） を測定することを特徴とする本発明のレセプター蛋白質またはその塩 に対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプター蛋白質に 結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。 まず、 リガンド決定方法に用いるレセプター蛋白質としては、 上記した本発明 のレセプター蛋白質または本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れの ものであってもよいが、 動物細胞を用レ、て大量発現させたレセプター蛋白質が適 している。
本発明のレセプター蛋白質を製造するには、 上記の発現方法が用いられるが、 該レセプター蛋白質をコードする D N Aを哺乳動物細胞ゃ昆虫細胞で発現するこ とにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片 には、 通常、 相補 D N Aが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではな い。 例えば、 遺伝子断片や合成 D N Aを用いてもよい。 本発明のレセプター蛋白 質をコードする D NA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させ るためには、 該 D NA断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角 体病ウイノレス (nuclear polyhedrosis virus； N P V) のポリヘドリンプロモー ター、 S V 4 0由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタロチ ォネインプロモーター、 ヒ トヒートショックプロモーター、 サイトメガロウイノレ スプロモーター、 S R aプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現 したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例え ば、 文献 〔Nambi, P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリ 一 (J. Biol. Chem. ) ， 267卷， 19555〜19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行 うことができる。 したがって、 本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプター蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有するものとしては、 それ自体公知 の方法に従って精製したレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩であってもよいし、 該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分 を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細 胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定ィ匕しても よい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプター蛋白 質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン （Kinematica社製） による破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノズルから嘖出させることによる破碎などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （5 0 0 r p m〜3 000 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 ( 15000 r p m〜 30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られ る沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋白質と細胞由来 のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。 該レセプター蛋白質を含有する細胞やその膜画分中のレセプター蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子である のが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比 活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の① 〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプター蛋白質画分と、 標識した試験 化合物が必要である。
レセプター蛋白質画分としては、 天然型のレセプター蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプター画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験ィ匕合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 な どで標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナビノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 パソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 力 ルシトニン、 アドレノメジユリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACT H、 GRP、 PTH、 V I P (パソアクティブ インテスティナル アンド リ ィテッド ポリペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイ コトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデ ノシン、 アドレナリン、 ひおよび —ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L —8、 GRO<¾、 GRO 3、 GROy、 NAP- 2, ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP—1、 HC 14、 MCP— 3、 1 -309, MI P 1 a、 MI P— 1 ]3、 RANTE Sなど） 、 ェンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイ ド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸などが 好適である。 具体的には、 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定 方法を行なうには、 まず本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞または細胞の 膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を 調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バ ッファー、 トリス一塩酸パッファーなどのリガンドとレセプタ一蛋白質との結合 を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減さ せる目的で、 CHAPS、 Twe e n-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギト ニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンやゼラチンなど の各種蛋白質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる リセプターやリガンドの分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること もできる。 0.0 lm 1〜10mlの該レセプター溶液に、 一定量 （5000 c p m〜500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで 標識した試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過 剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0 °C〜 5 0°C、 望ましくは約 4°C〜37°Cで、 約 20分〜 24時間、 望ましくは約 30分
〜 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗 浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ 一あるいは γ—カウンターで計測する。 全結合量 （Β) から非特異的結合量 （Ν SB) を引いたカウント （B— NSB) が 0 c pmを越える試験化合物を本発明 のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） として選択す ることができる。 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する上記の④ 〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性 または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定 することができる。 具体的には、 まず、 レセプター蛋白質を含有する細胞をマル チウエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新 鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さなレ、適当なパッファ一に交換し、 試験化合物 などを添加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回 収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標 とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素に よって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してァッセィを行な つてもよレ、。 また、 c AMP産生抑制などの活 1"生については、 フオルスコリンな どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検 出することができる。 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分べプチドもしくはその 塩、 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプター蛋白 質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1 . リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ土製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清ァノレ ブミン （シグマ社製） をカロえたもの。
孔径 0 . 4 5 μ πιのフィルターで濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター蛋白質標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた C HO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 0 5個 Z穴で継代し、 3 7 °C、 5 % C Oり、 9 5 % a i rで 2日間培養した もの。
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 ま たは適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4 °Cあるいは一 20 °Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて Ι μΜに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチルホノレ ムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜： 1000倍濃い濃度に調製する。 2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 CH O細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 μ 1の測定用緩衝液を 各穴に加える。
