WO2001060405A1 - Inducteur de l'apoptose specifique a l'eosinophilie - Google Patents

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WO2001060405A1
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eosinophils
apoptosis
heavy chain
monoclonal antibody
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Emi Shoji
Kazuyasu Nakamura
Masamichi Koike
Kenya Shitara
Nobuo Hanai
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to an apoptosis-inducing agent and a therapeutic agent for eosinophilic diseases, which contain, as an active ingredient, an antibody that specifically reacts with eosinophils and induces apoptosis of eosinophils. Further, the present invention provides a method for specifically inducing apoptosis to eosinophils using the antibody, and a method for specifically reducing or eosinophils in peripheral blood or tissues infiltrated with eosinophils. It relates to a method of removing.
  • Eosinophils have been shown to be linked to various diseases including allergic diseases, and play an important role in the pathogenesis of allergic diseases such as chronic bronchial asthma and atopic dermatitis. It has been considered [Advances 'in' Immunol. (Adv. Immunol.), 39, 177 (1986), Immunol. Today, 13, 501 (1992)].
  • eosinophilia eosinophilia eosinophilic gastroenteritis, eosinophilic leukemia, eosinophilic granuloma, Kimura disease, etc.
  • HES hyperedinophilic syndrome
  • Eosinophilic granuloma is an osteolytic, localized, and non-neoplastic lesion of unknown origin, a disease known to involve numerous eosinophil infiltrates [US Armed Forces Med.
  • IL-5 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • Anti-IL-5 antibodies have been developed as anti-inflammatory agents.
  • SB-240563 Smith Kleinby Cham
  • a humanized anti-IL-5 antibody has been shown to reduce eosinophil counts in peripheral blood in patients with mild asthma (100th Annual Meetings of the American Society for Clinical Pharmacology) and Therapeutics, March / 1999)
  • Matahibokui ⁇ IL- 5 is antibody Sch_55700 (CDP- 835) (Schering 'Plow / Celltech) pulmonary eosinophilic according ⁇ stimulation in monkey allergy model It is known to suppress proliferation [Arzneiidttel-Forschung, 49, 779 (1999)].
  • eosinophil activation and lifespan extension are possible with IL-3 or GM-CSF alone [J. Clin. Invest., 81, 1986 (1988)], and IL-3 or GM-CSF also predominantly induce bone marrow stem cells to eosinophil precursor cells [Blood, 76, 1956 (1990)].
  • eosinophils migrate to inflamed areas by chemokines such as eotaxin and RANTES (regulated on activation normal T-cell expressed and secreted), etc. [Clinicalile, and dexperimen allergy (Clin. Exp. Allergy), 26, 1005 (1996)], and stem cell factor (hereinafter referred to as SCF) is also involved in the accumulation of eosinophils in allergic bronchitis.
  • SCF stem cell factor
  • Eosinophils include subgroups of normal-density eosinophils (normodense eosinophil) and low-density eosinophils (hypodense eosinophil). [Immunology, 47, 531 (1982)]. Low-density eosinophils are also called activated eosinophils. It has been reported that eosinophils undergo qualitative changes in addition to numerical changes in peripheral blood of HES patients [Clin. Exp. Immunol., 4, 423 (1976)], activated eosinophils have been shown to be closely associated with the severity of HES pathology [American 'Journal of Ob' Cardiology (Am. J.
  • activated eosinophils have also been found in peripheral blood or bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of patients with bronchial asthma [Am. Rev. Respir. Dis, 132, 981 (1985) ].
  • BALF bronchoalveolar lavage fluid
  • Activated eosinophils have more active expression of various receptors such as cytokines than epsilon eosinophils [Journal 'Ob' Immunology (J. Immunol.) , 142, 4416
  • examples of drugs that suppress eosinophil function include substances that have an inhibitory action on cytokines or chemokines involved in eosinophil differentiation or proliferation.
  • these drugs are unlikely to act on cytokinin-independent eosinophils that have invaded and activated local inflammation. Therefore, in order to suppress any eosinophil function, it is necessary to specifically inhibit eosinophils and to induce cell death even for activated eosinophils.
  • Steroids are the main treatment for patients with eosinophilic disease at present, but they do not avoid the side effects of steroids. Also, if steroid administration is discontinued, the patient's condition will return to normal, and long-term administration of steroid will have disadvantages such as acquiring tolerance. At present, it is difficult to suppress eosinophilia, and in fact it relies on symptomatic treatment.
  • apoptosis can be specifically induced in human eosinophils using an anti-IL-5 receptor chain antibody having an Fc region of the human IgGl subclass disclosed in W097 / 10354, was found to be due to antibody-dependent cytotoxic activity.
  • eosinophil apoptosis due to antibody-dependent cytotoxicity does not release cytotoxic proteins, reduction of side effects can be expected.
  • IL-5 independent Activated eosinophils that are sexually induced also show that apoptosis is induced by the antibody, indicating that the antibody is useful in the treatment of eosinophilic diseases.
  • the present invention relates to the following (1) to (20).
  • An apoptosis-inducing agent containing, as an active ingredient, an antibody that specifically reacts with eosinophils and induces apoptosis of eosinophils.
  • the apoptosis-inducing agent according to the above (1) or (2), wherein the antibody that specifically reacts with eosinophils is an anti-human interleukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody.
  • the anti-human interleukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody is an anti-human interleukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody produced in animal cells.
  • a therapeutic agent for eosinophilic disease which comprises, as an active ingredient, an antibody that specifically reacts with eosinophils and induces apoptosis of eosinophils.
  • the anti-human interleukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody is an anti-human in-leukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody produced in animal cells.
  • the antibody that specifically reacts with eosinophils specifically reduces or reduces eosinophils according to (16) or (17) above, which is an anti-human interleukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody. How to get rid of it.
  • the anti-human interleukin 5 receptor heavy chain monoclonal antibody is an antibody produced by a transformant KM8399 (FERM BP-5648).
  • a transformant KM8399 FERM BP-5648
  • any antibody can be used as long as it specifically reacts with eosinophils and can induce apoptosis in eosinophils.
  • Antibodies that specifically react with eosinophils include antibodies against receptors expressed on the surface of eosinophils.
  • Antibodies to the receptor expressed on the surface of eosinophils include anti-human interleukin 5 receptor / chain antibody, anti-human influenza leukin 3 receptor antibody, anti-human monocyte 'macrophage-colony stimulating factor receptor Antibodies, anti-human interleukin 5 receptor heavy chain (hereinafter referred to as ML-5R) antibody and the like.
  • ML-5R anti-human interleukin 5 receptor heavy chain
  • an anti-hIL-5Ra antibody is used.
  • Antibodies that induce apoptosis of eosinophils include eosinophil differentiation or proliferation. Antibodies that have an inhibitory activity on the involved signal transduction action, or antibodies that have a cytotoxic activity, and the like. In order to induce apoptosis of any eosinophils described below, a cytotoxic activity is required. Are preferred.
  • antibodies that specifically react with eosinophils and can induce apoptosis of eosinophils include antibodies against receptors expressed on the surface of eosinophils that have antibody-dependent cytotoxic activity.
  • an anti-hIL-5R antibody having antibody-dependent cytotoxicity is used.
  • an antibody against an eosinophil surface-expressed receptor produced in an animal cell line such as CH0 cell, YB2 / 3.0-Ag20 cell, SP2 / 0-AG14 cell, NS0 cell, preferably produced in an animal cell line Anti-ML-5R antibody.
  • an antibody against a receptor expressed on the surface of human IgGl-type eosinophils can be mentioned, and preferably, an anti-hIL-5R antibody of human IgGl type can be mentioned.
  • an anti-ML-5R human CDR-grafted antibody KM8399 produced by a transformant KM8399 (FERM BP-5648).
  • Anti-IL-5 receptor chain antibody can be obtained based on the method described in W097 / 10354.
  • anticoagulant-treated peripheral blood is prepared.
  • the anticoagulant include heparin sodium, disodium EDTA ⁇ 2, and potassium EDTA ⁇ 2.
  • Heparin sodium is usually used in 100 units per 20-30 ml of peripheral blood.
  • PBMC peripheral blood-derived mononuclear cells
  • Lymphopre Polymorphoprep (manufactured by Nycomed)
  • Ficoll manufactured by NYCOMED
  • Fico 11 Fico 11 [manufactured by Sigma]. Separation can also be performed by using a separation medium in which the density of Pacol (Pharmacia) adjusted to 0.15M NaCl is adjusted from 1.085 to 1.088 by a densitometer. All centrifugation using the above-described separation medium is performed at room temperature.
  • the granulocytes isolated in (1) above contain neutrophils, eosinophils and, in some cases, erythrocytes. Erythrocytes can be removed by lysing erythrocytes by any of the following methods.
  • Ice-cold distilled water is added to the pellet of granulocytes containing erythrocytes in a centrifuge tube to add turbidity, and 30 seconds later, 1/10 volume of ice-cooled 10-fold isotonic buffer is added to cause hemolysis. Stop the reaction. Remove supernatant by centrifugation at 400 xg for 5 minutes at 4 ° C. By repeating this several times, red blood cells can be removed.
  • an ice-cooled 0.2% NaCl solution is added to the granulocyte pellet containing erythrocytes to suspend the suspension.After 15 seconds, an equal volume of an ice-cooled 1.6% NaCl solution is added to stop the hemolytic reaction. Red blood cells can also be removed by centrifugation at 300 g for 300 minutes [Clinical Immunity, 9 (Suppl. 17), 41 (1997)].
  • neutrophils After removing red blood cells, neutrophils are removed.
  • Neutrophils can be removed by performing negative sorting on the CD16 antigen expressed on the neutrophil surface.