②標識試験化合物を 5 μ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量 を知るためには非標識試験ィ匕合物を 5 μ 1加えておく。
③反応液を除去し、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識試験化合物を 0.2N Na OH- 1%SDSで溶解し、 4 m 1の液体シンチ レーター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定する。 本発明のレセプター蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとし ては、 例えば、 脳、 下垂体、 膝臓などに特異的に存在する物質などが挙げられ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グノレタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 才キシトシン、 P ACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 力 ルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトスタチン、 GHRH、 CRF、 ACT H、 GRP、 PTH、 VI P (パソアクティブ インテスティナル アンド リ レイテッド ポリペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリン、 ァミリ ン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドぺプチド) 、 ロイコトリェン、 ノ ンタレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび ]3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L_8、 GROa、 GRO β , GROy、 NAP— 2、 ΕΝΑ— 78、 PF4、
Ι Ρ 10、 GCP— 2、 MCP_ 1、 HC 1 4、 MCP— 3、 1—309、 MI P 1 α、 MI P- 1 j8、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリ ン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイ ド、 ガラニン、 リゾホスファチジン酸 （LPA) 、 スフインゴシン 1一リン酸な どが用いられる。
(2) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の 予防および /"または治療剤
上記 (1) の方法において、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが明 らカ、になれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプター蛋白質 または②該レセプター蛋白質をコードする DNAを、 本発明のレセプター蛋白質 の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤などの医薬として使用す ることができる。
例えば、 生体内において本発明のレセプター蛋白質が減少しているためにリガ ンドの生理作用が期待できない （該レセプター蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合 に、 ①本発明のレセプター蛋白質を該患者に投与し該レセプター蛋白質の量を捕 充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプター蛋白質をコードする DNAを該患者に投 与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明のレセプ ター蛋白質をコードする DNAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植 することなどによって、 患者の体内におけるレセプター蛋白質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 すなわち、 本発明のレセプタ 一蛋白質をコードする DNAは、 安全で低毒性な本発明のレセプター蛋白質の機 能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤として有用である。
本発明のレセプター蛋白質は、 G蛋白共役型レセプター蛋白質であるラット型 R TAおよぴヒト型 MA Sにアミノ酸配列レベルで、 各々、 約 3 6 %およぴ約 3
4 %の相同†生が認められる新規 7回膜貫通型受容体蛋白質である。
本発明のレセプター蛋白質は中枢疾患 (例えば、 アルツハイマー病、 痴呆、 摂 食障害など）、 炎症性疾患 (例えば、 アレルギー、 喘息、 リュウマチなど）、 循環 器疾患 (例えば、 高血圧症、 心肥大、 狭心症、 動脈硬化症等）、 癌 （例えば、 非小 細胞肺癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸 癌等） 、 糖尿病などの予防および Zまたは治療に有用である。
本発明のレセプター蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手 段に従って製剤化することができる。
—方、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D NA (以下、 本発明の D NA と略記する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノ ウィルスァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なべクタ一に挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 そのままで、 ある いは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのよ うな力テーテルによつて投与できる。
例えば、 ①本発明のレセプター蛋白質または②該レセプター蛋白質をコードす る D NAは、 必要に応じて糠衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイ クロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許 容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 ①本発明のレセプター蛋白質または②該レセプター蛋白質をコ ードする D N Aを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単 位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における 有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 ァノレギン酸などのような月彭 ィ匕剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、 塩ィ匕ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O— 5 0 ) などと併用してもよい。 油十生液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用 いられ、 溶解補助剤である安息香酸べンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 上記予防.治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコ-ゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
本発明のレセプター蛋白質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 ( 6 0 k g として） においては、 一日につき約 0 . l m g〜l 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 0 k gとして） にお いては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. ：!〜 20mg 程度、 より好ましくは約 0. 1〜： 10 m g程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、. 60 k g当たりに換算した量を投与することが できる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 O k gとして） に おいては、 一日につき約 0. 1 m g〜 100 m g、 好ましくは約 1. 0〜 50 m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 k gとして） においては、 一 日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より 好ましくは約 0. 1〜： L 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 (3) 遺伝子診断剤
本発明の DNAは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） における本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドする D N Aまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DN Aまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザンハ イブリダィゼーシヨンや PCR— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 卷， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ *ザ ·ナショナ ル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー （Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 第 8 6卷， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
(4) 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプチドの発現量を変化させ る化合物のスクリーニング方法
本発明の D NAは、 プローブとして用いることにより、 本発明のレセプター蛋 白質またはその部分べプチドの発現量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、 （i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もしくは細胞、 または （ii) 形質転換体等に含まれる本 発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの mRNA量を測定することに よる、 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプチドの発現量を変化させる 化合物のスクリーニング方法を提供する。 本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの mRNA量の測定は具体 的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット、 月巴満マウス、 動脈硬ィ匕ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴 呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ス トレス （例えば、 浸水ス トレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した 後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。
得られた細胞に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの mRNAは、 例えば、 通常の方法により細胞等から mRNAを抽出し、 例えば、 TaqManPCRなどの手法を用いることにより定量することができ、 自体公知の手段 によりノザンブロットを行うことにより角军析することもできる。
(ii) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ぺプチドを発現する形質転 換体を上記の方法に従い作製し、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプター蛋 白質またはその部分べプチドの m R N Aを同様にして定量、 解析することができ る。 本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を変化させるィ匕合 物のスクリーニングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （ 3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞に含まれる本発明のレセプター蛋白質また はその部分べプチドの mR N A量を定量、 解析することにより行なうことができ、 (ii) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、
—定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましくは 2日後〜 3日後） 、 該形質転換体に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはそ の部分ペプチドの mR N A量を定量、 解析することにより行なうことができる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 本発明 のレセプター蛋白質またはその部分ぺプチドの発現量を変化させる作用を有する 化合物であり、 具体的には、 （ィ） 本発明のレセプター蛋白質またはその部分べ プチドの発現量を増加させることにより、 G蛋白質共役型レセプターを介する細 胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 + 遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細 胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 P Hの低下など を促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化合物、 （口） 本発明の レセプター蛋白質またはその部分ペプチドの発現量を減少させることにより、 該 細胞刺激活性を減弱させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の ィ匕合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。 該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることがで さる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば、 癌患者 （6 O k gと して） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O k gとして） においては、一 日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より 好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
( 5 ) 本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの発現量を変化させ る化合物を含有する各種疾病の予防および zまたは治療剤
本発明のレセプター蛋白質は上記のとおり、 例えば、 中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 本発明のレセプタ 一蛋白質またはその部分べプチドの発現量を変化させる化合物は、 本発明のレセ プター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として用い ることができる。
該化合物を本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防およぴ /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 S武形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セノレ ロースのような賦形 ¾|、 コーンスターチ、 ゼラチン、 ァノレギン酸などのような H彭 ィ匕剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5
0 ) などと併用してもよい。 油†生液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用 いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩ィ匕ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 0 k gとし て） においては、 一日につき約 0 . 1〜1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜 2 O m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが.、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌症患者 （6 O k gとして） においては、 —日につき約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 よ り好ましくは約 0 . 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合であ る。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
( 6 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプター蛋白質等は、 リガンドに対して結合 1"生を有しているので、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプター蛋白質等と接触させることによ つて被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以 下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従つて用いること ができる。
①入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） ( 7 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変ィ匕 させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニストなど） のスクリーニング方法 本発明のレセプター蛋白質等を用いるか、 または糸且換え型レセプター蛋白質等 の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプター結合アツセィ系を用いることに よって、 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物な ど） またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活 性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細 胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進す る活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明のレセプタ 一蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわ ゆる、 本発明のレセプター蛋白質に対するアンタゴニスト） 、 （ハ） リガンドと 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるい は （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を減少 させる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 上記したリガンド 決定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。
すなわち、 本発明は、 （i ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （ii) 本発明のレセプター 蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試験化合物と を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明のレセプ ター蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （ii) の場合における、 例 えば、 該レセプター蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測 定して、 比較することを特徴とする。 より具体的には、 本発明は、 ①標識したリガンドを、 本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合と、 標 識したリガンドおよび試験ィ匕合物を本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場 合における、 標識したリガンドの該レセプター蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞または該 細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドぉよび試験化合物を本発明 のレセプター蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合に おける、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比 較することを特徴とするリガン.ドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によつて細胞膜上に発現したレセプタ一蛋白質等に接触させた場合と、 標識した リガンドおよび試験化合物を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養するこ とによつて細胞膜上に発現した本発明のレセプタ一蛋白質等に接触させた場合に おける、 標識したリガンドの該レセプター蛋白質等に対する結合量を測定し、 比 較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 ④本発明のレセプター蛋白質等を活性ィ匕する化合物 (例えば、 本発明のレセプ ター蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明のレセプター蛋白質等を含有する 細胞に接触させた場合と、 本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物およ び試験ィ匕合物を本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合に おける、 レセプターを介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチ ルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および ⑤本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ ター蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明の D N Aを含有する形質転換体を 培養することによつて細胞膜上に発現した本発明のレセプター蛋白質等に接触さ せた場合と、 本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物 を本発明の D NAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現 した本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合における、 レセプターを介す る細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下な どを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング方法を提供する。 本発明のレセプター蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプターァ ゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする場合、 まずラットなどの G 蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用いて 候補化合物を得て （一次スクリーニング） 、 その後に該候補化合物が実際にヒト の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合を阻害する力否かを確認 する試験 (二次スクリーニング) が必要であった。 細胞、 組織または細胞膜画分 をそのまま用いれば他のレセプター蛋白質も混在するために、 目的とするレセプ ター蛋白質に対するァゴニストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニングす ることは困難であった。