  • granulocytes and a mouse anti-CD16 antibody are allowed to react and bind to each other, and then dynabeads (manufactured by DYNAL) immobilized on a mouse anti-mouse antibody are added.
  • CD16-positive cells to which dynabeads are bound are collected using a magnetic bead accumulator MPC-1 [manufactured by DYNAL], and eosinophils can be separated by collecting the remaining floating cells [ J. Immunol., 24, 518 (1994), Journal 'Ob' Immunological 'Methodology, Allergy, 50, 34 (1995); (J. Immunol. Methods), 122, 97 (1989)].
  • Activated eosinophils can be obtained by culturing eosinophils isolated from peripheral blood with IL-3 for several days [Jan Clin Clinical Investigation (J. Clin. Invest.), 81,1986 (1988)] or by co-culturing with PBMC for 2 days. In addition, blood collected from a living body is centrifuged by changing the density of the separation medium used for cell separation. Activated eosinophils with a lower specific gravity than normal can be obtained [Clin. Exp. Immunol., 85, 312 (1991)], Activation Eosinophils can be identified by the expression of the CD69 molecule [Journal of 'Experimental' Medicine (Exp. Med.), 172, 701 (1990)].
  • FCS Fetal calf serum
  • Neutral eosinophils die by inhibiting the signaling involved in eosinophil differentiation and proliferation.
  • low-density eosinophils activated eosinophils
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • Death is caused by cytotoxic activities such as inflammatory cytotoxic activity (ADCC).
  • Cell death may be due to the induction of necrosis or the induction of apoptosis, and the detailed mechanism of action has not yet been resolved.
  • cytotoxic activity is not always the case of apoptosis induction, but also may be the result of necrosis induction.
  • the following methods can be used to determine which of the above causes and the phenomenon of cell death observed when eosinophils are caused to act on eosinophils.
  • One method for detecting cell death due to necrosis is a method for staining intracellular DNA with PI (Propidium Iodide) reagent.
  • One method for detecting cell death due to apoptosis is a method using Annexin V Is raised. Specifically, using the measurement of cell surface phosphatidylserine (hereinafter referred to as PS) by annexin V [Journal of Immunol. Methods (J. Immunol. Methods), 217, 61 (1998)] as an index, Cell death due to apoptosis can be detected by the method described in (1).
  • ADCC activity By measuring ADCC activity), the induction of apoptosis to target cells can be confirmed.
  • one effector cell and a target cell are used.
  • Effector cells include nacellular killer cells (NK) cells, large granular lymphocytes (LGL), or PBMs containing them, neutrophils, eosinophils, leukocytes having Fc receptors on the cell surface, such as macrophages, etc. can give.
  • NK nacellular killer cells
  • LGL large granular lymphocytes
  • PBMs containing them neutrophils, eosinophils, leukocytes having Fc receptors on the cell surface, such as macrophages, etc.
  • the effector cells can be isolated according to the method described in 1.
  • any cells may be used as long as they express the antigen recognized by the antibody to be evaluated on the surface.
  • examples include eosinophils that express the IL-5 receptor on the cell surface.
  • the overnight get cells are labeled with a detectable reagent to detect cytotoxicity.
  • the labeling reagent a radioactive substance in a sodium chromate (Na 2 51 Cr0 4, hereinafter referred to as 51 Cr) [Imunoroji one (Immunology), 14, 181 ( 1968)], the force Rusein - AM (calcein -
  • An apoptosis-inducing agent containing, as an active ingredient, an antibody that induces an antibody, for example, an anti-hIL-5R antibody, preferably an anti-ML-5R antibody produced in animal cells, causes eosinophils from peripheral blood or eosinophil-infiltrated tissues.
  • the spheres can be specifically reduced or eliminated.
  • the direct action of the hIL-5R heavy chain monoclonal antibody KM8399 on peripheral blood or tissues induces apoptosis specifically in eosinophils, resulting in eosinophils in peripheral blood or tissues infiltrated with eosinophils.
  • the sphere can be reduced or eliminated.
  • the apoptosis-inducing agent or the therapeutic agent for eosinophil disease containing an antibody that specifically reacts with eosinophils and induces apoptosis of eosinophils as an active ingredient is administered alone as a drug although it is possible, it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and provided as a pharmaceutical preparation produced by any method well-known in the technical field of pharmaceutics. It is desirable.
  • intravenous administration can be preferably used.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol It can be produced using a binder such as hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both. It is prepared by
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids. Sprays are prepared using the antibody preparation itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory tract mucosa of the recipient and disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosol and dry powder can be prepared.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 g / kg to 8 mg / kg per day for an adult.
  • the eosinophilic diseases include allergic diseases such as bronchial asthma and atopic dermatitis, eosinophilic pneumonia, eosinophilic hyperplasia including idiopathic eosinophilia, and It refers to diseases caused by eosinophils, such as hypereosinophilic syndrome (HES) such as eosinophilic gastroenteritis, eosinophilic leukemia, eosinophilic granuloma and Kimura's disease.
  • HES hypereosinophilic syndrome
  • the apoptosis-inducing agent and the therapeutic agent for eosinophilic disease of the present invention can be used as the therapeutic agent for the above-mentioned eosinophilic disease.
  • FIG. 1 is a view showing the inhibitory effect of IL-5-dependent prolonged survival in vitro using eosinophils isolated from peripheral blood.
  • the vertical axis shows% annexin V positive by inhibition of the activity of recombinant human IL-5 (hereinafter referred to as rhIL-5), and the horizontal axis shows each antibody.
  • Human IgGl was used as a negative control.
  • FIG. 2 is a diagram showing staining properties of the eosinophil fraction after reaction with the added antibody with respect to each reagent.
  • the vertical axis indicates the percentage of each reagent positive relative to the total number of eosinophils, and the horizontal axis indicates the staining reagent.
  • Annexin V-FITC-positive cells indicate cells that have undergone apoptosis, and PI-positive cells indicate cells that have undergone necrosis.
  • FIG. 3 shows the cell specificity of the apoptosis-inducing effect of KM8399.
  • the vertical axis shows% annexin V positive, and the horizontal axis shows cell population.
  • FIG. 4 shows the presence or absence of apoptosis-inducing effects of KM8399 and TRFK5.
  • the vertical axis shows the percentage of Annexin V positive, and the horizontal axis shows the added antibody.
  • FIG. 5 is a graph showing the concentration dependence of the apoptosis-inducing effect of KM8399. Vertical axis Indicates the percentage of Annexin V positive, and the horizontal axis indicates the added antibody.
  • FIG. 6 shows the apoptosis-inducing effect in the presence of cytokines.
  • the vertical axis shows% annexin V positive, and the horizontal axis shows added cytokines.
  • FIG. 7 shows the quantitative values of eosinophilic granule protein (EP0) released after ADCC activity.
  • the vertical axis indicates the ratio to the total cell number), and the horizontal axis indicates the added antibody.
  • FIG. 8 shows the quantitative values of eosinophilic granule protein (EDN) released after ADCC activity.
  • EDN eosinophilic granule protein
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of visual observation of eosinophils.
  • the vertical axis indicates the dead cells%, and the horizontal axis indicates the added antibody.
  • FIG. 10 shows the enrichment of the CD16-positive cell population by KM8399.
  • the vertical axis shows the percentage of CD16-positive cells in all granulocytes, and the horizontal axis shows antibodies.
  • FIG. 11 is a diagram showing the apoptosis-inducing effect on activated eosinophils.
  • the vertical axis indicates annexin V positive, and the horizontal axis indicates antibodies.
  • heparin sodium injection Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 60 ml of healthy human peripheral blood was collected.
  • the whole amount was diluted twice with an equal amount of physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to make 120 ml.
  • Lymphoprep [Nicomed (NYC0MED)] was dispensed 5 ml at a time into 12 15 ml centrifuge tubes (manufactured by Sumitomo Bei-Client). Centrifuged at 800 xg for 20 minutes.
  • the PBMC fraction between the plasma layer and the lymphoprep layer was collected from all the centrifuge tubes and suspended in RPMI 1640 medium [GIBCO (GIBC0)] containing 1% FCS (hereinafter referred to as 13 ⁇ 4FCS-RPMI).
  • the suspension was turbid and washed twice by centrifugation at 400 xg for 5 minutes at 4 ° C to obtain effector cells.
  • an aspirator was used to remove the remaining sediment layer, and the remaining four sediment layers were collected in a single 50 ml centrifuge tube (Falcon) using a transfer pipe.
  • hemolysis of erythrocytes was performed by adding 27 ml of ice-cooled distilled water and turbidity. After 30 seconds, 10 times the concentration of the Piase buffer [a buffer consisting of 0.1 M sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 25 mM piperazine-1, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) and 42 mM sodium hydroxide] Add 3 ml to make it isotonic, stop the reaction, 4 ° C For 5 minutes at 400 xg. The supernatant was removed by decantation, and the precipitate was well suspended in 3 ml of a piase buffer.
  • the Piase buffer a buffer consisting of 0.1 M sodium chloride, 5 mM potassium chloride, 25 mM piperazine-1, 4-bis (2-ethanesulfonic acid) and 42 mM sodium hydroxide
  • 1% FCS-PIPES 1% FCS-containing buffer
  • Various antibodies include anti-human IL-5R chain antibody KM8399 and KM9399 (W097 / 10354), anti-human IL-5 antibody TRFK5 (Pharmingen), and control antibodies
  • An anti-ganglioside GM2 monoclonal antibody KM8969 Japanese Patent Laid-Open No. 10-257893, which is human IgGl, was used.
  • Eosinophils separated to high purity (purity of 95% or more) using the method of Example 1 were adjusted to 2 ⁇ 10 6 cells / ml with 1 FCS-RPMI, and 100 ⁇ l each was placed on a 96-well U-shaped plate. Noted.