しかしながら、 例えば、 本発明のヒト由来レセプター蛋白質を用いることによ つて、 一次スクリーニングの必要がなくなり、 リガンドと G蛋白質共役型レセプ ター蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることができ る。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴニストかアンタゴニストかを簡 便に評価することができる。
本発明のスクリ一ユング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプター蛋白質等とし ては、 上記した本発明のレセプター蛋白質等を含有するものであれば何れのもの であってもよいが、 本発明のレセプター蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細 胞膜画分が好適である。 し力、し、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なこと から、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現さ せたヒト由来のレセプター蛋白質等などが適している。 本発明のレセプター蛋白質等を製造するには、 上記の方法が用いられるが、 本 発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D NA断片には相補 D N Aが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用 いてもよい。 本発明のレセプター蛋白質をコードする D NA断片を宿主動物細胞 に導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を昆虫を宿主と するパキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； N P V) のポリヘドリンプロモーター、 S V 4 0由来のプロモーター、 レトロウイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒ トヒートシ ョックプロモーター、 サイトメガロウイノレスプロモーター、 S R aプロモーター などの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ 自体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャー ナル ·オフ、、 ·パイォロジカル 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 267巻， 19555— 19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従って行なうことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプター蛋白 質等を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプター 蛋白質等であってもよいし、 該レセプター蛋白質等を含有する細胞を用いてもよ く、 また該レセプター蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよレ、。 本 明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプター蛋白質等を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をグルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定ィ匕し てもよい。 固定ィ匕方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞としては、 該レセプター蛋白質等 を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆 虫細胞、 動物細胞などが好ましレ、。
細胞膜画分としては、 細胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter—
Elveh jem型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン （Kinematica社製） のよる破枠、 超音波による破枠、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破枠などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500 r ρπ！〜 3 000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速
(15000 r p m〜 30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られ る沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋白質等と細胞由 来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプター蛋白質等を含有する細胞や膜画分中のレセプター蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子である のが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比 活十生） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一口ットで大量の試料を測定できるようになる。 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変ィ匕させる化合物をスク リーニングする上記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプター蛋 白質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプター蛋白質画分としては、 天然型のレセプター蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプター蛋白質画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 など で標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本努明のレセプター蛋白質等を含有 する細胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁する ことによりレセプター蛋白質標品を調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファーなどの リガンドとレセプター蛋白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれで もよい。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Tween- 80 τ Μ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバ ッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるレセプターやリガ ンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E—64 (ペプチド研究所 製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0.0 1 m 1 ~ 1 Om 1の該レセプター溶液に、 一定量 （ 5000 c p n！〜 50000 O c pm) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10_4M〜10— 10Mの試験ィ匕 合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のリ ガンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ましくは 約 4 °Cから 37 °Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分から 3時間行 う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガ ラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたは 0 _ カウンターで計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（B。） 力 ^非特異 的結合量 （NSB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 100%とした時、 特 異的結合量 （B— NSB) 力 例えば、 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害 能力のある候補物質として選択することができる。 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物スクリ 一ユングする上記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプター蛋白 質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの 低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測 定用キットを用いて測定することができる。 具体的には、 まず、 本発明のレセプター蛋白質等を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な 培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物など を添加して一定時間ィンキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とす る物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してァッセィを行なって もよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオノレスコリンなどで 細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す ることができる。
細胞刺激活 1·生を測定してスクリ一ユングを行なうには、 適当なレセプター蛋白 質を発現した細胞が必要である。 本発明のレセプター蛋白質等を発現した細胞と しては、 天然型の本発明のレセプター蛋白質等を有する細胞株、 上記の組換え型 レセプタ一蛋白質等を発現した細胞株などが望ましレ、。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性ィヒ合物、 合成ィ匕 合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用いられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変ィ匕させる化合物または その塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプター蛋白質等、 本発明のレ セプター蛋白質等を含有する細胞、 または本発明のレセプター蛋白質等を含有す る細胞の膜画分を含有するものなどである。
本宪明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1 . スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液およぴ洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコネ土製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清ァノレ ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0 . 4 5 mのフィルターで濾過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。 ② G蛋白質共役型レセプター標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37 °C、 5 % C O 2、 95 % a i rで 2日間培養した もの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水溶液の状態のものを 4 あるいは一 20 °Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 に希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P B Sで 1 mM となるように溶解し、 一 20 °Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 CH O細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 μ 1の測定用緩衝液を 各穴に加える。