  • Eosinophils are known to prolong survival in the presence of 0.1 ng / ml rhIL-5 (R & D). Therefore, 0.4 ng / ml rhIL-5 was dispensed at 50 ⁇ 1 / ⁇ .
  • the various antibodies adjusted to 4 g / nil were dispensed at 50 11 / ⁇ l and cultured at 37 ° C. for 24 hours at a total of 200 ⁇ 1 in a 5% CO 2 stream.
  • eosinophils in the gel were stained using Annexin V-FITC kit [TREVIGEN].
  • FS side scattered light
  • SS side scattered light
  • Annexin V-FITC positive cell population based on the total number of target cells was calculated by measuring the first fluorescence (FL1), and was defined as the apoptosis-inducing cell ratio.
  • the percentage of apoptosis-inducing cells was calculated assuming that the percentage of Annexin V-FITC positive without rhIL-5 was 100% and that of Annexin V-FITC positive without rhIL-5 and no antibody was 0%.
  • KM8399 and TRFK5 induced eosinophil apoptosis based on the inhibition of rhIL-5 action to a similar extent. Similar activity was also confirmed with KM9399 (W097 / 10354), a human IgG4 subclass without cytotoxic activity. This indicates that eosinophil apoptosis was induced by the IL-5 inhibitory effect.
  • a 96-well U-shaped plate [manufactured by FALCON] for cell culture was used.
  • a cell suspension prepared at 1 ⁇ 10 7 cells / ml with 1% FCS-RPMI was dispensed at 100 J 1 / well.
  • the eosinophil fraction prepared in Example 1 was adjusted to 8 ⁇ 10 5 cells / ml, and dispensed in 50/1 / well, and the effector / evening ratio (E / T ratio) was set to 25/1, which approximated the ratio in vivo.
  • the medium was removed from the wells, the reagents were reacted with Annexin V-FITC kit (TREVIGEN) according to the attached instructions, and analyzed by flow cytometry.
  • the annexin V positive rate of only the eosinophil fraction was calculated by limiting the measurement target cells in the sample to the eosinophil fraction using FS and SS and measuring the fluorescence intensity of FL1.
  • Example 3 (1) Except that the ADCC reaction time was set to 20 hours, the procedure was performed in the same manner as in Example 3 (1), and apoptosis was examined by single staining with Annexin V. At the time of measurement in the flow cytometer Based on the difference between FS and SS, lymphocytes, monocytes or eosinophils were used to determine the range of fluorescence intensity measurement by Annexin V, and the Annexin V positive rate in each range was determined.Example 3 (1) was detected by the method described in (1).
  • KM8399 which is an IgGl type antibody having ADCC activity
  • KM9399 which is an IgG4 type antibody having almost no ADCC activity
  • an IgGl type anti-ganglioside GD3 monoclonal antibody KM871 [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373-380 (1993)] was used. These antibodies were all tested at a final concentration of 1 ⁇ g / ml. As shown in FIG.
  • Example (2) The eosinophil-specific apoptosis induction of KM8399 shown in Example (2) can be significantly detected as compared with TRFK5 by using PBMC fractions of three healthy individuals. The study was conducted in the same manner as in (1).
  • FIG. 5 shows the results.
  • KM8399 increased apoptosis-inducing activity in an antibody concentration-dependent manner, and maintained its activity even at a final concentration of 0.01 g / ml.
  • KM8399 an anti-human IL-5 receptor heavy chain antibody that binds specifically to eosinophils, has a higher apoptosis-inducing activity than the anti-human IL-5 antibody TRFK5. This indicates that it is more preferable as a therapeutic agent for spherical diseases.
  • ADCC activity in the presence of cytokines Eosinophils were activated in the presence of IL-5, IL-3, and GM-CSF, and the ADCC activity when various antibodies were allowed to act on the eosinophils at 1 g / ml was examined.
  • the PBMC fraction adjusted to twice the concentration of the PBMC fraction used in Example 3 (1) was dispensed at 50 ⁇ l / ⁇ l, and diluted with various cytokines of 4 ng / ml or 12 ng / ml. Add 50 UL 1 / ⁇ ⁇ of the cytokine mixture, and add the eosinophil fraction and the antibody diluent to each well in the same manner as in Example 3 (1) to give a total volume of 200 1 / ⁇ . And The added cytokine was IL-5, IL-3, and GM-CSF (all manufactured by MD), and the mixed solution of the above three types of 4 ng / inl cytokine was used as the mixed solution of the cytokine.
  • Example 3 (1) After completion of the ADCC reaction in the same manner as in Example 3 (1), the plate was centrifuged at 350 xg for 5 minutes at 4 ° C, and the supernatant was transferred to a 1.5 ml tube (manufactured by Eppendorf). C, and used as a quantitative sample of free eosinophilic granule protein described below.
  • a culture supernatant obtained by adding 10 1 / ⁇ of 1% FCS-RPMI containing 10 Triton X and using the cells for lysis was used as a sample.
  • Each culture supernatant sample 50 1 was dispensed in duplicate into a 96-well ELISA plate [manufactured by Greiner], and a chromogenic substrate solution [50 mM sodium citrate (pH 5.0), 0.4 mg / ml o- A solution consisting of phenylenediamine and 30% hydrogen peroxide solution 1/1000] was added in an amount of 100% 1/1, and the color was developed for 30 minutes. Thereafter, 4N sulfuric acid was added at 50 ⁇ 1 / ⁇ to stop color development, and the absorbance at 490 nm was measured with a plate reader (manufactured by Molecular Devices). As shown in FIG. 2, the EP0 release rate by KM8399 was equivalent to that without antibody addition.
  • a sample diluent (Assay diluent) included in an EDN ELISA kit (manufactured by MBL) was added to 50 ⁇ l of the culture supernatant after the ADCC reaction, and the mixture was diluted 5-fold to obtain a measurement sample.
  • the measurement sample was duplicated, and EDN was quantified according to the kit instructions.
  • the absorbance was measured using a plate reader [manufactured by Molecular Devices, Inc.], and the conversion of the concentration in the sample was determined using the soft max [Molecular Devices] based on the standard product in the kit. Seeds (molecular devices)].
  • the EDN release rate of KM8399 was extremely low, and no significant difference was observed as compared with the case where no antibody was added.
  • ju1 of the cell-containing reaction solution is diluted 10-fold with 1% FCS-RPMI, and it is added to the slide glass (Chandon) at a ratio of 100 ⁇ 1 for each sample.
  • Specimens were prepared using two site spins. Similar to the eosinophil purity conversion method, the cells were stained with Diffou Quick Staining Solution (manufactured by Kokusai Reagents), and the number of live eosinophils and the number of dead eosinophils in each slide glass (almost all of the cell morphology were retained). Cells were counted 100 times under a microscope, and the dead cell rate was calculated. As shown in FIG.
  • Granulocytes in peripheral blood consist of CD16 positive neutrophils and a CD16 negative eosinophil fraction.
  • the selective removal of eosinophils from peripheral blood granulocytes was examined by measuring the percentage of CD16-positive cells by the method described below.
  • Lymphocytes and granulocytes were fractionated by the method of Example 1, and 5 ⁇ 10 5 fractions were dispensed at 50 JUL 1 / well into a 96-well U-shaped plate.
  • KM8399 adjusted to 2 ⁇ g / ml with 10% FCS-RPMI was dispensed at 100 ⁇ l / ⁇ l to the plate, and cultured at 37 ° C. for 96 hours under a 5% CO 2 stream. After the culture, the mixture was centrifuged at 350 xg at 4 ° C for 3 minutes, and the supernatant was removed.
  • Buffer solution for measurement [PBS containing 1% bovine serum albumin, 0.0% EDTA (ethylenediamine- ⁇ , ⁇ , ⁇ ,, ⁇ , -tetraacetic acid), 0.05% sodium azide (phosphate-buffer- (Salin)] was added to the cells, and the cells were washed.
  • FITC-labeled anti-CD16 antibody (manufactured by Nippon Becton, Dickinson) was added in 20 JLL 1 / well, followed by reaction on ice for 30 minutes. Thereafter, the mixture was centrifugally washed three times with a measurement buffer, and the fluorescence intensity of FITC was measured overnight at a flow site. The results are shown in FIG. In the KM8399-added group, the number of CD16-negative eosinophils decreased and the number of CD16-positive neutrophils increased in the KM8399-added group compared to the group without the antibody.
  • the method for detecting apoptosis described in 3. (1) above was improved to detect apoptosis on activated eosinophils.
  • Eosinophils (4 ⁇ 10 5 cells / ml) and PBMC (lx10 6 cells / ml) isolated from peripheral blood were dispensed into 96-well plates at 100 ⁇ 1 / ml, and co-cultured for 48 hours. Activated eosinophils were induced. The co-cultured eosinophils expressed the activated eosinophil marker CD69 molecule.
  • the culture supernatant was removed at 100 JUL 1 / ml, and 2 jug / ml of various antibody diluents were added at 100 ⁇ l each (final concentration 1 ig / ml), and the cells were further cultured for 20 hours. After the culture, apoptotic cells were detected by staining with Annexin V-FITC.
  • KM8399 also significantly induced apoptosis on activated eosinophils. Because activated eosinophils survive in the absence of cytokines, inhibition of IL-5 alone cannot eliminate or reduce activated eosinophils. From the above results, it is clear that KM8399 can remove or reduce not only eosinophils in peripheral blood but also activated eosinophils that have infiltrated local inflammation, and should be clinically useful. It has been shown.
  • the apoptosis-inducing agent of the present invention induces apoptosis in an eosinophil-specific manner, and reduces or eliminates eosinophils or activated eosinophils, thereby inducing inflammatory diseases such as chronic bronchial asthma. It is useful for treating eosinophilic diseases such as eosinophilic granuloma.