② 10— 3〜10— 10Μの試験化合物溶液を 5^ 1加えた後、 標識リガンドを 5 IX 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合 物の代わりに 10— 3Μのリガンドを 5 μ 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識リガンドを 0.2 N NaOH—l%SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ 一ター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式で求める。
PMB= [ (B-NS B) Z (B。一 NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量）
B n ：最大結合量 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプタ一蛋白質等との結合性を変 化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ ターを介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f 0 sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわ ゆる、 本発明のレセプター蛋白質に対するァゴ-スト） 、 （口） 該細胞刺激活个生 を有しない化合物 （いわゆる、 本発明のレセプター蛋白質に対するアンタゴニス ト） 、 （ハ） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を 増強する化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター 蛋白質との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。
本発明のレセプター蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプター蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガ ンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプター蛋白質等に対するアンタゴニストは、 本発明のレセプター 蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リ ガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増強する化 合物は、 本発明のレセプター蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を減少させる 化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を減 少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上記の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 実施することができる。 例えば、 上記した本発明のレセプター蛋白質を含有する 医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無 菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 0 k gとし て） においては、 一日につき約 0 . 1〜1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 0 k gとして） においては、 一 日につき約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . ：!〜 2 0 m g程度、 より 好ましくは約 0 . 1〜： L 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
( 8 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化 させる化合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） を含有する各種疾病の予防おょぴ /または治療剤
本発明のレセプター蛋白質は上記のとおり、 例えば中枢機能など生体内で何ら かの重要な役割を果たしていると考えられる。 従って、 本発明のレセプター蛋白 質とリガンドとの結合性を変化させるィ匕合物 （ァゴ二スト、 アンタゴニスト） は、 本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療 剤として用いることができる。
該化合物を本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。 例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 P方腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 ィ匕剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、 塩ィヒナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用 いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 上記予防'治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩ィ匕ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 k gとし て） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜 2 Omgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O k gとして） においては、 一 日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より 好ましくは約 0. ：!〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(9) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の定 本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質等を特異的に認識することができ るので、 被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量、 特にサンドイッチ免疫 測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプター蛋白質等とを競合的に 反応させ、 該抗体に結合した標識化レセプター蛋白質等の割合を測定することを 特徴とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量法、
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量法を提 供する。
上記 (ii) においては、 一方の抗体が本発明のレセプター蛋白質等の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプター蛋白質等の C端部に反応する 抗体であることが好ましい。 本発明のレセプター蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプター蛋白質等の 測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のレセプター蛋白質等に対 する抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗 原量 （例えば、 レセプター蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原 複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む 標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法 を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法おょぴ サンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後に記載するサン ドイツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵 素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 βーガラクトシダ ーゼ、 β—ダルコシダーゼ、 ァノレカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リ ンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス力 ミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチン一アビジン系を 用いることもできる。 抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定ィ匕するのに用いられる化学結合を用いる方 法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識ィヒした本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の本発明のレセプター蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なつ てもよい。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法によるレセプター蛋白質等の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプター蛋白質等 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応およ ぴ 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 レセプ ター蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。 本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原と（F) と抗体と結合した標識抗原 (B ) とを分離し （B /F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B/F分離をポリエチレングリコ —ル、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いる力、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するカ あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識ィ匕抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物し力 4寻られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプター蛋白質またはそ の塩の測定系を構築すればょレ、。 これらの一般的な技術手段の詳細にっレ、ては、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノア ッセィ〕 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 (講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭 和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ 'イン 'ェンジモノジー (Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 |PJ書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) |F0書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) ) 同書 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプター蛋白 質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプター蛋白質またそ の塩を定量することによって、 本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する 各種疾患の診断をすることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプ ター蛋白質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明の レセプター蛋白質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分 画中の本発明のレセプター蛋白質等の検出、 被検細胞内における本発明のレセプ ター蛋白質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 1 0 ) 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法
本発明の抗体は、 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩を特異的に認識することができるので、 細胞膜における本発明のレセプタ 一蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスクリーニングに用 いることができる。
すなわち本発明は、 例えば、
( i ) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の臓器、 ③臓器から単離した組織もし くは細胞等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明の レセプター蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜におけ る本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変ィヒさせるィ匕合物の スクリーニング方法、
(ii) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体等を破壊した後、 細胞膜画分を単離し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセ プター蛋白質またはその部分ペプチドを定量することによる、 細胞膜における本 発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化させる化合物のスク リー-ング方法、
(iii) 非ヒト哺乳動物の①血液、 ②特定の S 、③ βから単離した組織も しくは細胞等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該 受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該蛋白質を確認 することによる、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプ チドの量を変ィ匕させるィ匕合物のスクリ一ユング方法を提供する。 (iv) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体等を切片とした後、 免疫染色法を用いることにより、 細胞表層での該受容体 蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該蛋白質を確認するこ とによる、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの 量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの定 量は具体的には以下のようにして行なう。
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラット、 月巴満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴 呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ス トレス （例えば、 浸水ス トレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過した 後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または臓器 から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等を、 例えば、 適当な緩衝液 （例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 へぺス緩衝 液など） 等に懸濁し、 臓器、 組織あるいは細胞を破壊し、 界面活性剤 (例えば、 トリ トン X 1 0 0 TM、 ツイーン 2 0 TMなど） などを用い、 さらに遠心分離ゃ濾 過、 カラム分画などの手法を用いて細胞膜画分を得る。 細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破粋方法としては、 Potter—
Elvehjem型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮーリングプレンダーゃポリ トロン （Kinematica社製） のよる破碎、 超音波による破碎、 フレンチプレスなど で加圧しながら細胞を細いノスレレから嘖出させることによる石皮碎などが挙げられ る。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力によ る分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （5 0 0 r p n！〜 3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 ( 1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られ る沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプター蛋白質等と細胞由 来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドは、 例えば、 本発明の抗体を用レ、たサンドィッチ免疫測定法、 ウェスタンプロッ ト解 析などにより定量することができる。
かかるサンドィツチ免疫測定法は上記の方法と同様にして行なうことができ、 ウェスタンプロットは自体公知の手段により行なうことができる。 (ii) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを発現する形質転 換体を上記の方法に従い作製し、 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋白 質またはその部分べプチドを定量することができる。 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの量を変化 させる化合物のスクリーユングは、
( i ) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、 薬剤あるいは物理的 ストレスなどを与える一定時間前 （ 3 0分前〜 2 4時間前、 好ましくは 3 0分前 〜 1 2時間前、 より好ましくは 1時間前〜 6時間前） もしくは一定時間後 （ 3 0 分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ましくは 1時間後〜 2 4時 間後） 、 または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に被検化合物を投与し、 投与 後一定時間経過後 （3 0分後〜 3日後、 好ましくは 1時間後〜 2日後、 より好ま しくは 1時間後〜 2 4時間後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質また はその部分べプチドの量を定量することにより行なうことができ、
(ii) 形質転換体を常法に従い培養する際に被検化合物を培地中に混合させ、 一定時間培養後 （1日後〜 7日後、 好ましくは 1日後〜 3日後、 より好ましくは
2日後〜 3日後） 、 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分べ プチドの量を定量することにより行なうことができる。 細胞膜画分に含まれる本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの確 認は具体的には以下のようにして行なう。
(iii) 正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど、 より具体的には痴呆ラッ ト、 肥満マウス、 動脈硬化ゥサギ、 担癌マウスなど） に対して、 薬剤 （例えば、 抗痴呆薬、 血圧低下薬、 抗癌剤、 抗肥満薬など） あるいは物理的ストレス （例え ば、 浸水ストレス、 電気ショック、 明暗、 低温など） などを与え、 一定時間経過 した後に、 血液、 あるいは特定の臓器 （例えば、 脳、 肝臓、 腎臓など） 、 または 臓器から単離した組織、 あるいは細胞を得る。 得られた臓器、 組織または細胞等 を、 常法に従い組織切片とし、 本発明の抗体を用いて免疫染色を行う。 細胞表層 での該受容体蛋白質の染色度合いを定量化することにより、 細胞膜上の該蛋白質 を確認することにより、 定量的または定性的に、 細胞膜における本発明のレセプ ター蛋白質またはその部分ペプチドの量を確認することができる。
(iv) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分べプチドを発現する形質転 換体等を用いて同様の手段をとることにより確認することもできる。 本発明のスクリーユング方法を用いて得られるィ匕合物またはその塩は、 細胞膜 における本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの量を変ィヒさせる作 用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） 細胞膜における本発明のレセプタ 一蛋白質またはその部分ぺプチドの量を増加させることにより、 G蛋白質共役型 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシ トーノレリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c _ f o sの活 性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を増強させる化 合物、 （口） 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチド の量を減少させることにより、 該細胞刺激活性を減弱させる化合物である。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の 化合物であってもよい。
該細胞刺激活性を増強させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。
該細胞刺激活性を減弱させる化合物は、 本発明のレセプター蛋白質等の生理活 性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を医薬組成 物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 上記 した本発明のレセプター蛋白質を含有する医薬と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌†生溶液、 懸濁液剤などとすることがで さる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （6 0 k gとし て） においては、 一日につき約 0 . 1〜： 1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜 2 O m gである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なる力 s、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （6 O k gとして） においては、 ― 日につき約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . l〜2 0 m g程度、 より 好ましくは約 0 . 1〜 1 0 m g程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
( 1 1 ) 細胞膜における本発明のレセプター蛋白質またはその部分ペプチドの 量を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および _ または治療剤
本努明のレセプター蛋白質は上記のとおり、 例えば、 中枢機能など生体内で何 らかの重要な役割を果たしていると考えられる。 したがって、 細胞膜における本 発明のレセプター蛋白質またはその部分ぺプチドの量を変化させる化合物は、 本 発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療斉 ij として用いることができる。 該化合物を本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および /または治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。