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Description

明 細
好酸球特異的なアポトーシス誘導剤
技術分野
本発明は、 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対してアポトーシスを 誘導する抗体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤および好酸球性疾患 治療剤に関する。 また、 本発明は該抗体を用いて、 好酸球に対して特異的にアポト 一シスを誘導する方法および末梢血または好酸球の浸潤した組織中の好酸球を特 異的に減少もしくは除去させる方法に関する。
背景技術
好酸球はァレルギー性疾患をはじめとする様々な疾患との関連性が示され、慢性 気管支喘息、ァ卜ピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の病態形成において重要な 働きをしているものと考えられている [ァドバンシーズ'イン'ィムノロジ一（Adv. Immunol . ) , 39, 177( 1986 ) , ィ ムノ ロジ一 ' ト ウディ（Immunol . Today), 13, 501( 1992)] 。
上記疾患のほか好酸球の関連が示唆される疾病として、 好酸球増多症 (eosinophilia 好酸球性胃腸炎、 好酸球性白血病、 好酸球性肉芽腫、 木村病など があげられ、 これらの疾病はハイパーェォジノフィ リック症候群 (HES)と総称され る [アナルズ 'ォブ 'ィン夕一ナル 'メディシン（Ann. Intern. Med. ), 97, 78 ( 1982)]。 好酸球性肉芽腫（eosinophilic granuloma)は骨融解性、 限局性、 そして非腫瘍性 の原因不明の病変であるが、多数の好酸球浸潤を伴うことが知られている疾患であ り [U. S. Armed Forces Med. J. , 2, 1085 ( 1951 )] 、 全国骨腫瘍患者登録一覧表（昭 和 47〜59年）によれば、 骨腫瘍患者の 404人中 379人 (93.8%)が好酸球性肉芽腫で ある。好酸球性肉芽腫の病早期には、好酸球や組織球からなる肉芽腫が主体である が、 末期には線維化し、 肺線維症に移行する場合もある。 このように、 好酸球はァ レルギ一等の炎症性疾患以外でも様々な疾患の原因となり得る。
好酸球の分化■増殖，活性化の調節に関しては、 サイ トカインファミリ一である ィン夕一ロイキン _5 (以下 IL- 5と称す）、 ィン夕ーロイキン _3 (以下 IL- 3と称 す）、 顆粒球-マクロファージコロニ一刺激因子 （以下 GM- CSFと称す） が関与して おり、 これらサイ トカインのうち、 IL- 5 は好酸球に対して特異的に、 好酸球産生 分化の最終段階に働くことが知られている [プロシ一ディング ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス （Proc . Natl . Acad. Sci . U. S.A. )， 85, 2288 ( 1988) ] 。
抗 IL-5抗体は抗炎症剤としての開発がなされている。ヒト化抗 IL- 5抗体である SB-240563 (スミス · クラインビーチャム社） は軽度の喘息患者に対して末梢血中 好酸球数の減少作用を示す（100th Annual Meetings of the American Society for Clinical Pharmacology and Therapeutics, March/1999)0 またヒ卜ィ匕抗 IL— 5抗 体である Sch_55700(CDP- 835 ) (シエーリング 'プラウ/セルテック社） もサルの アレルギーモデルにおいて钪原刺激による肺の好酸球増多を抑制することが知ら れている [Arzneiidttel- Forschung, 49, 779 ( 1999)] 。
試験管内では IL- 3または GM-CSF単独でも好酸球活性化や寿命延長は可能であり [ジャーナル ·ォブ ·クリニカル ·ィンべスティゲ一シヨン （J. Cl in. Invest. ) , 81, 1986 ( 1988)]、骨髄幹細胞から好酸球前駆細胞への誘導にも IL-3または GM-CSF が優位に働く [ブラッド（Blood)， 76, 1956 ( 1990) ] 。 さらに好酸球の炎症局所へ の遊走は、 ケモカインであるェォタキシン （eotaxin) 、 RANTES( regulated on activation normal T-cell expressed and secreted)等が働き [クリニカリレ · アン ド ·ェクスペリメン夕ル ·アレルギー（Clin. Exp. Al lergy), 26, 1005 ( 1996 )] 、 また幹細胞因子（stem cel l factor:以下 SCF と称す）もアレルギー性気管支炎にお ける好酸球の集積に関与しており、 好酸球を取り卷く環境は IL- 5以外にも多岐に 渡る。
好酸球には、 正比重好酸球（normodense eosinophil )と低比重好酸球（hypodense eosinophil )の亜群が存在するが、 好酸球が活性化されると低比重化することが示 されている [ィムノロジ一 （Immunology) ， 47, 531 ( 1982)] 。 低比重好酸球を活 性化好酸球ともいう。 HES患者の末梢血では、 好酸球の数的変化の他に質的変化も 起こっていることが報告されており [クリニカル ·ェクスペリメンタル ·ィムノロ ジ一 （Clin. Exp. Immunol. ) ， 4, 423 ( 1976 )] 、 活性化好酸球は、 HES の病態 の重症度との深い関連性が示されている [ァメリカン 'ジャーナル ·ォブ 'カルジ ォロジ一 （Am. J. Cardiol . ) ， 52, 321 ( 1983) ]。 HES以外に気管支喘息患者の末 梢血または気管支肺胞洗浄液 (bronchoalveolar lavage fluid： BALF )にも活性化好 酸球が見出されている [Am. Rev. Respir. Dis, 132, 981 ( 1985 )] 。 活性化好酸 球（低比重好酸球）は正比重好酸球と比べてサイ トカインなどの様々な受容体が盛 んに発現されており [ジャーナル 'ォブ 'ィムノロジー（J. Immunol . ) , 142, 4416
( 1989) ] 、 IL-5 に対する感受性も上昇している [クリニカル ·エキスペリメン夕 ル 'ィムノロジ一（Clin. Exp. Immunol . ) , 85, 312 ( 1991 )、 ジャーナル .ォブ - エキスペリメンタル -メディシン（J. Exp. Med. ) , 172, 1347 ( 1990 )] 。
上述した活性化好酸球は、上述した好酸球の分化または増殖に関与するサイ ト力 インがなくとも、 生体外で生存することが知られており [ジャーナル ·ォブ ·ェク スペリメンタル ·メデイシン（J. Exp. Med. ) , 170, 343( 1989)] 、 活性化好酸球の 性質は肺胞などの組織に浸潤した好酸球と同様である [インターナショナル ·ァ一 カイプズ'ォプ'アレルギ一'アンド'ィムノロジー（Int. Arch. Allergy Immunol . ) , 120, 91 ( 1999)] 。 活性化好酸球がサイ トカイン非依存性になる詳細な理由はまだ 不明であるが、 IL-5 以外の様々な生体機能分子により脱顆粒 ·寿命延長が誘発さ れている可能性が高い。
これまでに好酸球機能を抑制する薬剤としては、好酸球の分化または増殖に関与 するサイ トカインまたはケモカインなどに対する阻害作用を有する物質があげら れる。 しかしながら、 これらの薬剤は、 炎症局所に浸潤して活性化したサイ トカイ ン非依存性の好酸球に対しては作用しない可能性が高い。そのため、 いかなる好酸 球の機能を抑制するためには、好酸球を特異的に阻害し、 かつ活性化好酸球に対し ても細胞死を誘導することが必要である。
しかしながら、現在までに知られている抗炎症剤が活性化好酸球をアポトーシス させることは知られていない。
現在の好酸球性疾患の患者に対する主な治療法はステロイ ド投与であるが、ステ ロイ ドによる副作用を免れることは出来ない。 また、 ステロイ ド投与を中止した場 合には、 患者の病態はまた元に戻り、 長期間のステロイ ド投与は耐性を獲得するな どの欠点を有する。現時点では好酸球増加の抑制は困難であり、対症療法に頼って いるのが実状である。
発明の開示
慢性気管支喘息を始めとする炎症疾患や好酸球性肉芽腫など好酸球性疾患につ いて、 副作用が軽減され、 かつ臨床学的にもより有効な治療方法が求められている。 本発明者らは、 W097/10354に開示されているヒト IgGlサブクラスの Fc領域を 有する抗 IL- 5受容体ひ鎖抗体を用いて、 ヒト好酸球特異的にアポトーシスを誘導 させ、アポト一シスの誘導が抗体依存性細胞傷害活性によるものであることを見出 した。 また、抗体依存性細胞傷害活性による好酸球のアポトーシスが細胞傷害性蛋 白質を放出させないことから、 副作用の軽減が期待できる。 さらに、 IL- 5 非依存 性である活性化好酸球でも、該抗体によるアポト一シス誘導が行われることを示し、 該抗体の好酸球性疾患への治療における有用性を示した。
すなわち、 本発明は以下の （ 1) 〜 （20) に関する。
( 1) 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導す る抗体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
( 2 ) アポトーシスを誘導する抗体が、抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体で ある上記 （ 1) 記載のアポトーシス誘導剤。
(3) 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、抗ヒトインターロイキン 5受容 体ひ鎖モノクローナル抗体である上記 （ 1) または （2) 記載のアポトーシス誘導 剤。
(4) 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 動物細胞で 生産された抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である上記
(3) 記載のアポトーシス誘導剤。
(5) 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、形質転換株 KM8399(FERMBP-5648)により生産される抗体である上記 （3) 記載のアポトーシス 誘導剤。
(6) 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導す る抗体を有効成分として含有する好酸球性疾患治療剤。
( 7 ) アポトーシスを誘導する抗体が、 抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体で ある上記 （6) 記載の好酸球性疾患治療剤。
(8) 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容 体ひ鎖モノクローナル抗体である上記 （6) または （7)記載の好酸球性疾患治療 剤。
(9) 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 動物細胞で 生産された抗ヒ卜イン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である上記
(8) 記載の好酸球性疾患治療剤。
( 10) 抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、形質転換 株 KM8399(FERM BP- 5648)により生産される抗体である上記 （8) 記載の好酸球性 疾患治療剤。
( 1 1) 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導 する抗体を用いて、 好酸球に対して特異的にアポ卜一シスを誘導する方法。 ( 12) アポトーシスを誘導する抗体が、抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体 である上記 （ 1 1) 記載の方法。
( 13) 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、抗ヒトインターロイキン 5受 容体ひ鎖モノクローナル抗体である上記 （ 1 1) または （ 12) 記載の方法。
( 14) 抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、動物細胞 で生産された抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である上 記 （ 13 ) 記載の方法。
( 15) 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、形質転換 株 KM8399(FERM BP- 5648)により生産される抗体である上記 （ 13) 記載の方法。
( 16) 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球へのアポト一シスを誘導す る抗体を用いて、末梢血または好酸球の浸潤した組織中の好酸球を特異的に減少も しくは除去させる方法。
( 17) アポトーシスを誘導する抗体が、抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体 である上記 （ 16) 記載の方法。
( 18) 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、抗ヒトインターロイキン 5受 容体ひ鎖モノクローナル抗体である上記 （ 16) または （ 17)記載の好酸球を特 異的に減少もしくは除去させる方法。
( 19) 抗ヒトインタ一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、動物細胞 で生産された抗ヒトインタ一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である上 言己 （ 18 ) 記載の方法。
(20) 抗ヒトインタ一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、形質転換 株 KM8399(FERM BP- 5648)により生産される抗体である上記 （ 18) 記載の方法。 本発明に用いる抗体としては、好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対 しアポト一シスを誘導できるものであればいずれの抗体でもよい。
好酸球に対して特異的に反応する抗体としては、好酸球表面に発現する受容体に 対する抗体があげられる。好酸球表面に発現する受容体に対する抗体としては、抗 ヒトインターロイキン 5受容体/?鎖抗体、抗ヒトイン夕一ロイキン 3受容体抗体、 抗ヒト単球 'マクロファ一ジ—コロニー刺激因子受容体抗体、抗ヒトインターロイ キン 5受容体ひ鎖 （以下、 ML- 5R ひと称する） 抗体などがあげられる。 好ましく は抗 hIL- 5R a抗体があげられる。
好酸球に対しアポトーシスを誘導する抗体としては、好酸球の分化または増殖に 関与する情報伝達作用に対して阻害活性を有する抗体、または細胞傷害活性を有す る抗体などがあげられるが、後述するいかなる好酸球に対してもアポトーシスを誘 導するためには細胞傷害活性を有する抗体が好ましい。
したがって、 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを 誘導できる抗体として、抗体依存性細胞傷害活性を有する好酸球表面に発現する受 容体に対する抗体があげられ、 好ましくは抗体依存性細胞傷害活性を有する抗 hIL- 5R ひ抗体があげられる。 または CH0細胞、 YB2/3.0- Ag20細胞、 SP2/0- AG14細 胞、 NS0細胞など動物細胞株で生産された好酸球表面に発現する受容体に対する抗 体、 好ましくは動物細胞株で生産された抗 ML-5R ひ抗体があげられる。 さらに、 ヒト IgGl型の好酸球表面に発現する受容体に対する抗体があげられ、 好ましくは ヒト IgGl型の抗 hIL- 5R ひ抗体があげられる。 具体的には形質転換株 KM8399(FERM BP-5648 )が生産する抗 ML-5Rひヒト型 CDR移植抗体 KM8399があげられる。
抗 IL- 5受容体ひ鎖抗体は、 W097/10354に記載した方法に基づき、 取得すること ができる。
上述した抗体による好酸球に対するアポトーシスの誘導は、以下の方法により確 認することができる。
1.好酸球の分離
( 1 ) 末梢血からの顆粒球の分離
末梢血から顆粒球を分離するために、まず抗凝固剤処理された末梢血を用意する。 抗凝固剤としては、 へパリンナトリウム、 EDTA · 2ナトリウムまたは EDTA · 2カリ ゥムなどがあげられる。 へパリンナトリウムは通常末梢血 20〜30ml に対して 100 単位を用いる。
抗凝固剤入りの注射筒で末梢血を採取し、目的にあつた分離媒体に重層して遠心 分離することにより、 白血球を単核球、 顆粒球、 単球などの細胞集団に分離するこ とができる [ネイチヤー（Nature ) , 204, 793 ( 1964) ]。
末梢血由来単核球 (以下 PBMC と称す）と顆粒球とを分離する媒体としては、 リン ホプレップ ( Lymphopre )、 ポリモルフオプレップ ( Po lymorphoprep ) [ニコメ ッ ド ( NYCOMED )社製]およびフイコール ( F i co 11 ) [シグマ（ S igma )社製]などがあげられる。 また、 0. 15M NaClに調整したパ一コール [フアルマシア（Pharmacia)社製]の密度を 密度計で 1.085から 1.088に調整した分離媒体を用いることによつても分離するこ とができる。 上述の分離媒体を用いて遠心分離を行う際にはすべて室温で行う。 ( 2 ) 顆粒球からの好酸球の分離
上記 （ 1) で分離された顆粒球には、 好中球、 好酸球、 および場合によっては赤 血球が混在している。赤血球を除去するには、 以下のいずれかの方法で赤血球を溶 血させることにより行うことができる。
遠心管中に入れた赤血球を含む顆粒球のペレッ トに対して氷冷した蒸留水を加 え混濁し、 30秒後に氷冷した 10倍濃度の等張緩衝液を 1/10量加えて溶血反応を 停止する。 4°Cで 5分間、 400xgで遠心分離することにより上清を除去する。 これ を数回繰り返すことにより赤血球を除去することができる。
または、 赤血球を含む顆粒球ペレツトに対して氷冷した 0.2%NaCl溶液を加え懸 濁させ、 15秒後に氷冷した 1.6% NaCl溶液を等量加えて溶血反応を停止し、 4°Cで 5分間、 300 gで遠心分離することによつても赤血球を除去することができる [臨 床免疫， 9 (Suppl. 17), 41 (1997)]。
赤血球を除去後、 続いて好中球の除去を行う。
好中球の除去は、 好中球表面に発現している CD16抗原に対して、 ネガティブソ 一ティングを行うことにより行うことができる。
まず顆粒球とマウス抗 CD16抗体とを反応させて結合させ、 その後ヒヅジ抗マウ ス抗体固定化ダイナビーズ [ダイナル (DYNAL)社製]を添加する。 磁気ビーズ集積機 MPC-1 [ダイナル (DYNAL)社製]を用いてダイナビーズの結合した CD16陽性細胞を集 積させ、 残りの浮遊細胞を回収することにより好酸球を分離することができる [ァ レルギ一（Allergy), 50, 34 (1995)、 ョ一口ビアン ·ジャーナル ·ォブ 'ィムノロ ジ一（Eur. J. Immunol.), 24, 518 (1994)、 ジャーナル 'ォブ 'ィムノロジカル ' メソッズ (J. Immunol. Methods), 122, 97 (1989)]。
または、 MACSシステム [ミルテニ一 (Miltenyi)社製]を用いて抗 CD16抗体固定化 マイクロビーズを用いて、顆粒球から好中球をネガティブソ一ティングすることに より好中球を分離することができる [ジャーナル ·ォブ ·ィムノロジカル ·メソッ ズ (J. Immunol. Methods), 165, 253 (1993)、 同， 127, 153 (1990)]。
( 3 ) 活性化好酸球の誘導
活性化好酸球は、 末梢血から分離した好酸球を、 IL-3 と数日間培養する [ジャ —ナル ·ォブ ·クリニカル ·ィンべスティゲ一シヨン（J. Clin. Invest.), 81,1986 (1988)] かまたは、 PBMC と 2 日間共培養することにより取得することができる。 また、生体から採取した血液を、細胞分離に用いる分離媒体の密度を変えて遠心分 離して、 通常より低比重である活性化好酸球を取得することもできる [クリニ力 ル ·エキスペリメン夕ル · ィムノロジ一（Clin. Exp. Immunol . ) , 85, 312 ( 1991 ) ] , 活性化好酸球は、 CD69 分子の発現により確認することができる [ジャ一ナル · ォブ 'エキスペリメンタル 'メディシン（ Exp. Med. ) , 172, 701 ( 1990)] 。
( 4 ) 好酸球の培養法
好酸球は、 1%もしくは 10°/。牛胎児血清（以下 FCS と称す)添加の RPMI1640培地に IL-5、 IL-3もしくは GM-CSFのいずれかのサイ トカインを終濃度 lng/mlで添加し、 5%C02気流下、 37°Cにて培養することができる。
2 .ヒト好酸球に対するアポトーシス誘導法
正比重好酸球は、好酸球の分化および増殖に関与する情報伝達作用を阻害するこ とによって死に至る。 一方、 低比重好酸球 （活性化好酸球） は好酸球の分化および 増殖に関与する情報伝達作用を阻害するだけでは死に至らず、補体依存性細胞傷害 活性 （CDC) または抗体依存性細胞傷害活性 （ADCC) などの細胞傷害活性により死 に至る。
細胞死には、ネクロ一シスの誘導による場合とアポトーシスの誘導による場合と が考えられ、 その詳細な作用機序は未だ解決されていない。