例えば、 該ィ匕合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該ィヒ合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができ る。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるよ うにするものである。 錠剤、 力プセノレ剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 ァノレギン酸などのような月彭 ィ匕剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 ？し糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油†生液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用 いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 上記予防'治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールな ど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤な どと配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 癌患者 （60 k gとし て） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 癌患者 （60 k gとして） においては、 一 日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より 好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。 . (12) 本発明のレセプター蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対 する抗体による中和
本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩に対する抗 体の、 それらレセプター蛋白質などに対する中和活性とは、 すなわち、 該レセプ ター蛋白質の関与するシグナル伝達機能を不活性ィ匕する活性を意味する。 従って、 該抗体が中和活性を有する場合は、 該レセプター蛋白質の関与するシグナル伝達、 例えば、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活' 14 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c- f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を不活性ィ匕することができる。 したがって、 該レセプター蛋白質の過剰発現など に起因する疾患の予防および/または治療に用いることができる。
( 1 3 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする D NAを有す る動物の作製
本発明の D NAを用いて、 本発明のレセプター蛋白質等を発現するトランスジ エニック動物を作製することができる。 動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する場合がある） が挙げれるが、 特に、 マウス、 ゥサギなどが好適で ある。
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で 発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラタトとして用いる のが一般に有利である。 例えば、 ゥサギ由来の本発明の D NAを転移させる場合、 これと相同性が高レ、動物由来の本発明の D N Aを動物細胞で発現させうる各種プ 口モーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 ゥサギ受精卵へ マイクロインジェクションすることによって本発明のレセプター蛋白質等を高産 生する D N A転移動物を作出できる。 このプロモーターとしては、 例えば、 ウイ ルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモーターも 使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモーターゃェ ノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。 受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のレセプター蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全て その胚芽細胞おょぴ体細胞の全てに本発明のレセプター蛋白質等を有することを 意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞おょぴ体細胞 の全てに本発明のレセプター蛋白質等を有する。
本発明の D NA転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D N Aを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明のレセプター蛋白質等が高発現さ せられているので、 本発明のレセプター蛋白質等に対するァゴニストまたはアン タゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明の D NA転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の D NA転移マウスの組織中の D NAもしくは R NAを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプター蛋白質が存 在する組織を分析することにより、 本発明のレセプター蛋白質等について分析す ることができる。 本発明のレセプター蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培 養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一 般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞 を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能 である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセプター蛋白質等 を単離精製することも可能である。 本明細書おょぴ図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P Aし一 I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号める いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
D NA デォキシリボ核酸
c D NA 相補的デォキシリボ核酸
A アデユン
T チミン
G グァユン
C シトシン
R NA リボ核酸 mRNA メッセンジャーリボ核酸 d ATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L e u ロイシン
I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレ才ニン
Cy s システィン
Me t メチォニン
G 1 u グノレタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g ァノレギニン
H i s
P h e フエニノレアラユン
T y r チロシン
T r p
P r o プロリン
A s n
G 1 n グノレタミン p G 1 u ピログノレタミン酸
終止コドンに対応する
Me メチル基
E t ェチル基
B u プチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルボキサミ ド基 また、 本明細 ΐ ：中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s 一トノレエンスノレフォニノレ
CHO ホルミル
Β ζ 1
Cl2Bzl 2, 6—ジクロロべンジノレ
B om ベンジノレ才キシメチノレ
Z ベンジノレオキシカルポ'二ノレ
C 1 -Z 2—クロ口ペンジノレオキシカノレポニノレ
B r— Z 2一ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c tープトキシカノレポ二ノレ
DNP ジニトロフエノ一ノレ
T r t 卜リチル
Bum t—プトキシメチル
Fm o c N- 9—フルォレニノレメ トキシカノレポ二ル
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリァゾール
HOOB t 3， 4ージヒドロー 3—ヒドロキシ一 4ーォキソ一
1， 2, 3—べンゾトリァジン
HONB ： 1 -ヒドロキシ- 5 -ノルボルネン- 2， 3-ジカルボキシイミ ド DCC ： N、 N' —ジシクロへキシルカルポジイミ ド 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
配列番号： 1
本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 TGR 7のァミノ酸酉己 列を示す。
配列番号： 2
本発明のヒト由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 TGR 7をコードする c DN Aの塩基配列を示す。
配列番号： 3
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマー 1の塩基配列を示す。 配列番号： 4
以下の実施例 1における P C R反応で使用したプライマー 2の塩基配列を示す。 配列番号： 5
以下の実施例 2における TaqMan PCR反応で使用したフォヮ一ドプライマ一の塩 基配列を示す。
配列番号： 6
以下の実施例 2における TaqMan PCR反応で使用したリパースプライマーの塩基 配列を示す。
配列番号： 7
以下の実施例 2における TaqMan PCR反応で使用したプローブの塩基配列を示す。 以下の実施例 1で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escherichia coli) T0P10/PCR2.1- TGR7は、 平成 12年 5月 1日から、 ブタぺスト条約の下、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センター （I POD) に寄託番号 FERM BP— 7151として、 また、 平成 12年 4月 2◦日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2—17— 85の 財団法人 ·発酵研究所 (I FO) に寄託番号 I FO 16422として寄託され ている。 以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子は、 モレキュラー - クローニング（Molecular cloning)に記載されている方法に従った。 実施例 1
ヒト肝臓由来 G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする c DNAのクロー ニングと塩基配列の決定
ヒト肝臓 cDNA (CL0NTECH社） を铸型とし、 2個のプライマー、 プライマー 1 (配列番号： 3) およびプライマー 2 (配列番号： 4) を用いて PCR反応を 行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DNAを 3 μ 1餘型として使用し、 Advantage- 2 Polymerase Mix (CL0NTECH社） Ι μ ΐ、 プライマー 1 (配列番 号： 3) およびプライマー 2 (配列番号： 4) を各 0. 2μΜ、 dNTPmixを 200 ίΜ, および酵素に添付のバッファーを 5 μ 1加え、 50 i lの液量とし た。 PCR反応は、 95°C ' l分の後、 95°C ' 30秒、 68°C · 2分のサイク ルを 5回、 95°C ' 30秒、 66°C ' 30秒、 68 °C · 2分のサイクルを 5回、 95°C · 30秒 \ .64°C · 30秒、 68 °C · 2分のサイクルを 30回繰り返し最 後に 68°C ' 7分の伸長反応を行った。 該 PCR反応産物を TOPO— TAクロ 一二ングキット （Invitrogen社） の処方に従いプラスミドベクター p C R 2. 1 (Invitrogen社） へクローニングした。 これを大腸菌 T O P 10に導入し、 cD NAを持つクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した。 個々のク ローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす る cDNAを得た （配列番号： 2) 。 配列番号： 2で表わされる塩基配列により 導き出されるアミノ酸配列を有する新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質を TG R 7と命名した。 また、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAを含 有する DN Aで形質転換された形質転換体を大腸菌 (Escherichia coli)
T0P10/pCR2.1-TGR7と命名した。
TGR 7の疎水性プロット図を図 1に示す。 実施例 2
TaqMan PCRを用いた TGR7 の発現組織分布の解析 まずプライマー及びプローブは Primer Express ver. 1. 0 ( PEパイオシステ ムズジャパン） を用いてデザインし、 フォワードプライマー TGR7TQF ( 5' ― TTCGA ATGCA CAGGA ACCC一 3， （配列番号： 5 ) ) 、 リバースプライマー TGR7TQR ( 5' 一 GGAAG CCATG CTGAA GAGGA A - 3' (配列番号： 6 ) ) 、 プロ一 プ TGR7TQP ( 5， - TTCTG CATCT ATATC CTCAA CCTGG CGG - 3' (配列番号： 7 ) ) を作製した。 プローブのリポーター色素は FAM ( 6-carboxyfluorescein ) を付 力 Dした。
スタンダード cDNAは、 pCR2. 1- TGR7を铸型にしてプライマー 1 (配列番号： 3 )、 プライマー 2 (配列番号： 4 )を用いて増幅した PCR断片を QIAquick PCR Purification Kit [ QIAGEN ( Germany ) ] にて精製し、 10ο一 106 コピー / μ ΐ に調製して用いた。
各組織の cDNAソースは Human Tissue cDNA Panel I及び Panel II
[ CLONTECH Laboratories, Inc. ( CA， USA ) ] を用いた。
TaqMan PCRは、 TaqMan Universal PCR Master Mix ( PEバイオシステムズジ ャパン ） の試薬を用い、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System ( PE バイオシステムズジャパン） にて、 添付の説明書に従い反応させた。 ， 結果を図 3およぴ表 1に示した。 TGR7は精巣に高い発現が見られた。
脳肺胎肝骨卵小大心白
盤臓腸臓臓腸血格腺巣立
組織腺力
(コピー/ 1 )
0
4
4
4
4
1
5
7
1 0 4
8 1
1 5 3
2 8 8
1 0
3 2
6 6
1 4 1 産業上の利用の可能性
本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはそ の塩、 該レセプター蛋白質またはその部分ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチ ド （例えば、 D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） は、 ①リガンド （ァゴエス ト） の決定、 ②抗体および抗血清の入手、 ③組換え型レセプター蛋白質の発現系 の構築、 ④同発現系を用いたレセプター結合ァッセィ系の開発と医薬品候補化合 物のスクリーニング、 ⑤構造的に類似したリガンド'レセプターとの比較にもと づいたドラッグデザィンの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブや P C Rプライ マーの作成のための試薬、 ⑦トランスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予 防 ·治療 ^¾等の医薬等として用いることができる。 配列表フリーテキスト
SEQ ID NO: 3
Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR7
SEQ ID NO: 4 Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding TGR7 SEQ ID NO: 5
Designed oligonucleotide forward primer for TaqMan PCR SEQ ID NO: 6
Designed oligonucleotide reverse primer for TaqMan PCR SEQ ID NO: 7
Designed oligonucleotide probe for TaqMan PCR

Claims

請 求 の 範 囲
I . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはそ の塩。
2 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分べプチドまたはその
3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするポリヌクレオ チドを含有するポリヌクレオチド。 '
4 . D N Αである請求項 3記載のポリヌクレオチド。
5 . 配列番号： 2で表される塩基配列を有する請求項 3記載のポリヌクレオチド。
6 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドを含有する糸且換えべクタ一。
7 . 請求項 6記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
8 . 請求項 7記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ ター蛋白質を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プター蛋白質またはその塩の製造法。
9 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 2記載の部 分べプチドまたはその塩に対する抗体。
1 0 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不活性 化する中和抗体である請求項 9記載の抗体。
I I . 請求項 9記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 2 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分べプチドまたはその塩を用いることにより得られうる請求項 1記載の G蛋白 質共役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンド。
1 3 . 請求項 1 2記載の G蛋白質共役型レセプターのリガンドを含有してなる医
1 4 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共 役型レセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
1 5 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分ぺプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリ一ユング方法。
1 6 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは請求項 2記載の 部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記載 の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング用キット。
1 7. 請求項 1 5記載のスクリ一ユング方法または請求項 1 6記載のスクリ一二 ング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 8 . 請求項 1 5記載のスクリ一ユング方法または請求項 1 6記載のスタリ 二 ング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有し てなる医薬。 "
1 9. 請求項 3記載のポリヌクレオチドとノ、イストリンジヱントな条件下でハイ
2 0 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含 有してなるポリヌクレオチド。
2 1 . 請求項 3記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とす る請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の m R N Aの定量方法。 2 2 . 請求項 9記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共 役型レセプター蛋白質の定量方法。
2 3 . 請求項 2 1または請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする請 求項 1記載の G蛋白質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断方法。
2 4 . 請求項 2 1記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一ユング方法。
2 5 . 請求項 2 2記載の定量方法を用いることを特徴とする細胞膜における請求 項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変ィ匕させる化合物またはその塩 のスクリーユング方法。
2 6 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法を用いて得られうる請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩。 2 7 . 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られうる細胞膜における 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物またはそ の塩。
2 8 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法を用いて得られうる請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含 有してなる医薬。
2 9 . 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られう.る細胞膜における 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる化合物またはそ の塩を含有してなる医薬。
3 0 . 中ネ区疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治 療剤である請求項 1 8、 2 8または 2 9記載の医薬。
3 1 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器 疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治療方法。
3 2 . 哺乳動物に対して、 請求項 2 4記載のスクリーニング方法を用いて得られ うる請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変化させる化合 物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性疾患、 循 環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 '治療方法。
3 3 . 哺乳動物に対して、 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られ うる細胞膜における請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化さ せる化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患、 炎症性 疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治療方法。
3 4 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治 療剤を製造するための請求項 1 5記載のスクリーニング方法または請求項 1 6記 載のスクリーニング用キットを用いて得られうるリガンドと請求項 1記載の G蛋 白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物または その塩の使用。
3 5 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 *治 療剤を製造するための請求項 2 4記載のスクリーニング方法を用いて得られうる 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現量を変ィ匕させる化合物ま たはその塩の使用。
3 6 . 中枢疾患、 炎症性疾患、 循環器疾患、 癌、 糖尿病または不妊症の予防 ·治 療剤を製造するための請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られうる 細胞膜における請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質量を変化させる 化合物またはその塩の使用。
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