アポト一シスの原因のひとつに、 細胞傷害活性があげられる [キャンサー'ィム ノロジ一 ■ ィムノセラピー（Cancer Immunol Immunother), 43, 220 ( 1996 )] 。 し かしながら、 細胞傷害活性は必ずしもアポトーシス誘導の場合だけではなく、 ネク ローシス誘導による場合もある。
好酸球へ作用させた場合に見られる細胞死の現象および原因が上記のいずれに よるものであるかは、 下記の方法で調べることができる。
ネクロ一シスによる細胞死を検出する方法としては、 PI (Propidium Iodide) 試 薬での細胞内 DNAの染色における検出方法があげられ、アポトーシスによる細胞死 を検出する方法としては、 ァネキシン Vによる検出方法があげられる。具体的には、 ァネキシン Vによる細胞表面ホスファチジルセリン（以下 PSと称する）の測定 [ジャ ーナル .ォブ■ ィムノロジカル ·メソッズ（J. Immunol . Methods) , 217, 61 ( 1998) ] を指標として、以下に示す方法によりアポトーシスによる細胞死を検出することが できる。
正常な細胞では、 細胞膜に存在する PSは細胞質側に存在するが、 アポト一シス が起こると 1時間以内に細胞表面に露出する。 そこで、 PSにカルシウム依存的に 結合する F ITC標識ァネキシン Vと細胞とを混合して、細胞膜上の PSを検出するこ とにより、 細胞膜の損傷より前の早期アポトーシスを検出することができる [ジャ —ナル ·ォブ ·エキスペリメンタル ·メディシン（J. Exp. Med) , 182, 1545 ( 1995 ) ] < ァネキシン Vの細胞膜への結合はネクロ一シスを起こした細胞にも見られるこ とがあるので、 ネクロ一シスを検出する PI との二重染色を行うことが好ましい。 早期のアポトーシスは、 ァネキシン V- F ITCで染色され、 PIで染色されないことに より検出できる。
さらに、 後述する 3.に示した方法によって抗体依存性細胞傷害性活性 （以下、
ADCC活性と略記する） を測定することにより、 標的細胞に対するアポトーシス誘 導を確認することができる。
3.ADCC活性の測定
ADCC活性の測定にはエフヱクタ一細胞とターゲット細胞が用いられる。
エフヱクタ一細胞としては、 ナキュラルキラ一 (NK)細胞、大顆粒リンパ球 (LGL)、 もしくはそれらを含む PBM または好中球、 好酸球、 マクロファージなどの、 Fc 受容体を細胞表面に有する白血球などがあげられる。
エフェクター細胞の分離は、 上言己 1 . の方法に準じて行うことができる。
夕ーゲット細胞としては、評価する抗体が認識する抗原を表面に発現している細 胞であればいかなる細胞でもよい。 例えば、 IL-5 受容体を細胞表面に発現してい る好酸球等があげられる。
夕一ゲット細胞は、 細胞傷害性を検出するために検出可能な試薬で標識する。 標識試薬としては、 放射性物質であるクロム酸ナトリウム（Na2 51Cr04、 以下 51Cr と称す） [ィムノロジ一（Immunology) , 14, 181 ( 1968) ]、 力ルセイン- AM( calcein -
AM) [ジャーナル'ォブ'ィムノロジカル'メソッド（J. Immunol . Methods ) , 172 , 227
( 1994) ]、 ユーロピウム（Europium) [同， ， 29 ( 1995 ) ]があげられ、 好ましくは
51Crがあげられる。
夕ーゲット細胞として最終分化細胞であるヒ卜末梢血好酸球を用いる場合には、 標識効率が低いため、 ADCC 反応後に夕ーゲット細胞の死を別の方法で検出する必 要がある。 細胞死の検出には、 上記 2 .に記載された方法を用いることができる。 4 .末梢血または好酸球の浸潤した組織中の好酸球を特異的に減少もしくは除去さ せる方法
本発明の好酸球に対して特異的に反応し、かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導 する抗体、 例えば抗 hIL- 5R ひ鎖抗体、 好ましくは動物細胞で生産された抗 ML - 5R ひ抗体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤により、末梢血または好酸球 の浸潤した組織から好酸球を特異的に減少もしくは除去させることができる。例え ば钪 hIL- 5Rひ鎖モノクローナル抗体 KM8399を末梢血または組織に直接作用させる ことにより、 好酸球特異的にアポト一シスを誘導させ、末梢血または好酸球が浸潤 した組織中の好酸球を減少もしくは除去することができる。
5 . 薬剤の形態
上述した好酸球に対して特異的に反応し、かつ好酸球に対するアポトーシスを誘 導する抗体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤または好酸球性疾患治 療剤は、 薬剤として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容 される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよ く知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげ ることができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることができる。 投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座 剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖 等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ご ま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐 剤、 ストロベリーフレーバー、 ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用 いて製造できる。
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール 等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシ ゥム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を 添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用い て調製される。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は抗体製剤そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激 せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用い て調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。該抗体および用いる担 体の性質により、 エアロゾル、 ドライバウダ一等の製剤が可能である。 また、 これ らの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもで きる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体 重等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10 g/kg〜8mg/kgである。
本発明において好酸球性疾患とは気管支喘息やアトピー性皮膚炎を始めとする アレルギー疾患、 好酸球性肺炎、突発性好酸球増多症を始めとする好酸球増多症、 好酸球性胃腸炎、 好酸球性白血病、 好酸球性肉芽腫、 木村病などのハイパーェォジ ノフィ リック症候群 (HES)等の、 好酸球が原因である疾患を示す。
本発明のアポトーシス誘導剤および好酸球性疾患治療剤は、上記好酸球性疾患の 治療剤として用いることができる。
図面の簡単な説明
第 1図は末梢血から分離した好酸球を用いた in vitroにおける IL- 5依存性生存 延長の阻害効果を示した図である。縦軸はリコンビナントヒト IL- 5 (以下、 rhIL - 5 と称す） 作用阻害によるァネキシン V陽性 %、 横軸は各抗体をそれぞれ示す。 陰性 対象としてはヒト IgGlを用いた。
第 2 図は添加抗体と反応後の好酸球画分の各試薬に対する染色性を示した図で ある。 縦軸が全好酸球数に対する各試薬陽性 %、 横軸が染色試薬をそれぞれ示す。 ァネキシン V- FITC陽性細胞はアポトーシスを起こした細胞、 PI陽性細胞はネク口 一シスを起こした細胞を示す。
第 3図は KM8399のアポト一シス誘導作用の細胞特異性を示した図である。 縦軸 はァネキシン V陽性 %、 横軸は細胞集団をそれぞれ示す。
第 4図は KM8399と TRFK5のアポトーシス誘導作用の有無を示した図である。 縦 軸はァネキシン V陽性％、 横軸は添加した抗体をそれぞれ示す。
第 5図は KM8399のアポトーシス誘導作用の濃度依存性を示した図である。 縦軸 はァネキシン V陽性％、 横軸は添加した抗体をそれぞれ示す。
第 6図はサイ トカイン共存下でのアポト一シス誘導作用を示した図である。縦軸 はァネキシン V陽性％、 横軸は添加したサイ トカインをそれぞれ示す。
第 7図は ADCC活性後に遊離された好酸球性顆粒蛋白 （EP0) の定量値を示した図 である。 各測定項目に対して、 縦軸は全細胞数に対する割合 ） 、 横軸は添加し た抗体をそれぞれ示す。
第 8図は ADCC活性後に遊離された好酸球性顆粒蛋白 （EDN) の定量値を示した図 である。 各測定項目に対して、 縦軸は全細胞数に対する割合 ） 、 横軸は添加し た抗体をそれぞれ示す。
第 9図は目視による好酸球の観察結果を示した図である。 縦軸は死細胞 %、 横軸 は添加した抗体をそれぞれ示す。
第 10図は KM8399による CD16陽性細胞集団の濃縮を示した図である。 縦軸は全 顆粒球中における CD16陽性細胞率、 横軸は抗体をそれぞれ示す。
第 11図は活性化好酸球に対するアポトーシス誘導作用を示した図である。 縦軸 はァネキシン V陽性 横軸は抗体をそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 . ヒト PBMCおよび好酸球の分離
へパリンナトリゥム注射液 (武田薬品社製）を 200単位 (200 HI 1 )入れた注射筒を 用いて、健常人ヒト末梢血 60mlを採取した。その全量を等量の生理食塩液 (大塚製 薬社製）にて 2倍に希釈し、 120mlとした。 15ml容量の遠心管 (住友べ一クライ ト社 製） 12本にリンフォプレップ [ニコメッド（NYC0MED )社製]を 5ml ずつ分注し、 その 上から希釈した末梢血を 10mlずつ重層し、 室温で 20分間、 800 x gで遠心分離し た。 血漿層とリンフオプレップ層の間にある PBMC画分を全ての遠心管より採取し て 1%の FCSを含む RPMI 1640培地 [ギブコ（GIBC0)社製] (以下 1¾FCS-RPMIと称す）に 懸濁し、 4°Cで 5分間、 400 x gで 2回遠心洗浄して、エフェクター細胞とした。 15ml 遠心管から赤血球を含んだ沈殿層以外をァスピレーターで除去し、 4本分の残った 沈殿層をトランスファーピぺッ卜で 1本の 50ml遠心管 [ファルコン（FALCON)社製] に集めた。 続いて、 氷冷した蒸留水を 27ml加えて混濁することで、 赤血球の溶血 反応を行った。 30秒後にピぺス緩衝液 [0. 11M塩化ナトリウム， 5mM塩化カリウム， 25mMピぺラジン- 1 , 4-ビス （2 -エタンスルホン酸） および 42mM水酸化ナトリウム からなる緩衝液]の 10倍濃度のものを 3ml加えて等張に戻し、反応を停止させ、 4°C で 5分間、 400 xgで遠心分離した。 上清をデカンテーシヨンにより除去し、 沈殿 をピぺス緩衝液 3mlでよく懸濁した。さらにもう一度同様の操作を行い、 全ての遠 心管中の沈殿を 1 本の 15ml 遠心管に移し、 1%FCS を含むピぺス緩衝液（以下 1%FCS- PIPESと称す） 15mlで洗浄した。 この細胞集団を顆粒球画分 (約 4 x 107〜6 x 107個）とし、細胞数を数えた後に、細胞数 1 X 107個に対して 2〃 gのマウス抗 CD16 抗体 [クローン名： 3G8、 ィムノテック（IMMUNOTECH)社製]を添加して 30分間、 時々 攪拌しながら氷中にて反応させた。 1%FCS-PIPESにて 2回遠心洗浄した後、 ヒッジ 抗マウス抗体付加磁気ビーズ [ダイナル (DYNAL)社製]を細胞数の 4倍量加え、 さら に氷中で時々攪拌しながら 30分間反応させた。その後、磁気ビーズ集積機 MPC- 1 [ダ イナル (DYNAL )社製]で磁気ビーズとそれに結合した CD16発現細胞群を除去し、 残 りの上清のみを別の 15ml遠心管に移し、 4°Cで 5分間、 400 x gで遠心分離し、 細 胞を回収した。ペレツ卜の細胞数を数え、 この細胞集団を好酸球画分 (約 I X 106〜2 X 106個）とした。 これらの細胞はサイ トスピン [シャンドン（SHAND0N)社製]で標本 を作り、 ディフークイック染色液（国際試薬社製） で染色し、 約 500個の細胞を顕 微鏡で数えることによってその好酸球の純度を計算した。常時 95%以上の純度で分 離することが出来た。
実施例 2. IL-5作用阻害に基づく好酸球のアポト一シスの検出
in vitro で、 各種抗体について、 好酸球の生存を延長することを阻害する活性 を測定した。測定は、 以下に示したァネキシン V陽性のアポトーシス誘発細胞を測 定することにより行った。各種抗体としては、抗ヒ卜 IL- 5Rひ鎖抗体である KM8399 および KM9399(W097/10354)、 抗ヒ ト IL- 5 抗体である TRFK5 [ファーミンジェン (Pharmingen)社製]、 コントロール抗体としては、 ヒト IgGlである抗ガングリオシ ド GM2モノクローナル抗体 KM8969 (特開平 10- 257893) を用いた。
実施例 1の方法を用いて高純度（純度 95%以上）に分離した好酸球を 1 FCS-RPMI で 2 X 106個/ mlに調整し、 96ゥエル U字プレートに 100〃 1ずつ分注した。
好酸球は、 0. 1ng/ml rhIL-5(R&D社製)存在下にて生存延長することが知られて いる。 そこで、 0.4ng/ml rhIL- 5を 50〃 1/ゥエルずつ分注した。
4 g/nilに調整した各種抗体を、 50 1 1/ゥエルずつ分注し、計 200〃 1で 5%C02 気流下、 37°C、 24時間培養した。
培養後、ァネキシン V- F I TCキット [トレビジヱン（ TREV I GEN )社製）]を用いてゥェ ル中の好酸球を染色した。 フローサイ トメ一夕一 [コ一ルター（Coulter)社製]で前 方散乱光（以下 FSと称す)、側方散乱光 (以下 SSと称す）により細胞の形態を保持し た画分に測定対象を合わせ、 その全対象細胞数に対するァネキシン V- FITC陽性細 胞集団の割合を第 1蛍光 (FL1 )を測定することで算出し、 アポトーシス誘発細胞率 とした。 アポトーシス誘発細胞率は、 rhIL-5非添加のァネキシン V-FITC陽性％を 100%、 rhIL-5添加で抗体非添加のァネキシン V- FITC陽性％を 0%として算出した。 第 1図に示すように、 KM8399、 TRFK5は同程度に rhIL- 5作用阻害に基づく好酸 球のアポトーシスを誘導した。 また、 細胞傷害活性を持たないヒト IgG4サブクラ スである KM9399(W097/10354)でも同等の活性が確認された。 このことは、 IL- 5阻 害作用により、 好酸球のアポトーシスが誘導されたことを示す。
実施例 3. 細胞傷害活性に基づく好酸球のアポトーシスの検出
( 1 )エフヱクタ一細胞による ADCC反応後のアポトーシス検出 （I )
細胞培養用 96ゥエル U字プレート [ファルコン（FALCON)社製]を用いた。 ェフエ クタ一細胞としては上記 1 .で調製した健常人 PBMC画分を用い、 1%FCS- RPMI で 1 X 107個/ mlに調製した細胞懸濁液を 100 J 1/ゥエルずつ分注した。 夕ーゲット細 胞としては実施例 1で調整した好酸球画分を 8 x l05個/ mlに調整し、 50〃 1/ゥェ ルずつ分注してエフヱクタ一/夕ーゲット比 (E/T ratio)は生体内の割合に近似さ せた 25/1とした。
これに KM8399抗体希釈液 4〃g/mlを 50〃 1/ゥヱルずつ添加し、 該プレートを、 5%C02気流下、 37°C、 4時間静置させて、 ADCC反応を行った。
反応後、 ゥエル中から培地を除去し、 ァネキシン V- FITCキット（TREVIGEN社）で 添付の説明書に従って試薬を反応させた後、 フローサイ トメ トリーで解析した。サ ンプル中の測定対象細胞を FS、 SSにて好酸球画分に限定して FL1の蛍光強度を測 定することで、 好酸球画分のみのァネキシン V陽性率を算出した。
第 2図に示すように、 KM8399 を添加した場合は、 抗体非添加の場合と比較して 有意にァネキシン V- FITC陽性細胞集団が増加したが、 PI陽性細胞集団は増加しな かった。
以上の結果は、 KM8399 による好酸球除去の機構がアポトーシスであることを示 している。
(2)エフヱクタ一細胞による ADCC反応後のアポト一シス検出（I I )
ADCC反応時間を 20時間とする以外は、 実施例 3 ( 1 ) と同様に行い、 ァネキシ ン Vでの単一染色でアポト一シスを検討した。フローサイ トメ一夕一での測定時に FS、 SSの違いを元にリンパ球、 単球または好酸球にそれそれァネキシン Vによる 蛍光強度の測定対象の範囲を決定し、各対象範囲でのァネキシン V陽性率を実施例 3 ( 1 ) に記載した方法により検出した。
添加する抗体としては、 ADCC活性を有する IgGl型の抗体である KM8399および ADCC活性をほとんど有さない IgG4型の抗体である KM9399を用いた。 コント口一 ル抗体としては、 IgGl型である抗ガングリオシド GD3モノクローナル抗体 KM871 [キ ヤンサー ·ィムノロジー ·ィムノセラピー (Cancer Immunol . Immunother. ) ， 36, 373-380 ( 1993 ) ]を用いた。 これらの抗体は全て終濃度 1〃 g/mlで検討した。 第 3図に示すように、 IgGl型で ADCC活性を有する KM8399を添加した場合、 好 酸球特異的にアポトーシスを誘導することが認められたが、 PBMC 画分中に含まれ るリンパ球、 単球画分には反応が認められなかった。 IgG4型で ADCC活性を有して いない KM9399を添加した場合には、 すべての細胞で反応が認められなかった。 以 上の結果から、 KM8399のアポトーシス誘導は ADCC活性を介して生ずる機構が含ま れることが示された。 陰性対照の IgGl型の抗ガングリオシド GD3モノクローナル 抗体 KM871 [キヤンサ一 ' ィムノロジ一 · ィムノセラピ一 （Cancer Immunol . Immunother. ) ， 36, 373-380 ( 1993 ) ]では特異的な作用は検出されなかった。
( 3 )抗 IL- 5抗体 TRFK5 との比較
実施例 （2 ) で示された KM8399の好酸球特異的なアポト一シス誘導が TRFK5と 比較して有意に検出できるかを、 3人の健常人の PBMC画分を用いて、 実施例 3( 1 ) の方法と同様の方法で検討した。
その結果、 第 4図に示すように、 KM8399 はアポトーシスの誘導が見られたが、 TRFK5添加の場合はアポトーシスの誘導が見出されなかった。
再度、 3名の健常人の PBMC画分を用いて同様の実験を行ったが、 結果は同様で あった。
また、用いる抗体濃度を変化させて同様の方法で実験を行った。第 5図に結果を 示した。 KM8399 は抗体濃度依存的にアポトーシス誘導活性が高くなり、 また終濃 度 0.01 g/mlの濃度でもその活性を維持した。以上の結果は、好酸球特異的に結 合する抗ヒト IL- 5受容体ひ鎖抗体 KM8399は抗ヒト IL- 5抗体 TRFK5に比べ、 高い アポト一シス誘導活性を有しており、好酸球性疾患の治療薬としてより好ましいこ とを示している。
(4)サイ トカイン共存下での ADCC活性 IL-5、 IL- 3、 GM-CSF共存下で好酸球を活性化させ、 該好酸球に各種抗体を 1 g/ml作用させた場合の ADCC活性を検討した。
実施例 3 ( 1 )で用いた PBMC画分の 2倍濃度に調整した PBMC画分を 50〃 1/ゥエル ずつ分注し、 4ng/mlの各種サイ トカイン希釈液または 12ng/mlの 3種類のサイ ト カイン混合液を 50 UL 1/ゥヱル添加し、 さらに好酸球画分および抗体希釈液を実施 例 3( 1 )と同様に各 50 1/ゥエル分注することで全量を 200 1/ゥエルとした。 添加するサイ トカインは IL- 5、 IL- 3、 GM-CSF (全て MD社製） を用い、 サイ トカ ィン混合液としては上記 3種類の 4ng/inlサイ トカインの混合液を用いた。
第 6図に示すように、 いずれのサイ ト力インの共存下においても、 1 〃 g/ml の K 8399は抗体非添加と比較して有意にアポトーシスを誘導した。一方、 TRFK5では 全くアポトーシス誘導は観察されなかった。
実施例 4 . 好酸球顆粒蛋白質の測定
実施例 3 ( 1 ) と同様に ADCC反応終了後、 プレートを 4 °Cで 5分間、 350 x gで 遠心分離し、 上清を 1.5ml チューブ [エツペンドルフ（eppendorf )社製]に移し、 - 80°Cで保存して、後述の遊離好酸球性顆粒蛋白質の定量サンプルとして用いた。細 胞中の全顆粒蛋白質の測定には、 10 のトライ トン X(Triton X)を含む 1%FCS- RPMI を 10 1/ゥエル添加して細胞融解した培養上清をサンプルとして用いた。
(1) 好酸球性ペルォキシダ一ゼ（eosinophil peroxidase： EP0)の測定
96 ゥヱル ELISAプレート [グライナ一（greiner)社製]に各培養上清サンプル 50 1 を 2連で分注し、 さらに発色基質溶液 [50mM クェン酸ナトリウム（pH5.0 )、 0.4mg/ml o -フエ二レンジァミンおよび 30%過酸化水素水 1/1000からなる溶液] を 100〃 1/ゥヱル加えて 30分間発色させた。その後、 4規定の硫酸を 50〃 1/ゥエル 添加し、 発色を停止させて、 プレートリーダー （モレキュラーデバイシーズ社製） で、 490nmの吸光度を測定した。第 Ί図で示すように、 KM8399による EP0遊離率は 抗体非添加の場合と同等であつた。
(2) 好酸球性神経毒（eosinophil- derived neurotoxin： EDN)の測定
ADCC反応後の培養上清 50〃 1に EDN ELISAキット（MBL社製）に含まれるサンプ ル希釈液 (Assay di luent)を 200 ju 1加え、 5倍希釈して測定サンプルとした。 測 定サンプルは 2連とし、 キットの説明書に従って EDNを定量した。吸光度測定はプ レートリーダ一 [モレキュラーデバイシ一ズ（molecular devices)社製]を用い、 サ ンプル中の濃度の換算はキット中の標準品をもとに soft max [モレキュラーデバイ シーズ（molecular devices )社製]を用いた。 第 8図に示すように、 KM8399の EDN 遊離率は極めて低く、 抗体非添加の場合と比較して有意差は見られなかった。
以上のことから、 KM8399による好酸球の除去が、 細胞質である EP0や EDNが周 囲に散るネクローシスではなく、アポト一シスによるものであることが確認できた すなわち、 KM8399 により好酸球を除去させた際に、 好酸球内の顆粒蛋白質放出に よる周囲の組織、 または細胞に対する傷害性は見られなかった。
実施例 5 . ADCC反応後の目視による好酸球生存率の算出
ADCC反応終了後、 細胞を含んだ反応液 30 ju 1を 1%FCS-RPMIにて 10倍希釈し、 それをスライ ドグラス （シャンドン社製） 1枚あたり 100〃 1ずつ付加し、 各サン プルについて 2枚ずつのサイ トスピンによる標本を作製した。好酸球純度の換算法 と同様に、 ディフークイック染色液 （国際試薬社製） で染色し、 各スライ ドグラス 中の生好酸球数と死好酸球数 （細胞の形態をほぼ残している細胞） を顕微鏡で 100 個数えてその死細胞率を算出した。第 9図に示すように、 ァネキシン Vによるアポ トーシス誘導結果と同じく KM8399添加により好酸球特異的な除去が確認された。 IgG4型の KM9399および陰性対照の IgGl型の抗ガングリオシド GD3モノクローナ ル抗体 KM871 [キャンサー 'ィムノロジ一 ' ィムノセラピー （Cancer Immunol . Immunother. ) ， 36, 373-380 ( 1993 ) ]では好酸球特異的な除去は認められなかった。 実施例 6 . 末梢血顆粒球の CD16陽性細胞の濃縮
末梢血中の顆粒球は、 CD16陽性の好中球と CD16陰性の好酸球画分とから成る。 末梢血顆粒球からの好酸球の選択的な除去を、 以下に示す方法で CD16陽性細胞の 割合を測定することにより検討した。
実施例 1.の方法でリンパ球と顆粒球を分画し、 各分画 5 X 105個を 50 JUL 1/ゥェ ルずつ 96ゥエル U字プレートに分注した。該プレートに 10%FCS- RPMIにて 2〃 g/ml に調整した KM8399を 100〃 1/ゥヱルずつ分注し、 5%C02気流下、 37°C、 96時間培 養した。 培養後、 4°Cで 3分間、 350 x gで遠心分離し、 上清を除去した。 測定用緩 衝液 [ 1%牛血清アルブミン、 0. 0¾EDTA (エチレンジァミン- Ν，Ν，Ν，，Ν，-テトラァセ ティックァシッド） 、 0. 05%アジ化ナトリウムを含む PBS (フォスフェイ ト-バッフ ァード -サリン） ]を 100〃 1/ゥエル加えることで細胞を洗浄し、 F ITC標識抗 CD16 抗体（日本べクトン 'ディッキンソン社製）を 20 JLL 1/ゥヱル添加して氷上で 30分 間反応させた。その後 3回測定用緩衝液にて遠心洗浄し、 フローサイ トメ一夕一で F ITCの蛍光強度を測定した。 その結果を第 1 0図に示す。 抗体非添加群と比較して KM8399添加群では CD16 陰性である好酸球が減少し、 CD16陽性である好中球が増加した。
実施例 7 . 活性化好酸球に対するアポトーシスの検出
上記 3. ( 1 )のアポトーシス検出法を改良し、 活性化好酸球に対するアポトーシス を検出した。末梢血より分離した好酸球 ( 4 X 105個 /ml )と PBMC( l x l06個/ ml )を 100 ^ 1 /ゥヱルずつ 96 ゥエルプレートに分注した後、 48時間共培養して活性化好酸 球を誘導した。このように共培養した好酸球は、活性化好酸球マーカ一である CD69 分子を発現していた。
共培養後、 培養上清を 100 JUL 1/ゥ ルずつ除去し、 2 ju g/mlの各種抗体希釈液 を 100〃 1ずつ添加し（最終濃度 1 i g/ml ) 、 さらに 20時間培養した。 培養後、 ァネキシン V- FITCによる染色でアポト一シス細胞の検出を行った。
第 1 1図に示すように、 KM8399 は活性化好酸球に対してもアポトーシスを有意 に誘導した。 活性化好酸球はサイ トカイン非存在下でも生存するため、 IL- 5 の阻 害だけでは活性化好酸球を除去もしくは減少させることは出来ない。上記の結果か ら KM8399は、 末梢血中の好酸球だけでなく炎症局所に浸潤した活性化好酸球を除 去または減少させることができることが明らかとなり、臨床学的にも有用であるこ とが示された。
産業上の利用可能性
本発明のアポトーシス誘導剤は、好酸球特異的にアポトーシスを誘導して、好酸 球または活性化好酸球を減少もしくは除去させることにより、慢性気管支喘息をは じめとする炎症疾患、 好酸球性肉芽腫などの好酸球性疾患の治療に有用である。

Claims

請求の範囲
1. 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導する 抗体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
2. アポトーシスを誘導する抗体が、 抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体であ る請求項 1記載のアポトーシス誘導剤。
3. 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、 抗ヒトインターロイキン 5受容体 ひ鎖モノクロ一ナル抗体である請求項 1または 2記載のアポトーシス誘導剤。
4. 抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 動物細胞で生 産された抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 3記載のアポト一シス誘導剤。
5. 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 形質転換株 KM8399(FERM BP- 5648 )により生産される抗体である請求項 3記載のアポトーシス 誘導剤。
6. 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導する 抗体を有効成分として含有する好酸球性疾患治療剤。
7. アポトーシスを誘導する抗体が、 抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体であ る請求項 6記載の好酸球性疾患治療剤。
8. 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、 抗ヒトインターロイキン 5受容体 ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 6または 7記載の好酸球性疾患治療剤。
9. 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 動物細胞で生 産された抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 8記載の好酸球性疾患治療剤。
10. 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 形質転換株 KM8399(FERM BP- 5648)により生産される抗体である請求項 8記載の好酸球性疾患 治療剤。
11. 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球に対しアポトーシスを誘導する 抗体を用いて、 好酸球に対して特異的にアポト一シスを誘導する方法。
12. アポトーシスを誘導する抗体が、抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体であ る請求項 1 1記載の方法。
13. 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、抗ヒトインターロイキン 5受容体 ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 1 1または 1 2 3載の方法。
14. 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、動物細胞で生 産された抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 1 3記載の方法。
15. 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 形質転換株 KM8399(FERM BP- 5648)により生産される抗体である請求項 1 3記載の方法。
16. 好酸球に対して特異的に反応し、 かつ好酸球へのアポトーシスを誘導する抗 体を用いて、末梢血または好酸球の浸潤した組織中の好酸球を特異的に減少もしく は除去させる方法。
17. アポトーシスを誘導する抗体が、抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体であ る請求項 1 6記載の方法。
18. 好酸球に対して特異的に反応する抗体が、抗ヒトインターロイキン 5受容体 ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 1 6または 1 7記載の好酸球を特異的に減 少もしくは除去させる方法。
19. 抗ヒトインターロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、動物細胞で生 産された抗ヒトインタ一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体である請求項 1 8記載の方法。
20. 抗ヒトイン夕一ロイキン 5受容体ひ鎖モノクローナル抗体が、 形質転換株 KM8399(FERM BP- 5648)により生産される抗体である請求項 1 8記載の方法。
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